CN113797335B - 基于多肽的自组装光敏纳米纤维材料及其制备方法、在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

基于多肽的自组装光敏纳米纤维材料及其制备方法、在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于多肽的自组装光敏纳米纤维材料(CFTNFs)，其主要由二苯丙氨酸短肽FF、细胞穿透肽CPP44和卟啉光敏剂共价偶联得到。该CFTNFs不仅在体外对HepG2细胞表现出优异的光毒性，会引起更多的HepG2细胞凋亡和坏死；而且具有肿瘤靶向能力、改善肿瘤滞留情况和抑制肿瘤增殖，在体内展现出更好的抗肿瘤增殖活性，可以显著提高光动力治疗效果，有望用于光动力抗肿瘤药物的研发。本发明还公开了该CFTNFs的制备方法、在制备抗肿瘤药物中的应用。制备方法的操作简单，过程容易控制，成功构建了基于二苯丙氨酸短肽、细胞穿透肽和卟啉光敏剂共价偶联的CFTNFs纳米纤维材料，且制备得到的产品纯度高。

Description

基于多肽的自组装光敏纳米纤维材料及其制备方法、在制备 抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于医用材料领域，具体涉及一种基于二苯丙氨酸短肽(FF)、细胞穿透肽(CPP44)和卟啉光敏剂(TPP)共价偶联的多功能多组分配合的自组装光敏纳米纤维，及其制备方法和在制备光动力抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
光动力疗法(PDT)是一种由光敏剂、氧气和特定波长的激光相结合，从而对肿瘤疾病发挥细胞毒性的临床治疗方法。PDT抗肿瘤的作用机制主要有三种：通过直接杀伤肿瘤细胞、血管损伤和介导免疫反应。PDT由于其微创性、高时空精度和有限的副作用而引起了广泛的关注。
卟啉是一类优良的光敏剂，具有独特的优势，包括相对较高的单线态氧产率和倾向于在肿瘤细胞中积累。然而，卟啉在临床治疗中更广泛的应用却受水不溶性、低细胞摄取率、肿瘤脱靶效应和皮肤光毒性的限制。这些限制促进了超分子纳米载体递送平台的发展，该平台可以改善卟啉的药代动力学特征、生物医学相关的光物理特性和肿瘤靶向能力。
因此，基于卟啉光敏剂研发一种可用于光动力抗癌的超分子纳米材料对本技术领域具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种多功能多组分配合的自组装光敏纳米纤维(CFTNFs)及其制备方法和在制备光动力抗肿瘤药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种基于多肽的自组装光敏纳米纤维材料，其主要由二苯丙氨酸短肽FF、细胞穿透肽CPP44和卟啉光敏剂(TPP)共价偶联得到，其中所述细胞穿透肽CPP44的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述的自组装光敏纳米纤维材料，所述自组装光敏纳米纤维材料的分子量为3466.49Da。
优选的，所述自组装光敏纳米纤维材料的宽度为10-20nm，长度为2-2.5μm。
二苯丙氨酸短肽FF作为自组装基元，可以辅助卟啉表现出灵活的自组装能力。
细胞穿透肽CPP44，是一个包含15个氨基酸的多肽，能够特异性靶向HepG2细胞，但其本身不具备细胞毒性，在本发明中CPP44作为靶向单元用于提高纳米纤维的组织特异性。本发明首次发现将CPP44、FF和TPP结合后，会在DMSO:H2O＝1:9的溶液中自发组装形成纳米纤维，该纳米纤维能够在630nm激光激发下在体内展现更优的肿瘤滞留效应和抗肿瘤增殖活性。
