TWI383985B - 吖丙啶基-埃坡黴素（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）化合物 - Google Patents

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Description

吖丙啶基－埃坡黴素(EPOTHILONE)化合物
本發明係關於吖丙啶基－埃坡黴素類似物、包含吖丙啶基－埃坡黴素類似物之醫藥組合物以及使用該等類似物及醫藥組合物之方法。
埃坡黴素A與埃坡黴素B為由Hfle等人發現的自微生物纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)之醱酵產物分離出的天然存在之化合物(參見，例如，WO 93/10121)。Hfle等人亦發現由纖維堆囊菌產生的37種天然埃坡黴素變異體及相關化合物，包括埃坡黴素C、D、E、F以及其他異構體及變異體。參見，例如，美國專利第6,624,310號。在1993年Hfle等人對埃坡黴素A與埃坡黴素B之細胞毒素作用進行報導的同時，在1995年研究者與Merck報導埃坡黴素B發揮類似於紫杉醇(TAXOL)之微管穩定作用(參見，D.M.Bollag，"Epothilones,a New Class of Microtubule－Stabilizing Agents with a Taxol－like Mechanism of Action"，Cancer Research，第55卷(1995年6月)，在第2325－2333頁)。
Bristol－Myers Squibb Co.已發現天然存在之埃坡黴素的多種衍生物及類似物。埃坡黴素類似物之實例包括稱為伊沙匹隆(ixabepilone)之氮雜－埃坡黴素B類似物、包括21－胺基類似物的埃坡黴素B之21－經取代之類似物、2,3－烯烴類似物、C－3氰基類似物、環丙基類似物及包括吖丙啶基－埃坡黴素類似物之雜環類似物。參見，例如，美國專利第6,605,599號；第6,262,094號；第6,399,638號；第6,498,257號；第6,380,395號；及第6,800,653號，該等專利中之每一者以引用的方式併入本文中。其他人亦已對其他埃坡黴素衍生物及類似物之發現進行報導。參見，例如，PCT公開案第WO 99/65913號、第WO 98/25929號；第WO 00/99/07692號；第WO 99/67252號；第WO 00/00485號；第WO 00/37473號；第WO 01/83800號；第WO 99/67253號、第WO 99/07692號、第WO 00/00485號、第WO 00/49021號、第WO 00/66589號、第WO 03/045324號、第WO 04/014919號、第WO 04/056832號、第WO 03/022844號；美國專利第6,441,186號；第6,284,781號；第6,660,758號；第6,380,394號；第6,242,469號；第6,531,497號；第6,441,186號；第6,489,314號；第6,589,968號；第6,930,102號；美國專利申請公開案第US 2004/0072870 A1號；第US 2003/0023082 A1號；第US 2004/0053910 A1號；第US 2004/0152708 A1號，所有專利之全文以引用的方式併入。
天然存在之埃坡黴素及其類似物如同其他微管穩定劑可一樣適用於治療諸如癌症之增生性疾病，其通常藉由殺滅腫瘤細胞、其他病原性細胞及外來病原體(或阻止其生長)而起作用。然而，抗癌藥常常不僅攻擊腫瘤細胞，而且攻擊正常組織，引起不希望有之副作用。另外，抗癌藥通常有溶解性問題，使得藥劑之調配及傳遞可存在難題，從而導致使用諸如CREMOPHOR之助溶劑。已知一些抗癌藥及/或調配物成份之細胞毒性引起神經病或其他副作用，諸如，過敏反應。該等不利副作用突出顯示需要對病原性細胞群有選擇性且因此引起宿主毒性下降之抗癌治療。
然而，如WO 2004/054622 A1中所論述，多年來科學家試圖在用於將化學治療劑傳遞至患者之目標藥物治療中使用單株抗體(mAb)，但已在(特別)可裂解部分、連接子及釋放於細胞中之藥物形式方面遇到困難。據報導用mAb進行之成功腫瘤治療為抗體不充分滲透入腫瘤中所限制且為相應之腫瘤相關抗原於腫瘤組織中的不均勻分布所限制。參見，Klar等人之WO 05/074901(讓渡於Schering AG)。
美國專利申請公開案第2005/0002942號揭示適用於目標藥物傳遞之維生素受體結合藥物傳遞共軛物。在此項技術中存在識別可用於製造諸如US 2005/0002942中所述之彼等之共軛物的抗癌劑之需要以提供用於癌症治療之目標藥物傳遞。
本發明係關於具有下式X之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中：K為－O－、－S－或－NR7 －；A為－(CR8 R9 )－(CH2 )m －Z－，其中Z為－(CHR10 )－、－C(＝O)－、－C(＝O)－C(＝O)－、－OC(＝O)－、－N(R11 )C(＝O)－、－SO2 －或－N(R11 )SO2 －；B1 為羥基或氰基，且R1 為氫，或B1 與R1 一起形成一雙鍵；R2 、R3 及R5 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、芳基或經取代之芳基；或R2 與R3 可與其所連接之碳一起形成視情況經取代之環烷基；R4 為氫、烷基、烯基、經取代之烷基、經取代之烯基、芳基或經取代之芳基；R6 為氫、烷基或經取代之烷基；R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；R13 為芳基、經取代之芳基、雜芳基或經取代之雜芳基；且m為0至6。
本發明進一步係關於藉由使用式X之化合物治療癌症的方法以及式X之化合物在與醫藥學上可接受之載劑一起製備用於治療癌症之醫藥組合物中的用途。式X之化合物特別適用於製備用於目標藥物治療之組合物。
 術語之定義
以下所述為用於本說明書中之術語的定義。除非另有陳述，否則本文提供給一基團或術語之初始定義適用於整個本說明書中單獨或作為另一基團之部分的彼基團或術語。
如本文所使用之術語"葉酸結合部分或其類似物或衍生物"意謂將與癌症細胞中過度表現或優先表現之葉酸受體蛋白相結合的部分(非單株抗體)。例如，已知葉酸受體(FR)在卵巢癌細胞及其他癌細胞中過度表現。葉酸之例示性類似物及衍生物係揭示於Vlahov等人之美國專利申請公開案第2005/0002942號(下文中稱為"Vlahov")中，該公開案以引用的方式併入本文中。
如本文所使用之術語"可釋連接子"意謂包括至少一個在生理條件下可斷裂之可裂解鍵(例如，pH值不穩定之鍵、還原性不穩定之鍵、酸不穩定之鍵、氧化性不穩定之鍵或酵素不穩定之鍵)的二價連接子。應瞭解引起鍵斷裂之該等生理條件包括標準化學水解反應，其(例如)在生理pH值下發生或由於區域化至諸如pH值比胞內pH值低之內體的細胞器內或由於與諸如麩胱甘肽之細胞還原劑反應而發生。
應瞭解可裂解之鍵可連接可釋連接子內之兩個鄰近原子且/或在連接子之任一端或兩端如本文中所述將諸如Q及K之其他基團與可釋連接子相連接。
術語"烷基"單獨或與一些其他基團組合時係指在任何可用碳原子處連接之直鏈或支鏈烷(烴)基，其含有1至10個碳原子，較佳1至6個碳原子，更佳1至4個碳原子。示範性之該等基團包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、第三丁基、異丁基、戊基、己基、庚基、4,4－二甲基戊基、辛基、2,2,4－三甲基戊基及其類似基團。"低碳烷基"或"低碳伸烷基"意謂具有1至4個碳原子之直鏈或支鏈烷基。當使用關於烷基或其他基團之下標時，該下標係指基團可含有之碳原子數。舉例而言，術語"C0－4 烷基"包括一鍵及含有1至4個碳原子之烷基，且術語"C1－4 烷基"意謂含有1至4個碳原子之烷基。
術語"伸烷基"係指如上"烷基"中所述但具有兩個連接點之二價烴基。例如，亞甲基為－CH2 －基團且伸乙基為－CH2 －CH2 －基團。
當如在雜環烷基或環烷基烷基中，術語烷基結合另一基團使用時，此意謂另一確定(首先命名)之基團係直接經由如上所定義之烷基(例如，其可為支鏈或直鏈)鍵結。因而，在該狀況下術語"烷基"係用來指具有兩個可用連接點之伸烷基，例如，二價烷基。舉例而言，環丙基C1－4 烷基意謂經由具有1至4個碳原子之直鏈或支鏈伸烷基鍵結之環丙基，且羥基烷基意謂經由具有1至10個碳原子且較佳具有1至6個碳原子且更佳具有1至4個碳原子之直鏈或支鏈伸烷基鍵結的基團OH。就取代基而言，如在"經取代之環烷基烷基"中，基團之伸烷基部分除支鏈或直鏈外還可如下經取代之烷基中所述被取代，且/或首先命名之基團(例如，環烷基)可如本文彼命名基團(例如，環烷基)中所述被取代。
"經取代之烷基"係指在任何可用連接點處經一或多個取代基且較佳經1至4個取代基取代之烷基。然而，當烷基係經多個鹵基取代基取代時，該烷基可隨價數允許含有多達10個取代基，更佳含有多達7個取代基。烷基取代基可包括一或多個以下基團：鹵基(例如，所形成之單鹵基取代基或多鹵基取代基，在後種狀況下，基團係諸如全氟烷基或具有Cl3 或CF3 之烷基)、氰基、－ORa 、－SRa 、－C(＝O)Ra 、－C(＝O)ORa 、－OC(＝O)Ra 、－OC(＝O)ORa 、－NRa Rb 、－C(＝O)NRa Rb 、－OC(＝O)NRa Rb 、－S(＝O)Ra 、－S(O)2 Ra 、－NHS(O)2 Ra 、－NHS(O)2 NHRa 、－NHC(＝O)NHRa 、－NHC(＝O)Ra 、－NHC(O)2 Ra 、－NHC(＝N－CN)Ra 、芳基、雜環基、環烷基及/或雜芳基，其中基團Ra 及Rb 獨立地選自氫、烷基、烯基、環烷基、雜環基、芳基及雜芳基，且其中各Ra 及/或Rb 又視情況經1至4個選自以下基團之基團取代：烷基、烯基、鹵素、鹵烷基、鹵烷氧基、氰基、硝基、胺基、烷基胺基、胺基烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、硫醇基、烷硫基、苯基、苯甲基、苯基氧基、苯甲氧基、C3－7 環烷基、5員或6員雜環基或雜芳基及/或經1至4個選自羥基、氰基、鹵素、鹵基C1－4 烷基、鹵基1－4 烷氧基、氰基、硝基、胺基、C1－4 烷基胺基、胺基C1－4 烷基、羥基C1－4 烷基、C1－4 烷氧基、硫醇基及/或C1－4 烷硫基之基團取代的低碳烷基或低碳烯基。為避免產生疑義，"經取代之低碳烷基"意謂具有1至4個碳原子及1至4個選自以上經取代之烷基中剛述及之彼等基團之取代基的烷基。就經取代之低碳烷基而言，基團Ra 及Rb 較佳係選自氫、低碳烷基、低碳烯基、C3－7 環烷基、苯基及5至6員單環雜環基及/或雜芳基，其又如上視情況經取代。
術語"烯基"係指含有2至12個碳原子及至少一個碳－碳雙鍵之直鏈或支鏈烴基。示範性之該等基團包括乙烯基或烯丙基。"經取代之烯基"係指在任何可用連接點處經一或多個取代基且較佳經1至4個取代基取代之烯基。示範性取代基包括烷基、經取代之烷基及以上作為烷基取代基所述的彼等基團。
術語"烷氧基"及"烷硫基"係指分別經由氧鍵(－O－)或硫鍵(－S－)鍵結的如上所述之烷基。術語"經取代之烷氧基"及"經取代之烷硫基"係指分別經由氧鍵或硫鍵鍵結的如上所述之經取代之烷基。"低碳烷氧基"或C1－4 烷氧基為基團OR，其中R為低碳烷基(含有1至4個碳原子之烷基)。
"胺基"為NH2 。烷基胺基為－NRc Rd ，其中Rc 與Rd 中之至少一者為烷基或經取代之烷基，且Rc 與Rd 中之另一者係選自氫、烷基及經取代之烷基。"胺基烷基"意謂經由伸烷基鍵結之胺基(－伸烷基－NH2 )，且烷基胺基烷基意謂經由伸烷基鍵結的如上所定義之烷基胺基(－伸烷基－NRc Rd )。
術語"芳基"係指具有1至3個芳環之環狀芳族烴基，尤其為單環或雙環基團，諸如，苯基或萘基。為雙環或三環之芳基必須包括至少一個完全芳族之碳環，但另一或其他稠環可為芳族的或非芳族的，且可視情況含有雜原子，其限制條件為在該狀況下連接點將連接至芳族碳環。另外，當芳基已稠合至雜環或環烷基環上時，該雜環及/或環烷基環可具有一或多個羰基碳原子，亦即，經由雙鍵與氧原子連接以界定羰基。因而，"芳基"之實例可包括(但不限於)：、、、、、、、、、、、、、、、、、、及其類似基團。
術語"伸芳基"係指二價芳基，亦即，在芳基環之任何可用連接點處具有連接至兩個其他基團之兩個連接點的如上所定義之芳基。伸芳基環亦可經適於在本文所定義之芳基上取代之基團的任何基團取代。
"經取代之芳基"係指在任何連接點處經一或多個取代基且較佳經1至4個取代基取代的如上所定義之芳基或伸芳基。取代基包括烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基以及以上作為烷基取代基所述的彼等基團。
術語"碳環"意謂飽和或不飽和單環、雙環或三環(較佳為單環或雙環)，其中所有環之所有原子為碳。因而，術語包括環烷基環及芳基環。碳環可被取代，在該狀況下，取代基係選自以上環烷基及芳基中所述之彼等取代基。
術語"環烷基"係指含有1至3個環且每環含有3至7個碳原子之完全飽和或部分飽和環烴基。示範性完全飽和環烷基包括環丙基、環丁基、環戊基及環己基。示範性部分飽和環烷基包括環丁烯基、環戊烯基及環己烯基。術語"環烷基"包括具有含3至4個碳原子之橋的該等基團。另外，為雙環或三環之環烷基必須包括至少一個完全飽和或部分飽和烴環，但另一或其他稠環可為芳族的或非芳族的，且可含有雜原子，其限制條件為在該狀況下連接點將連接至環狀之非芳族烴基。另外，環烷基之一或多個碳原子可形成碳氧雙鍵以界定羰基。因而，"環烷基"之實例可包括(但不限於)：,,,,,,,,,,,,,,及其類似基團。
術語"伸環烷基"係指二價環烷基，亦即，在環烷基環的任何可用之兩個連接點處具有連接至兩個其他基團之兩個連接點的如上所定義之環烷基。
"經取代之環烷基"係指在任何可用連接點處經一或多個取代基且較佳經1至4個取代基取代的如上所定義之環烷基。環烷基取代基包括烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基以及以上作為烷基取代基所述的彼等基團。
術語"胍基"意謂基團。因而，胍基烷基意謂與胍基鍵結之烷基，諸如具有式之基團。
術語"鹵素"或"鹵基"係指氟、氯、溴及碘。
術語"雜原子"包括氧、硫及氮。
術語"鹵烷基"意謂具有一或多個鹵基取代基之烷基，包括(但不限於)諸如－CH2 F、－CHF2 及－CF3 之基團。
術語"鹵烷氧基"意謂具有一或多個鹵基取代基之烷氧基。舉例而言，"鹵烷氧基"包括－OCF3 。
當術語"不飽和"在本文中用來指示環或基團時，該環或基團可為完全不飽和或部分不飽和。
