CN110585441B - 一种靶向乏氧肿瘤的短肽小分子自组装纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向肿瘤乏氧区域的短肽小分子自组装纳米材料的制备方法及其应用，所述纳米材料为短肽修饰的小分子碳酸酐酶抑制剂，其中，所述短肽的N端与取代或未取代的芳香基团结合。通过靶向乏氧肿瘤细胞膜高表达的碳酸酐酶，实现肿瘤微环境原位响应的自组装，并诱发乏氧肿瘤细胞的特异性内吞，从而调控并杀伤乏氧肿瘤细胞。此材料制备工艺简单，具有较高生物安全性，可有效杀伤肿瘤乏氧细胞，显著提高常规临床化疗治疗效果，减缓肿瘤转移进程，为临床肿瘤治疗提供更多思路与手段。

Description

一种靶向乏氧肿瘤的短肽小分子自组装纳米材料及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种靶向乏氧肿瘤的短肽小分子自组装纳米材料，及其制备方法和应用。
背景技术
作为各类实体肿瘤中共有的一个特征，肿瘤乏氧微环境在肿瘤的多药耐药和癌细胞转移中具有深远的临床意义。同时，肿瘤乏氧微环境还抑制免疫反应并募集肿瘤相关巨噬细胞，为肿瘤干细胞的生存提供保护。在传统的肿瘤放射治疗或化疗治疗期间，肿瘤微环境可以显着促进癌细胞存活。α-碳酸酐酶的是具备16个不同表型的大家族，其中碳酸酐酶IX(CA IX) 高度依赖于肿瘤乏氧微环境，需要转录激活乏氧诱导因子-1(HIF-1)。CA IX 被称为肿瘤相关酶，在不同种类肿瘤的乏氧区域中高度过表达，已证实的肿瘤类型包括脑，颈，肺，膀胱，乳房，子宫颈等相关癌症。
CA IX在实体肿瘤中的主要功能之一是pH调节：一方面，CA IX在乏氧微环境中促使肿瘤细胞外周的环境酸化，有利于乏氧肿瘤获得抗化疗和抗转移性的表型；另一方面，这种跨膜金属酶同时帮助乏氧肿瘤细胞的胞内酸性产物进行跨膜转运，从而在随后的乏氧诱导代谢过程中保护乏氧癌细胞免于酸中毒(保持中性的胞内pH)。此外，目前的研究已经证实了乏氧肿瘤细胞膜上高表达的CA IX酶会主导肿瘤细胞在乏氧微环境中进行细胞内吞，从而实现肿瘤乏氧微环境下细胞外的物质摄取。考虑到CA IX酶在乏氧肿瘤中的关键作用，抑制CA IX酶作用已成为乏氧肿瘤治疗中抗增殖、抗转移和抗血管生成等的重要诊断和治疗手段。
传统的CA抑制剂，例如磺胺类和香豆素类的衍生物，对肿瘤相关CA IX 缺乏足够的选择性，它们同时还会抑制人体内其它正常功能CA酶的亚型。为了增强它们对跨膜CA IX酶的选择性，人们试图调节这些CA抑制剂的化学或物理性质。选择性靶向CA IX的重要策略之一是降低其在癌细胞膜中的通透性，使抑制剂优先结合位于细胞膜表面的CA IX酶。其中，通过纳米粒子的修饰提高CA抑制剂的选择性，这种手段引起了人们的极大关注。由于纳米粒子的可调形状和大小强烈影响细胞摄取过程，CA抑制剂化学修饰的纳米材料被认为是CA IX靶向治疗的创新平台。
例如，CA抑制剂修饰的金纳米棒已实现对乏氧癌细胞的更多选择性摄取，从而在肿瘤热疗中产生更高的功效。载带CA抑制剂的氧化铜纳米颗粒也被招募用于乏氧癌症治疗，其选择性地靶向CA IX并随后诱导细胞内线粒体损伤。尽管CA抑制剂和纳米颗粒的结合在乏氧癌症疗法中展性出优异的协同效应，但目前的研究仍然面临着一系列的挑战：例如纳米材料不能深入渗透实体肿瘤内部的乏氧区域，纳米材料在临床上相关的生物稳定性和生物安全问题，以及纳米药物大型规模制造生成所面临的高额制备成本等。如何简单、低毒、有效地增强碳酸酐酶抑制剂小分子对CA IX酶的特异性靶向，如何提高抑制剂小分子在乏氧肿瘤治疗中的效果与相关临床应用，依旧是人们关注的重点。
基于天然的生物相容性和生物降解性，生物启发的小分子自组装纳米结构几十年来引起了越来越多的关注。超分子纳米材料通过非共价相互作用，自发组装生命必需元素(例如肽，糖，脂质，甾醇，DNA)，模仿生物系统中的结构和性质。作为生物医学应用的创新生物材料，多肽小分子自组装已经在组织工程，免疫疗法，药物靶向递送，肿瘤细胞调控，以及肿瘤细胞内/细胞外成像等方面得到了广泛的探索。最近的研究表明，细胞环境触发的多肽自组装可调纳米结构的设计非常有利于肿瘤治疗。例如，酸性pH 引发的多肽纳米结构变化已被用于刺激肿瘤靶向递送和随后的细胞内摄取；通过细胞外/细胞内环境激活的差异化自组装，提供两种类型的多肽自组装纳米结构，以实现更好的肿瘤治疗；通过肿瘤微环境诱导多肽自组装形成细胞周围纳米网的新策略，用于阻断癌细胞之间的物质交换，限制肿瘤细胞迁移，帮助肿瘤治疗靶向富集诊疗试剂等等。因此，作为改造肿瘤细胞膜表面并高度干扰细胞膜相关蛋白酶功能的创新方法，多肽超分子纳米结构通过调控肿瘤细胞的摄取，提出了改变其与细胞相互作用机制的有效策略。
然而目前为止，短肽的自组装分子纳米材料缺乏应用于乏氧癌症治疗。因此，本发明人开发了一种新型的短肽的纳米纤维材料。利用短肽修饰普通CA抑制剂小分子，实现靶向乏氧肿瘤细胞膜CA IX酶的自组装，以及乏氧肿瘤细胞的特异性杀伤。这种智能设计可以有益于传统化疗，不仅实现更精确的药物递送，还能产生全新的治疗机制，是一种生物安全性高，制备工序简单的材料。其为乏氧肿瘤治疗提供了一个全新的方向并促进了现有化疗手段的临床应用前景。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种靶向乏氧肿瘤的短肽小分子自组装纳米材料，及其制备方法和应用。
在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“CA”是指：碳酸酐酶。
术语“dd H2O”是指：双蒸水。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种靶向乏氧肿瘤的短肽小分子自组装纳米材料，所述纳米材料为短肽修饰的小分子碳酸酐酶抑制剂，其中，所述短肽的N端与取代或未取代的芳香基团结合；
优选地，所述短肽由3-5个氨基酸组成；和/或
优选地，所述芳香基团选自以下一种或多种：苯环、芘环、萘环、芴甲氧羰基；优选地，所述芳香封端基团为萘乙酸。
根据本发明第一方面的纳米材料，其中，所述碳酸酐酶抑制剂选自以下一种或多种：磺胺类药物、磺酰胺类药物，氨基磺酸盐、二硫代氨基甲酸盐、黄原酸盐、多聚胺、苯酚衍生物、香豆素类衍生物；
优选地，所述碳酸酐酶抑制剂为4-(2-氨乙基)苯磺酰胺。
根据本发明第一方面的纳米材料，其中，所述短肽包含非自然D型氨基酸序列DFDF；和/或
所述短肽包含非自然D型氨酸序列DK；
所述短肽最优选为DFDFDK。
根据本发明第一方面的纳米材料，其中，所述自组装纳米材料的化学结构式如下：
Figure RE-GDA0002257729740000031
本发明的第二方面提供了第一方面所述的纳米材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)活化所述碳酸酐酶抑制剂；
