CN114984245B - 负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统及其制备方法和应用。本发明的纳米载药系统粒径在160nm左右，其内部中空结构可以装载青蒿琥酯和亚甲基蓝两种药物，在肿瘤部位发挥纳米药物的光热和光动联合抑瘤效果，同时生成具有较长半衰期的碳中心自由基，在减少药物负载量的基础上，显著提高抗癌疗效。本发明通过水热反应法合成中空的纳米载药框架，室温下搅拌和挥发溶剂得到负载药物的纳米载药系统，工艺简单，操作方便，在纳米药物的癌症治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及药物纳米载体技术。
背景技术
基于纳米酶的肿瘤催化疗法已经取得了很多进展，可有效地将过氧化氢转化为活性氧，但大多数具有细胞毒性的羟基自由基半衰期很短(≈1μs)，在细胞内扩散得不够远，无法损伤主要细胞器以进行有效的肿瘤治疗。因此，开发一种具有能产生更长半衰期的活性氧的新型纳米载药系统显得尤为重要。
青蒿琥酯(ATS)作为一种铁依赖性药物，已被广泛用于癌症治疗研究，其对癌细胞的选择性毒性依赖于Fe(II)的激活。研究表明，外源Fe(II)的供应可以增强ATS对肿瘤的选择性杀伤作用，可以提高ATS抗癌效果并且避免大量药物富集造成的毒副作用。因此，有必要提供一种可以激活Fe(II)进而增强ATS药效的ATS制剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统及其制备方法和应用。
为实现本发明的目的，本发明采用水热合成法制备普鲁士蓝纳米粒，在此基础上，利用载体的中空结构在室温下搅拌得到纳米载药系统。通过扫描电镜和透射电镜方法，证实纳米粒中空结构的存在。通过紫外、红外等方法证明纳米载药系统的成功制备。通过ESR手段，证实该纳米载药系统可以原位生成碳自由基。
具体地：
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统，包括中空普鲁士蓝纳米粒，所述中空普鲁士蓝纳米粒的内部中空结构装载有药物青蒿琥酯和光敏剂亚甲基蓝。
进一步地，所述纳米载药系统的粒径为150～200nm，例如为160nm左右。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统的制备方法，包括：
1)普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)的制备
将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])溶解于HCl溶液中，通过水热法在烘箱中75～85℃反应18～22h；之后，将反应液离心清洗2～3次，弃上清后所得沉淀即为PB NPs；
2)中空普鲁士蓝纳米粒(HPB NPs)的制备
将PVP溶解于0.5～1.5M HCl中，称取PB NPs冻干样品超声分散均匀；之后，将混合溶液置于烘箱中135～145℃反应3～5h。最后，将反应液使用乙醇和超纯水清洗2～3次，即得到HPB NPs；
3)负载青蒿琥酯的中空普鲁士蓝纳米粒(HPB/ATS NPs)的制备
首先，将青蒿琥酯(ATS)样品溶解于乙醇中，加入HPB NPs冻干粉末超声分散后在室温下搅拌10～15h；之后，用量筒量取超纯水加入反应液中，在通风橱中使用磁力加热搅拌器于55～65℃下搅拌挥发乙醇溶剂；最后，将HPB NPs与ATS的反应液离心，通过乙醇和超纯水清洗2～3次，所得沉淀即为HPB/ATS NPs；
4)负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米粒(HPB/ATS/MB NPs)的制备
称取HPB/ATS NPs溶解于超纯水中，加入一定量亚甲基蓝(MB)样品在室温下避光搅拌22～25h；搅拌完成后，将溶液进行离心，用超纯水清洗两次，所得沉淀即为HPB/ATS/MBNPs，即为所述纳米载药系统。
进一步地，所述步骤3)中，青蒿琥酯(ATS)、中空普鲁士蓝纳米粒(HPB NPs)的质量比为1:1～3。
进一步地，所述步骤4)中，负载青蒿琥酯的中空普鲁士蓝纳米粒(HPB/ATS NPs)、亚甲基蓝(MB)的质量比为4～6:1。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
