CN105878212A - 一种双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊及制备方法 - Google Patents

一种双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，包括以下步骤：（1）巯基化透明质酸的制备；（2）乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖的制备；（3）巯基化透明质酸上接枝二代异亚丙基保护吡喃半乳糖；（4）载药纳米胶囊的制备。该方法制备出的载药纳米胶囊与肿瘤细胞亲和性强，对高浓度的谷胱甘肽及酸性环境的双重高敏感响应性，实现在肿瘤细胞内高选择性的快速释药，抗肿瘤效率高，安全性好。

Description

一种双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊及制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊及其制备方法。
背景技术
肿瘤已经成为威胁人类健康的重要疾病之一，近年来纳米药物制剂在肿瘤治疗方面显现出巨大的应用潜力。纳米技术在解决传统抗肿瘤药物水溶性差、选择性低、毒副作用大等方面取得了很大进展，例如运载抗肿瘤药物的聚合物纳米粒子、胶束、脂质体、组装的树状大分子粒子等，这些纳米载体由特定的化学结构组成，可以对药物进行很好的运载和保护；同时纳米载体的各种功能化修饰，可以实现粒子在特定环境条件下的选择性降解，可以有效解决载药纳米粒子在体内的系统屏障及细胞摄取屏障等问题。这种环境刺激响应的纳米载体，在肿瘤病变部位特殊的生理环境下选择性“智能化”释放药物，提高了化疗药物的抗肿瘤效果，同时明显减少治疗过程中对正常组织的毒副作用。
透明质酸（HA）是一种天然的高分子聚合物，大量存在于细胞外基质（ECM）及细胞基质（ICM），具有重要的生理功能，同时可以被特殊的细胞受体识别，从而调控相关功能。由于透明质酸良好的理化性质和各种生物学功能，使HA 和 HA 衍生物广泛用于药物输送，治疗关节炎、眼科手术，组织工程支架等领域。在纳米载药领域，由于透明质酸良好的生物相容性以及肿瘤部位过表达的透明质酸受体（CD44，RHAMM等），使透明质酸的应用更加成为研究的热点。由于透明质酸含有大量的功能基团（羧基，羰基，乙酰胺基），通常将抗肿瘤药物（阿霉素，紫杉醇等）通过化学键或者交联连接于透明质酸上来实现抗肿瘤作用。但一种操作过程简单且有效的物理包裹，无疑为一些不能进行化学连接的药物提供了很好的运载方法，同时也更利于载药体系向临床的推广应用。
随着纳米载体的不断发展，有研究表明尺度合适的纳米粒子在体循环过程中可以有效避免网状内皮系统（MPS）的清除作用，实现稳定的长循环，最终通过肿瘤部位的增强的渗透和滞留作用（EPR）有效富集于肿瘤部位。为了控制透明质酸纳米粒子的尺度，研究者提出表面活性剂辅助的逆向油包水乳化和无机盐诱导矿化等方法，但无论是引入有机的表面活性剂还是无机盐，都需要较多的步骤，这从很大程度上限制了透明质酸纳米粒子的发展和临床应用，所以寻求一种操作简单同时可调节透明质酸纳米粒子，进而提高以透明质酸为骨架的载药纳米载体释放药物速度、抗肿瘤效果和安全性是非要有必要的。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊及其制备方法，可有效解决抗肿瘤过程中操作复杂，载药纳米粒子释放药物速度慢，抗肿瘤效果和安全性差的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）巯基化透明质酸的制备
将透明质酸溶于浓度为0.01mol/L，pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，然后加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，活化2-3h，然后再加入胱胺二盐酸盐，搅拌反应12-16h，用去离子水透析72h，最后加入二硫苏糖醇，透析，冷冻干燥后得巯基化透明质酸；其中透明质酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺二盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比分别为1-2:3-4:3-4:3:5-6；
（2）乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖的制备
将3-氯-2-氯甲基丙烯和NaH溶于四氢呋喃中，然后加入异亚丙基保护的吡喃半乳糖和催化剂，65-70℃加热回流22-24h，加水终止反应，再用乙酸乙酯萃取产物，得乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖；其中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、异亚丙基保护的吡喃半乳糖和催化剂的摩尔比为3:3-4:1-2: 0.005-0.015；
（3）巯基化透明质酸上接枝二代异亚丙基保护吡喃半乳糖
