KR20210020228A - 프러시안 블루 나노케이지 및 목적물질을 포함하는 전달체 - Google Patents

프러시안 블루 나노케이지 및 목적물질을 포함하는 전달체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프러시안 블루 나노케이지, 나노케이지에 로딩된 목적물질과 스텔스 성분 및 상기 나노케이지에 부착된 그래핀 옥사이드를 포함하는 목적물질 전달체에 관한 것으로 상기 목적물질 전달체는 상기 성분을 포함하는 분산액을 분사시킴으로써 간편하게 제조될 수 있고, 임상에서 사용되는 물질인 프러시안 블루를 사용하여 안전하며, 목적물질로 항암제를 포함하는 경우 광열 활성 및 항암제 방출의 조합 효과에 의하여 항종양 효능이 현저히 우수하다.

Description

프러시안 블루 나노케이지 및 목적물질을 포함하는 전달체{Target Material Carrier comprising Prussian Blue Nanocage and Target Material}
본 발명은 프러시안 블루 나노케이지, 상기 나노케이지에 로딩된 목적물질과 스텔스 성분을 포함하는 목적물질 전달체에 관한 것이다.
국내에서 암 환자의 5년 이상 생존율은 2016년 기준 전체 암 환자의 52.7%로 이 수치는 계속적으로 증가하고 있다. 그러나 간암, 폐암, 췌장암 환자의 5년 이상 생존율은 각각 34.3%, 27.6% 및 11%로 이들 암에서는 여전히 효과적인 암 치료가 이루어지지 않고 있다.
일반적인 암 치료 방법에는 외과적 수술, 항암화학요법, 방사선치료 등이 있다. 기존의 단일 암 치료요법은 심각한 부작용과 불만족스러운 효능이라는 단점이 있어 나노의약(nanomedicine) 분야에서는 이를 개선하기 위해 나노 규모의 다기능성 물질을 개발하기 위해 연구하고 있다. 구체적으로 특정 자극에 의해 활성화되는 기능을 갖는 다양한 나노물질(nanoagent, NA)을 광-, 방사성-, 소노(sono)-, 및 면역 요법과 같은 다른 암 치료 방법과 병용하여 사용하는 방법이 연구되고 있다. 특히, 나노물질의 광유발성 온도 상승에 기초한 조합 광치료 요법은 단순성, 최소 침습성, 광 조사 조건에서 화학 요법 및 광열 요법을 동시에 사용할 수 있는 장점으로 인해 많이 사용되어 왔다. 그러나 암 치료에 있어 나노물질의 사용은 독성, 부작용, 유효성 및 비용 문제로 인해 아직까지 제한적이며, 나노물질의 변형을 통해 상기 단점을 극복하려는 시도가 있으나, 변형 과정이 복잡하고 이에 따라 비용 또한 많이 소모된다.
이와 같은 배경에서, 본 발명자들은 기존 나노물질의 단점을 개선하기 위해 임상에서 사용하고 있는 물질인 프러시안 블루(Prussian blue, PB)로 나노케이지 구조를 만들고, 여기에 목적물질과 스텔스 성분을 포함시켜 본 발명을 완성하였다.
1. Black-Phosphorus-Incorporated Hydrogel as a Sprayable and Biodegradable Photothermal Platform for Postsurgical Treatment of Cancer. Adv. Sci. 2018, Mar 3;5(5):1700848. 2. Indocyanine Green-Conjugated Magnetic Prussian Blue Nanoparticles for Synchronous Photothermal/Photodynamic Tumor Therapy. Nano-Micro Lett. 2018;10(4):74.
본 발명의 목적은 프러시안 블루로 이루어진 나노케이지; 및 상기 나노케이지에 로딩된 목적물질 및 스텔스 성분을 포함하는 목적물질 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 목적물질 전달체에 항암제를 로딩한 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 프러시안 블루로 이루어진 나노케이지; 및 나노케이지에 로딩된 목적물질 및 스텔스 성분을 포함하는 목적물질 전달체를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "프러시안 블루(K3[Fe(CN)6], Prussian blue)"는 진한 파란색의 합성 염료이며, 방사성 세슘 및 탈륨 중독시 해독제로 사용되고 있다. 세계보건기구에서 지정하는 필수의약품 목록에 등재되어 있는 해독제로 독일과 미국 등에서는 의학적 용도로 승인되어 있다. 또한, Fe2 + 및 Fe3 + 사이의 전하 이동으로 인하여 근적외선 광열 변환(near-infrared photothermal conversion) 활성을 가지므로 광열 치료에 활용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "나노케이지(nanocage)"는 속이 비어있는 중공의 나노입자(hollow nanoparticle)를 의미하는 것으로 빈 공간에 특정 물질이 로딩(적재)될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 프러시안 블루로 이루어진 나노케이지는 0.5 내지 10 ㎚ 직경의 공극을 가질 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10 ㎚ 크기의 공극을 가질 수 있고, 상기 공극에는 목적물질 및 스텔스 성분이 로딩될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 프러시안 블루와 폴리비닐피롤리돈을 염산 용액에 용해시킨 후 수열반응을 진행하면, 프러시안 블루의 일부가 폴리비닐피롤리돈에 의해 환원되고, 비환원 상태의 프러시안 블루와 반응하여 입방체 (cube) 형태의 프러시안 블루 나노케이지가 형성된다(도 1 참조).
본 명세서에 사용된 용어, "목적물질(target material)"은 상기 목적물질 전달체를 사용하여 생체 내로 전달하고자 하는 물질을 말한다. 본 발명에서 상기 목적물질은 약물, 항체, 핵산, 세포, 펩티드, 효소 및 호르몬으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 원하는 목적을 얻기 위해 생체 내로 전달하고자 하는 물질이면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 약물은 질병의 예방, 개선 또는 치료 목적을 갖는 물질이면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 제품명 알로코드(allocord), 클레베코드(clevecord), 듀코드(ducord), 헤마코드(hemacord)와 같은 조혈모세포(hematopoietic progenitor cell); 티사젠렉루셀(Tisagenlecleucel, 제품명: 킴리아 주(Kymriahⓡ)), 라비브(LAVIV, 제품명: Azficel-T)) 및 악시카브타젠 실로루셀(axicabtagene ciloleucel, 제품명: 예스카타 주(Yescartaⓡ)과 같은 CAR-T 치료제; 제품명 진투이트(Gintuit, 성분명-Allogeneic Cultured Keratinocytes and Fibroblasts in Bovine Collagen), 제품명 마시(Maci, 성분명-Autologous Cultured Chondrocytes on a Porcine Collagen Membrane) 및 시푸르셀-T (sipuleucel-T, 제품명: 프로벤지 주(Provengeⓡ)와 같은 세포 치료제; 및 보레티젠 네파보벡(voretigene neparvovec-rzyl, 제품명: 럭스터나(Luxtuna)), 탈리모젠 라헤르파렙벡 (talimogene laherparepvec, 제품명: 임리직 주(lmlygicⓡ)) 및 오나셈노겐 아베파르보벡(onasemnogene abeparvovec-xioi, 제품명: Zolgensma)과 같은 유전자 치료제가 사용될 수 있다.
