CN115429891A - 含氟高分子在mRNA胞内递送中的应用 - Google Patents

含氟高分子在mRNA胞内递送中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含氟高分子在mRNA递送中的应用，所述含氟高分子由含氟脂肪链功能基团和聚酰胺‑胺树形高分子组成，所述含氟脂肪链共价连接在聚酰胺‑胺树形高分子上；所述的含氟高分子可以作为mRNA胞内递送载体。本发明公开的含氟高分子作为mRNA胞内递送载体的方法可在低mRNA剂量及材料用量的条件下实现高效mRNA转染，在多种细胞中的mRNA递送效率显著优于Lipofectamine3000等商业化转染试剂，在高浓度血清干扰条件下，仍具有高效的mRNA胞内递送效率。

Description

含氟高分子在mRNA胞内递送中的应用
技术领域
本发明属于生物技术、高分子化学、细胞生物学等领域，具体涉及含氟高分子在mRNA胞内递送中的应用。
背景技术
20世纪70年代至80年代，随着体外mRNA合成技术的成熟和其免疫原性的改善，mRNA被广泛研究作为蛋白质替代疗法用于基因缺陷遗传病、癌症及传染病防治之中。2019年新型冠状病毒爆发后，多款mRNA疫苗由于独特的优势快速获批上市。相对于DNA疫苗，mRNA只需在细胞质内发挥功能，没有整合入宿主基因组的风险，并且发挥功能后易被降解，安全性较高；相对于灭活病毒疫苗，mRNA疫苗编码表达抗原蛋白感染风险低；面对病毒的快速变异，mRNA疫苗只需要改变对应抗原的mRNA的序列，研发周期短、成本低。新冠mRNA疫苗的快速上市及使用，极大地推动了mRNA药物的研发。由于mRNA易被降解、无法自主跨膜进入细胞，且血浆半衰期短，生物利用度低，基于mRNA的生物治疗亟需高效、安全的胞内递送载体的支持。一般来说，mRNA载体主要分为两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体递送mRNA效率较高，但其对于mRNA装载能力有限，且具有遗传毒性和免疫原性等安全隐患。目前非病毒载体如脂质纳米颗粒(Lipidnanoparticle，LNP)和阳离子聚合物等受到了人们的广泛研究和青睐。LNP是目前唯一获批的mRNA递送载体，具有组成成份明确、工业制备技术成熟，良好的临床审批基础等优点。虽然这类载体实现了高效的mRNA胞内递送，但也存在诸多亟待解决的问题，例如，现阶段，LNP的知识产权多被国外垄断；大部分的LNP经全身给药后，主要被动靶向至肝脏；LNP体内应用时易引发免疫应答反应；LNP制剂的成份易氧化降解，运输及储存难度大，批次间不稳定等。目前我国亟需开发高效、安全的新型mRNA递送载体，突破国外专利壁垒，为mRNA药物的研发提供技术和材料学支持。
近年来，含氟高分子被广泛报道作为质粒(pDNA)和小干扰RNA(siRNA)递送载体，含氟高分子可通过静电相互作用结合核酸，并利用其优异的自组装性能，在水溶液中组装形成纳米囊泡或纳米聚集体，其所结合的核酸分子包裹在该组装体中，形成稳定的转染复合物。同时含氟高分子具有很强的跨膜能力，可以有效提高转染复合物的细胞内吞和内涵体逃逸能力，从而能够帮助核酸分子克服递送过程中的多重障碍，实现高效的胞内递送。尽管mRNA与pDNA以及siRNA同为核酸，具有相似的化学性质。但mRNA其物理结构、电荷分布以及稳定性与pDNA以及siRNA有所不同。siRNA分子量较小，为双链核苷酸、分子链较短、柔性较小，所带的负电荷量较少；pDNA分子量较大，为双链核苷酸、分子链较长、柔性较大，所带的负电荷量较多。而mRNA分子量较大，为单链核苷酸、分子链较长、柔性较大，所带的负电荷量较多，更易被RNA酶降解。相对于pDNA和siRNA，mRNA结构更柔，并且具有较高的表面负电荷，因此更易于与阳离子载体通过静电相互作用发生结合缠绕，其对于载体的正电荷含量要求较低，与此同时，mRNA为单链核苷酸，更容易被递送体系中核酸酶降解，其对于载体的保护作用要求更高。含氟高分子由于其独特得优势在siRNA和pDNA的递送中取得了较大的成功，但其在mRNA递送的应用目前尚未见报道。
发明内容
为了解决现有mRNA胞内递送载体缺乏的问题，本发明创新提供了一类含氟高分子作为mRNA胞内递送的载体。这类载体胞内递送效率高，在低mRNA剂量及材料用量的条件下实现高效mRNA转染，在高浓度血清干扰条件下，仍具有高效的mRNA胞内递送效率。此外，本发明创新性将这类含氟高分子与脂质分子复合，结合聚合物及脂质的双重优势，提供了一类高效的可用于胞内及体内mRNA递送的新型载体材料。