(2)通过标准固相肽合成方法制备所述短肽；和
(3)将步骤(1)所得活化的碳酸酐酶抑制剂与步骤(2)所制得的短肽在室温下在水和甲醇混合溶液中反应得到所述纳米材料的自组装前体小分子；
和
(4)室温下在水溶液中自组装得到所述纳米材料；
优选地，所述步骤(4)中，所述短肽小分子自组装纳米材料在溶液中的重量百分比为0.2wt％～1.0wt％。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(3)中还包括以下步骤：
提纯步骤(3)中所得自组装前体小分子，确认所得小分子的结构与纯度；
优选地，所述提纯方法为高效液相色谱法。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，通过调节不同pH获得不同形态的纳米材料；
其中，所述自组装短肽小分子在pH 9.0的条件下为澄清溶液；在pH 7.0～6.5的条件下自组装成为直径为10～15nm的纳米纤维，并形成水凝胶；在pH5.5～5.0的条件下自组装成直径为200～500nm的纳米纤维。
本发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
如第一方面的纳米材料；根据第二方面的制备方法而制得的纳米材料；和
药学上可接受的载体。
本发明的第四方面提供了第一方面的纳米材料或按照第二方面的制备方法而制得的纳米材料在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
根据本发明第四方面的应用，所述肿瘤为特异性高表达CA IX蛋白酶的乏氧肿瘤；优选地，所述乏氧肿瘤选自以下一种或多种癌症：肺癌，结肠癌，乳腺癌，宫颈癌，膀胱癌，卵巢癌，脑部胶质瘤，头颈部，口腔癌。
传统的CA抑制剂，例如磺胺类和香豆素类的衍生物，对肿瘤相关CA IX缺乏足够的选择性，它们同时还抑制人体内其它正常功能CA酶的亚型。尽管CA抑制剂和纳米颗粒的结合在乏氧癌症疗法中展性出优异的协同效应，但目前的研究仍然面临着一系列的挑战：例如纳米材料不能深入渗透实体肿瘤内部的乏氧区域，纳米材料在临床上相关的生物稳定性和生物安全问题，以及纳米药物大型规模制造生成所面临的高额制备成本等。如何简单、低毒、有效地增强碳酸酐酶抑制剂小分子对CA IX酶的特异性靶向，如何提高抑制剂小分子在乏氧肿瘤治疗中的效果与相关临床应用，依旧是人们关注的重点。
本发明的目的在于提供一种基于生物相容性较高的氨基酸短肽修饰普通CA抑制剂小分子的靶向乏氧肿瘤的自组装纳米材料及其制备方法。本发明人利用芳香基封端基团和氨基酸自组装短肽简单修饰普通CA抑制剂小分子，使其实现靶向乏氧肿瘤细胞膜CA IX酶的自组装，从而产生乏氧肿瘤细胞的特异性杀伤。这种智能设计是制备工序简单，生物安全性高，不仅能更精确的对肿瘤乏氧区域实施药物递送，还能实现全新的治疗机制，有助于传统临床化疗应用，为乏氧肿瘤治疗提供了一个全新的方向。
本发明利用CA IX酶中细胞外活性位点的特点，使短肽修饰的CA抑制剂小分子在细胞膜表面构建CA IX的靶向自组装，从而具备以下优点： (1)通过更强的细胞膜外滞留时间以及结合CA IX能力，这些新的CA抑制剂自组装纳米纤维表现出对CA IX更强的抑制效力；(2)这种乏氧肿瘤细胞膜上的靶向自组装会进一步阻塞乏氧肿瘤细胞的正常活动，中断CA IX 对肿瘤微环境pH的调控，减弱乏氧肿瘤细胞转移迁徙能力；(3)CA IX介导的相关内吞作用，促进了这些自组装纳米纤维在乏氧微环境下的细胞内摄取；(4)内吞后纳米纤维的形态和特征亦将随着内吞囊泡中pH值的降低而改变，从而导致乏氧肿瘤细胞内的酸性内吞囊泡损伤以及保护性自噬阻断。
这种乏氧肿瘤细胞微环境pH响应的结构可控自组装纳米材料为乏氧癌细胞提供了新的治疗机制和策略，有益于乳腺癌肿瘤治疗中的抑制肿瘤细胞增殖和转移，以及抑制肿瘤组织中的血管生成等临床应用，能显著提升现有临床化疗药物的治疗效果，为乏氧癌症治疗提供了一个全新方向。
本发明利用CA IX酶中细胞外活性位点的特点，使短肽修饰的CA抑制剂小分子在细胞膜表面构建CA IX的靶向自组装，通过更强的细胞膜外滞留时间以及结合CA IX能力，这些新的CA抑制剂自组装纳米纤维表现出对CA IX更强的抑制效力。与此同时，这种乏氧肿瘤细胞膜上的靶向自组装会进一步阻断乏氧肿瘤细胞的正常活动，其中包括中断CA IX对肿瘤微环境pH的调控，以及削弱乏氧肿瘤细胞转移迁徙能力。更重要的是， CA IX介导的相关内吞作用，促进了这些自组装纳米纤维在乏氧微环境下的细胞内摄取，在随后的内吞过程中，纳米纤维的形态和特征亦将随着内吞囊泡中pH值的降低而改变，从而导致乏氧肿瘤细胞内的酸性内吞囊泡损伤以及保护性自噬阻断。这种乏氧肿瘤细胞微环境pH响应的结构可控自组装纳米材料为乏氧癌细胞提供了新的治疗机制和策略，有益于实现抗肿瘤组织血管生成，以及抗肿瘤细胞增殖和转移等，显著提升现有临床化疗药物的治疗效果，为乏氧癌症治疗提供了一个全新方向。
具体内容如下：
(A)提供一种基于生物相容性较高的氨基酸短肽修饰普通碳酸酐酶抑制剂小分子的靶向乏氧肿瘤的自组装纳米材料设计，提供所述纳米短肽小分子制备方法：
(1)自组装短肽合成制备：利用经典FMOC固相合成方法得到由3～5 个氨基酸组成的短肽小分子序列，并通过酰胺键将短肽的N-端与芳香基团 (例如苯环、芘环、萘环、芴甲氧羰基等)结合，得到具备良好自组装能力的短肽小分子；
优选地，自组装短肽小分子包含非自然D型氨酸序列DFDF，从而在生物体内得到长效稳定的自组装纳米结构；
优选地，自组装短肽小分子包含非自然D型氨酸序列DK，其侧链氨基为化学键结合CA抑制剂提供了良好反应位点；
优选地，萘乙酸(NAP)为芳香封端基团，以酰胺与氨基酸相连，帮助氨基酸短肽DFDFDK提供更好的自组装效果；
(2)CA抑制剂小分子作为靶向乏氧肿瘤细胞并产生特异性抑制与杀伤的重要组成部分，制备方法如下：常见CA抑制剂小分子(磺胺类药物、磺酰胺类药物，氨基磺酸盐、二硫代氨基甲酸盐、黄原酸盐、多聚胺、苯酚衍生物、香豆素类衍生物)通过硫代脲基与氨基酸DK上的侧链氨基共价键结合；
优选地，碳酸酐酶抑制剂小分子4-(2-氨乙基)苯磺酰胺的伯氨基团通过与N,N'-硫羰基二咪唑(TCDI)反应活化生成异硫氰酸酯得到稳定中间产物4-(2-异硫氰酸乙酯基)苯磺酰胺，通过与自组装短肽小分子 NAP-DFDFDK在室温水/甲醇混合溶液中反应过夜，经高效液相色谱仪提纯得到优化后分子，结构式如下：
Figure RE-GDA0002257729740000061
(B)本发明提供了如第一方面所述靶向乏氧肿瘤的短肽小分子的自组装制备方法，能响应乏氧肿瘤微环境中细胞内与细胞外不同pH，从而得到不同的纳米结构，并形成纳米水凝胶(图2)。