바람직하게 상기 약물은 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 이다루비신 (idarubicin), 픽산트론 (pixantrone), 사바루비신 (sabarubicin), 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab), 니볼루맙 (Nivolumab), 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 아벨루맙 (Avelumab), 이필리무맙 (Ipilimumab), 에르다피티닙(erdafitinib), 아벨루맙(avelumab), 악시티닙 (axitinib), 라무시루맙(ramucirumab), 트라스트주맙 (trastuzumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 다롤루타미드(darolutamide), 알펠리십(alpelisib), 폴라투주맙 (polatuzumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 펙시다티닙(pexidartinib), 베네토클락스(venetoclax), 셀리넥소 (selinexor), 엔코라페닙(encorafenib), 두벨리십(duvelisib), 글라스데깁(glasdegib), 아팔루타미드(apalutamide), 세미플리맙 (cemiplimab), 렌바피닙 (lenvatinib), 로라티닙 (loratinib), 목세투모맙 (moxetumomab), 니볼루맙 (nivolumab), 모가물리주맙 (mogamulizumab), 탈라조파립 (talazoparib), 이보시데닙 (ivosidenib), 라로트렉티닙 (larotrectinib), 다코미티닙 (dacomitinib), 길테리티닙 (gilteritinib), 코판리십 (copanlisib), 브리가티닙 (brigatinib), 이노투주맙 오조가미신 (inotuzumab ozogamicin), 아칼라브루티닙 (acalabrutinib), 에나시데닙 (enasidenib), 이브루티닙 (ibrutinib), 더발루맙 (durvalumab), 리보시클립 (ribociclib), 네라티닙 (neratinib), 미도스타우린 (midostaurin), 아베마시클립 (abemaciclib), 시타라빈 (cytarabine), 니라파립 (niraparib), 카보잔티닙 (cabozantinib), 올라라투맙 (olaratumab), 루카파립 (rucaparib), 그라니세트론 (granisetron) 및 베네토클락스 (venetoclax)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 독소루비신일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "스텔스 성분(stealth component)"은 생체 내의 면역 체계가 상기 목적물질 전달체를 지나치게 방어하여 신속하게 제거하지 않도록 은폐하는 성분을 말하며, 면역 체계가 목적물질 전달체를 외부 물질로 인식하지 않도록 생체적합성 고분자인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol), 글리콜 키토산(glycol chitosan), 폴리락틱산(poly lactic acid), 폴리락틱-코-글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid)), 알지네이트(alginate), 히알루론산 (hyaluronic acid), 폴리-L-리신, 젤라틴 및 콜라겐으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 목적물질 전달체는 나노케이지 표면에 나노크기 그래핀 옥사이드가 부착된 것일 수 있다. 상기 나노크기 그래핀 옥사이드 (nanodimensional graphene oxide)는 80 내지 100 ㎚의 크기일 수 있고, 프러시안 블루 나노케이지와 1:1의 비율로 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 나노크기 그래핀 옥사이드는 목적물질 전달체에서 목적 약물의 로딩 효율, 근적외선 조사에 따른 광열 변환 활성을 향상시킬 수 있다(도 7 내지 9 참조).
본 발명의 다른 양상은 (a) 프러시안 블루로 이루어진 나노케이지; 및 (b) 상기 나노케이지에 로딩된 항암제 및 스텔스 성분을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암 치료용 약학적 조성물은 실질적으로 본 발명의 목적물질 전달체를 사용하는 것이므로 이 둘 사이에 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 픽산트론, 사바루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에르다피티닙, 아벨루맙, 악시티닙, 라무시루맙, 트라스트주맙, 펨브롤리주맙, 다롤루타미드, 알펠리십, 폴라투주맙, 아테졸리주맙, 펙시다티닙, 베네토클락스, 셀리넥소, 엔코라페닙, 두벨리십, 글라스데깁, 아팔루타미드, 세미플리맙, 렌바피닙, 로라티닙, 목세투모맙, 니볼루맙, 모가물리주맙, 탈라조파립, 이보시데닙, 라로트렉티닙, 다코미티닙, 길테리티닙, 코판리십, 브리가티닙, 이노투주맙 오조가미신, 아칼라브루티닙, 에나시데닙, 이브루티닙, 더발루맙, 리보시클립, 네라티닙, 미도스타우린, 아베마시클립, 시타라빈, 니라파립, 카보잔티닙, 올라라투맙, 루카파립, 그라니세트론 및 베네토클락스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 독소루비신일 수 있다.
상기 암 치료용 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구의 예로는 복강, 직장, 정맥, 근육, 피하 주사로 투여될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있다. 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 ㎎/㎏(체중)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기 단계를 포함하는 목적물질 전달체 제조 방법을 제공한다:
(a) 프러시안 블루 및 폴리비닐피롤리돈의 용액을 수열반응시켜 프러시안 블루 나노케이지를 제조하는 단계;
(b) 프러시안 블루 나노케이지 분산액에 목적물질 및 스텔스 성분을 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 (b)의 분산액을 진동 노즐 장치로 분사시키는 단계.
본 명세서에 사용된 용어, "수열 반응(hydrothermal reaction)"은 용매와 함께 또는 고체와 용액 성분을 수열 조건(고온의 물 또는 수용액 상태)에서 반응시켜 새로운 화합물을 만드는 방법을 말한다. 반응 속도가 빠르고 분산성이 좋아 균일한 결정상을 갖는 화합물 제조가 용이하고, 수열 조건의 압력, 온도, 첨가제 등을 조절하여 제조하려는 화합물의 입경, 형상, 입도분포, 조성 및 순도를 제어할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (a)의 수열반응은 50 내지 100℃에서 3시간 내지 50시간 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 70 내지 90℃에서 5시간 내지 40시간 동안 수행될 수 있고, 산성 조건에서 진행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 제조 방법은 단계 (b)의 프러시안 블루 나노케이지 분산액에 나노크기 그래핀 옥사이드가 추가로 첨가될 수 있으며, 이 경우 프러시안 블루 나노케이지 표면에 나노크기 그래핀 옥사이드가 부착된 목적물질 전달체가 제조된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 목적물질과 스텔스 성분은 상기 목적물질 전달체에 사용되는 것과 동일한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (c)의 분사시키는 단계는 작동 주파수 128 kHz에서 상기 분산액을 노즐에서 PBS 용액으로 자유낙하시키는 방식으로 이루어질 수 있다.
구체적으로, 프러시안 블루 나노케이지 분산액에 독소루비신, 폴리에틸렌 글리콜 및 나노크기 그래핀 옥사이드를 첨가하여 진동 노즐 장치로 분사하면 프러시안 블루 나노케이지에 독소루비신과 폴리에틸렌 글리콜이 로딩되고, 나노케이지 표면에 나노크기 그래핀 옥사이드가 부착된 목적물질 전달체를 손쉽게 제조할 수 있다(실험방법에서 "1. 프러시안 블루 나노케이지 제조" 참조).
