CN103305549A

CN103305549A - 具有多重氧化还原刺激响应的纳米粒子基因载体系统及其制备方法和应用

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Publication number: CN103305549A
Application number: CN2013102424511A
Authority: CN
Inventors: 顾忠伟; 聂宇; 何一燕; 程刚; 谢丽
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-06-19
Also published as: CN103305549B

Abstract

本发明公开了具有多重氧化还原刺激响应的纳米粒子基因载体系统及其制备方法和应用。该基因载体系统由遮蔽体系、阳离子材料和外源质粒DNA组成；所述遮蔽体系和阳离子材料都具有氧化还原刺激响能力，从而形成具有多重氧化还原刺激响应性的三元复合物纳米粒子。本发明的三元复合物纳米粒子基因载体细胞毒性小，在生理条件下可以很好的压缩和复合质粒DNA，并成功将负载的基因物质转移到细胞内，进入细胞内，由于细胞内的还原环境可较快断裂而释放出所载基因，实现基因物质的表达，完成转染过程，可以显著提高基因转染效率。

Description

具有多重氧化还原刺激响应的纳米粒子基因载体系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，涉及具有多重氧化还原刺激响应特性的纳米粒子基因载体。

背景技术

在治疗遗传性疾病以及肿瘤方面，病毒虽然是目前最有效的基因载体，但是其不可忽视的安全隐患限制了病毒载体的临床应用。大多数病毒是由压缩基因组的内核和包被的蛋白质壳层所组成的具有核壳结构的纳米尺度颗粒。病毒在细胞外稳定存在，其可以识别细胞所提供的信号，并依据的体内或细胞微环境的变化而进行逐步的分子转化从而启动解组装响应的特点为非病毒基因载体的设计提供了很好的启迪。人们也设计出模拟病毒解组装响应的核壳型“人造病毒”，如特定的酶、酸碱度或还原环境而引起单一式响应的壳的去遮蔽或核的解压缩过程。双响应式设计也证明，同时具备“壳的去遮蔽”和“核的解压缩”的“人造病毒”更为敏感，但它们都没有真正模仿到病毒的程序性响应的去遮蔽和解压缩过程。

研究发现，肿瘤组织中的还原剂如谷胱甘肽（GSH）的水平比正常组织（1～5微摩尔/升）的高4倍左右，达到约20微摩尔/升的水平（Cancer Research. 2002;62:307-12.）；细胞内的还原剂总浓度更高，相当于正常组织的1000倍，达到了1～10毫摩尔/升的水平（Adv Drug Deliver Rev. 2003;55:199-215.）。针对这些不同组织不同部位的不同氧化还原环境，设计多重刺激响应的拟病毒基因载体，可以智能化的控制基因的释放表达和对于肿瘤细胞的靶向杀伤性。

分子量为25kDa的聚乙烯亚胺(PEI)是非病毒类载体中被广泛地作为黄金基准的聚合物载体，但是PEI固有的细胞毒性和很高的表面正电荷，限制其在体内的应用。分子量为800Da的OEI，虽然几乎没有细胞毒性，但不能很好压缩DNA，转染效率较低。

因此，开发出具有良好稳定性并能生物降解为无毒安全小分子的载体，又同时具有氧化还原等多重刺激响应性的，且具有较高转染效率的基因载体是行业亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明所要提供的是具有梯度氧化还原刺激响应性的三元复合物纳米粒子基因载体及其制备方法，并将其用于体外基因转染、肿瘤、哮喘和心血管疾病的基因治疗。

本发明通过以下技术方案来实现：

基因载体系统，由遮蔽体系、阳离子材料和质粒DNA组成，所述遮蔽体系和阳离子材料中都含有氧化还原敏感键，构成具有多重氧化还原刺激响应特性的纳米粒子基因载体，所述阳离子材料和质粒DNA复合形成二元复合物颗粒，所述遮蔽体系通过静电作用遮蔽到所述二元复合物表面，形成三元复合物颗粒。采用多重氧化还原刺激响应的策略，更接近病毒载体的去遮蔽和解压缩过程，可以提高基因输送的效率，并远优于单一式响应。