具有开发前景的CPP44-FF-TPP的分子量为3466.49Da(M+H+)。利用透射电子显微镜观察证明到CFTNFs的丝状形态。有趣的是，自组装后形成的CFTNFs不仅在体外对HepG2细胞表现出优异的光毒性，会引起更多的HepG2细胞凋亡和坏死；而且具有肿瘤靶向能力、改善肿瘤滞留情况和抑制肿瘤增殖，在体内展现出更好的抗肿瘤增殖活性，有望用于抗肿瘤药物的研发。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种自组装光敏纳米纤维材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)向含有卟啉光敏剂的DMF溶液中，再加入二乙醇酸酐，在室温下避光搅拌反应，然后依次向溶液中加入CHCl3、水，得到的产物进行萃取，收集有机相进行洗涤、浓缩、干燥，得到DA-卟啉光敏剂；
(2)采用Rink Amide树脂通过Fmoc固相多肽合成法制备细胞穿透肽CPP44，并进一步加入二苯丙氨酸短肽FF合成CPP44-FF肽基树脂；
(3)将所述DA-卟啉光敏剂加入DMF溶液中混合，然后加入DIPEA、HOBt和TBTU，混合反应后，再加入所述CPP44-FF肽基树脂，在室温下摇动反应，得到的树脂使用三氟乙酸/苯甲硫醚/苯甲醚混合液进行裂解反应后，在冷乙醚中沉淀，再用水将沉淀溶解后过滤，得到的上清液经过进一步分离纯化，得到CPP44-FF-卟啉光敏剂；
(4)将所述CPP44-FF-卟啉光敏剂加入DMSO溶液中，与水混合，进行低温老化，然后对其进行透析、超滤，收集保留在超滤管上管中的产物，即得到所述的自组装光敏纳米纤维材料(CFTNFs)。
上述的制备方法，优选的，所述步骤(1)中，所述卟啉光敏剂与二乙醇酸酐的摩尔比为1-2:3，反应时间为20-28h；所述萃取采用的萃取剂为CHCl3，洗涤采用的洗涤剂为水。
优选的，所述步骤(2)的具体操作包括如下步骤：首先将RinkAmide树脂放入盖好底盖的合成柱中，加入DMF进行活化，抽干后加入哌啶溶液于合成柱中，摇动反应，抽干后用DMF洗涤，吸干后得到树脂；然后将HCTU、HOBt和氨基酸溶于N-甲基吗啉溶液中后转移到合成柱中与所述树脂混匀，摇动反应，抽滤，DMF洗涤，抽干；按照上述方法，依次加入组成细胞穿透肽CPP44和二苯丙氨酸短肽FF的氨基酸，直到最后一个氨基酸偶联完成，得到CPP44-FF肽基树脂。
优选的，所述步骤(3)中，所述DA-卟啉光敏剂、DIPEA、HOBt和TBTU的摩尔比为0.4-0.6:1:1:1；所述DA-卟啉光敏剂与CPP44-FF肽基树脂的摩尔比为0.4-0.6:2；所述三氟乙酸/苯甲硫醚/苯甲醚混合液中，三氟乙酸、苯甲硫醚、苯甲醚的体积比为95:3:2；所述混合反应的时间为15-30min，所述摇动反应的时间为20-28h，所述裂解反应的时间为120-180min；所述过滤采用的滤头尺寸0.22μm，所述分离纯化采用的色谱柱为C18 RP-HPLC。
优选的，所述步骤(4)中，CPP44-FF-卟啉光敏剂加入到DMSO溶液中后，所含CPP44-FF-卟啉光敏剂的浓度为30mg mL-1；所述DMSO溶液与水的体积比为1:9；所述低温老化的温度为2-6℃，时间为20-28h。
优选的，所述步骤(4)中，所述透析、超滤具体包括如下步骤：将低温老化后得到的溶液密封在截留分子量为5kDa的透析袋中，并浸入纯水中36-48h，每2-3h换一次水；然后，将得到的产物转移到截留分子量为10kDa的超滤管中，并以10000rmp离心20-30min。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种自组装光敏纳米纤维材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的自组装光敏纳米纤维(CFTNFs)，不仅在体外对HepG2细胞表现出优异的光毒性，会引起更多的HepG2细胞凋亡和坏死；而且具有肿瘤靶向能力、改善肿瘤滞留情况和抑制肿瘤增殖，在体内展现出更好的抗肿瘤增殖活性，可以显著提高光动力治疗效果，有望用于光动力抗肿瘤药物的研发。