본 발명에서, 프러시안 블루 나노케이지에 독소루비신 및/또는 폴리에틸렌 글리콜이 로딩된 목적물질 전달체는 PB-D, PB-peg 또는 PB-Dpeg로 기재하였고, 여기에 나노크기 그래핀 옥사이드가 부착된 경우에는 PB-D@nGO, PB-peg@nGO 또는 PB-Dpeg@nGO로 기재하였다.
본 발명의 목적물질 전달체는 상기 성분을 포함하는 분산액을 분사시킴으로써 간편하게 제조될 수 있고, 임상에서 사용되는 물질인 프러시안 블루를 사용하여 안전하며, 목적물질로 항암제를 포함하는 경우 광열 활성 및 항암제 방출의 조합 효과에 의하여 항종양 효능이 현저히 우수하다.
도 1은 프러시안 블루가 환원되어 나노케이지를 형성하는 과정(A)과 진동 노즐 장치의 구조(B)를 개략적으로 나타낸다.
도 2는 상이한 수열 반응 시간에 따라 생성된 프러시안 블루 (Prussian blue, PB) 나노케이지의 저배율 및 고배율 투과전자현미경(TEM) 이미지를 나타낸다.
도 3은 상이한 수열 반응 시간에 따라 생성된 프러시안 블루 나노케이지의 크기 분포 및 다분산도 지수(PDI)를 보여주는 그래프이며, 오른쪽 하단의 이미지는 프러시안 블루 나노케이지의 고배율 TEM 이미지이다.
도 4는 30시간 수열 반응으로 생성된 프러시안 블루 나노케이지의 흡착 등고선 (A) 및 공극 크기 분포(B)를 보여주는 그래프이다.
도 5는 독소루비신(D) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(peg)이 로딩된 프러시안 블루 나노케이지(PB-D 또는 PB-Dpeg)에 나노크기 그래핀 옥사이드(nGO) 플레이크를 부착하거나, 부착하지 않은 경우의 TEM 이미지이다.
도 6에서 A는 진동 노즐에서 분사된 나노크기 그래핀 옥사이드(nGO) 플레이크의 저배율 및 고배율 TEM 이미지이고, B는 프러시안 블루 나노케이지에 나노크기 그래핀 옥사이드(nGO)의 결합 유무에 따른 제타 전위 변화를 측정한 그래프이다.
도 7에서 A는 프러시안 블루(PB) 나노케이지에서 나노크기 그래핀 옥사이드 (nGO) 플레이크의 부착 유무 및 독소루비신(D)의 함량에 따른 독소루비신의 캡슐화 효율(EE)과 로딩 용량(LC)을 나타내는 그래프이고, B는 PB-Dpeg에서 나노크기 그래핀 옥사이드(nGO) 플레이크의 부착 유무에 따른 독소루비신(D)의 캡슐화 효율(EE)과 로딩 용량(LC)을 나타내는 그래프이며, C는 프러시안 블루(PB) 나노케이지에 나노크기 그래핀 옥사이드 (nGO) 플레이크의 부착 유무 및 독소루비신(D)의 함량에 따른 제타 전위 변화를 측정한 그래프이고, D는 PB-Dpeg에서 나노크기 그래핀 옥사이드(nGO) 플레이크의 부착 유무 및 독소루비신(D)의 함량에 따른 입자 크기 및 다분산도 지수(PDI)를 나타내는 그래프이다.
도 8에서 A는 상이한 농도의 프러시안 블루(PB) 나노케이지 분산액에서 자외선-가시광선 스펙트라를 확인한 그래프이고, B 및 C는 다른 농도의 PB-Dpeg 및 PB-peg@nGO를 포함하는 분산액에 근적외선을 조사한 후 온도 변화를 확인한 그래프이며, D는 PB-Dpeg 및 PB-peg@nGO 분산액에서 근적외선 조사 온-오프 사이클에 따른 온도 변화를 확인한 그래프이다.
도 9는 PB-Dpeg 분산액(A) 및 PB-peg@nGO 분산액(B)에서 나노크기 그래핀 옥사이드(nGO) 플레이크의 부착 유무, 분산액의 농도에 따른 온도 변화를 나타낸다.
도 10에서 A는 프러시안 블루(PB) 나노케이지, 독소루비신(D), PB-Dpeg 및 PB-peg@nGO의 자외선-가시광선 스펙트라를 확인한 그래프이고, B는 독소루비신(D), 프러시안 블루(PB) 나노케이지, 나노크기 그래핀 옥사이드(nGO), PB-Dpeg 및 PB-peg@nGO의 FTIR 스펙트라를 나타내며, C는 peg와 PB-D@nGO의 FTIR 스펙트라를 확인한 그래프이다.
도 11에서 A 및 B는 독소루비신(D)과 이를 포함하는 프러시안 블루(PB) 나노케이지의 DSC 써모그램(A) 및 X-선 회절분석 프로파일(B)을 나타내고, C는 프러시안 블루(PB) 나노케이지, 나노크기 그래핀 옥사이드(nGO) 및 폴리에틸렌 글리콜(peg)의 X-선 회절분석 프로파일을 나타낸다.
도 12에서 A는 상이한 pH 조건에서 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO로부터 방출되는 독소루비신(D)의 함량을 측정한 그래프이고, B는 상기 A의 그래프에서 초기 12시간을 확대한 그래프이다.
도 13에서 A 및 B는 세포에 다른 농도의 프러시안 블루(PB) 나노케이지, 나노크기 그래핀 옥사이드(nGO) 또는 PB-peg를 처리한 후 근적외선 조사(NIR) 및 비조사 조건에서 24시간(A) 또는 48시간(B) 동안 세포 생존율을 측정한 그래프이고, C 및 D는 세포에 다른 농도의 PB@nGO 또는 PB-peg@nGO를 처리한 후 근적외선 조사(NIR) 및 비조사 조건에서 24시간(C) 또는 48시간(D) 동안 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 14는 세포에 다른 농도의 독소루비신(D)을 포함하는 PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 처리한 후 근적외선 조사(NIR) 및 비조사 조건에서 24시간(A) 또는 48시간(B) 동안 세포 생존율을 측정한 그래프이며, 삽도는 근적외선 조사 0분 및 5분에 촬영한 대표적 온도 등고선을 나타낸다.
도 15는 세포에 PB-peg(A) 또는 PB-peg@nGO(B)를 다른 농도로 처리한 후 세포 내재화 여부를 확인한 결과를 결과이다.
도 16은 세포에 PB-peg(A) 또는 PB-peg@nGO(B)를 다른 시간 동안 처리한 후 세포 내재화 여부를 확인한 결과를 결과이다.
도 17은 세포에 PB-Dpeg(A) 또는 PB-Dpeg@nGO(B)를 처리한 후 독소루비신(D) 농도 및 처리 시간에 따른 세포내 흡수 여부를 확인한 결과이다.
