CN113041356A - 血筒素靶向载药体系、制备方法及其应用 - Google Patents

血筒素靶向载药体系、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血筒素靶向载药体系，包括血筒素、普鲁士蓝纳米颗粒、生物仿生膜包裹层和透明质酸修饰层。本发明还公开了该靶向载药体系的制备方法，包括如下步骤：合成普鲁士蓝纳米颗粒；制备生物仿生膜；使用普鲁士蓝纳米颗粒和血筒素制备普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子；使用生物仿生膜和普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子制备生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子；进行透明质酸修饰，得到本发明的血筒素靶向载药体系。该血筒素靶向载药体系能够将血筒素准确地递送到关节炎的病变部位，延长药物在关节炎病发部位的提留时间，保证治疗的安全性和有效性。此外，本发明还公开了血筒素靶向载药体系在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。

Description

血筒素靶向载药体系、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及靶向药物，具体涉及一种血筒素靶向载药体系。本发明还涉及一种血筒素靶向载药体系的制备方法及该血筒素靶向载药体系在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
背景技术
血筒是一种土家族常用的药用植物,为五味子科南五味子属植物异型南五味子Kadsura heteroclita(Roxb)Craib，常用其藤茎入药。血筒性味甘，微辛，温。具有补血活血、祛风除湿、行气止痛之功效,土家民族民间常用于治疗风湿痹痛、胃脘痛、经痛、骨痛、风湿性关节炎、腰肌劳损、感冒、产后风瘫等症。血筒素是从血筒中提取的三萜类化合物五内酯E(schisanlactone E、SE)，现有的研究认为，SE能够抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的繁殖和生长，并抑制其炎性因子的表达，具有抗类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)的作用。
类风湿关节炎是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失，导致患者丧失劳动力或者致残。类风湿关节炎目前尚无法治愈，需要进行长期的治疗。但长期的药物治疗通常会产生较强的不良反应，降低了病人对药物的耐受和影响了类风湿关节炎的长期治疗的效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种血筒素靶向载药体系，能够将血筒素递送到类风湿关节炎的病变部位，提高病变部位的药物浓度。
本发明进一步要解决的技术问题是提供一种血筒素靶向载药体系的制备方法，得到能够将血筒素递送到类风湿关节炎的病变部位的靶向药物。
本发明还要解决的技术问题是提供血筒素靶向载药体系在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种血筒素靶向载药体系，包括血筒素、普鲁士蓝纳米颗粒、生物仿生膜包裹层和透明质酸修饰层。
根据本发明，所述普鲁士蓝负载层为普鲁士蓝立方体纳米颗粒、普鲁士蓝球形颗粒或者普鲁士蓝立方体纳米颗粒与普鲁士蓝球形颗粒的混合物。普鲁士蓝(PB)是一种具有金属有机骨架(MOF)结构的纳米材料，已被美国食品和药品监督局(FDA)批准用于治疗铊和铯放射性暴露。立方体的普鲁士蓝纳米颗粒的金属有机骨架结构能够与血筒素较好的结合，将血筒素携带到类风湿关节炎的病变部位。
根据本发明，所述生物仿生膜包裹层为红细胞膜与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞膜组成的融合膜。红细胞膜(RBCM)，具有生物相容性好等特点，可以帮助包裹的材料在血液中的运输。类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞膜(RAFLSM)提取自关节炎症状态下的滑膜细胞，该细胞膜具有特殊功能的蛋白分子如CD44分子，能与关节炎病理状态的炎性滑膜组织进行靶向识别，进而聚集到病变的关节炎滑膜中，这是一种特殊的“归巢效应”。而红细胞膜与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞膜杂化成的生物仿生膜(RFM)具有两种生物膜的功能特点，在包裹了药物材料后，能够将药物材料准确递送至关节炎发病部位。