2、本发明的制备方法，操作简单，制备过程容易控制，成功构建了基于二苯丙氨酸短肽、细胞穿透肽和卟啉光敏剂共价偶联的CFTNFs纳米纤维材料，且制备得到的产品纯度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为CPP44-FF-TPP的分离纯化和鉴定结果；其中：A为分离纯化结果；B为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定结果。
图2为CFTNFs纳米纤维的表征图；其中：A为CFTNFs的水合粒径图和透射电镜图(插图)；B为CFTNFs在水中和CPP44-FF-TPP在DMSO中的紫外吸收光谱；C为CFTNFs在水中和CPP44-FF-TPP在DMSO中的荧光发射光谱；D是利用SOSG荧光探针在胞外评估TPP和CFTNFs的活性氧产生情况。
图3为CFTNFs在HepG2细胞内产生活性氧的激光共聚焦扫描电镜图(CLSM)。
图4为HepG2细胞对TPP和CFTNFs的细胞内化行为结果；其中：A和C分别代表了HepG2细胞在不同时间间隔对CFTNFs摄取的CLSM观察图和流式细胞计数图；B和D分别代表了HepG2细胞对不同处理PBS、TPP和CFTNFs摄取的CLSM观察图和流式细胞计数图。
图5为TPP和CFTNFs对HepG2细胞的光动力活性评估结果；其中：A是CFTNFs的光动力活性和暗毒性评估；B是TPP的光动力活性和暗毒性评估；C是流失细胞仪测定TPP和CFTNFs在激光或无激光照射下诱发HepG2细胞的凋亡率；D是HepG2细胞在不同处理下利用Calcein AM/PI双染荧光成像图。
图6为TPP和CFTNFs在异种移植HepG2荷瘤小鼠体内的荧光成像和生物分布图；其中：A是小鼠尾静脉注射TPP或CFTNFs后不同时间段的活体成像图；B是在尾静脉注射药物10h后将小鼠脏器(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤解剖后的荧光成像图。
图7为荷瘤模型的实验；其中：A是在10天治疗中肿瘤体积变化图；B是小鼠在给药期间的体重变化图；C是肿瘤解剖后，肿瘤的重量图；D是肿瘤解剖图。
图8为荷瘤小鼠在10天观察期内的肿瘤局部拍照记录图。
图9为荷瘤模型小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的H&E染色图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种基于多肽的自组装光敏纳米纤维材料(CFTNFs)，其主要由二苯丙氨酸短肽(FF)、细胞穿透肽(CPP44)和卟啉光敏剂(TPP)共价偶联得到，其中所述细胞穿透肽(CPP44)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。其制备方法的操作步骤如下：
(1)CPP44-FF-TPP的合成、纯化与鉴定
DA-TPP：向含有TPP(100mg，0.16mmol)的DMF(1ml)溶液中加入二乙醇酸酐(55mg，0.48mmol)，在室温下避光搅拌反应24h。然后向溶液中加入10mL CHCl3，再加入150ml蒸馏水。产物经分液漏斗用CHCl3(10mL×3)萃取，合并的有机相用水洗涤3次，再通过旋转蒸发仪浓缩产物，最后真空干燥，得到100mg(84％)的DA-TPP。
CPP44-FF：采用Rink Amide树脂通过Fmoc固相多肽合成法制备CPP44以及CPP44-FF。合成规模为0.2mM，首先将0.3g的树脂放入盖好底盖的合成柱中，加入5mLDMF活化30min，抽干后加入5ml 20％的哌啶于合成柱中，摇动反应2次(7min+8min)，抽干后用DMF洗涤8次，吸干。分别称量1mM的HCTU和HOBt以及0.8mM的氨基酸溶于5％的N-甲基吗啉中后转移到合成柱中与树脂混匀，摇动反应1h，抽滤，DMF洗涤8次，抽干。按照上述方法，依次加入需要反应的氨基酸，直到最后一个氨基酸偶连完成，得到CPP44-FF肽基树脂，将连有树脂的多肽存放于4℃冰箱用于后续偶联反应。