도 18에서 A는 세포에 PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 처리한 후 근적외선 조사(NIR) 및 비조사 조건에서 세포 생존율을 생존/사멸 분석 방법으로 확인한 결과이고, B는 세포 생존율을 FACS 분석으로 확인한 결과이다.
도 19에서 A는 세포에 PB-peg, nGO 또는 PB-peg@nGO를 처리한 후 근적외선 조사(NIR) 및 비조사 조건에서 세포 생존율을 생존/사멸 분석 방법으로 확인한 결과이고, B는 세포 생존율을 FACS 분석으로 확인한 결과이다.
도 20에서 A는 세포에 대조군(a) 독소루비신(b), PB-Dpeg(c), PB-Dpeg(NIR)(d), PB-Dpeg@nGO(e) 또는 PB-Dpeg@nGO(NIR)(f)를 처리한 후 세포사멸 여부를 Hoechst 33342 염색으로 확인한 결과이고, B는 PANC-1 세포에 A와 동일한 처리를 한 후 DCFH-DA 염색으로 활성산소 수준을 확인한 결과이다.
도 21은 스크래치가 형성된 세포에 독소루비신(D), PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 처리한 후 근적외선 조사(NIR) 및 비조사 조건에서 세포 이동 수준을 확인한 결과이다.
도 22에서 A는 종양 형성을 유도한 누드마우스에 형광 표지된 PB-peg 또는 PB-peg@nGO를 투여한 후 종양 부위에 축적되는지 여부를 확인한 결과이고, B는 상기 A의 누드마우스에서 종양 부위의 형광 강도를 그래프로 표시한 것이다.
도 23에서 A는 종양 형성을 유도한 누드마우스에 형광 표지된 PB-peg 또는 PB-peg@nGO를 투여한 후 주요 장기에서 PB-peg 또는 PB-peg@nGO의 축적 여부를 확인한 결과이고, B는 상기 A의 주요 장기의 형광 강도를 그래프로 표시한 것이다.
도 24는 종양 형성을 유도한 누드마우스에 PBS, PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 투여한 후 근적외선 조사 시간에 따른 온도 변화를 확인한 결과이다.
도 25는 종양 형성을 유도한 누드마우스에 각각 식염수(대조군, G1), 독소루비신(G2), PB-Dpeg(G3), PB-Dpeg(NIR)(G4), PB-Dpeg@nGO(G5), 및 PB-Dpeg@nGO(NIR)(G6)를 투여한 후 종양 부피(A)와 체중(B)을 측정한 결과로 A의 삽도는 누드마우스로부터 분리한 종양의 이미지이다.
도 26에서 A는 종양 형성을 유도한 누드마우스에 각각 식염수(대조군, G1), 독소루비신(G2), PB-Dpeg(G3), PB-Dpeg(NIR)(G4), PB-Dpeg@nGO(G5), 및 PB-Dpeg@nGO(NIR)(G6)를 투여한 후 종양 조직을 분리하여 헤마토실린&에오신 염색과 세포사멸 마커(절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP), 혈관신생 마커(CD31) 및 종양 세포 증식 마커(Ki-67)를 염색한 결과이며, B는 상기 누드마우스에서 분리한 주요 장기의 조직학적 염색 결과이다.
도 27은 적혈구와 하기 물질을 반응시켜 용혈 여부를 확인한 결과이다: PC=양성 대조군; NC=음성 대조군; 1. 독소루비신(D)(10 ㎍/㎖); 2. PB-peg (50 ㎍/㎖); 3. peg@nGO (50 ㎍/㎖); 4. PB-peg@nGO (50 ㎍/㎖); 5. Dpeg@nGO (D=10 ㎍/㎖); 6. PB-Dpeg@nGO (D=10 ㎍/㎖); 7. Dpeg@nGO (D=20 ㎍/㎖); 및 8. PB-Dpeg@nGO (D=20 ㎍/㎖).
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 프러시안 블루 나노케이지 제조
프러시안 블루(K3[Fe(CN)6], Prussian blue, 시그마-알드리치, 미국; 이하, PB로 기재함) 792 ㎎과 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP, 시그마-알드리치) 4.5 g을 0.001 M 염산 용액(시그마-알드리치) 50 ㎖에 용해시키고, 실온에서 30분 동안 교반하여 노란색 용액을 수득하였다. 상기 노란색 용액을 가열된 챔버에 주입하고, 85℃에서 24시간 동안 추가로 반응시켜 청색 분산액을 제조하였다. 30시간 동안 반응시킨 후 분산액 내의 청색 입자를 원심분리로 회수하고, 증류수로 3회 세척한 후 건조시켜 PB 나노케이지(nanocage)를 수득하였다. 제조된 PB 나노케이지는 투과전자현미경(transmission electron microscope; 이하, TEM으로 기재함)으로 관찰하였다. 각각 10시간 및 20시간으로 반응시간을 변화시킨 청색 입자 또한 동일한 과정으로 건조시켰다.
상기 PB 나노케이지(PB NC) 입자를 PBS에 분산시키고, 독소루비신(doxorubicin, D)(상이한 %w/w) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, peg)(1 ㎎/㎖)의 혼합 용액에 상기 PB 나노케이지 분산액을 첨가하여 PB-Dpeg 분산액을 제조하였다. 또한, 나노케이지의 표면을 수식(patch-up)하기 위해, 상기 PB-Dpeg 분산액에 나노크기 그래핀 옥사이드(nanodimensional graphene oxide, 80 내지 100 ㎚; 이하, nGO로 기재함) 플레이크(flake)를 1-PB 나노케이지:1-nGO의 비율로 첨가하여 PB-Dpeg@nGO 분산액을 제조하였다. 제조한 PB-Dpeg 분산액 및 PB-Dpeg@nGO 분산액을 각각 진동 노즐 장치의 저장소에 주입하고, 작동 주파수 128 kHz에서 상기 분산액을 노즐에서 PBS 용액으로 자유낙하시켜 각각 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO를 제조하였다. PB-Dpeg@nGO 분산액의 경우, 자유낙하동안 nGO가 PB 나노케이지의 표면에 부착된다. 오염을 방지하기 위해 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO의 제조 과정은 클린 벤치에서 수행하였다.
도 1에 프러시안 블루가 환원되어 나노케이지를 형성하는 과정(A)과 진동 노즐 장치의 구조(B)를 개략적으로 도시하였다.
2. PB- Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO 특성 확인
PB 나노케이지(PB NC), PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO의 크기 분포와 제타 전위(zeta potential)는 DLS 시스템(Nano-S90, Malvern Instruments, 영국)으로 분석하고, 광 흡수 특성은 자외선-가시광선(UV-visible) 분광광도계(U-2800, Hitachi, 일본)로 확인하였다. PB 나노케이지(PB NC), PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO의 형태는 100 kV의 가속 전압에서 TEM (H7600, Hitachi)으로 관찰하였고, nGO 플레이크의 저배율 및 고배율 TEM 이미지는 다른 TEM (Tecnai G2 F20 S-TWIN, FEI, 미국)으로 수득하였다. 또한, PB 나노케이지(PB NC)의 흡착 등온선(adsorption isotherm)과 공극 크기 분포는 공극률 측정기(porosimeter; ASAP 2010, Micromeritics, 미국)로 확인하였다.