根据本发明，所述红细胞膜为大鼠红细胞膜。大鼠红细胞膜获取容易，生物相容性较好。
本发明第二方面提供了一种血筒素靶向载药体系的制备方法，包括如下步骤：S10、合成普鲁士蓝纳米颗粒；S20、制备生物仿生膜；S30、使用所述普鲁士蓝纳米颗粒和血筒素制备普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子；S40、使用所述生物仿生膜和所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子制备生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子；S50、对所述生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子进行透明质酸修饰，得到所述血筒素靶向载药体系。
根据本发明，所述生物仿生膜的制备方法包括如下步骤：S21、将大鼠红细胞溶血后，超声破碎，过滤，得到红细胞膜片段；S22、将类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞低渗裂解后，超声破碎，冻融数次，离心，得到类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞片段；S23、将所述红细胞膜片段和所述类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞片段等体积混合，加压过滤，离心，得到所述生物仿生膜。
根据本发明，所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子的制备方法为：将血筒素和所述普鲁士蓝纳米颗粒按4:1的质量比混合，搅拌，透析去除未负载的血筒素，得到所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子。
根据本发明，所述生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子的制备方法为：将所述生物仿生膜和所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子等体积混合，搅拌，使得所述生物仿生膜充分包裹所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子，离心取沉淀，重悬，得到所述生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子。
根据本发明，所述透明质酸修饰的方法包括如下步骤：S51、将透明质酸中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌活化；S52、在所述生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子中加入活化后的透明质酸和磷脂-聚乙二醇-氨基，搅拌；S53、使用透析袋透析，得到所述血筒素靶向载药体系。
本发明第三方面提供了血筒素靶向载药体系在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的血筒素靶向载药体系能够靶向聚集到病变的RAFLS细胞中，提高病变部位的血筒素浓度，增强治疗效果。同时，还可以降低血液中和身体其他部位的血筒素浓度，减轻血筒素引起的不良反应。本发明的血筒素靶向载药体系的制备方法，提供了一种血筒素靶向载药体系的制备手段，能够实现对类风湿关节炎的靶向治疗。利用本发明的血筒素靶向载药体系，可以制成多种合适的药物剂型，在对类风湿关节炎进行治疗的过程中使用。
附图说明
图1是本发明一个实施例的PB NPs扫描电镜照片；
图2是本发明一个实施例的PB NPs透射电镜照片；
图3是本发明一个实施例的RAFLSM结构形成示意图；
图4是本发明一个实施例的RBCM、RAFLSM及RFM的紫外吸收表征示意图；