作为优选方式，所述氧化还原敏感键为双硫键或双硒键中的至少一种，使得材料在氧化还原条件下会发生降解。所述遮蔽体系和阳离子材料中可以都含有双硫键或都含有双硒键，也可以一个含双硫键，另一个含双硒键，还可以各自都同时含有双硫键和双硒键。

作为优选方式，所述遮蔽体系中含有双硫键，所述阳离子材料中含有双硒键。这种结构的基因载体系统能够在肿瘤的细胞外和细胞内不同还原剂浓度的条件下，通过分子化学结构的变化作出实时响应，实现梯度氧化还原刺激响应。可以使得三元复合物载体在细胞外低GSH浓度的环境中保持稳定，长时间循环，并保护DNA免受血清中的脱氧核糖核酸酶(DNase)降解；到达目标肿瘤组织时，由于肿瘤组织稍高的GSH浓度，导致外层（遮蔽体中）更为敏感的双硫键首先断开（或部分断开），更有利于复合物颗粒的内吞；进入细胞后，胞内GSH浓度比胞外高至1000倍达到1～10毫摩尔/升，此时，较为稳定的双硒键（阳离子材料中）也断开，阳离子材料降解，释放出DNA，有利于DNA入核，从而实现基因的高表达。

作为优选方式，所述遮蔽体系中含有双硒键。这种结构的基因载体能更好的保护DNA，使其免受血清中的（脱氧核糖核酸酶）DNase降解，以及避免血清中负电荷的血清蛋白造成的聚沉现象而形成血栓。外层（遮蔽体中）采用相对更稳定的双硒键，使得三元复合物载体在细胞外低GSH浓度的环境中更稳定，循环时间更长，到达目标肿瘤组织时，在肿瘤组织稍高的GSH浓度下仍然需要接触更长的时间或直到进入细胞后才会断开，进入细胞后，整个三元复合物体系彻底解组装，从而释放出DNA，实现基因转染。还可以与外层含双硫键的载体混合使用，已到达更好的综合效果。

作为优选方式，所述遮蔽体系为对糖胺聚糖上的至少一个葡萄糖醛酸单元上的羧基进行修饰，得到的具有还原敏感的双硫键或双硒键并且末端仍是羧基的糖胺聚糖衍生物。糖胺聚糖（glycosaminoglycan），为杂多糖的一种，糖胺聚糖分为：透明质酸、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素等。它是由重复的二糖单位构成的长链多糖，其二糖单位之一是氨基己糖（氨基葡萄糖或氨基半乳糖），故称糖胺聚糖；另一个是糖醛酸。糖胺聚糖是细胞间质的重要组成部分，细胞间质绝大部分都是糖胺聚糖，因此具有良好的生物相容性和可降解性。

作为一种优选，本发明中所述遮蔽体系中所用的糖胺聚糖的分子量为 5-2000kDa。

作为一种优选，本发明中所述糖胺聚糖为透明质酸。

作为一种优选，所述遮蔽体系为通过对透明质酸上的至少一个葡萄糖醛酸单元上的羧基进行修饰，得到的具有还原敏感的双硫键并且末端仍是羧基的透明质酸衍生物（HA-SS-COOH）。结构示意如下：

作为优选方式，所述阳离子材料由含双硫键或双硒键的化合物与聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、精胺、氨基酸多肽、肽类树状分子或含肽类树状分子的阳离子脂质材料或其他脂质材料（如阳离子脂质聚合物等）中的至少一种交联而成。所述阳离子材料的外围都含有丰富的氨基，便于与含双硫键或双硒键的化合物交联，所述含双硫键或双硒键的化合物为含双硫键或双硒键的二羧酸或二烯。所述聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、精胺、氨基酸多肽或脂质材料的分子量为200～4000 Da。