(C)利用CA IX酶位于细胞膜外的活性位点，所述材料在乏氧肿瘤细胞膜表面构建一种靶向CA IX酶的自组装纳米纤维。该现象依赖于CA IX 的高表达(图3)。
(D)通过更强的与CA IX酶蛋白结合能力，这些氨基酸短肽修饰的新型碳酸酐酶抑制剂能增强对CA IX酶的抑制作用。CA IX酶最重要的功能之一是它们的pH调节能力。在乏氧条件下，CA IX酶调节癌细胞的细胞外pH值并将其降低至6.5，而细胞内pH将保持在7.4左右。这一重要功能不仅有助于糖酵解代谢下的乏氧癌细胞存活，而且有利于它们的迁移行为。因此，本发明人也通过以下两个方面验证所述材料增强的CA IX酶的抑制作用(图4)：
(1)阻断CA IX酶对乏氧肿瘤微环境pH的调控：所述材料使CA IX 酶出现pH调控功能障碍。乏氧肿瘤微环境中的这种碱化现象还可能进一步阻碍乏氧肿瘤细胞中的无氧代谢通路，破坏乏氧肿瘤细胞存活所依赖的必须环境。
(2)降低乏氧肿瘤细胞转移迁徙能力：本发明的短肽修饰自组装CA 抑制剂不仅减弱了跨膜CA IX酶的活性，而且还限制了乏氧癌细胞的正常运动，从而展现出更强的抑制乏氧肿瘤转移迁徙的功效。
(E)另一方面，通过乏氧肿瘤微环境中CA IX酶介导的相关内吞作用，促进了这些自组装纳米纤维在乏氧肿瘤细胞内的摄取。其纳米纤维的形态和特征将随着pH值的降低而改变，并因此造成乏氧癌细胞内的酸性囊泡损伤与保护性自噬阻断，最终导致乏氧肿瘤细胞的特异性杀伤，具体内容如下：
(1)CA IX酶介导的自组装纳米纤维在乏氧肿瘤的相关内吞作用，造成乏氧肿瘤细胞酸性内吞囊泡损伤(图5)，其中，UHPLC实验分析了所述材料处理后的乏氧肿瘤细胞膜与肿瘤细胞裂解液，证实了所述材料对乏氧肿瘤细胞的靶向自组装与特异性内吞(图6)；
(2)本发明通过监测乏氧条件下肿瘤细胞保护性自噬的相关信号通路，证实了CAIX酶介导的自组装纳米纤维的内吞作用，将进一步阻断乏氧肿瘤细胞中保护性自噬的正常功能(图7)。
(3)本发明通过细胞毒性实验证实了所述短肽自组装小分子纳米材料能对乏氧肿瘤细胞产生特异性杀伤，其在乏氧环境中对肿瘤细胞的杀伤效果显著高于常氧，并且治疗效果明显优于其它对照组，包括未修饰的商用 CA抑制剂小分子对照组以及未连接CA抑制剂的短肽对照组(图8)。
(F)本发明的目的还在于，这种乏氧肿瘤细胞微环境pH响应的结构可控自组装纳米材料为乏氧肿瘤细胞提供了新治疗机制和策略，有助于在乳腺癌治疗中实现抑制肿瘤细胞增殖和转移，以及抑制肿瘤组织中的血管生成等效益，能显著提升现有临床化疗药物的治疗效果。(可拓展到脑，颈，肺，膀胱，乳房，子宫颈等同样具备肿瘤乏氧微环境CA IX过表达的癌症)
(1)目前为止，体外细胞实验已揭示了所述材料选择性抑制乏氧 MDA-MB-231肿瘤细胞的巨大潜力，本发明人进行动物实验证明这种设计在活体肿瘤中的抑制乏氧微环境治疗效果：
采用携带乳腺癌异种移植的裸鼠模型进行动物实验，只有材料处理组显着削弱了乏氧肿瘤的相关生物标记信号(HIF-1α和CA IX)，意味着成功削弱实体肿瘤内的乏氧程度(如图9)。值得注意的是，其余对照组的治疗均未表现出显著地抑制乏氧的功效。此外，在所述材料处理组中出现了自噬体积聚的独特增加(如LC3B的点状结构)，以及明显的癌细胞增殖衰减(Ki67荧光减弱)，再次验证了体外细胞实验结果。因此，所述材料确实对活体中的乏氧肿瘤具有相当的抑制乏氧微环境治疗效果。
(2)由于CA IX酶在乏氧肿瘤微环境中的关键作用，CA IX抑制剂可以在肿瘤治疗中抑制肿瘤转移和血管生成。本发明人前期体外细胞实验已经显示出一些相关的效应，因此，本发明人通过动物实验进一步验证所述发明材料抑制转移与血管生成方面的潜在应用。本发明人采用了鼠4T1乳腺癌细胞的同源小鼠转移模型，统计分析了肺组织中转移灶的数量，直接证实所述材料具有显著抑制肿瘤转移的功能(图10)。通过检测肿瘤组织中的血管内皮标记物CD31后，本发明人进一步发现所述材料处理组中，肿瘤血管相关的CD31免疫荧光图像变得破碎且微弱，而对照组中肿瘤血管则保持了相对完整的结构，提示本发明所述材料在乏氧肿瘤组织中具备抑制肿瘤血管生成的功效。
(3)通过抑制CA IX相关生物功能，有效促进常规化疗的临床应用和疗效。乏氧微环境已被认为是临床上肿瘤生长、转移性传播和多药耐药的关键因素。CA IX在多种癌症的肿瘤乏氧环境中特异性地过量表达，调控着肿瘤微环境的pH，并且帮助实体瘤具备高转移性以及抗化疗的特性。目前为止，本发明人已证实所述材料将通过抑制CA IX有效地破坏实体瘤内的乏氧微环境，从而影响肿瘤的增殖、转移和血管生成。这里，本发明人通过动物实验进一步证明，所述材料能促进常规临床化疗药物的使用，在低剂量给药的情况下，增强常规临床化疗药物的抗肿瘤效果。
本发明人开发了所述材料与传统临床化疗药物的联合治疗，优选地，低剂量使用阿霉素(Dox)。
本发明人建立了肿瘤异种移植的裸鼠模型，所述材料和低剂量Dox的联合使用有效地实现了肿瘤体积的降低(图11)，并且显著优于单独给药的Dox组。这表明所述材料处理后可以有效地增强肿瘤对Dox的敏感度，通过所述材料处理破坏实体肿瘤的乏氧微环境，即使在相对低剂量的情况下， Dox治疗也能表现出显着的抗肿瘤性能，从而加速常规化疗治疗效果。
(4)此外，本发明还评估了所述材料在动物实验中的安全性。
优选地，本发明人监测所述纳米材料治疗组的毒性作用。所述材料治疗组在小鼠体重和器官结构方面均未出现明显异常，确保其在体内应用中的生物相容性；
优选地，本发明人监测联合治疗组的毒性作用。在整个治疗期间，联合治疗没有小鼠死亡。与对照组比较后，所述材料和Dox的联合使用并未明显降低小鼠的体重。血液生化指标(如丙氨酸转氨酶，天冬氨酸转氨酶和肌氨酸酐)进一步反映了在所述材料和Dox联合治疗后没有明显的肝脏和肾脏严重损伤(图12)。
伴随着肿瘤的快速增殖，乏氧微环境对肿瘤生长和转移具有深远的临床意义，它们不仅显着增加了肿瘤部位内药物扩散的难度，而且还保护了肿瘤干细胞，并在传统的肿瘤放疗或化疗期间显着提高肿瘤细胞存活能力。然而，目前纳米材料在乏氧肿瘤治疗中的应用受限于生物安全性、渗透性，以及材料稳定性等问题。作为乏氧诱导的跨膜酶，CA IX是乏氧性肿瘤的特异性治疗诊断靶标。利用CA IX酶中的细胞外活性位点，本发明人用D 型氨基酸修饰了CA抑制剂，并因此开发了短肽构建的靶向乏氧自组装纳米纤维。成功地在乏氧肿瘤细胞膜表面实现CA IX靶向自组装，这些新型 CA抑制剂组成的纳米纤维基于其较长的细胞外保留时间和更高强的结合能力而展现出对CA IX的更强的抑制效力。此外，乏氧环境中肿瘤细胞通过CA IX酶介导这些纳米纤维材料的内吞，并引起乏氧肿瘤细胞特异性的细胞器损伤和保护性自噬阻断。