PB-Dpeg, PB-Dpeg@nGO 및 개별 구성물질의 표면 화학, 결정 성질 및 열적 거동은 FTIR 분광기 (Nicolet Nexus 670, Thermo Fisher Scientific, 미국), X선 회절 분석법(Malvern Pananalytical, 영국), 및 DSC 분석 (Q200, TA Instruments, 미국)으로 분석하였다.
근적외선-유도성 광열 전환 활성을 조사하기 위해 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO를 10, 20, 30, 40, 및 50 ㎍/㎖ 농도로 PBS에 분산시켰다. 상기 분산액에 NIR을 조사(808 ㎚, 2 W/㎠)하고, 조사하는 동안 분산액의 온도는 열 화상 카메라(Therm-App TH, 이스라엘)로 모니터링하였다.
3. 캡슐화 효율 및 로딩 용량
PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO에서 독소루비신의 캡슐화 효율(encapsulation efficiency, EE)은 원심 초미세여과 장치 (Amicon®, MWCO 10000 Da, Millipore, 미국)로 50000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 평가하였다. 독소루비신의 농도는 자외선-가시광선 분광광도계로 485 ㎚ 파장에서 확인하였고, 캡슐화 효율(EE) 및 로딩 용량(loading capacity, LC)의 백분율은 하기 수학식에 따라 산출하였다:
[수학식 1]
EE(%)=샘플에 포집된 독소루비신 농도(CED)/독소루비신의 총 농도(CTD)x100 (%)
LC(%)=(독소루비신의 총 농도(CTD)-미결합한 독소루비신 농도(CUD))/전체 샘플의 독소루비신 농도(CTS)x100 (%)
4. 시험관내 독소루비신 방출
PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO에서 독소루비신의 방출 양상은 투석 방법으로 확인하였다. 투석 튜브(Spectra/Por, MWCO 3500 Da, Spectrum Labs, 미국)에 상기 나노물질 1 ㎖을 넣고, PBS (pH 7.4) 또는 ABS (acetate buffered saline, pH 5.0) 25 ㎖에 완전히 담근 후 37℃를 유지하면서, 100 rpm으로 교반하였다. 이후, 일정 간격으로 PBS 또는 ABS 0.5 ㎖을 취한 후 신선한 PBS 또는 ABS를 동일 용량 보충하였다. 독소루비신의 방출량은 자외선-가시광선 분광광도계로 485 ㎚ 파장에서 확인하였다.
5. 세포 생존율 확인
PANC-1 세포(한국 세포주 은행, 한국)를 96-웰 플레이트 (1x104 세포/웰)에 접종하고, PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 동안 배양하였다. 이때, NIR 조사에 의한 효과를 비교하기 위하여 개별 성분 또한 PANC-1 세포에 처리하였다. 배양 후 MTT 용액을 각 웰에 첨가하고, 디메틸 술폭시드 (dimethyl sulfoxide, 시그마-알드리치)에 용해된 포르마잔(formazan) 결정의 흡광도는 마이크로플레이트 리더기(Multiskan EX, Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 570 ㎚에서 측정하였다.
6. 세포 내재화(internalization) 및 흡수(uptake)
세포 내재화: 12-웰 플레이트에 위치한 커버슬립에 세포를 2x104 세포/웰 농도로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 상이한 시간동안 PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 각각 1. 3 및 5 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 이후, 각 웰에 LysoTracker green (100 ng/㎖; Thermo Fisher Scientific)을 처리하고, PBS로 세척한 후 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정하였다. 12-웰 플레이트에서 커버슬립을 분리하여 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM; K1- Fluo, Nanoscope Systems, 한국)으로 확인하였다.
세포 흡수: 6-웰 플레이트에 1x105 세포/웰 농도로 세포를 분주하고, 상기와 동일한 방식으로 PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 처리하였다. 이후 차가운 PBS로 세포를 세척하고, 트립신을 처리한 후 세포 펠렛을 수득하였다. 상기 세포 펠렛을 PBS 1 ㎖에 재현탁시키고, 유세포 분석기(FACSCalibur?, BD Bioscience, 미국)로 확인하였다.
7. 세포사멸( apoptosis ) 분석
생존/사멸 분석(Live/dead assay): 각 웰에 1x105 세포/웰 농도로 세포를 분주하고, 근적외선을 조사하거나 조사하지 않는 조건에서 PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 처리하였다. 이후, 세포에 프로피디움 요오드(propidium iodide, PI) 750 μM 및 아크리딘 오렌지(acridine orange, AO) 6.7 μM 용액을 처리하여 세포를 염색시켰다. PI-양성 세포는 죽은 세포이고, AO-양성 세포는 살아있는 세포이다.
FACS 분석: 상기 생존/사멸 분석과 유사한 방식으로 세포에 PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 처리하고, 48시간 후 세포를 회수하여 결합 버퍼와 혼합한 후 PE(phycoerythrin)-Annexin V 및 7-AAD(7-Aminoactinomycin D)로 15분 동안 염색하였다. 염색된 세포는 결합 버퍼로 희석하여 유세포 분석기로 확인하였다.
Hoechst 형광 염색: Hoechst 형광 염색은 PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO 처리에 의하여 세포사멸이 유도되는지 확인하기 위해 수행하였다. 12-웰 플레이트에 세포를 1x105 세포/웰 농도로 분주하여 24시간 동안 배양하고, PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 처리하여 48시간 동안 추가로 배양하였다. 이후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, Hoechst 33342 (10 ㎍/㎖)로 염색한 후 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon, 일본)으로 관찰하였다.
8. 활성산소 측정
세포내 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 생성은 산화 조건 반응성 형광 염료인 DCFH-DA(dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 사용하여 형광 현미경으로 확인하였다. 세포에 PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 48시간 동안 처리하고, PBS로 세척한 뒤 DCFH-DA의 L-1을 30 μM 농도로 포함하는 배양 배지를 첨가하여 어두운 곳에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 세포를 PBS로 세척하고, 형광 현미경으로 활성산소를 관찰하였다.
9. 세포 이동 실험
12-웰 플레이트에 세포를 분주하여 웰에 세포가 가득 찰 때까지 배양하였다. 각 웰에 두 개의 평행한 선을 그어 스크래치를 만들고, 세포에 PB-Dpeg 또는 PB-Dpeg@nGO를 처리하였다. 세포 이동을 확인하기 위해, 스크래치 후 24시간 또는 48시간이 경과한 뒤 iSolution Lite digital imaging system이 구비된 도립 현미경(CKX41SF, Olympus, 일본)으로 이미지를 촬영하였다.
