CN103191411A - 环孢素a和两亲性透明质酸衍生物的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了一种环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物及其制备方法。该组合物是环孢素A和两亲性透明质酸衍生物。该组合物具有载药量高、稳定性好、生物相容性好的特点，并可克服环孢素眼用制剂的生物利用度较低、毒副作用严重等不足。本发明制备方法简单、使用方便。

Description

环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物及其制备方法。

背景技术

环孢素即环孢菌素(Cyclosporine)，临床常用的环孢素A(CyclosporinA，CsA)是由11个氨基酸构成的环状多肽化合物，为第三代免疫抑制剂，是目前临床上应用于抗器官移植排斥反应最为有效的药物。然而全身应用环孢素制剂生物利用度低且易导致全身免疫力降低，还可以引起严重毒副作用，如高血压、肝肾毒性、中枢神经毒性、淋巴瘤等，故而采用局部应用方法直接针对病灶作用，既减少药物用量又降低毒副作用。

眼部应用环孢素A现已成为治疗干眼症、结膜炎、降低角膜移植术后免疫排斥反应和自身免疫性眼病的重要方法，目前临床最常使用的是环孢菌素A滴眼液，其溶剂是蓖麻油或豆油。但由于CsA水溶性差、分子量大，同时油剂对眼部具有刺激性，患者顺应性及药物生物利用度不高。从另一方面来看，溶液型滴眼剂同样由于眼部保护机制药物滞留时间短，用药后药物脉冲式进入易形成药物浓度峰谷现象，眼角膜特殊致密结构限制药物透过，以及药液经鼻泪管引流吸收易引起全身不良反应等原因使得滴眼液眼部生物利用度低，易引起眼部及全身不良反应。目前具有高度亲水性及良好组织相容性的纳米凝胶(in situ nanogel)，由于制备简单、使用方便、可热压灭菌，且最重要的是与眼部亲和力强、可以增加眼部滞留时间且减少药物溢出损失故而提高生物利用度，减少不良反应的发生进而成为眼用制剂研究新方向。CN101244256A、CN101181227A和CN101085341A陆续公开了微/亚微乳原位凝胶、生物粘附性固体脂质纳米粒原位凝胶和眼植入凝胶的组方。

聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)是目前研究较多的温敏水凝胶，在其最低临界溶解温度LCST(约32～34℃)附近能发生可逆的体积相变。PNIPAAm分子内同时具有亲水性的酰胺基和疏水性的异丙基，它们与水存在分子内或分子间的相互作用。PNIPAAm的羰基及亚胺基与周围的水分子形成氢键，并与疏水基团的疏水作用形成相对平衡。低温时氢键起主要作用，表现为PNIPAAm能溶于水；随着温度的升高，部分氢键破坏，PNIPAAm分子内及大分子间的疏水作用加强，当达到PNIPAAm的LCST约为32℃之上时，由溶解状态的线团转变为坍陷的球型，导致聚合物析出，溶液变成两相，反之亦然。把PNIPAAm作药物载体用于药物释放时，它能够响应环境温度的变化来实现对药物的控制释放。目前，已有诸多有关PNIPAAm水凝胶用于药物的温控释放报道。眼用温度敏感型原位凝胶以水溶液的形式眼部局部用药，在眼部通过离子交联，温度诱导因独特的溶液-凝胶相转变成为亲水性三维网状凝胶，缓慢控制药物释放，既节约成本、保证疗效，又减少了相关毒副作用。

目前尚没有将环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物制备成眼用制剂的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物。通过将羧基引入，将温度敏感的聚N异丙基丙烯酰胺接枝到透明质酸上。该组合物可克服现有环孢素A制剂存在生物利用度低、严重毒副作用等不足，可制备载药量高、毒副作用小、稳定性好、生物相容性好、储藏运输制备方便的环孢素A眼用制剂。

本发明的另外一个目的是提供上述组合物的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种环孢素A和两亲性透明质酸衍生物HA-g-PNIPAAm的组合物，该组合物由活性成分环孢素A与两亲性透明质酸组成。上述药物组合物，按所述组合物总重计：环孢素A为30-45wt％，HA-g-PNIPAAm为55-70wt％；

所述的环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物制备方法，包括以下步骤：

将上述HA溶于适当溶剂，采用己二酸二酰肼为连接臂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)为活化剂进行反应，得到胺化的透明质酸(AHA)，合成路线见图1。

将上述单体N-异丙基丙烯酰胺溶于适当溶剂，采用偶氮二异丁腈为催化剂，3-巯基丙酸为羧基引入剂进行聚合反应，得到末端带羧基的聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm-COOH)，合成路线见图2。

将上述的胺化的透明质酸和末端带羧基的聚N异丙基丙烯酰胺，孵育，混合搅拌24h，得到产物(HA-g-PNIPAAm)，合成路线见图3。

所述的药物组合物HA-g-PNIPAAm具有两亲性、温敏性。

所述的药物组合物中透明质酸衍生物，透明质酸骨架分子量为1×10⁴～1×10⁶，胺基与透明质酸的羧基形成酰胺键，总取代76～120％，聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)末端羧基取代于透明质酸中间体(AHA)氨基，总取代度1～59％。