这些有趣的体外现象和作用机制激励本发明人进一步探索了靶向乏氧的自组装纳米材料在体内的潜在应用。首先，通过体内各种方法和工具研究了它们抑制乏氧微环境的性能，如免疫荧光图像，流式细胞仪和Western 印迹。在这些结果的支持下，本发明人设计的这种新型自组装CA抑制剂通过抑制CA IX在乏氧肿瘤中实现了显着的治疗效果。此后，本发明人在 4T1乳腺癌模型中验证了所述材料显着抑制CA IX相关的肿瘤转移和血管生成。更有趣的是，作为常规临床化疗的一个手段，Dox治疗在所述材料的辅助下取得了显着进步。失去乏氧微环境的保护，实体肿瘤似乎对Dox 给药更敏感且不耐受。如本发明人所知，Dox现在仍然面临着各种副作用的挑战，例如心脏毒性，过敏反应，色素沉着异常，治疗相关的白血病等。长期化疗对患者来说可能是危险和痛苦的，同时也提高了发生耐药性的风险。因此，癌症介入治疗因其在辅助治疗和缓解疼痛方面的优异效果，越来越受到关注。它提供局部治疗(如血管内栓塞和局部消融)，最近应用于食管癌，结肠直肠癌，肺癌和原发性肝癌等癌症治疗。考虑到CA IX酶在临床中的关键作用，所述的新型自组装CA抑制剂纳米材料在肿瘤乏氧区域给药亦可成为癌症介入治疗的上佳选择。它不仅抑制CA IX相关的肿瘤血管生成，还有效地抑制那些没有血管输送氧气和营养的乏氧区域。得益于其生物相容性成分和卓越的乏氧疗效，这种新型自组装CA抑制剂可以是一种安全方便的材料，促进着目前的临床化疗手段。
最后同样重要的是，通过自组装短肽修饰抗癌药物构建靶特异性纳米结构，为本发明人提供了更多的治疗工具选择。巨大的投资，漫长的周期和高风险的挑战使小分子类药物的创新研发进入了瓶颈期。然而，近年来，老药新用成为药物研发的新方向。与普通药物开发不同，这种研发策略可缩短临床试验时间，降低成本，提高成功率，有效解决传统创新药物开发的各种关键问题。最近发现许多传统药物，例如抗炎药物阿司匹林，戒酒药物双硫仑，糖尿病药物二甲双胍等具有全新的机制，并且在抗癌治疗中表现出意想不到的生物效应。受这种策略的启发，本发明人利用传统CA 抑制剂的新功能及其自组装纳米结构，提供了一个利用几个氨基酸改造传统药物，并发掘传统药物的全新作用机制的新思路。
本发明的纳米材料可以具有但不限于以下有益效果：
(1)本发明利用生物相容性较高的氨基酸短肽修饰普通碳酸酐酶抑制剂小分子，这种新型的自组装碳酸酐酶抑制剂纳米材料是一种生物安全性高，制备工序简单的材料。
(2)本发明所述纳米材料能实现靶向乏氧肿瘤细胞膜CA IX酶的自组装设计，并通过响应乏氧肿瘤微环境胞外、胞内不同pH条件，产生不同尺寸的纳米纤维结构，从而展现对乏氧肿瘤细胞的特异性杀伤。
(3)这种自组装碳酸酐酶抑制剂的水凝胶纳米材料显着增强了传统化疗药物的抗肿瘤功效。得益于其较好的生物相容性和卓越的乏氧肿瘤疗效，这种新型短肽修饰的自组装碳酸酐酶抑制剂可以是一种安全，方便的材料，推动现有化疗手段的临床应用发展，为乏氧癌症治疗提供了一个全新的方向。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1(a)示出了本发明所述的靶向乏氧自组装短肽小分子的核磁数据；图1(b)示出了本发明所述的靶向乏氧自组装短肽小分子的质谱数据。
图2(a)示出了不同pH下纳米材料的宏观形貌与电镜形貌，图2(b) 示出了不同pH下纳米水凝胶的流变学数据。
图3(a)示出了乏氧肿瘤细胞培养皿图片；环境扫描电镜：短肽自组装小分子靶向乏氧肿瘤细胞膜表面形成网状纤维结构；图3(b)示出了乏氧肿瘤细胞中CA IX的mRNA和蛋白水平。
图4示出了所述材料处理后，图4(a)示出了乏氧肿瘤细胞培养基颜色变化，以及图4(b)示出了乏氧肿瘤细胞的转移迁徙能力表现。
图5示出了所述材料处理后(N-pepABS(+)组)的结果，其中，图5 (A)示出了乏氧肿瘤细胞出现显著数量的CA IX和内吞囊泡的荧光共定位，继而图5(B)示出了乏氧肿瘤细胞出现酸性囊泡溶胀，然后图5(C) 示出了荧光染色证实乏氧肿瘤细胞内酸性囊泡出现损伤，以及图5(D) 电镜图像展示乏氧细胞的胞浆内观察到大量纳米纤维结构。
图6示出了CA IX蛋白表达敲低后，所述材料(N-pepABS(+)组) 在乏氧肿瘤细胞膜上以及胞内富集量的变化，从而说明了所述材料的乏氧靶向自组装以及特异性内吞皆具有CA IX的依赖性：图6(A)示出了通过基因干扰实验降低乏氧肿瘤细胞中CA IX的表达量，继而图6(B)示出了流式结果证实所述材料造成的酸性囊泡损伤程度与CA IX表达量正相关，然后UHPLC结果证实，图6(C)示出了乏氧肿瘤细胞膜上富集的所述纳米材料浓度也具有CAIX依赖性，以及图6(D)示出了乏氧肿瘤细胞的胞浆内(细胞裂解液)富集的所述纳米材料浓度也具有CA IX依赖性。
图7示出了酸性囊泡损伤阻断MDA-MB-231细胞中的保护性自噬：用所述材料处理细胞48小时后，图7(A)示出了Atg 5/GADPH的mRNA 水平比率；图7(B)示出了MDA-MB-231细胞的细胞质中自噬体积聚的荧光图像；图7(C)示出了自噬相关信号的Western印迹分析；图7(D) 示出了MDA-MB-231细胞中的自噬流研究，预处理10nM Baf 1小时，然后再所述材料处理48小时。
图8示出了所述材料处理72小时后，肿瘤细胞在乏氧/常氧条件下的细胞活性结果(CCK-8实验)。
图9示出了动物活体实验中，所述材料处理组(N-pepABS)、多肽分子对照组(N-pep)、CA抑制剂对照组(ABS)，图9(A)和图9(B)示出了分别在实体肿瘤中展现的抑制乏氧肿瘤相关生物标记物(A)CA IX和 (B)HIF-1A的免疫荧光图像，以及图9(C)和图9(D)示出了肿瘤组织内(C)自噬相关蛋白LC3B和(D)肿瘤细胞增殖相关Ki67的免疫荧光图像。
图10示出了肿瘤转移模型中，图10(A)示出了所述材料处理组 (N-pepABS)显著减少小鼠肺叶组织中出现的转移灶数量，图10(B)示出了和溶剂对照组(Con)相比展现了具有统计选差异的抑制肿瘤转移效果；所述材料处理后，图10(C)和图10(D)示出了肿瘤组织内(C)乏氧相关CA IX信号和(D)肿瘤血管组织相关生物标记物CD31均展示出显著差异。
图11示出了所述材料(N-pepABS)与低剂量阿霉素(Dox)联用后，图11(A)示出了显著抑制肿瘤生长的体积和图11(C)示出了显著抑制肿瘤生长的重量，并图11(B)示出了与溶剂对照组(Con)对比展示出统计学显著差异；所述材料与低剂量Dox联用后，图11(D)示出了在肿瘤组织内展现出最明显的CA IX酶表达降低，图11(E)示出了在肿瘤组织内展现出最明显的坏死区域型成，图11(F)示出了在肿瘤组织内展现出最明显的细胞增殖活性减弱，以及图11(G)示出了在肿瘤组织内展现出最明显的肿瘤血管结构破坏。