本发明提供了一类含氟高分子用于mRNA的胞内递送，所述含氟高分子包括含氟脂肪链功能基团和聚酰胺-胺树形高分子，所述含氟脂肪链功能基团通过共价键连接在树形高分子上。所述含氟脂肪链功能基团为七氟丁酰基功能基团；所述的含氟高分子的结构如式(1)：
Figure BDA0003851886980000021
其中，R为聚酰胺-胺树形高分子；x为七氟丁酰基功能基团的连接数，为5-128之间的整数。
R为所述聚酰胺-胺树形高分子，如式(2)所示：
Figure BDA0003851886980000031
其中，M是树形高分子的核心，乙二胺；n为1-5之间的整数。
当n＝1时，x为5-8之间的整数，优选地，x＝7；当n＝2时，x为7-16之间的整数；当n＝3时，x为16-32之间的整数；当n＝4时，x为17-64之间的整数，优选地，x为34、40或47；当n＝5时，x为60-128之间的整数，优选地，x为83。
本发明还提出了上述含氟高分子在mRNA胞内递送的应用。通过将上述含氟高分子与mRNA在室温孵育下形成稳定的递送复合物，对细胞进行转染。
本发明还提出了一种新的转染复合物，包含式(1)所示的含氟高分子、mRNA，或包含式(1)所示的含氟高分子、mRNA和脂质分子。
其中，所述脂质分子包括但不限于胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1,2-二肉豆蔻酰-RAC-甘油-3-甲氧基-PEG2000(DMG-PEG2000)等。
本发明还提出了所述的转染复合物在mRNA胞内递送中的应用。
本发明的有益效果包括：本发明通过材料库筛选的方法，提出了一类可以用于高效mRNA胞内递送的含氟高分子载体，这类载体能够在多种细胞(如143B,HeLa等)上高效递送mRNA，其效率显著高于市售转染试剂Lipofectamine 3000(Lipo3000)，递送过程中mRNA的结构和生物学活性均得到有效维持。本发明提出含氟高分子作为mRNA递送载体，其内涵体逃逸能力和递送效率与聚酰胺-胺树形高分子的代数，以及含氟脂肪链的接枝率密切相关，只有选择合适的参数才能获得高性能的mRNA递送载体。本发明提出的含氟高分子与mRNA的递送复合物在小鼠体内具有较强的脾脏富集能力，将上述复合物与脂质分子复合后，仍具有脾脏特异性mRNA递送能力且递送效率显著提升。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备含氟高分子的合成路线。
图2为本发明实施例1中制备含氟高分子的反应物投料比、反应条件、产物的表征结果和产物的命名。
图3为本发明实施例1中含氟高分子1-0，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7在不同氮磷比条件下，向143B细胞内递送绿色荧光蛋白(GFP)mRNA的效率。
图4为本发明实施例1中含氟高分子2-0，2-5，2-7，2-10，2-11在不同氮磷比条件下，向143B细胞内递送GFPmRNA的效率。
图5为本发明实施例1中含氟高分子3-0，3-9，3-16，3-21，3-22在不同氮磷比条件下，向143B细胞内递送GFPmRNA的效率。
图6为本发明实施例1中含氟高分子4-0，4-17，4-34，4-40，4-47在不同氮磷比条件下，向143B细胞内递送GFPmRNA的效率。
图7为本发明实施例1中含氟高分子5-0，5-36，5-62，5-83，5-96在不同氮磷比条件下，向143B细胞内递送GFPmRNA的效率。
图8为本发明实施例1中所得含氟高分子、Lipo2000以及Lipo3000在143B细胞上转染GFP mRNA的最佳转染效果对比。
图9为本发明实施例1中所得含氟高分子4-47，含不同浓度血清条件下、氮磷比为2.5时，向143B细胞递送GFP mRNA的结果。
图10为本发明实施例1所得含氟高分子4-47携带Luciferase mRNA形成的复合物在小鼠体内的递送情况。
图11为本发明实施例1所得含氟高分子4-47与脂质分子形成的复合载体携带Luciferase mRNA，在小鼠体内的递送情况。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在未背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：利用以乙二胺为核心、表面基团为伯胺的第1-5代(G1-G5)聚酰胺-胺(PAMAM)树形高分子和七氟丁酸酐合成所述含氟高分子，拟用于mRNA胞内递送。