图5是本发明一个实施例得到的HA@RFM@PB@SE NPs透射电镜照片；
图6是本发明一个实施例中各纳米颗粒的粒度分布曲线示意图；
图7是本发明一个实施例中各纳米颗粒的zeta电位示意图；
图8是本发明一个实施例中各纳米颗粒的大鼠溶血示意图；
图9是本发明一个实施例中各纳米颗粒对RAFLS细胞的细胞活力影响示意图；
图10是本发明一个实施例中各纳米颗粒在大鼠体内分布荧光成像图；
图11是本发明一个实施例中各纳米颗粒在大鼠内脏中分布离体荧光成像图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下通过实施例对本发明进行详细说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，本发明的保护范围并不局限于下述的具体实施方式。
在本发明的具体实施方式中：
所使用的实验细胞和动物：RAFLS细胞购自北京北纳创联生物技术研究院；SPF级SD大鼠购自湖南省斯莱克景达实验动物有限公司(合格证号：43004700063752)。
所使用的药物和试剂：铁氰化钾(K3[Fe(CN)6].3H2O)购自天津福晨化学试剂有限公司；聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)购自上海展云化工有限公司；1×PBS(磷酸缓冲盐溶液)、0.25×PBS均购于美国Gibco公司；细胞膜蛋白提取试剂盒A液和苯甲基磺酰氟(PMSF)购自Beyotime生物技术研究所，胎牛血清(FBS)、DMEM培养基和胰酶细胞消化液购于美国Gibco公司；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自美国Sigma-Aldrich生命科学技术有限公司；磷脂-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG2000-NH2)购自上海芃圣生物科技有限公司；DMSO、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；热灭活结核分枝杆菌H37Ra(美国Sigma Aldrich公司，20150411)。其他药物和试剂均为常规的市售产品。
所使用的器械和仪器，扫描电子显微镜为日本電子(JEOL)のオフィシャルサイト生产，型号：JSM-6700F；超声波细胞破碎仪为南京赛飞生物科技有限公司生产，型号：Biosafer 900-92；超纯水制备系统为英国威立雅ELGA水处理技术(上海)有限公司生产，型号：FLB00003057；Zeta电位与纳米粒度分析仪为英国Malvin仪器有限公司生产，型号：Zetasizer Nano；过滤器由美国默克密理博生命科技有限公司生产；透析袋由北京索莱宝科技有限公司生产；高速冷冻离心机(德国Eppendorf 5810R)。其他均为常见的市售产品。
本发明的实施方式中所用的超纯无菌水为由超纯水制备系统制备的18.2MΩ超纯水，PH为7.4。
实施例1
1、普鲁士蓝纳米颗粒的合成：
取铁氰化钾0.016g和PVP 2g，先后加入40mL 0.01M的HCl中，于室温下，搅拌溶解30min。将溶解后得到的黄色澄清溶液置于80℃油浴锅中静止反应20小时，得到粗制PB纳米材料。
将粗制PB纳米材料分装至1.5mL EP管，在4℃环境下以13500rpm的转速离心15分钟。离心完毕后，弃去上清液，将每两管EP管中的材料合并成1管，加入1mL无菌去离子水，充分混匀后，以同样的条件离心15分钟，再将每两管EP管浓缩成1管，得到精制的PB材料。
取0.05mg/mL精制的PB材料5μL，滴加到切割好的硅片上，置于烘箱中45℃烘干，通过扫描电子显微镜拍摄，得到如图1所示的扫描电镜照片。如图1所示，得到的PB纳米颗粒为粒径为70-80nm的立方体纳米颗粒。
对得到的PB纳米颗粒进行透射电镜拍摄，得到如图2所示的透射电镜照片。
由此可见，所得到的精制PB材料即为立方体PB纳米颗粒。
2、RBCM与RAFLSM杂化生物仿生膜的制备
2.1、大鼠全血RBCM的提取
取自大鼠的全血，用1×PBS洗涤，以3000rpm离心5min，弃去上清液，加入0.25×PBS在4℃下在中溶血1小时。将溶血的血液以12000rpm离心10min，收集RBCM。用1×PBS反复洗涤至上清液变为无色，离心收集RBCM，重新分散在1×PBS中。将RBC膜在冰水中超声破碎30分钟。