CPP44-FF-TPP：向含有DA-TPP(0.04mmol)的DMF(3mL)溶液中加入DIPEA(N,N-二异丙基乙胺，0.1mmol)、HOBt(1-羟基苯并三唑，0.1mmol)和TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸，0.1mmol)。混合物反应20min后，将CPP44-FF肽基树脂。(0.2mmol)加入合成器中。混合物在室温下摇动反应24h，即可得到绿色树脂。使用三氟乙酸/苯甲硫醚/苯甲醚(95/3/2(v/v))裂解150min后，在冷乙醚中沉淀，即可得到产物的粗品。用20ml双蒸水将其溶解后，8000rpm/5min，用0.22μm的滤头过滤，得到的上清液用C18 RP-HPLC进行分离纯化(图1A)(美国Waters公司，Alliance HPLC&Millennium高效液相色谱工作站，2690溶剂输送系统，996PDA检测器，分离柱：反相柱，Vydac，C18，4.6mm×250mm；洗脱液分别为：A液(0.1％TFA/H2O)、B液(0.1％TFA/ACN)；洗脱梯度，0-20min，20-60％B液；流速，1ml/min；温度，40℃)，在215nm和280nm下监测多肽的洗脱，收集洗脱峰，冻干，并用质谱测定其分子量。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定CPP44-FF-TPP的分子量分别为3466.49Da(图1B)。
(2)CFTNFs纳米纤维的制备
CFTNFs纳米纤维的制备如下：取400μL 30mg mL-1的含有CPP44-FF-TPP的DMSO溶液与3600μL纯水混合，在4℃冰箱老化24h，然后对其进行透析。对于透析，将4mL CPP44-FF-TPP溶液密封在透析袋中(截留分子量：5kDa)并浸入2L纯水中48h；最初，每2h换一次水，总共换水6次。然后，将得到的CFTNFs转移到超滤管中(截留分子量：10kDa)并以10000RPM离心20min。最后，收集保留在超滤管上管中的CFTNFs用去离子水重新分散。
(3)CFTNFs的物化表征方法
用动态光散射分析仪(DLS)对CFTNFs的水合粒径进行测定，将样品用去离子水稀释到0.3mg mL-1进行测定，结果显示CFTNFs的水合粒径大小约为2458nm(图2A)。
用透射电子显微镜(TEM)对CFTNFs的形貌进行观察，首先用去离子水将CFTNFs稀释到0.3mg mL-1，取30μl溶液滴到铜网上，将铜网放置37℃烘箱中30min使样品充分干燥，再用TEM观察样品的微观形貌，观察到了宽度为10-20nm长度约为2-2.5μm左右的纳米纤维样结构(图2A的插图)。
测试了CFTNFs在水中以及CPP44-FF-TPP在DMSO中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，紫外吸收光谱的结果表明相比于DMSO中的单体CPP44-FF-TPP(图2B)，水中聚集体CFTNFs的Soret带发生红移和加宽。同时，水溶液中CFTNFs的荧光被完全淬灭(图2C)，表明分子发生了聚集。这些结果都证实了CFTNFs纳米纤维的成功构建。
CFTNFNs成功合成后以及物化表征完成后，为了进一步探究CFTNFNs的光动力治疗活性，我们分别在体外和体内对CFTNFNs的活性探究进行了相关实验，实验中以TPP做为对照，实验的开展都是严格按照标准化研究所进行。
1、主要材料和仪器
DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibco公司，CCK8试剂盒和DCFH-DA荧光探针购自碧云天，96孔板购自Corning公司，Calcein-AM/PI双染试剂盒购自上海懋康生物科技有限公司，苏木精染色液和伊红染色液购自广东翁江化学试剂有限公司。HepG2细胞从中科院上海细胞库中购买。5周雄性BALB/c-nu小鼠，SPF级别，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。
2、实验结果和讨论
2.1 CFTNFs单线态氧生成以及观察
