CN101495482B

CN101495482B - 氮杂环丙基-埃坡霉素化合物

Info

Publication number: CN101495482B
Application number: CN200780028309XA
Authority: CN
Inventors: 格雷戈里·D·维特; 克里斯托弗·P·利蒙; 艾恩特乔·R·弗拉霍夫; 金崇薰
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2006-05-25
Filing date: 2007-05-25
Publication date: 2012-05-02
Anticipated expiration: 2027-05-25
Also published as: JP2009538349A; CA2655668A1; CA2655668C; KR101413955B1; MX2008014735A; ZA200810022B; TW200815452A; CN101495482A; TWI383985B; WO2007140297A3; ES2371111T3; US7872145B2; EA200802389A1; EP2041140A2; IL195236A; JP5249929B2; ATE524477T1; US20070276018A1; HK1124335A1; NZ572763A

Abstract

本发明涉及如本文中进一步描述的具有式(X)的氮杂环丙基埃坡霉素化合物及/或其可药用盐及/或溶剂化物。所述化合物可用于治疗癌症或用于制备用于靶向药物递送的结合物尤其是叶酸结合物。

Description

氮杂环丙基-埃坡霉素化合物

本申请要求2006年5月25日提交的美国临时专利申请60/808,366的优先权，在此将其完整引入作为参考。

技术领域

本发明涉及氮杂环丙基-埃坡霉素类似物，含有氮杂环丙基-埃坡霉素类似物的药物组合物，以及使用上述氮杂环丙基-埃坡霉素类似物及药物组合物的方法。

背景技术

埃坡霉素A与埃坡霉素B为由

等人发现的自微生物纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)的发酵产物分离出的天然存在的化合物(参见例如WO 93/10121)。等人亦发现由纤维堆囊菌产生的37种天然埃坡霉素变体及相关化合物，包括埃坡霉素C、D、E、F以及其它异构体及变体。参见例如美国专利第6,624,310号。在1993年

等人对埃坡霉素A与埃坡霉素B的细胞毒性作用进行了报导，而在1995年研究人员与Merck报导埃坡霉素B发挥类似于紫杉醇(TAXOL

)的微管稳定作用(参见D.M.Bollag，“Epothilones，a New Class of Microtubule-Stabilizing Agents with a Taxol-likeMechanism of Action”，Cancer Research，第55卷(1995年6月)，第2325-2333页)。

Bristol-Myers Squibb Co.已发现天然存在的埃坡霉素的多种衍生物及类似物。埃坡霉素类似物的实例包括称为伊沙匹隆(ixabepilone)的氮杂埃坡霉素B类似物、埃坡霉素B的21-经取代的类似物(包括21-氨基类似物)、2，3-烯烃类似物、C-3氰基类似物、环丙基类似物及杂环类似物(包括氮杂环丙基-埃坡霉素类似物)。参见例如美国专利第6,605,599号、第6,262,094号、第6,399,638号、第6,498,257号、第6,380,395号及第6,800,653号，将这些专利中的每篇都引入作为参考。其他人亦已对其它埃坡霉素衍生物及类似物的发现进行了报导。参见例如PCT公开号WO 99/65913、WO 98/25929、WO 00/99/07692、WO 99/67252、WO 00/00485、WO 00/37473、WO 01/83800、WO 99/67253、WO 99/07692、WO 00/00485、WO 00/49021、WO 00/66589、WO 03/045324、WO 04/014919、WO 04/056832、WO 03/022844、美国专利6,441,186、6,284,781、6,660,758、6,380,394、6,242,469、6,531,497、6,441,186、6,489,314、6,589,968、6,930,102、美国专利申请公开号US 2004/0072870A1、US 2003/0023082A1、US 2004/0053910A1和US 2004/0152708A1，在此将所有这些专利文献完整引入作为参考。

天然存在的埃坡霉素及其类似物如同其它微管稳定剂一样可用于治疗诸如癌症那样的增殖性疾病，其典型地通过杀灭肿瘤细胞、其它病原性细胞及外来病原体(或阻止其生长)而起作用。然而，抗癌药常常不仅攻击肿瘤细胞，而且攻击正常组织，引起不希望有的副作用。另外，抗癌药通常有溶解性问题，使得药物的调配及递送可能存在难题，从而导致使用诸如CREMOPHOR

那样的增溶剂。已知一些抗癌药及/或制剂成份的细胞毒性可引起神经病或其它副作用诸如过敏反应。这些不利的副作用突出显示出亟需对病原性细胞群有选择性且因此引起宿主毒性下降的抗癌治疗。

然而，如WO 2004/054622A1中所论述，多年来科学家试图在用于将化学治疗剂递送至患者的靶向药物治疗中使用单克隆抗体(mAb)，但已在特别是可裂解部分、连接基团及释放于细胞中的药物形式方面遇到困难。据报导用mAb进行的成功肿瘤治疗被抗体不充分渗透入肿瘤中所限制且被肿瘤组织中相应的肿瘤相关抗原的不均匀分布所限制。参见Klar等人的WO05/074901(转让给Schering AG)。

美国专利申请公开号2005/0002942披露了用于靶向药物递送的与维生素受体结合的药物递送接合物。为了提供用于癌症治疗的靶向药物递送，在本领域中需要鉴定以下抗癌药，其可用于制备如US 2005/0002942中所述那样的接合物。

发明内容

本发明涉及具有式X的化合物或其可药用盐和/或溶剂化物：

其中

K为-O-、-S-或-NR₇-；

A为-(CR₈R₉)-(CH₂)_m-Z-，其中Z为-(CHR₁₀)-、-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-N(R₁₁)C(＝O)-、-SO₂-或-N(R₁₁)SO₂-；

B₁为羟基或氰基以及R₁为氢；或B₁和R₁一起形成双键；

R₂、R₃和R₅独立为氢、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；或R₂和R₃可与它们所连接的碳一起形成任选取代的环烷基；

R₄为氢、烷基、烯基、取代的烷基、取代的烯基、芳基或取代的芳基；

R₆为氢、烷基或取代的烷基；

R₇、R₈、R₉、R₁₀和R₁₁独立为氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂环烷基、取代的杂环烷基、杂芳基或取代的杂芳基；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；

R₁₃为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；和

m为0至6。

本发明还涉及使用具有式X的化合物来治疗癌症的方法，以及式X的化合物与可药用载体一起在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。式X的化合物尤其可用于制备用于靶向药物治疗的组合物。

附图说明

图1为埃坡霉素类似物化合物AA的六种叶酸基团接合物(接合物编号为AA.I至AA.VI)的化学结构、相对亲和力及抗KB肿瘤细胞的EC₅₀(nM)值。

图2为埃坡霉素类似物化合物BB的三种叶酸基团接合物(接合物编号为BB.I至BB.III)的化学结构、相对亲和力及抗KB肿瘤细胞的EC₅₀(nM)值。

图3显示了用浓度(浓度为nM)(x轴)增加的化合物G(棒形)、化合物CC(三角形)、化合物AA(菱形)或伊沙匹隆(正方形)处理后存活KB克隆的分数(存活分数)(y轴)。

图4显示了与未经任何处理(对照)(黑色圆形)相比用各种剂量的化合物J(灰色正方形、白色正方形、灰色菱形)或伊沙匹隆(黑色棒形)处理裸鼠中KB鼻咽表皮样癌异种移植物的体内抗肿瘤功效，以(A)肿瘤植入后若干天(x轴)时的中值肿瘤重量(mg)(y轴)或(B)肿瘤植入后若干天(x轴)时的重量减轻(％体重变化)(y轴)进行测量。

图5显示了与未经任何处理(对照)(黑色圆形)相比化合物J(灰色正方形)或伊沙匹隆(白色正方形)对抗FR(-)M109鼠科肺癌(murine lung carcinoma)的体内抗肿瘤作用，以肿瘤植入后若干天(x轴)时的中值肿瘤重量(mg)(y轴)进行测量。

图6显示了未经任何处理(对照)(黑色圆形)、用单独的化合物J(灰色正方形)处理、用叶酸类似物基团存在下的化合物J(黑色棒形)处理或用化合物G(灰色菱形)处理的体内抗肿瘤作用，以肿瘤植入后若干天(x轴)时的中值肿瘤重量(mg)(y轴)进行测量。

具体实施方式

术语的定义

以下所述为用于本说明书中的术语的定义。除非另有说明，否则本文为基团或术语提供的初始定义适用于整篇说明书中单独出现或作为另一基团的部分而出现的上述基团或术语。

如本文所使用的术语“叶酸结合部分或其类似物或衍生物”意指与叶酸受体(folate receptor)蛋白(不是单克隆抗体)发生结合的部分，所述叶酸受体蛋白在癌细胞上过度表达或优先表达。例如，已知叶酸受体(FR)在卵巢癌细胞及其它癌细胞中过度表达。叶酸的示例性类似物及衍生物披露于Vlahov等人的美国专利申请公开号2005/0002942(下文中称为“Vlahov”)中，在此将其引入作为参考。

如本文所使用的术语“可释放的连接基团”意指包含至少一个在生理条件下可断裂的可裂解键(例如pH值不稳定的键、还原性不稳定的键、酸不稳定的键、氧化不稳定的键或酶不稳定的键)的二价连接基团。应该理解的是，引起键断裂的上述生理条件包括标准化学水解反应，其例如在生理pH值下发生或由于区域化至细胞器(诸如pH值比胞质pH值低的内体)内或由于与细胞还原剂(诸如谷胱甘肽)反应而发生。

应该理解的是，如本文中所述，可裂解的键可连接可释放的连接基团中的两个相邻原子，且/或在所述连接基团的任一端或两端将诸如Q及K那样的其它基团与可释放的连接基团连接。

术语“烷基”单独出现或与一些其它基团组合时指在任何可用碳原子处连接的直链或支链烷(烃)基，其含有1至10个碳原子，优选1至6个碳原子，更优选1至4个碳原子。示范性的上述基团包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基等。“低级烷基”或“低级亚烷基”意指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。当针对烷基或其它基团使用下标时，所述下标指所述基团可含有的碳原子数。举例而言，术语“C_0-4烷基”包括化学键及含有1至4个碳原子的烷基，且术语“C_1-4烷基”意指含有l至4个碳原子的烷基。

术语“亚烷基”指如上“烷基”中所述但具有两个连接点的二价烃基。例如，亚甲基为-CH₂-基团且亚乙基为-CH₂-CH₂-基团。

当术语烷基结合另一基团使用(如在杂环烷基或环烷基烷基中)时，此意指另一确定的(名称在先的)基团直接经由如上所定义的烷基(例如所述烷基可为支链或直链)连接。因而，在上述情况下术语“烷基”用来指具有两个可用连接点的亚烷基，例如二价烷基。举例而言，环丙基C_1-4烷基意指经由具有1至4个碳原子的直链或支链亚烷基连接的环丙基，且羟基烷基意指经由具有1至10个碳原子且优选具有1至6个碳原子且更优选具有1至4个碳原子的直链或支链亚烷基连接的OH基团。就取代基而言，如在“经取代的环烷基烷基”中，基团的亚烷基部分除支链或直链外还可如下被取代为经取代的烷基，且/或名称在先的基团(例如环烷基)可如本文所述被取代为经取代的所述名称在先的基团(例如环烷基)。

“经取代的烷基”指在任何可用连接点处经一个或多个取代基且优选经1至4个取代基取代的烷基。然而，当烷基经多个卤素取代基取代时，所述烷基可随价数允许而含有多达10个取代基，更优选含有多达7个取代基。烷基取代基可包括一个或多个以下基团：卤素(例如单卤素取代基或多卤素取代基，在后种情况下形成基团诸如全氟烷基或具有Cl₃或CF₃的烷基)、氰基、-OR_a、-SR_a、-C(＝O)R_a、-C(＝O)OR_a、-OC(＝O)R_a、-OC(＝O)OR_a、-NR_aR_b、-C(＝O)NR_aR_b、-OC(＝O)NR_aR_b、-S(＝O)R_a、-S(O)₂R_a、-NHS(O)₂R_a、-NHS(O)₂NHR_a、-NHC(＝O)NHR_a、-NHC(＝O)R_a、-NHC(O)₂R_a、-NHC(＝N-CN)R_a、芳基、杂环基、环烷基及/或杂芳基，其中基团R_a及R_b独立地选自氢、烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基及杂芳基，且其中各R_a及/或R_b又任选经1至4个选自以下的基团取代：烷基、烯基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、巯基、烷基硫基、苯基、苯甲基、苯基氧基、苄基氧基、C_3-7环烷基、5员或6员杂环基或杂芳基及/或低级烷基或低级烯基，所述基团经1至4个选自羟基、氰基、卤素、卤代C_1-4烷基、卤代C_1-4烷氧基、氰基、硝基、氨基、C_1-4烷基氨基、氨基C_1-4烷基、羟基C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、巯基及/或C_1-4烷基硫基的基团取代。为了避免产生疑义，“经取代的低级烷基”意指具有1至4个碳原子及1至4个选自以上刚刚就经取代的烷基所描述的取代基的烷基。就经取代的低级烷基而言，基团R_a及R_b优选地选自氢、低级烷基、低级烯基、C_3-7环烷基、苯基及5至6员单环杂环基及/或杂芳基，这些取代基又任选如上经取代。

术语“烯基”指含有2至12个碳原子及至少一个碳-碳双键的直链或支链烃基。示范性的上述基团包括乙烯基或烯丙基。“经取代的烯基”指在任何可用连接点处经一个或多个取代基且优选经1至4个取代基取代的烯基。示范性的取代基包括烷基、经取代的烷基及以上作为烷基取代基而描述的那些基团。

术语“烷氧基”及“烷基硫基”指分别经由氧键(-O-)或硫键(-S-)连接的如上所述的烷基。术语“经取代的烷氧基”及“经取代的烷基硫基”指分别经由氧键或硫键连接的如上所述的经取代的烷基。“低级烷氧基”或C_1-4烷氧基为基团OR，其中R为低级烷基(含有1至4个碳原子的烷基)。