作为优选方式，所述由含双硫键或双硒键的化合物与聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺或精胺交联而成阳离子材料结构式为：

或

其中，n=1~10，x≥1，y≥1，DT为聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺或精胺。所述阳离子材料细胞毒性低，转染效率高，分子量可控。

作为优选方式，所述阳离子材料为双硒键交联的寡聚乙烯亚胺(OEI-SeSe_x)，结构示意如下：

其中n=1～10，x≥1。

作为一种优选，所述含肽类树状分子的阳离子脂质材料结构式为：

其中，R₁为饱和/不饱和烃基或氨基酸基团，R₂为氨基酸基团、饱和/不饱和烃基或

，R₁和 R₂中至少一个为氨基酸基团，X、Y、Z为NH、O或S，o、p、q分别独立为1或0；所述饱和/不饱和烃基优选烷基、烯基、芳香基，更优选为C10-C20的烷基、的烯基、含芳香基的氨基酸衍生物，所述氨基酸基团优选为赖氨酸、精氨酸或组氨酸基团。

或

作为一种优选，本发明所述基因载体系统中所述的质粒DNA采用在真核细胞表达的质粒DNA。可以是含报告基因或细胞因子基因或抑癌基因的真核重组表达质粒。

作为一种优选，本发明所述基因载体系统中遮蔽体系与质粒DNA的质量比例为0. 1：1～50：1，阳离子材料与质粒DNA的质量比例为0. 1：1～50：1。

本发明还提供了制备上述基因载体系统的方法，其具体步骤如下：

将质粒DNA溶于无菌HBG缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 毫摩尔， 5% 葡萄糖）中，配制成浓度为0.1 mg/mL的DNA溶液；将阳离子材料溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.1-10 mg/mL的溶液A；将遮蔽体系溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.01-1 mg/mL的溶液B;

将上述步骤中得到的溶液A与DNA溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到二元复合物，再加入溶液B，在室温下孵育20分钟后，得到三元复合物。

本发明还提供了上述基因载体系统的应用：将所述基因载体与超顺磁性纳米粒子（MNP）和/或脂溶性的药物联合制成复合载体或药物，用于体外基因转染、肿瘤、哮喘或心血管疾病的基因治疗、基因与化学药物疗联合治疗、疾病诊疗一体化。

本发明还提供了由基因载体与磁性纳米粒子联合的复合载体系统，所述磁性纳米粒子可以是水溶性的也可以是脂溶性的。作为优选，所述磁性纳米粒子和基因弥散地分布于所述基因载体中。作为优选，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁，伽马三氧化二铁或掺有锰、钴或锌的铁氧磁性纳米粒子中的至少一种。作为优选，所述磁性纳米粒子为负电性的，其平均粒径尺度在5 ~ 50 nm之间,其表面电位在-5 ~ -50 mV之间。作为优选，所述磁性纳米粒子表面修饰有负电性有机材料，所述负电性有机材料可以是羧基硅烷偶联剂、氨基酸类树状分子、酒石酸、柠檬酸、草酸、乙酸中的至少一种。通过加入磁性纳米粒子使复合载体能响应外加磁场，并在外加磁场的引导下集中到目标部位，实现磁靶向功能。

本发明还提供了一种复合药物，包括所述基因载体和药物有效成分。所述药物可以与所述质粒DNA一起包裹在所述阳离子材料，实现质粒DNA与药物同时释放，同时达到基因治疗和药物治疗的目的；所述药物也可以包裹在所述遮蔽体系中或同时包裹在遮蔽体系和阳离子材料中，实现药物与DNA的分阶段释放。