我们使用商业化的单线态氧生成检测探针(SOSG)来评估激光照射下CFTNFs的单线态氧产生能力。与自由TPP相比，在被630nm 0.3W cm-2的激光强度照射不同时间下，CFTNFs显示出更高的单线态氧生成能力(图2D)。这些结果表明，CFTNPs可以有效促进单线态氧的产生。我们利用2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光染料进一步评估CFTNFs在激光照射下的细胞内活性氧(ROS)生成能力。如图3所示，与对照组相比，CFTNFs组在激光照射5min后可以在荧光显微镜下观察到强烈的绿色荧光。然而，在没有激光照射的情况下，CFTNFs中的绿色荧光可以忽略不计，这与前面的结果一致。这些结果表明CFTNFs可以在激光照射过程中在细胞外和细胞内产生有效的ROS。
2.2 HepG2细胞对CFTNFs摄取的探究
我们通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞术(FCM)探索了HepG2细胞对CFTNFs的时间依赖性摄取行为。如图4A所示，CFTNFs的红色荧光几乎位于细胞质中，并且荧光强度随着时间的延长而逐渐增加。流式细胞术结果分析表明，随着孵育时间的延长，CFTNFs的荧光信号发生偏移(图4C)。这些结果表明CFTNFs可以有效地通过时间依赖性行为被摄取。此外，我们还研究了HepG2细胞对自由TPP和CFTNFs的摄取行为。通过CLSM的图像显示，与自由TPP相比，CFTNFs表现出更高的细胞内化行为(图4B)。流式细胞术分析显示，CFTNFs比自由TPP组展示更强的荧光强度(图4D)，这些结果都表明自组装肽基纳米纤维可以有效地增强癌细胞的细胞摄取行为。
2.3 CFTNFs对HepG2肝癌细胞的细胞毒活性
我们以上的研究表明CFTNFs可以在细胞内产生ROS，因此采用CCK-8法来评估CFTNFs和TPP对HepG2的细胞毒性。如图5A和5B所示，分别用不同浓度的CFTNFs和TPP孵育HepG2细胞24h。有趣的是，CFTNFs和TPP的IC50值分别为0.167μM和>50μM。在630nm激光照射下，CFTNFs表现出比自由TPP更好的光活性，这与ROS产生能力的结果是一致的。相反，在没有630nm激光照射的情况下，CFTNFs和TPP的细胞活力变化都可以忽略不计，表明CFTNFs具有优异的生物相容性。总之，这些结果表明CFTNFs具有较高的光毒性和较低的暗细胞毒性，有利于光动力抗癌治疗。此外，采用Fluor 647-Annexin V/PI方法通过流式细胞术测定CFTNFs引起HepG2细胞的凋亡和坏死情况。结果如图5C所示，对照处理显示在有或没有激光照射的情况下，细胞凋亡可忽略不计，表明了激光强度对细胞是安全的。在没有激光照射的情况下，CFTNFs和TPP处理也几乎没有显示出细胞凋亡。然而，流式细胞术分析表明，在630nm激光照射5min后，CFTNFs和TPP诱导的凋亡细胞比例分别为58.5％和17.22％。这些结果都表明CFTNFs仅在激光照射条件下能够诱导HepG2细胞凋亡，CFTNFs引起的细胞凋亡率远高于自由TPP所引起的，这与细胞毒性结果一致。此外，我们也采用Calcein-AM/PI死活细胞双染试剂盒来探究CFTNFs的细胞毒活性，以直观地检测PDT的效果。PI的红色荧光和Calcein-AM的绿色荧光分别代表死细胞和活细胞。用1μM的CFTNFs和TPP分别处理HepG2细胞4个h。正如预期的那样，CFTNFs组在照射5min后呈现红色染色，而TPP组和对照组都仍然保持绿色(图5D)，表明CFTNFs组发生了更强的光损伤。这些结果可能是由于CFTNFs更高的细胞摄取和更强的细胞内ROS产生。总之，以上实验结果，ROS生成能力、CCK-8测定、流式细胞术测定以及Calcein-AM/PI染色测定的结果都是一致的，都表明了CFTNFs是卓越的光动力纳米材料，具有转化为临床抗癌应用的潜能。
2.4 CFTNFs在体内的成像及分布