一种负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述纳米载药系统中，两种药物可以同时负载于纳米粒的中空部位发挥作用，可在肿瘤部位原位生成碳自由基，具有光热和光动联合抑瘤效果。优选地，所述药物为光热和光动联合治疗药物
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.本发明选择普鲁士蓝(PB)这种可释放外源Fe(II)的纳米粒构建了光动和光热于一体的中空普鲁士蓝/青蒿琥酯/亚甲基蓝(HPB/ATS/MB)纳米载药系统。在近红外光照射、肿瘤微酸性环境以及谷胱甘肽(GSH)三重作用联合下，HPB降解并释放出Fe(III)、ATS和MB，而Fe(III)利用肿瘤细胞中的GSH还原生成Fe(II)，扰乱了肿瘤细胞的氧化还原稳态平衡；生成的Fe(II)能利用肿瘤细胞中的H2O2与ATS原位生成具有更长半衰期的碳自由基(≈4min)；在655nm光源照射下，MB活化肿瘤细胞中的O2生成1O2(单线态氧)。该纳米载药系统可以显著增强药物的抗癌效果，且毒副作用低，生物安全性良好。
2.本发明的纳米载药系统的粒径可控为160nm左右，粒径分布均匀，ATS和MB的药物负载量高，具有良好的光热和光动力效果，且可以生成半衰期长的碳自由基。
3.本发明的制备方法工艺简单，操作方便，可以显著提高纳米药物在肿瘤治疗中的抗癌效果。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的PB NPs、HPB NPs、HPB/ATS NPs和HPB/ATS/MB NPs的扫描电镜和透射电镜图，其中：a、b、c、d依次为PB NPs、HPB NPs、HPB/ATS NPs和HPB/ATS/MBNPs的扫描电镜图，e、f、g、h依次为PB NPs、HPB NPs、HPB/ATS NPs和HPB/ATS/MB NPs的透射电镜图。
图2为实施例1中MB、ATS、PB NPs、HPB NPs、HPB/ATS NPs和HPB/ATS/MB NPs的红外光谱图和紫外光谱图，其中：a为红外光谱图，b为紫外光谱图。
图3为实施例2中HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs在808nm激光器下的光热转换效果考察，其中：a为1mL 100μg/mL的HPB NPs在不同功率密度下10min内的光热转换结果，b为不同浓度HPB NPs在1.5W/cm2功率密度下10min内的光热转换结果，c为100μg/mL的HPB NPs在1.5W/cm2功率密度下反复升温降温3次的光热转换结果，d为HPB/ATS/MB NPs在不同功率密度下10min内的光热转换结果，e为不同浓度HPB/ATS/MB NPs在1.5W/cm2功率密度下10min内的光热转换结果，f为HPB/ATS/MB NPs在1.5W/cm2功率密度下反复升温降温3次的光热转换结果。
图4为实施例3中HPB/ATS/MB NPs生成单线态氧性能考察，其中：a为在655nm激光器不同功率密度下HPB/ATS/MB NPs照射5min的紫外吸收光谱图，曲线由上到下分别为0W/cm2、0.5W/cm2、1.0W/cm2、2.0W/cm2；b为1W/cm2功率密度下照射不同时间的紫外吸收光谱图，曲线由上到下分别为0min、1min、2min、3min、4min、5min。
图5是实施例4中不同实验组HPB/ATS NPs、HPB/ATS/MB NPs、HPB/ATS/MB NPs+655、HPB/ATS/MB NPs+808和HPB/ATS/MB NPs+808+655与4T1细胞共培养24h的细胞光疗效果考察(****P＜0.0001)，用于说明对细胞的毒性，各组中从左到右依次为HPB/ATS NPs、HPB/ATS/MB NPs、HPB/ATS/MB NPs+655、HPB/ATS/MB NPs+808和HPB/ATS/MB NPs+808+655。
图6为实施例5中不同实验组与4T1细胞共培养24h后的细胞活死染色结果(标尺＝100μm)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1.PB NPs的制备
首先，准确称取3g PVP和131.7g的K3[Fe(CN)6]粉末置于烧杯中；然后，在烧杯中加入40mL 0.01M的HCl溶液，将溶液磁力搅拌为澄清透明状时倒入反应釜，烘箱温度为80℃，反应20h；最后，将反应釜中的液体离心清洗2～3次，弃上清后所得沉淀即为PB NPs。
2.HPB NPs的制备