将巯基化透明质酸和乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖溶于二甲基甲酰胺与磷酸盐缓冲液以体积比为1:3混合的混合液中，然后再加入2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，在波长为365nm，功率为6W的紫外光下照射2-3h后透析，冷冻干燥；其中，巯基化透明质酸、乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为1-2:0.5-1:0.05-0.1；
（4）载药纳米胶囊的制备
将溶解有抗肿瘤药物的氯仿与溶解有步骤（3）所得物的PBS溶液按体积比为1:20混合，在超声探头作用下，利用超声乳化法制备纳米胶囊，将得到的白色乳液置于黑暗环境下挥发除去溶剂中的氯仿，再利用去离子水透析，除去未被包裹的抗肿瘤药物后，冷冻干燥，形成载药纳米胶囊；其中抗肿瘤药物和步骤（3）所得物的质量比为1-2.5:8-10。
进一步地，步骤（1）中透明质酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺二盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比分别为1:3:3:3:5。
进一步地，步骤（1）中搅拌反应时间为12h。
进一步地，步骤（2）中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、异亚丙基保护的吡喃半乳糖和催化剂的摩尔比为3:3.13:1:0.0075。
进一步地，步骤（2）中所述催化剂为KI、18-冠醚-6和15-冠醚-5按质量比为1:1:1混合所得的混合物。
进一步地，步骤（2）中加热回流反应24h。
进一步地，步骤（3）中巯基化透明质酸、乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为1:0.5:0.05。
进一步地，步骤（4）中抗肿瘤药物和步骤（3）所得物的质量比为1:8。
进一步地，步骤（4）中抗肿瘤药物为阿霉素和/或紫杉醇。
由上述方法制备出的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊。
本发明提供的一种双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊及其制备方法，具有以下有益效果：
（1）本发明利用肿瘤细胞内溶酶体（pH为4.5-6.0）与正常体液（pH为7.4）的酸度差异，同时利用肿瘤细胞内相对较高的谷胱甘肽浓度（10mmol/L），双重刺激响应使载药纳米胶囊可以对肿瘤环境更加敏感，在肿瘤细胞内实现药物突释，有效发挥药效。
（2）本发明首先将透明质酸巯基化得巯基化透明质酸，然后在巯基化透明质酸上连接二代异亚丙基保护吡喃半乳糖，所含的缩酮键在酸性条件下发生断裂，进而使纳米胶囊具有酸敏感性；其次二硫键的引入，使纳米胶囊具有氧化还原敏感性；缩酮键和二硫键在肿瘤环境刺激下断裂，使载药纳米胶囊发生膨胀和解体，实现载药纳米胶囊的溶酶体逃逸，快速释放药物。
（3）本发明以天然的聚合物透明质酸作为纳米胶囊的骨架材料，其透明质酸是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分，具有很好的生物安全性，通过特定的制备过程，制备出的双重细胞微环境敏感的载药纳米胶囊，骨架材料透明质酸（HA）可以与肿瘤部位过表达的受体结合，可增强载药纳米胶囊对肿瘤细胞的亲和性；其载药纳米胶囊粒径在EPR效应范围内，可实现被动靶向；载药纳米胶囊对高浓度的谷胱甘肽及酸性环境的双重高敏度响应性，可实现其在肿瘤细胞内高选择性的快速释药，因此制备出的载药纳米胶囊具有生物相容性好、生物可降解性、无免疫原性以及对肿瘤细胞的高亲和性等特点，其安全性高、无毒副作用。
附图说明
图1为双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备过程；
图2为制备过程中所得中间产物的1H-NMR表征图；
图3为双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的粒径分布图；
图4为双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的透射电镜图；
图5为双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的原子力显微镜图；
图6为双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊在PBS（0.01mol/L，pH7.4）中的电位图；
图7为双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊在pH5.0，GSH浓度为10 mmol/L条件下的粒径图；
图8为双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊在pH6.8，GSH浓度为2.8μmol/L条件下的粒径图；
图9为双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊在不同pH及谷胱甘肽浓度下的药物释放曲线；