“氨基”为-NH₂。烷基氨基为-NR_cR_d，其中R_c与R_d中的至少一个为烷基或经取代的烷基，且R_c与R_d中的另一个选自氢、烷基及经取代的烷基。“氨基烷基”意指经由亚烷基连接的氨基(-亚烷基-NH₂)，且烷基氨基烷基意指经由亚烷基连接的如上所定义的烷基氨基(-亚烷基-NR_cR_d)。

术语“芳基”指具有1至3个芳环的环状芳族烃基，尤其为单环或二环基团，诸如苯基或萘基。为二环或三环的芳基必须包含至少一个完全芳族的碳环，但其它稠环可为芳族或非芳族的，且可任选含有杂原子，其限制条件为在上述情况下连接点连接至芳族碳环。另外，当芳基已稠合至杂环基环或环烷基环上时，所述杂环基环及/或环烷基环可具有一个或多个羰基碳原子，即所述碳原子经由双键与氧原子连接，形成羰基。因而，“芳基”的实例可包括但不限于：

术语“亚芳基”指二价芳基，即在芳基环的任何可用连接点处具有连接至两个其它基团的两个连接点的如上所定义的芳基。亚芳基环亦可经适于在本文所定义的芳基上进行取代的任何基团取代。

“经取代的芳基”指在任何连接点处经一个或多个取代基且优选经1至4个取代基取代的如上所定义的芳基或亚芳基。取代基包括烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基以及以上作为烷基取代基所述的那些基团。

术语“碳环”意指饱和或不饱和的单环、二环或三环(优选为单环或二环)，其中所有环的所有原子为碳。因而，术语包括环烷基环及芳基环。碳环可被取代，在这种情况下，取代基选自以上针对环烷基及芳基而描述的那些取代基。

术语“环烷基”指含有1至3个环且每个环含有3至7个碳原子的完全饱和或部分饱和的环烃基。示范性的完全饱和的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基及环己基。示范性的部分饱和的环烷基包括环丁烯基、环戊烯基及环己烯基。术语“环烷基”包括具有由3至4个碳原子组成的桥的环烷基。另外，为二环或三环的环烷基必须包含至少一个完全饱和或部分饱和的烃环，但其它稠环可为芳族或非芳族，且可含有杂原子，其限制条件为在这种情况下连接点连接至环状的非芳族的烃基。另外，环烷基的一个或多个碳原子可形成碳-氧双键，定义为羰基。因而，“环烷基”的实例可包括但不限于：

术语“亚环烷基”指二价环烷基，即在环烷基环的任何两个可用连接点处具有连接至两个其它基团的两个连接点的如上所定义的环烷基。

“经取代的环烷基”指在任何可用连接点处经一个或多个取代基且优选经1至4个取代基取代的如上所定义的环烷基。环烷基的取代基包括烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基以及以上作为烷基取代基所述的那些基团。

术语“胍基”意指基团

因而，胍基烷基意指与胍基连接的烷基，诸如具有式

的基团。

术语“卤素”或“卤代”指氟、氯、溴及碘。

术语“杂原子”包括氧、硫及氮。

术语“卤代烷基”意指具有一个或多个卤素取代基的烷基，包括但不限于诸如-CH₂F、-CHF₂及-CF₃那样的基团。

术语“卤代烷氧基”意指具有一个或多个卤素取代基的烷氧基。举例而言，“卤代烷氧基”包括-OCF₃。

当术语“不饱和”在本文中用来指示环或基团时，所述环或基团可为完全不饱和或部分不饱和。

术语“杂芳基”指为4至7员单环系统、7至11员二环系统或10至15员三环系统的芳族基团，其具有至少一个含有至少一个杂原子的环。含有杂原子的杂芳基的各环可含有一个或两个氧原子或硫原子及/或1至4个氮原子，其限制条件为各环中杂原子的总数为4或小于4且各环具有至少一个碳原子。构成二环及三环基团的稠环可仅含有碳原子且可为饱和的、部分饱和的或不饱和的。氮原子及硫原子可任选被氧化且氮原子可任选被季铵化。为二环或三环的杂芳基必须包含至少一个完全芳族的环，但其它稠环可为芳族的或非芳族的且可为碳环，其限制条件为在这种情况下连接点在含有杂原子的芳环的任何可用氮原子或碳原子处。另外，杂芳基其自身的定义包括其中一个或多个碳原子经由双键与氧原子连接以定义为羰基的环(其限制条件为杂芳基是芳族的)，且亦当杂芳基已稠合至杂环基环或环烷基环上时，所述杂环基环及/或环烷基环可具有一个或多个羰基。

示范性的单环杂芳基包括吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基(即

噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基等。另外，因杂芳基其自身的定义包括其中一个或多个碳原子定义为羰基的环，故包括诸如2，4-二氢-[1，2，4]三唑-3-酮(即)等那样的环。

示范性的二环杂芳基包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、二氢异吲哚基、四氢喹啉基等。

示范性的三环杂芳基包括咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基(phenanthrolinyl)、吖啶基(acridinyl)、菲啶基(phenanthridinyl)、呫吨等。

术语“亚杂芳基”指二价杂芳基，即在杂芳基环的任何两个可用连接点处具有连接至两个其它基团的两个连接点的如上所定义的杂芳基。

“经取代的杂芳基”为在任何可用连接点处经一个或多个取代基且优选经1至4个取代基取代的如上所定义的杂芳基。示范性的取代基包括但不限于烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基以及以上作为烷基取代基所述的那些基团。

术语“杂环”、“杂环的”和“杂环基”可交换使用，并且指完全饱和或部分不饱和的非芳族环状基团，其可经取代或未经取代，举例而言，其为4至7员单环系统、7至11员二环系统或10至15员三环系统，其在至少一个含碳原子的环中具有至少一个杂原子。含有杂原子的杂环基的各环可具有1个、2个或3个选自氮、氧及硫原子的杂原子，其中氮及硫杂原子亦可任选被氧化且氮杂原子亦可任选被季铵化。优选地，两个相邻的杂原子不同时选自氧及氮。为二环或三环的杂环基必须包含至少一个非芳族的非碳环，但其它稠环可为芳族的或非芳族的且可为碳环，其限制条件为在这种情况下连接点在含有杂原子的非芳环的任何可用氮原子或碳原子处。另外，杂环基其自身的定义包括其中一个或多个碳原子经由双键与氧原子连接以定义为羰基的环(其限制条件为杂环基为非芳族的)，且亦当杂环基已稠合至另一环上时，所述另一环可具有一个或多个羰基。

示范性的单环杂环基包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、咪唑啉基、吡咯啉基、四氢吡喃基、吗啉基、硫吗啉基等。

“经取代的杂环”和“经取代的杂环基”指在任何可用连接点处经一个或多个取代基且优选经1至4个取代基取代的如上所定义的杂环基。示范性的取代基包括烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基以及以上作为示范性烷基取代基所述的那些基团。

“羟基”指-OH。

“巯基”意指基团-SH。

术语“四级氮”指四价正电性氮原子，包括例如四烷基铵基团(例如四甲基铵或N-甲基吡啶鎓)中的正电性氮、质子化铵物质(例如三甲基氢铵或N-氢吡啶鎓)中的正电性氮、胺N-氧化物(例如N-甲基-吗啉-N-氧化物或吡啶-N-氧化物)中的正电性氮及N-氨基-铵基团(例如N-氨基吡啶鎓)中的正电性氮。

当称官能团为“受保护的官能团”时，此意指所述基团呈经修饰的形式以减少且特别是排除在受保护的位点处发生不希望有的副反应。用于本文所述的方法及化合物的合适保护基包括但不限于标准教科书中所述的那些保护基，所述标准教科书包括以引用方式并入本文中的Greene，T.W.等人，Protective Groups in Organic Synthesis，Wiley，N.Y.(1991)。

可供选择的本发明实施方案

本发明包括如发明内容中列出的具有式X的化合物。

本发明包括具有立体特异性形式的式X’的化合物：

包括其可药用盐和/或溶剂化物，其中

K为-O-、-S-或-NR₇-；

B₁为羟基或氰基以及R₁为氢；或B₁和R₁一起形成双键；

R₆为氢、烷基或取代的烷基；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；

R₁₃为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；以及

m为0至6。

在另一个实施方案中，本发明的化合物具有式X或以上的立体特异性式X’：

包括其可药用盐和/或溶剂化物，其中

K为-O-；

A为C_2-4亚烷基；

B₁为-OH；

R₂、R₃、R₄和R₅独立为氢或低级烷基；

R₆为氢或甲基；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；以及

R₁₃为任选取代的5元或6元杂芳基。

在另一个实施方案中，本发明的化合物具有如上文定义的式X或X’，包括其可药用盐和/或溶剂化物，其中

K为-O-；

A为C_2-4亚烷基；

B₁为-OH；

R₂、R₃、R₄和R₅独立为氢或低级烷基；

R₆为氢；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；以及

R₁₃为任选取代的5元或6元杂芳基。

K为-O-；

A为C_2-4亚烷基；

B₁为-OH；

R₂、R₃、R₄和R₅独立为氢或低级烷基；

R₆为氢或甲基；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；以及

R₁₃为任选取代的噻唑基、吡啶基或噁唑基。

在另一个实施方案中，本发明提供具有式Xa的化合物：

包括其可药用盐和/或溶剂化物，其中

K为-O-、-S-或-NR₇-；

R₆为氢或甲基；

R₈、R₉、R₁₀和R₁₁独立为氢、烷基或取代的烷基，

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；以及

R₁₃为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；以及

m为0至6。

在本发明的另一个实施方案中，本发明提供式Xa的化合物，包括具有立体特异性形式的式Xa’的化合物，其与就X’而显示的立体化学相对应。

在另一个实施方案中，本发明提供上文中具有式Xa或Xa’的化合物，其中K为-O-，以及R₁₃为任选取代的噻唑基、吡啶基或噁唑基，以及其余基团如上文中定义。

在另一个实施方案中，本发明提供上文中具有式Xa或Xa’的化合物，其中K为-O-；A为C_2-4亚烷基；R₆为氢或甲基；R₁₂为H、低级烷基或卤素；以及R₁₃为任选取代的噻唑基、吡啶基或噁唑基。

本发明的化合物还可具有式Xb：

包括其可药用盐和/或溶剂化物，其中R₆为氢或甲基。

在另一个实施方案中，本发明的化合物具有式Xb，其中R₆为氢。

在另一个实施方案中，本发明的化合物可具有立体特异性的式Xb’：

包括其可药用盐和/或溶剂化物，其中R₆为氢或甲基。

在另一个实施方案中，本发明的化合物具有式Xb’，其中R₆为氢。

根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于治疗癌症(例如与叶酸受体相关的病症)的方法，所述方法包括用治疗有效量的具有下式X的化合物或其可药用盐和/或溶剂化物来治疗患者：

其中

K为-O-、-S-或-NR₇-；

B₁为羟基或氰基以及R₁为氢；或B₁和R₁一起形成双键；

R₆为氢、烷基或取代的烷基；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；

R₁₃为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；以及

m为0至6。

在一个实施方案中，所述方法包括用治疗有效量的具有立体特异性式X’的化合物(包括其可药用盐和/或溶剂化物)来治疗患者：

其中K、A、B₁、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃和m如上文中就式X的化合物而言所定义。

在另一个实施方案中，所述方法包括用治疗有效量的如上文所述的具有式X(包括式X’)的化合物(包括其可药用盐和/或溶剂化物)来治疗患者，其中

K为-O-；

A为C_2-4亚烷基；

B₁为-OH；

R₂、R₃、R₄和R₅独立为氢或低级烷基；

R₆为氢或甲基；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；以及

R₁₃为任选取代的5元或6元杂芳基。

在另一个实施方案中，所述方法包括用治疗有效量的如上文所述的具有式X或X’的化合物(包括其可药用盐和/或溶剂化物)来治疗患者，其中

K为-O-；

A为C_2-4亚烷基；

B₁为-OH；

R₂、R₃、R₄和R₅独立为氢或低级烷基；

R₆为氢；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；以及

R₁₃为任选取代的5元或6元杂芳基。

K为-O-；

A为C_2-4亚烷基；

B₁为-OH；

R₂、R₃、R₄和R₅独立为氢或低级烷基；

R₆为氢或甲基；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；以及

R₁₃为任选取代的噻唑基、吡啶基或噁唑基。

本发明的方法还包括用治疗有效量的具有上文中式Xa或立体特异性形式Xa’的化合物(包括其可药用盐和/或溶剂化物)来治疗需要所述治疗的患者，其中K为-O-、-S-或-NR₇-；A为-(CR₈R₉)-(CH₂)_m-Z-，其中Z为-(CHR₁₀)-、-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-N(R₁₁)C(＝O)-、-SO₂-或-N(R₁₁)SO₂-；R₆为氢或甲基；R₈和R₉独立为氢、烷基或取代的烷基，R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；R₁₃为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；以及m为0至6。

本发明的方法还包括用治疗有效量的具有上文中式Xb或Xb’的化合物来治疗需要所述治疗的患者，其中R₆为氢或甲基。在另一个实施方案中，所述方法包括用式Xb或Xb’的化合物来治疗患者，其中R₆为氢。

本发明的另一个实施方案包括上述任何化合物(包括式X、Xa、Xa’、Xb和/或Xb’的化合物，其中基团K、A、B₁、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂和R₁₃可如上文所述进行选择)在制备用于治疗患者中癌症的药物组合物中的用途，特别是在制备含有接合化合物(conjugated compound)的药物组合物中的用途，所述接合化合物用于对过度表达或优先表达叶酸受体的肿瘤进行靶向药物递送。