術語"雜芳基"係指為4至7員單環系統、7至11員雙環系統或10至15員三環系統之芳族基團，其具有至少一個含有至少一個雜原子之環。含有雜原子的雜芳基之各環可含有一個或兩個氧原子或硫原子及/或1至4個氮原子，其限制條件為各環中雜原子之總數為4或小於4且各環具有至少一個碳原子。構成雙環及三環基團之稠環可僅含有碳原子且可為飽和的、部分飽和的或不飽和的。氮原子及硫原子可視情況被氧化且氮原子可視情況被季銨化。為雙環或三環之雜芳基必須包括至少一個完全芳族之環，但另一或其他稠環可為芳族的或非芳族的且可為碳環，其限制條件為在該等狀況下連接點將在含有雜原子之芳環的任何可用氮原子或碳原子處。另外，雜芳基其自身之定義包括其中一或多個碳原子係經由雙鍵與氧原子連接以界定羰基的環(其限制條件為雜芳基為芳族的)，且亦當雜芳基已稠合至雜環或環烷基環上時，該雜環及/或環烷基環可具有一或多個羰基。
示範性單環雜芳基包括吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基(亦即，)、噻二唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、三嗪基及其類似基團。另外，因雜芳基其自身之定義包括其中一或多個碳原子界定羰基之環，故包括諸如2,4－二氫－[1,2,4]三唑－3－酮(亦即，)及其類似基團之環。
示範性雙環雜芳基包括吲哚基、苯幷噻唑基、苯幷間二氧雜戊烯基、苯幷噁唑基、苯幷噻吩基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯幷咪唑基、苯幷哌喃基、吲嗪基、苯幷呋喃基、色酮基、香豆素基、苯幷哌喃基、喏啉基、喹喏啉基、吲唑基、吡咯幷吡啶基、呋喃幷吡啶基、二氫異吲哚基、四氫喹啉基及其類似基團。
示範性三環雜芳基包括咔唑基、苯幷吲哚基、啡啉基、吖啶基、啡啶基、基及其類似基團。
術語"雜伸芳基"係指二價雜芳基，亦即，在雜芳基環的任何可用之兩個連接點處具有連接至兩個其他基團之兩個連接點的如上所定義之雜芳基。
"經取代之雜芳基"基團為在任何可用連接點處經一或多個取代基且較佳經1至4個取代基取代的如上所定義之雜芳基。示範性取代基包括(但不限於)烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基以及以上作為烷基取代基所述的彼等基團。
術語"雜環"係指完全飽和或部分不飽和非芳族環狀基團，其可經取代或未經取代，舉例而言，其為4至7員單環系統、7至11員雙環系統或10至15員三環系統，其具有至少一個在至少一個含碳原子之環中的雜原子。含有雜原子的雜環基之各環可具有1個、2個或3個選自氮、氧及硫原子之雜原子，其中氮及硫雜原子亦視情況可被氧化且氮雜原子亦視情況可被季銨化。較佳地兩個鄰近之雜原子不同時選自氧及氮。為雙環或三環之雜環基必須包括至少一個非芳族之非碳環，但另一或其他稠環可為芳族的或非芳族的且可為碳環，其限制條件為在該等狀況下連接點將在含有雜原子之非芳環的任何可用氮原子或碳原子處。另外，雜環基其自身之定義包括其中一或多個碳原子係經由雙鍵與氧原子連接以界定羰基的環(其限制條件為雜環基為非芳族的)，且亦當雜環基已稠合至另一環上時，該另一環可具有一或多個羰基。
示範性單環雜環基包括吡咯啶基、咪唑啶基、四氫呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吡唑啶基、咪唑啉基、吡咯啉基、四氫哌喃基、嗎啉基、噻嗎啉基及其類似基團。
"經取代之雜環"係指在任何可用連接點處經一或多個取代基且較佳經1至4個取代基取代的如上所定義之雜環基。示範性取代基包括烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基以及以上作為示範性烷基取代基所述的彼等基團。
"羥基"係指－OH。
"硫醇基"意謂基團－SH。
術語"四級氮"係指四價正電性氮原子，包括(例如)四烷基銨群(例如，四甲基銨或N－甲基吡錠)中之正電性氮、質子化銨類(例如，三甲基氫銨或N－氫吡錠)中之正電性氮、胺N－氧化物(例如，N－甲基－嗎啉－N－氧化物或吡啶－N－氧化物)中之正電性氮及N－胺基－銨群(例如，N－胺基吡錠)中之正電性氮。
當稱官能基為"受保護官能基"時，此意謂該基團係呈經修飾之形式以減少且特別為排除在保護位點處發生不希望有之副反應。用於本文所述之方法及化合物的合適保護基包括(但不限於)標準教科書中所述之彼等，該等標準教科書包括以引用的方式併入本文中的Greene,T.W.等人之Protective Groups in Organic Synthesis ,Wiley,N.Y.(1991)。
本發明之替代性實施例
如發明內容中所述，本發明包含具有下式X之化合物。
本發明包含具有式X'之立體特異性形式的化合物 包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中：K為－O－、－S－或－NR7 －；A為－(CR8 R9 )－(CH2 )m －Z－，其中Z為－(CHR10 )－、－C(＝O)－、－C(＝O)－C(＝O)－、－OC(＝O)－、－N(R11 )C(＝O)－、－SO2 －或－N(R11 )SO2 －；B1 為羥基或氰基且R1 為氫，或B1 與R1 一起形成一雙鍵；R2 、R3 及R5 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、芳基或經取代之芳基；或R2 與R3 可與其所連接之碳一起形成視情況經取代之環烷基；R4 為氫、烷基、烯基、經取代之烷基、經取代之烯基、芳基或經取代之芳基；R6 為氫、烷基或經取代之烷基；R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；R13 為芳基、經取代之芳基、雜芳基或經取代之雜芳基；且m為0至6。
在另一實施例中，本發明之化合物具有式X 或以上立體特異性式X'，包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中：K為－O－；A為C2－4 伸烷基；B1 為－OH；R2 、R3 、R4 及R5 獨立地為氫或低碳烷基；R6 為氫或甲基；R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；且R13 為視情況經取代之5員或6員雜芳基。
在另一實施例中，本發明之化合物具有如上所述之式X或X'，包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中：K為－O－；A為C2－4 伸烷基；B1 為－OH；R2 、R3 、R4 及R5 獨立地為氫或低碳烷基；R6 為氫；R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；且R13 為視情況經取代之5員或6員雜芳基。
在另一實施例中，本發明之化合物具有如上所述之式X或X'，包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中：K為－O－；A為C2－4 伸烷基；B1 為－OH；R2 、R3 、R4 及R5 獨立地為氫或低碳烷基；R6 為氫或甲基；R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；且R13 為視情況經取代之噻唑基、吡啶基或噁唑基。
在另一實施例中，提供具有式Xa之化合物 包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中：K為－O－、－S－或－NR7 －；A為－(CR8 R9 )－(CH2 )m －Z－，其中Z為－(CHR10 )－、－C(＝O)－、－C(＝O)－C(＝O)－、－OC(＝O)－、－N(R11 )C(＝O)－、－SO2 －或－N(R11 )SO2 －；R6 為氫或甲基；R8 與R9 獨立地為氫、烷基或經取代之烷基，R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；且R13 為芳基、經取代之芳基、雜芳基或經取代之雜芳基；且m為0至6。
在本發明之另一實施例中，提供式Xa之化合物，該等化合物包括具有對應於X'中所顯示之立體化學之立體特異型Xa'的式Xa'之化合物。
在另一實施例中，提供以上剛述及之具有式Xa或Xa'之化合物，其中K為－O－且R13 為視情況經取代之噻唑基、吡啶基或噁唑基，且其餘基團係如上所述。
在另一實施例中，提供具有以上式Xa或Xa'之化合物，其中K為－O－；A為C2－4 伸烷基；R6 為氫或甲基；R12 為H、低碳烷基或鹵素；且R13 為視情況經取代之噻唑基、吡啶基或噁唑基。
本發明之化合物亦可具有式Xb 包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R6 為氫或甲基。
在另一實施例中，本發明之化合物具有式Xb，其中R6 為氫。
在另一實施例中，本發明之化合物可具有立體特異性式Xb' 包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物，其中R6 為氫或甲基。
在另一實施例中，本發明之化合物具有式Xb'，其中R6 為氫。
根據本發明之一實施例，提供用於治療例如葉酸受體相關之病況的癌症之方法，該方法包含用治療有效量的具有下式X之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物來治療患者， 其中：K為－O－、－S－或－NR7 －；A為－(CR8 R9 )－(CH2 )m －Z－，其中Z為－(CHR10 )－、－C(＝O)－、－C(＝O)－C(＝O)－、－OC(＝O)－、－N(R11 )C(＝O)－、－SO2 －或－N(R11 )SO2 －；B1 為羥基或氰基且R1 為氫，或B1 與R1 一起形成一雙鍵；R2 、R3 及R5 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、芳基或經取代之芳基；或R2 與R3 可與其所連接之碳一起形成視情況經取代之環烷基；R4 為氫、烷基、烯基、經取代之烷基、經取代之烯基、芳基或經取代之芳基；R6 為氫、烷基或經取代之烷基；R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；R13 為芳基、經取代之芳基、雜芳基或經取代之雜芳基；且m為0至6。
在一實施例中，方法包含用治療有效量的具有立體特異性式X'之化合物(包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物)治療患者， 其中K、A、B1 、R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 、R10 、R11 、R12 、R13 及m係如上式X之化合物中所述。
在另一實施例中，該方法包含用治療有效量的如上所述之具有式X(包括式X')之化合物(包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物)治療患者，其中：K為－O－；A為C2－4 伸烷基；B1 為－OH；R2 、R3 、R4 及R5 獨立地為氫或低碳烷基；R6 為氫或甲基；R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；且R13 為視情況經取代之5員或6員雜芳基。
在另一實施例中，該方法包含用治療有效量的如上所述之具有式X或X'之化合物(包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物)治療患者，其中：K為－O－；A為C2－4 伸烷基；B1 為－OH；R2 、R3 、R4 及R5 獨立地為氫或低碳烷基；R6 為氫；R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；且R13 為視情況經取代之5員或6員雜芳基。
在另一實施例中，該方法包含用治療有效量的如上所述之具有式X或X'之化合物(包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物)治療患者，其中：K為－O－；A為C2－4 伸烷基；B1 為－OH；R2 、R3 、R4 及R5 獨立地為氫或低碳烷基；R6 為氫或甲基；R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；且R13 為視情況經取代之噻唑基、吡啶基或噁唑基。
本發明之一方法亦可包含用治療有效量的具有以上式Xa或立體特異性式Xa'之化合物(包括其醫藥學上可接受之鹽及/或溶劑合物)治療需要該治療之患者，其中：K為－O－、－S－或－NR7 －；A為－(CR8 R9 )－(CH2 )m －Z－，其中Z為－(CHR10 )－、－C(＝O)－、－C(＝O)－C(＝O)－、－OC(＝O)－、－N(R11 )C(＝O)－、－SO2 －或－N(R11 )SO2 －；R6 為氫或甲基；R8 與R9 獨立地為氫、烷基或經取代之烷基，R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；R13 為芳基、經取代之芳基、雜芳基或經取代之雜芳基；且m為0至6。
本發明之一方法亦可包含用治療有效量的具有以上式Xb或Xb'之化合物治療需要該治療之患者，其中R6 為氫或甲基。在另一實施例中，該方法包含用式Xb或Xb'之化合物治療患者，其中R6 為氫。
本發明之另一實施例包含上述化合物(包括式X、Xa、Xa'、Xb及/或Xb'之化合物，其中基團K、A、B1 、R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 、R10 、R11 、R12 及R13 可如上所述進行選擇)中之任一種在製造用於治療患者之癌症之醫藥組合物中的用途及尤其用於製造含有用於目標藥物傳遞至過度表現或優先表現葉酸受體之腫瘤的共軛化合物之醫藥組合物的用途。
本發明之另一實施例包含用治療有效量的具有式X、Xa、Xa'、Xb及/或Xb之化合物(其中基團K、A、B1 、R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 、R10 、R11 、R12 及R13 可如上所述進行選擇)治療需要該治療之患者，其中已釋放於腫瘤部位處之治療係在腫瘤部位處進行。在該實施例中，將共軛化合物傳遞至腫瘤部位，且接著將如上所述的式X、Xa、Xa'、Xb或Xb'之化合物釋放在腫瘤部位且在腫瘤部位處治療患者。因此，應瞭解本文中每當使用關於治療患者之術語"治療"時，此涵蓋在腫瘤部位處之治療，另一方面(例如)經由共軛化合物進行傳遞。