10. 용혈 독성(hemolytic toxicity)
목적물질 전달체의 개별 구성 성분과 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO의 혈액적합성 (hemocompatibility)은 Sprague Dawley 랫트의 혈액으로 확인하였다. 랫트로부터 채취한 혈액을 원심분리(3500 rpm, 10분)하여 적혈구를 분리하고, 식염수로 희석한 적혈구 1 ㎖을 샘플 10 ㎖을 포함하는 각 테스트 튜브에 첨가하였다. 테스트 튜브에 포함된 독소루비신은 5 ㎍/㎖ 농도에 상응한다. 각 테스트 튜브를 가볍게 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 양성 및 음성 대조군은 각각 희석한 적혈구 1 ㎖와 물 9 ㎖의 혼합물, 적혈구 1 ㎖와 식염수 9 ㎖의 혼합물로 준비하였다. 반응 후, 모든 샘플을 3500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 분리하여 540 ㎚에서 자외선-가시광선 분광광도계로 분석하였다. 용혈 백분율은 하기 식으로 계산하였다:
[수학식 2]
용혈(%)=(As-As0/As100-As0) x 100(%)
상기 식에서 As는 샘플의 흡광도, As0는 음성 대조군의 흡광도 및 As100은 양성 대조군의 흡광도를 의미한다.
11. 생체내 분포( biodistribution ) 및 광열 이미지
5주령의 Balb/c 누드 마우스에 PANC-1 세포(1x107 세포)를 오른쪽 옆구리에 주사하여 종양 형성을 유도하였다. 이후 종양이 형성된 마우스에 Cy5.5로 표지된 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 목적물질 전달체 주사 0.5, 6, 12, 24, 및 48시간 후에 NIR fluorescence imaging system (FOBI, NeoScience 한국)으로 마우스의 형광 이미지를 촬영하였다. 또한, 목적물질 전달체 주사 48시간 후에 마우스를 희생시켜 종양 및 주요 장기(심장, 지라, 신장, 폐 및 간)를 분리하고, 세척한 후 목적물질 전달체의 분포를 확인하였다.
생체내 수준에서 목적물질 전달체의 광열 활성(photothermal activity)은 나노물질 주사 24시간 후 종양 부위에 근적외선을 조사(808 ㎚, 2 W/㎠)하여 확인하였다. 목적물질 전달체를 주사한 마우스의 온도 등고선(contour)은 근적외선 조사 동안 열 카메라로 기록하였다.
12. 생체내 항종양 실험
5주령의 Balb/c 누드 마우스에 PANC-1 세포를 주사하고, 종양 크기가 ~100 ㎣에 도달하면 누드 마우스를 무작위로 6개 그룹으로 나누었다. 모든 마우스에 꼬리 정맥을 통해 동일량(10 ㎎/㎏)의 독소루비신을 4일마다, 총 4회 주사하고 대조군에는 식염수를 주사하였다. 주사 24시간 후 종양이 형성된 부위에 근적외선을 2분 동안 조사하고, 24일 동안 종양 부피 및 체중 변화를 기록하였다.
13. 조직병리학적 분석
조직병리학적 및 조직계측학적(histomorphometrical) 변화를 평가하기 위해, 이종 이식(xenograft) 마우스 모델에서 종양 덩어리를 분리하고, 헤마토실린&에오신 염색을 사용하여 종양 덩어리의 변화를 관찰하였다. 세포사멸 마커(절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP), 혈관신생(angiogenesis) 마커(CD31) 및 종양 세포 증식 마커(Ki-67)에 대한 종양 덩어리의 면역반응성 변화 또한 분석하였다.
14. 통계 분석
실험군 간의 유의성은 Fisher's LSD 테스트 및 Student's unpaired t-test를 통한 일원분산분석(one-way ANOVA)을 사용하여 평가하였다.
실험 결과
1. PB 나노케이지 전달체 제조 및 특성 확인
도 2의 A는 상이한 수열 반응(hydrothermal reaction) 시간으로 생성된 PB 나노입자(PB NP)의 저배율 및 고배율 TEM 이미지를 나타낸다. 10시간 동안 반응시킨 경우 약 50 ㎚ 측면 크기의 입방형 구조가 만들어졌고, 입자 크기는 자가핵생성 (autonucleation) 및 미리 형성된 표면에 PB 결정의 성장으로 인하여 반응 시간이 늘어남에 따라 증가하였다.
상기 PB 나노입자의 크기는 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 측정으로 확인한 크기와 일치하였다. 30시간 동안 반응시킨 경우, 다분산도 지수(polydispersity index, PDI)는 산란 입자(scattering particle)를 제거하는 K3Fe(CN)6의 부분적 분해로 인해 PVP의 존재 하에 상당히 감소하였다(도 3). 또한, PB 나노입자가 PB 나노케이지(PB NC)로 만들어질 때 공극(pore)이 생성되었고, TEM으로 관찰시 30시간 동안 반응시킨 경우와는 다른 단계적 차이(gradation)를 나타냈다. 도 3의 우측 하단에 제시된 PB 나노케이지의 고배율 TEM 이미지는 PB의 (200) 및 (220) 평면과 각각 일치하는 0.50 ㎚ 및 0.31 ㎚의 d-간격(d-spacing)을 보여준다. 이 결과는 부분 열분해로 의해 PB 나노케이지에 공극이 생성되지만 수열 반응 과정 동안 PB의 결정성(crystallinity)이 유지될 수 있음을 의미한다.
공극률 측정기로 확인한 흡착 등온선 (비표면적(specific surface area): 534.3 ㎡/g, 공극 부피: 0.459 ㎤/g) 및 공극 크기 분포(삽도, 4.9 ㎚ 평균 공극 직경)를 통해 PB 나노케이지의 메조공극성(mesoporous) 특성을 확인할 수 있었다(도 4). D 또는 Dpeg 분자와 같이 분사된 PB 나노케이지는 어두운 색으로 변하였고(도 5), 이는 생성된 메조공극이 흡착을 통해 D 또는 Dpeg 분자를 함유할 수 있음을 의미한다. PB 나노케이지와 nGO를 동시에 분사시키는 경우 PB-D@nGO 및 PB-Dpeg@nGO 모두 TEM 관찰에서 모양의 현저한 변화없이 입자만 흐려지는 것으로 나타났다(도 5). 이는 분사된 nGO 플레이크의 구겨진 형태(crumpled shape)와 비교하여(도 6의 A), 모세관 흡입(capillary suction)에 의해 PB-D 또는 PB-Dpeg에 nGO 플레이크가 단단히 결합된 것을 나타낸다. PB 나노케이지와 nGO의 견고한 결합력은 PB@nGO 및 PB-peg@nGO 사이에서 유의미한 차이가 없는 것으로 나타난 제타 전위 측정 결과에 의해서도 확인할 수 있었다(도 6의 B).