本发明还提供了所述基因载体与药物和磁性纳米粒子三者同时复合的复合载体系统。将三者的功能集成在一个载体系统中。

本发明中所述优选方式之间可以任意组合。

本发明的有益效果：

1. 本发明所述具有多重氧化还原刺激响应性的基因载体，采用多重氧化还原刺激响应的策略，更接近病毒载体的去遮蔽和解压缩过程，其基因转染效率明显优于其他单一式刺激响应或非智能响应的传统基因载体。

2.本发明所述含有双硒键的氧化还原刺激响应阳离子材料（如OEI-SeSe_x），能与质粒DNA通过静电作用形成表面带有正电荷的纳米尺度的二元复合物颗粒（OEI-SeSe_x/DNA binary polyplexes,简写为DSe）。本发明所述含有双硫键的氧化还原刺激响应遮蔽体系（如HA-SS-COOH），其末端的羧基可通过静电络合作用与DSe表面剩余的正电荷结合，形成表面具有很低正电荷或是负电荷的三元复合物（OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS-COOH ternary polyplexes, 简写为DSeS）。

3.本发明所述含有双硫键的氧化还原刺激响应遮蔽体系，一方面可以达到屏蔽正电荷的作用，降低毒性及避免血清白蛋白引起的聚集，逃脱网状内皮系统的清除作用，从而减少阳离子聚合物的细胞毒性、增加血清稳定性；另一方面，在到达肿瘤组织部位或进入细胞后，在还原性环境的作用下，更敏感的双硫键会发生断裂，解除屏蔽作用，使内部的DSe暴露出来，提高其从内涵体逃逸的能力，从而有利于提高转染效率。

4. 本发明所述基因载体系统在肿瘤的细胞外和细胞内不同还原剂浓度的条件下，通过分子化学结构的变化作出实时响应。梯度氧化还原刺激响应性可以使得OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS-COOH三元复合物载体在细胞外低GSH浓度的环境中保持稳定，长时间循环，并保护DNA免受血清中的DNase降解；到达目标肿瘤组织时，由于肿瘤组织稍高的GSH浓度，导致外层更为敏感的双硫键首先断开（或部分断开），更有利于复合物颗粒的内吞；进入细胞后，胞内GSH浓度比胞外高至1000倍达到1～10毫摩尔/升，此时，较为稳定的双硒键也断开，降解为低分子量的OEI，释放出DNA，有利于DNA入核，从而实现基因的高表达。

5. 本发明所述基因载体的制备方法操作简单、便于大规模生产。

6.本发明所述基因载体，能够很方便地用于体外基因转染、肿瘤、哮喘和心血管疾病的基因治疗。

附图说明

图1本发明所述含有双硫键的氧化还原刺激响应遮蔽体系的结构式。

图2本发明所述含有双硒键的氧化还原刺激响应阳离子材料的结构式。

图3本发明实施例4所述三元复合物纳米粒子基因载体示意图。

图4是采用GPC测定的色谱图。

图5是不同转染复合物对HepG2细胞转染24小时后的细胞存活率。

图6是不同转染复合物（DP; DSe; DPS; 和DSeS）分别介导绿色荧光蛋白质粒对HepG2细胞转染效率图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。下列实施例选用透明质酸和聚乙烯亚胺作为示范，本领域技术人员很容易将其推广到其他材料。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

简写说明：

DP： PEI 25kDa和DNA的二元复合物，质量比为1.2/1。

DSe：OEI-SeSe_x和DNA的二元复合物。

DPS：PEI 25kDa、DNA和HA-SS-COOH的三元复合物。

DSeS：OEI-SeSe_x、DNA和HA-SS-COOH的三元复合物。

实施例1：具有双重氧化还原刺激响应性的基因载体（OEI-SS/DNA/HA-SS-COOH）的制备

将质粒DNA溶于无菌HBG缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 毫摩尔， 5% 葡萄糖）中，配制成浓度为0.1 mg/mL的DNA溶液；将双硫键交联的聚乙烯亚胺（OEI-SS）溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.1-10 mg/mL的OEI-SS溶液；将含有双硫键的遮蔽体系（HA-SS-COOH）溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.01-1 mg/mL的HA-SS-COOH溶液。