使葉酸受體(FR)含量上調之藥劑的使用可在某些癌細胞或腫瘤類型中有效增強FR表現以增加將本發明之化合物投予患者後所獲得之優勢及/或增加可用根據本發明之葉酸受體結合化合物進行治療的多種疾病或腫瘤類型。在某些癌症中葉酸受體之表現可藉由投予葉酸受體誘導物而上調，該葉酸受體誘導物在癌症細胞中選擇性增加葉酸受體含量，從而增強葉酸受體目標治療之有效性。舉例而言，雌激素受體陽性(ER＋)乳癌表現低含量之葉酸受體。已知用諸如雌激素拮抗劑三苯氧胺之葉酸受體誘導物進行治療在ER＋乳癌中使葉酸受體之表現上調，增強ER＋乳癌細胞對用葉酸受體目標治療進行治療之易感性。
本發明之一態樣提供一種治療患者之癌症或增生性疾病之方法，其包含視情況將有效量之至少一種葉酸受體誘導物投予患者及用有效量的至少一種式X之化合物治療該患者。葉酸受體誘導物可在用式X之化合物對患者進行治療前、期間或後投予。在一實施例中，葉酸受體誘導物係在用式X之化合物進行治療前投予。葉酸受體誘導物之有效量係指在所要細胞中使葉酸受體上調以便用化合物進行治療在治療上有效之量。
用於使葉酸受體α(FRα)上調之葉酸受體誘導物的實例包括：雌激素受體拮抗劑，諸如，三苯氧胺；孕酮受體促效劑，諸如，孕激素；雄激素受體促效劑，諸如，睪固酮及二羥基睪固酮；及糖皮質激素受體促效劑，諸如，地塞米松(dexamethasone)。
用於使葉酸受體β(FRβ)上調之葉酸受體誘導物的實例包括：視黃酸受體促效劑，諸如，全反式視黃酸(ATRA)、四甲基萘基丙烯基苯甲酸(TTNPB)、9－順式視黃酸(9－順式RA)、CD33336、LG101093及CD2781。
在一實施例中，提供一種治療有此需要之患者之癌症或增生性疾病之方法，其包含投予有效量之至少一種葉酸受體誘導物亦及用至少一種式X之化合物治療該患者；其中該葉酸受體誘導物使葉酸受體α上調。較佳地，該癌症或增生性疾病係選自諸如ER＋乳癌之乳癌以及卵巢癌。
在本發明之一實施例中，提供一種治療有此需要之患者之癌症或增生性疾病之方法，其包含投予有效量之至少一種葉酸受體誘導物及投予有效量的至少一種式X之化合物；其中該葉酸受體誘導物使葉酸受體β上調。較佳地，該癌症或增生性疾病係選自白血病，且更佳係選自急性骨髓性白血病(AML)及慢性骨髓性白血病(CML)。
在另一實施例中，提供一種治療有此需要之患者之癌症或增生性疾病之方法，其包含投予有效量之至少一種葉酸受體誘導物，投予至少一種組蛋白脫乙醯基酶抑制劑及用有效量的至少一種式X之化合物治療該患者。組蛋白脫乙醯基酶抑制劑之一實例為曲古菌素A(trichostatin A，TSA)。美國專利申請公開案第2003/0170299 A1號，WO 2004/082463，Kelly,K.M.、B.G.Rowan及M.Ratnam之Cancer Research 63,2820－2828(2003)，Wang、Zheng、Behm及Ratnam之Blood ，96：3529－3536(2000)。
本發明之化合物可形成亦在本發明之範疇內的鹽或溶劑合物。除非另有陳述，否則應瞭解本文中提及式(X)之化合物包括提及其鹽及溶劑合物、其外消旋體、非對映異構體及對映異構體。如本文所採用之術語"鹽"表示用無機及/或有機酸及鹼形成之酸性及/或鹼性鹽。此外，當式(X)之化合物含有諸如(但不限於)吡啶基咪唑基、胺或胍基之鹼性部分及諸如(但不限於)羧酸之酸性部分時，兩性離子可形成且係包括在如本文所使用之術語"鹽"內。儘管其他鹽亦可用於(例如)製備期間可採用之分離或純化步驟中，但醫藥學上可接受(亦即，無毒之生理學上可接受)之鹽係較佳的。式(X)之化合物的鹽可例如藉由將式(X)之化合物與諸如當量數之一定量之酸或鹼在諸如其中鹽發生沈澱之介質的介質中或在水性介質中反應而形成且接著凍乾而形成。
含有諸如(但不限於)胺、胍基、吡啶基或咪唑基環之鹼性部分的式(X)之化合物可與多種有機酸及無機酸形成鹽。示範性酸加成鹽包括乙酸鹽(諸如，用乙酸或三鹵乙酸(例如，三氟乙酸)形成之彼等鹽)、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天門冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、羥基乙烷磺酸鹽(例如，2－羥基乙烷磺酸鹽)、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲烷磺酸鹽、萘磺酸鹽(例如，2－萘磺酸鹽)、煙鹼酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、果膠酸鹽、過氧硫酸鹽、苯基丙酸鹽(例如，3－苯基丙酸鹽)、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽(諸如，用硫酸形成之彼等鹽)、磺酸鹽(諸如本文中提及之彼等鹽)、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、諸如甲苯磺酸鹽之甲苯磺酸鹽類、十一烷酸鹽及其類似鹽。
含有諸如(但不限於)羧酸之酸性部分的式(X)之化合物可與多種有機鹼及無機鹼形成鹽。示範性鹼性鹽包括銨鹽；鹼金屬鹽，諸如鈉鹽、鋰鹽及鉀鹽；鹼土金屬鹽，諸如，鈣鹽及鎂鹽；用有機鹼(例如，有機胺，諸如，N,N'－雙苯甲基伸乙基二胺、二環己基胺、海卓胺(用N,N－雙(脫氫松香基)伸乙基二胺形成)、N－甲基－D－葡糖胺、N－甲基－D－甘醯胺、第三丁基胺)形成之鹽；及用諸如精胺酸、離胺酸之胺基酸形成的鹽；及其類似物。鹼性含氮基團可用如下試劑來季銨化：低碳烷基鹵化物(例如，甲基、乙基、丙基及丁基氯化物、溴化物及碘化物)、二烷基硫酸鹽(例如，二甲基、二乙基、二丁基及二戊基硫酸鹽)、長鏈鹵化物(例如，癸基、十二烷基、十四烷基及十八烷基氯化物、溴化物及碘化物)、芳烷基鹵化物(例如，苯甲基及苯乙基溴化物)及其他試劑。
本發明之化合物的溶劑合物亦涵蓋於本文中。式(X)之化合物的溶劑合物包括(例如)水合物。
包括對映異構體形式及非對映異構體形式的本發明之化合物的所有立體異構體(例如，可由於各種取代基上之不對稱碳而存在之彼等物質)係涵蓋於本發明之範疇內。因而，例如，每次提及式X之化合物意欲包含式X'之化合物。本發明之化合物的個別立體異構體可(例如)大體上不含其他異構體(例如，呈具有指定活性的純或大體上純之光學異構體)，或可為混雜的，例如作為外消旋體，或與所有其他立體異構體或其他選定之立體異構體混雜。本發明之對掌性中心可具有如由IUPAC 1974建議所定義之S或R組態。外消旋形式可藉由諸如非對映異構體衍生物之分步結晶、分離或結晶或藉由對掌性管柱層析進行之分離的物理方法進行拆分。個別光學異構體可自立體特異性方法獲得，其中選擇具有與最終產物所要之立體化學相一致之立體化學的起始物質及/或中間物，且該立體化學在整個反應期間維持，及/或異構體可藉由包括(但不限於)諸如用光學活性酸形成鹽接著結晶之習知方法的任何合適方法自外消旋體獲得。
本發明涵蓋以混雜物形式或以純或大體上純之形式的本發明之化合物的所有組態異構體。如可瞭解的，較佳組態可隨特定化合物及所要活性而變化。組態異構體可藉由本文所述之可為立體選擇性的方法來製備。換言之，最終化合物之所要立體化學可藉由使用具有相應之所要立體化學的起始物質且接著在整個製備方法期間維持立體選擇性而達成。或者，化合物可作為外消旋體或非對映異構體來製備，且接著所要立體化學可經由分離可藉由此領域中已知之任何合適方法(諸如，管柱層析)達成的組態異構體而達成。
在整個說明書中，可選擇基團及其取代基以提供穩定部分及化合物，其適用作在製造醫藥學上可接受之化合物中適用的醫藥學上可接受之化合物及/或中間化合物。熟習此領域者將瞭解變數之合適選擇以獲得穩定化合物。
本文中表示為示範性或較佳之實施例意欲為例證性的且非限制性。
例如鑒於以上所提及之實施例的組合，本發明之其他實施例對於熟習此領域者而言將易於瞭解，且係涵蓋於本文所包含的本發明之範疇內。
效用
在某些癌細胞中過度表現或優先表現之一種蛋白質為葉酸受體。葉酸為DNA合成所需要的，且已知某些人類腫瘤細胞過度表現葉酸結合蛋白。舉例而言，Campbell等人之"Folate Binding Protein is a Marker for Ovarian Cancer,"(Cancer Research，第51卷(1991年10月1日)，在第5329－38頁)及Coney等人之"Cloning of a Tumor－Associated Antigen：MOv18 and MOv19 Antibodies Recognize Folate－binding Protein"(Cancer Research，第51卷(1991年11月15日)，在第6125－31頁)報導葉酸結合蛋白為卵巢癌之標記物。亦已知諸如皮膚癌、腎癌、乳癌、肺癌、結腸癌、鼻癌、咽喉癌、乳腺癌及腦癌以及本文所提及之其他癌症的其他癌症過度表現葉酸受體。
本發明之化合物為適用的且可作為由埃坡黴素衍生之微管穩定劑傳遞至表現葉酸受體之腫瘤中。其適用於治療多種癌症及其他增生性疾病，尤其為特徵為癌細胞或腫瘤表現葉酸受體之彼等癌症。如本文所使用之術語"葉酸受體相關之病況"包含特徵為表現葉酸受體之疾病或病症，或換言之，包含可基於患病組織中葉酸受體之表現量與正常組織相比來診斷或治療之彼等疾病或病症。本發明之化合物適用於形成共軛物。舉例而言，本發明之化合物可用於形成以下式I之共軛化合物 其中：V為葉酸或其類似物或衍生物；Q為O、S或NR7 ；M為可釋連接子；K為O、S或NR7a ；A為－(CR8 R9 )－(CH2 )m －Z－，其中Z為－(CHR10 )－、－C(＝O)－、－C(＝O)－C(＝O)－、－OC(＝O)－、－N(R11 )C(＝O)－、－SO2 －或－N(R11 )SO2 －；B1 為羥基或氰基且R1 為氫，或B1 與R1 一起形成雙鍵；R2 、R3 及R5 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、芳基或經取代之芳基；或R2 與R3 可與其所連接之碳一起形成視情況經取代之環烷基；R4 為氫、烷基、烯基、經取代之烷基、經取代之烯基、芳基或經取代之芳基；R6 為氫、烷基或經取代之烷基；R7a 、R7 、R8 、R9 、R10 及R11 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、芳基、經取代之芳基、雜環烷基、經取代之雜環烷基、雜芳基或經取代之雜芳基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；R13 為芳基、經取代之芳基、雜芳基或經取代之雜芳基；m為0至6；T具有下式： 其中：R14 在各狀況下獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、芳基、經取代之芳基、芳基烷基、經取代之芳基烷基、環烷基、經取代之環烷基、環烷基烷基、經取代之環烷基烷基、雜芳基、雜芳基烷基、經取代之雜芳基烷基、經取代之雜芳基、雜環烷基或經取代之雜環烷基；q為1至10；且R15 、R16 及R17 獨立地為氫、烷基、經取代之烷基或環烷基。
作為另一非限制性實例，本發明之化合物可用於形成以下式Ia之共軛化合物： 其中V為葉酸受體結合部分。
例如，V可具有下式： 其中W與X獨立地為CH或氮；R20 為氫、胺基或低碳烷基；R21 為氫、低碳烷基，或與R23 形成環烷基；R22 為氫、低碳烷基、低碳烯基或低碳炔基；且R23 為氫，或與R21 形成環烷基。
較佳地，V為
本發明之化合物可為共軛的以形成具有下式Ib之化合物： 其中：V為葉酸受體結合部分；Q為O、S或NR7 ；M為具有下式之可釋連接子： 較佳為；R14 在各狀況下獨立地為氫、烷基、經取代之烷基、芳基、經取代之芳基、芳基烷基、經取代之芳基烷基、環烷基、經取代之環烷基、環烷基烷基、經取代之環烷基烷基、雜芳基、雜芳基烷基、經取代之雜芳基烷基、經取代之雜芳基、雜環烷基或經取代之雜環烷基；且較佳為選自H、甲基、胍基丙基、－(CH2 )1－2 －CO2 H、－CH2 －SH、－CH2 －OH、咪唑基(甲基)、胺基丁基及－CH(OH)－CH3 之基團；且更佳為經－C(＝O)－OH或NH－C(＝NH)－NH2 中之一者取代的C1 至C3 烷基；q為1至10；較佳為1至5；R15 、R16 及R17 獨立地為氫、低碳烷基、經取代之低碳烷基；且R18 、R19 、R31 、R32 、R33 、R24 、R25 、R26 、R27 、R28 及R29 各自獨立地為H、低碳烷基、經取代之低碳烷基、環烷基或經取代之環烷基，或者R18 與R19 、R31 與R32 、R19 與R31 、R33 與R24 、R25 與R26 、R24 與R25 或R27 與R28 中之任一組可一起形成環烷基。
本發明之化合物尤其適用於形成具有下式之共軛化合物(包括其醫藥學上可接受之鹽及溶劑合物)：
對於能夠插入式I之化合物中的本文所列出之任何二價基團(諸如，－(CR8 R9 )－(CH2 )m －Z－)而言
插入應自左向右進行。舉例而言，在A被界定為－(CR8 R9 )－(CH2 )m －Z－之以下情況中，亞甲基與K連接，且Z基團與吖丙啶基環之氮連接，如下所示：
作為一非限制性實例，該等葉酸受體相關之癌症包括卵巢癌及皮膚癌、乳癌、肺癌、結腸癌、鼻癌、咽喉癌、乳腺癌、肝癌、腎癌、脾癌及/或腦癌；間皮瘤、垂體腺瘤、子宮頸癌、腎細胞癌或其他腎癌、脈絡叢癌及上皮腫瘤(參見，Asok,Antony，"Folate Receptors：Reflections on a Personal Odyssey and a Perspective on Unfolding Truth"，Advanced Drug Delivery Reviews 56(2004)，在1059－66頁)。
另外，抗雌激素(諸如，三苯氧胺、ICI 182,780)之使用可在某些癌細胞或腫瘤類型中有效增強FR表現以增加將本發明之化合物投予患者後所獲得之優勢及/或增加可用根據本發明之化合物進行治療的各種疾病或腫瘤類型。
舉例而言，可用本發明之化合物及/或藉由包含與抗雌激素組合的本發明之化合物之組合治療進行治療的疾病可進一步包括(但不限於)以下疾病：－癌，包括以上所列出之彼等癌及/或膀胱癌、胰腺癌、胃癌、甲狀腺癌及前列腺癌；－淋巴系統之造血組織腫瘤，包括白血病，諸如急性淋巴細胞白血病及急性淋巴母細胞白血病；及淋巴瘤，諸如，B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金(Hodgkins)淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤及伯基特氏(Burkitts)淋巴瘤；－骨髓系統之造血組織腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓細胞白血病；－中樞及周邊神經系統之腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；－間葉細胞來源之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及－其他腫瘤，包括黑素瘤、著色性乾皮病、精原細胞瘤、角化棘皮瘤、甲狀腺濾泡癌及畸胎癌。