合成方法：将PAMAM高分子溶于无水甲醇，在搅拌条件下，加入不同剂量的七氟丁酸酐；随后，加入不同剂量的三乙胺(TEA)；室温搅拌反应48小时后，进行后处理。对于G1PAMAM，反应结束后，将反应液滴入20倍体积的乙醚中，离心得到产物沉淀；接着利用少量甲醇将产物溶解，再次进行乙醚沉淀，重复上述操作2次；最后，将得到的沉淀置于真空干燥箱中，40℃过夜干燥，得到淡黄色胶状产物，用去离子水溶解产物、4℃保存备用。对于G2PAMAM到G5 PAMAM，通过透析法除去杂质，具体做法如下：将反应后的溶液置于透析袋中(分子量3500)，首先利用甲醇透析3次，然后继续用纯水透析8次，最后将透析液冻干，得到白色絮状产物，用去离子水溶解产物、4℃保存备用。
茚三酮法表征PAMAM高分子表面含氟烷基链的连接数：以茚三酮检测法检测反应后PAMAM分子表面剩余的伯胺数目，然后间接计算PAMAM分子表面接枝的七氟丁基条数。具体实施方法如下：首先制备还原茚三酮，取1g茚三酮溶于25mL沸水中，在搅拌条件下，逐滴加入含有1g抗坏血酸的25mL双蒸水溶液，继续搅拌15分钟。随后，将该溶液置于4℃冷却结晶，通过减压过滤获得白色沉淀，接着利用冷却的去离子水清洗沉淀两次，将所得沉淀置于干燥皿中进行干燥，得到白色或淡粉色还原茚三酮粉末，于室温干燥箱中，充氮气，密封保存，备用。
提前制备0.2M pH＝5.4的乙酸钠缓冲液，具体地，取16.4g的乙酸钠溶解在950mL的双蒸水中；然后逐滴加入乙酸，调节pH值至5.4；最后，将溶液定容到1L。
测量前，配制还原茚三酮和茚三酮重量比为85/15的乙二醇甲醚溶液，例如，取85mg还原茚三酮和15mg茚三酮溶解在10mL乙二醇甲醚中。配制200μL未修饰的高分子材料的标准曲线溶液和浓度为0.45mg/mL的待测样品的水溶液；向上述溶液中加入200μL0.2mol/LpH＝5.4的乙酸钠缓冲液；接着加入200μL上述还原茚三酮和茚三酮的乙二醇甲醚溶液；将溶液置于沸水中加热10min；待样品冷却后，加入600μL 60％的乙醇水溶液，利用酶标仪检测样品在570nm处的吸收值；最后，根据标准曲线计算待测样品中剩余伯胺数目。每个样品制作5个平行以保证实验的精准度。
利用氟元素分析，检测样品中氟元素含量，直接计算高分子表面七氟丁基的接枝数。
本发明实施例1中，合成路线详见图1。
通过本发明实施例1，成功合成如式(1)所示的七氟丁基修饰的聚酰胺-胺树形高分子；反应的投料比、反应条件、产物的表征结果和产物的命名详见图2，其中，M(Dendrimer)为树形高分子用量；M(F7)为七氟丁酸酐用量；M(TEA)为三乙胺用量；V(MeOH)为反应溶剂甲醇的体积；n(F7)/n(Gn)为七氟丁酸酐与树形高分子的摩尔比；n(TEA)/n(F7)为三乙胺与七氟丁酸酐的摩尔比；七氟丁酰基功能基团的连接数(Conjugatednumber)是通过茚三酮方法测得的七氟丁酸酐接枝条数；Fluorine Content(wt％)为产品中氟元素的含量；Mw ofproduct是根据茚三酮方法表征计算的产物理论分子量；Conjugated number/-NH2 number(％)是七氟丁基数占高分子表面伯胺数的百分比；Product name为产物的命名(也称n-x)，n为聚酰胺-胺树形高分子的代数，x(Conjugated number)为七氟丁基的实际接枝条数，产物名称及其对应的n，x(Conjugated number)见图2，未修饰含氟脂肪链的G1至G5PAMAM分别命名为1-0、2-0、3-0、4-0和5-0。
Figure BDA0003851886980000061
其中，R为聚酰胺-胺树形高分子；x为七氟丁酰基功能基团的连接数，为5-128之间的整数。
实施例2：对通过本发明实施例1所得到的含氟高分子的mRNA胞内递送效率进行比较。
以表达绿色荧光蛋白的mRNA(GFP mRNA)作为模型mRNA，在143B细胞上通过检测细胞内的绿色荧光评估本发明实施例1所得含氟高分子递送的效率，筛选最优材料。所用的GFP mRNA为ARCAEGFP mRNA(5-moUTP)，购买于APExBIO(美国)，货号为R1007，该mRNA使用ARCA(抗反向帽类似物)以共转录的方式对mRNA进行加帽，形成了Cap 0结构，结构中含有5-moUTP的修饰，mRNA的长度为996个核苷酸。将ARCAEGFP mRNA(5-moUTP)转染到细胞后，细胞可表达EGFP(增强型绿色荧光蛋白)。EGFP蛋白是一种常见的报告分子，激发时会发出强烈且明亮的绿色荧光，其最大激发/发射光波长分别为488nm/509nm。
