CN108753830A - 萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用 - Google Patents

萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108753830A
CN108753830A CN201810641124.6A CN201810641124A CN108753830A CN 108753830 A CN108753830 A CN 108753830A CN 201810641124 A CN201810641124 A CN 201810641124A CN 108753830 A CN108753830 A CN 108753830A
Authority
CN
China
Prior art keywords
modification
tree form
form modification
naphthalimide
transgene carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810641124.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108753830B (zh
Inventor
高永光
骞爱荣
田野
李郁
党凯
姜山峰
罗晓庆
赵欣
杨超飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xi'an Jiuqing Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Xi'an Nine Qing Biological Technology Co Ltd
Northwestern Polytechnical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xi'an Nine Qing Biological Technology Co Ltd, Northwestern Polytechnical University filed Critical Xi'an Nine Qing Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201810641124.6A priority Critical patent/CN108753830B/zh
Publication of CN108753830A publication Critical patent/CN108753830A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108753830B publication Critical patent/CN108753830B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/028—Polyamidoamines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Polyamides (AREA)

Abstract

本发明提供一种萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，其包括树形高分子骨架以及含萘酰亚胺功能基团，所述含萘酰亚胺功能基团通过共价连接在聚酰胺‑胺树形高分子表面。本发明还提供所述树形高分子转基因载体的制备方法及其作为核酸分子输送载体中的应用。本发明采用全新的修饰方法和功能基团修饰树形高分子，反应简单高效，产率高，在细胞转染过程中达到高效转染效果，材料生产简易且成本低，转染过程细胞毒性低，能有效且安全地将基因分子输送到细胞中，本发明的树形高分子转基因载体具有高效、低毒、价格低廉、合成简易的优点。

Description

萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于高分子化学及生物材料技术领域，具体涉及一种萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用。
背景技术
基因治疗是将外源正常的基因导入靶细胞，用于纠正或者补偿因基因缺陷或者异常引起的疾病，从而达到治疗的目的。基因治疗在许多重大的疾病的治疗中显示出巨大的潜力，如：癌症、艾滋病、糖尿病、囊胞性纤维症、心血管疾病等。
基因治疗的关键是要把具有治疗功能的基因高效地导入细胞内，然而裸露的DNA一般以舒展的线型螺旋形式存在，体积较大，并且DNA分子本身为带负电的阴离子，进入细胞时会与细胞膜外层的阴离子之间产生静电排斥作用。这些不利因素都使得DNA分子在不借助其它技术手段的情况下，无法独立穿过细胞膜，因此发展有效的基因载体是基因治疗成功的前提条件。
基因载体包括病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体是一种高效的转染试剂，能够高效地将外源的DNA或RNA转入细胞，但是它存在一些缺点，如免疫原性、致癌性，基因的大小容易受到病毒所容纳的大小限制、不能大量生产、同时存在变异的可能性，安全性差。因此，病毒载体在应用中受到了极大的限制。与病毒载体相比，结构易于修饰的非病毒载体完全克服病毒载体的上述缺点。非病毒载体包括阳离子脂质体、阳离子聚合物、金属纳米粒子以及多肽等。其中高分子聚合物具有安全性高、免疫性低、结构易于修饰以及转染效率高等特点，因此，近些年来高分子聚合物成为了具有良好应用前景的非病毒基因载体。高分子聚合物包括聚丙烯亚胺(PEI),聚精氨酸(PArg)，L-聚赖氨酸(PLL)以及树形高分子等。