将破碎的RBCM通过0.45μm过滤器后，在通过0.22μm过滤器过滤。得到粒径小于200nm的RBCM。
2.2、RAFLSM的提取
将RAFLS细胞培养于10cm培养皿中的含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，培养24小时，待细胞长满培养皿后，移除培养基，用1×PBS清洗，0.5％的胰酶进行消化，传代转移至15cm的大培养皿中进行培养。待细胞长满后，用刮刀收集15cm培养皿中的RAFLS细胞，用1×PBS洗涤，0.5％的胰酶将细胞全部消化，以转速800rpm，室温下离心5分钟，将获得的RAFLS细胞沉淀悬浮于0.25×PBS中低渗裂解，加入细胞膜蛋白提取试剂盒A液和PMSF(细胞膜蛋白提取试剂盒A液：PMSF＝100：1)，充分混匀后，在冰上温浴15分钟。使用超声波细胞破碎仪超声破碎5分钟，破碎功率80W，每超声破碎0.3s，停止0.5s。破碎后，放入-80℃中快速冷冻，反复冻融3次。将融化后的液体在4℃条件下以转速800rpm离心10分钟，取上清液进一步在4℃下以转速12000rpm离心30分钟，取沉淀物，得到细胞膜片段。
2.3、RBC&RAFLS生物仿生膜的制备
将获得的RBCM与RAFLSM等体积混合，如：取600μL的RBCM与600μL的RAFLSM混合在一起，在恒温37℃条件下超声破碎5分钟后，以800rpm的转速搅拌4小时。将混合物分别挤出1μm、400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜以促进膜的融合。再经混合物在4℃条件下以转速21000rpm离心30分钟，收集沉淀物，即为RBC&RAFLS生物仿生膜囊泡，并将其重新悬浮于1×PBS中。
如图3所示，得到RFM为由RBCM和RAFLSM交替联结而成的杂合膜。分别取10μL提取的RBCM、RAFLSM及获得的RFM，加入290μL的1×PBS，充分混匀后，用移液器加入比色皿，通过紫外分光光度计观察3种膜的紫外特征吸收峰，得到的结果如图4所示。从图4可以看出，RBCM的紫外吸收曲线在210nm和250-275nm处具有特征吸收峰，RAFLSM的紫外吸收曲线在405nm和540-560nm处具有特征吸收峰，RFM的紫外吸收曲线上具有与RBCM与RAFLSM的紫外吸收曲线叠加而成的特征吸收峰，即在波长为210nm、250-275nm、405nm和540-560nm处均有特征吸收峰。由此可知，RFM中同时具有RBCM片段和RAFLSM片段。
3、PB负载SE NPs的制备
取浓度为4mg/mL立方体PB纳米颗粒溶液366.75μL，加入浓度为500μM的SE溶液1800μL，再加入833.25μL超纯无菌水，充分混合，于25℃条件下，以800rpm转速搅拌24小时，使SE充分被负载到PB中。将混合液置于截留分子量(MWCO)为3kDa的透析袋中，在超纯水中透析12小时，去除未负载的呈游离状态的SE，得到PB负载SE NPs(PB@SE NPs)溶液。
4、RFM包裹PB@SE NPs的制备
取1mL浓度为1mg/mL的RBC&RAFLS生物仿生膜(RFM)，与上一步制得的PB@SE NPs溶液等体积混合，于25℃条件下，以800rpm的转速搅拌24小时，使RFM充分包裹PB@SE NPs。将所得溶液以12000rpm的转速离心15分钟，去除上清中未包裹材料的RFM，将得到的沉淀用1×PBS重悬，得到RFM包裹PB@SE NPs(RFM@PB@SE NPs)溶液。
5、透明质酸(HA)修饰RFM@PB@SE NPs的制备
取100μL新鲜配制的浓度为60mg/mL的透明质酸(HA)溶液，加入1mg EDC和0.5mgNHS，在室温下以800rpm的转速搅拌30分钟，使HA充分活化。取2mL由上一步制得的RFM@PB@SE NPs溶液，加入活化的HA和5mg DSPE-PEG-NH2，在4℃的温度下，以800rpm的转速搅拌过夜，将搅拌后的溶液置于MWCO为10kDa的透析袋中，在超纯水中透析12小时，得到透明质酸修饰RFM@PB@SE NPs(HA@RFM@PB@SE NPs)溶液，也就是本发明的血筒素靶向载药体系。
实施例2
取HA@RFM@PB@SE NPs(0.01mg/mL)溶液20μL滴于覆有碳膜的铜网上，置于红外灯下以60℃的温度烘干，使用透射电子显微镜拍摄其形状及RFM膜包裹的状态。如图5所示，HA@RFM@PB@SE NPs显示出典型的核壳结构。