具体方法如下：首先，将143B细胞均匀地接种于24孔板中，将孔板放置于培养箱中培养24小时，待细胞密度约为80-90％，进行细胞转染。用DEPC水将mRNA稀释为100ng/μL，取0.2μg mRNA(2μL，100ng/μL)置于RNase free的1.5mL ep管中；用DEPC水对转染材料(本发明实施例1所得高分子材料)进行稀释，取对应转染氮磷比(N/P)的材料至于管中；向管中补加DEPC水至液体总体积为15μL，将混合溶液吹打混匀并盖好ep管，室温孵育15分钟；补加35μL无血清培养基，继续孵育15分钟；补加200μL无血清培养基，至总体积为250μL；移除细胞孔中原有培养基，加入上述250μL转染液；转染6小时后，补加500μL含有10％胎牛血清(FBS)的培养基；转染24小时后，移除培养基，加入250μLPBS溶液，利用倒置荧光显微镜对细胞进行拍照观察；利用胰酶消化细胞后、收集细胞，通过流式细胞仪定量细胞的平均荧光强度。此外，Lipo2000及Lipo3000的转染步骤均按照说明书进行。
实验结果：图3到图7为本发明实施例1中所得含氟高分子在143B细胞上递送GFPmRNA的筛选结果。结果表明，含氟脂肪链在树形高分子表面修饰的接枝率达到一定量时，能够获得较高的mRNA递送效果。含氟高分子的最佳转染氮磷比与树形高分子代数以及高分子表面含氟脂肪链修饰程度相关，在同代数的树形高分子间，随着含氟脂肪链修饰程度增加，材料的最佳转染氮磷比呈下降趋势；在不同代数的树形高分子间，随着树形高分子代数的增加，材料的最佳氮磷比呈下降趋势。但是含氟高分子在低mRNA剂量及材料用量条件下可实现高效mRNA递送。本发明将实施例1所有含氟高分子的最佳转染结果进行了综合排序，结果如图8所示，含氟高分子5-83、4-34、4-40和4-47在143B细胞上转染GFP mRNA的效率明显优于Lipo2000，含氟高分子4-47在143B细胞上转染GFP mRNA的效率明显优于Lipo3000。
实施例3：对本发明实施例1中所得含氟高分子4-47，在有血清条件下递送mRNA的效率进行考察。
以GFP mRNA作为模型mRNA，通过检测细胞内的绿色荧光，在143B细胞上评估本发明实施例1所得含氟高分子4-47材料在最佳转染氮磷比时抵抗血清干扰的能力。
具体方法如下：将细胞均匀地接种于24孔板中，在培养箱中培养24小时，细胞密度约为80-90％时，进行转染。用DEPC将GFP mRNA水稀释为100ng/μL，取0.2μg mRNA(2μL，100ng/μL)置于RNase free的1.5mL ep管中；用DEPC水对转染材料(本发明实施例1所得含氟高分子4-47)进行稀释，取对应转染氮磷比(N/P)的材料置于ep管中，补加DEPC水至总体积为15μL，将混合溶液吹打混匀并盖好ep管，室温孵育15分钟；补加35μL无血清培养基，继续孵育15分钟；补加200μL含有不同浓度血清的培养基，至总体积为250μL，使溶液中血清的终浓度分别为10％、20％、50％和75％；移除孔中原有培养基，加入上述250μL转染液；转染6小时后，移除培养基，加入500μL含有10％FBS的培养基；转染24小时后，移除培养基，加入250μL PBS溶液，利用倒置荧光显微镜对细胞进行拍照观察；胰酶消化后，收集细胞，利用流式细胞仪定量细胞的平均荧光强度。
实验结果：图9为有血清条件下，本发明实施例1所得含氟高分子4-47材料在氮磷比为2.5时向143B细胞递送GFP mRNA的结果。结果表明，本发明实施例1所得含氟高分子4-47材料在25％血清存在时，仍具有高效的GFP mRNA递送效率；在50％和75％血清干扰下，本发明实施例1所得含氟高分子4-47材料的转染效率显著下降，但转染阳性率仍然能够维持不变。
实施例4：利用本发明实施例1所得含氟高分子4-47携带Luciferase mRNA，形成递送复合物，考察该复合物在小鼠体内递送mRNA的情况。
具体方法如下：将5μg Luciferase mRNA与不同氮磷比的本发明实施例1所得含氟高分子4-47材料置于50μL灭菌水中，室温孵育30分钟，补加灭菌水溶液，至溶液终体积为200μL。将200μL的转染复合物溶液，通过尾静脉注射至Balb/C小鼠体内；6小时后，向小鼠腹腔注射200μL 15mg/mL的Luciferase底物；5分钟后，处死小鼠并进行解剖，得到各主要脏器；10分钟时，利用小动物活体成像仪(iVIS spectrum，PerkinElmer，美国)对各脏器进行成像(F Number为8；Binning Factor为2；60s曝光)。