树形高分子是一类人工合成的具有树形扑拓结构的化合物，具有可控的分子量和尺寸，良好的单分散性，和表面易于多官能团修饰等特点。聚阳离子树形高分子(PAMAM)可以与DNA结合后形成纳米复合物，将DNA或RNA转运至细胞内，而且在运输过程中还可以保护DNA或RNA免受核酸酶的降解。树形高分子内部存在大量的三级胺起到“质子海绵”的作用，可促进核酸复合物内涵体逃逸，并进入细胞质高效的转录、翻译以及表达等。但是，未经修饰的树形高分子细胞毒性大，而且转染效率低，极大的限制了树形高分子的应用。为了增加生物相容性，提高转染效率，各种各样的功能分子被应用于树枝状分子的表面修饰，如氨基酸，疏水烷基链、多肽、环糊精、聚乙二醇(PEG)以及壳聚糖等。其中，有许多修饰后的树枝状分子已经成为了商业化的转染试剂如PolyFect、SuperFect以及ProFect等。但是，目前的大部分树形高分子的修饰过程比较复杂、修饰后细胞毒性较大，转染效率并不理想，这些因素极大地限制了它们在基因治疗中的应用。因此，通过简单方法合成生物相容性好、转染效率高的转基因载体是解决这些问题的关键。
发明内容
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，将萘酰亚胺化合物与聚酰胺-胺树形高分子通过共价键连接合成的树形高分子转基因载体，具有安全、高效以及低毒的优点、本发明以萘酰亚胺化合物和树形高分子为原料，合成成本较低，材料易得，反应高效、安全、合成步骤简单，获得细胞毒性低，同时具备高转染效率的树形高分子转基因载体。基于这种发现，完成了本发明。
本发明提供了一种基于树形高分子表面化学共价修饰萘酰亚胺基团的转基因载体以及制备方法。萘酰亚胺类化合物合成简单且具有良好的结构修饰多样性，具有大π键共轭体系的化学结构特征，是新型功能染料的中间体。萘酰亚胺类化合物具备特殊的理化性质及光学性质，具备较强的DNA结合能力，良好的生物相容性、优良的体内体外成像性能等特点，在癌症诊疗以及基因治疗等领域中呈现出了广阔的应用前景。基于萘酰亚胺修饰的树形高分子合成工艺十分成熟，并且操作简单，合成速度快，产率高，无需繁琐的纯化步骤即可快速的获得高产率的树形高分子转基因载体，为新型载体的设计开发提供了一种全新的思路。简便的合成及纯化方法为其商业化提供了良好的条件。因此，此类萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体具有细胞毒性低、转染效率高、合成方法简单、易于操作等优点，可以开发为一类新型的转基因材料并具有商业化的潜力。
本发明的一个目的是解决至少上述问题或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体的制备方法以及该转基因载体的应用。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，所述树形高分子转基因载体的结构式(I)如下：
式(I)中，R为树形高分子，a为与树形高分子表面共价连接的萘酰亚胺化合物基团的数量。
优选的是，其中，R的结构式(II)如下：
式(II)中，M为氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺或1,12-十二烷基二胺；n是1～10的整数；m是2～4的整数。
优选的是，其中，a＝1～1024。
优选的是，其中，a＝1～128。
本发明的目的还可以进一步由萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体的制备方法来实现，将萘酸酐化合物与树形高分子在有机溶剂中混合加热反应。通过反应将萘酰亚胺化合物通过共价键连接到树形高分子的表面，得到萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体(I)。
优选的是，其中，所述萘酸酐化合物为4-氨基-1,8-萘酸酐。
优选的是，其中，所述有机溶剂为乙醇。
优选的是，其中，反应温度为70℃；反应时间为8小时。
本发明的目的还可以进一步由萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体在作为核酸分子输送载体中的应用来实现。
优选的是，其中，核酸分子为DNA或miRNA。
本发明基于萘酰亚胺化合物修饰的树形高分子转基因载体，萘酰亚胺化合物为式(Ia)所示，4-氨基-1,8-萘酸酐化合物修饰的树形高分子转基因载体。
本发明基于萘酰亚胺化合物修饰的树形高分子转基因载体，包括树形高分子骨架以及萘酰亚胺化合物功能基团，所述萘酰亚胺化合物功能基团通过共价键连接在树形高分子表面。包括聚酰胺-胺树形高分子以及萘酰亚胺化合物修饰的功能基团，所述聚酰胺-胺树形高分子表面的伯胺基团与所述4-氨基-1,8-萘酸酐化合物通过酰胺化反应以酰胺键相连接。
本发明中，“萘酰亚胺化合物”是指4-氨基-1,8-萘酸酐，结构如(Ia)所示，可以与树形高分子表面的氨基发生酰胺化反应。
本发明(I)式中，由聚酰胺-胺树形高分子和萘酰亚胺化合物通过共价键连接，且在树形高分子表面进行修饰，合成一种新型的高分子转基因载体，所述聚酰胺-胺树形高分子以乙二胺和丙烯酸甲酯作为单体合成树形高分子，该聚酰胺-胺树形高分子的末端为伯胺基团，n为1～10的整数，m为2～4的整数。
本发明还提供了一种新的基因萘酰亚胺修饰的树形分子转基因载体的制备方法，将萘酰亚胺化合物及树形高分子溶于有机溶剂，加热搅拌后冷却，通过反应将萘酰亚胺化合物功能基团共价连接到树形高分子表面，得到如式(I)所示的转基因载体。具体地，基于聚酰胺-胺树形高分子转基因载体的制备方法，以所述树形高分子和所述萘酰亚胺化合物为原料，首先将所述萘酰亚胺化合物和所述树形高分子溶于有机溶剂，在一定温度下搅拌反应一段时间，得到如式(I)所示的部分萘酰亚胺修饰的树形高分子的新型转基因载体。
目前的树形高分子转基因载体合成工艺复杂，价格昂贵，细胞毒性大，而且转染效果不理想。本发明式(I)基于聚酰胺-胺的树形高分子载体经萘酰亚胺化合物修饰后，能够安全高效地将基因运输的细胞中。本材料具有合成周期短，制备方法简单，细胞毒性低以及转染效率高等优点。
本发明还提供了一种基于萘酰亚胺化合物修饰的聚酰胺-胺树形高分子基因载体及其在体内体外作为核酸分子的运输载体的应用。所述核酸包括DNA和miRNA.