图10为不同浓度的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊抑制肝肿瘤细胞存活率图；
图11为不同浓度空白纳米胶囊对肝肿瘤细胞的毒副作用图；
图12为双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊在不同时间点被细胞摄取的激光共聚焦照片。
具体实施方式
本发明以天然的聚合物透明质酸作为骨架材料，利用胱胺二盐酸盐制备巯基化透明质酸，再利用异亚丙基保护的吡喃半乳糖和3-氯-2-氯甲基丙烯制备乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖，接着利用紫外光催化的巯烯反应，在巯基化透明质酸上连接二代异亚丙基保护吡喃半乳糖，将该所得物溶解于PBS缓冲液中，再包裹上抗肿瘤药物，利用超声乳化法制备纳米胶囊，最后利用透析袋透析，除去未被包载的抗肿瘤药物，得到双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊，制备过程见图1。
实施例 1 巯基化透明质酸的制备
将透明质酸（HA）溶于浓度为0.01mol/L，pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，然后加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，活化2h，之后再逐滴加入胱胺二盐酸盐，搅拌反应12h，将所得物在去离子水中用3.5kD透析袋透析72h，除去缩合剂等小分子物质，最后加入二硫苏糖醇来打断已形成的二硫键，再次通过去离子水透析纯化，冷冻干燥后得巯基化透明质酸；其中透明质酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺二盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比分别为1:3:3:3:5；
将透明质酸和所得的巯基化透明质酸分别溶于D2O中，做400 MHz 1H-NMR扫描，结果见图2，图中a表示透明质酸的1H-NMR扫描图，b表示巯基化透明质酸的1H-NMR扫描图。
实施例 2 乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖的制备
将3-氯-2-氯甲基丙烯和NaH溶于无水的四氢呋喃中，然后加入异亚丙基保护的吡喃半乳糖，同时加入少量KI、18-冠醚-6（18-Crown-6）和15-冠醚-5（15- Crown-5）作为催化剂，65-70℃加热回流24h，加水终止反应，再用乙酸乙酯萃取产物，旋蒸除去有机溶剂后，再以乙酸乙酯：正己烷=1:3（体积比）为洗脱剂，用硅胶色谱柱进行纯化，除去有机溶剂得乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖；其中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、异亚丙基保护的吡喃半乳糖和催化剂的摩尔比为3:3.13:1:0.0075；其中催化剂为KI、18-冠醚-6和15-冠醚-5按质量比为1:1:1混合所得的混合物。
将所得的乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖溶于CDCl3，做400 MHz 1H-NMR扫描，结果见图2中c。
实施例 3 巯基化透明质酸上接枝二代异亚丙基保护吡喃半乳糖
将巯基化透明质酸和乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖溶于二甲基甲酰胺与磷酸盐缓冲液以体积比为1:3混合的混合液中，然后再加入光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DAPA），在波长为365nm，功率为6W的紫外光下照射2h，反应完成后，用去离子水透析，除去未反应的小分子物质，最后冷冻干燥得产物；其中巯基化透明质酸、乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为1:0.5:0.05。
将所得产物做1H-NMR扫描，核磁图谱如图2中d所示，用盐酸断裂产物中的缩酮键后，再做1H-NMR扫描，核磁图谱如图2中e所示。
实施例 4 双重细胞微环境敏感的载药纳米胶囊的制备
将溶解有阿霉素的氯仿与溶解有实施例3所得物的PBS溶液按体积比为1:20混合，在超声探头作用下，利用超声乳化法制备纳米胶囊，将得到的白色乳液置于黑暗环境下挥发除去溶剂中的氯仿，再利用去离子水透析，除去未被包裹的阿霉素后，冷冻干燥，得到双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊，简称载药纳米胶囊；其中阿霉素和实施例3所得物的摩尔比为1:8。
将未加阿霉素的纳米胶囊作为空白对照即空白纳米胶囊。
通过马尔文激光粒度仪测定载药纳米胶囊的粒径大小及分布，结果见图3，由图3可知载药纳米胶囊的粒径为195±53nm。