所述的环孢素A与HA-g-PNIPAAm组合物的制备步骤如下：

HA-g-PNIPAAm溶于水中，将环孢素A用药学上可接受的有机溶剂溶解后，加入上述溶液中，经探头超声处理后，透析或蒸发法除去有机溶剂，以微孔滤膜过滤，即得组合物。

所述的药物组合物的制备方法，其特征在于可接受的有机溶剂包括甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚。

本发明的有益效果：

我们制备所得的环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物中使用了交联透明质酸。透明质酸可保湿和润滑房水滤过通道及玻璃体等，减少眼内体液与组织间的摩擦，保证体液流通、药物顺利进入体内。与PNIPAAm形成HA-g-PNIPAAm纳米凝胶，因分子量和分子体积增大，形成的连续网状结构，在水中可溶胀但不再溶解，机械强度明显提高，在组织中相对不易被降解和扩散，体内存留时间较长，有更好的凝胶的物理支撑和阻隔作用，同时交联透明质酸具有良好的生物相容性，在体内降解产物为机体固有成分，并不会改变机体局部的生理环境，安全性高，刺激性小。

本发明与现有环孢素A制剂相比，具有“高载药量、高安全性、生产工艺简单”等优点。具体表现在：(1)该药物组合物载药效率高达73.92％，电镜下显示纳米粒子是规整的圆球形。(2)该组合物不含蓖麻油、大豆油，具有更好的生物相容性，不会产生严重的过敏反应，刺激性小，显著改善了患者的临床顺应性。(3)该组合物可通超声等作用力制备而成，易于实现工业化。(4)该组合物以冻干粉末形式保存，能够解决载药纳米粒溶液由于聚集使粒径增大以及贮存和运输稳定性等问题。

附图说明：

图1：透明质酸中间体的合成路线。

图2：末端带羧基的聚N异丙基丙烯酰胺的合成路线。

图3：两亲性透明质酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)的合成路线。

图4：两亲性透明质酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)的粒径图谱。

图5：环孢素A的体外释放。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明本发明，不是限制本发明。

实施例1制备两亲性透明质酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)

a.制备透明质酸中间体AHA

精密称取透明质酸HA100mg，加入200ml的蒸馏水使HA充分溶解。然后将己二酸二酰肼ADH1.736g加入上述溶液，充分混匀搅拌20分钟，用0.1mol HCl溶液调节pH至4.8。再加20ml乙醇，搅拌30分钟。加入EDC·HCl0.191g，用0.1mol HCl溶液调节pH值，使反应pH保持在4.8。2h后反应结束，用0.1mol NaOH溶液调节pH至7.0。将反应液转入预先洗好的透析袋中(截留分子量7KDa)。采用0.1mol NaCl为透析液，透析24h后，采用去离子水为透析液，透析24h后离心15min，3500rpm。取上层液，过0.45μm微孔滤膜，预冻24h后-50℃冻干36h，得产物透明质酸中间体AHA。

b.制备末端带羧基的聚N异丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH

三颈瓶中加入1g N-异丙基丙烯酰胺单体、0.02g偶氮二异丁腈，缓慢加入30ml乙醇，溶解后加入50μL3-巯基丙酸，氮气保护下升温至70℃，继续通氮气并不断搅拌。24h后反应结束，蒸去溶剂，混合物用丙酮溶解，然后逐滴滴加进大量的正己烷中沉淀，过滤后得产物，40℃真空干燥，制得PNIPAAm-COOH。

c.制备两亲性透明质酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)

将0.10g透明质酸中间体AHA溶解于40ml水中；取末端带羧基的聚N异丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH0.10g溶解于去离子水中，再向溶液中加入0.10g EDC·HCl，4℃下孵育48h。将两种溶液充分混合均匀，调节pH为5.6，混合液在室温下搅拌24h。将反应液转入预先洗好的透析袋中(截留分子量3500Da)，采用去离子水透析3天，预冻后冻干36h，得两亲性透明质酸衍生物HA-g-PNIPAAm的冻干品。

实施例2制备环孢素A和两亲性透明质酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)

采取透析法载药，药物为环孢素CsA。称取HA-g-PNIPAAm20mg，加双蒸水2ml，室温下充分溶胀30min。将6mg环孢素A溶于药学上可接受有机溶剂后滴加入上述溶液中，通过探头超声30min，药物与HA-g-PNIPAAm形成纳米凝胶。将上述纳米凝胶转入预先洗好的透析袋中(截留分子量3500Da)，采用去离子水透析1天，预冻24h后冻干36h，制得环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物冻干品。上述制备方法中，溶解环孢素A的可接受的有机溶剂包括甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚，优选乙醇。