本發明之化合物適用於治療先前已接受過癌症治療之患者以及先前未接受過癌症治療之彼等患者。本發明之方法及組合物可用於第一線及第二線癌症治療中。此外，式(X)之化合物適用於治療難治癒或抗性癌症。
本發明之化合物亦可適用於治療對經由葉酸受體對傳遞之微管穩定劑有反應的其他病況，包括(但不限於)關節炎，尤其為發炎性關節炎，及其他由活化巨噬細胞介導之發炎性病況，以及中樞神經系統病症，諸如，阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。
此外，正用本發明之化合物進行治療的患者可接受(例如)與適用於治療癌症或其他增生性疾病之其他抗癌劑及細胞毒素藥劑或其他治療的治療之組合。在治療癌症中，本發明之化合物與一或多種另外藥劑及/或其他治療之組合可為有利的。第二藥劑可具有與式(X)之化合物相同或不同之作用機制。特別有用的係抗癌藥與細胞毒素藥物組合，其中選定之第二藥物以與本發明之化合物的活性藥物部分不同之方式或在不同之細胞週期階段起作用。
抗癌劑類及細胞毒素藥劑類之實例包括(但不限於)烷基化劑，諸如，氮芥、烷基磺酸鹽、亞硝基尿素、伸乙基亞胺及三氮烯；抗代謝物物質，諸如，葉酸拮抗劑、嘌呤類似物及嘧啶類似物；抗生素或抗體，諸如單株抗體；酵素；法呢基(farnesyl)蛋白質轉移酶抑制劑；激素藥劑，諸如，糖皮質激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素及黃體促素釋放拮抗劑；微管破裂劑，諸如，依特那斯汀(ecteinascidin)或其類似物及衍生物；微管穩定劑；植物來源之產物，諸如長春花屬生物鹼、表鬼臼脂素及紫杉烷；拓撲異構酶抑制劑；含異戊二烯基之蛋白質轉移酶抑制劑；鉑配位錯合物；激酶抑制劑，包括多激酶抑制劑及/或Src激酶或Src/abl之抑制劑；信號轉導抑制劑；及用作抗癌劑及細胞毒素藥劑之其他藥劑，諸如，生物反應改質劑、生長因子或免疫調節劑。式X之化合物亦可結合放射性治療使用。
可與本發明之化合物組合使用之抗癌劑的其他實例包括Src激酶抑制劑N－(2－氯－6－甲基苯基)－2－[[6－[4－(2－羥基乙基)－1－哌嗪基]－2－甲基－4－嘧啶基]胺基]－5－噻唑甲醯胺及以引用的方式併入本文中之美國專利第6,596,746號及2005年2月4日申請之美國專利申請案第11/051,208號中所述的其他化合物；氮雜－埃坡黴素B類似物伊沙匹隆及/或美國專利第6,605,599號；第6,262,094號；第6,288,237號；第6,291,684號；第6,359,140號；第6,365,749號；第6,380,395號；第6,399,638號；第6,498,257號；第6,518,421號；第6,576,651號；第6,593,115號；第6,613,912號；第6,624,310號、2003年3月公開之美國申請公開案第2003/0060623號；德國專利第4138042.8號；WO 97/19086、WO 98/22461、WO 98/25929、WO 98/38192、WO 99/01124、WO 99/02224、WO 99/02514、WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO 99/28324、WO 99/43653、WO 99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO 99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253、WO 00/00485、美國專利申請公開案第2004/0053910號及第2004/0152708號中所述之其他埃坡黴素類似物；WO 99/24416中可見之週期素依賴性激酶抑制劑(亦參見美國專利第6,040,321號)；WO 97/30992及WO 98/54966中可見的含異戊二烯基之蛋白質轉移酶抑制劑；美國專利第6,011,029號中所述之法呢基蛋白質轉移酶藥劑；PCT公開案第WO01/14424號中所述之CTLA－4抗體及/或PCT公開案第WO 00/37504號中所述之CTLA－4抗體，諸如，稱為CP－675206(替斯莫納(ticilimunab))，或ORENCIA；MDX－010；長春氟寧(vinflunine，JavlorTM )及愛必妥(Erbitux，西妥昔單抗(cetuximab))之抗體。
可能適用於組合本發明之化合物的其他藥劑可包括紫杉醇(TAXOL)、多烯紫杉醇(TAXOTERE)、各種其他藥劑(諸如，羥基脲、甲基苄肼、鄰氯苯對氯苯二氯乙烷、六甲密胺、順氯胺鉑(cisplatin)及卡波鉑(carboplatin)；阿瓦斯丁(Avastin)；及赫賽汀(Herceptin))。
根據本發明製備之醫藥組合物亦可與因其在與上述病況相關之投予治療中的特殊適用性而選出之其他治療劑一起調配或共投予。舉例而言，醫藥組合物可與諸如抗嘔劑以及H1 及H2 抗組胺劑的預防噁心、過敏及胃受刺激之藥劑一起調配。
上述其他治療劑當與本發明之化合物組合採用時可(例如)以Physicians' Desk Reference(PDR)中所示或如另外由一般技術者所確定之彼等量進行使用。
本發明之一實施例包含本發明之化合物在製備用於治療癌症之醫藥組合物中的用途，尤其用於製備用於目標藥物傳遞至過度表現或優先表現葉酸受體之腫瘤之醫藥組合物中的用途。本發明之醫藥組合物可藉由任何合適方法(例如，非經腸，諸如，藉由皮下、靜脈內、肌肉內或胸骨內注射或輸注技術(例如，以無菌可注射水性或非水性溶液或懸浮液))及/或以含有無毒性、醫藥學上可接受之媒劑或稀釋劑的劑量單位調配物來投予以用於本文所述之用途中的任一種。醫藥組合物可(例如)以適於立即釋放或延遲釋放之形式投予。立即釋放或延遲釋放可藉由使用包含本發明之化合物的合適醫藥組合物或尤其在延遲釋放之狀況下藉由使用諸如皮下植入物或滲透泵之裝置而達成。
用於非經腸投予之示範性組合物包括可注射之溶液或懸浮液，其可含有(例如)合適的無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑，諸如，甘露醇、1,3－丁二醇、水、林格氏溶液(Ringer's solution)、等張氯化鈉溶液(0.9%氯化鈉注射劑[生理鹽水]或5%右旋糖注射劑)，或可含有其他合適之分散劑或濕潤劑及懸浮劑，其包括合成之甘油一酸酯或甘油二酸酯及脂肪酸。投予本發明之化合物的醫藥學上可接受之組合物及/或方法可包括使用包括(但不限於)乙醇、N,N－二甲基乙醯胺、丙二醇、甘油及聚乙二醇(例如，聚乙二醇300及/或聚乙二醇400)之共溶劑，可包含使用界面活性劑(可用於藉由減小化合物之表面張力而增強其分散或濕潤性質的醫藥學上可接受之表面活性劑)，包括(但不限於)CREMOPHOR、SOLUTOL HS 15、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆(poloxamer)、諸如N－烷基吡咯啶酮(例如，N－甲基吡咯啶酮)及/或聚乙烯吡咯啶酮之吡咯啶酮；亦可包含使用一或多種"緩衝液"(例如，在添加增量之酸或鹼後賦予抵抗介質之有效酸度或鹼度變化之能力的成份)，包括(但不限於)磷酸鈉、檸檬酸鈉、二乙醇胺、三乙醇胺、L－精胺酸、L－離胺酸、L－組胺酸、L－丙胺酸、甘胺酸、碳酸鈉、緩血酸胺(a/k/a三[羥基甲基]胺基甲烷或Tris)及/或其混合物。
本發明之化合物的有效量可由一般技術者來確定，且包括約0.01－10 mg(活性化合物)/kg(體重)的示範性成人日劑量，其可以單劑量投予或以個別分次劑量之形式(諸如，每天1至4次)投予。較佳之範圍包括約0.02至5 mg/kg(體重)之劑量，其中範圍為約0.05－0.3最佳。應瞭解用於任何特殊受檢者之特定劑量及給藥頻率可變化且將視包括如下因素之多種因素而定：所採用之特定化合物之活性、彼化合物之代謝穩定性及作用持續時間、受檢者之種類、年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食、投藥模式及時間、排泄速率、藥物組合及特殊病況之嚴重程度。較佳受治療之受檢者包括患有微管穩定性相關之病況的動物，最佳為哺乳動物類(諸如，人類)及家畜(諸如，狗、貓及其類似家畜)。
諸如在一或多個以下實例中所揭示之化合物的本發明之化合物已在一或多個以下所述檢定及/或此領域中已知之檢定中進行測試，且顯示作為微管穩定劑的可量測之活性水平。
檢定 核心集團細胞群存活檢定
將癌細胞以3.0E＋05個細胞接種於一具有不含葉酸但含有10%胎牛血清及25 mM HEPES之10 ml RPMI1640培養基的T75燒瓶中。使細胞在一含有5% CO2 之37℃恆溫箱中生長2天。於第2天即將上清液自燒瓶移除，且將燒瓶分為兩組。一組細胞係用含有100 M葉酸(Sigma)之5 ml培養基培養30分鐘，且其他細胞係在未添加葉酸之5 ml培養基中生長。接著用20 nM埃坡黴素、埃坡黴素類似物、共軛埃坡黴素或共軛埃坡黴素類似物處理細胞1小時。在培養結束時將藥物自燒瓶移除且用PBS緩衝液洗滌細胞3次。洗滌後，將5 ml完全培養基添加入各燒瓶中，且使細胞在CO2 恆溫箱中生長23小時。次日早晨，藉由胰酶消化將細胞自燒瓶移出，測定細胞數，且接著將細胞塗於一6孔板中。在塗後10天，用結晶紫對群落進行染色，且計數之。測定出存活率。
活體外MTS增殖/細胞毒性檢定
活體外細胞毒性係在腫瘤細胞中使用基於四唑鎓之比色檢定進行評估，該檢定係利用MTS(3－(4,5－二甲基噻唑－2－基)－5－(3－羧基甲氧基苯基)－2－(4－次磺醯基)－2H－四唑鎓，內鹽)代謝性轉化為吸收492 nm之光的還原形式。細胞係在添加埃坡黴素、埃坡黴素類似物、共軛埃坡黴素或共軛埃坡黴素類似物前24小時接種。在用連續稀釋之化合物於37℃下培養72小時後，將與電子偶合劑啡嗪硫酸甲酯組合之MTS添加至細胞中。繼續培養3小時，接著用一分光光度計量測492 nm處的培養基之吸光度以獲得存活細胞相對於對照群體之數量。結果係以中值細胞毒性濃度(IC50 值)表示。
葉酸受體檢定
用於FR檢定之所有樣品製備程序係在4℃下執行。使用一PowerGen 125均質機將組織樣品在均質化緩衝液(10 mM Tris，pH 8.0，亮抑蛋白酶肽及抗蛋白酶各為0.02 mg/ml；1 ml緩衝液/50 mg組織)中均質化。藉由溫和離心(3000 X g，15 min)將大碎片移除。接著藉由以40,000 X g離心60分鐘而收集膜小球，且將其重懸浮於助溶緩衝液(50 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，25 mM正辛基－β－D－葡萄哌喃糖苷，5 mM EDTA及0.02%疊氮化鈉)中。藉由又一次離心(40,000 X g，60分鐘)將不溶物質移除，且藉由二喹啉甲酸(BCA)方法(Pierce Chemical)測定上清液之總蛋白濃度。接著以助溶緩衝液將各樣本稀釋至0.25 mg/ml，且將100 μl置於兩台Microcon－30微型濃縮器(30,000－MW cutoff,Millipore)之每一者內。接著在室溫下以14,000 X g使樣品離心10分鐘以使所有液體通過膜且將溶解之FR保留於微型濃縮器膜之表面上。所有隨後的離心步驟係使用該等相同參數執行。接著將55 μl 30 mM乙酸鹽緩衝液(pH 3.0)添加至各微型濃縮器中，接著進行離心步驟。緊接著將55 μl磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)分配至各微型濃縮器中，接著進行又一次離心。接著將50 μl[3 H]葉酸結合試劑(120 nM[3 H]葉酸(Amersham)在含有500 mM NaCl、2.7 mM KCl及25 mM正辛基－β－D－葡萄哌喃糖苷之10 mM Na2 PO4 ,1.8 mM KH2 PO4 ,pH 7.4中)或50 μl競爭試劑(結合試劑加上120 μM未標記之葉酸)添加至適當濃縮器中。室溫下培養20分鐘後，用75 μl 50 mM正辛基－β－D－葡萄哌喃糖苷，0.7 M NaCl(在PBS中，pH 7.4)洗滌/離心濃縮器三次。最終洗滌後，藉由兩次用含有4% Triton X－100之100 μl PBS進行沖洗而自微型濃縮器之膜表面回收含有溶解之FR的保留物。接著在一液體閃爍計數器(Packard Bioscience)中對樣品進行計數。基於已知標準品之cpm將每分鐘計數(cpm)值轉化為FR之皮莫耳數，且根據樣品蛋白質含量將最終結果正規化。
動物及腫瘤
在該等研究中使用保持在受控環境中且以適量水及食物供應的雌性CD2F1小鼠(Harlan Sprague－Dawley Inc.,20－22 g)。鼠FRα(－)馬迪遜(Madison)109(M109)肺癌(Marks等人，1977)及FR－表現(FRα(＋))98M109變異體係用來評估埃坡黴素、埃坡黴素類似物(例如，埃坡黴素衍生物)、葉酸－埃坡黴素共軛物或葉酸－埃坡黴素類似物共軛物之功效。此外，在裸鼠中生長之人類頭及頸表皮樣癌KB亦用於此目的。
藥物治療及抗腫瘤功效評估
為將埃坡黴素或埃坡黴素類似物投予小鼠，使用由以下物質組成之賦形劑：CREMOPHOR/乙醇/水(1：1：8，v/v)。將化合物首先溶解於CREMOPHOR/水(50：50)之混合物中。在藥物投予前1小時以內進行最終稀釋直至所需劑量濃度。藉由經尾靜脈之團式靜脈注射將藥劑投予大鼠。葉酸－埃坡黴素共軛物或葉酸－埃坡黴素類似物共軛物係於無菌磷酸鹽緩衝鹽水中製備且藉由經尾靜脈之團式靜脈注射以0.01 mL/g(小鼠)之體積投予小鼠。各動物之治療係基於個別體重。
在實驗開始時，集中偵測有意義反應所需之動物的所需數量且對各動物進行腫瘤漿(2% w/v)之皮下接種。使腫瘤生長4天。在第4天，將動物均一地分配至各個治療組及對照組。每天核查經治療之動物的治療相關毒性/死亡率。在治療開始前稱重各組動物(Wt1)然後在最後治療給藥後再次稱重各組動物(Wt2)。體重之差(Wt2－Wt1)提供治療相關毒性之量度。
腫瘤反應係每週兩次藉由用一測徑規量測腫瘤來判定，直至腫瘤達到預定"目標"尺寸1 gm。腫瘤重量(mg)係根據下式來估計：腫瘤重量＝(長度×寬度2 )÷2。
抗腫瘤活性係以最大耐受劑量(MTD)來評估，MTD被定義為低於且最接近過度毒性(亦即，一隻以上死亡)出現之劑量的劑量。當出現死亡時，記錄死亡日期。在腫瘤達到目標尺寸前死亡的經治療之小鼠視為已因藥物毒性而死亡。沒有具有小於目標尺寸之腫瘤的對照小鼠死亡。有一隻以上因藥物毒性而死亡之治療組視為已接受了過度毒性治療，且其資料不包括在化合物之抗腫瘤功效評估中。
腫瘤反應終點係以腫瘤生長延遲(T－C值)表示，該腫瘤生長延遲被定義為經治療之腫瘤(T)達到預定目標尺寸所需之時間(天)與對照組(C)之彼等時間的差。