将上述OEI-SS溶液溶液和质粒DNA溶液混合，混合后的溶液在室温下孵育20分钟后，得到OEI-SS/DNA二元复合物。再加入HA-SS-COOH溶液，所得混合溶液在室温下孵育20分钟后，得到遮蔽体系和阳离子材料同时含有双硫键的具有多重氧化还原刺激响应性的基因载体OEI-SS/DNA/HA-SS-COOH三元复合物。

实施例2：具有双重氧化还原刺激响应性的基因载体（OEI-SeSe_x/DNA/HA-SeSe -COOH）的制备

将质粒DNA溶于无菌HBG缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 毫摩尔， 5% 葡萄糖）中，配制成浓度为0.1 mg/mL的DNA溶液；将双硒键交联的聚乙烯亚胺（OEI-SeSe_x）溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.1-10 mg/mL的OEI-SeSe_x溶液；将含有双硒键的遮蔽体系（HA-SeSe-COOH）溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.01-1 mg/mL的HA-SeSe-COOH溶液。

将上述OEI- SeSe_x溶液溶液和质粒DNA溶液混合，混合后的溶液在室温下孵育20分钟后，得到OEI- SeSe_x/DNA二元复合物。再加入HA-SeSe-COOH溶液，所得混合溶液在室温下孵育20分钟后，得到遮蔽体系和阳离子材料同时含有双硒键的具有多重氧化还原刺激响应性的基因载体OEI-SeSe_x /DNA/HA- SeSe-COOH三元复合物。

实施例3：具有双重氧化还原刺激响应性的基因载体（OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS -COOH）的制备

将质粒DNA溶于无菌HBG缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 毫摩尔， 5% 葡萄糖）中，配制成浓度为0.1 mg/mL的DNA溶液；将双硒键交联的聚乙烯亚胺（OEI-SeSe_x）溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.1-10 mg/mL的OEI-SeSe_x溶液；将含有双硫键的遮蔽体系（HA-SS-COOH）溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.01-1 mg/mL的HA-SS-COOH溶液。

将上述OEI- SeSe_x溶液溶液和质粒DNA溶液混合，混合后的溶液在室温下孵育20分钟后，得到OEI-SeSe_x/DNA二元复合物。再加入HA-SS-COOH溶液，所得混合溶液在室温下孵育20分钟后，得到具有多重氧化还原刺激响应性的基因载体OEI-SeSe_x /DNA/HA- SS-COOH三元复合物。

体外基因转染试验显示实施例1-3所述的三种基因载体基因转染效率均高于只含有一重还原刺激响应性的基因载体。

实施例4：具有梯度氧化还原双重刺激响应性的基因载体的制备

将不同浓度的双硒键交联的聚乙烯亚胺（OEI-SeSe_x）溶液和质粒DNA溶液以一定质量比混合，混合后的溶液在室温下孵育20分钟后，得到OEI-SeSe_x/DNA二元复合物。再加入不同浓度的HA-SS-COOH溶液，所得混合溶液在室温下孵育20分钟后，得到同时含有双硫键和双硒键具有梯度氧化还原双重刺激响应性的基因载体OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS-COOH三元复合物。此OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS-COOH三元复合物用于下一步的毒性和转染等实验。按照上述方法制备的三元复合物粒子的组成及性能如表1所示。

表1. OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS-COOH三元复合物的组成和性能

复合物简写	阳离子：DNA：HA-SS-COOH的质量比	复合物粒径（nm）	复合物表面电荷（mV）
				DP	1.2：1：0	111.25	23.73
DPS	1.2：1：2	197.52	6.92
				DSe	0.1：1：0	>1 μm	-16.12
DSe	10：1：0	84.35	27. 07
				DSe	50：1：0	76.74	28.50
DSeS	10：1：0.1	89.43	25.65
				DSeS	10：1：2	164.50	15.54
DSeS	50：1：50	>1 μm	-19.48