取PB NPs、PB@SE NPs、RFM@PB@SE NPs以及HA@RFM@PB@SE NPs各100μL置于样品比色皿中，分别使用Zeta电位与纳米粒度分析仪测量其粒径分布及Zeta电位。结构如图6、图7所示。如图6所示，PB NPs和PB@SE NPs的粒径峰值均在80nm左右，而PB@SE NPs的粒径分布更广，大粒径的颗粒更多，说明PB纳米颗粒负载SE后粒径变化不大，部分颗粒有所增大。RFM@PB@SE NPs的粒径约为140nm，显示出膜包裹后纳米颗粒的粒径明显增大，增大的粒径也与一层RFM的厚度相一致。HA@RFM@PB@SE NPs的粒径约为160nm，说明在经过HA修饰后，HA靶向材料使得纳米粒子的粒径进一步增加。如图7所示，PB NPs、PB@SE NPs、RFM@PB@SE NPs和HA@RFM@PB@SE NPs的Zeta电位分别为-16.1mV、-5.4mV、-23.6mV和-15.3mV，RFM@PB@SENPs与HA@RFM@PB@SE NPs在包裹RFM之后Zeta电位接近，其表面电荷的绝对值升高可能与RFM囊泡包裹产生的电荷屏蔽效应有关，而在添加靶向物质HA时同时加入了带正电荷的PEG，使得纳米粒子表面的Zeta电位相对降低，这也从另一个侧面证实了HA@RFM@PB@SE NPs的成功制备。
实施例3
取SPF级成年SD大鼠全血样，在4℃下以3000rpm离心5min，并用PBS洗涤5次，获得纯红细胞。将50μL 4％红细胞(v/v)与950μL不同浓度(浓度分别为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL，分散剂均为PBS)的PB NPs、PB@SE NPs、RFM@PB@SE NPs、HA@RFM@PB@SE NPs相混合，将混合液在37℃下静置4小时。阳性对照采用纯水与红细胞进行混合，混合后红细胞100％溶血。将混合液在4℃下以3000rpm的转速离心5分钟，使用UV-Vis分光光度计测定540nm处上清液的吸光度。通过公式：Hemolysis(％)＝(I/I0)×100％计算溶血率，式中，Hemolysis为溶血率，I表示检测样品的吸光度，I0表示阳性对照(100％溶血)的吸光度。每种样品重复进行三次，取平均值作为样品的溶血率，检测结果见图8。如图8所示，不同浓度的PB NPs、PB@SE NPs、RFM@PB@SE NPs、HA@RFM@PB@SE NPs的溶血率均在4％以下，可见，本发明的血筒素靶向载药体系具有较高的生物相容性。
取RAFLSs细胞，采用含100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素作为双抗、接种到含10％FBS的高糖DMEM培养基中，置于含5％CO2的培养箱中37℃培养，待细胞贴壁，生长状态良好后，2～3天传代一次。取对数生长期的RAFLSs细胞，用1×PBS清洗2次，加入500μL0.25％的胰酶细胞消化液放置于37℃培养箱中消化4min，再用1mL含10％FBS的DMEM培养基终止消化，收集细胞，置于1.5mL EP管中，900rpm的转速离心5分钟，移除上清，再加入1mL含10％FBS的DMEM培养基，制备单细胞悬浮液。再用10mL含10％FBS的DMEM培养基制成1×105个/mL单细胞悬液，以每孔100μL均匀接种于96孔板中，置于含5％CO2培养箱中37℃培养24小时。待细胞贴壁良好后，移除培养基，用1×PBS清洗1次，各孔加入100μM的含1％FBS的DMEM培养基，除Control对照组外，在阳性药组中分别加入终浓度为5μM的甲氨蝶呤和吲哚美辛，其余各孔分别加入PB终浓度为25μg/mL的PB NPs、SE终浓度为4.5μM的SE、PB@SE NPs、RFM@PB@SE NPs和HA@RFM@PB@SE NPs。其中PB NPs、PB@SE NPs、RFM@PB@SE NPs和HA@RFM@PB@SE NPs各设两个组，共设12个组，每组6个复孔。分别对PB NPs、PB@SE NPs、RFM@PB@SENPs和HA@RFM@PB@SE NPs的一个组中的每个孔使用808nm近红外激光(1W/cm2)照射5分钟后，将96孔板置于5％CO2培养箱中37℃培养48小时后，弃去培养基，观察细胞生长状态。再用含10％MTT的无血清DMEM孵育4小时，弃上清液，每孔加入DMSO 100μL，在酶标仪上于492nm处检测OD值，通过公式：给药组的细胞活力＝(给药组OD值/空白对照组OD值)×100％计算细胞存活率，计算结果见图9。