图12(A)示出了所述材料处理后的小鼠生物安全性评价，包括体重与各类脏器机构均未出现异常；图12(B)示出了所述材料与低剂量Dox 联合治疗后的小鼠生物安全性评价，包括体重、肝功能和肾功能都未出现显著异常。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺购自BIOMOL，DMF购自ALFA，1,1'-硫代羰基二咪唑、甲醇和无水二氯甲烷购自Macklin，乙酸乙酯购自Acros，正己烷购自Aldrich，2-氯三苯甲基氯树脂购自Aisabio，Fmoc-D-Lys-Boc-OH购自SIGMA，N，N-二异丙基乙胺购自MERYER，哌啶购自Acmec，三乙胺和N'，N'-四甲基-六氟磷酸六氟磷酸盐购自TCI，DCM购自GE，浓盐酸购自Amresco，PBS购自WISENT，结晶紫购自TargetMol，阿霉素购自 RHAWN，MDA-MB-231和Hela细胞等购自ATCC，培养基购自Invitrogen，各类免疫荧光抗体购自Abcam、Cell SignalingTechnology、System Biosciences、EarthOx；
仪器：
透射电子显微镜，型号为Morgagni 268 transmission electron microscope。
核磁共振成像仪，型号为Varian Unity Inova 400
流式细胞仪，购自碧迪医疗器械公司、型号BD Accuri C6
共聚焦显微镜，购自德国Zeiss光学集团、型号Zeiss 710
高效液相色谱仪，购自Waters、型号为Waters Delta600HPLC system
高效液相色谱仪半制备柱，购自Waters、型号为XTerra C18 RP column
高效液相色谱仪，购自Shimadzu corporation、型号为LC20AT。
实施例1
本实施例用于说明异硫氰酸酯-苯磺酰胺的合成。
将4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺(0.5mmol)溶于1mL DMF中，并将三乙胺(3mmol)加入上述溶液中。在50℃下将1,1'-硫代羰基二咪唑(1mmol) 溶解在1.5mL DMF中，并滴加到上述溶液中。将溶液在室温下连续搅拌30 分钟，然后用dd H2O淬灭。首先用乙酸乙酯萃取产物，然后通过硅胶色谱法(乙酸乙酯-己烷)纯化。核磁信息如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ7.79(d,J＝7.8Hz,2H),7.49(d,J＝7.8Hz,2H),7.35(s,2H),3.96(t,2H), 3.04(t,2H)。
实施例2
本实施例用于说明2-萘乙酸-(D)-Phe-(D)-Phe-(D)-Lys-OH的合成。
通过标准的固相多肽合成(SPPS)制备短肽水凝胶剂，即2-氯三苯甲基氯树脂(1.10mmol/g)和具有由叔丁氧基羰基保护侧链氨基，以及Fmoc 保护主链氨基的各类D型氨基酸反应制得。通过氮气在无水二氯甲烷 (DCM)中鼓泡30分钟使树脂溶胀，然后用5mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤三次。然后加入第一个Fmoc保护的氨基酸(2eqv. Fmoc-D-Lys-Boc-OH)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)的混合溶液(1mL DMF)，并通过在溶液中鼓泡使树脂与氨基酸C-末端反应40分钟。然后用 DMF 5mL洗涤树脂三次。然后将封闭溶液(16：3：1的DCM/MeOH/ DIPEA)加入树脂中以淬灭树脂中未反应的位点并鼓泡10分钟，重复此步骤两次。反应完成后通过DMF洗涤树脂三次，随后在树脂中加入5mL 20％的哌啶并鼓泡30分钟，将保护基团Fmoc从树脂上切下，然后将树脂在DMF 中洗涤五次。然后加入DIPEA(1mL)与苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2eqv.)，与第二个Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-D-Phe-OH， 2eqv.)一起溶解在DMF中并与树脂上的裸露的氨基反应。重复这些偶联和去保护步骤以延长肽链，这是标准的Fmoc SPPS方案。每个步骤后，将树脂用5mL DMF洗涤3次。在最后的步骤中，用DMF(5mL×5)，DCM (5mL×50)，甲醇(5mL×5)和己烷(5mL×5)洗涤树脂，然后通过加入10毫升TFA反应2小时，将多肽从树脂中切下，并在在乙醚中沉淀。收集产物并用高效液相色谱HPLC进一步纯化。
核磁信息如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.26(d,J＝8.4Hz,1H), 8.09(d,J＝8.1Hz,1H),7.85(d,J＝7.4Hz,1H),),7.78(d,J＝7.5Hz,1H), 7.74(d,J＝8.4Hz,1H),7.58(s,1H),7.51–7.42(m,2H),7.29–7.10(m, 10H),4.60–4.54(m,2H),,4.54–4.45(m,1H),4.20(dd,1H),3.53(dd,J＝ 35.9,14.0Hz,2H),3.08–3.03(m,2H),2.95–2.79(m,2H),2.69(dd,J＝13.4, 10.3Hz,1H),2.54(s,2H),1.33-1.62(m,6H)
实施例3
本实施例用于说明2-萘乙酸-(D)-Phe-(D)-Phe-(D)-Lys-(苯磺酰胺)-OH 的合成。
将0.3mmol的上述实施例2制备的短肽小分子加入到甲醇(6mL)和 dd H2O(1mL)的混合物中，然后加入1M NaOH以将pH调节至8，将活化的异硫氰酸酯-苯磺酰胺(0.33mmol)溶解在甲醇(1mL)中并添加至短肽小分子的混合溶液里。混合物在室温下搅拌反应过夜。通过高效液相色谱仪HPLC纯化得到的粗产物。
核磁信息如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.25(d,J＝8.1Hz,1H), 8.13(d,J＝8.3Hz,1H),7.85(d,J＝7.4Hz,1H),7.80–7.76(m,1H),7.75(d,J ＝2.9Hz,2H),7.73(d,J＝3.5Hz,2H),7.58(s,1H),7.50–7.44(m,2H),7.43 (d,2H),7.30–7.12(m,10H),4.61–4.55(m,2H),4.54–4.46(m,1H),4.20 (dd,1H),),3.59(s,2H),3.53(dd,J＝35.9,14.0Hz,2H),3.08–3.03(m, 2H),2.95–2.79(m,2H),2.69(dd,J＝13.4,10.3Hz,1H)1.33-1.64(m,6H).