实施例5：双硒键的氧化还原刺激响应性能测试

为了验证双硒键的氧化还原刺激响应性能，将OEI₈₀₀-SeSe_x分别用不同浓度GSH（10 μm或100 μm）处理一定的时间（4 h或8 h）后，用凝胶渗透色谱法（GPC法）测其分子量，色谱图见图4。GPC设备参数如下：Waters 2690D HPLC, ultrahydrogel 120 及ultrahydrogel 1000 柱串联，折射率检测器；流动相：0.1 摩尔/升的甲酸钠缓冲液（pH 2.8），流速1.0 毫升/分，柱温35°C；以聚乙二醇为标准物质计算分子量。

图4是采用GPC测定的色谱图，从下往上分别是：PEI_25k是分子量为25kDa的聚乙烯亚胺；OEI₈₀₀-SeSe_x是双硒键交联的聚乙烯亚胺；OEI₈₀₀-SeSe_x经10 μm GSH 处理4 h后；OEI₈₀₀-SeSe_x经10 μm GSH 处理8 h后；OEI₈₀₀-SeSe_x经100 μm GSH 处理4 h后；OEI₈₀₀是分子量为800 Da的寡聚乙烯亚胺。由图4可见，本实施例中选用与PEI_25k分子量相当的OEI₈₀₀-SeSe_x，经过10 μm GSH处理4 h或8 h后，其分子量均不发生改变，而当用更高浓度的GSH（100 μm）处理4 h后，分子量变小至OEI₈₀₀。说明OEI₈₀₀-SeSe_x中的双硒键在10 μm GSH环境下是比较稳定的，而在100 μm的高浓度下，双硒键会断开，使OEI₈₀₀-SeSe_x降解为小分子的OEI₈₀₀片段。而文献报道（Aaps Journal. 2009；11：445-455），双硫键在10μm水平的还原剂作用下也会随着时间的延长而断开。说明在相同10 μm水平的还原剂下，双硒键要比双硫键更稳定；在更高水平的还原剂下，双硒键和双硫键都会断开。可见，本发明所述OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS-COOH三元复合物载体具有梯度氧化还原刺激响应性能。

实施例6：细胞存活率检测

HepG2细胞的培养：取人的肝肿瘤细胞HepG2细胞，在含有10%（质量/体积百分数）的胎牛血清的培养液中，在含5%（体积百分数）CO₂，温度为37℃的培养箱中培养24小时。

转染前24小时内，取对数生长期HepG2细胞，胰酶消化后用DMEM培养基稀释，按每孔1X10⁴细胞的密度接种于96孔培养板，置于含5%（体积百分数）的CO₂，温度为37℃的培养箱中继续培养至80-90%融合，转染时，吸去前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入转染复合物颗粒和含有10%（质量/体积百分数）的胎牛血清的DMEM培养基至终体积0.1 mL，继续培养24小时；

然后加入10 μL浓度为5 mg/mL 的MTT溶液（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）在37℃孵育4小时，加入150 μL DMSO（二甲基亚砜）。然后用酶标仪（Bio-Rad）测试每孔的吸光度值A，测试波长选用492 nm。细胞存活率按下公式计算：

细胞存活率（%）=（A_sample/A_control）X 100

A_sample是转染后的细胞样品孔的吸光度值，A_control是不与转染复合物作用的细胞对照孔的吸光度值，每组实验重复六次。

图5是不同转染复合物对HepG2细胞转染24小时后的细胞存活率。由图5可见，双重刺激响应的DSeS三元复合物对HepG2细胞毒性远远低于单一核刺激响应的DSe和单一壳刺激响应的DPS复合物，在HA-SS-COOH/DNA质量比为2，不同的OEI-SeSe_x/DNA质量比的情况下，DSeS细胞存活率在80%以上，可见本发明的双重刺激响应的基因载体具有较低的细胞毒性。