TPP固有的红色荧光有利于通过体内成像系统评估CFTNFs在HepG2荷瘤裸鼠体内的荧光成像和体内分布。如图6A所示，我们采用静脉注射CFTNFs或TPP，1h后可在肿瘤部位观察到荧光信号，并且荧光强度可以维持到10h，表现出优异的肿瘤滞留能力。然而，作为对照组的自由TPP不具有肿瘤靶向性。静脉注射10h后，将TPP治疗组和CFTNFs治疗组小鼠处死，切除主要器官(心、肝、脾、肺、肾)以及肿瘤，再次评价肿瘤靶向效果和组织分布情况。与自由TPP相比，CFTNFs在肿瘤部位显示出更强的荧光强度。然而，自由TPP主要积累到肝脏和肾脏(图6B)。与自由TPP一样，CFTNFs也被肝脏和肾脏捕获和代谢，导致肝脏和肾脏中CFTNFs的强荧光信号。这些结果都表明了CFTNFs相较于自由TPP展现了优越的肿瘤靶向能力和肿瘤滞留能力。
2.5 CTFNFs在体内的光动力疗效
基于体内成像的结果，我们证实了CFTNFs具有在肿瘤部位积累和滞留的能力。为了实现对CFTNFs的抗癌活性进一步探究，本实验建立了HepG2肝癌细胞的异种移植荷瘤模型来评价其体内抑瘤效果。整个实验观察持续10天，分别在第1天、第3天和第5天进行尾静脉给药处理，在尾静脉注射10h后，CFTNFs和TPP处理的小鼠被630nm激光以0.3W cm-2照射10min。我们在10天内每两天记录一次肿瘤体积和体重。如图8所示，肿瘤成功被消融，肿瘤部位留下深色烧伤疤痕，但其他组肿瘤无明显变化。值得注意的是，CFTNFs+激光治疗组的肿瘤在整个3次治疗中几乎被完全抑制，而CFTNFs的注射对肿瘤生长的影响可以忽略不计(图7A)。TPP+激光治疗组的肿瘤对肿瘤生长表现出中等的抑制作用，在治疗期内也表现出缓慢的生长。在10天的治疗结束后，对小鼠实行断颈处死，将瘤子解剖出来进行称重，从图7D中可直观的发现，CFTNFs+激光治疗的瘤子明显小于其他五组，从图7C的瘤重统计数据中可看出，CFTNFs+激光治疗组的瘤子重量与对照组相比有显著学差异。此外，各个处理组的老鼠没有表现出显着的体重减轻(图7B)，表明没有引起全身毒性。为了进一步评估CFTNFs的生物相容性，我们在观察结束时采集了各个处理组的主要器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏并且对器官进行苏木精和伊红(H&E)染色以进行组织病理学检查。结果如图9所示，所有组织中都没有明显的组织病理学异常，表明CFTNFs在体内应用是安全的。这些结果都证实了CFTNFs是一种有效且安全的光动力抗癌纳米纤维。
以上实验结果表明，与自由TPP相比，CFTNFs在HepG2细胞中表现出更高的细胞摄取能力；在体内实验中，CFTNFs比自由TPP表现出更好的肿瘤靶向能力；此外，CFTNFs在体外会引起更多的HepG2细胞凋亡和坏死并且在体内展现出更好的抗肿瘤增殖活性。总体而言，CFTNFs可以显著提高光动力治疗效果，可以进一步用于制备抗肿瘤药物。
总之，将自组装短肽、细胞穿透肽和小分子光敏剂结合起来构建优异的光敏纳米材料是一个充满创新性的策略。此外，这可能为设计高效和智能的光动力治疗剂铺平道路，并可能最终推动多种癌症的临床治疗。也就是说，本发明为开发基于多肽的多组分多功能配合的自组装光动力纳米纤维以增强肿瘤特异性递送和抗癌效率提供了新的思路和方法。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 基于多肽的自组装光敏纳米纤维材料及其制备方法、在制备抗肿瘤药物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Arg Pro Thr Met Arg Phe Arg Tyr Thr Trp Asn Pro Met Lys
1 5 10 15

Claims (9)

1.一种基于多肽的自组装光敏纳米纤维材料，其特征在于，其主要由二苯丙氨酸短肽FF、细胞穿透肽CPP44和卟啉光敏剂共价偶联得到，其中所述细胞穿透肽CPP44的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述自组装光敏纳米纤维材料的宽度为10-20nm，长度为2-2.5μm。