本发明的另一个实施方案包括用治疗有效量的具有式X、Xa、Xa’、Xb和/或Xb’的化合物(其中基团K、A、B₁、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂和R₁₃可如上文所述进行选择)来治疗需要所述治疗的患者，其中所述治疗发生在肿瘤位点，而所述化合物在肿瘤位点被释放。在这个实施方案中，接合化合物被递送至肿瘤位点，然后如上文定义的式X、Xa、Xa’、Xb或Xb’的化合物在肿瘤位点被释放，并在肿瘤位点治疗患者。因此，在本申请中应该理解的是，不论何时术语“治疗”针对治疗患者而使用时，不论递送方式(例如通过接合化合物递送)如何，其都涵盖在肿瘤位点进行治疗。

使叶酸受体(FR)水平上调的药物的使用可在某些癌细胞或肿瘤类型中有效地增强FR的表达，以增加将本发明的化合物投予患者后所得到的优势及/或增加可用根据本发明的叶酸受体结合化合物进行治疗的各种疾病或肿瘤类型。在某些癌症中叶酸受体的表达可通过投予叶酸受体诱导剂而上调，所述叶酸受体诱导剂在癌症细胞中选择性地增加叶酸受体的水平，从而增强叶酸受体靶向治疗的有效性。举例而言，雌激素受体阳性(ER+)的乳癌表达低水平的叶酸受体。已知用诸如他莫昔芬(一种雌激素拮抗剂)那样的叶酸受体诱导剂进行的治疗可在ER+乳癌中使叶酸受体的表达上调，增加ER+乳癌细胞对用叶酸受体靶向治疗进行的治疗的易感性。

本发明的一个方面提供治疗患者中癌症或增殖性疾病的方法，所述方法包括任选将有效量的至少一种叶酸受体诱导剂给药于患者，并用有效量的至少一种式X的化合物来治疗患者。可将叶酸受体诱导剂在用式X的化合物治疗患者之前、同时或之后给药。在一个实施方案中，将叶酸受体诱导剂在用式X的化合物治疗之前给药。叶酸受体诱导剂的有效量是指在所期望的细胞中使叶酸受体上调以使用本发明的化合物进行的治疗在治疗上是有效的量。

用于使叶酸受体α(FRα)上调的叶酸受体诱导剂的实例包括：雌激素受体拮抗剂，诸如他莫昔芬；孕酮受体激动剂，诸如孕激素；雄激素受体激动剂，诸如睾酮及二羟基睾酮；及糖皮质激素受体激动剂，诸如地塞米松。

用于使叶酸受体β(FRβ)上调的叶酸受体诱导剂的实例包括：视黄酸受体激动剂，诸如全反式视黄酸(ATRA)、四甲基萘基丙烯基苯甲酸(TTNPB)、9-顺式视黄酸(9-顺式RA)、CD33336、LG101093及CD2781。

在一个实施方案中，本发明提供在需要治疗癌症或增殖性疾病的患者中治疗癌症或增殖性疾病的方法，所述方法包括给药有效量的至少一种叶酸受体诱导剂，并且还用至少一种式X的化合物来治疗患者；其中所述叶酸受体诱导剂上调叶酸受体α。优选地，所述癌症或增殖性疾病选自乳癌(如ER+乳癌)和卵巢癌。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供在需要治疗癌症或增殖性疾病的患者中治疗癌症或增殖性疾病的方法，其包括给药有效量的至少一种叶酸受体诱导剂及给药有效量的至少一种式X的化合物；其中所述叶酸受体诱导剂使叶酸受体β上调。优选地，所述癌症或增殖性疾病选自白血病，且更优选地选自急性骨髓性白血病(AML)及慢性骨髓性白血病(CML)。

在另一个实施方案中，本发明提供在需要治疗癌症或增殖性疾病的患者中治疗癌症或增殖性疾病的方法，其包括给药有效量的至少一种叶酸受体诱导剂，给药至少一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，及用有效量的至少一种式X的化合物对所述患者进行治疗。组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的实例为曲古菌素A(trichostatin A，TSA)。参见美国专利申请公开案第2003/0170299A1号、WO 2004/082463、Kelly，K.M.，B.G.Rowan及M.Ratnam，CancerResearch 63，2820-2828(2003)以及Wang，Zheng，Behm及Ratnam，Blood，96：3529-3536(2000)。

本发明的化合物可形成亦在本发明的范畴内的盐或溶剂化物。除非另有说明，否则应该理解的是，本文中提及的式(X)的化合物包括其盐及溶剂化物、其外消旋体、非对映异构体和对映异构体。如本文所使用的术语“盐”表示与无机酸及碱及/或有机酸及碱形成的酸加成盐及/或碱加成盐。此外，当式(X)的化合物含有诸如但不限于吡啶基、咪唑基、氨基或胍基那样的碱性部分及诸如但不限于羧酸基团那样的酸性部分时，可形成两性离子且包括在如本文所使用的术语“盐”内。尽管其它盐亦可用于例如制备期间可使用的分离或纯化步骤中，但药学上可接受的(即无毒的生理学上可接受的)盐是优选的。式(X)的化合物的盐可例如通过以下方法来制备：将式(X)的化合物与一定量(诸如当量)的酸或碱在介质(诸如其中盐发生沉淀的介质)中或在水性介质中反应且接着冻干。

含有诸如但不限于氨基、胍基、吡啶基或咪唑基那样的碱性部分的式(X)的化合物可与多种有机酸及无机酸形成盐。示范性的酸加成盐包括乙酸盐(诸如与乙酸或三卤乙酸(例如三氟乙酸)形成的那些盐)、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、羟基乙烷磺酸盐(例如2-羟基乙烷磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲烷磺酸盐、萘磺酸盐(例如2-萘磺酸盐)、烟碱酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、苯基丙酸盐(例如3-苯基丙酸盐)、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(诸如与硫酸形成的那些盐)、磺酸盐(诸如本文中提及的那些盐)、酒石酸盐、硫氰酸盐、诸如甲苯磺酸盐那样的甲苯磺酸盐、十一酸盐等。

含有诸如但不限于羧酸基团那样的酸性部分的式(X)的化合物可与多种有机碱及无机碱形成盐。示范性的碱加成盐包括铵盐；碱金属盐，诸如钠盐、锂盐及钾盐；碱土金属盐，诸如钙盐及镁盐；与有机碱(例如有机胺)(诸如苄星胺(benzathine)、二环己胺、哈胺(hydrabamine)(用N，N-二(脱氢松香基)亚乙基二胺形成)、N-甲基-D-葡糖胺、N-甲基-D-咪唑双酰胺、叔丁胺)形成的盐；及与诸如精氨酸、赖氨酸那样的氨基酸形成的盐等。碱性含氮基团可用以下试剂来季铵化：诸如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基及丁基的氯化物、溴化物及碘化物)、硫酸二烷酯(例如硫酸的二甲酯、二乙酯、二丁酯及二戊酯)、长链卤化物(例如癸基、十二烷基、十四烷基及十八烷基的氯化物、溴化物及碘化物)、芳烷基卤化物(例如苯甲基及苯乙基的溴化物)及其它试剂。

本发明的化合物的溶剂化物亦涵盖于本文中。式(X)的化合物的溶剂化物包括例如水合物。

包括对映异构体形式及非对映异构体形式在内的本发明的化合物的所有立体异构体(例如可由于各取代基上的不对称碳而存在的立体异构体)都涵盖于本发明的范畴内。由此，例如当每次涉及式X的化合物时，都意在包括包括式X’的化合物。本发明的化合物的各个立体异构体可例如大体上不含其它异构体(例如具有特定活性的纯或大体上纯的光学异构体)，或可混合成例如外消旋体，或与所有其它立体异构体或其它选定的立体异构体混合。本发明的手性中心可具有IUPAC 1974 Recommendations所定义的S或R构型。外消旋形式可通过诸如对非对映异构体衍生物进行分级结晶、分离或结晶或通过手性柱色谱进行分离的物理方法来进行拆分。各个光学异构体可通过立体特异性方法来得到，其中选择具有与最终产物所要立体化学相一致的立体化学的起始原料及/或中间体，且所述立体化学在整个反应期间维持不变，且/或可通过任何合适的方法，包括但不限于诸如与光学活性酸形成盐接着结晶那样的常规方法，自外消旋体得到异构体。

本发明涵盖呈混合物形式或呈纯或大体上纯形式的本发明的化合物的所有构型异构体。应该理解的是，优选的构型可随特定的化合物及所要的活性而变化。构型异构体可通过本文所述的可具有立体选择性的方法来制备。换言之，最终化合物的所要立体化学可通过使用具有相应所要立体化学的起始原料且接着在整个制备方法期间维持立体选择性而实现。或者，本发明的化合物可制备成外消旋体或非对映异构体，且接着所要的立体化学可经由对构型异构体进行分离而实现，所述对构型异构体进行的分离可通过本领域已知的任何合适方法(诸如柱色谱)来实现。

在整个说明书中，可选择基团及其取代基以提供稳定的部分及化合物，其可用作可药用化合物及/或在制备可药用化合物中所使用的中间体化合物。本领域技术人员应该理解的是，变量的合适选择可得到稳定的化合物。

本文中的示范性或优选的实施方案意在说明而非限制。

例如，鉴于以上所提及的实施方案的组合，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，且涵盖于本发明的范畴内。

用途

在某些癌细胞中过度表达或优先表达的一种蛋白质为叶酸受体。叶酸是DNA合成所需要的，且已知某些人类肿瘤细胞过度表达叶酸结合蛋白。例如，Campbell等人，“Folate Binding Protein is a Marker for OvarianCancer，”(Cancer Research，第51卷(1991年10月1日)，第5329-38页)及Coney等人，“Cloning of a Tumor-Associated Antigen：MOv18 and MOv19Antibodies Recognize Folate-binding Protein，”(Cancer Research，第51卷(1991年11月15日)，第6125-31页)报导叶酸结合蛋白为卵巢癌的标志物(marker)。亦已知在其它癌症诸如皮肤癌、肾癌、乳癌、肺癌、结肠癌、鼻癌、咽喉癌、乳腺癌及脑癌以及本文所提及的其它癌症中，叶酸受体过度表达。

本发明的化合物是有用的，并且可以按埃坡霉素所衍生的微管稳定剂的形式被递送至表达叶酸受体的肿瘤。其可用于治疗多种癌症及其它增殖性疾病，尤其是以癌细胞或肿瘤表达叶酸受体为特征的那些癌症。如本文所使用的术语“与叶酸受体相关的病症”包括以表达叶酸受体为特征的疾病或病症，或换言之，包括可基于对患病组织中叶酸受体表达水平与正常组织进行比较来诊断或治疗的那些疾病或病症。本发明的化合物可用于形成接合物。例如，本发明的化合物可用于形成下式I的接合化合物：

其中

V为叶酸基团(folate)或其类似物基团或衍生物基团；

Q为O、S或NR₇；

M为可释放的连接基团(linker)；

K为O、S或NR_7a；

B₁为羟基或氰基以及R₁为氢；或B₁和R₁一起形成双键；

R₆为氢、烷基或取代的烷基；

R_7a、R₇、R₈、R₉、R₁₀和R₁₁独立为氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂环烷基、取代的杂环烷基、杂芳基或取代的杂芳基；

R₁₂为H、烷基、取代的烷基或卤素；

R₁₃为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；

m为0-6；

T具有下式：

其中

R₁₄在每次出现时独立为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、环烷基、取代的环烷基、环烷基烷基、取代的环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、取代的杂芳基、杂环烷基或取代的杂环烷基；

q为1-10；以及

R₁₅、R₁₆和R₁₇独立为氢、烷基、取代的烷基或环烷基。

作为另一个非限制性实施例，本发明的化合物可用于形成下式Ia的接合化合物：

其中V为叶酸受体结合部分。

例如，V可具有下式：

其中W和X独立为CH或氮；

R₂₀为氢、氨基或低级烷基；

R₂₁为氢或低级烷基，或与R₂₃形成环烷基；

R₂₂为氢、低级烷基、低级烯基或低级炔基；以及

R₂₃为氢，或与R₂₁形成环烷基。

优选地，V为

本发明的化合物可接合形成具有下式Ib的化合物：

其中

V为叶酸受体结合部分；

R为H或低级烷基；

Q为O、S或NR₇；

M为具有下式的可释放的连接基团：

优选为

R₁₄在每次出现时独立为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、环烷基、取代的环烷基、环烷基烷基、取代的环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、取代的杂芳基、杂环烷基或取代的杂环烷基；以及优选为选自下列的基团：H、甲基、胍基丙基、-(CH₂)_1-2-CO₂H、-CH₂-SH、-CH₂-OH、咪唑基(甲基)、氨基丁基和-CH(OH)-CH₃；以及更优选为被-C(＝O)-OH或-NH-C(＝NH)-NH₂中的一个取代的C₁-C₃烷基。

q为1-10；优选为1至5；

R₁₅、R₁₆和R₁₇独立为氢、低级烷基或取代的低级烷基；以及

R₁₈、R₁₉、R₃₁、R₃₂、R₃₃、R₂₄、R₂₅、R₂₆、R₂₇、R₂₈和R₂₉各自独立为H、低级烷基、取代的低级烷基、环烷基或取代的环烷基，或R₁₈和R₁₉、R₃₁和R₃₂、R₁₉和R₃₁、R₃₃和R₂₄、R₂₅和R₂₆、R₂₄和R₂₅或R₂₇和R₂₈中任一组可一起形成环烷基。