用透射电子显微镜（TEM）观察载药纳米胶囊的尺寸及形态，结果见图4，由图4可知，载药纳米胶囊呈规则的球形，且可见明显的内腔结构，由于透明质酸纳米胶囊所包裹水分的挥发，粒子的粒径明显变小（66.71±9.29nm）；同时用原子力显微镜观察载药粒子的立体结构，结果与TEM结果相符，见图5。
测定载药纳米胶囊在PBS（0.01mol/L，pH7.4）中的电位图，结果见图6，由图6可知，载药纳米胶囊的表面电荷为-0.216mV，可以有效避免由于电荷引起的网状内皮系统对其的清除作用。
实施例 5 不同 pH 值及不同谷胱甘肽浓度下载药纳米胶囊的粒径变化及分布
将载药纳米胶囊分别分散于pH 5.0，GSH浓度为10mmol/L的PBS缓冲液中和pH 6.8，GSH浓度为 2.8μmol/L的PBS缓冲液中，设定的不同时间点，通过马尔文激光粒度仪分别测定其粒径分布，结果分别见图7和图8。
如图7所示，在类肿瘤细胞内环境条件下（pH 5.0，GSH浓度为10mmol/L），载药纳米胶囊粒径随着作用时间的延长，逐渐增大至416.2±154nm，分布变宽，且在5407nm处出现一个较明显的峰，证明载药纳米胶囊在谷胱甘肽的作用下发生了膨胀；之后在8h时，粒径分布变为两个甚至多个峰，证明膨胀之后的胶囊发生了降解。
在类肿瘤微环境条件下（pH 6.8，GSH浓度为 2.8μmol/L），作用24 h后，粒径仅从195±53nm增大至348.2±104.5nm，如图8所示，这一结果验证了该载药纳米胶囊对酸及谷胱甘肽的刺激敏感性。
实施例 6 纳米胶囊对阿霉素的包载量及不同环境条件下的药物释放曲线
通过荧光色谱法检测载药纳米胶囊的载药量：称取适量实施例4中的冻干载药纳米胶囊，溶解于水与DMF（二甲基甲酰胺）按体积比为1:5的混合溶液中，分别在λ ex=480nm和λ em=589nm下，用标准曲线法测定对阿霉素的包载量，有63.9%的药物被包封在纳米胶囊中，其中胶囊的载药量范围为6%-8%。
称取适量实施例4中的冻干载药纳米胶囊，分散于PBS中，然后将该溶液分装于透析袋中，每截透析袋中分装1mL，然后分别浸没于以下缓冲液中：20 mL的1）磷酸缓冲液(0.01M，pH 7.4，不含GSH)； 2) 醋酸缓冲液 1 (0.01M，pH 6.8，GSH浓度为2.8μM)； 3) 醋酸缓冲液2 (0.01M，pH 5.0，GSH浓度为10mM)中，每个条件下设置3个平行，然后放置于37℃恒温摇床水浴中，在设计的时间点吸取透析袋外部的溶液1mL，用于后续测量时间点处药物的释放量，同时及时补充相应的新鲜缓冲液1mL，以维持透析袋外围液体体积的恒定。用标准曲线法测定相应时间点处药物的累计释放量，并绘制释放曲线，结果见图9，如图9所示，在pH 5.0，GSH浓度为10mM的条件下，载药纳米胶囊中的药物在12h内快速释放（斜率2.591），之后释药速度有所变缓（斜率0.407），在96h时，累计释药量到达75%，随着时间的延长，释药量趋于不变；而在其他两个条件下（pH 6.8， GSH浓度为2.8μM和pH 7.4，不含GSH），释药量相较于pH 5.0，GSH浓度为10mM明显变小，且释药速率明显变缓；在120h时，pH 6.8，GSH浓度为2.8μM累计释药量为30%，pH 7.4，不含GSH累计释药量为12%。这一释药结果说明该载药纳米胶囊对pH和谷胱甘肽的刺激都有较敏感的响应，也证明了该载药纳米胶囊可以选择性地在低pH和高谷胱甘肽浓度的肿瘤细胞内实现药物突释，实现良好的抗肿瘤效果。
实施例 7 细胞毒性评价
采用CCK-8法测定本发明中载药纳米胶囊对细胞的抑制作用：将一定数量的肝肿瘤细胞HepG2接种于96孔板中，培养24h后，分别加入不同浓度的阿霉素（DOX·HCl）和载药纳米胶囊（DOX/HA-NCs），继续养48h，之后每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃下避光孵育2h，用酶标仪测定450nm处96孔板各孔的吸光值，计算细胞存活率，每个实验组设置5个平行样，实验结果如图10所示，载药纳米胶囊的抗肿瘤效率随着浓度的增加而增加，对HepG2的半抑制浓度（IC50）为0.42μg/mL，同时，与盐酸阿霉素组（DOX·HCl）相比，载药纳米胶囊（DOX/HA-NCs）需要经历进入细胞后将包封的药物释放的过程，作用于细胞核的速率会相对减慢，故IC50轻微增大。
用上述同样的方法，对空白纳米胶囊的安全性进行评价，结果如图11所示，横坐标为不同浓度的HA，纵坐标为细胞存活率（Cell Viability 100%），由图11可知，细胞较高的存活率证明了该纳米胶囊材料具有良好的生物相容性和较小的毒性。
实施例 8 细胞摄取评价
利用激光共聚焦显微镜对细胞摄取该载药纳米胶囊进行评价：将该载药纳米胶囊与培养皿中对数期的肝肿瘤细胞共培养不同的时间（0.5h，2h，4h），载药纳米胶囊所包裹的阿霉素浓度为5μg/mL，然后在激光共聚焦显微镜下观察载药纳米胶囊在细胞内的分布和变化情况，结果见图12，左边一列为阿霉素通道下图片，中间为明场图片，右边为重合后的图片，图中标尺为25μm。
如图12所示，共培养0.5h，仅有少量载药纳米胶囊进入细胞，随着共孵育时间的增加；在2h时，载药纳米胶囊进入细胞的量不断增加，且有少量释放后的阿霉素进入细胞核；4h时，更多的载药纳米胶囊被摄取进入细胞，且逐渐释放阿霉素进入细胞核发挥作用，也证明了该载药纳米胶囊可以很好的被肿瘤细胞摄取，并在环境刺激下释放药物，杀死肿瘤细胞。

