CN102626518A - 一种包载难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包载有难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束制剂的制备和应用。通过透析法或溶剂挥发法制备难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束，该混合胶束临界胶束浓度低，能明显延长稳定时间，载药量高，并具有纳米胶束的长循环作用和抑制P-糖蛋白及细胞色素P450酶的代谢的双重作用，提高了口服给药的生物利用度。该混合胶束制备方法简单，工艺成熟，产率高，可制备成片剂，胶囊剂，丸剂、糖浆剂等制剂用于口服给药。

Description

一种包载难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束的制备和应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种针对难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束的制备方法及其在口服给药方面的应用。

背景技术

口服给药是众多给药途径中最普遍的一种给药方式，因为它服用和携带方便，容易为一般患者所接受，特别是对那些需要长期或者每天用药的患者来说，药物口服的顺应性大大优于其他给药途径。此外，为了减少毒副作用，细胞毒性剂类药物的口服比注射给药更适合长期用药，可以达到更好的疾病治疗效果。

能够口服给药的药物，其活性成分应该首先溶解在人体胃肠道的液体中，才有可能被人体吸收。然而，低水溶性却是很多活性治疗物质所固有的特质(如抗癌活性化合物中，很多为多环化合物，例如喜树碱、紫杉醇或他莫昔芬等)，近半数经过高通量筛选出的、具有良好治疗潜力的候选化合物，因为水溶性不良，而被终止了进一步的研发。聚合物胶束以其性质稳定、生物相容性好、增溶能力强等优点，受到越来越多的关注。多糖是所有生命有机体的重要组成部分，在控制细胞分裂，诱导细胞分化以及维持生命体正常代谢方面有着重要的意义。此外，由于多糖具有优良的生物相容性和生物降解性，主链结构易于化学修饰(如酯化、接枝与交联等)而改善其理化性质等优点，被越来越多的研究者修饰成两亲性多糖，用于制备成聚合物胶束。CN101791411A和CN101745119A公开了这些制备两亲性多糖偶联物的技术。将聚合物胶束开发为口服给药系统有助于减少药物对胃肠道的刺激性，增加吸收部位的药物浓度，提高药物在胃肠道中的稳定性，又由于胃肠道拥有巨大的吸收面积，溶解后的疏水性药物很容易被吸收，再加上胶束粒径较小，可以通过EPR效应和内吞作用进入细胞，从而提高了载药聚合物胶束的生物利用度。

但是由于胃肠道中复杂的环境以及一些膜蛋白转运系统的作用，如P-糖蛋白外排系统和细胞色素P450酶的代谢作用，使得聚合物胶束的口服生物利用度的提高仍然受到的很大的限制。泊洛沙姆是由亲水段聚氧乙烯(PEO)和疏水段聚氧丙烯(PPO)按照PEO-PPO-PEO的结构形成的，具有较好的生物相容性，较低的毒性。泊洛沙姆聚合物胶束既可以增加难溶药物的溶解性又能够减少P-糖蛋白介导的药物外排作用，并且能够抑制细胞色素P450酶的代谢作用，从而能够提高药物的口服生物利用度。然而，泊洛沙姆胶束的包封率和载药量低，临界胶束浓度(CMC)高，使得其胶束的稳定性降低，从而使其的应用受到限制。

针对以上问题，本专利制备了一种包载难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束，并将其应用在口服给药系统中。这种混合胶束兼具了两亲性多糖偶联物胶束和泊洛沙姆胶束的优点，弥补了这两种胶束单独应用时的缺陷，为聚合物胶束用于口服给药系统提供了新的思路。该混合胶束不仅提高了难溶性药物的溶解度，在疏水作用、立体络合作用、静电作用、氢键作用和化学交联作用下，具有良好的动力学稳定性。两亲性多糖偶联物的引入降低了泊洛沙姆的CMC，提高了混合胶束的热力学稳定性，并且大大提高了胶束的载药能力；同时，该混合物兼具两亲性多糖偶联物介导的内吞作用和泊洛沙姆介导的抑制P-糖蛋白外排系统的作用和细胞色素P450酶的代谢作用，从而能够明显提高药物的口服生物利用度，延长药物在体内的循环作用时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种包载有难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束。该混合胶束通过化学键之间的相互作用或者物理包裹作用包载难溶性药物，改善了药物的溶解性，载药量高，稳定性好，毒副作用降低，口服生物利用度提高。