本发明的化合物尤其可用于形成具有下式的接合化合物：

包括其可药用盐和溶剂化物。

对于能够插入到式I化合物中的本文所列出的任何二价基团(诸如-(CR₈R₉)-(CH₂)_m-Z-)而言，

插入应自左向右进行。举例而言，在A定义为-(CR₈R₉)-(CH₂)_m-Z-的以下情况下，亚甲基与K连接，且Z基团与氮杂环丙基环的氮连接，如下所示：

作为非限制性实例，上述与叶酸受体相关的癌症包括卵巢癌、皮肤癌、乳癌、肺癌、结肠癌、鼻癌、咽喉癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、脾癌及/或脑癌、间皮瘤(mesothelioma)、垂体腺瘤(pituitary adenoma)、子宫颈癌、肾细胞癌或其它肾癌、脉络丛癌(choroid plexus carcinoma)及上皮肿瘤(参见Asok，Antony，“Folate Receptors：Reflections on a Personal Odyssey and a Perspectiveon Unfolding Truth”，Advanced Drug Delivery Reviews 56(2004)，第1059-66页)。

另外，抗雌激素(诸如他莫昔芬、ICI 182,780)的使用可在某些癌细胞或肿瘤类型中有效地增加FR的表达，以增加将本发明的化合物给药患者后所得到的优势及/或增加可用根据本发明的化合物进行治疗的各种疾病或肿瘤类型。

例如，可用本发明的化合物进行治疗及/或通过包含本发明的化合物与抗雌激素的组合治疗而进行治疗的疾病可进一步包括但不限于以下疾病：

-癌，包括以上所列出的那些癌及/或膀胱癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌及前列腺癌；

-淋巴系统的造血组织肿瘤，包括白血病，诸如急性淋巴细胞白血病及急性淋巴母细胞白血病；及淋巴瘤，诸如B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤及伯基特(Burkitt)淋巴瘤；

-骨髓系统的造血组织肿瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓细胞白血病；

-中枢及外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤及神经鞘瘤；

-间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤及骨肉瘤；及

-其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、精原细胞瘤、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌及畸胎癌。

本发明的化合物可用于治疗先前已接受癌症治疗的患者以及先前未接受癌症治疗的患者。本发明的方法及组合物可用于第一线及第二线癌症治疗。此外，式(X)的化合物可用于治疗顽固性或抵抗性癌症。

本发明的化合物亦可用于治疗对经由叶酸受体递送的微管稳定剂有应答的其它病况，包括但不限于关节炎(尤其为发炎性关节炎)及由活化巨噬细胞介导的其它发炎性病况以及中枢神经系统病症(诸如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease))。

此外，正在用本发明的化合物进行治疗的患者可以接受联合治疗，例如与其它抗癌药和细胞毒性药物或用于治疗癌症或其它增殖性疾病的其它治疗一起进行的联合治疗。在治疗癌症中，本发明的化合物与一种或多种额外药物及/或其它治疗的组合可以是有利的。第二药物可具有与式(X)的化合物相同或不同的作用机制。尤其有用的组合是与抗癌药及细胞毒性药物的组合，其中选定的第二药物以与本发明的化合物的活性药物部分不同的方式或在与本发明的化合物的活性药物部分不同的细胞周期阶段起作用。

抗癌药及细胞毒性药物的类型实例包括但不限于烷基化剂，诸如氮芥、烷基磺酸酯(盐)、亚硝基脲、亚乙基亚胺及三氮烯；抗代谢物质，诸如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物及嘧啶类似物；抗生素或抗体，诸如单克隆抗体；酶；法尼基(farnesyl)蛋白转移酶抑制剂；激素药物，诸如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素及黄体化激素释放拮抗剂；微管破裂剂，诸如海鞘素(ecteinascidin)或其类似物及衍生物；微管稳定剂；植物来源的产物，诸如长春花属生物碱、表鬼臼毒素及紫杉烷；拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基蛋白转移酶(prenyl-protein transferase)抑制剂；铂配位络合物；激酶抑制剂，包括多激酶抑制剂及/或Src激酶或Src/abl的抑制剂；信号转导抑制剂；及用作抗癌药及细胞毒性药物的其它药物，诸如生物应答调节剂、生长因子和免疫调节剂。式X的化合物亦可与放射治疗组合使用。

可与本发明的化合物组合使用的抗癌药的其它实例包括Src激酶抑制剂即N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺及以引用方式并入本文中的美国专利第6,596,746号及2005年2月4日提交的美国专利申请第11/051,208号中所述的其它化合物；伊沙匹隆(一种氮杂埃坡霉素B类似物)及/或在美国专利第6,605,599号、第6,262,094号、第6,288,237号、第6,291,684号、第6,359,140号、第6,365,749号、第6,380,395号、第6,399,638号、第6,498,257号、第6,518,421号、第6,576,651号、第6,593,115号、第6,613,912号、第6,624,310号、2003年3月公开的美国申请公开号2003/0060623、德国专利第4138042.8号、WO97/19086、WO 98/22461、WO 98/25929、WO 98/38192、WO 99/01124、WO99/02224、WO 99/02514、WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO99/28324、WO 99/43653、WO 99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253、WO 00/00485、美国专利申请公开号2004/0053910及2004/0152708中所述的其它埃坡霉素类似物、WO99/24416中披露的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(亦参见美国专利第6,040,321号)、WO 97/30992及WO 98/54966中披露的异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂、美国专利第6,011,029号中披露的法尼基蛋白转移酶药物、PCT公开号WO 01/14424中披露的CTLA-4抗体及/或PCT公开号WO 00/37504中披露的CTLA-4抗体(诸如称为CP-675206(ticilimunab)的抗体)或ORENCIA、MDX-010、长春氟宁(vinflunine)(Javlor^TM)及Erbitux(西妥昔单抗(cetuximab))。

可能用于与本发明的化合物组合的其它药物可包括紫杉醇(TAXOL

)、多西紫杉醇(TAXOTERE

)和各种其它药物(诸如羟基脲、丙卡巴肼、米托坦、六甲密胺、顺铂及卡铂、Avastin及赫赛汀(Herceptin))。

根据本发明制备的药物组合物亦可与因其在与上述病况相关的给药治疗中特别有用而选择的其它治疗剂配制在一起或组合给药。举例而言，本发明的药物组合物可与诸如抗呕剂以及H₁及H₂抗组胺剂那样的预防恶心、超敏反应及胃刺激的药物配制在一起。

上述其它治疗剂当与本发明的化合物组合使用时可例如以Physicians’Desk Reference(PDR)中所示的量或以本领域技术人员另外确定的量来使用。

本发明的一个实施方案包括本发明的化合物在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途，特别是在制备用于对过度表达或优先表达叶酸受体的肿瘤进行靶向药物递送的药物组合物中的用途。本发明的药物组合物可通过任何合适的方法(例如非经肠，诸如通过皮下、静脉内、肌肉内或胸骨内注射或输注技术(例如以无菌可注射水性溶液或非水性溶液或悬浮液的形式))且/或以含有无毒可药用媒介或稀释剂的剂量单位制剂来给药，用于本文所述用途中的任何一种。本发明的药物组合物可例如以适于立即释放或延迟释放的形式来给药。立即释放或延迟释放可通过以下方法来实现：使用包含本发明化合物的合适药物组合物，或尤其在延迟释放的情况下，使用诸如皮下植入物或渗透泵那样的装置。

用于非经肠给药的示范性组合物包括可注射的溶液或悬浮液，其可含有例如合适的无毒的非经肠可接受的稀释剂或溶剂，诸如甘露醇、1，3-丁二醇、水、林格溶液(Ringer’s solution)、等张氯化钠溶液(0.9％氯化钠注射液[生理盐水]或5％右旋糖注射液)，或可含有其它合适的分散剂或湿润剂及助悬剂，包括合成的甘油一酯或甘油二酯及脂肪酸。用于给药本发明的化合物的可药用组合物及/或方法可包括使用共溶剂，所述共溶剂包括但不限于乙醇、N，N-二甲基乙酰胺、丙二醇、甘油及聚乙二醇(例如聚乙二醇300及/或聚乙二醇400)；用于给药本发明的化合物的可药用组合物及/或方法可包括使用表面活性剂(可通过减小化合物的表面张力而用于增强其分散性质或湿润性质的可药用表面活性剂)，所述表面活性剂包括但不限于CREMOPHOR

、SOLUTOL HS 15

、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆(poloxamer)、诸如N-烷基吡咯烷酮(例如N-甲基吡咯烷酮)及/或聚乙烯基吡咯烷酮那样的吡咯烷酮；用于给药本发明的化合物的可药用组合物及/或方法亦可包括使用一种或多种“缓冲剂”(例如在添加增量的酸或碱后能够抵抗介质有效酸度或碱度变化的成份)，所述缓冲剂包括但不限于磷酸钠、柠檬酸钠、二乙醇胺、三乙醇胺、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、碳酸钠、氨丁三醇(a/k/a三[羟基甲基]氨基甲烷或Tris)及/或它们的混合物。

本发明的化合物的有效量可由本领域技术人员来确定，且包括约0.01-10mg活性化合物/kg体重的示范性成人日剂量，其可按单一剂量的形式给药或按分份剂量的形式(诸如每天1至4次)给药。优选的范围包括约0.02至5mg/kg体重的剂量，而约0.05-0.3mg/kg体重的范围是最优选的。应该理解的是，用于任何特定受试者的具体剂量水平及给药频率可发生变化且取决于多种因素，这些因素包括所使用的特定化合物的活性、所述化合物的代谢稳定性及作用持续时间、受试者的物种、年龄、体重、一般健康情况、性别及饮食、给药模式及时间、排泄速率、药物组合及具体病况的严重程度。接受治疗的优选受试者包括患有与微管稳定性相关的病况的动物，最优选为哺乳动物物种，诸如人类及家畜(诸如狗、猫等)。

已在一项或多项以下所述的测定及/或本领域已知的测定中对本发明的化合物(诸如在一个或多个以下实施例中所披露的化合物)进行了试验，且这些化合物显示出作为微管稳定剂的可测量的活性水平。

测定

克隆细胞(clonogenic cell)存活测定

用不含叶酸但含有10％胎牛血清及25mM HEPES的10ml RPMI1640培养基将癌细胞以3.0E+05个细胞接种于T75烧瓶中。使细胞在含有5％CO₂的37℃培养箱中生长2天。在第2天将上清液自烧瓶除去，且将烧瓶分为两组。一组细胞用含有100M叶酸(Sigma)的5ml培养基培养30分钟，且其它细胞在未添加叶酸的5ml培养基中生长。接着用20nM埃坡霉素、埃坡霉素类似物、接合埃坡霉素或接合埃坡霉素类似物处理细胞1小时。在培养结束时将药物自烧瓶除去且用PBS缓冲液洗涤细胞3次。洗涤后将5ml完全培养基加到各烧瓶中，且使细胞在CO₂培养箱中生长23小时。次日早晨，通过胰酶消化将细胞自烧瓶取出，确定细胞数目，且接着将细胞涂布于6孔板中。在涂布后10天，用结晶紫对群落进行染色且计数。确定存活分数。

体外MTS增殖/细胞毒性测定

在肿瘤细胞中使用基于四唑鎓的比色测定来对体外细胞毒性进行评估，所述测定利用MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-亚磺酰基)-2H-四唑鎓内盐)代谢转化为吸收492nm光的还原形式。细胞在添加埃坡霉素、埃坡霉素类似物、接合埃坡霉素或接合埃坡霉素类似物前24小时接种。在与连续稀释的化合物一起在37℃培养72小时后，将MTS以及电子偶联剂即吩嗪甲硫酸盐(phenazine methosulphate)添加至细胞中。继续培养3小时，接着用分光光度计测量492nm处培养基的吸光度，得到存活细胞相对于对照群体的数目。结果以中值细胞毒性浓度(IC₅₀值)表示。

叶酸受体测定

用于FR测定的所有样品制备程序在4℃进行。使用PowerGen 125均质机将组织样品在均质化缓冲液(10mM Tris，pH 8.0，亮肽酶素及抑肽酶各为0.02mg/ml；1ml缓冲液/50mg组织)中均质化。通过温和离心(3000×g，15min)将大的碎片除去。接着通过以40,000×g离心60分钟而收集膜沉淀，且将其重新悬浮于助溶缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，25mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，5mM EDTA及0.02％叠氮化钠)中。通过再一次离心(40,000×g，60分钟)将不溶物质除去，且通过二金鸡纳酸(bicinchoninic acid，BCA)方法(Pierce Chemical)确定上清液的总蛋白质浓度。接着以助溶缓冲液将各样品稀释至0.25mg/ml，且将100μl置于两台Microcon-30微型浓缩器(30,000-MW cutoff，Millipore)的每一台内。接着在室温以14,000×g使样品离心10分钟，使所有液体通过膜，且使经增溶的FR保留在微型浓缩器膜的表面上。使用上述相同的参数进行所有随后的离心步骤。接着将55μl 30mM乙酸盐缓冲液(pH 3.0)添加至各微型浓缩器中，随后进行离心步骤。接着将55μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)分配至各微型浓缩器中，接着进行又一次离心。接着将50μl[³H]叶酸结合试剂(120nM[³H]叶酸(Amersham)在含有500mMNaCl、2.7mM KCl及25mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷的10mM Na₂PO₄和1.8mM KH₂PO₄(pH 7.4)中)或50μl竞争试剂(结合试剂加上120μM未标记的叶酸)添加至适当的浓缩器中。在室温培养20分钟后，浓缩器用75μl 50mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和0.7M NaCl的PBS溶液(pH 7.4)洗涤/离心三次。最终洗涤后，通过用100μl含有4％Triton X-100的PBS冲洗两次，自微型浓缩器的膜表面回收含有经增溶的FR的保留物。接着在液体闪烁计数器(Packard Bioscience)中对样品进行计数。基于已知标准品的cpm将计数/分钟(cpm)值换算成FR的皮摩尔数，且根据样品的蛋白质含量对最终结果进行归一化。