Claims (10)

1.一种双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）巯基化透明质酸的制备
将透明质酸溶于浓度为0.01mol/L，pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，然后加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，活化2-3h，然后再加入胱胺二盐酸盐，搅拌反应12-16h，用去离子水透析72h，最后加入二硫苏糖醇，透析，冷冻干燥后得巯基化透明质酸；其中透明质酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺二盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比分别为1-2:3-4:3-4:3:5-6；
（2）乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖的制备
将3-氯-2-氯甲基丙烯和NaH溶于四氢呋喃中，然后加入异亚丙基保护的吡喃半乳糖和催化剂，65-70℃加热回流22-24h，加水终止反应，再用乙酸乙酯萃取产物，得乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖；其中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、异亚丙基保护的吡喃半乳糖和催化剂的摩尔比为3:3-4:1-2:0.005-0.015；
（3）巯基化透明质酸上接枝二代异亚丙基保护吡喃半乳糖
将巯基化透明质酸和乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖溶于二甲基甲酰胺与磷酸盐缓冲液以体积比为1:3混合的混合液中，然后再加入2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，在波长为365nm，功率为6W的紫外光下照射2-3h后透析，冷冻干燥；其中，巯基化透明质酸、乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为1-2:0.5-1:0.05-0.1；
（4）载药纳米胶囊的制备
将溶解有抗肿瘤药物的氯仿与溶解有步骤（3）所得物的PBS溶液按体积比为1:20混合，在超声探头作用下，利用超声乳化法制备纳米胶囊，将得到的白色乳液置于黑暗环境下挥发除去溶剂中的氯仿，再利用去离子水透析，除去未被包裹的抗肿瘤药物后，冷冻干燥，形成载药纳米胶囊；其中抗肿瘤药物和步骤（3）所得物的质量比为1-2.5:8-10。
2.根据权利要求1所述的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中透明质酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺二盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比分别为1:3:3:3:5。
3.根据权利要求1所述的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中搅拌反应时间为12h。
4.根据权利要求1所述的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（2）中3-氯-2-氯甲基丙烯、NaH、异亚丙基保护的吡喃半乳糖和催化剂的摩尔比为3:3.13:1:0.0075。
5.根据权利要求1或4所述的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述催化剂为KI、18-冠醚-6和15-冠醚-5按质量比为1:1:1混合所得的混合物。
6.根据权利要求1所述的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（2）中加热回流反应24h。
7.根据权利要求1所述的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（3）中巯基化透明质酸、乙烯基功能化的二代异亚丙基保护吡喃半乳糖和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为1:0.5:0.05。
8.根据权利要求1所述的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（4）中抗肿瘤药物和步骤（3）所得物的质量比为1:8。
9.根据权利要求1所述的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（4）中抗肿瘤药物为阿霉素和/或紫杉醇。
10.如权利要求1-9任一项所述的制备方法制备出的双重细胞微环境敏感的抗肿瘤载药纳米胶囊。
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