本发明的另一个目的是提供上述包载难溶性药物的泊洛沙姆-两亲性多糖混合胶束的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述包载难溶性药物的泊洛沙姆-两亲性多糖混合胶束在口服给药中的应用。

本发明中，两亲性多糖和泊洛沙姆对难溶性药物均有增溶作用。两亲性多糖应用于混合胶束克服了泊洛沙姆临界胶束浓度高，载药量低的问题；混合胶束中的泊洛沙姆又能够抑制P-糖蛋白的外排作用和细胞色素P450酶的代谢作用，提高了难溶性药物的口服生物利用度。

所述的包载难溶性药物的泊洛沙姆-两亲性多糖混合胶束的制备方法，其特征包括如下步骤：两亲性多糖偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，泊洛沙姆与水按重量比为1～50∶1000的比例溶解，得到泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束；将治疗有效量的难溶或微溶与水的药学活性或药理活性分子用药学上可接受溶剂溶解，与上述混合胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。

所述的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束，是指泊洛沙姆与两亲性多糖按照重量比为0.05～10∶1的比例混合。

所述的泊洛沙姆，其特征为亲水链聚氧乙烯占60％～80％的泊洛沙姆。

所述的两亲性多糖偶联物，选自下述亲水端和疏水端的组合，所述亲水端选自未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素、透明质酸、软骨素、多硫酸化软骨素、海藻酸和原本不具有羧基但引入羧基的多糖壳聚糖、羧甲基壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、葡聚糖、真菌多糖；所述的疏水基团为选自全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、甲氨蝶呤、氨基蝶呤、齐墩果酸、藤黄酸、甘草次酸、熊果酸、黄芩苷、2-羟基苯甲酸、2-(乙酰氧基)苯甲酸、水杨酸、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、酮洛芬、芬布芬、甲芬那酸、吡洛芬、氟比洛芬、苯丁酸氮芥、美法仑、胆烷酸、长链烷基。

所述的难溶性药物，是指每1ml水中溶解度小于1mg或1μL且属于下列类别的物质：紫杉醇/烷类、喜树碱类、长春碱类、阿霉素类、环孢菌素类、黄酮类、二氢吡啶类、抗生素类、维A酸类、他丁类、依托泊苷、挥发油类物质或上述物质的衍生物。

所述的包载难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束的应用，其特征在于可应用于口服给药，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂。

本发明所制备的混合胶束在冻干时可加入冻干保护剂，冻干保护剂可选自右旋糖酐、甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖中的一种或几种。冻干保护剂的量按照胶束溶液体积计算，每份胶束溶液优选加入0.01-0.1％(w/v)的冻干保护剂，过滤后冷冻干燥。

本发明的有益效果：

一、本发明将两亲性多糖偶联物与泊洛沙姆相结合制备成混合胶束，两亲性多糖降低了泊洛沙姆的临界胶束浓度，提高了载药量和胶束的稳定性，具有良好的增溶作用，并且能够延长体内循环、减少网状内皮细胞的吞噬，增加药物的靶向性，提高安全性。

二、本发明提供的包载难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束，泊洛沙姆能够抑制P-糖蛋白的外排作用和细胞色素P450酶的代谢作用，从而可以在胶束作用的基础上进一步提高难溶性药物的口服生物利用度。

三、本发明制备的混合胶束不含有任何有机溶剂，安全性高，粒径在10～1000nm范围内可控，溶解性好，稳定性好，制备方法简单，工艺成熟，产率高，可制备成片剂，胶囊剂，丸剂、糖浆剂等制剂用于口服给药。