动物及肿瘤

在这些研究中使用保持在受控环境中且以适量水及食物供应的雌性CD2F1小鼠(Harlan Sprague-Dawley Inc.，20-22g)。鼠科FRα(-)Madison109(M109)肺癌(Marks等人，1977)及表达FR的(FRα(+))98M109变体用于评估埃坡霉素、埃坡霉素类似物(例如埃坡霉素衍生物)、叶酸-埃坡霉素接合物或叶酸-埃坡霉素类似物接合物的功效。此外，在裸鼠中生长的人类头及颈表皮样癌KB亦用于此目的。

药物治疗及抗肿瘤功效评估

为了将埃坡霉素或埃坡霉素类似物给药小鼠，使用由以下物质组成的赋形剂：CREMOPHOR

/乙醇/水(1∶1∶8，v/v)。将化合物首先溶解于CREMOPHOR

/乙醇(50∶50)的混合物中。在药物给药前1小时以内进行最终稀释直至所需剂量强度。通过经尾静脉的静脉内推注注射将药物给药小鼠。将叶酸-埃坡霉素接合物或叶酸-埃坡霉素类似物接合物配制在无菌磷酸盐缓冲盐水中且通过经尾静脉的静脉内推注注射以0.01mL/g小鼠的体积给药小鼠。对各动物进行的治疗基于各自的体重。

在实验开始时，集中检测有意义应答所需数量的动物，且对各动物进行肿瘤浆(2％w/v)的皮下接种。使肿瘤生长4天。在第4天，将动物平等地分至各个治疗组及对照组。每天核查经治疗动物的治疗相关毒性/死亡率。在治疗开始前称重各组动物(Wt1)，然后在最后治疗给药后再次称重各组动物(Wt2)。体重之差(Wt2-Wt1)提供了治疗相关毒性的测量结果。

每周两次通过用测径器测量肿瘤来确定肿瘤应答，直至肿瘤达到预定的“靶标”大小即1克。肿瘤重量(mg)根据下式来估计：

肿瘤重量＝(长度×宽度²)÷2。

以最大耐受剂量(MTD)来评估抗肿瘤活性，其中刚好在MTD所定义的剂量水平以下出现过度毒性(即死亡多于一只)。当出现死亡时，记录死亡日期。在肿瘤达到靶标大小前死亡的经治疗小鼠被视为因药物毒性而死亡。对照小鼠在死亡时都具有在靶标大小以上的肿瘤。因药物毒性而死亡多于一只的治疗组被视为接受了过度毒性治疗，且其数据不包括在对化合物抗肿瘤功效进行的评估中。

以肿瘤生长延迟(T-C值)表示肿瘤应答终点，所述肿瘤生长延迟被定义为经治疗的肿瘤(T)达到预定靶标大小所需时间(天)与对照组(C)达到预定靶标大小所需时间(天)的差。

为了评估肿瘤细胞杀灭作用，首先根据下式计算肿瘤体积翻倍时间(TVDT)：

TVDT＝对照肿瘤达到靶标大小的中值时间(天)-对照肿瘤达到一半靶标大小的中值时间(天)，和

对数细胞杀灭作用＝T-C÷(3.32×TVDT)

使用格翰氏广义威尔卡逊检验(Gehan’s generalized Wilcoxon test)来对数据进行统计学评价。

缩写

为了便于参考，在本文的流程及实施例中使用以下缩写：

CBZ-OSu＝N-(苄氧羰基氧基)琥珀酰亚胺

DCM＝二氯甲烷

DEA＝二乙胺

DIAD＝偶氮二羧酸二异丙酯

DIPEA＝二异丙基乙胺

DMA＝二甲胺

DMF＝二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲基亚砜

EDC＝1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

EtOH＝乙醇

EtOAc＝乙酸乙酯

FR＝叶酸受体

HOBt＝N-羟基苯并三唑

HPLC＝高效液相色谱

iPr-OH或IPA＝异丙醇

LC/MS＝液相色谱/质谱

LDA＝二异丙基氨基锂

MeOH＝甲醇

OTES＝o-三乙基硅基

OMs＝甲磺酸酯基团

Ph＝苯基

Pd/C＝钯/碳

PyBOP＝苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

Py＝吡啶基

RT＝室温

Sat’d＝饱和

THF＝四氢呋喃

TFA＝三氟乙酸

TLC＝薄层色谱

TESCL＝三乙基氯硅烷

UV＝紫外线

制备方法

本发明的化合物一般可根据以下流程及本领域技术人员的知识及/或使用在美国专利第6,605,599号、第6,831,090号、第6,800,653号、第6,291,684号、第6,719,540号、第7,172,884号、美国专利申请公开号2005/0002942及Organic Letters，2001，3，2693-2696(在此将这些文献所披露的内容引入作为参考)中及/或在以下实施例中所述的方法来制备。

如流程1中所示，可自式II的化合物来制备式X的化合物。式II的化合物可通过发酵(参见例如Gerth等人，“Studies on the Biosynthesis ofEpothilones：The Biosynthetic Origin of the Carbon Skeleton”，Journal ofAntibiotics，第53卷，第12号(2000年12月)及Hofle等人，“Epothilone A andB-Novel 16-Membered Macrolides：Isolation，Crystal Structure，andConformation in Solution”，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，第35卷，第13/14号，1567-1569(1996)，在此将这些文献所披露的内容引入作为参考)或通过合成(参见例如Vite等人的美国专利第6,605,599号、第6,242,469号、第6,867,333号、美国专利申请公开号2006/004065及Johnson等人，Organic Letters，2000，2：1537-1540，在此将这些文献所披露的内容完整引入作为参考)来得到。举例而言，其中R₂、R₃、R₄、R₅及R₁₂为甲基、B₁为羟基、R₁及R₆为氢且R₂为2-甲基噻唑-4-基的式II的化合物称为埃坡霉素A且如以上所述可通过对纤维堆囊菌进行发酵而得到。式II的化合物可转化为其中P为硅基保护基(诸如三乙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、三异丙基硅基等)的式III的化合物(参见例如Greene等人，“Protective groups in OrganicSynthesis”，John Wiley and Sons，Inc.)。例如，其中P为三乙基硅基的式III的化合物可通过在Hunig碱(Hunig’s base)的存在下用三乙基氯硅烷处理式II的化合物而制备。在B₁在式II的化合物中为羟基的情况下，B₁亦可转化为相应的硅基醚。式IV的卤醇(Y为Cl、Br或I)可通过本领域中已知的方法通过用金属卤化物盐处理式III的化合物而自式III的化合物制备。举例而言，在低温(-20至-5℃)使用溴化镁乙醚合物来使环氧化物开环，这可得到非对映异构的卤醇，其中Y为溴。式V的化合物可通过使用例如在诸如二甲基甲酰胺那样的极性溶剂中的叠氮化钠来置换卤素而自式IV的化合物制备。本领域技术人员可理解的是，流程I中所示C₁₂处的立体化学不应该被视为限制性的，而应该被视为示范性的。如果需要，则可按照本领域中所确定的三信(Mitsunobu)方案来实现C₁₂位置处的立体化学的反转。例如，用对硝基苯甲酸、偶氮二羧酸二乙酯及三苯基膦处理式V的化合物，得到相应的硝基苯甲酸酯，其可接着通过使用例如氨甲醇溶液进行温和酯水解而裂解，得到式VI的化合物。再次地，化合物VI中所示C₁₂处的立体化学为非限制性的，且如此图示以显示如所述那样对化合物V进行的处理可反转所述位置处的立体化学。或者，其它有机酸、偶氮二羧酸酯及有机膦可用于实现三信反转。其中OG为离去基团(诸如甲磺酸酯基团、甲苯磺酸酯基团、硝基苯磺酸酯基团、三氟甲磺酸酯基团等)的式VII的化合物可通过本领域中已知的方法自式VI的化合物来制备。例如，在诸如二氯甲烷那样的合适有机溶剂中用甲磺酰氯及三乙胺处理VI，得到其中OG为甲磺酸酯基团的式VII的化合物。式VIII的化合物可通过用诸如有机膦(例如三甲基膦)那样的还原剂使叠氮基还原而自式VII的化合物制备。或者，可使用诸如三苯基膦那样的有机膦还原剂而自式VI的化合物直接制备式VIII的化合物。式IX的化合物可通过本领域中已知的方法自式VIII的化合物来制备(参见例如美国专利第6,800,653号及Regueiro-Ren等人，Organic Letters，2001，3，2693-2696)。举例而言，其中H-K-A-为2-羟基乙基的式IX的化合物可通过使用例如过量的2-溴乙醇及诸如碳酸钾那样的碱来对氮丙啶环进行烷基化而自式VIII的化合物制备。式X的化合物可通过使用本领域中已知的方法来除去硅基醚保护基而自式IX的化合物制备(参见例如Greene等人，“Protective groups in Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，Inc.)。例如，当P为三乙基硅基时，在二氯甲烷中用三氟乙酸处理式IX的化合物，实现脱保护，得到式X的化合物。

流程1

流程2显示了制备具有叶酸类似物基团或衍生物基团V和二价连接基团T-Q的式XI化合物的方法，所述式XI的化合物可与本发明的化合物一起使用，以制备用于靶向药物递送的接合分子，例如先前描述的式I化合物。如流程2所示，叶酸类似物基团和二价连接基团可使用本领域中已知的方法来组装，特别在V为叶酸或叶酸类似物(参见例如Jackson等人，AdvancedDrug Delivery Rev.56(2004)1111-1125，在此将其所披露的内容引入作为参考)及T-Q为肽的情况下。例如，肽基叶酸XI可如流程2中所示来制备。用经Fmoc(芴基甲氧羰基)保护的天冬氨酸、精氨酸、天冬氨酸及谷氨酸对负载有半胱氨酸的聚苯乙烯树脂进行连续的肽偶联，这可使用PyBOP作为偶联剂及使用哌啶作为Fmoc脱保护剂而实现。N¹⁰经三氟乙酰胺基团保护的喋酸可通过将叶酸酶促(羧肽酶G)转化为喋酸且接着使用三氟乙酸酐对N¹⁰进行保护而以两步来制备。接着，使N¹⁰经保护的喋酸与树脂所结合的肽发生偶联，随后用三氟乙酸自树脂裂解且使用氢氧化铵除去N¹⁰上的三氟乙酰基，得到式I的化合物的V-T-Q片段，其中V为叶酸基团且T-Q为-Asp-Arg-Asp-Cys-OH。或者，可使用喋酸类似物替代喋酸，且可使用其它氨基酸替代流程2中所说明的那些氨基酸。

流程2

以下流程3显示了使用本发明的埃坡霉素衍生物来制备用于靶向药物递送的式I接合分子的方法。如流程3中所示，可通过逐步引入可释放的连接基团M来使式X的化合物与片段V-T-Q发生偶联，由此实现式I的化合物的组装。举例而言，其中-A-K-H为-CH₂CH₂OH的式X的化合物可使用经苯并三唑活化的式XII的化合物来转化为二硫基乙基碳酸酯(disulfanylethyl carbonate)XIII。式XII的化合物可自巯基乙醇、甲氧羰基硫基氯(methoxycarbonyl sulfenyl chloride)及任选经取代的2-巯基吡啶来制备，得到中间体2-(2-吡啶-2-基二硫基)乙醇，其可接着通过用双光气(diphosgene)及任选经取代的1-羟基苯并三唑处理而转化为式XII的化合物。随后二硫化物与诸如XI那样的肽基叶酸进行交换，得到式I化合物，其中V为叶酸，T-Q为-Asp-Arg-Asp-Cys-OH，M为-SCH₂CH₂O(C＝O)-，A为-CH₂CH₂-，且K为O。

流程3

流程4显示了自式XIV的化合物制备式X的化合物的可替换方法(参见2006年5月25日提交的美国专利申请号60/940,088，在此将其完整引入作为参考)。式XIV的化合物可通过本领域中熟知的方法来得到，例如通过发酵(参见例如Gerth等人，“Studies on the Biosynthesis of Epothilones：TheBiosynthetic Origin of the Carbon Skeleton”，Journal of Antibiotics，第53卷，第12号(2000年12月)及Hofle等人，“Epothilone A and B-Novel 16-MemberedMacrolides：Isolation，Crystal Structure，and Conformation in Solution”，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，第35卷，第13/14号，1567-1569(1996)，在此将这些文献所披露的内容引入作为参考)或通过全合成(参见例如Vite等人的美国专利第6,605,599号、第6,242,469号、第6,867,333号及美国专利申请公开号2006/004065，在此将这些文献所披露的内容完整引入作为参考)来得到。举例而言，其中R₂、R₃、R₄、R₅及R₁₂为甲基、B₁为羟基、R₁及R₆为氢且R₂为2-甲基噻唑-4-基的式XIV的化合物被称为埃坡霉素C，且如上所述可通过对纤维堆囊菌进行发酵而得到。式XIV的化合物可转化为其中P为硅基保护基(诸如三乙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、三异丙基硅基等)的式XV的化合物(参见例如Greene等人，“Protective groups inOrganic Synthesis”，John Wiley and Sons，Inc.)。例如，其中P为三乙基硅基的式XV的化合物可通过在诸如Hunig碱那样的碱的存在下用三乙基氯硅烷处理式XIV的化合物而制备。在B₁在式XIV的化合物中为羟基的情况下，B₁亦可转化为相应的硅基醚。式XVI或XVII的卤醇(Y为Cl、Br或I)可通过用卤代试剂诸如Y₂处理式XV的化合物而自式XV的化合物制备。例如，在诸如乙腈那样的极性溶剂中使用碘进行亲电子加成，这可立体选择性地得到区域异构的式XVI及XVII的卤醇，其中Y为碘。或者，N-卤素琥珀酰亚胺亦可用于相同的转化。可通过在诸如乙腈/水那样的极性/水性溶剂系统中在诸如三乙胺或Hunig碱那样的碱的存在下进行环氧化物环合而自式XVI及/或XVII的化合物制备式XVIII的化合物。如果需要，化合物XIV可直接转化为式XVI及/或XVII的化合物(其中P为H)，其可接着转化为环氧化物XVIII(其中P为H)。式XVIII的化合物可通过在醇溶剂中在无机叠氮化物盐或叠氮化四烷基铵的存在下进行叠氮化物基团置换而转化为式VI及XIX的叠氮基醇。在P为硅基保护基的情况下，其中0G为离去基团(诸如甲磺酸酯基团、甲苯磺酸酯基团、硝基苯磺酸酯基团、三氟甲磺酸酯基团等)的式XX及/或XXI的化合物可通过本领域中已知的方法自式VI及/或XIX的化合物来制备。例如，在诸如二氯甲烷那样的合适有机溶剂中用甲磺酰氯及三乙胺处理VI及/或XIX，得到其中OG为甲磺酸酯基团的式XX及XXI的化合物。式VIII的化合物可经由本领域中已知的方法通过对式XX及/或XXI的化合物进行叠氮基还原而自式XX及/或XXI的化合物制备。例如，化合物VIII可通过在诸如乙腈那样的极性溶剂中使式XX及/或XXI的化合物与诸如有机膦(例如三甲基膦)那样的还原剂反应而自式XX及/或XXI的化合物制备。或者，当P为H时，式VIII的化合物可通过在诸如乙腈那样的极性溶剂中用诸如有机膦(例如三苯基膦)那样的还原剂使叠氮基还原而自式VI及/或XIX的化合物直接制备。式IX的化合物可通过本领域中已知的方法自式VIII的化合物制备(参见例如美国专利第6,800,653号及Regueiro-Ren等人，Organic Letters，2001，3，2693-2696)。举例而言，其中H-K-A-为2-羟基乙基的式IX的化合物可通过使用例如过量的2-溴乙醇及诸如碳酸钾那样的碱来对氮丙啶环进行烷基化而自式VIII的化合物制备。在P为三烷基硅基的情况下，式X的化合物可通过使用本领域中已知的方法来除去硅基醚保护基而自式IX的化合物制备(参见例如Greene等人，“Protective groups in Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，Inc.)。举例而言，当P为三乙基硅基时，在二氯甲烷中用三氟乙酸处理式IX的化合物，实现脱保护，得到式X的化合物。