实施例3两亲性透明质酸衍生物取代度表征

将0.10g透明质酸中间体AHA溶解于40ml水中；分别取末端带羧基的聚N异丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH0.10g，0.20g，0.30g溶解于去离子水中，再向溶液中加入0.10gEDC·HCl，4℃下孵育48h。将两种溶液充分混合均匀，调节pH为5.6，混合液在室温下搅拌24h。将反应液转入预先洗好的透析袋中(截留分子量3500Da)，采用去离子水透析3天，预冻24h后冻干36h，得两亲性透明质酸衍生物HA-g-PNIPAAm的冻干品，-4℃冷藏备用。以公式(1)计算样品的取代度(DS)，W为质量，MW为分子量，结果见表1。

$\mathrm{DS}=\frac{(W_{\mathrm{HA}-g-\mathrm{PNIPAAm}}-W_{\mathrm{HA}})/{\mathrm{MW}}_{\mathrm{PNIPAAm}}}{W_{\mathrm{HA}}/{\mathrm{MW}}_{\mathrm{HA}}}$

表1PNIPAAm-透明质酸的取代度

实施例4环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物的表征

1、环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物溶液的制备：环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物冻干品20mg溶解在2ml水中，于室温搅拌0.5h，然后超声30min后，0.45μm滤膜过滤，即得。

2、粒径、电位：将1制备得到环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物溶液，用粒径测定仪(Malvern Instruments，Malvern，UK)进行测定，平均粒径在200nm，结果见图4

3、渗透压：将1制备得到环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物溶液，用OSMOMAT030-D渗透压仪进行测定，结果见表2。结果见表2。

4、表面张力：将1制备得到环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物溶液，用dataphysics DCAT21表面张力测定仪进行测定，结果见表2。

表2环孢素A和两亲性透明质酸衍生物物理性质表征

实施例5环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物载药量测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行载药量测定。流动相为甲醇∶水＝90∶(v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为210nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为60℃，进样量：20μL。以公式(2)计算样品的载药量。结果见表3。

表3环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物载药量

实施例6环孢素A体外释放测定

取2mL环孢素A和两亲性透明质酸衍生物的组合物溶液(含500μg环孢素A)，放入预先洗好的透析袋中(截留分子量3500Da)，置于200ml，0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，在设计的温度25℃(低于LCST)、37℃(高于LCST)下透析，透析袋置于水浴振荡器上，振荡速度为100rpm。分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h取出1.5ml溶液，过0.22μm滤膜，高效液相测含量，同时补充同温同量释放介质。计算各时间点的平均累积释药百分率，绘制释药曲线(n＝3)。结果表明总释药量在37℃条件下明显高于25℃，且每个时间点的释药量均高于25℃，见图5。

Claims (8)

1.一种环孢素A药物组合物，其特征在于它是由活性成分环孢素A与两亲性透明质酸衍生物HA-g-PNIPAAm所制成的制剂：环孢素A为5-40wt％，HA-g-PNIPAAm为60-95wt％。

2.根据权利要求1所述的环孢素A药物组合物，其特征在于，活性成分环孢素A与HA-g-PNIPAAm微凝胶通过非共价键结合，按所述组合物总重计：环孢素A为10-35wt％，HA-g-PNIPAAm微凝胶为65-90wt％。

3.根据权利要求1所述的环孢素A药物组合物，其特征在于所述的透明质酸衍生物HA-g-PNIPAAm由下列方法制备得到：

a.制备透明质酸中间体AHA：

将所述透明质酸HA溶于适当溶剂，采用己二酸二酰肼为连接臂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)为活化剂进行反应，得到透明质酸中间体AHA；

b.制备末端带羧基的聚N异丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH：

将所述单体N-异丙基丙烯酰胺溶于适当溶剂，采用偶氮二异丁腈为催化剂，3-巯基丙酸为羧基引入剂进行聚合反应，得到末端带羧基的聚N异丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH；

c.两亲性透明质酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)的制备方法：

将步骤b所得的末端带羧基的聚N异丙基丙烯酰胺孵育，与步骤a所得透明质酸中间体混合，搅拌24h，得到产物HA-g-PNIPAAm。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述HA-g-PNIPAAm具有两亲性、温敏性；步骤a中适当溶剂为去离子水，步骤b中适当溶剂为乙醇。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述两亲性透明质酸衍生物，透明质酸骨架分子量为1×10⁴～1×10⁶，胺基与透明质酸的羧基形成酰胺键，总取代76～120％，聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)末端羧基取代于透明质酸中间体(AHA)氨基，总取代度1～59％。

6.一种制备如权利要求1所述的环孢素A与HA-g-PNIPAAm组合物的方法，其制备步骤如下：

HA-g-PNIPAAm溶于水中，将环孢素A用药学上可接受的有机溶剂溶解后，加入上述溶液中，经探头超声处理后，透析或蒸发法除去有机溶剂，以微孔滤膜过滤，即得组合物。

7.根据权利要求6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于可接受的有机溶剂包括甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚。

8.根据权利要求7所述的药物组合物的制备方法，其特征在于可接受的有机溶剂为乙醇。

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