附图说明

附图1：泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束的粒径图谱

附图2：包载紫杉醇的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束的肠吸收实验结果

具体实施方式

下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。

实施例1：泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物的CMC值测定

1、临界胶束浓度(CMC)：采用荧光探针法测定CMC。以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极性变化极为敏感。当泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物的浓度低于CMC时，溶液中不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；当其浓度高于CMC时，胶束形成，芘向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光谱中可以观察到一系列变化，如荧光强度将增强，放射光谱中振动精细结构发生变化，激光光谱中(0，0)波段红移。因此，通过以芘的发射光谱中的I₁/I₃比(在固定的激发波长下扫描，I₁，I₃分别代表发射光谱中第一和第三强峰的荧光强度比)或激发光谱中I₃₃₈/I₃₃₃比，(激发光谱中波长分别为338nm和333nm的荧光强度比)对泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物的浓度作图即得其表观CMC，结果见表1、表2、表3。

表1泊洛沙姆F127(A)/两亲性多糖偶联物(B)的CMC(mg/ml)

表2泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物(0.25∶1，w∶w)的CMC(mg/ml)

表3泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物(0.30∶1，w∶w)的CMC(mg/ml)

实施例2：包载紫杉醇的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束的制备和表征

1、制备工艺：

(1)透析法

18mg低分子量肝素-全反式维甲酸溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。低分子量肝素-全反式维甲酸溶液与不同重量比的泊洛沙姆P188混合。紫杉醇10mg溶解在乙醇中。在混合溶液中，加入紫杉醇/乙醇溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载紫杉醇的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束。

(2)乳化溶剂蒸发法

18mg低分子量肝素-全反式维甲酸溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。低分子量肝素-全反式维甲酸溶液与不同重量比的泊洛沙姆混合。紫杉醇10mg溶解在二氯甲烷中。在混合溶液中，加入紫杉醇/二氯甲烷溶液，室温搅拌15min，冰浴探头超声30min，室温敞口搅拌过夜，使二氯甲烷挥发，离心3000rpm，15min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载紫杉醇的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束。

2、包载紫杉醇的低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束中紫杉醇的含量测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为227nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表3。

3、包载紫杉醇的低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束的粒径测定

将1制备得到紫杉醇的低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束，取1ml用水稀释到3ml，用粒径测定仪(Malvern Instruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表4。

表4包载紫杉醇的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束的表征

实施例3：包载伊曲康唑的泊洛沙姆/硫酸软骨素-甘草次酸混合胶束的制备

20mg硫酸软骨素-甘草次酸溶于4ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。硫酸软骨素-甘草次酸溶液与250μL泊洛沙姆混合。伊曲康唑10mg溶解在乙醇中。在混合溶液中，加入伊曲康唑/乙醇溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载伊曲康唑的泊洛沙姆/硫酸软骨素-甘草次酸混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中伊曲康唑的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例4：包载阿霉素的泊洛沙姆/葡聚糖-甲氨蝶呤混合胶束的制备

22mg葡聚糖-甲氨蝶呤溶于5ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。葡聚糖-甲氨蝶呤溶液与275μL泊洛沙姆混合。阿霉素9mg溶解在二甲基亚砜(N，N-二甲基甲酰胺)。在混合溶液中，加入阿霉素/二甲基亚砜(N，N-二甲基甲酰胺)溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载阿霉素泊洛沙姆/葡聚糖-甲氨蝶呤混合胶束，用荧光法法测定混合胶束中阿霉素的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例5：包载羟基喜树碱的泊洛沙姆/真菌多糖-齐墩果酸混合胶束的制备

20mg真菌多糖--齐墩果酸溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。真菌多糖-齐墩果酸溶液与250μL泊洛沙姆混合。羟基喜树碱10mg溶解在N，N-二甲基甲酰胺(二甲基亚砜)中。在混合溶液中，加入羟基喜树碱/N，N-二甲基甲酰胺(二甲基亚砜)，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载羟基喜树碱的泊洛沙姆/真菌多糖-齐墩果酸混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中羟基喜树碱的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例6：包载尼莫地平的泊洛沙姆/羧甲基壳聚糖-黄芩苷混合胶束的制备

24mg羧甲基壳聚糖-黄芩苷溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。羧甲基壳聚糖-黄芩苷溶液与300μL泊洛沙姆混合。尼莫地平10mg溶解在乙醇中。在混合溶液中，加入尼莫地平/乙醇溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载尼莫地平的泊洛沙姆/羧甲基壳聚糖-黄芩苷混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中尼莫地平的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例7：包载环孢素的泊洛沙姆/透明质酸-藤黄酸混合胶束的制备