또한, nGO와 같이 분사하는 경우 분사 용액에서 독소루비신의 함량이 10 내지 30%(w/w)로 증가함에 따라 PB 나노케이지의 캡슐화 효율(EE) 및 로딩 용량(LC) 또한 증가하였으며(도 7의 A), 이러한 경향은 peg와 같이 분사하는 경우에도 동일하게 나타났다(도 7의 B). 이 결과는 PB 나노케이지에 nGO를 결합시키는 것이 독소루비신의 로딩 촉진에 효과적임을 의미한다. PB 나노케이지 단독인 경우와 비교하여 PB@nGO의 경우 독소루비신의 로딩 용량이 증가함에 따라 제타 전위 또한 명백히 변화하였다(도 7의 C). 그러나 PB-Dpeg와 비교하여 PB-Dpeg@nGO에서 독소루비신 로딩 용량에 따른 DLS 크기와 다분산도 지수(PDI)의 유의미한 증가는 확인할 수 없었다(도 7의 D). 또한, PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO 모두 EPR (enhanced permeability and retention)이 가능한 크기(<200 ㎚)인 것으로 확인되었으며, 이는 본 발명의 PB 나노케이지 전달체 제조 방법이 복잡한 반응없이 임상 현장에서의 약물 전달체 조립에 적합하다는 것을 의미한다.
2. PB 나노케이지 전달체의 물리화학적 특성
PB 나노케이지의 광-활성화 특성을 평가하기 위해, 입자 농도 10-50 ㎍/㎖ 범위에서 자외선-가시광선 흡수 스펙트라를 측정하였다. PB 나노케이지 분산액은 500 ㎚와 1000 ㎚ 사이의 파장 범위에서 명확한 흡수를 나타내어, 근적외선 감수성과의 관련성을 보여주었다(도 8의 A). 근적외선(808 ㎚, 2 W/㎠)을 PB-Dpeg 분산액 또는 PB-Dpeg@nGO 분산액 (10-50 ㎍/㎖)에 5분 동안 조사하고, 온도 등고선(contour)을 기록하였다(도 9의 A 및 B). 그 결과, PB-Dpeg 분산액에서 온도가 현저히 상승하였고(도 8의 B), 이러한 경향은 nGO의 π-네트워크로 인해 PB-Dpeg@nGO에서 더욱 강화되었다(도 8의 C).
PB-Dpeg@nGO의 경우 PB-Dpeg와 비교하여 5 사이클 후에 광열 활성(photothermal activity)의 안정성이 더 우수하였으며(도 9의 D), 이는 PB 나노케이지에 nGO를 부착시킴으로써 빈틈없는 독소루비신 로딩 및 안정적인 광열 변환을 향상시킬 수 있음을 암시한다.
PB 나노케이지에 대한 독소루비신의 로딩 여부 및 nGO 결합 여부는 자외선-가시광선 분광법 및 푸리에-변환 적외선(Fourier-transform infrared, FTIR) 분광법으로 확인하였다. PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO의 경우, 480 ㎚ 부근에서 확인되는 흡수 피크와 1720 cm-1 부근의 투과율 밴드(transmittance band)는 독소루비신이 로딩된 것을 나타낸다(도 10의 A 및 B). 또한, 2070 cm-1 부근의 투과율 밴드는 Fe2 +-CN-Fe3+의 스트레칭(stretching)과 일치하고, 3420 cm-1 부근의 밴드는 peg의 말단 하이드록실 그룹에 상응한다. 아울러 1050 cm-1, 1390 cm-1 및 1610 cm-1 부근의 밴드는 각각 nGO 표면의 C-O, O-H 및 C=O의 스트레칭 진동(stretching vibration)에 기인하는 것으로, PB-Dpeg가 nGO로 감싸져 있음을 암시한다(도 10의 B 및 C).
10℃/분의 속도로 가열한 독소루비신의 써모그램(thermogram)에서, 독소루비신(D)의 유리 전이 온도(glass transition temperature)는 205.4℃로 나타났고, PB-Dpeg에서는 187.7℃로 나타나 감소하였다(도 11의 A). PB-Dpeg@nGO에서 독소루비신의 열 변형(thermal deformation)을 나타내는 피크 강도 또한 PB-Dpeg에 비해 현저하게 감소하였고(도 11의 A), 이 결과는 PB-Dpeg에 부착된 nGO가 독소루비신의 안정성을 높이는 것을 의미한다. nGO의 견고한 부착은 X선 회절 측정법(X-ray diffractometry, XRD)으로 추가로 조사하였으며, 독소루비신의 특징적 밴드가 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO 모두에서 거의 사라지는 것으로 나타나(도 11의 B), 독소루비신이 PB 나노케이지 내부에 성공적으로 로딩되는 것을 알 수 있었다. PB-Dpeg의 경우 PB의 특징적 밴드만 17.6°, 24.6°, 35.3° 및 39.4°에서 명확하게 확인할 수 있었고, 이는 면심 입방 PB 격자(face-centered cubic PB lattice)의 (200), (220), (420) 및 (400) 평면에 각각 해당한다(도 11의 B 및 C). 밴드의 강도는 nGO의 추가로 감소하였고, nGO의 (001) 베이스 평면과 일치하는 9.4°에서의 밴드 또한 관찰되었다. PB에서 첫 두 피크 사이의 작은 밴드는 peg를 나타내며, PB-Dpeg@nGO의 표면에 스텔스 성분(stealth component)이 있음을 의미한다.
PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO의 물리화학적 특징은 임상적으로 허용가능한 성분을 사용하여 복합 암 치료를 위한 화학 요법 활성, 광열 활성 및 스텔스 효과를 모두 갖는 물질을 임상 현장에서 쉽게 제조할 수 있음을 의미한다.
3. PB 나노케이지 전달체의 시험관내 효능
3-1. 독소루비신 방출
PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO의 시험관내(in vitro) 효능을 평가하기 위해, pH 5.0 및 7.4 조건에서 72시간동안의 누적 독소루비신 방출 프로파일을 수득하였다. PB-Dpeg에서 방출되는 누적 독소루비신의 양은 pH 7.4의 생리적 조건에서 43% 미만이었고, 독소루비신의 아미노 그룹의 양성자 부가(protonation)로 인해 산성 조건(pH 5.0, 모사된 종양 미세 환경)에서는 약 71%까지 현저히 증가하였다(도 12의 A 및 B; B는 처음 12시간을 확대한 것). 이 결과는 PB 나노케이지 전달체에 로딩된 독소루비신이 pH 조건에 따라 다른 속도로 방출될 수 있음을 의미한다.
독소루비신 방출은 PB-Dpeg@nGO에서 증가하여 pH 7.4에서 36% 미만 및 pH 5.0에서 62% 미만 수준이었고(도 12의 A 및 B), 이는 PB-Dpeg에 패치된 nGO가 PB-Dpeg 구조에서 화학요법의 오프-타겟 효과(off-target effect)를 감소시키기 때문이다.
상기 결과는 본 발명에서 개발된 현장 공학적 접근법(in situ engineering approach)을 사용하면 추가적인 화학적 및 정제 과정 없이 독소루비신 방출 조절이 가능한 목적물질 전달체를 제조할 수 있음을 의미한다.
3-2. 세포 독성 평가
독소루비신의 방출 효과를 확인하기 위해 인간 췌장암 세포주인 PANC-1를 사용하여, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)로 세포 독성을 평가하였다. 개별 구성물질과 PB-peg(10-50 ㎍/㎖)의 경우, 근적외선 비조사 조건에서는 모든 실험군이 80% 이상의 생존률을 나타내었고, 근적외선 조사 조건에서는 세포 생존률이 20-30% 정도 감소했다(도 13의 A 및 B). 이러한 결과는 개별 구성물질과 PB 나노케이지 모두 생체적합성이지만 근적외선을 조사하면 광열 활성에 의해 세포 증식을 억제할 수 있음을 의미한다.