為評估腫瘤細胞殺滅，首先根據下式計算腫瘤體積倍增時間(TVDT)，TVDT＝對照腫瘤達到目標尺寸之中值時間(天)－對照腫瘤達到一半目標尺寸之中值時間(天)且，對數細胞殺滅＝T－C÷(3.32×TVDT)。
資料之統計評價係使用格翰氏廣義威爾卡遜測試(Gehan's generalized Wilcoxon test)來執行。
縮寫
為了便於參考，在本文之流程及實例中使用以下縮寫：CBZ－OSu＝N－(苯甲氧基羰基氧基)琥珀醯亞胺DCM＝二氯甲烷DEA＝二乙胺DIAD＝偶氮二甲酸二異丙酯DIPEA＝二異丙基乙胺DMA＝二甲胺DMF＝二甲基甲醯胺DMSO＝二甲亞碸EDC＝1－(3－二甲基胺基丙基)－3－乙基碳化二醯亞胺鹽酸鹽EtOH＝乙醇EtOAc＝乙酸乙酯FR＝葉酸受體HOBt＝n－羥基苯幷三唑HPCL＝高效液相層析iPr－OH或IPA＝異丙醇LC/MS＝液相層析/質譜分析LDA＝二異丙基醯胺鋰MeOH＝甲醇OTES＝o－三乙基矽烷基OMs＝甲磺酸鹽Ph＝苯基Pd/C＝碳載鈀PyBOP＝六氟磷酸苯幷三唑－1－基－氧基三吡咯啶基鏻Py＝吡啶基RT＝室溫Sat'd＝飽和THF＝四氫呋喃TFA＝三氟乙酸TLC＝薄層層析TESCL＝氯三乙基矽烷UV＝紫外線
製備之方法
本發明之化合物一般可根據以下流程及熟習此項技術者之知識及/或使用美國專利第6,605,599號；第6,831,090號；第6,800,653號；第6,291,684號；第6,719,540號；第7,172,884號、美國專利申請公開案第2005/0002942號及Organic Letters, 2001,3 ,2693－2696(其揭示內容以引用的方式併入本文中)中及/或在以下實例中所述之方法進行製備。
如流程1中所示，式X之化合物可自式II之化合物來製備。式II之化合物可藉由醱酵(參見，例如，Gerth等人之"Studies on the Biosynthesis of Epothilones：The Biosynthetic Origin of the Carbon Skeleton"，Journal of A ntibiotics，第53卷，第12號(2000年12月)及Hofle等人之"Epothilone A and B－ Novel 16－Membered Macrolides：Isolation,Crystal Structure,and Conformation in Solution"，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，第35卷，第13/14號，1567－1569(1996)，其揭示內容以引用的方式併入本文中)或藉由合成(參見，例如，Vite等人之美國專利第6,605,599號；第6,242,469號；第6,867,333號及美國專利申請公開案2006/004065，及Johnson等人之Organic Letters, 2000 ,2 ：1537－1540，其揭示內容之全文以引用的方式併入本文中)獲得。舉例而言，式II之化合物(其中R2 、R3 、R4 、R5 及R12 為甲基，B1 為羥基，R1 與R6 為氫，且R2 為2－甲基噻唑－4－基)係稱為埃坡黴素A且如以上所提及可自纖維堆囊菌 之醱酵獲得。式II之化合物可轉化為P為矽烷基保護基(諸如，三乙基矽烷基、第三丁基二甲基矽烷基、第三丁基二苯基矽烷基、三異丙基矽烷基及其類似基團)的式III之化合物(參見，例如，Greene等人，"Protective groups in Organic Synthesis"，John Wiley and Sons,Inc.)。例如，P為三乙基矽烷基的式III之化合物可藉由在胡尼格氏鹼(Hunig's base)存在下用氯三乙基矽烷處理式II之化合物而製備。在B1 於式II之化合物中為羥基之狀況下，則B1 亦將轉化為相應之矽烷基醚。式IV之鹵醇(Y為Cl、Br或I)可藉由此項技術中已知之方法，藉由用金屬鹵化物鹽處理而自式III之化合物製備。舉例而言，在低溫(－20至－5℃)下使用溴化鎂醚合物之環氧化物開環可提供非對映異構體鹵醇，其中Y為溴。式V之化合物可藉由使用(例如)疊氮化鈉在諸如二甲基甲醯胺之極性溶劑中置換鹵素而自式IV之化合物製備。一般技術者將認識到如流程I中所示的C12 處之立體化學不應解釋為限制性的，而應解釋為示範性的。必要時，則C12 位置處之立體化學的反轉可按照此項技術中所確定之光延(Mitsunobu)方案達成。例如，用對硝基苯甲酸、偶氮二羧酸二乙酯及三苯膦處理式V之化合物提供相應之硝基苯甲酸酯，其可接著使用(例如)氨之甲醇溶液的溫和酯水解而裂解以提供式VI之化合物。同樣地，如化合物VI中所示的C12 之立體化學為非限制性的，且如此圖示以顯示如所述的化合物V之處理將反轉彼位置處之立體化學。或者，其他有機酸、偶氮二羧酸酯及有機膦可用於實現光延反轉。OG為脫離基(諸如，甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、硝基苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基及其類似基團)的式VII之化合物可藉由此項技術中已知之方法自式VI之化合物來製備。例如，在諸如二氯甲烷之合適有機溶劑中用甲烷磺醯氯及三乙胺處理VI提供OG為甲磺酸酯基的式VII之化合物。式VIII之化合物可藉由用諸如有機膦(例如，三甲膦)之還原劑使疊氮基還原而自式VII之化合物製備。或者，式VIII之化合物可使用諸如三苯膦之有機膦還原劑自式VI之化合物直接製備。式IX之化合物可藉由此項技術中已知之方法自式VIII之化合物來製備(參見，例如，美國專利第6,800,653號；及Regueiro－Ren等人，Organic Letters, 2001,3 ,2693－2696)。舉例而言，H－K－A－為2－羥基乙基的式IX之化合物可使用(例如)過量2－溴乙醇及諸如碳酸鉀之鹼，藉由氮丙啶環之烷基化作用自式VIII之化合物來製備。式X之化合物可藉由使用此項技術中已知之方法移除矽烷基醚保護基而自式IX之化合物來製備(參見，例如，Greene等人，"Protective groups in Organic Synthesis"，John Wiley and Sons,Inc.)。例如，當P為三乙基矽烷基時，在二氯甲烷中用三氟乙酸處理式IX之化合物實現去保護作用以提供式X之化合物。
流程2顯示一種用於製造葉酸類似物或衍生物V及具有以下式XI之二價連接子T－Q的方法，該葉酸類似物或衍生物V及二價連接子T－Q可與本發明之化合物一起使用以製造先前所述的用於目標藥物傳遞之(例如)根據式I之共軛分子。如流程2中所示，葉酸類似物及二價連接子可使用此項技術中已知之方法進行裝配，特別係在V為葉酸或葉酸類似物(如揭示內容以引用的方式併入本文中之Jackson等人之Advanced Drug Delivery Rev. 56(2004)1111－1125所述進行裝配)及T－Q為肽之狀況下。例如，肽基葉酸XI可如流程2中所示來製備。用Fmoc保護之天門冬胺酸、精胺酸、天門冬胺酸及接著麩胺酸使負載半胱胺酸之聚苯乙烯樹脂發生連續肽偶合可使用PyBOP作為偶合劑及哌啶作為Fmoc去保護劑而實現。N10 －三氟乙醯胺保護之喋酸可藉由將葉酸酶促(羧肽酶G)轉化為喋酸且接著使用三氟乙酸酐進行N10 －保護而以兩步來製備。接著，N10 －保護之喋酸與樹脂結合肽偶合，隨後用三氟乙酸自樹脂裂解出且使用氫氧化銨移除N10 －三氟乙醯基提供式I之化合物的V－T－Q片段，其中V為葉酸且T－Q為－Asp－Arg－Asp－Cys－OH。或者，可使用喋酸類似物替代喋酸，且可使用其他胺基酸替代流程2中所說明之彼等胺基酸。
以下流程3顯示一種使用本發明之埃坡黴素衍生物以製備用於目標藥物傳遞的式I之共軛分子之方法。如流程3中所示，式I之化合物的裝配可藉由使式X之化合物與片段V－T－Q偶合且藉由逐步併入可釋連接子M而達成。舉例而言，－A－K－H為－CH2 CH2 OH的式X之化合物可使用式XII之活化苯幷三唑化合物而轉化為碳酸二硫基乙酯XIII。式XII之化合物可自巰基乙醇、甲氧羰基次磺醯氯及視情況經取代之2－巰基吡啶進行製備以提供中間物2－(2－吡啶－2－基)二硫基)乙醇，其可接著藉由用雙碳醯氯及視情況經取代之1－羥基苯幷三唑處理而轉化為式XII之化合物。二硫化物與諸如XI之肽基葉酸的隨後交換提供式I之化合物，其中V為葉酸，T－Q為－Asp－Arg－Asp－Cys－OH，M為－SCH2 CH2 O(C＝O)－，A為－CH2 CH2 －且K為O。
流程4闡明一種自式XIV之化合物製造式X之化合物的替代性方法。式XIV之化合物可藉由此領域中熟知之方法獲得，例如，藉由醱酵(參見，例如，Gerth等人，"Studies on the Biosynthesis of Epothilones：The Biosynthetic Origin of the Carbon Skeleton"，Journal of Antibiotics，第53卷，第12號(2000年12月)及Hofle等人，"Epothilone A and B－Novel 16－Membered Macrolides：Isolation,Crystal Structure,and Conformation in Solution"，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，第35卷，第13/14號，1567－1569(1996)，其揭示內容以引用的方式併入本文中)或藉由全合成(參見，例如，Vite等人，美國專利第6,605,599號；第6,242,469號；第6,867,333號及美國專利申請公開案2006/004065，其揭示內容之全文以引用的方式併入本文中)獲得。舉例而言，式XIV之化合物(其中R2 、R3 、R4 、R5 及R12 為甲基，B1 為羥基，R1 與R6 為氫，且R2 為2－甲基噻唑－4－基)係稱為埃坡黴素C，且如上所提及可自纖維堆囊菌 之醱酵獲得。式XIV之化合物可轉化為P為矽烷基保護基(諸如，三乙基矽烷基、第三丁基二甲基矽烷基、第三丁基二苯基矽烷基、三異丙基矽烷基及其類似基團)的式XV之化合物(參見，例如，Greene等人，"Protective groups in Organic Synthesis"，John Wiley and Sons,Inc.)。例如，P為三乙基矽烷基的式XV之化合物可藉由在諸如胡尼格氏鹼之鹼存在下用氯三乙基矽烷處理式XIV之化合物而製備。在B1 於式XIV之化合物中為羥基之狀況下，則B1 亦將轉化為相應之矽烷基醚。式XVI或XVII之鹵醇(Y為Cl、Br或I)可藉由此項技術中已知之方法，藉由用鹵素Y2 處理而自式XV之化合物製備。例如，使用碘在諸如乙腈之極性溶劑中的親電子加成可立體選擇性地提供式XVI及XVII之區位異構鹵醇，其中Y為碘。或者N－鹵基琥珀醯亞胺亦可用於相同轉化。式XVIII之化合物可在諸如乙腈/水之極性/水性溶劑系統中於諸如三乙胺或胡尼格氏鹼之鹼存在下藉由環氧化物閉環而自式XVI及/或XVII之化合物製備。必要時，則化合物XIV可直接轉化為式XVI及/或XVII之化合物(其中P為H)，其可接著轉化為環氧化物XVIII(其中P為H)。式XVIII之化合物可在醇溶劑中於無機疊氮化物鹽或四烷基銨疊氮化物存在下藉由疊氮化物置換而轉化為式VI及XIX之疊氮基醇。在P為矽烷基保護基之狀況下，OG為脫離基(諸如，甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、硝基苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基及其類似基團)的式XX及/或XXI之化合物可藉由此項技術中已知之方法自式VI及/或XIX之化合物來製備。例如，在諸如二氯甲烷之合適有機溶劑中用甲烷磺醯氯及三乙胺處理VI及/或XIX提供OG為甲磺酸酯基的式XX及XXI之化合物。式VIII之化合物可經由此項技術中已知之方法，藉由疊氮基之還原自式XX及/或XXI之化合物製備。例如，化合物VIII可在諸如乙腈之極性溶劑中經由與諸如有機膦(例如，三甲膦)之還原劑反應而自式XX及/或XXI之化合物製備。或者，當P為H時，式VIII之化合物可在諸如乙腈之極性溶劑中藉由用諸如有機膦(例如，三苯膦)之還原劑使疊氮基還原而自式VI及/或XIX之化合物直接製備。式IX之化合物可藉由此項技術中已知之方法自式VIII之化合物製備(參見，例如，美國專利第6,800,653號；及Regueiro－Ren等人，Organic Letters, 2001,3 ,2693－2696)。舉例而言，H－K－A－為2－羥基乙基的式IX之化合物可使用(例如)過量2－溴乙醇及諸如碳酸鉀之鹼，藉由氮丙啶環之烷基化作用自式VIII之化合物製備。在P為三烷基矽烷基之狀況下，式X之化合物可藉由使用此項技術中已知之方法移除矽烷基醚保護基而自式IX之化合物製備(參見，例如，Greene等人，"Protective groups in Organic Synthesis"，John Wiley and Sons,Inc.)。舉例而言，當P為三乙基矽烷基時，在二氯甲烷中用三氟乙酸處理式IX之化合物實現去保護作用以提供式X之化合物。
現將根據以下例證性實例來進一步描述本發明。
實例 實例1 葉酸共軛埃坡黴素類似物
如以上詳細描述中所述，葉酸類似物及衍生物係描述於Vlahov中。在針對共軛埃坡黴素及埃坡黴素類似物化合物的葉酸受體靶向腫瘤細胞之研究與開發中，一些化合物係與葉酸共軛。例如，化合物AA與化合物BB被視為與葉酸共軛之候選物：
化合物AA在II期臨床試驗中具有活性，且製備化合物AA(化合物AA.I至AA.VI；參見圖1 )之六種葉酸共軛物且視情況在細胞培養中測試其化學穩定性、FR結合及FR介導之活性。
化合物AA之該等葉酸共軛物與FR的結合係在量測放射性標記之葉酸自生長至匯合之KB腫瘤細胞中表現之FR移位的檢定中測定。化合物AA.I及AA.II之葉酸共軛物與FR之結合結果被認為係可接受的[相對親和力(RA)大於0.25；葉酸之RA等於1.0]。然而，令人驚訝的係圖1中所示的化合物AA之六種共軛物中沒有一種共軛物在量測3 H－胸苷併入之抗增殖檢定中顯示抗KB腫瘤細胞之明顯細胞毒性(資料未顯示)。
因化合物AA之共軛物顯示不令人滿意的抗腫瘤細胞之細胞毒性，故使用化合物BB(化合物BB.I至BB.III)之三種共軛物進行研究。化合物BB亦稱為埃坡黴素F，且為化合物AA(其中21－胺基係由21－羥基取代)之類似物。化合物BB.II(圖2 )在高濃度下顯示細胞毒性的同時，活性在使用過量葉酸之競爭性研究中不衰減。因此，所觀測之細胞毒性係歸因於化合物BB.II之非特異性釋放。