18mg透明质酸-藤黄酸溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。透明质酸-藤黄酸溶液与225μL泊洛沙姆混合。环孢素10mg溶解在乙醇中。在混合溶液中，加入环孢素/乙醇溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载环孢素的泊洛沙姆/透明质酸-藤黄酸混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中环孢素的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例8：包载葛根黄酮的泊洛沙姆/海藻酸-熊果酸混合胶束的制备

16mg海藻酸-熊果酸溶于4ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。海藻酸-熊果酸溶液与200μL泊洛沙姆混合。葛根黄酮10mg溶解在甲醇中。在混合溶液中，加入葛根黄酮/甲醇溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载葛根黄酮的泊洛沙姆/海藻酸-熊果酸混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中葛根黄酮的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例9：包载长春新碱的泊洛沙姆/N-辛基-N-精氨酸壳聚糖混合胶束的制备

22mg N-辛基-N-精氨酸壳聚糖溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。N-辛基-N-精氨酸溶液与275μL泊洛沙姆混合。长春新碱10mg溶解在乙醇中。在混合溶液中，加入长春新碱/乙醇溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载长春新碱的泊洛沙姆/N-辛基-N-精氨酸壳聚糖混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中长春新碱的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例10：包载硝苯地平的泊洛沙姆/壳聚糖-胆烷酸混合胶束的制备

21mg壳聚糖-胆烷酸溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。壳聚糖-胆烷酸溶液与325μL泊洛沙姆混合。硝苯地平10mg溶解在三氯甲烷中。在混合溶液中，加入硝苯地平/三氯甲烷溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载硝苯地平的泊洛沙姆/壳聚糖-胆烷酸混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中硝苯地平的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例11：包载洛伐他丁的泊洛沙姆/透明质酸-苯丁酸氮芥混合胶束的制备

24mg洛伐他丁溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。透明质酸-苯丁酸氮芥溶液与300μL泊洛沙姆混合。洛伐他丁10mg溶解在三氯甲烷中。在混合溶液中，加入洛伐他丁/三氯甲烷溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载洛伐他丁的泊洛沙姆/透明质酸-苯丁酸氮芥混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中洛伐他丁的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例12：包载丝裂霉素的泊洛沙姆/十六烷基壳聚糖混合胶束的制备

18mg丝裂霉素溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。十六烷基壳聚糖溶液与225μL泊洛沙姆混合。丝裂霉素10mg溶解在二甲基乙酰胺中。在混合溶液中，加入丝裂霉素/二甲基乙酰胺溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载丝裂霉素的泊洛沙姆/十六烷基壳聚糖混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中丝裂霉素的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

实施例13：包载依托泊苷的泊洛沙姆/肝素-布洛芬混合胶束的制备

20mg依托泊苷溶于3ml蒸馏水，20mg泊洛沙姆溶于1ml的蒸馏水，分别搅拌30min。肝素-布洛芬溶液与250μL泊洛沙姆混合。依托泊苷10mg溶解在乙腈-醋酸盐中。在混合溶液中，加入依托泊苷/乙腈-醋酸盐溶液，室温搅拌15min后，冰浴探头超声30min，蒸馏水透析1d(MWCO＝3500)，透析后产物离心3000rpm，10min，上清液用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥即得包载依托泊苷的泊洛沙姆/肝素-布洛芬混合胶束，用HPLC法测定混合胶束中依托泊苷的含量，按公式(1)计算载药量，结果见表5。

表5载难溶性药物的泊洛沙姆/多糖偶联物混合胶束的制备及载药量

实施例14：MTT法测定泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物载药纳米胶束的抗肿瘤活性

1、包载紫杉醇的泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物载药纳米胶束的抗肿瘤活性

将处于对数生长期的MCF-7细胞用0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，分别以1×10⁵/ml细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100μl，设五复孔，置37℃5％CO₂孵箱内培养24h左右。