本发明还提供了一种复合物，其包含如式(I)所示萘酰亚胺化合物修饰的转基因载体以及核酸。
本发明还提供了一种利用式(I)所示萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体输送核酸的方法。即萘酰亚胺化合物修饰的树形高分子转基因载体与核酸在室温孵育后形成稳定的核酸复合物，再与细胞共孵育，完成基因转染过程。
本发明采用全新的修饰方法和功能单元修饰树形高分子，原料廉价易得，反应高效，产物易于纯化，转染过程中对细胞的毒性小，能高效的进行基因转染，是兼具低廉、安全、高效、合成简单等优点的转基因载体。
以荧光素酶为报告基因，以Antagomir-138-5p作为沉默miR-138-5p的沉默基因，利用本发明转基因载体运输质粒DNA和miRNA，实验表明本发明具有以下优点：本发明中基因载体不仅具有良好生物相容性，而且具有高效的基因转染效率。通过基因转染实验发现，在优化的条件加对DNA和RNA的转染中，转染效率要高于商业化的转染试剂Lipofectamine2000。在细胞毒性实验中，本发明中的转基因载体细胞毒性低，即使在高转染效率的浓度下，细胞成活率大于90％，具有良好的生物相容性。本发明转基因载体，合成所需原料廉价易得，合成步骤简单，合成产品易于纯化。在细胞转染中，细胞毒性低，转染效率高，可作为一种兼具安全、高效、价格低廉等优点的转基因载体。
本发明至少包括以下有益效果：
1、通过聚酰胺-胺树形高分子和萘酰亚胺化合物通过共价键连接，且在树形高分子表面进行修饰，合成一种新型的高分子转基因载体，该树形高分子转基因载体具有合成周期短、制备方法简单，细胞毒性低以及转染效率高的优点；
2、通过基于萘酰亚胺化合物修饰的聚酰胺-胺树形高分子基因载体及其复合物在体内体外作为核酸分子的运输载体，具有良好的生物相容性，而且具有高效的基因转染效率，细胞成活率大于90％，转染效率要高于商业化的转染试剂Lipofectamine2000；
3、本发明的树形高分子转基因载体，合成所需原料廉价易得，合成步骤简单，合成产品易于纯化。在细胞转染中，细胞毒性低，转染效率高，可作为一种兼具安全、高效、价格低廉等优点的转基因载体。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一个实施例中制备的基于萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体(G5-NA)的合成路线及转基因载体结构示意图；
图2为本发明一个实施例中制备的转基因载体G5-NA的1H NMR图；
图3为本发明一个实施例中制备的转基因载体G5-NA的1H NMR图；
图4为本发明一个实施例中制备的转基因载体G5-NA的1H NMR图；
图5为本发明一个实施例中制备的转基因载体G5-NA与DNA或RNA复合物的琼脂糖凝胶电泳实验结果示意图；
图6为本发明一个实施例中制备的转基因载体G5-NA与质粒DNA的复合物在E1细胞中的细胞毒性图；
图7为本发明一个实施例中制备的转基因载体G5-NA与pGL-3DNA复合物在E1和HEK293细胞中的转染效率图；
图8为本发明一个实施例中制备的转基因载体G5-NA与Antagomir-138-5p复合物在E1细胞中的转染效率图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
<实例1>
以摩尔比为1:10的比例制备基于萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体，以基于共价键连接4-氨基-1,8-萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体为例：
一种萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，所述树形高分子转基因载体的结构式(I)如下：
式(I)中，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，a为与树形高分子表面共价连接的萘酰亚胺化合物基团的数量，a的理论预期值为10。
G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其结构式(II)如下：
式(II)中，M为乙二胺；末端伯胺基团为128，n＝6；m＝2。
上述萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体制备合成方法：称取50毫克第五代聚酰胺-胺树形高分子与3.7毫克4-氨基-1,8-萘酸酐溶于5毫升乙醇中。将反应溶液加热到70摄氏度，搅拌8小时后，冷却至室温。再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的基于萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，其结构式如上式(I)所示。本实施例中所用原料树形高分子与4-氨基-1,8-萘酸酐之间的摩尔比为1:10。合成路线如图1所示。
以1H NMR法表征检测上述产物：取10毫克实施例1中合成的转基因载体，溶于0.5毫升氘代二甲基亚砜中，将溶液进行核磁共振测试，根据1H NMR谱图，如图2所示，计算树形高分子的修饰效率。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面连接了8个萘酰亚胺基团，即式(I)中a为8。
<实例2>
以摩尔比为1:40的比例制备基于萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体，以基于共价键连接4-氨基-1,8-萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体为例：
一种萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，所述树形高分子转基因载体的结构式(I)如下：
式(I)中，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，a为与树形高分子表面共价连接的萘酰亚胺化合物基团的数量，a的理论预期值为40。