其他埃坡黴素類似物(例如，吖丙啶基埃坡黴素)在此項技術中係已知的(參見，例如，美國專利第6,399,638號；Regueiro－Ren,A等人，(2001)Org.Letters. 3：2693－96)且顯示有效之抗腫瘤細胞毒性。例如，進行比較許多種埃坡黴素類似物抗一對抗紫杉烷癌細胞株(HCTVM46與A2790Tax)之相對細胞毒性效能的MTS檢定(參見表1)。HCTVM46為源自敏感性HCT116母株之人類結腸癌細胞株，且由於170 kD p－糖蛋白藥物流出轉運體之過度表現而對紫杉烷有抗性。A2780Tax為源自A2780母株之人類卵巢癌細胞株，且因微管蛋白胺基酸序列中使結合紫杉醇之能力削弱的突變故對紫杉醇有抗性。
如表1中所示，與其他已知抗腫瘤劑(例如，紫杉醇、化合物AA及埃坡黴素B)相比，各種吖丙啶基埃坡黴素類似物(化合物CC－EE)顯示抗HCT116結腸癌細胞株及A2780卵巢癌細胞株之有效抗腫瘤活性。
不論吖丙啶基埃坡黴素化合物CC－EE之抗腫瘤活性如何，可用於與葉酸共軛之該等分子上的僅有羥基為存在於C3 及C7 碳原子上之彼等。因此，在已對許多坡黴素化合物及類似物進行研究後，仍需要發現將容易用於與葉酸共軛且將經由活性埃坡黴素部分在腫瘤細胞中之特異性釋放而表現活性的化合物。
發現具有下式之吖丙啶基埃坡黴素化合物G
化合物G(參見實例2及3)令人驚訝地顯示出容易與葉酸共軛以形成化合物J(參見實例2)，當與葉酸相比時，其與葉酸受體之相對親和力為0.77。
意外的係氮丙啶側鏈上之極性羥基不對氮丙啶埃坡黴素類似物之抗腫瘤活性產生不利影響。此點係重要的，原因在於係氮丙啶埃坡黴素類似物(例如，化合物G)在自葉酸釋放後介導抗腫瘤作用。化合物G及三種其他高度有效之埃坡黴素類似物(伊沙匹隆、化合物AA及化合物BB)之效能係藉由以上所述之群落形成檢定來評估。殺滅90%核心集團KB癌細胞所需之濃度(IC90 )係在藥物暴露持續時間為17小時後進行測定。如圖3 中所示，化合物G呈現IC90 為4.3 nM，且效能分別為化合物CC、化合物AA及伊沙匹隆之約2倍、4倍及6倍。
形成化合物J的化合物G之共軛不影響化合物G之抗腫瘤活性。化合物J在活體內表現相當高的抗腫瘤細胞之細胞毒素活性。在KB活體內FRα(＋)腫瘤模型中，化合物J在最大耐受劑量(MTD)及在產生最低毒性之兩個較低劑量下表現活性(參見圖4 )。相比之下，伊沙匹隆僅在其MTD(5 μmol/kg)下有活性。當在MTD比較時，化合物J產生比伊沙匹隆高之抗腫瘤作用(圖4 )。
相比之下，在FRα(－)M109母瘤模型中，化合物J在所有測試劑量(包括在其MTD(2.4 μmol/kg))下具有較弱活性，而伊沙匹隆在其為5 μmol/kg之MTD下有活性(圖5 )。該等結果表明FRα(－)M109對伊沙匹隆敏感且化合物J之無活性可能在很大程度上為該腫瘤不表現FRα之結果。該等結果亦提供化合物J之抗腫瘤活性可經由FRα受體來介導的證據。
化合物J的FRα介導之藥物傳遞機制之另外證據係由觀測到共投予劑量為化合物J劑量之20倍的過量葉酸類似物可充分與化合物J競爭與受體之結合且使FRα(＋)98M109腫瘤免於受化合物J之抗腫瘤作用的影響來提供(圖6) 。因化合物G及共軛物(化合物J)在活體外及在活體內具有驚人之抗腫瘤作用且因化合物J之抗腫瘤活性可歸因於FRα(＋)－介導之作用，故本文中亦描述形成化合物J(參見實例2)的吖丙啶基埃坡黴素類似物化合物G(參見實例2及3)之共軛。
實例2 化合物J之製備
(S)－2－(4－((2－胺基－4－側氧基－3,4－二氫喋啶－6－基)甲基胺基)苯甲醯胺基)－5－((S)－3－羧基－1－((S)－1－((S)－3－羧基－1－((R)－1－羧基－2－(2－(2－((2－((1S,3S,7S,20R,11S,12S,16R)－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－5,9－二側氧基－4－氧雜－17－氮雜－雙環[14.1.0]十七烷－17－基)乙氧基)羰基氧基)乙基)二硫基)乙基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－胍基－1－側氧基戊烷－2－基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－側氧基戊酸A.[1S－[1R ＊ ,3R ＊ (E),7R ＊ ,10S ＊ ,11R ＊ ,12R ＊ ,16S ＊ ]]－8,8,10,12－四甲基－3－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－7,11－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－4,17－二氧雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮
在N2 氣氛下將三乙基矽烷基氯(15.0 mL,89.4 mmol)添加至埃坡黴素A(5.0 g,10.1 mmol)、咪唑(3.40 g,49.9 mmol)及DIPEA(28.5 mL,163.6 mmol)於無水DMF(100 mL)中之攪拌溶液中。添加完成後，將反應溶液保溫在55℃下(油浴溫度)歷時12小時以得到所要產物之單點(tlc)。
將上述反應又重複兩次。在高真空下使組合溶液之DMF蒸餾。藉由管柱層析(矽膠，E.Merck，230－400目，600 g；5：95、10：90及15：85 EtOAc/己烷)將泡沫狀殘餘物純化以得到19.4 g(88.6%)呈白色固體之化合物A。
HPLC：ES Industries FluoroSep RP苯基，4.6×250 mm，等度，30 min，100%B，(B＝90% MeOH/H2 O＋0.2% H3 PO4 )，流動速率為1.0 ml/min，UV 254，t＝23.15 min。LC/MS(ES＋)722(M＋H)。
B.[4S－[4R ＊ ,7S ＊ ,8R ＊ ,9R ＊ ,13S ＊ ,14S ＊ ,16R ＊ (E)]]－14－溴－13－羥基－5,5,7,9－四甲基－16－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4,8－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－1－氧雜環十六烷－2,6－二酮之製備
於－20℃下，在N2 氣氛下將MgBr2 －Et2 O(3×2.13 g,24.78 mmol)分三份每隔兩小時一次添加至[1S－[1R＊ ,3R＊ (E),7R＊ ,10S＊ ,11R＊ ,12R＊ ,16S＊ ]]－8,8,10,12－四甲基－3－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－7,11－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－4,17－二氧雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮(5.0 g,6.92 mmol)於無水二氯甲烷(140 mL)中之攪拌溶液中同時維持內部溫度低於－5℃。約7小時後，將反應混合物用二氯甲烷稀釋，且用飽和NaHCO3 洗滌2次，經無水Na2 SO4 乾燥且在真空中蒸發以得到發泡體。藉由管柱層析(矽膠，E.Merck，230－400目，180 g；5：95、7.5：92.5及12.5：87.5 EtOAc/己烷)使殘餘物純化以得到與回收之起始物質(0.9 g,18%)一起的呈白色發泡體之化合物B(2.5 g，45%產率)。
HPLC：ES Industries FluoroSep RP苯基，4.6×250 mm，等度，30 min，100%B，(B＝90% MeOH/H2 O＋0.2% H3 PO4 )，流動速率為1.0 ml/min，UV 254，t＝14.37 min。(100%純度)LC/MS(ES＋)：802(M＋H)。
C.[4S－[4R ＊ ,7S ＊ ,8R ＊ ,9R ＊ ,13S ＊ ,14R ＊ ,16R ＊ (E)]]－14－疊氮基－13－羥基－5,5,7,9－四甲基－16－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4,8－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－1－氧雜環十六烷－2,6－二酮之製備
在室溫下，於N2 氣氛下將疊氮化鈉(8.01 g,123.3 mmol)及18－冠(crown)－6(3.26 g,12.3 mmol)添加至[4S－[4R＊ ,7S＊ ,8R＊ ,9R＊ ,13S＊ ,14S＊ ,16R＊ (E)]]－14－溴－13－羥基－5,5,7,9－四甲基－16－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4,8－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－1－氧雜環十六烷－2,6－二酮(9.9 g,12.3 mmol)於1.2 L DMF中之溶液中。在室溫下將澄清溶液機械攪拌7天。將溶液用EtOAc(4 L)稀釋，且用H2 O(6×3 L)洗滌。乾燥(Na2 SO4 )有機層，且接著蒸發以得到9.2 g粗產物。管柱層析(矽膠450 g，5－15% EtOAc/己烷)提供6.7 g(71%產率)呈白色發泡體之化合物C。
HPLC：YMC ODS－A S5，4.6×50 mm，等度，30 min，100%B，(B＝90% MeOH/H2 O＋0.2% H3 PO4 )，流動速率為4.0 mL/min，UV 254 nm，t＝2.00 min。LC/MS(ES＋)765(M＋H)。
D.[4S－[4R ＊ ,7S ＊ ,8R ＊ ,9R ＊ ,13R ＊ ,14R ＊ ,16R ＊ (E)]]－14－疊氮基－5,5,7,9－四甲基－16－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－13－[(4－硝基苯甲醯基)氧基]－4,8－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－1－氧雜環十六烷－2,6－二酮之製備
將[4S－[4R＊ ,7S＊ ,8R＊ ,9R＊ ,13S＊ ,14R＊ ,16R＊ (E)]]－14－疊氮基－13－羥基－5,5,7,9－四甲基－16－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4,8－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－1－氧雜環十六烷－2,6－二酮(7.0 g,9.15 mmol)、4－硝基苯甲酸(3.82 g,22.9 mmol)及三苯膦(6.0 g,22.9 mmol)溶解於THF(100 mL)中。經5分鐘之時段添加偶氮二羧酸二乙酯(9.0 mL 40%於甲苯中之溶液，22.9 mmol)。將反應混合物在室溫下維持4小時，濃縮，且藉由矽膠層析(5%乙酸乙酯/己烷至15%乙酸乙酯/己烷之階式梯度)純化以分離出呈白色發泡體之硝基苯甲酸酯(7.3 g,87%)。
LC－MS：Phenomenex C18，4.6×50 mm，等度，15 min，100%B，(B＝90% MeOH/H2 O＋0.1% TFA)，流動速率為4.0 mL/min，UV 220 nm。滯留時間＝8.9 min。MS(ESI)M＋H＝886.7。
E.[4S－[4R ＊ ,7S ＊ ,8R ＊ ,9R ＊ ,13R ＊ ,14R ＊ ,16R ＊ (E)]]－14－疊氮基－13－羥基－5,5,7,9－四甲基－16－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4,8－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－1－氧雜環十六烷－2,6－二酮之製備
將硝基苯甲酸酯化合物D(7.3 g,7.98 mmol)溶解於乙酸乙酯(35 mL)中且冷卻至0℃。添加於甲醇中之氨(350 mL 2 M於甲醇中之溶液)，且在室溫下將反應混合物攪拌4小時，濃縮，且藉由矽膠層析(10%乙酸乙酯/己烷至30%乙酸乙酯/己烷之階式梯度)純化以分離出呈玻璃狀白色固體之[4S－[4R＊ ,7S＊ ,8R＊ ,9R＊ ,13R＊ ,14R＊ ,16R＊ (E)]]－14－疊氮基－13－羥基－5,5,7,9－四甲基－16－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4,8－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－1－氧雜環十六烷－2,6－二酮(5.97 g,98%)。
LC－MS：Phenomenex C18，4.6×50 mm，等度，5 min，100%B，(B＝90% MeOH/H2 O＋0.1% TFA)，流動速率為4.0 mL/min，UV 220 nm。滯留時間＝2.25 min。MS(ESI)M＋H＝765.66。
F.[1S－[1R ＊ ,3R ＊ (E),7R ＊ ,10S ＊ ,11R ＊ ,12R ＊ ,16S ＊ ]]－8,8,10,12－四甲基－3－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－7,11－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－4－氧雜－17－氮雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮之製備
將[4S－[4R＊ ,7S＊ ,8R＊ ,9R＊ ,13R＊ ,14R＊ ,16R＊ (E)]]－14－疊氮基－13－羥基－5,5,7,9－四甲基－16－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4,8－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－1－氧雜環十六烷－2,6－二酮(5.97 g,7.8 mmol)及三乙胺(4.34 mL,31.2 mmol)溶解於二氯甲烷(85 mL)中且冷卻至0℃。經5分鐘之時段逐滴添加甲烷磺醯氯(1.8 mL,23.4 mmol)。10分鐘後，將反應混合物自冰浴移出，且在室溫下攪拌。3小時後，將反應混合物溶解於飽和NaHCO3 (300 mL)中，用二氯甲烷(3×100 mL)萃取，經Na2 SO4 乾燥，濃縮且在未進一步純化下用於下一步。
將粗甲烷磺酸酯溶解於THF/H2 O(12：1,130 mL)中。添加三乙胺(2.2 mL,16 mmol)及三甲膦(16 mmol，16 mL 1.0 M於THF中之溶液)，且將反應混合物在室溫下攪拌。3小時後，將反應物在45℃下加熱7小時，濃縮，且藉由矽膠層析(2%甲醇/三氯甲烷至5%甲醇/三氯甲烷之階式梯度)純化以分離呈白色固體之化合物F(5.08 g，88%，對兩個步驟而言)。