如图9所示，与Control组对比，PB NPs、PB NPs+Laser、SE、PB@SE NPs、PB@SE NPs+Laser、RFM@PB@SE NPs、RFM@PB@SE NPs+Laser、HA@RFM@PB@SENPs、HA@RFM@PB@SE NPs+Laser组的RAFLS细胞活力均明显受到抑制。以Control组抑制率为0％，PB NPs、SE、PB@SE NPs、RFM@PB@SE NPs、HA@RFM@PB@SE NPs组对RAFLS细胞的抑制率分别为12.95％、27.25％、25.02％、51.58％、70.57％。使用激光照射的PB NPs+Laser、PB@SENPs+Laser、RFM@PB@SE NPs+Laser和HA@RFM@PB@SE NPs+Laser组对RAFLS细胞的抑制率分别为28.60％、32.02％、63.68％和78.99％，与相应的未使用激光照射的给药组相比，使用808nm的近红外激光照射后，对RAFLS细胞的抑制率更高，能够起到更好的抑制RAFLS细胞增生的效果。RFM包裹PB@SE NPs形成的RFM@PB@SE NPs和本发明的血筒素靶向载药体系HA@RFM@PB@SE NPs，对RAFLS细胞的抑制率明显高于单纯的SE和PB@SE NPs。本发明的HA@RFM@PB@SE NPs，对RAFLS细胞的抑制率达到和超过阳性药甲氨蝶呤和吲哚美辛的水平(5μM的甲氨蝶呤和吲哚美辛对RAFLS细胞的抑制率分别为70.81％与59.48％)，特别是，经过808nm的近红外激光照射后，本发明的HA@RFM@PB@SE NPs对RAFLS细胞的抑制率明显大于甲氨蝶呤及吲哚美辛，具有更好地抗类风湿关节炎的作用。
取体重为70-90g的SPF级SD大鼠分为4组，每组6只，饲养于IVC屏障系统内，保持恒温恒湿。喂养一周后，在大鼠尾根部皮下注射0.1mL含200μg热灭活结核杆菌(Mtb)的完全弗氏佐剂(CFA)建立AIA模型，免疫后18d造模成功，大鼠足趾红热肿胀。在1×PBS中分别加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和ICG，形成NHS含量为1mg/mL、EDC含量为1mg/ml、ICG含量为2.5mg/mL的溶液。在室温下以800rpm的转速搅拌24小时，使用截留分子量为3.5KDa的透析袋在1×PBS中透析24小时以去除游离的ICG，得到ICG-PBS溶液。在PB@SE NPs中分别加入NHS、EDC和ICG，形成NHS含量为1mg/mL、EDC含量为1mg/ml、ICG含量为2.5mg/mL、SE含量为0.21mg/mL的溶液。在室温下以800rpm的转速搅拌24h，使用截留分子量为3.5KDa的透析袋透析24小时以去除游离的ICG，得到ICG-PB@SENPs。依照同样的方法，分别获得SE含量为0.21mg/mL的ICG-RFM@PB@SE NPs和ICG-HA@RFM@PB@SE NPs。分别将制得的ICG-PBS、ICG-PB@SE NPs、ICG-RFM@PB@SE NPs、ICG-HA@RFM@PB@SE NPs按1mL/Kg的量经尾静脉各注射到1只大鼠体内。使用柯达多模成像系统(Ex/Em＝740nm/820nm)分别在注射后0、6、12、24和48小时进行体内荧光成像。对于脏器分布，在注射后48小时仔细收集大鼠肿胀的足趾和主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏)并使用柯达多模式成像系统成像。如图10、图11所示，除PBS处理的大鼠外，各大鼠均在第12-24小时内出现最强的荧光信号，此外，从第12小时起，注射HA@RFM@PB@SE NPs的大鼠体内荧光主要集中在大鼠发病的足趾关节部位，而不是均布于大鼠机体组织和各脏器中，显示出明显的靶向分布。并且，各材料在大鼠足趾部位的靶向能力为HA@RFM@PB@SE NPs>RFM@PB@SE NPs>PB@SE NPs>PBS。由此可见，本发明的血筒素靶向载药体系能够使得抗类风湿关节炎药物SE在类风湿关节炎的病变部位聚集，提高了病变部位的SE浓度，降低了身体其他组织器官中的SE浓度，从而提高了SE对类风湿关节炎的治疗作用，降低了SE对身体其他部位产生的副作用。