实验结果：结果详见附图10，结果表明，本发明实施例1所得含氟高分子4-47/Luciferase mRNA复合物经尾静脉注射后，复合物主要聚集于脾脏表达荧光素酶，在N/P为5时效果最佳。
实施例4：利用本发明实施例1所得含氟高分子4-47与脂质分子形成复合载体，利用该复合载体携带Luciferase mRNA，形成复合物，考察该复合物在小鼠体内递送mRNA的情况。
具体实验方法如下：将5μg Luciferase mRNA溶于45μL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中；将不同质量的本发明实施例1所得含氟高分子4-47材料、DOPE、胆固醇及DMG-PEG2000(DMG-PEG)溶于15μL乙醇溶液中；将上述乙醇溶液加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，吹打混匀；室温孵育30分钟后，补加灭菌水溶液，至溶液终体积为200μL。聚合物与脂质复合载体中，本发明实施例1所得含氟高分子4-47材料与mRNA的氮磷比为5，固定本发明实施例1所得含氟高分子4-47材料的用量不变，改变其它脂质成份的含量。具体比例详见下表1：
表1
Figure BDA0003851886980000091
将200μL的转染复合物溶液，通过尾静脉注射至小鼠体内；6小时后，向小鼠腹腔注射200μL 15mg/mL的Luciferase底物；5分钟后，处死小鼠并进行解剖，得到各主要脏器；10分钟时，利用小动物活体成像仪(iVIS spectrum，PerkinElmer，美国)对各脏器进行成像(FNumber为8；Binning Factor为2；60s曝光)。
实验结果：结果详见附图11，结果表明，本发明实施例1所得含氟高分子4-47/胆固醇/DOPE/DMG-PEG摩尔比分别为5/35/57.5/2.5、15/35/47.5/2.5、30/35/32.5/2.5和45/35/17.5/2.5的复合载体，在小鼠体内递送Luciferase mRNA时，复合物仍然聚集于脾脏表达荧光素酶；相较于本发明实施例1所得含氟高分子4-47，复合载体在脾脏的递送效率均有所提高，其中30/35/32.5/2.5组别的效果最佳，荧光素酶强度提高约15倍；该结果凸显了复合载体在递送中的优势。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (6)

1.一种含氟高分子在mRNA胞内递送中的应用，其特征在于，所述含氟高分子包括聚酰胺-胺树形高分子和七氟丁酰基功能基团，所述七氟丁酰基通过共价键连接在所述聚酰胺-胺树形高分子上；所述含氟高分子的结构如式(1)所示：
Figure FDA0003851886970000011
其中，R为聚酰胺-胺树形高分子；x为七氟丁酰基功能基团的连接数，为5-128之间的整数。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚酰胺-胺树形高分子如式(2)所示：
Figure FDA0003851886970000012
其中，M是树形高分子的核心，乙二胺；n为1-5之间的整数。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，当n＝1时，x为5-8之间的整数；当n＝2时，x为7-16之间的整数；当n＝3时，x为16-32之间的整数；当n＝4时，x为17-64之间的整数；当n＝5时，x为60-128之间的整数。
4.一种转染复合物，其特征在于，其包含如权利要求1中所述的含氟高分子与mRNA，或包含如权利要求1中所述的含氟高分子、mRNA和脂质分子。
5.如权利要求4所述的转染复合物，其特征在于，所述脂质分子包括胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE、1,2-二肉豆蔻酰-RAC-甘油-3-甲氧基-PEG2000(DMG-PEG2000)。
6.如权利要求4所述的转染复合物在mRNA胞内递送中的应用。
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