对照品紫杉醇配制成0.01、0.1、1、10、100μg/ml 5个浓度；取待测包载紫杉醇的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束(F127/LHR和P188/LHR)、包载紫杉醇的泊洛沙姆/透明质酸-藤黄酸混合胶束、包载紫杉醇的泊洛沙姆/N-辛基-N-精氨酸壳聚糖混合胶束以及相应的载紫杉醇的两亲性多糖纯胶束用完全培养液分别配制相当于对应紫杉醇浓度的5个浓度。分别加入上述细胞培养液中，孵育72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，继续培养4h，弃去全部上清，加入DMSO 100μl/孔，微型振荡器上振动5min，使结晶完全溶解，于酶联仪570nm波长处测定吸光度值(A)，A值越高活细胞数也越多。根据A可计算药物对细胞的活力抑制率。

在不同浓度下经统计分析，结果见表6，即不同的载紫杉醇的泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物混合纳米胶束的抗肿瘤活性均比紫杉醇单独存在的活性提高。

表6包载紫杉醇的泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物载药纳米胶束对MCF-7细胞的IC50(μg/mL)

2、包载阿霉素的泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物载药纳米胶束的抗肿瘤活性

将处于对数生长期的HEPG2细胞用0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，分别以1×105/ml细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100l，设五复孔，置37℃5％CO2孵箱内培养24h左右。

对照品阿霉素配制成0.01、0.1、1、10、100μg/ml 5个浓度；取待测包载阿霉素的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束、包载阿霉素的泊洛沙姆/硫酸软骨素-甘草次酸混合胶束、包载阿霉素的泊洛沙姆/葡聚糖-甲氨蝶呤混合胶束以及相应的载阿霉素的两亲性多糖纯胶束用完全培养液分别配制相当于对应阿霉素浓度的5个浓度。分别加入上述细胞培养液中，孵育72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20l，继续培养4h，弃去全部上清，加入DMSO 100l/孔，微型振荡器上振动5min，使结晶完全溶解，于酶联仪570nm波长处测定吸光度值(A)。根据A计算药物对细胞的活力抑制率。

实验结果表明，包载阿霉素的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束对HEPG2细胞的IC₅₀值为0.564μg/mL，阿霉素/低分子量肝素-全反式维甲酸纯胶束对HEPG2细胞的IC50值为0.741μg/mL，阿霉素单独存在时对HEPG2细胞的IC50值为2.336μg/mL。这表明不同的载阿霉素的泊洛沙姆/两亲性多糖偶联物混合纳米胶束的抗肿瘤活性均比阿霉素单独存在以及载阿霉素的两亲性多糖纯胶束的活性提高。同样，在不同浓度下统计分析，包载阿霉素的泊洛沙姆/透明质酸-藤黄酸混合胶束、包载阿霉素的泊洛沙姆/N-辛基-N-精氨酸壳聚糖混合胶束也都比相应的阿霉素/两亲性多糖纯胶束和阿霉素单独存在时的细胞毒性提高。

实施例15：药代动力学评价

20只SD大鼠随机分为4组(n＝5)。4组大鼠均口服给药：第一组接受Taxol(单剂量口服20mg/Kg紫杉醇)；其余组的大鼠接受不同剂型，相同剂量的紫杉醇：(1)低分子量肝素-全反式维甲酸纳米胶束；(2)泊洛沙姆F127/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束；(3)泊洛沙姆P188/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束。给药前，将所有的口服制剂用水稀释。口服给药30min，1，2，4，6，8，12，24和36h，眼眶取血，收集样品(～0.5ml)置于含有肝素的试管中。然后离心，上清液血浆在-20℃保存。

按如下方法提取血浆中的紫杉醇：多西紫杉醇(内标)溶于甲醇，配置成100μg/ml的多西紫杉醇/甲醇溶液。取15μl上述溶液添加至10ml的离心管中，蒸发干燥；加入150μl的血浆样品，涡旋混合，加入4ml甲基叔丁基醚。大力涡旋5min，取3ml的有机层转移至玻璃试管中，蒸发干燥。剩余物涡旋溶解于100μl甲醇，取20μl上述溶液用于HPLC分析。