质谱信息如下：MS(ESI)(m/z):C45H51N6O7S2calcd.850.32；found 851.33[M+1]+.
图1示出了本发明所述的靶向乏氧自组装短肽小分子的(a)核磁和(b) 质谱数据。
实施例4
本实施例用于说明水凝胶制备程序。
通过将实施例3中制备的材料(7.5mg)溶解在1mL dd H2O中，并用 1M NaOH调节pH至9.0以制备0.75wt％的短肽小分子水溶液。将其超声处理以制备澄清溶液，并通过pH试纸监测，然后加入0.1M HCl并随后形成水凝胶将pH值缓慢降至7.5-6.5；为了观察纳米纤维形态和水凝胶强度的差异，以相同的方式制备另一份水凝胶，其最终pH值保持为5.5-4.5。
具体条件如下：
(1)0.2wt％～1.0wt％的自组装短肽小分子在水溶液pH 9.0的条件下为澄清溶液；
(2)0.2wt％～1.0wt％的自组装短肽小分子在水溶液pH 9.0的条件下为澄清溶液，通过0.1M盐酸调节水溶液pH至7.0～6.5的条件下(模拟肿瘤乏氧微环境pH)能自组装成直径为10～15nm的纳米纤维均一结构，并形成水凝胶；
(3)0.2wt％～1.0wt％的自组装短肽小分子在水溶液pH 9.0的条件下为澄清溶液，通过0.1M盐酸调节水溶液pH至5.5～5.0的条件下(模拟肿瘤细胞内吞囊泡pH)能自组装成直径为200～500nm的纳米纤维束，水凝胶硬度增大。
图2(a)示出了不同pH下纳米材料的宏观形貌与电镜形貌，图2(b) 示出了不同pH下纳米水凝胶的流变学数据。
试验例1
本试验例用于说明电镜样品制备。
(1)纳米自组织材料通过负染色技术拍摄TEM图像。将样品加载到具有碳膜的铜网(230目铜网栅格，已涂覆厚碳膜)上以覆盖铜网表面。随后用dd H2O小心地漂洗铜网三次，用滤纸小心地触摸网格边缘让水吸干。然后再将铜网用3％乙酸双氧铀(UA)染色溶液染色三次，类似于水洗步骤。在接触染色溶液后，使用滤纸吸收过多的染色溶液，将铜网干燥十分钟。重复dd H2O漂洗并UA染色步骤三次后，将覆盖有样品的铜网在空气中干燥。
(2)肿瘤细胞的TEM图像样品制备。收集每个样品的细胞，洗涤两次并在4℃下用2.5％戊二醛固定过夜。用PBS洗涤后，用1％的锇酸固定细胞，进行第二轮洗涤，并用梯度乙醇脱水。在嵌入之前，用丙酮和包埋介质的混合物处理每个样品，其中浓度逐渐升高。然后将样品切成几片，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅有序染色并成像。
(3)肿瘤细胞环境扫描电镜图像制备。在37℃下，在每个孔的玻璃上培养约3×105个细胞过夜，然后在37℃下在低氧培养箱中预培养约12小时。乏氧条件下用药物处理指定时间后，用冰PBS和蒸馏水快速洗涤细胞，随后浸入液氮中，冻成固体后立即转移到冷冻干燥仪中。干燥过夜后，每个玻璃涂有2nm厚的金，然后扫描电镜成像。
本发明人用所述材料处理乏氧肿瘤细胞24小时，然后通过环境扫描电子显微镜(ESEM)观察细胞表面。如图3所示，与对照组相比，处理组出现明显的纳米纤维并构成覆盖细胞膜表面的致密网络结构。对照组则显示正常的完整细胞膜图像。此外，乏氧肿瘤细胞在经过所述材料处理48小时后，培养皿的底部也出现水凝胶样物质。这些现象都伴随着升高的CA IX 的mRNA和蛋白水平，证明它们的CA IX酶依赖性与相关性。
本试验例中采用15mM所述材料溶解于pH 9.0水溶液，再稀释于细胞培养液，终浓度控制在200μM～500μM，pH值保持在7.4；
本试验例中本发明人选用三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞，并使其保持在1.0％浓度的O2和5％浓度的CO2环境中培养。
图3(a)示出了乏氧肿瘤细胞培养皿图片；图3(b)示出了环境扫描电镜：短肽自组装小分子靶向乏氧肿瘤细胞膜表面形成网状纤维结构。
试验例2
本试验例用于说明本发明纳米材料的细胞实验。
(1)细胞培养：将MDA-MB-231细胞与含有10％FBS和1％青霉素- 链霉素的DMEM培养基在CO2培养箱中于37℃一起培养。在乏氧实验中，将MDA-MB-231细胞在37℃下、含有1％O2和5％CO2的低氧培养箱中培养。药物处理之前，MDA-MB-231细胞将在低氧培养箱中预培养12小时。
(2)CCK-8分析实验：将约1×104个细胞接种到96孔板的每个孔中，并用不同剂量(200，300，400，500μM)的材料处理72小时。随后将每个样品与CCK-8试剂一起孵育约1小时后，通过检测450nm处的可见光激发，并在600nm处检测吸收值来评估细胞活力。
所述材料处理48小时后，对照组培养基颜色显著变黄，指示着CA IX 在乏氧环境中降低细胞外pH值。然而，通过所述材料处理的乏氧肿瘤细胞 48小时，培养基保持了原有的粉红色，意味着所述材料使CA IX酶出现pH 调控功能障碍。图4示出了所述材料处理后，图4(a)示出了乏氧肿瘤细胞培养基颜色变化。
所述材料处理72小时后，通过CCK-8实验监测乏氧条件下肿瘤细胞活性,本发明证实了所述短肽自组装小分子纳米材料能对乏氧肿瘤细胞产生特异性杀伤，其在乏氧环境中对肿瘤细胞的杀伤效果显著高于常氧，并且，所述短肽自组装小分子纳米材料治疗效果明显优于其它对照组：包括未修饰的商用CA抑制剂小分子(4-(2-氨乙基)苯磺酰胺)对照组，以及未连接CA抑制剂的短肽对照组。图8示出了所述材料处理72小时后，肿瘤细胞在乏氧/常氧条件下的细胞活性结果(CCK-8实验)。
(3)Transwell Assay实验：在乏氧条件下(1.0％O2)药物处理24 小时后，用含有0.2％BSA的无血清培养基收集4×104细胞并接种到上室中，而下室填充600μL含有2.5％FBS的培养基，随后让细胞迁移约10小时，并用4℃PBS洗涤两次。在拍照和计数之前，将膜的下表面的细胞固定，洗涤并用0.1％结晶紫染色，同时清除上表面上的细胞。Transwell板(3422)来自Corning。
本发明通过transwell测定检测乏氧癌细胞的转移迁徙行为。在低氧条件下处理肿瘤细胞24小时后，所述材料展现出明显优越于市售的CA抑制剂小分子(4-(2-氨乙基)苯磺酰胺)的抑制肿瘤细胞迁移效果。这种有趣的现象应该源于CA IX靶向自组装，其将CA抑制剂小分子浓缩在细胞膜上，并且增强它们与CA IX蛋白酶的结合功效。因此，本发明的短肽修饰自组装CA抑制剂不仅减弱了跨膜CA IX酶的活性，而且还限制了乏氧肿瘤细胞的正常活动，展现更强的抑制乏氧肿瘤转移迁徙的功效。图4(b) 示出了乏氧肿瘤细胞的转移迁徙能力表现。
本试验例中采用15mM所述材料溶解于pH 9.0水溶液，再稀释于细胞培养液，终浓度控制在200μM～500μM，pH值保持在7.4；
本试验例中选用三阴性乳腺癌MDA-MB-231和宫颈癌Hela细胞，并使其保持在1.0％浓度的O2和5％浓度的CO2环境中培养；
本试验例中发明人选用200μM的所述材料(低氧条件下对 MDA-MB-231细胞没有明显的毒性的浓度)处理肿瘤细胞24小时，然后孵育另外10小时，观测他们从上腔室中的膜的上侧爬行迁移现象。