使用冻干机将PB NPs样品进行冷冻干燥。然后，称取20mg冻干样品和100mg的PVP，加入1M HCl溶液20mL，超声分散均匀；之后，将溶液置于烘箱中140℃反应4h。最后，将反应液使用乙醇和超纯水清洗2～3次，即得到HPB NPs。
3.HPB/ATS NPs的制备
首先，称取5mg的ATS样品溶解于10mL乙醇中，再加入10mg的HPB NPs冻干粉末超声分散后在室温下搅拌12h；之后，用量筒量取10mL的超纯水加入反应液中，在通风橱中使用磁力加热搅拌器于60℃下搅拌挥发乙醇溶剂。由于ATS不溶于水溶液，在乙醇挥发过程中ATS便可载入HPB NPs的空腔中；最后，将HPB NPs与ATS的反应液离心，通过乙醇和超纯水清洗2～3次，所得沉淀即为HPB/ATS NPs。
4.HPB/ATS/MB NPs的制备
称取10mg的HPB/ATS NPs溶解于10mL超纯水中，加入2mg的MB样品在室温下避光搅拌24h。搅拌完成后，将溶液进行离心，用超纯水清洗两次，所得沉淀即为HPB/ATS/MB NPs。
从图1中可以看出：PB NPs呈现实心的立方形结构，粒径约在160nm左右，大小较为均一；高温下经过HCl的刻蚀后，得到的HPB NPs表面出现介孔结构、且内部呈现中空便于后期药物的负载；当HPB NPs载入ATS和MB后粒径和结构并无明显变化。同时由于药物的负载和纳米粒的清洗要经过长时间的搅拌、超声和离心过程，所得到的纳米粒结构没有未载药的HPB NPs形貌规整，但是药物的载入并不会对纳米粒子的本身结构造成破坏，对后续实验的进行并未造成影响。
从图2中a可以看出PB NPs、HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs在2080cm-1均出现了Fe2+-C≡N-Fe3+的伸缩振动峰，这是属于合成PB NPs原料中K3[Fe(CN)6]的特征吸收峰，同时证明了在PB NPs通过HCl刻蚀为HPB NPs和HPB NPs负载ATS与MB的过程中，纳米粒子的晶体框架没有被破坏；图(a)中MB在约1700cm-1处出现的特征吸收峰是其骨架结构中C＝S的伸缩振动峰，在1597cm-1处的吸收峰归属于其结构中苯环C-C骨架的弯曲振动，同时在最终合成产物HPB/ATS/MB NPs的1500cm-1也出现吸收峰，证明MB的成功负载；ATS在1758cm-1处的峰是其结构中内过氧化物桥的特征吸收峰，同时在终产物HPB/ATS/MB NPs的相应位置也出现同样的特征吸收峰，证明HPB NPs成功负载ATS。
图2中b是HPB NPs、HPB/ATS NPs和HPB/ATS/MB NPs的紫外吸收光谱图。由于ATS本身在200nm处的近红外区具有较强的吸收，这和HPB NPs在此区域的吸收峰出现重合，所以通过紫外无法判断ATS是否载入HPB NPs空腔内，需与其他的表征手段相结合。而MB在650nm处具有其特征吸收峰，可以看出HPB/ATS/MB NPs中，原本平滑的曲线在50nm处出现了属于MB的吸收峰，由此可以证明HPB NPs成功负载MB。
实施例2
HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs的光热转换效果及光热稳定性
使用808nm近红外激光器考察HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs的光热转换效果及光热稳定性。
光热转换效果：分别将HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs以超纯水做溶剂，配制成12.5、25、50、100和200μg/mL的溶液。调节激光器光斑直径为1cm，使用玻璃比色皿盛装1mL的100μg/mL样品液，分别在激光器功率密度为0.5、1、1.5和2W/cm2下考察溶液经激光照射10min的温度变化，每隔30s记录一次。之后，选择1.5W/cm2的功率密度，考察浓度为12.5、25、50、100和200μg/mL的样品溶液在激光照射10min内的光热转换效果。
光热稳定性：设置激光器的功率密度为1.5W/cm2，溶液浓度为100μg/mL，记录在激光器照射10min的样品温度变化。10min后关闭光源，每隔30s记录一次溶液温度。当温度降低至溶液的起始温度附近时，再次打开光源照射10min。如此重复3次，考察纳米粒的光热稳定性。