综上所述，本发明的血筒素靶向载药体系，能够与类风湿关节炎病变部位的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞靶向结合，提高类风湿关节炎病变部位的血筒素浓度，增强对RAFLS细胞的抑制作用，从而提高了对类风湿关节炎的治疗效果。本发明的血筒素靶向载药体系，生物相容性好，能够有效聚集在类风湿关节炎病变部位，降低身体其他部位的血筒素浓度，使用安全性高，副作用低，能够用于制备抗类风湿关节炎药物。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种血筒素靶向载药体系，其特征在于，包括血筒素、普鲁士蓝纳米颗粒、生物仿生膜包裹层和透明质酸修饰层。
2.根据权利要求1所述的血筒素靶向载药体系，其特征在于，所述普鲁士蓝负载层为普鲁士蓝立方体纳米颗粒、普鲁士蓝球形颗粒或者普鲁士蓝立方体纳米颗粒与普鲁士蓝球形颗粒的混合物。
3.根据权利要求1所述的血筒素靶向载药体系，其特征在于，所述生物仿生膜包裹层为红细胞膜与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞膜组成的融合膜。
4.根据权利要求3所述的血筒素靶向载药体系，其特征在于，所述红细胞膜为大鼠红细胞膜。
5.一种血筒素靶向载药体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S10、合成普鲁士蓝纳米颗粒；
S20、制备生物仿生膜；
S30、使用所述普鲁士蓝纳米颗粒和血筒素制备普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子；
S40、使用所述生物仿生膜和所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子制备生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子；
S50、对所述生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子进行透明质酸修饰，得到所述血筒素靶向载药体系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物仿生膜的制备方法包括如下步骤：
S21、将大鼠红细胞溶血后，超声破碎，过滤，得到红细胞膜片段；
S22、将类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞低渗裂解后，超声破碎，冻融数次，离心，得到类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞片段；
S23、将所述红细胞膜片段和所述类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞片段等体积混合，加压过滤，离心，得到所述生物仿生膜。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子的制备方法为：将血筒素和所述普鲁士蓝纳米颗粒按4:1的质量比混合，搅拌，透析去除未负载的血筒素，得到所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子的制备方法为：将所述生物仿生膜和所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子等体积混合，搅拌，使得所述生物仿生膜充分包裹所述普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子，离心取沉淀，重悬，得到所述生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述透明质酸修饰的方法包括如下步骤：
S51、将透明质酸中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌活化；
S52、在所述生物仿生膜包裹普鲁士蓝负载血筒素纳米粒子中加入活化后的透明质酸和磷脂-聚乙二醇-氨基，搅拌；
S53、使用透析袋透析，得到所述血筒素靶向载药体系。
10.血筒素靶向载药体系在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
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