试验例3
本试验例用于说明本发明纳米材料的CA IX介导内吞纳米纤维的细胞实验。
(1)共聚焦免疫荧光成像：使细胞在玻璃表面上生长并用药物材料处理指定的时间。在与一抗在4℃温育过夜之前，将细胞用4％多聚甲醛固定，用0.1％Triton X-100处理并用2％BSA封闭。用PBS洗涤后，将每个样品与二抗在室温下孵育约2小时。之后，每个样品进行第二轮洗涤，并用DAPI染色缓冲液处理约5分钟。最后，洗涤载玻片并立即用抗褪色介质固定。
通过共聚焦显微镜荧光成像可知，所述材料处理乏氧肿瘤细胞24小时后，将显著增加细胞的内吞囊泡数量。同时，其内吞囊泡与CA IX酶共定位情况优于对照组；所述材料处理乏氧肿瘤细胞48小时后则进一步造成酸性囊泡的肿胀与损伤，最终使材料在乏氧肿瘤细胞的胞浆中富集。图5示出了所述材料处理后(N-pepABS(+)组)的结果，其中，图5(A)示出了乏氧肿瘤细胞出现显著数量的CA IX和内吞囊泡的荧光共定位，继而图 5(B)示出了乏氧肿瘤细胞出现酸性囊泡溶胀，然后图5(C)示出了荧光染色证实乏氧肿瘤细胞内酸性囊泡出现损伤，以及图5(D)电镜图像展示乏氧细胞的胞浆内观察到大量纳米纤维结构。
本试验例中采用15mM所述材料溶解于pH 9.0水溶液，再稀释于细胞培养液，终浓度控制在200μM～500μM，pH值保持在7.4；
本试验例中本发明人选用三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞，并使其保持在1.0％浓度的O2和5％浓度的CO2环境中培养。
(2)流式细胞学实验：将每种处理的细胞与2.5μM溶酶体标记物在 37℃下孵育40分钟。收集细胞并洗涤后，用Accuri C6流式细胞仪检测每个细胞中溶酶体标记物的强度。图6B示出了流式结果证实所述材料 (N-pepABS)处理造成的酸性囊泡损伤，并且损伤程度与CA IX表达量正相关。
(3)Westen Blots实验：收集细胞，洗涤两次，然后用裂解缓冲液重悬。通过加热用SDS上样缓冲液变性后，上载等量的蛋白质样品并用SDS PAGE胶分离。然后将蛋白质从PAGE转移到PVDF膜上。在用5％无脂牛奶封闭后，将膜与一抗在4℃温育过夜。第二天，用TBST洗涤膜3次，然后在室温下与HRP缀合的第二抗体一起温育约2小时。在第二轮洗涤后，用ECL反应缓冲液处理膜，并观察每个条带。
图3b示出了乏氧肿瘤细胞中CA IX的mRNA和蛋白水平。图6A示出了通过基因干扰实验降低乏氧肿瘤细胞中CA IX的表达量。
(4)敲除CA IX蛋白的基因转染实验：MDA-MB-231细胞在6孔板中孵育约12小时，然后进行转染实验。在siRNA和转染试剂在Opti-MEM 中充分混合后，用该混合物将细胞转染约6小时。然后用完全培养基替换 Opti-MEM。将细胞暴露于不同的处理组后培养过夜。Lipofectamine 2000 Transfection Reagent购自Thermo Fisher，而siRNA序列 (5'-GGAAGAAAUCGCUGAGGAA-3')及其阴性对照(NC)购自 GenePharma；
(5)细胞内/细胞外纳米纤维的定量分析：用MDA-MB-231细胞进行不同材料处理后，裂解细胞，并分离细胞裂解物和膜残余物，然后用1.2mL 甲醇和dd H2O(5：1)的混合物萃取。制备浓度为1μM，2μM，5μM， 10μM，20μM，50μM的材料小分子的标准样品以获得校准曲线。通过LC20AT UHPLC(Shimadzu corporation，Japan)分析每个样品，梯度洗脱水和乙腈(0.1％TFA)作为流动相。洗脱程序如下：0-20分钟，60-100％，流速为1mL/min，注射体积为10μL。
UHPLC对乏氧肿瘤细胞膜与肿瘤细胞裂解液的结果分析证实了，所述材料处理48小时后，无论是乏氧肿瘤细胞膜上，还是细胞的胞浆内，都富集了更多的短肽修饰的CA抑制剂小分子。与此同时，通过降低CA IX蛋白酶在乏氧肿瘤细胞膜上的表达，实验发现所述材料的富集也随之显著降低，指示对CA IX酶表达的依赖性，亦证实了所述材料对乏氧肿瘤细胞的靶向性与特异性(图6)。
(6)本发明通过监测乏氧条件下肿瘤细胞保护性自噬的相关信号通路，证实了CAIX酶介导的自组装纳米纤维的内吞作用，将进一步阻断乏氧肿瘤细胞中保护性自噬的正常功能。
通过检测自噬起始标记物Atg5的表达，我们观察到所述材料在乏氧条件处理48小时后，Atg5/GADPH的mRNA水平比例上调了5倍(图7A)，远胜于常氧中的变化。微管相关蛋白(LC3B)抗体成像(图7B)进一步证实自噬体积聚在乏氧肿瘤细胞的细胞质中。此外，P62是自噬的常见降解底物之一，通常会随着自噬体积聚而呈现递减信号。然而，图7C未显示任何显着的P62下调，表明细胞内的自噬流可能被阻断。
此外，发明人通过巴弗洛霉素A1(10nM Baf)预处理肿瘤细胞1h，抑制溶酶体和自噬体的融合，随后，即便与所述材料在乏氧条件下孵育48 小时也不再引起LC3B的增加。这不仅证实了乏氧条件下所述材料会阻断肿瘤细胞的自噬作用，而且还暗示其阻断机制应该与溶酶体损伤相关联。相反，这种抑制溶酶体和自噬体融合的Baf预处理手段，可以在常氧条件下显着增加所述材料处理后引起的LC3B积聚，表明原先的实验结果中，所述材料在常氧条件下只造成了有限的溶酶体损伤。另外，图7D还通过 Westen Blots实验显示了切割PARP蛋白的改变，表明所述材料处理的乏氧细胞中的自噬具有保护作用。因此，相关保护性自噬的阻断应该是所述材料对乏氧肿瘤细胞具有选择性抑制作用的另一个重要原因。
试验例4
本试验例用于说明本发明纳米材料的动物实验。
根据中国科学院的机构动物使用和护理委员会建立和分析动物模型。向皮下注射约4-6周龄的雌性裸鼠皮下注射癌细胞。在可检测到肿瘤后，将小鼠随机分成几组，这取决于每只小鼠的肿瘤体积(长度×宽度^2/2)。然后用不同的化学品，PBS或dox处理异种移植物。处理数天后，处死小鼠，同时收集每个器官或肿瘤用于进一步分析。
(1)本发明人进行动物实验证明这种材料发明在活体内的抑制乏氧微环境的治疗效果：
采用携带乳腺癌异种移植的裸鼠模型，其中皮下注射107个 MDA-MB-231细胞。本发明人首先让小鼠承受平均体积达250mm3的肿瘤，确保在肿瘤组织内形成足够的乏氧区域，然后每四天通过肿瘤内注射给予治疗(1mM，10μL)。在处理小鼠32天后，本发明人收集它们的肿瘤组织并通过免疫荧光测定特异性地分析乏氧区域(图9)。CA IX和HIF-1α作为特征性生物标志物，在溶剂对照组中远离实体瘤血管的区域中过表达(染成红色)。然而，只有所述材料处理组显著削弱了HIF-1α和CA IX的信号，意味着成功减轻了实体肿瘤内的乏氧程度。值得注意的是，其余对照组的治疗均未表现出类似的抑制乏氧功效。此外，在所述材料处理组中出现了自噬体积聚的独特增加，如LC3B的点状结构。同时，所述材料处理组中的癌细胞增殖活性比其它对照组更低，也与先前的体外细胞实验一致。因此，所述材料确实对体内乏氧肿瘤具有相当大的治疗效果，对溶剂对照组具有统计学显着性(**P<0.01)。