实施例7：具有梯度氧化还原刺激响应的OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS-COOH三元复合物基因载体介导绿色荧光蛋白质粒对HepG2细胞的体外转染效率的测定

转染前，取对数生长期HepG2细胞，胰酶消化后用DMEM培养基稀释，按每孔4X10⁵细胞的密度接种于6孔培养板，置于含5%（体积百分数）的CO₂，温度为37℃的培养箱中继续培养至80-90%融合，转染时，吸去前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入转染复合物颗粒以及含有10%（质量/体积百分数）的胎牛血清的DMEM培养基至终体积2 mL，4小时后，更换新鲜的含10%胎牛血清的培养基，继续培养44个小时。

体外转染效率的测定：取出培养板，用倒置荧光显微镜照相；图6是不同转染复合物（DP; DSe; DPS; 和DSeS）分别介导绿色荧光蛋白质粒对HepG2细胞转染效率图。分别显示了作为基因转染金标准的DP，单一核氧化还原刺激响应的DSe和单一壳刺激响应的DPS，以及双重刺激响应的DSeS四种基因载体介导绿色荧光蛋白质粒对HepG2细胞转染后的荧光照片。

从照片中绿色荧光蛋白表达的情况可见，具有双重梯度氧化还原刺激响应性能的DSeS基因载体系统，很大程度的提高了绿色荧光蛋白质粒在HepG2细胞中的表达。这是由于具有双硫键的HA-SS-COOH作为遮蔽体系，在粒子进入细胞后，还原响应的双硫键断裂，帮助遮蔽体系的剥离，使得暴露出OEI-SeSe_x的正电荷，发挥其质子泵效应，帮助粒子从内涵体中逃逸出来，进一步双硒键的断裂可以促进DNA的释放，进而明显的提高了基因转染效率。

实施例8：具有梯度氧化还原刺激响应的OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS-COOH三元复合物基因载体介导荧光素酶质粒对HepG2细胞的体外转染效率的测定

在6孔板上以4X10⁵细胞/孔接种HepG2细胞，在37℃，5%的CO₂的细胞培养箱中培养24小时左右，转染时，吸去前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入表2中所列的含有荧光素酶DNA的转染复合物颗粒以及含有10%（质量/体积百分数）的胎牛血清的新鲜DMEM培养基至终体积2 mL，4小时后，更换新鲜的含10%胎牛血清的培养基，继续培养20个小时。

体外转染效率的测定：取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤细胞2次，然后加入含1%的Triton X-100的裂解液，使细胞裂解后用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒检测相对荧光强度，相应的总蛋白量用Thermo公司的BCA试剂盒检测，最后转染结果表示为RLU/mg protein，结果如表2所示。

本发明利用具有梯度氧化还原刺激响应性能的OEI-SeSe_x/DNA/HA-SS-COOH（DSeS）三元复合物基因载体，显著提高基因载体的性能，其对HepG2细胞的转染效率分别比作为金标准的DP，单一核刺激响应的DSe和单一壳刺激响应的DPS，相应提高了197.2倍，95.4倍及43倍。

表2具有梯度氧化还原刺激响应性能的基因载体系统介导荧光素酶质粒对HepG2的体外转染效率表

复合物编号	阳离子：DNA：HA-SS-COOH的质量比	转染效率 RLU/mg protein
			DP （*）	1.2：1：0	2.096E+7
DSe （*）	10：1：0	4.335E+7
			DPS （*）	1.2：1：2	9.622E+7
DSeS	0.1：1：2	3.325E+6
			DSeS	50：1：2	5.748E+5
DSeS	10：1：0.1	1.165E+9
			DSeS （*）	10：1：2	4.137E+9
DSeS	10：1：50	9.918E+4