结果如图3，HPB NPs在600～900nm的近红外区具有较强的吸收峰，激光照射后其表面结构中的Fe2+和Fe3+发生电荷跃迁，将吸收的光能转换为热能，实现光热转换。为研究HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs的体外升温效果。首先，分别取1mL的浓度为100μg/mL的样品溶液考察其在不同功率密度下的温度变化：如图3中a和d所示，随着功率密度的增大，HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs的升温效果逐渐增强。在功率密度为0.5、1.0、1.5和2.0W/cm2下HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs于10min时分别升温了11.1、24.8、39.5和44.9℃及9.6、19.7、32.5和41.9℃。可以看出，样品温度的变化与激光的功率密度呈现正相关，同时药物ATS和MB的负载使得HPB纳米材料的光热转换效果降低。
然后，取不同浓度12.5、25、50、100和200μg/mL的HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs溶液各1mL，以超纯水为空白对照，在激光功率密度为1.5W/cm2下，考察溶液浓度对光热转换效果的影响。图3中b和e分别为不同浓度HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs的光热升温曲线。从图中可以看出，对照组水溶液(即：0μg/mL)在激光照射10min内，其温度并无明显变化趋势。随着样品溶液浓度的升高，光热升温效果增强，浓度为12.5、25、50、100和200μg/mL的HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs在10min时的温度分别为34、41.2、48.8、63.3和69.4℃及34.8、37.9、43.1、49和53.6℃，温度变化了10、17.7、24.8、39.5和44.9℃及5.6、8.5、13.6、19.7和25.1℃。计算可得，HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs的光热转换效果分别为28.36％和18.23％，与传统光热剂相比，其光热转换效率保持在较高水平。
图3中c和f分别是HPB NPs和HPB/ATS/MB NPs在激光照射10min后自然降温循环三次的温度变化，从图中可以看出，停止激光照射后溶液温度迅速下降，在光源的开关周期内纳米粒依旧保持良好的光热转换性能，后两次循环的温度变化与第一次并无明显差异。这说明纳米粒在激光照射后，其结构没有发生变化，具有极好的光热稳定性和优良的光热转换效率。
实施例3
HPB/ATS/MB NPs的单线态氧测定
1,3-二苯基异苯并吡喃(DPBF)是一种单线态氧指示剂，其在420nm处具有特征吸收峰，当与单线态氧进行反应后，其紫外吸光度会发生衰减，体系内生成的单线态氧数量与吸光度的衰减成正比。以乙醇作为溶剂，将DPBF配制成1mol/L的DPBF/乙醇溶液，取1mL的DPBF/乙醇溶液，加入1mL 100μg/mL的HPB/ATS/MB NPs溶液作为空白对照，使用紫外光谱仪测定其在350～450nm范围的紫外吸收。之后，将DPBF与HPB/ATS/MB NPs混合液加入玻璃比色皿中，使用655nm激光器在0.5、1.0和2.0W/cm2的功率密度下分别照射5min，测定在不同功率密度下HPB/ATS/MB NPs产生单线态氧的能力。其中，在使用1W/cm2的功率密度照射时，分别测定溶液在被激光照射0、1、2、3、4和5min时的紫外图谱，考察单线态氧随着时间变化的生成量。
单线态氧是一种可以引导细胞凋亡和坏死的活性氧，常用于肿瘤中的光动力治疗。光敏剂MB在激光照射的条件下，可以敏化氧气产生单线态氧。本实施例使用DPBF荧光衰减法测定体系中单线态氧的生成。DPBF作为单线态氧的指示剂，其在420nm处有较强的吸收。当它与体系中的单线态氧反应时，可以根据420nm处的吸光度降低程度判断体系产生单线态氧的能力。如图4中a所示，随着功率密度的增大，光谱曲线逐步呈现下降的趋势，这表明：HPB/ATS/MB NPs产生单线态氧的能力与光照的功率密度呈正相关。当功率密度恒定，即1.0W/cm2时，随着光照时间的增加，420nm处的吸光度逐渐降低(图4中b)，这表明在一定范围内，光照时间的延长可以使体系产生更多的单线态氧。
实施例4
HPB/ATS/MB NPs的细胞光疗效果