实验结果见表7，载有紫杉醇的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸混合胶束的药物动力学参数，与紫杉醇相比均有所提高。这可能是因为在胃肠道稀释以后，混合胶束能够保持稳定，并且由于泊洛沙姆能够抑制P-糖蛋白的药物外排作用，混合胶束中紫杉醇的清除量减少，由于泊洛沙姆抑制细胞色素P450，这可能也与减少紫杉醇在肠道和肝脏的代谢消除有关。

表7包载紫杉醇的泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸(LHR)混合胶束的药物动力学参数

参照上述实验方法对不同的载有难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束进行药代动力学评价，结果见表8。实验结果表明，混合胶束的AUC值均比单纯的胶束的AUC值提高，增加了难溶性药物的生物利用度。

表8泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束与两亲性多糖纯胶束的药动学参数AUC(μg.h/mL)

实施例16：肠吸收实验

实验前将大鼠禁食过夜，自由饮水，用20％的乌拉坦腹腔注射麻醉(1.2g/kg)，固定。分离空肠和十二指肠8-10cm，在上端切口处插管(此管连接恒流泵)，结扎，用预热至37℃的生理盐水将肠内容物冲洗干净，然后在出液口插管，结扎。灌注KR液，0.2ml/min，平衡15min。将伤口用浸有生理盐水的纱布覆盖，于红外灯下将大鼠保温。用药液进行灌注，0.2ml/min，平衡30min后，收集出液口药液。每隔15min收集一次，共收集6～7个时间点。

实验结果见附图2，与紫杉醇/低分子量肝素-全反式维甲酸相比，紫杉醇/泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸的有效渗透量明显增加，与泰素相比，增加了5-6倍。同时，在P-糖蛋白抑制剂维拉帕米的存在下，泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸的紫杉醇的吸收量没用明显增加，泊洛沙姆/低分子量肝素-全反式维甲酸的有效透过率的增加有可能是由于泊洛沙姆是P-糖蛋白抑制剂的原因。

同样，对不同的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束进行肠吸收实验，发现混合胶束的Peff比纯胶束的值高，结果见表9，说明混合胶束能够促进药物的吸收。

表9泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束与两亲性多糖纯胶束的肠吸收参数P_eff(×10^-4cm/s)

Claims (7)

1.一种包载难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束的制备和应用，其特征在于泊洛沙姆和两亲性多糖偶联物作为载体形成混合胶束，将难溶性药物包裹在疏水性内核内。

2.根据权利要求1所述的包载难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束的制备方法，其特征包括如下步骤：两亲性多糖偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，泊洛沙姆与水按重量比为1～50∶1000的比例溶解，得到泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束；将治疗有效量的难溶或微溶与水的药学活性或药理活性分子用药学上可接受溶剂溶解，与上述混合胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。

3.根据权利要求1所述的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束，泊洛沙姆与两亲性多糖按照重量比为0.05～10∶1的比例混合。

4.根据权利要求1所述的泊洛沙姆，其特征为亲水链聚氧乙烯占60％～80％的泊洛沙姆。

5.根据权利要求1所述的两亲性多糖偶联物，选自下述亲水端和疏水端的组合，所述亲水端选自未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素、透明质酸、软骨素、多硫酸化软骨素、海藻酸和原本不具有羧基但引入羧基的多糖壳聚糖、羧甲基壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、葡聚糖、真菌多糖；所述的疏水端选自全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、甲氨蝶呤、氨基蝶呤、齐墩果酸、藤黄酸、甘草次酸、熊果酸、黄芩苷、2-羟基苯甲酸、2-(乙酰氧基)苯甲酸、水杨酸、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、酮洛芬、芬布芬、甲芬那酸、吡洛芬、氟比洛芬、苯丁酸氮芥、美法仑、胆烷酸、长链烷基。

6.根据权利要求1所述的难溶性药物，是指每1ml水中溶解度小于1mg或1μl且属于下列类别的物质：紫杉醇/烷类、喜树碱类、长春碱类、阿霉素类、环孢菌素类、黄酮类、二氢吡啶类、抗生素类、维A酸类、他丁类、依托泊苷、挥发油类物质或上述物质的衍生物。

7.根据权利要求1所述的包载难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束的应用，其特征在于可应用于口服给药，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂。 

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