实施例9：复合载体系统的制备

将上述OEI-SS溶液溶液和质粒DNA溶液混合，同时加入磁性纳米粒子，混合后的溶液在室温下孵育20分钟后，得到OEI-SS/DNA/MNP三元复合物。再加入HA-SS-COOH溶液（该步骤中还可以再次加入磁性纳米粒子），所得混合溶液在室温下孵育20分钟后，得到联合磁性纳米粒子的复合载体。所述复合载体能够相应外加磁场。

将上述OEI-SS溶液溶液和质粒DNA溶液混合，同时加入药物，混合后的溶液在室温下孵育20分钟后，得到OEI-SS/DNA/药物三元复合物，再加入HA-SS-COOH溶液（该步骤中还可以再次加入药物），所得混合溶液在室温下孵育20分钟后，得到联合药物的复合载体。

将上述OEI-SS溶液溶液和质粒DNA溶液混合，混合后的溶液在室温下孵育20分钟后，得到OEI-SS/DNA二元复合物，再加入HA-SS-COOH溶液，同时加入药物，所得混合溶液在室温下孵育20分钟后，得到另一种联合药物的复合载体。

还可以在所述基因载体的制备过程中既加入磁性纳米颗粒又加入药物，得到同时联合MNP和药物的复合载体。

Claims

1.基因载体系统，由遮蔽体系、阳离子材料和质粒DNA组成，其特征在于：所述遮蔽体系和阳离子材料中都含有氧化还原敏感键，所述阳离子材料和质粒DNA复合形成二元复合物颗粒，所述遮蔽体系通过静电作用遮蔽到所述二元复合物表面，形成三元复合物颗粒。

2.如权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于：所述氧化还原敏感键为双硫键或双硒键中的至少一种。

3.如权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于：所述遮蔽体系中含有双硫键，所述阳离子材料中含有双硒键。

4.如权利要求1-3中任意一个所述的基因载体系统，其特征在于：所述阳离子材料为双硫键或双硒键交联的聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、精胺、氨基酸多肽、肽类树状分子或含肽类树状分子的阳离子脂质材料中的至少一种。

5.如权利要求1-3中任意一个所述的基因载体系统，其特征在于：所述遮蔽体系为对糖胺聚糖上的至少一个葡萄糖醛酸单元上的羧基进行修饰，得到的具有还原敏感的双硫键或双硒键并且末端仍是羧基的糖胺聚糖衍生物。

6.如权利要求1-3中任意一个所述的基因载体系统，其特征在于：所述的质粒DNA，是含报告基因或细胞因子基因或抑癌基因的真核重组表达质粒。

7.如权利要求1-3中任意一个所述的基因载体系统，其特征在于：所述遮蔽体系与质粒DNA的质量比例为0. 1：1～50：1，阳离子材料与质粒DNA的质量比例为0. 1：1～50：1。

8.如权利要求4所述的基因载体系统，其特征在于：所述糖胺聚糖的分子量为 5～2000kDa。

9.如权利要求1-8中任意一个中所述的基因载体系统的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)将质粒DNA溶于无菌HBG缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 毫摩尔， 5% 葡萄糖）中，配制成浓度为0.1 mg/mL的DNA溶液；将阳离子材料溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.1～10 mg/mL的溶液A；将遮蔽体系溶于HBG缓冲液中，配制成浓度为0.01～1 mg/mL的溶液B;

2）将上述步骤中得到的溶液A与DNA溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到二元复合物，再加入溶液B，在室温下孵育20分钟后，得到三元复合物。

10.如权利要求1-8中任意一个所述的基因载体系统的应用，其特征在于，将所述基因载体与超顺磁性纳米粒子和/或脂溶性的药物联合制成复合载体或药物，用于体外基因转染、肿瘤、哮喘或心血管疾病的基因治疗、基因与化学药物疗联合治疗、疾病诊疗一体化。