LC－MS：Phenomenex C18，4.6×50 mm，等度，5 min，100%B，(B＝90% MeOH/H2 O＋0.1% TFA)，流動速率為4.0 mL/min，UV 220 nm，滯留時間＝0.298 min。MS(ESI)M＋H＝721.58。
G.[1S－[1R ＊ ,3R ＊ (E),7R ＊ ,10S ＊ ,11R ＊ ,12R ＊ ,16S ＊ ]]－7,11－二羥基－17－[2－羥基乙基]－8,8,10,12－四甲基－3－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4－氧雜－17－氮雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮之製備
將K2 CO3 (1.4 g,10.2 mmol)及2－溴乙醇(0.52 mL,7.3 mmol)添加至乙腈(20 mL)中之[1S－[1R＊ ,3R＊ (E),7R＊ ,10S＊ ,11R＊ ,12R＊ ,16S＊ ]]－8,8,10,12－四甲基－3－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－7,11－雙[(三乙基矽烷基)氧基]－4－氧雜－17－氮雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮(1.05 g,1.46 mmol)中，且加熱至82℃。4小時後，添加另外2－溴乙醇(0.52 mL,7.3 mmol)及K2 CO3 (1.4 g,10.2 mmol)。5小時後，添加另外2－溴乙醇(0.21 mL,2.92 mmol)。3小時後，將反應混合物冷卻至室溫，經由矽藻土過濾，用乙腈(5×5 mL)、二氯甲烷(2×5 mL)洗滌，濃縮且在未進一步純化下用於下一步。
將粗反應產物溶解於二氯甲烷(40 mL)中，冷卻至0℃，且添加三氟乙酸(8.0 mL)。1小時後，將反應混合物濃縮，溶解於飽和NaHCO3 (200 mL)中，用二氯甲烷(3×100 mL)萃取，經Na2 SO4 乾燥，濃縮，且藉由矽膠層析(10%甲醇/二氯甲烷)純化以分離出呈透明薄膜之[1S－[1R＊ ,3R＊ (E),7R＊ ,10S＊ ,11R＊ ,12R＊ ,16S＊ ]]－7,11－二羥基－17－[2－羥基乙基]－8,8,10,12－四甲基－3－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4－氧雜－17－氮雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮(化合物G)(0.62 g，79%，對兩個步驟而言)。
LC－MS：Waters Sunfire C18，4.6×50 mm，梯度，0至100%B，經4分鐘。(A＝10% MeOH/H2 O＋0.1% TFA；B＝90% MeOH/H2 O＋0.1% TFA)，流動速率為4.0 mL/min，UV 220 nm。滯留時間＝2.12 min。MS(ESI)M＋H＝537.52。
H.(S)－2－(4－((2－胺基－4－側氧基－3,4－二氫喋啶－6－基)甲基胺基)苯甲醯胺基)－5－((S)－3－羧基－1－((S)－1－((S)－3－羧基－1－((S)－1－羧基－2－巰基乙基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－胍基－1－側氧基戊烷－2－基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－側氧基戊酸之製備
(S)－2－(4－((2－胺基－4－側氧基－3,4－二氫喋啶－6－基)甲基胺基)苯甲醯胺基)－5－((S)－3－羧基－1－((S)－1－((S)－3－羧基－1－((S)－1－羧基－2－巰基乙基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－胍基－1－側氧基戊烷－2－基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－側氧基戊酸係藉由固相肽合成自H－Cys(4－甲氧基三苯甲基)－2－氯三苯甲基－樹脂開始以5步合成。表2顯示合成中所使用之試劑的量。
使用以下程序：偶合步驟： 將胺基酸溶液、DIPEA及PyBOP添加至一肽合成容器中之樹脂中。使混合物起泡1小時，且用DMF及異丙醇洗滌3次。FMOC去保護係在各胺基酸偶合前藉由用DMF中之20%哌啶處理2次(10 min)的方式進行。針對各胺基酸偶合步驟重複該程序。
N 10 －TFA保護之喋酸的合成： 將200 g(0.453 mol)葉酸添加至一配備有一加熱套之22 L機械攪拌之圓底燒瓶中的10 L 0.1 M三羥甲基胺基甲烷(tris base)溶液(121.1 g三羥甲基胺基甲烷於10 L水中)中。攪拌混合物以溶解葉酸且接著添加500 mg(3.67 mmol)氯化鋅。添加羧肽酶G(13×20單位小瓶(unit vials)，可自Sigma獲得)且用1 N HCl將pH值調至7.3，且在整個反應期間保持此pH值。使混合物避光，且在30℃下加熱8－10天(使用一自動滴定器以保持pH值不變使得轉化時間減少4－5天)。反應係藉由分析型HPLC來監控直至達到80%轉化率(另外轉化率係適當的但並非最佳的)。藉由使用6 N HCl將溶液之pH值調至3.0而將產物自反應混合物沈澱出。將漿料轉移至一離心小瓶中且以4000 rpm離心10分鐘。傾析出上清液。接著如下直接純化濕固體(濕固體可經冰凍以便儲存或先凍乾之；然而，濕固體在溶解前儲存於冷凍器中更為有效)。將1.0 M NaOH添加至700 mL水中之40 g粗喋酸中直至pH值為11.5。將混合物過濾(惠特曼(Whatman)1型)且接著進行層析(管柱：10×120 cm；固定相：8 kg DEAE纖維素；移動相：1.0 M NaCl/0.01 M NaOH，pH＝11.5；流動速率：17 ml/min)。收集1公升黃色溶離份且藉由HPLC對其進行分析。用6 M HCl將含有純喋酸之溶離份調節至pH值為3以使喋酸沈澱。以3000 rpm使混合物離心20分鐘。傾析出上清液，且用水洗滌三次。將固體凍乾至少72小時。殘餘水對下一反應之影響未知。
在高真空下經P2 O5 使喋酸進一步乾燥24小時以上(注意保護步驟中在沒有該另外乾燥步驟之狀況下獲得類似結果)。隨後將100 g(0.32 mol)喋酸添加至一配備有一機械攪拌器及一氬氣入口之5 L圓底燒瓶中，且在高真空下隔夜儲存。添加氬氣，接著添加3500 g(2316 mL)三氟乙酸酐。用一橡皮塞或氬氣入口轉接器密封燒瓶，且接著用力攪拌。使燒瓶避光且在室溫、氬氣氣氛下攪拌7天(反應係藉由各自用水及DMSO稀釋20倍之等分試樣的HPLC來監控)。將混合物旋轉蒸發至乾燥且用水中之2.5 L 3%三氟乙酸處理。將混合物在室溫下隔夜攪拌以水解酸酐副產物。旋轉蒸發得到乾燥固體。將固體懸浮於2 L水中，且接著在250 mL離心管中以3000 rpm離心20分鐘。移除上澄液，且用水洗滌固體並離心(4次)。將固體凍乾3天，轉移至琥珀色瓶中，且在P2 O5 存在下於高真空下乾燥2天(純度95%；藉由元素分析評估殘餘TFA)。
裂解步驟： 使用自92.5%(50 mL)TFA、2.5%(1.34 mL)H2 O、2.5%(1.34 mL)三異丙基矽烷及2.5%(1.34 mL)乙烷二硫醇製備之裂解劑將受保護中間物自樹脂釋放。將裂解劑添加至反應容器(25 mL)中。使氬氣發泡通過混合物歷時1.5小時。將液體自容器排出，且用剩餘試劑(3×8 mL)洗滌樹脂。藉由旋轉蒸發使揮發物濃縮至體積為10 mL。添加乙醚(35.0 mL)以實現沈澱。藉由離心收集固體，且乾燥以得到1.25 g裂解產物。
去保護步驟： 在鹼性條件下移除喋酸部分中之N10 －三氟乙醯基保護基。以10 mL水中之250 mg保護中間物開始，使用4：1 H2 O：氫氧化銨(1－2 mL)將pH值調節至9.3且維持1小時。1小時後，用1 N HCl(約1 mL)將pH值調節至5，且藉由製備型HPLC純化產物以得到125 mg化合物H。
HPLC純化條件： 管柱：Waters NovaPak C18 300×19 mm溶劑A：10 mM乙酸銨緩衝液，pH＝5溶劑B：乙腈溶離：1%B至20%B，40 min，15 mL/min自組合反應之總產量：625 mg
I.碳酸2－((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－5,9－二側氧基－4－氧雜－17－氮雜－雙環[14.1.0]十七烷－17－基)乙酯2－(2－(吡啶－2－基)二硫基)乙酯之製備1.2－(2－(吡啶－2－基)二硫基)乙醇之製備
將巰基乙醇(7.6 mL,110 mmol)逐滴添加至甲氧基羰基次磺醯氯(10 mL,110 mmol)於二氯甲烷(100 mL)中的冷卻至0℃之溶液中。使反應混合物在0℃下攪拌30分鐘。此時，添加2－巰基吡啶(12.2 g,110 mmol)於二氯甲烷(160 mL)中之溶液。使溶液在0℃下反應1小時且接著使其溫至室溫，歷時又一小時。觀察到固體產物已自溶液沉下。TLC(1：1 Pet醚/EtOAc)顯示已形成有效產物。將反應混合物濃縮至體積為125 mL。經由一布赫納(Buchner)漏斗過濾混合物。用二氯甲烷洗滌濾餅且接著在真空下隔夜乾燥以得到呈鹽酸鹽之2－(2－(吡啶－2－基)二硫基)乙醇(23.6 g)。
TLC ：Rf ＝0.45板－EMD矽膠60 F254 ，5×10 cm，250 M
2.碳酸苯幷[d][1,2,3]三唑－1－基酯2－(2－(吡啶－2－基)二硫基)乙酯之製備
將雙碳醯氯(2.28 g,11.5 mmol)於15 mL無水二氯甲烷中之溶液在氬氣下於一圓底燒瓶中攪拌且藉由冰/鹽浴冷卻。將一具有2－(吡啶－2－基二硫基)乙醇(5.01 g,22.4 mmol)與三乙胺(2.25 g,22.2 mmol)於65 mL無水二氯甲烷中之混合物的加料漏斗置於圓底燒瓶上。經20分鐘之時段逐滴添加混合物。使反應混合物溫至室溫，且再攪拌一小時。反應混合物之TLC分析顯示消耗起始物質，且形成"條紋狀"的極性較小之氯甲酸酯產物，TLC(6：4 EtOAc：己烷)：起始物質之RF 為0.4；氯甲酸酯產物之RF 為0.8。
將反應混合物在一圓底燒瓶中於氬氣下攪拌且藉由冰/鹽浴冷卻。將3.02 g,22.4 mmol HOBt與2.23 g,22.0 mmol三乙胺於10 mL無水二氯甲烷中之混合物添加至一固定於圓底燒瓶上之滴液漏斗中。將混合物緩慢添加至圓底燒瓶中，同時維持反應溫度在2℃。使反應混合物溫至室溫，且隔夜攪拌。接著在大氣壓力下將約27 mL二氯甲烷自反應混合物蒸餾出。隨後使混合物冷卻至室溫且攪拌2小時。藉由過濾收集固體，且用20 mL二氯甲烷洗滌濾餅。接著藉由一旋轉式汽化器在真空、40℃下乾燥固體以得到7.81 g灰白色固體。藉由1 H－NMR對該固體進行分析且確定為所要產物。
3.碳酸2－((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－5,9－二側氧基－4－氧雜－17－氮雜－雙環[14.1.0]十七烷－17－基)乙酯2－(2－(吡啶－2－基)二硫基)乙酯之製備
將DMAP(1.2當量)及碳酸苯幷[d][1,2,3]三唑－1－基酯2－(2－(吡啶－2－基)二硫基)乙酯(1.0當量)先後添加至[1S－[1R＊ ,3R＊ (E),7R＊ ,10S＊ ,11R＊ ,12R＊ ,16S＊ ]]－7,11－二羥基－17－[2－羥基乙基]－8,8,10,12－四甲基－3－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4－氧雜－17－氮雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮於無水二氯甲烷中於0℃下的溶液中。將反應混合物在0℃、氬氣下攪拌且藉由TLC每隔10分鐘進行監控。必要時添加另外之DMAP(1.2當量)及化合物I(2)(1.0當量)直至消耗所有化合物G。在0℃下用MeOH(1 mL)使反應中止，在真空下使溶劑移除，且藉由層析(矽膠，DCM中之2.5－5% MeOH)純化殘餘物以得到呈米色固體之標題化合物。以下在表3中列出了化合物之量及回收量。化合物I自2.95 g化合物G獲得之總產量為2.80 g(67.9%)。
J.(S)－2－(4－((2－胺基－4－側氧基－3,4－二氫喋啶－6－基)甲基胺基)苯甲醯胺基)－5－((S)－3－羧基－1－((S)－1－((S)－3－羧基－1－((R)－1－羧基－2－(2－(2－((2－((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－5,9－二側氧基－4－氧雜－17－氮雜－雙環[14.1.0]十七烷－17－基)乙氧基)羰基氧基)乙基)二硫基)乙胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－胍基－1－側氧基戊烷－2－基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－側氧基戊酸之製備
將15 mL H2 O(使用前用氬氣起泡10分鐘)添加至於50 mL大小之離心管中之(S)－2－(4－((2－胺基－4－側氧基－3,4－二氫喋啶－6－基)甲基胺基)苯甲醯胺基)－5－((S)－3－羧基－1－((S)－1－((S)－3－羧基－1－((S)－1－羧基－2－巰基乙基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－胍基－1－側氧基戊烷－2－基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－側氧基戊酸(498 mg,0.534 mmol)中。在用氬氣起泡的同時，將飽和NaHCO3 溶液(使用前用氬氣起泡10分鐘)逐滴添加至該懸浮液中直至所得溶液之pH值達到6.9。快速添加於THF中之碳酸2－((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－5,9－二側氧基－4－氧雜－17－氮雜－雙環[14.1.0]十七烷－17－基)乙酯2－(2－(吡啶－2－基)二硫基)乙酯(400 mg,0.534 mmol)，且在氬氣下將所得均質溶液攪拌30分鐘。在15分鐘時藉由分析型HPLC檢查反應進程。在分析型HPLC條件下產物峰值在約6.4分鐘時出現。用約15 mL磷酸鹽緩衝液稀釋混合物且在真空下將THF移除。將渾濁溶液離心且過濾。將黃色濾液分為兩份且藉由製備型HPLC純化。使純之溶離份(純度大於98%)集中且凍乾。收集殘餘溶離份(純度小於98%)且每隔3－6輪層析再純化以得到700 mg呈白色粉末之標題化合物(含有11.8重量%水以及8.7重量%鈉鹽及磷酸鈉鹽，如藉由卡耳費雪(Karl Fischer)法及元素分析所測定的)。