流程4

根据以下示范性的实施例来进一步描述本发明。

实施例

实施例1：叶酸接合埃坡霉素类似物

如以上发明内容中所述，叶酸的类似物及衍生物描述于Vlahov中。在针对接合埃坡霉素及埃坡霉素类似物化合物的叶酸受体靶向肿瘤细胞的研究与开发中，将一些化合物与叶酸接合。例如，化合物AA与化合物BB被视为与叶酸接合的候选对象。

化合物AA 化合物BB

化合物AA在II期临床试验中具有活性，且制备了化合物AA的六种叶酸基团接合物(化合物AA.I至AA.VI)(参见图1)且在细胞培养中任选测试了其化学稳定性、FR结合及FR所介导的活性。

化合物AA的这些叶酸基团接合物与FR的结合在以下测定中确定，所述测定测量从在生长至融合的KB肿瘤细胞上表达的FR置换放射性标记的叶酸的程度。叶酸基团接合物即化合物AA.I及AA.II与FR的结合被认为是可接受的[相对亲和力(RA)大于0.25；叶酸的RA等于1.0]。然而，令人惊讶的是，图1中所示化合物AA的六种接合物中没有一种接合物在测量³H-胸苷引入程度的抗增殖测定中显示出对抗KB肿瘤细胞的明显细胞毒性(数据未显示)。

由于化合物AA的接合物显示出不令人满意的对抗肿瘤细胞的细胞毒性，故使用化合物BB的三种接合物(化合物BB.I至BB.III)进行研究。化合物BB亦称为埃坡霉素F，且为化合物AA的类似物，其中21-氨基被21-羟基代替。尽管化合物BB.II(图2)在高浓度时显示出细胞毒性，但活性在使用过量叶酸的竞争研究中没有衰减。因此，所观测的细胞毒性归因于化合物BB.II的非特异性释放。

其它埃坡霉素类似物(例如氮杂环丙基埃坡霉素)在本领域中是已知的(参见例如美国专利第6,399,638号和Regueiro-Ren，A等人，(2001)Org.Letters.3：2693-96)且显示出有效的抗肿瘤细胞毒性。例如，进行以下MTS测定：对多种埃坡霉素类似物对抗一对耐紫杉烷癌细胞系(HCTVM46与A2790Tax)的相对细胞毒性效能进行比较(参见表1)。HCTVM46为源自敏感性HCT116母系的人类结肠癌细胞系，且由于170kD p-糖蛋白药物流出转运体的过度表达而对紫杉烷有抗性。A2780Tax为源自A2780母系的人类卵巢癌细胞系，且由于微管蛋白氨基酸序列的突变使结合紫杉醇的能力削弱而对紫杉醇有抗性。

如表1中所示，与其它已知的抗肿瘤剂(例如紫杉醇、化合物AA及埃坡霉素B)相比，各种氮杂环丙基埃坡霉素类似物(化合物CC-EE)显示出对抗HCT116结肠癌细胞系及A2780卵巢癌细胞系的强效抗肿瘤活性。

表1.12，13-氮杂环丙基埃坡霉素的体外活性

化合物	R	HCT116 IC₅₀(nM)¹	R/S比值²	A2780 IC₅₀(nM)¹	R/S比值³
						CC	-H	4.2±2.8	3.1	3.4±1.5	4.7
DD	-CH₃	0.37±0.13	0.6	0.25±0.06	4.1
						EE	-CH₂CH₂OCH₃	0.40±0.25	0.8	0.22±0.12	4.7
紫杉醇	-	3.3±1.0	150	3.1±1.0	22.1
						AA	-	1.2±0.3	14.8	1.1±0.4	3
埃坡霉素B	-	0.40±0.13	0.5	0.23±0.09	2.5

¹平均IC₅₀±SD，由四组单独实验进行计算。

²R/S比值＝HCT116 IC₅₀/HCT116VM46 IC₅₀

³R/S比值＝A2780 IC₅₀/A2780Tax IC₅₀

不论氮杂环丙基埃坡霉素化合物CC-EE的抗肿瘤活性如何，这些分子上可用于与叶酸接合的仅有羟基为存在于C₃及C₇碳原子上的羟基。因此，在对多种坡霉素化合物及类似物进行研究后，仍需要发现可容易地与叶酸发生接合且可经由活性埃坡霉素部分在肿瘤细胞中的特异性释放而显示出活性的化合物。

发现了具有下式的氮杂环丙基埃坡霉素化合物G：

化合物G

化合物G(参见实例2及3)令人惊讶地显示出容易与叶酸接合形成化合物J(参见实例2)，当与叶酸相比时，其针对叶酸受体的相对亲和力为0.77。

预料不到的是，氮丙啶侧链上的极性羟基不对氮丙啶埃坡霉素类似物的抗肿瘤活性产生不利的影响。这是重要的，原因在于氮丙啶埃坡霉素类似物(例如化合物G)在自叶酸释放后介导抗肿瘤作用。化合物G及三种其它高度有效的埃坡霉素类似物(伊沙匹隆、化合物AA及化合物BB)的效能通过以上所述的群落形成测定来评估。在药物暴露持续17小时后确定杀灭90％克隆KB癌细胞所需的浓度(IC₉₀)。如图3中所示，化合物G呈现的IC₉₀为4.3nM，且效能分别为化合物CC、化合物AA及伊沙匹隆的约2倍、约4倍及约6倍。

化合物G接合形成化合物J，这不影响化合物G的抗肿瘤活性。化合物J在体内显示出相当高的对抗肿瘤细胞的细胞毒性活性。在KB体内FRα(+)肿瘤模型中，化合物J在最大耐受剂量(MTD)时及在产生最小毒性的两个较低剂量水平时显示出活性(参见图4)。相反地，伊沙匹隆仅在其MTD(5μmol/kg)时有活性。当在MTD时进行比较时，化合物J产生比伊沙匹隆好的抗肿瘤作用(图4)。

化合物J

相反地，在FRα(-)M109母瘤模型中，化合物J在所试验的所有剂量水平时(包括在其MTD(2.4μmol/kg)时)都只有弱的活性，而伊沙匹隆在其MTD(5μmol/kg)时有活性(图5)。这些结果表明FRα(-)M109对伊沙匹隆敏感且化合物J的无活性可能在很大程度上是由于这种肿瘤不表达FRα。这些结果亦提供了以下证据：化合物J的抗肿瘤活性可能经由FRα受体来介导。

有关FRα介导的化合物J的药物递送机制的另外证据是，观测到共给药20倍过量于化合物J剂量的叶酸类似物可充分与化合物J竞争与受体的结合且使FRα(+)98M109肿瘤免于受化合物J抗肿瘤作用的影响(图6)。由于化合物G及接合物(化合物J)在体外及在体内具有令人惊讶的抗肿瘤作用且由于化合物J的抗肿瘤活性可归因于FRα(+)所介导的作用，故本文亦描述了氮杂环丙基埃坡霉素类似物化合物G发生接合(参见实例2及3)，形成化合物J(参见实例2)。

实施例2：制备化合物J

(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢喋啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((R)-1-羧基-2-(2-(2-((2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙氧基)羰基氧基)乙基)二硫基)乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸

A.[1S-[1R^＊，3R^＊(E)，7R^＊，10S^＊，11R^＊，12R^＊，16S^＊]]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-7，11-二[(三乙基硅基)氧基]-4，17-二氧杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮

将三乙基硅基氯(15.0mL，89.4mmol)添加至N₂气氛下的埃坡霉素A(5.0g，10.1mmol)、咪唑(3.40g，49.9mmol)及DIPEA(28.5mL，163.6mmol)在无水DMF(100mL)中的搅拌溶液中。添加完成后，将反应溶液在55℃(油浴温度)温热12小时，得到所要产物的单一斑点(tlc)。

将上述反应又重复两次。在高真空下对组合溶液中的DMF进行蒸馏。泡沫状残余物通过柱色谱(硅胶E.Merck 230-400目，600g；5∶95、10∶90及15∶85EtOAc/己烷)来纯化，得到19.4g(88.6％)呈白色固体的化合物A。

HPLC：ES Industries FluoroSep RP Phenyl，4.6×250mm，等度洗脱，30min，100％B(B＝90％MeOH/H₂O+0.2％H₃PO₄)，流速为1.0ml/min，UV为254nm，t＝23.15min。LC/MS(ES+)：722(M+H)。

B.制备[4S-[4R^＊，7S^＊，8R^＊，9R^＊，13S^＊，14S^＊，16R^＊(E)]]-14-溴-13-羟基-5，5，7，9-四甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4，8-二[(三乙基硅基)氧基]-1-氧杂环十六烷-2，6-二酮

将MgBr₂-Et₂O(3×2.13g，24.78mmol)以每两小时一次分三次添加至-20℃及N₂气氛下的[1S-[1R^*，3R^*(E)，7R^*，10S^*，11R^*，12R^*，16S^*]]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-7，11-二[(三乙基硅基)氧基]-4，17-二氧杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(5.0g，6.92mmol)在无水二氯甲烷(140mL)中的搅拌溶液中同时维持内部温度低于-5℃。约7小时后，将反应混合物用二氯甲烷稀释，且用饱和NaHCO₃洗涤2次，经无水Na₂SO₄干燥且在真空中蒸发，得到泡沫状物。残余物通过柱色谱(硅胶E.Merck230-400目，180g；5∶95、7.5∶92.5及12.5∶87.5EtOAc/己烷)来纯化，得到呈白色泡沫状物的化合物B(2.5g，45％产率)连同回收的起始原料(0.9g，18％)。

HPLC：ES Industries FluoroSep RP Phenyl，4.6×250mm，等度洗脱，30min，100％B(B＝90％MeOH/H₂O+0.2％H₃PO₄)，流速为1.0ml/min，UV为254nm，t＝14.37min(100％纯度)。LC/MS(ES+)：802(M+H)。

C.制备[4S-[4R^＊，7S^＊，8R^＊，9R^＊，13S^＊，14R^＊，16R^＊(E)]]-14-叠氮基-13-羟基-5，5，7，9-四甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4，8-二[(三乙基硅基)氧基]-1-氧杂环十六烷-2，6-二酮

在室温及N₂气氛下将叠氮化钠(8.01g，123.3mmol)及18-冠-6(3.26g，12.3mmol)添加至[4S-[4R^*，7S^*，8R^*，9R^*，13S^*，14S^*，16R^*(E)]]-14-溴-13-羟基-5，5，7，9-四甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4，8-二[(三乙基硅基)氧基]-1-氧杂环十六烷-2，6-二酮(9.9g，12.3mmol)在1.2L DMF中的溶液中。将澄清溶液在室温机械搅拌7天。将溶液用EtOAc(4L)稀释，且用H₂O(6×3L)洗涤。干燥(Na₂SO₄)有机层，且接着蒸发，得到9.2g粗产物。通过柱色谱(硅胶450g，5-15％EtOAc/己烷)得到6.7g(71％产率)呈白色泡沫状物的化合物C。

HPLC：YMC ODS-A S5，4.6×50mm，等度洗脱，30min，100％B(B＝90％MeOH/H₂O+0.2％H₃PO₄)，流速为4.0mL/min，UV为254nm，t＝2.00min。LC/MS(ES+)：765(M+H)。

D.制备[4S-[4R^＊，7S^＊，8R^＊，9R^＊，13R^＊，14R^＊，16R^＊(E)]]-14-叠氮基-5，5，7，9-四甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-13-[(4-硝基苯甲酰基)氧基]-4，8-二[(三乙基硅基)氧基]-1-氧杂环十六烷-2，6-二酮