2.根据权利要求1所述的自组装光敏纳米纤维材料，其特征在于，所述自组装光敏纳米纤维材料的分子量为3466.49Da。
3.一种如权利要求1或2所述的自组装光敏纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）向含有卟啉光敏剂的DMF溶液中，再加入二乙醇酸酐，在室温下避光搅拌反应，然后依次向溶液中加入CHCl3、水，得到的产物进行萃取，收集有机相进行洗涤、浓缩、干燥，得到DA-卟啉光敏剂；
（2）采用Rink Amide树脂通过Fmoc固相多肽合成法制备细胞穿透肽CPP44，并进一步加入二苯丙氨酸短肽FF合成CPP44-FF肽基树脂；
（3）将所述DA-卟啉光敏剂加入DMF溶液中混合，然后加入DIPEA、HOBt和TBTU，混合反应后，再加入所述CPP44-FF肽基树脂，在室温下摇动反应，得到的树脂使用三氟乙酸/苯甲硫醚/苯甲醚混合液进行裂解反应后，在冷乙醚中沉淀，再用水将沉淀溶解后过滤，得到的上清液经过进一步分离纯化，得到CPP44-FF-卟啉光敏剂；
（4）将所述CPP44-FF-卟啉光敏剂加入DMSO溶液中，与水混合，进行低温老化，然后对其进行透析、超滤，收集保留在超滤管上管中的产物，即得到所述的自组装光敏纳米纤维材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述卟啉光敏剂与二乙醇酸酐的摩尔比为1-2:3，反应时间为20-28h；所述萃取采用的萃取剂为CHCl3，洗涤采用的洗涤剂为水。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体操作包括如下步骤：首先将Rink Amide树脂放入盖好底盖的合成柱中，加入DMF进行活化，抽干后加入哌啶溶液于合成柱中，摇动反应，抽干后用DMF洗涤，吸干后得到树脂；然后将HCTU、HOBt和氨基酸溶于N-甲基吗啉溶液中后转移到合成柱中与所述树脂混匀，摇动反应，抽滤，DMF洗涤，抽干；按照上述方法，依次加入组成细胞穿透肽CPP44和二苯丙氨酸短肽FF的氨基酸，直到最后一个氨基酸偶联完成，得到CPP44-FF肽基树脂。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述DA-卟啉光敏剂、DIPEA、HOBt和TBTU的摩尔比为0.4-0.6:1:1:1；所述DA-卟啉光敏剂与CPP44-FF肽基树脂的摩尔比为0.4-0.6:2；所述三氟乙酸/苯甲硫醚/苯甲醚混合液中，三氟乙酸、苯甲硫醚、苯甲醚的体积比为95:3:2；所述混合反应的时间为15-30min，所述摇动反应的时间为20-28h，所述裂解反应的时间为120-180min；所述过滤采用的滤头尺寸0.22 μm，所述分离纯化采用的色谱柱为C18 RP-HPLC。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，CPP44-FF-卟啉光敏剂加入到DMSO溶液中后，所含CPP44-FF-卟啉光敏剂的浓度为30 mg mL-1；所述DMSO溶液与水的体积比为1-2:9；所述低温老化的温度为2-6℃，时间为20-28 h。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述透析、超滤具体包括如下步骤：将低温老化后得到的溶液密封在截留分子量为5kDa的透析袋中，并浸入纯水中36-48h，每2-3h换一次水；然后，将得到的产物转移到截留分子量为10kDa的超滤管中，并以10000 rmp离心20-30min。
9.一种如权利要求1或2所述或由权利要求3-8中任一项所述制备方法制备得到的自组装光敏纳米纤维材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
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