製備型HPLC參數： 管柱：Waters Nova－Pak HR C18 6 μm 30×300 mm移動相A：7.0 mM磷酸鈉緩衝液，pH＝7.2移動相B：乙腈方法：10%B－50%B，30分鐘，流動速率：40 mL/min
分析型HPLC參數： 管柱：Waters Symmetry C18 3.5 μm 4.6×75 mm移動相A：10 mM乙酸三乙基銨(TEAOAc)緩衝液，pH＝7.5移動相B：乙腈方法：20%B－40%B，10分鐘，流動速率：1.0 mL/min
精確質量m/z(C 67 H 92 N 16 O 22 S 3 )： 計算值：1570.58907(M＋2H),785.29454(M＋2H)2＋ ,523.86563(M＋3H)3＋ ,393.15118(M＋4H)4＋ 實驗值：(M＋2H)2＋ ，785.29100(4.5 ppm)；(M＋3H)3＋ ，523.86431(2.5 ppm)；(M＋4H)4＋ ，393.14996(3.1 ppm)
實例3 化合物J之替代性製備
(S)－2－(4－((2－胺基－4－側氧基－3,4－二氫喋啶－6－基)甲基胺基)苯甲醯胺基)－5－((S)－3－羧基－1－((S)－1－((S)－3－羧基－1－((R)－1－羧基－2－(2－(2－((2－((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－5,9－二側氧基－4－氧雜－17－氮雜－雙環[14.1.0]十七烷－17－基)乙氧基)羰基氧基)乙基)二硫基)乙胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－胍基－1－側氧基戊烷－2－基胺基)－1－側氧基丙烷－2－基胺基)－5－側氧基戊酸A.[4S,7R,8S,10R,9S,13R,16S]－4,8,13－三羥基－14－碘－5,5,7,9－四甲基－16－[(E)－1－[2－甲基噻唑－4－基]丙－1－烯－2－基]氧雜環十六烷－2,6－二酮之製備
將埃坡黴素C(54.3 g,113.7 mmol)溶解於乙腈(480 mL)及水(50 mL)中。將溶液冷卻至－5℃至－10℃。將碘(144.3 g,568.4 mmol)添加至反應中，且保持反應至少15小時。
用15%偏亞硫酸氫鈉溶液(900 mL)使反應中止。用乙酸乙酯(2×1.1 L)萃取混合物。收集有機相，且依次用飽和碳酸氫鈉溶液(675 mL)及飽和氯化鈉溶液(675 mL)進行洗滌。在減壓下使溶劑蒸發以得到呈黃色油狀之粗化合物A(85.6 g)。化合物A在未進一步純化之狀況下用於下一反應中。
HPLC：Phenomex Luna C8(2)3 um，4.6×150 mm，等度，18 min，36%B，17 min，56%B，(移動相A＝於CAN：水(5：95)中之0.01 M NH4 OAc，移動相B＝於ACN：水(95：5)中之0.01 M NH4 OAc)，流動速率為1.0 ml/min，UV 245，Rt＝22.4 min。
B.[1R,3S,7S,10R,11S,12S,16S]－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－[(E)－1－[2－甲基噻唑－4－基]丙－1－烯－2－基]－4,17－二氧雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮之製備
將[4S,7R,8S,10R,9S,13R,16S]－4,8,13－三羥基－14－碘－5,5,7,9－四甲基－16－[(E)－1－[2－甲基噻唑－4－基]丙－1－烯－2－基]氧雜環十六烷－2,6－二酮(85.6 g)溶解於乙腈(670 mL)及水(130 mL)中。將三乙胺(135 mL,968.5 mmol)添加至溶液中。將反應加熱至50℃至60℃，歷時至少8小時。
在溶液冷卻至室溫後，在減壓下使其濃縮。用EtOAc(1.2 L)稀釋殘餘物，且用飽和氯化鈉溶液(3×500 mL)洗滌。在減壓下使溶劑蒸發以得到呈黃色油狀之粗產物。藉由矽膠墊過濾(矽膠700 g，庚烷中之66% EtOAc，2×4 L，及1×3 L)純化得到具有HPLC AP 80的呈發泡體之化合物B(50.3 g，90%產率)。
HPLC：Phenomex Luna C8(2)3 um，4.6×150 mm，等度，18 min，36%B，17 min，56%B，(移動相A＝於CAN：水(5：95)中之0.01 M NH4 OAc，移動相B＝於ACN：水(95：5)中之0.01M NH4 OAc)，流動速率為1.0 ml/min，UV 245，Rt＝15.0 min。
C/D.(4S,7R,8S,9S,13R,14R,16S)－13－疊氮基－4,8,14－三羥基－5,5,7,9－四甲基－16－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)氧雜環十六烷－2,6－二酮及(4S,7R,8S,9S,13S,14S,16S)－14－疊氮基－4,8,13－三羥基－5,5,7,9－四甲基－16－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)氧雜環十六烷－2,6－二酮之製備
將疊氮化鈉(11.45 g,174.41 mmol)及氯化銨(3.14 g,58.14 mmol)添加至表－埃坡黴素A(14.35 g,29.07 mmol)於乙醇(240 mL)及水(48 mL)中之攪拌溶液中。將混合物在60℃下攪拌17－20小時。在減壓下，於低於50℃之溫度下藉由旋轉式汽化器使揮發物蒸發。將殘餘物溶解於乙酸乙酯(287 mL)與水(50 mL)之混合物中。使各相分離，且用乙酸乙酯(115 mL)對底部水相進行萃取。用25%氯化鈉水溶液(鹽水)洗滌組合之有機相。在減壓下使溶劑蒸發，且使殘餘物通過一用乙酸乙酯/正庚烷(2：1)混合物溶離之矽膠墊。減壓下溶劑之蒸發提供呈白色發泡體的疊氮基醇，(4S,7R,8S,9S,13R,14R,16S)－13－疊氮基－4,8,14－三羥基－5,5,7,9－四甲基－16－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)氧雜環十六烷－2,6－二酮及(4S,7R,8S,9S,13S,14S,16S)－14－疊氮基－4,8,13－三羥基－5,5,7,9－四甲基－16－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)氧雜環十六烷－2,6－二酮以約6：1比率之區位異構混合物(12.8 g,82%)。
LC－MS：Phenomenex Luna C8(2)管柱：3 μm，4.6×50 mm。梯度：15 min，0%B至100% B，10 min，接著100% B，5 min。移動相：A＝於CH3 CN/H2 O 5：95中之0.01 M NH4 OAc；B＝於CH3 CN/H2 O 95：5中之0.01 M NH4 OAc。流動速率：3.0 mL/min。波長：UV 250 nm。滯留時間＝5.52 min。MS(ESI)(M＋H)＋ ＝537.69
該反應亦在諸如丙酮、乙腈、四氫呋喃、2－丙醇、二甲基甲醯胺、二甲亞碸及N－甲基－吡咯啶酮之其他溶劑中進行。
疊氮化四丁基銨試劑亦可替代疊氮化鈉/氯化銨使用。
E.(1S,3S,7S,10R,11S,12S16R)－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－4－氧雜－17－氮雜雙環(14.1.0)十七烷－5,9－二酮之製備
將三苯膦(9.48 g,35.77 mmol)在氮氣氛下添加至(4S,7R,8S,9S,13R,14R,16S)－13－疊氮基－4,8,14－三羥基－5,5,7,9－四甲基－16－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)氧雜環十六烷－2,6－二酮與(4S,7R,8S,9S,13S,14S,16S)－14－疊氮基－4,8,13－三羥基－5,5,7,9－四甲基－16－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)氧雜環十六烷－2,6－二酮混合物(12.8 g,23.85 mmol)於無水乙腈(90 mL)中之攪拌溶液中。將澄清溶液在20－40℃下攪拌19－40小時。使反應混合物冷卻至0－5℃，歷時3－4小時，且將產物過濾。用庚烷(64 mL)洗滌濾餅，且在減壓下，於40℃下乾燥15－18小時以得到呈白色固體之(1S,3S,7S,10R,11S,12S16R)－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－4－氧雜－17－氮雜雙環(14.1.0)十七烷－5,9－二酮(5.41 g,46%)。
LC－MS：Phenomenex Luna C8(2)管柱：3 μm,4.6×50 mm。梯度：15 min，0%B至100%B，10 min，接著100%B，5 min。移動相：A＝於CH3 CN/H2 O 5：95中之0.01 M NH4 OAc；B＝於CH3 CN/H2 O 95：5中之0.01 M NH4 OAc。流動速率：3.0 mL/min。波長：UV 250 nm。滯留時間＝4.43 min。MS(ESI)(M＋H)＋ ＝493.68。
該反應亦用諸如三環己基膦、三甲膦、三丁膦及三(4－甲氧基苯基)－膦之其他膦及另一溶劑四氫呋喃進行。
F.[1S－[1R ＊ ,3R ＊ (E),7R ＊ ,10S ＊ ,11R ＊ ,12R ＊ ,16S ＊ ]]－7,11－二羥基－17－[2－羥基乙基]－8,8,10,12－四甲基－3－[1－甲基－2－(2－甲基－4－噻唑基)乙烯基]－4－氧雜－17－氮雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮之製備
將Et3 N(4.95 mL,35.52 mmol)及2－溴乙醇(3.02 mL,42.62 mmol)添加至於乙腈(35 mL)中之(1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)－7,11－二羥基－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－4－氧雜－17－氮雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮(3.50 g,7.10 mmol)中且加熱至72.5℃。20小時後，將反應混合物冷卻至室溫，經由旋轉真空蒸餾濃縮至乾燥。將粗產物溶解於乙酸乙酯(50 mL)中且與去離子水(35 mL)混合。將混合物用乙酸乙酯(3×35 mL)萃取，經Na2 SO4 乾燥，過濾，濃縮，在乙腈(35 mL)中結晶，用乙腈(2×5 mL)洗滌，且在真空烘箱中於45.5℃下隔夜乾燥以分離呈白色結晶粉末之(1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)－7,11－二羥基－17－(2－羥基乙基)－8,8,10,12－四甲基－3－((E)－1－(2－甲基噻唑－4－基)丙－1－烯－2－基)－4－氧雜－17－氮雜雙環[14.1.0]十七烷－5,9－二酮(2.60 g，HPLC AP 97.1，68.2%產率)。
LC－MS：Phenomenex C8,3 μm,4.6×150 mm，梯度，10%至50%B(經10 min)，且在20 min時停止。(A＝5% MeCN/H2 O＋0.01 M NH4 OAc；B＝95% MeOH/H2 O＋0.01 M NH4 OAc)，流動速率為1.0 mL/min，UV 254 nm。滯留時間＝9.43 min。MS(ESI)M＋H＝537.21。
一般技術者將認識到如由該實例3製備之化合物3G與如由實例2製備之化合物G相同，且因而化合物3G可用於製備化合物H、I及J，其製備方法及其化合物係描述在實例2中。
圖1 為埃坡黴素類似物化合物AA之六種葉酸共軛物(共軛物編號為AA.I至AA－VI)之化學結構、相對親和力及抗KB腫瘤細胞之EC50(nM)值。
圖2 為埃坡黴素類似物化合物BB之三種葉酸共軛物(共軛物編號為BB.I至BB－III)之化學結構、相對親和力及抗KB腫瘤細胞之EC50(nM)值。
圖3 表明用濃度增加(濃度(nM)；x軸)之化合物G(橫條)、化合物CC(三角形)、化合物AA(菱形)或伊沙匹隆(正方形)處理後存活之KB純系的百分率(存活率；y軸)。
圖4 表明以(A) 腫瘤植入後若干天(x軸)之中值腫瘤重量(mg；y軸)或(B) 腫瘤植入後若干天(x軸)之重量減輕(%體重變化；y軸)量度的，相較於未經處理組(對照；黑色圓圈)，用各種劑量之化合物J(灰色正方形、白色正方形、灰色菱形)或伊沙匹隆(黑色橫條)處理裸鼠中之KB鼻咽表皮樣癌異種移植物的活體內抗腫瘤功效。
圖5 表明以腫瘤植入後若干天(x軸)之中值腫瘤重量(mg；y軸)量度的，相較於未經處理組(對照；黑色圓圈)，化合物J(灰色正方形)或伊沙匹隆(白色正方形)抗FR(－)M109鼠肺癌之活體內抗腫瘤作用。
圖6 表明以腫瘤植入後若干天(x軸)之中值腫瘤重量(mg；y軸)量度的，未經處理組(對照；黑色圓圈)、用單獨之化合物J(灰色正方形)處理、用葉酸類似物存在下之化合物J(黑色橫條)處理或用化合物G(灰色菱形)處理的活體內抗腫瘤作用。
(無元件符號說明)

Claims (10)

  1. 一種式X之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：K為-O-；A為C1-4 伸烷基；B1 為-OH且R1 為氫；R2 、R3 、R4 及R5 獨立地為氫或低碳烷基；R6 為氫或甲基；R12 為H、烷基、經取代之烷基或鹵素；且R13 為視情況經取代之5員或6員雜芳基。
  2. 如請求項1之化合物，其中R6 為氫。
  3. 如請求項1之化合物，其中R6 為甲基。
  4. 如請求項1之化合物，其中R13 為視情況經取代之噻唑基、吡啶基或噁唑基。
  5. 如請求項1之化合物，其具有式Xb
  6. 如請求項5之化合物，其中R6 為氫。
  7. 如請求項5之化合物，其中R6 為甲基。
  8. 如請求項5之化合物，其具有式Xb'
  9. 如請求項8之化合物，其中R6 為氫。
  10. 如請求項1之化合物，其具有式X'：
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