将[4S-[4R^*，7S^*，8R^*，9R^*，13S^*，14R^*，16R^*(E)]]-14-叠氮基-13-羟基-5，5，7，9-四甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4，8-二[(三乙基硅基)氧基]-1-氧杂环十六烷-2，6-二酮(7.0g，9.15mmol)、4-硝基苯甲酸(3.82g，22.9mmol)及三苯基膦(6.0g，22.9mmol)溶解于THF(100mL)中。经5分钟添加偶氮二羧酸二乙酯(9.0mL 40％在甲苯中的溶液，22.9mmol)。将反应混合物在室温保持4小时，浓缩，然后通过硅胶色谱(逐步梯度为5％乙酸乙酯/己烷至15％乙酸乙酯/己烷)纯化，分离到呈白色泡沫状物的所述硝基苯甲酸酯(7.3g，87％)。

LC-MS：Phenomenex C18，4.6×50mm，等度洗脱，15min，100％B(B＝90％MeOH/H₂O+0.1％TFA)，流速为4.0mL/min，UV为220nm。保留时间＝8.9min。MS(ESI)M+H＝886.7。

E.制备[4S-[4R^＊，7S^＊，8R^＊，9R^＊，13R^＊，14R^＊，16R^＊(E)]]-14-叠氮基-13-羟基-5，5，7，9-四甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4，8-二[(三乙基硅基)氧基]-1-氧杂环十六烷-2，6-二酮

将所述硝基苯甲酸酯化合物D(7.3g，7.98mmol)溶解于乙酸乙酯(35mL)中且冷却至0℃。添加在甲醇中的氨(350mL 2M在甲醇中的溶液)，且在室温将反应混合物搅拌4小时，浓缩，然后通过硅胶色谱(逐步梯度为10％乙酸乙酯/己烷至30％乙酸乙酯/己烷)纯化，分离到呈玻璃状白色固体的[4S-[4R^*，7S^*，8R^*，9R^*，13R^*，14R^*，16R^*(E)]]-14-叠氮基-13-羟基-5，5，7，9-四甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4，8-二[(三乙基硅基)氧基]-1-氧杂环十六烷-2，6-二酮(5.97g，98％)。

LC-MS：Phenomenex C18，4.6×50mm，等度洗脱，5min，100％B(B＝90％MeOH/H₂O+0.1％TFA)，流速为4.0mL/min，UV为220nm。保留时间＝2.25min。MS(ESI)M+H＝765.66。

F.制备[1S-[1R^＊，3R^＊(E)，7R^＊，10S^＊，11R^＊，12R^＊，16S^＊]]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-7，11-二[(三乙基硅基)氧基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮

将[4S-[4R^*，7S^*，8R^*，9R^*，13R^*，14R^*，16R^*(E)]]-14-叠氮基-13-羟基-5，5，7，9-四甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4，8-二[(三乙基硅基)氧基]-1-氧杂环十六烷-2，6-二酮(5.97g，7.8mmol)及三乙胺(4.34mL，31.2mmol)溶解于二氯甲烷(85mL)中且冷却至0℃。经5分钟逐滴添加甲磺酰氯(1.8mL，23.4mmol)。10分钟后，将反应混合物自冰浴取出，且在室温搅拌。3小时后，将反应混合物吸收于饱和NaHCO₃(300mL)中，用二氯甲烷(3×100mL)萃取，经Na₂SO₄干燥，浓缩，且在未进一步纯化的情况下用于下一步。

将粗甲磺酸酯溶解于THF/H₂O(12∶1，130mL)中。添加三乙胺(2.2mL，16mmol)及三甲基膦(16mmol，16mL 1.0M在THF中的溶液)，且将反应混合物在室温搅拌。3小时后，将反应混合物在45℃加热7小时，浓缩，然后通过硅胶色谱(逐步梯度为2％甲醇/三氯甲烷至5％甲醇/三氯甲烷)纯化，分离到呈白色固体的化合物F(5.08g，两步得率为88％)。

LC-MS：Phenomenex C18，4.6×50mm，等度洗脱，5min，100％B(B＝90％MeOH/H₂O+0.1％TFA)，流速为4.0mL/min，UV为220nm，保留时间＝0.298min。MS(ESI)M+H＝721.58。

G.制备[1S-[1R^＊，3R^＊(E)，7R^＊，10S^＊，11R^＊，12R^＊，16S^＊]]-7，11-二羟基-17-[2-羟基乙基]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮

将K₂CO₃(1.4g，10.2mmol)及2-溴乙醇(0.52mL，7.3mmol)添加至乙腈(20mL)中的[1S-[1R^*，3R^*(E)，7R^*，10S^*，11R^*，12R^*，16S^*]]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-7，11-二[(三乙基硅基)氧基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(1.05g，1.46mmol)中，且加热至82℃。4小时后，添加另外的2-溴乙醇(0.52mL，7.3mmol)及K₂CO₃(1.4g，10.2mmol)。5小时后，添加另外的2-溴乙醇(0.21mL，2.92mmol)。3小时后，将反应混合物冷却至室温，经由硅藻土过滤，用乙腈(5×5mL)和二氯甲烷(2×5mL)洗涤，浓缩，且在未进一步纯化的情况下用于下一步。

将粗反应产物溶解于二氯甲烷(40mL)中，冷却至0℃，且添加三氟乙酸(8.0mL)。1小时后，将反应混合物浓缩，吸收于饱和NaHCO₃(200mL)中，用二氯甲烷(3×100mL)萃取，经Na₂SO₄干燥，浓缩，然后通过硅胶色谱(10％甲醇/二氯甲烷)纯化，分离到呈透明膜状物的[1S-[1R^*，3R^*(E)，7R^*，10S^*，11R^*，12R^*，16S^*]]-7，11-二羟基-17-[2-羟基乙基]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(化合物G)(0.62g，两步得率为79％)。

LC-MS：Waters Sunfire C18，4.6×50mm，梯度为经4分钟从0％B至100％B(A＝10％MeOH/H₂O+0.1％TFA；B＝90％MeOH/H₂O+0.1％TFA)，流速为4.0mL/min，UV为220nm。保留时间＝2.12min。MS(ESI)M+H＝537.52。

H.制备(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢喋啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((S)-1-羧基-2-巯基乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸

(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢喋啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((S)-1-羧基-2-巯基乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸通过固相肽合成自H-Cys(4-甲氧基三苯甲基)-2-氯三苯甲基-树脂开始以5步来合成。表2显示了合成中所用试剂的量。

表2

	mmol	当量	MW	量
					H-Cys(4-甲氧基三苯甲基)-2-氯三苯甲基-树脂(载量为0.57mmol/g)	1.14			2.0g
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(溶解于15mL DMF中)	1.14	2	411.5	0.938g
					Fmoc-Arg(Pbf)-OH(15mL DMF)	1.14	2	648	1.477g
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(溶解于15mL DMF中)	1.14	2	411.5	0.938g
					Fmoc-Glu-OtBu(15mL DMF)	1.14	2	425.5	0.970g
N¹⁰TFA喋酸(溶解于15mL DMSO中)	1.14	1.25	408	0.581g
					DIPEA	1.14	4	174	0.793g
PyBOP	1.14	2	520	1.185g

使用以下程序：

偶联步骤：

将氨基酸溶液、DIPEA及PyBOP添加至肽合成容器中的树脂中。对混合物进行鼓泡1小时，且用DMF及异丙醇洗涤3次。FMOC脱保护在各氨基酸偶联前通过用DMF中的20％哌啶处理2次(10min)而实现。对于各氨基酸偶联步骤，重复上述程序。

合成N¹⁰经TFA保护的喋酸：

将200g(0.453mol)叶酸添加至配备有加热套的22L机械搅拌的圆底烧瓶中的10L 0.1M三羟甲基氨基甲烷(tris base)溶液(121.1g三羟甲基氨基甲烷在10L水中)中。搅拌混合物，溶解叶酸，且接着添加500mg(3.67mmol)氯化锌。添加羧肽酶G(13×20单位小瓶(unit vial)(得自Sigma))且用1N HCl将pH值调至7.3，且在整个反应期间保持此pH值。使混合物避光，且在30℃加热8-10天(使用自动滴定器来保持pH值不变，这使得转化时间减少4-5天)。反应混合物通过分析型HPLC来监测，直至达到80％转化率(更大的转化率是期望的但不是最佳的)。通过使用6N HCl将溶液的pH值调至3.0而使产物自反应混合物沉淀出来。将浆液转移至离心小瓶中且以4000rpm离心10分钟。倾出上清液。接着如下直接纯化湿固体(湿固体可冷冻贮存或先冻干，然而湿固体在溶解前贮存于冷冻器中是更有效的)。将1.0M NaOH添加至700mL水中的40g粗喋酸中直至pH值为11.5。将混合物过滤(Whatman1型)且接着进行色谱(色谱柱：10×120cm；固定相：8kg DEAE纤维素；流动相：1.0M NaCl/0.01M NaOH，pH＝11.5；流速：17ml/min)。收集1升黄色馏分且通过HPLC对其进行分析。用6M HCl将含有纯喋酸的馏分调至pH值为3，使喋酸沉淀。使混合物以3000rpm离心20分钟。倾出上清液，且用水洗涤三次。将固体冻干至少72小时。残余的水对下一反应的影响是未知的。

在高真空下经P₂O₅使喋酸进一步干燥24小时以上(注意：在保护步骤中在没有此另外干燥步骤的情况下得到类似的结果)。随后将100g(0.32mol)喋酸添加至配备有机械搅拌器及氩气入口的5L圆底烧瓶中，且在高真空下贮存过夜。添加氩气，接着添加3500g(2316mL)三氟乙酸酐。用橡胶塞或氩气入口转接器密封烧瓶，且接着剧烈搅拌。使烧瓶避光且在室温及氩气气氛下搅拌7天(反应混合物通过对用水及DMSO各稀释20倍的等分试样进行HPLC来监测)。将混合物旋转蒸发至干燥且用2.5L水中的3％三氟乙酸处理。将混合物在室温搅拌过夜，使酸酐副产物水解。旋转蒸发，得到干燥固体。将固体悬浮于2L水中，且接着在250mL离心管中以3000rpm离心20分钟。除去上清液，且用水洗涤固体，并离心(4次)。将固体冻干3天，转移至琥珀色瓶中，且在高真空下在P₂O₅的存在下干燥2天(纯度≥95％；通过元素分析来评估残余的TFA)。

裂解步骤：

使用自92.5％(50mL)TFA、2.5％(1.34mL)H₂O、2.5％(1.34mL)三异丙基硅烷及2.5％(1.34mL)乙二硫醇制备的裂解试剂将受保护的中间体自树脂释放。将裂解试剂添加至反应容器(25mL)中。使氩气鼓泡经过混合物，历时1.5小时。将液体自容器抽出，且用剩余的试剂(3×8mL)洗涤树脂。通过旋转蒸发使挥发物浓缩至体积为10mL。添加乙醚(35.0mL)，实现沉淀。通过离心收集固体，且干燥，得到1.25g裂解产物。

脱保护步骤：

在碱性条件下除去喋酸部分中的N¹⁰-三氟乙酰基保护基。以10mL水中的250mg经保护的中间体开始，使用4∶1 H₂O∶氢氧化铵(1-2mL)将pH值调至9.3且维持1小时。1小时后，用1N HCl(约1mL)将pH值调至5，且通过制备型HPLC纯化产物，得到125mg化合物H。

HPLC纯化条件：

色谱柱：Waters NovaPak C₁₈ 300×19mm

溶剂A：10mM乙酸铵缓冲液(pH＝5)

溶剂B：乙腈

洗脱：以15mL/min的流速历时40min从1％B变为20％B

各反应的总产量：625mg

I.制备碳酸2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙酯2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙酯

1.制备2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙醇

将巯基乙醇(7.6mL，110mmol)逐滴添加至甲氧羰基硫基氯(10mL，110mmol)在二氯甲烷(100mL)中的冷却至0℃的溶液中。使反应混合物在0℃搅拌30分钟。此时，添加2-巯基吡啶(12.2g，110mmol)在二氯甲烷(160mL)中的溶液。使溶液在0℃反应1小时，且接着使其温热至室温，再反应一小时。观察到固体产物自溶液沉下。TLC(1∶1石油醚/EtOAc)显示已形成足够多的产物。将反应混合物浓缩至体积为125mL。经由布氏漏斗过滤混合物。用二氯甲烷洗涤滤饼且接着在真空下干燥过夜，得到呈盐酸盐的2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙醇(23.6g)。

TLC：R_f＝0.45

板：EMD硅胶60 F₂₅₄，5×10cm，250M

2.制备碳酸苯并[d][1，2，3]三唑-1-酯2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙酯

将双光气(2.28g，11.5mmol)在15mL无水二氯甲烷中的溶液在氩气下在圆底烧瓶中搅拌且通过冰/盐浴冷却。将具有2-(吡啶-2-基二硫基)乙醇(5.01g，22.4mmol)和三乙胺(2.25g，22.2mmol)在65mL无水二氯甲烷中的混合物的加料漏斗置于圆底烧瓶上。经20分钟逐滴添加混合物。使反应混合物温热至室温，且再搅拌一小时。对反应混合物进行的TLC分析显示起始原料被消耗，且形成“条纹状的(streaking)”极性较小的氯甲酸酯产物。TLC(6∶4 EtOAc∶己烷)：起始原料的R_F为0.4；氯甲酸酯产物的R_F为0.8。

将反应混合物在圆底烧瓶中在氩气下搅拌且通过冰/盐浴冷却。将3.02g22.4mmol HOBt和2.23g 22.0mmol三乙胺在10mL无水二氯甲烷中的混合物添加至固定于圆底烧瓶上的滴液漏斗中。将混合物缓慢添加至圆底烧瓶中，同时维持反应混合物温度为2℃。使反应混合物温热至室温，且搅拌过夜。接着在大气压力下将约27mL二氯甲烷自反应混合物蒸馏出来。随后使混合物冷却至室温且搅拌2小时。通过过滤收集固体，且用20mL二氯甲烷洗涤滤饼。接着通过旋转式蒸发器在40℃和真空下干燥固体，得到7.81g灰白色固体。通过¹H-NMR对此固体进行分析且确定为所要产物。