G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其结构式(II)如下：
式(II)中，M为乙二胺；末端伯胺基团为128，n＝6；m＝2。
上述萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体制备合成方法：称取50毫克第五代聚酰胺-胺树形高分子与14.8毫克4-氨基-1,8-萘酸酐溶于5毫升乙醇中。将反应溶液加热到70摄氏度，搅拌8小时后，冷却至室温。再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的基于萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，其结构式如上式(I)所示。本实施例中所用原料树形高分子与4-氨基-1,8-萘酸酐之间的摩尔比为1:40。合成路线如图1所示。
以1H NMR法表征检测上述产物：取10毫克实施例1中合成的转基因载体，溶于0.5毫升氘代二甲基亚砜中，将溶液进行核磁共振测试，根据1H NMR谱图，如图3所示，计算树形高分子的修饰效率。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面连接了30个萘酰亚胺基团，即式(I)中a为30。
<实例3>
以摩尔比为1:80的比例制备基于萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体，以基于共价键连接4-氨基-1,8-萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体为例：
一种萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，所述树形高分子转基因载体的结构式(I)如下：
式(I)中，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，a为与树形高分子表面共价连接的萘酰亚胺化合物基团的数量，a的理论预期值为80。
G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其结构式(II)如下：
式(II)中，M为乙二胺；末端伯胺基团为128，n＝6；m＝2。
上述萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体制备合成方法：称取50毫克第五代聚酰胺-胺树形高分子与29.6毫克4-氨基-1,8-萘酸酐溶于5毫升乙醇中。将反应溶液加热到70摄氏度，搅拌8小时后，冷却至室温。再将反应液转移到截留分子量为3500的透析袋中，用乙醇透析10小时，再用水透析三次。收集样品并冷冻干燥，得到外观为橙黄色粉末的基于萘酰亚胺修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，其结构式如上式(I)所示。本实施例中所用原料树形高分子与4-氨基-1,8-萘酸酐之间的摩尔比为1:80。合成路线如图1所示。
以1H NMR法表征检测上述产物：取10毫克实施例1中合成的转基因载体，溶于0.5毫升氘代二甲基亚砜中，将溶液进行核磁共振测试，根据1H NMR谱图，如图4所示，计算树形高分子的修饰效率。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面连接了50个萘酰亚胺基团，即式(I)中a为50。
<实例4>
对实施例1中制备得到的树形高分子转基因载体进行了如下方面的检测：
(1)转基因载体与pUC18-DNA/RNA复合物的琼脂糖凝胶电泳实验
转基因载体与pUC18-DNA或者RNA复合物的制备
室温下，在PE管里分别加入转基因载体和pUC18-DNA或者RNA，其中转基因载体与pUC18-DNA的质量比分别为0.2:1，1:1，2:1，5:1,pUC18-DNA浓度为9μg/mL，转基因载体与RNA的质量比分别为0.1:1，0.2:1，1:1，5:1,RNA浓度为9μg/mL。然后，加入相应体积的超纯水，使反应液的最终体积保持在20μL，离心混合均匀，放入37℃恒温水浴中，保温0.5小时后，加入2μL的10×Loading Buffer上样缓冲液终止反应。
复合物的琼脂糖凝胶电泳实验
分别取上述制备的转基因载体与pUC18-DNA或者RNA复合物10μL加入凝胶上的加样孔内。盖上电泳盖，电压100V条件下电泳30分钟后停止，取出凝胶在凝胶电泳成相系统中曝光采样。
如图5所示，图中，G5-NA表示实施例1中制备的基于萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体，利用琼脂糖凝胶电泳实验，我们观察了转基因载体与pUC18-DNA或者RNA的作用情况。转基因载体与pUC18-DNA的质量比为0.2:1时，所有pUC18-DNA都滞留在上样孔；转基因载体与RNA的质量比为1:1时，所有RNA都滞留在上样孔。表明转基因载体不仅能包裹DNA，而且能包裹RNA，包裹凝聚效果都非常良好。
(2)转基因载体细胞毒性实验
转基因载体与pUC18-DNA复合物的制备
室温下，在PE管里分别加入转基因载体，其中转基因载体与pUC18-DNA的质量比分别为1:1,5:1,10:1,20:1，pUC18-DNA的浓度为9μg/mL，加入相应体积的DMEM，使反应液的最终体积保持在300μL，放入37℃恒温水浴中，保温1个小时。
细胞毒性实验
用胰酶消化收取对数生长期的E1细胞将大约每孔7000个细胞种入96孔板中，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的不同浓度的转基因载体与pUC18-DNA复合物100μL，每个浓度设置五个平行孔；采用不含转基因载体的DMEM培养基作为空白对照，采用商业化Lipofectamine 2000作为阳性对照，不含细胞只有α-MEM作为空白对照，4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入200μL含10％胎牛血清的α-MEM，于培养箱中培养24小时后，向每孔加入10μL MTT溶液，4小时后吸出所有加入液，生成的紫蓝色结晶用150μL二甲基亚砜溶解，于摇床上震荡10分钟后用酶标仪测定每一孔在490nm处的吸光度值。按如下公式计算细胞存活率(％)＝[A490test-空白]/[A490control-空白]×100。