使用4T1细胞验证载药普鲁士蓝纳米粒(HPB/ATS/MB NPs)的体外光疗效果。首先，取出6个96孔板进行细胞培养；之后，将HPB NPs、HPB/ATS NPs和HPB/ATS/MB NPs分别用培养基配制成浓度为0、20、40、60、80和100μg/mL的溶液；其次，取出培养24h的细胞孔板，将配制好的上述三种溶液加入孔板中，其中HPB NPs和HPB/ATS NPs溶液各一个孔板，HPB/ATS/MB NPs接种4个孔板用于考察在808nm和655nm激光器照射下的细胞光疗效果，记为：HPB/ATS/MB NPs、HPB/ATS/MB NPs+655(使用655nm激光器)、HPB/ATS/MB NPs+808(使用808nm激光器)和HPB/ATS/MB NPs+808+655(先使用808nm激光器，再使用655nm激光器)；然后在细胞与药物共培养8h时，取出HPB/ATS/MB NPs+655、HPB/ATS/MB NPs+808和HPB/ATS/MB NPs+808+655的三个孔板。调节孔板与激光器到合适距离，使得光斑直径正好覆盖孔的大小，使用1.5W/cm2的激光功率密度依次照射每个孔10min，照射完成后将孔板继续放入培养箱进行培养。最后，在细胞与药物共培养24h后取出孔板，吸弃培养液，取PBS缓冲液缓慢地小心冲洗孔板2～3次。最后，将CCK-8与DMEM培养基按1:10的比例配制成显色液(避光操作)，在每孔中加入100μL的显色液与细胞共培养1～2h，当孔板中培养基的颜色由淡粉色转变为橙黄色时取出。使用酶标仪在450nm下测定孔板的吸光度，进行后续计算。
本实施例为考察808nm和655nm激光器对于细胞的存活率影响，将不同浓度的HPB/ATS NPs、HPB/ATS/MB NPs、HPB/ATS/MB NPs+655、HPB/ATS/MB NPs+808、和HPB/ATS/MB NPs+808+655与4T1细胞共培养24h，通过CCK-8测定细胞的存活率，判断载药普鲁士蓝对于细胞的光疗效果。如图5所示，随着药物浓度的增加，细胞存活率呈现下降的趋势。100μg/mL的HPB/ATS NPs与细胞共培养24h后的存活率降低为57.49±3.31％，说明ATS负载入HPB中后，在外源Fe2+的引入下，激活了ATS对于癌细胞的选择性杀伤作用。从图中可以看出，HPB/ATSNPs、HPB/ATS/MB NPs和HPB/ATS/MB NPs+655三组实验的细胞存活率相差不大，这说明仅仅依靠HPB负载的MB进行光动力杀死肿瘤细胞的效果并不好。药物浓度达到100μg/mL时，HPB/ATS/MB NPs+655组相对于其他两组的细胞存活降低约16％，为41.78±1.35％。这可能是由于纳米粒浓度的增加，使得MB的药物负载量提高，所以纳米粒的光动力效果有显著增强。当在外部给予HPB/ATS/MB NPs组808nm激光器的激光刺激后，同等浓度条件下细胞毒性大幅增加，当其浓度为100μg/mL时，细胞存活率仅为24.04±1.38％。由于细胞在光热条件下会产生热休克蛋白使其本身对于高温并不敏感，导致光热剂的PTT效果大打折扣，所以需要外加其他的治疗手段用以协同治疗。从24.04±1.38％的细胞存活率可以看出，在细胞环境和光热刺激下，HPB可以提供大量的外源Fe2+用以激活ATS的癌细胞选择性杀伤作用，在抗癌药物ATS和光敏剂HPB的光热效果协同下对细胞造成一定的损伤。当808nm和655nm激光器共同作用于HPB/ATS/MB NPs时，由于光热和两种自由基的大量生成对细胞造成严重损伤，浓度为100μg/mL的载药纳米粒在光热和光动的协同作用下，4T1细胞在培养24h后的细胞存活率仅为16.79±0.61％。细胞光疗效果说明，该纳米载药系统具有优良的癌细胞杀伤作用。
实施例5
细胞活死染色
依据对活死细胞不同的荧光染色呈现出的颜色数量对比来判断药物和外部光刺激对于细胞的致死率。其中，Calcein-AM(钙黄绿素-乙酰甲氧基甲酯)是一种可以在保持细胞活性不影响细胞功能情况下将活细胞染成绿色的荧光染料，而PI(碘化丙啶)则是一种可以将死细胞的细胞核染成红色的染料。