3.制备碳酸2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙酯2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙酯

将DMAP(1.2当量)及碳酸苯并[d][1，2，3]三唑-1-酯2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙酯(1.0当量)先后添加至0℃的[1S-[1R^*，3R^*(E)，7R^*，10S^*，11R^*，12R^*，16S^*]]-7，11-二羟基-17-[2-羟基乙基]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮在无水二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在0℃和氩气下搅拌且通过TLC每10分钟监测1次。必要时添加另外的DMAP(1.2当量)及化合物I(2)(1.0当量)直至所有化合物G被消耗。在0℃用MeOH(1mL)使反应淬灭，在真空下使溶剂除去，且残余物通过色谱(硅胶，DCM中的2.5-5％MeOH)来纯化，得到呈米色固体的标题化合物。以下在表3中列出了化合物的量及回收率。自2.95g化合物G得到的总产量为2.80g(67.9％)化合物I。

表3

	化合物G(mg)	化合物I(2)(mg)	DMAP(mg)	DCM(mL)	化合物I(mg)^*
						第1批	303	197×3	82.8×3	8.0	204
第2批	952	683×3	260×3	22.0	984
						第3批	921	661×3	251×3	22.0	761
第4批	775	556×3	211×3	18.0	851

^*各色谱纯化通常得到纯的产物以及有些不纯的产物(80-90％纯度)。将不纯的产物与来自下一批的粗产物合并，用于色谱纯化。对于第2批及第4批而言，进行两次色谱纯化。

J.制备(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢喋啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((R)-1-羧基-2-(2-(2-((2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙氧基)羰基氧基)乙基)二硫基)乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸

将15mL H₂O(使用前用氩气鼓泡10分钟)添加至在50mL离心管中的(S)-2-(4-((2-氨基-4-氧代-3，4-二氢喋啶-6-基)甲基氨基)苯甲酰氨基)-5-((S)-3-羧基-1-((S)-1-((S)-3-羧基-1-((S)-1-羧基-2-巯基乙基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基)-5-氧代戊酸(498mg，0.534mmol)中。将饱和NaHCO₃溶液(使用前用氩气鼓泡10分钟)逐滴添加至上述悬浮液中直至所得溶液的pH值达到6.9，同时用氩气鼓泡。快速添加在THF中的碳酸2-((1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-5，9-二氧代-4-氧杂-17-氮杂-二环[14.1.0]十七烷-17-基)乙酯2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙酯(400mg，0.534mmol)，且将所得均质溶液在氩气下搅拌30分钟。在15分钟时通过分析型HPLC检查反应进程。在分析型HPLC的条件下产物峰在约6.4分钟时出现。用约15mL磷酸盐缓冲液稀释混合物且在真空下将THF除去。将浑浊的溶液离心且过滤。将黄色滤液分为两份且通过制备型HPLC纯化。使纯的馏分(纯度大于98％)汇集且冻干。收集残余馏分(纯度小于98％)且每3-6轮色谱操作就重新纯化1次，得到700mg呈白色粉末的标题化合物(含有11.8重量％的水以及8.7重量％的钠盐及磷酸钠盐，通过Karl Fischer法及元素分析来确定)。

制备型HPLC参数：

色谱柱：Waters Nova-Pak HR C18 6μm 30×300mm

流动相A：7.0mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.2)

流动相B：乙腈

方法：以40mL/min的流速历时30分钟从10％B变为50％B

分析型HPLC参数：

色谱柱：Waters Symmetry C183.5μm 4.6×75mm

流动相A：10mM乙酸三乙基铵(TEAOAc)缓冲液(pH＝7.5)

流动相B：乙腈

方法：以1.0mL/min的流速历时10分钟从20％B变为40％B

精确质量m/z(C₆₇H₉₂N₁₆O₂₂S₃)：

计算值：1570.58907(M+2H)、785.29454(M+2H)²⁺、523.86563(M+3H)³⁺、393.15118(M+4H)⁴⁺

实测值：(M+2H)²⁺为785.29100(4.5ppm)，(M+3H)³⁺为523.86431(2.5ppm)，(M+4H)⁴⁺为393.14996(3.1ppm)

实施例3：可替换地制备化合物J

3A.制备[4S，7R，8S，9S，13R，14R，16S]-4，8，13-三羟基-14-碘-5，5，7，9-四甲基-16-[(E)-1-[2-甲基噻唑-4-基]丙-1-烯-2-基]氧杂环十六烷-2，6-二酮

将埃坡霉素C(54.3g，113.7mmol)溶解于乙腈(480mL)及水(50mL)中。将溶液冷却至-5℃至-10℃。将碘(144.3g，568.4mmol)添加至反应混合物中，且保持反应至少15小时。

用15％焦亚硫酸钠溶液(900mL)使反应淬灭。用乙酸乙酯(2×1.1L)萃取混合物。收集有机相，且依次用饱和碳酸氢钠溶液(675mL)及饱和氯化钠溶液(675mL)洗涤。在减压下使溶剂蒸发，得到呈黄色油状物的粗化合物A(85.6g)。化合物A在未进一步纯化的情况下用于下一反应中。

HPLC：Phenomex Luna C8(2)3μm，4.6×150mm，等度洗脱，18min，36％B，17min，56％B，(流动相A＝在ACN∶水(5∶95)中的0.01M NH₄OAc，流动相B＝在ACN∶水(95∶5)中的0.01M NH₄OAc)，流速为1.0ml/min，UV为245nm，Rt＝22.4min。

3B.制备[1R，3S，7S，10R，11S，12S，16S]-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-[(E)-1-[2-甲基噻唑-4-基]丙-1-烯-2-基]-4，17-二氧杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮

将[4S，7R，8S，10R，9S，13R，16S]-4，8，13-三羟基-14-碘-5，5，7，9-四甲基-16-[(E)-1-[2-甲基噻唑-4-基]丙-1-烯-2-基]氧杂环十六烷-2，6-二酮(85.6g)溶解于乙腈(670mL)及水(130mL)中。将三乙胺(135mL，968.5mmol)添加至溶液中。将反应混合物加热至50℃至60℃，保持至少8小时。

溶液冷却至室温后，在减压下使其浓缩。用EtOAc(1.2L)稀释残余物，且用饱和氯化钠溶液(3×500mL)洗涤。在减压下使溶剂蒸发，得到呈黄色油状物的粗产物。通过硅胶垫过滤(硅胶700g，庚烷中的66％EtOAc，2×4L及1×3L)来纯化，得到具有HPLC AP 80的呈泡沫状物的化合物B(50.3g，90％产率)。

HPLC：Phenomex Luna C8(2)3μm，4.6×150mm，等度洗脱，18min，36％B，17min，56％B，(流动相A＝在ACN∶水(5∶95)中的0.01M NH₄OAc，流动相B＝在ACN∶水(95∶5)中的0.01M NH₄OAc)，流速为1.0ml/min，UV为245nm，Rt＝15.0min。

3C/3D.制备(4S，7R，8S，9S，13R，14R，16S)-13-叠氮基-4，8，14-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮及(4S，7R，8S，9S，13S，14S，16S)-14-叠氮基-4，8，13-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮

将叠氮化钠(11.45g，174.41mmol)及氯化铵(3.14g，58.14mmol)添加至表埃坡霉素A(epi-Epothilone-A)(14.35g，29.07mmol)在乙醇(240mL)及水(48mL)中的搅拌溶液中。将混合物在60℃搅拌17-20小时。通过旋转蒸发器在减压下在低于50℃的温度使挥发物蒸发。将残余物溶解于乙酸乙酯(287mL)和水(50mL)的混合物中。使各相分离，且用乙酸乙酯(115mL)对下层水相进行萃取。用25％氯化钠水溶液(盐水)洗涤合并的有机相。在减压下使溶剂蒸发，且使残余物通过硅胶垫(用乙酸乙酯/正庚烷(2∶1)混合物洗脱)。减压下使溶剂蒸发，得到呈白色泡沫状物的以下两种叠氮基醇的区域异构体混合物(12.8g，82％)：(4S，7R，8S，9S，13R，14R，16S)-13-叠氮基-4，8，14-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮及(4S，7R，8S，9S，13S，14S，16S)-14-叠氮基-4，8，13-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮(比例为约6∶1)。

LC-MS：Phenomenex Luna C8(2)色谱柱：3μm，4.6×50mm。梯度：以0％B保持15min，历时10min从0％B变为100％B，接着以100％B保持5min。流动相∶A＝在CH₃CN/H₂O 5∶95中的0.01M NH₄OAc；B＝在CH₃CN/H₂O 95∶5中的0.01M NH₄OAc。流速：3.0mL/min。波长：UV 250nm。保留时间＝5.52min。MS(ESI)(M+H)⁺＝537.69

此反应亦在诸如丙酮、乙腈、四氢呋喃、2-丙醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜及N-甲基-吡咯烷酮那样的其它溶剂中进行。

叠氮化四丁基铵试剂亦可替代叠氮化钠/氯化铵来使用。

3E.制备(1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮

将三苯基膦(9.48g，35.77mmo1)在氮气氛下添加至(4S，7R，gS，9S，13R，14R，16S)-13-叠氮基-4，8，14-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮及(4S，7R，8S，9S，13S，14S，16S)-14-叠氮基-4，8，13-三羟基-5，5，7，9-四甲基-16-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)氧杂环十六烷-2，6-二酮混合物(12.8g，23.85mmol)在无水乙腈(90mL)中的搅拌溶液中。将澄清溶液在20-40℃搅拌19-40小时。使反应混合物冷却至0-5℃，保持3-4小时，且将产物过滤。用庚烷(64mL)洗涤滤饼，且在减压下在40℃干燥15-18小时，得到呈白色固体的(1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(5.41g，46％)。

LC-MS：Phenomenex Luna C8(2)色谱柱：3μm，4.6×50mm。梯度：以0％B保持15min，历时10min从0％B变为100％B，接着以100％B保持5min。流动相∶A＝在CH₃CN/H₂O 5∶95中的0.01M NH₄OAc；B＝在CH₃CN/H₂O 95∶5中的0.01M NH₄OAc。流速：3.0mL/min。波长：UV 250nm。保留时间＝4.43min。MS(ESI)(M+H)⁺＝493.68。

此反应亦用诸如三环己基膦、三甲基膦、三丁膦及三(4-甲氧基苯基)-膦那样的其它膦及另一种溶剂即四氢呋喃进行。

3G.制备[1S-[1R^＊，3R^＊(E)，7R^＊，10S^＊，11R^＊，12R^＊，16S^＊]]-7，11-二羟基-17-[2-羟基乙基]-8，8，10，12-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-噻唑-4-基)乙烯基]-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮

将Et₃N(三乙胺)(4.95mL，35.52mmol)及2-溴乙醇(3.02mL，42.62mmol)添加至乙腈(35mL)中的(1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(3.50g，7.10mmol)中且加热至72.5℃。20小时后，将反应混合物冷却至室温，经由旋转真空蒸馏来浓缩至干燥。将粗产物溶解于乙酸乙酯(50mL)中且与去离子水(35mL)混合。将混合物用乙酸乙酯(3×35mL)萃取，经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，在乙腈(35mL)中结晶，用乙腈(2×5mL)洗涤，且在真空烘箱中在45.5℃过夜干燥，分离到呈白色结晶粉末的(1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羟基-17-(2-羟基乙基)-8，8，10，12-四甲基-3-((E)-1-(2-甲基噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基)-4-氧杂-17-氮杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(2.60g，HPLC AP 97.1，68.2％产率)。

LC-MS：Phenomenex C8，3μm，4.6×150mm，梯度为历时10min从10％B变为50％B且在20min时停止。(A＝5％MeCN/H₂O+0.01M NH₄OAc；B＝95％MeOH/H₂O+0.01M NH₄OAc)，流速为1.0mL/min，UV为254nm。保留时间＝9.43min。MS(ESI)M+H＝537.21。

本领域技术人员可认识到的是，通过上述实施例3制备的化合物3G与通过实施例2制备的化合物G相同，且因而化合物3G可用于制备化合物H、I及J，其制备方法及有关化合物描述在实例2中。

Claims

1.具有式X’的化合物或其可药用盐：

其中

K为-O-；

A为C_2-4亚烷基；

B₁为-OH以及R₁为氢；

R₂、R₃、R₄和R₅独立为氢或C_1-4烷基；

R₆为氢或甲基；

R₁₂为H或C_1-4烷基；以及

R₁₃为任选取代的噻唑基、吡啶基或

唑基，其中取代基为C_1-4烷基。

2.权利要求1的化合物，其中R₆为氢。

3.权利要求1的化合物，其中R₆为甲基。

4.权利要求1的化合物，其具有式Xb’：

5.权利要求4的化合物，其中R₆为氢。

6.权利要求4的化合物，其中R₆为甲基。

7.权利要求1的化合物，其具有下式：

8.权利要求1、2、3、4、5、6或7中任一项的化合物在制备用于治疗患者中癌症的药物中的用途。

9.权利要求8的用途，其中所述癌症为以下癌症中的一种：卵巢癌、皮肤癌、乳癌、肺癌、结肠癌、鼻癌、咽喉癌、肝癌、肾癌、脾癌、脑癌、间皮瘤、垂体腺瘤、子宫颈癌或脉络丛癌。

10.权利要求9的用途，其中所述癌症为卵巢癌。

11.权利要求9的用途，其中所述癌症为结肠癌。

12.制备用于靶向药物递送的药物组合物的方法，所述方法包括使权利要求1、2、3、4、5、6或7中任一项的化合物与可释放的连接基团接合形成接合化合物，其中所述接合化合物包含叶酸结合部分，其中所述可释放的连接基团意指包含至少一个在生理条件下可断裂的可裂解键的二价连接基团。