如图6所示，图中，G5-NA表示实施例1中制备的基于萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体。经过在E1细胞中测定转基因载体的细胞毒性，发现转基因载体的细胞毒性都比较低。细胞的成活率基本都在90％以上，高于商业化的转基因载体Lipofectamine 2000。
(3)转基因载体与pGL-3DNA的复合物体外转染实验
转基因载体与pGL-3DNA复合物的制备
室温下，在PE管里加入转基因载体与pGL-3DNA，转基因载体与pGL-3DNA的质量比为10:1，pGL-3DNA的浓度为9μg/mL，加入相应体积的培养基，使反应液的最终体积保持在200μL，轻轻吹打混匀，放入37℃恒温水浴中，保温5分钟。
体外转染实验
用胰酶消化收取对数生长期的E1细胞将大约每孔7.0×104-9.0×104个细胞种入24孔细胞培养板，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的转基因载体与pGL-3DNA质粒复合物200μL。4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入200μL含10％胎牛血清的α-MEM，于培养箱中培养24小时后，取出24孔板，用PBS洗液洗涤两次。加入120μL细胞裂解液，常温震荡15min，将充分裂解产物转入1.5mL EP管，12000rpm离心30s，将离心好的上清液移入新的EP管进行后续检测。取裂解样品20μL加入96孔白板，另外加入100μLLuciferase Assay Reagent吹打两到三次混匀，放到酶标仪上测定。
按照上述的方法制备转基因载体Lipofectamine2000与pGL-3DNA的复合物，按照上述的方法将转基因载体Lipofectamine2000与pGL-3DNA以及转基因载体与pGL-3DNA复合物加入到HEK293细胞中进行体外转染实验，转染所选用培养基为DMEEM。
如图7所示，图中，G5-NA表示实施例1中制备的基于萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体，通过细胞转染实验可以得出：在HEK293细胞的转染中，与商业化转染试剂lipofectamine 2000相比，合成的转基因载体具有较高转染效率。
(4)转基因载体与Antagomir-138-5p的复合物体外转染实验
转基因载体与Antagomir-138-5p复合物的制备
室温下，在PE管里加入转基因载体与Antagomir-138-5p，转基因载体与Antagomir-138-5p的质量比分别为10:1，20:1，30:1，Antagomir-138-5p的浓度为50nM，加入相应体积的α-MEM，使反应液的最终体积保持在200μL，轻轻吹打混匀，放入37℃恒温水浴中，保温5分钟。
体外转染实验
用胰酶消化收取对数生长期的E1细胞将大约每孔2.0×105个细胞种入6孔细胞培养板，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的不同质量比的转基因载体与Antagomir-138-5p复合物1000μL。4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入1000μL含10％胎牛血清的α-MEM，于培养箱中培养48小时后，取出24孔板，用PBS洗液洗涤两次。加入200μL细胞裂解液，常温震荡15min，将充分裂解产物转入1.5mL EP管，12000rpm离心30s，将离心好的上清液移入EP管，qPCR检测miR-138-5p的表达量。
按照上述的方法制备转基因载体Lipofectamine2000与Antagomir-138-5的复合物。
如图8所示，图中，G5-NA表示实施例1中制备的基于萘酰亚胺化合物修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子转基因载体，通过细胞转染实验可以得出：在E1细胞的转染中，转基因载体与Antagomir-138-5p的质量比为10:1时，转染效率最高，能够使基因miR-138-5p沉默90％以上，远好于商业化转染试剂lipofectamine 2000。
综上所述，本发明中通过聚酰胺-胺树形高分子和萘酰亚胺化合物通过共价键连接，且在树形高分子表面进行修饰，合成一种新型的高分子转基因载体，萘酰亚胺化合物基团在1～1024合成的高分子转基因载体均具有低的细胞毒，在DNA和RNA的转染中，都具有较高的转染效率，其制备方法简单、成熟、易于掌控。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，其特征在于，所述树形高分子转基因载体的结构式(I)如下：
式(I)中，R为树形高分子，a为与树形高分子表面共价连接的萘酰亚胺化合物基团的数量。
2.如权利要求1所述的萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，其特征在于，R的结构式(II)如下：
式(II)中，M为氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺或1,12-十二烷基二胺；n是1～10的整数；m是2～4的整数。
3.如权利要求1所述的萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体，其特征在于，a＝1～1024。
4.一种制备权利要求1～3任一项所述的萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体的方法，其特征在于，将萘酸酐化合物与树形高分子在有机溶剂中混合加热反应。通过反应将萘酰亚胺化合物通过共价键连接到树形高分子的表面，得到萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体(I)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述萘酸酐化合物为4-氨基-1,8-萘酸酐。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，反应温度为70℃；反应时间为8小时。