(2)本发明人通过动物实验进一步验证所述发明材料的潜在抑制肿瘤细胞转移与抑制肿瘤组织血管生成的体内治疗应用，如图10所示。图10 示出了肿瘤转移模型中，图10(A)示出了所述材料处理组(N-pepABS) 显著减少小鼠肺叶组织中出现的转移灶数量，图10(B)示出了和溶剂对照组(Con)相比展现了具有统计选差异的抑制肿瘤转移效果；所述材料处理后，图10(C)和图10(D)示出了肿瘤组织内(C)乏氧相关CA IX信号和(D)肿瘤血管组织相关生物标记物CD31均展示出显著差异。
本发明人关注鼠4T1乳腺癌细胞的同源小鼠模型。在皮下注射105个 4T1癌细胞后，健康的BALB/c小鼠在治疗之前承受平均大小约100mm3的肿瘤。然后每2天在肿瘤内给予药物处理(1mM，10μL)。经过21天的治疗，所述材料有效降低肿瘤体积和重量，具有统计学意义。同时，流式细胞术实验定量分析三个随机的肿瘤组织中的CA IX表达结果，其统计分析进一步证实了所述材料对4T1乳腺癌的抗乏氧功能。更重要的是，所述材料确实在该动物模型中表现出显着的抗肿瘤转移功效。随后，本发明人随机抽取每组3只小鼠，然后通过HE染色实验仔细观察和分析其肺组织的器官结构。黑色箭头指出在每个肺叶中检测到的肿瘤病变。本发明人统计分析了肺组织中转移的数量，直接证明了所述材料的显著抗肿瘤转移功能。在检测肿瘤组织中的血管内皮标记物CD31后，本发明人进一步发现了所述材料的抗肿瘤组织内血管生成功效。CD31免疫荧光图像显示对照组中肿瘤血管的完整结构，所述材料处理后，肿瘤血管荧光则变得破碎且微弱，提示本发明所述材料在抗肿瘤组织血管生成中的潜在应用。
(3)抑制CA IX治疗推进了常规化疗应用。本发明人开发了所述材料与传统临床化疗药物的联合治疗，本实施例中采取低剂量使用阿霉素。
本发明人建立了肿瘤异种移植的裸鼠模型，其中裸BALB/c小鼠接受皮下注射107个MDA-MB-231细胞，然后在任何处理之前钻出平均尺寸大于100mm3的肿瘤。如图11所示，本发明人静脉给予小鼠相对低剂量的Dox (2.0mg/kg，每4天)，其显示出对肿瘤生长有限的抑制效果。将所述材料同时施用于小鼠肿瘤内(1mM，10μL，每2天)，并将模型处理24天以监测肿瘤生长和组织病理学。基于图11B，Dox给药在前两周治疗期间几乎不展现任何有效治疗，而单独的所述材料处理对延迟肿瘤生长具有一些作用。然而，所述材料和Dox的联合使用已经实现了肿瘤体积的显着降低，并且这种抗肿瘤作用在整个治疗期间持续存在。这表明所述材料处理后可以有效地使肿瘤对Dox给药敏感，从而加速常规化疗治疗效果。图11B和图11C都证实了所述材料和Dox联合治疗的最强抗肿瘤效力，其在24天后显着降低了肿瘤的重量和体积。此外，该组合治疗确实表现出比其他治疗组更严重的坏死区域(图11E)和肿瘤组织内更少的细胞增殖(图11F)。 Western印迹分析，证实了该组合治疗后，整个实体瘤范围内出现了较低水平的CA IX表达。免疫荧光染色显示了它们关于CA IX的抗血管生成性能。涉及所述材料的两个治疗组都会破坏肿瘤组织内的完整血管(图11G)，暗示增强的抗肿瘤功效的潜在机制。总的来说，一旦本发明人通过所述材料处理破坏实体瘤的乏氧微环境，即使在相对低剂量的情况下，Dox治疗也可能令人惊讶地表现出显着的抗肿瘤性能。
(4)此外，本发明还评估了所述材料在动物实验中的安全性。
所述材料治疗组在小鼠体重和器官结构方面均未出现明显异常，确保其在体内应用中的生物相容性；
优选地，本发明人监测联合治疗组的毒性作用。在整个治疗期间，联合治疗没有小鼠死亡。与对照组比较后，所述材料和Dox的联合使用并未明显降低小鼠的体重。血液生化指标(如丙氨酸转氨酶，天冬氨酸转氨酶和肌氨酸酐)进一步反映了在所述材料和Dox联合治疗后没有明显的肝脏和肾脏严重损伤。图12(A)示出了所述材料处理后的小鼠生物安全性评价，包括体重与各类脏器机构均未出现异常；图12(B)示出了所述材料与低剂量Dox联合治疗后的小鼠生物安全性评价，包括体重、肝功能和肾功能都未出现显著异常。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (11)

1.一种靶向乏氧肿瘤的短肽小分子自组装纳米材料，其特征在于，所述纳米材料为短肽修饰的小分子碳酸酐酶抑制剂，其中，所述碳酸酐酶抑制剂为4-(2-氨乙基)苯磺酰胺；
所述自组装纳米材料的化学结构式如下：
Figure FDA0003493651170000011
2.根据权利要求1所述的纳米材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)活化所述碳酸酐酶抑制剂；
(2)通过标准固相肽合成方法制备所述短肽；
(3)将步骤(1)所得活化的碳酸酐酶抑制剂与步骤(2)所制得的短肽在室温下在水和甲醇混合溶液中反应得到所述纳米材料的自组装前体小分子；和
(4)室温下在水溶液中自组装得到所述纳米材料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述纳米材料在溶液中的重量百分比为0.2wt％～1.0wt％。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中还包括以下步骤：
提纯步骤(3)中所得自组装前体小分子，确认所得小分子的结构与纯度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提纯方法为高效液相色谱法。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，通过调节不同pH获得不同形态的纳米材料；
其中，所述自组装短肽小分子在pH 9.0的条件下为澄清溶液；在pH 7.0～6.5的条件下自组装成为直径为10nm～15nm的纳米纤维，并形成水凝胶；在pH5.5～5.0的条件下自组装成直径为200～500nm的纳米纤维。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：
如权利要求1所述的纳米材料。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：根据权利要求2至6中任一项所述的制备方法而制得的纳米材料和药学上可接受的载体。
9.权利要求1所述的纳米材料或按照权利要求2至6中任一项所述的制备方法而制得的纳米材料在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为特异性高表达CAIX蛋白酶的乏氧肿瘤。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述乏氧肿瘤选自以下一种或多种癌症：肺癌，结肠癌，乳腺癌，宫颈癌，膀胱癌，卵巢癌，脑部胶质瘤，口腔癌。
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