首先，重悬4T1细胞后以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，放入培养箱培养24h。分别准备含有100μg/mL的HPB NPs、HPB/ATS NPs和HPB/ATS/MB NPs的培养基适量；之后，取出6孔板，吸出旧的培养基，将孔板分为七组，即：对照组(培养基不含药物)、HPB NPs、HPB/ATS NPs、HPB/ATS/MB NPs、HPB/ATS/MB NPs+655、HPB/ATS/MB NPs+808和HPB/ATS/MB NPs+808+655，每组三个复孔。将孔板在培养箱中继续培养，8h后取出后三组的6孔板按照实施例4中的条件施加激光；激光照射完成后，取出所有孔板，吸出孔板中旧的培养基，用无血清培养基冲洗两遍之后，将液体收集在离心管中，离心之后吸出上清，用培养基重悬沉淀。之后，分别将Calcein-AM和PI在避光条件下按照与无血清培养基1:1000的比例配制成染色液。将配制好的Calcein-AM溶液加入孔板中，于培养箱中孵育染色20min。之后染色液吸出，用无血清培养基冲洗孔板2～3次。最后取出之前重悬的细胞悬液，加入在孔板中，于倒置荧光显微镜下进行拍照考察细胞的活死染色结果。
图6中a和b中细胞全部为绿色荧光，看不到死细胞，证明HPB NPs本身对于细胞并无毒害作用，细胞相容性较好；c中可以看到一些红色荧光的出现，但是与活细胞数量相比较少，证明虽然HPB/ATS NPs可以产生一些轻微的毒性。由于细胞光疗效果实验中HPB/ATSNPs组细胞的存活率约为60％，实验操作过程中死细胞单独染色离心之后覆盖在活细胞之上，所以在操作过程中可能会出现损耗，使得拍摄结果中死细胞的数目变少；d与c相比，可以看到大量被染成红色荧光的死细胞出现，证明双载药纳米粒本身对于细胞具有一定的杀伤作用，该结果也与细胞光疗效果中的细胞毒性相匹配；e为加入655nm激光外部刺激的HPB/ATS/MB NPs的作用结果，可以看出，与活细胞数量相比，死细胞数量较少；f中可以明显看到，施加808nm光照后，视野内的死细胞数量急剧增加，活细胞数量明显变少，说明普鲁士蓝的光热作用和光热促进释放Fe2+形成碳自由基对于细胞的致死效果要比仅加入655nm激光器的效果好；当808和655nm激光器共同作用时，可以看到g中视野可见范围内全部呈现被染成红色的死细胞，几乎没有活细胞的出现，证明在两种激光器的共同作用下，HPB/ATS/MBNPs对于细胞的杀伤力极大，可以大批量杀死肿瘤细胞。这也进一步说明了在体内实验中，该纳米药物体系可能具有很好的肿瘤治疗效果。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统的制备方法，其特征在于：包括：
1）将聚乙烯吡咯烷酮和铁氰化钾置于HCl中，通过水热法反应得到普鲁士蓝纳米粒；
2）将聚乙烯吡咯烷酮和普鲁士蓝纳米粒置于HCl中，反应得到中空普鲁士蓝纳米粒；
3）将青蒿琥酯溶解于乙醇中，加入中空普鲁士蓝纳米粒，超声分散后在室温下搅拌10～15 h，再加入水并在55～65℃下搅拌挥发乙醇；离心，清洗，所得沉淀即为负载青蒿琥酯的中空普鲁士蓝纳米粒；
4）将负载青蒿琥酯的中空普鲁士蓝纳米粒溶解于水中，加入亚甲基蓝在室温下避光搅拌22～25 h，离心，清洗，所得沉淀即为负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米粒，即所述纳米载药系统。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，水热法的反应温度为75～85℃，反应时间为18～22 h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，反应温度为135～145℃，反应时间为3～5 h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中，青蒿琥酯和中空普鲁士蓝纳米粒的质量比为1:1～3。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中，负载青蒿琥酯的中空普鲁士蓝纳米粒和亚甲基蓝的质量比为4～6:1。
6.如权利要求1所述的制备方法制备得到的一种负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统，其特征在于：包括中空普鲁士蓝纳米粒，所述中空普鲁士蓝纳米粒的内部中空结构装载有青蒿琥酯和亚甲基蓝。
7.根据权利要求6所述的负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统，其特征在于：所述纳米载药系统的粒径为150～200 nm。
8.一种权利要求6所述的负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物为光热和光动联合治疗药物。
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