8.如权利要求1～3中任一项所述的萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体在作为核酸分子输送载体中的应用。
9.如权利要求8所述的萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体在作为核酸分子输送载体中的应用，其特征在于，核酸分子为DNA或miRNA。
CN201810641124.6A 2018-06-21 2018-06-21 萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用 Active CN108753830B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810641124.6A CN108753830B (zh) 2018-06-21 2018-06-21 萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810641124.6A CN108753830B (zh) 2018-06-21 2018-06-21 萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108753830A true CN108753830A (zh) 2018-11-06
CN108753830B CN108753830B (zh) 2021-06-29

Family

ID=63979424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810641124.6A Active CN108753830B (zh) 2018-06-21 2018-06-21 萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108753830B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111983234A (zh) * 2020-07-20 2020-11-24 西北工业大学 一种基于太赫兹波快速检测大肠杆菌的方法
CN115737914A (zh) * 2022-11-25 2023-03-07 杭州矩正医疗科技有限公司 一种具有血管修复功能的感光材料制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103289101A (zh) * 2013-05-31 2013-09-11 华东师范大学 一种基因转染载体及其制备方法与应用
WO2014109985A1 (en) * 2013-01-14 2014-07-17 The Regents Of The University Of Michigan Fluorogenic dendrimer reporters and related methods of use
WO2015038493A1 (en) * 2013-09-10 2015-03-19 The Research Foundation For The State University Of New York Synthesis of novel asymmetric bow-tie pamam dendrimer-based conjugates for tumor-targeting drug delivery
CN105418939A (zh) * 2015-12-15 2016-03-23 华东师范大学 胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料、制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014109985A1 (en) * 2013-01-14 2014-07-17 The Regents Of The University Of Michigan Fluorogenic dendrimer reporters and related methods of use
CN103289101A (zh) * 2013-05-31 2013-09-11 华东师范大学 一种基因转染载体及其制备方法与应用
WO2015038493A1 (en) * 2013-09-10 2015-03-19 The Research Foundation For The State University Of New York Synthesis of novel asymmetric bow-tie pamam dendrimer-based conjugates for tumor-targeting drug delivery
CN105418939A (zh) * 2015-12-15 2016-03-23 华东师范大学 胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料、制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAO, Y.G.等: "Functional lipids based on [12]aneN3 and naphthalimide as efficient non-viral gene vectors", 《ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111983234A (zh) * 2020-07-20 2020-11-24 西北工业大学 一种基于太赫兹波快速检测大肠杆菌的方法
CN115737914A (zh) * 2022-11-25 2023-03-07 杭州矩正医疗科技有限公司 一种具有血管修复功能的感光材料制备方法
CN115737914B (zh) * 2022-11-25 2024-02-06 杭州矩正医疗科技有限公司 一种具有血管修复功能的感光材料制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108753830B (zh) 2021-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103665384B (zh) 新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体制备方法和应用
Sun et al. The strategy to improve gene transfection efficiency and biocompatibility of hyperbranched PAMAM with the cooperation of PEGylated hyperbranched PAMAM
Sun et al. Mannosylated biodegradable polyethyleneimine for targeted DNA delivery to dendritic cells
AU2001235695B2 (en) Method for preparing functionalised polyalkylenimines, composition containing same and uses thereof
CN103710388A (zh) 包裹纳米金颗粒的peg功能化的pamam树状大分子载体的基因转染方法
CN105254900B (zh) 溴取代的芳香化合物修饰的高分子材料及制备方法与应用
Kadlecova et al. Hyperbranched polylysine: a versatile, biodegradable transfection agent for the production of recombinant proteins by transient gene expression and the transfection of primary cells
CN108753830A (zh) 萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用
Kim et al. Effects of the Physicochemical, Colloidal, and Biological Characteristics of Different Polymer Structures between α-Poly (l-lysine) and ε-Poly (l-lysine) on Polymeric Gene Delivery
Chen et al. Fabrication of zein-based hydrophilic nanoparticles for efficient gene delivery by layer-by-layer assembly
CN104419004B (zh) 改性聚乙烯亚胺及其制备方法和基因转染试剂及其应用
CN107937443B (zh) 一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用
CN105418939B (zh) 胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料、制备方法和应用
CN101812178A (zh) 还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用
CN108753829B (zh) 骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用
CN102698290A (zh) 基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法
CN102154351B (zh) 阳离子化当归多糖纳米粒基因传递系统及其制法
CN107245099B (zh) 树枝状人源性细胞穿膜肽hPP7K、生产及其介导质粒DNA转染的方法
CN108395411B (zh) 树枝状分子类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN102154350B (zh) 阳离子化枸杞多糖纳米粒基因传递系统及其制法
CN104910387B (zh) 聚乙二醇（peg）化小分子量pei衍生物、制备方法、用途及其复合物
CN109136271A (zh) 阳离子聚乙烯胺线形高分子作为转基因载体的应用
CN102516535B (zh) 可降解亚胺类聚阳离子及其合成方法、纳米颗粒
CN106480092B (zh) 一种基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体及其制备方法和应用
CN113683780B (zh) 具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221215

Address after: 710086 Room 001, F1902, 19/F, Building 4-A, Xixian Financial Port, Fengdong New City Energy Jinmao District, Xixian New District, Xi'an, Shaanxi

Patentee after: Xi'an Jiuqing Medical Technology Co.,Ltd.

Address before: 710072 No. 127 Youyi West Road, Shaanxi, Xi'an

Patentee before: Northwestern Polytechnical University

Patentee before: XI'AN JIUQING BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.