PB 나노케이지, PB-peg 및 nGO를 모두 포함하는 경우, 향상된 광열 활성로 인해 개별 구성물질을 처리한 세포와 비교하여 더 큰 세포 독성 효과를 나타냈다(도 13의 C 및 D). 따라서 PB-peg@nGO에 독소루비신을 로딩하면 낮은 독소루비신 농도(<10 ㎍/㎖)에서도 NIR 조사로 인해 세포 독성 효과가 현저히 증가하였다(도 14의 A 및 B).
공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여, 독소루비신 미포함 PB 나노케이지 전달체의 농도-의존적 및 시간-의존적 세포내 흡수를 관찰하였다. 오버레이 이미지에서 볼 수 있듯이, PB-peg 처리군과 비교하여 PB-peg@nGO 처리군에서 리소좀 흡수(uptake)가 증가하였으며, 이러한 경향은 독소루비신 미포함 PB 나노케이지 전달체의 처리 농도 및 처리 시간에 의존적이었다 (도 15의 A 및 B; 도 16의 A 및 B). 상기 결과는 PB-peg에 nGO를 부착시켜 PB-peg의 스텔스 효과(stealth effect)를 향상시킬 수 있고, 결과적으로 효과적인 항종양 효과를 위한 부위 선택적 독소루비신 방출을 촉진할 수 있는 있음을 의미한다.
독소루비신을 포함하는 PB 나노케이지 전달체의 세포내 흡수는 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석으로 확인하였다. PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO 처리군 모두에서 농도 및 시간 의존적으로 리소좀 흡수가 증가하였으며, PB-Dpeg 처리군과 비교하여 PB-Dpeg@nGO 처리군의 흡수 정도가 현저히 우수하였다(도 17의 A 및 B).
또한, PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO, 독소루비신 미포함 PB 나노케이지 전달체 및 개별 구성물질을 48시간 동안 PANC-1 세포에 처리하고, 근적외선 조사(808 ㎚, 2 W/㎠로 5분) 및 비조사 조건에서 생존 및 사멸분석으로 항종양 활성을 평가하였다. MTT 분석(도 32 및 도 14) 결과와 유사하게, 근적외선을 조사한 PB-Dpeg@nGO 처리군이 가장 큰 항종양 활성을 나타내었고(도 18의 A 및 도 19의 A), 이는 유동 세포 계측법을 사용한 세포사멸 프로파일 분석에서 추가로 확인할 수 있었다(도 18의 B 및 도 19의 B).
Hoechst 염색 분석에서는 세포핵의 응축된 염색질을 나타내는 밝은 반점(녹색 화살표로 표시)을 관찰할 수 있었고, 상기 밝은 반점은 근적외선을 조사한 PB-Dpeg@nGO 처리군(도 20의 A에서 f)에서 가장 많았으며(도 20의 A), 이 반점들은 세포사멸로 인한 세포의 형태학적 변화를 나타낸다. 활성산소(ROS) 생성 또한 근적외선을 조사한 PB-Dpeg@nGO 처리군에서 가장 높았다(도 20의 B에서 f). 상기 결과는 PB-Dpeg@nGO 처리로 인해 화학- 및 광-치료 효과가 결합 및 향상되어 세포사멸이 현저히 증가함을 의미한다.
세포 이동 실험에서는 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO 처리군 모두 근적외선 조사 조건에서 암세포의 이동을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며(도 21), 이는 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO가 암세포의 원거리 이동을 감소시켜 전이를 억제할 가능성이 있음을 의미한다.
4. 생체내 효능
생체내 분포(in vivo biodistribution)를 평가하기 위해 PANA-1 종양-보유 마우스에 PB-peg-Cy5.5 및 PB-peg@nGO-Cy5.5를 정맥 주사로 투여한 후 다른 시간대에 모니터링하였다. PB-peg@nGO-Cy5.5 투여군의 경우 주사 6시간 이후부터 종양에 축적되는 것을 명확하게 확인할 수 있었고, 축적 정도는 PB-peg-Cy5.5 투여군과 비교하여 유의미하게 많았다(도 22의 A). PB-peg-Cy5.5 또는 PB-peg@nGO-Cy5.5 투여군의 형광 강도 프로파일 또한 상이하였으며(도 22의 B), 이 결과는 생체 내에서도 nGO 부착에 의해 스텔스 효과가 향상됨을 의미한다.
PB-peg-Cy5.5 또는 PB-peg@nGO-Cy5.5의 주사 48시간 후에 마우스를 희생시키고, 주요 장기 및 종양을 절제하여 상기 물질들의 종양-회귀(tumor-homing) 능력을 확인하였다. PB-peg-Cy5.5 투여군의 경우 종양 부위에 어느 정도 축적되나, PB-peg@nGO-Cy5.5 투여군과 비교하여 상당히 많은 양이 심장과 간에 축적되었고(도 23), nGO 부가에 의한 효과를 재확인할 수 있었다. 상기 결과는 종양 내에 PB-peg@nGO가 더 많이 축적되므로 망상 내피 시스템(reticuloendothelial system)에 의한 제거가 지연될 수 있고, 목적하는 종양 치료 조건을 만들기 위해 PB 나노케이지 분산액의 구성을 변형시켜 PB 나노케이지 전달체의 종양 축적 활성을 조절할 수 있음을 의미한다.
근적외선 조사(808 ㎚, 2 W/㎠로 5분) 조건에서 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO의 종양 세포 제거 능력을 평가하기 위해 생체내 온도 상승 정도를 열 카메라로 확인하였다. PB-Dpeg와 PB-Dpeg@nGO 투여군은 종양 부위에서 각각 46.8℃ 및 57.8℃로 온도가 상승하는 반면, PBS 투여군에서는 유의미한 온도 상승이 나타나지 않았다 (도 43). PB-Dpeg@nGO 투여군의 우수한 광열 활성은 PB-Dpeg에 nGO의 부착으로 인하여 열 발생과 저장이 증가하였고, 향상된 스텔스 효과로 종양에서 더 많이 축적되기 때문일 것으로 생각된다. 상기 결과는 PB-Dpeg@nGO를 사용하여 생체 내에서 광열 치료 효과를 발생시키는데 있어 근적외선 조사가 2분이면 충분하다는 것을 보여준다.
종양 부피 및 체중을 측정하여 근적외선 조사 및 비조사 조건에서 PB 나노케이지 전달체의 전신 효과를 평가하였다. 그 결과, 24일의 모니터링 기간 동안 독소루비신 단독 투여군(G2)에서 종양 부피가 현저히 증가하는 것을 확인하였고, 이는 독소루비신 단독 투여가 다른 투여군(G3-G6)과 비교하여 종양 세포를 파괴하지 않음을 시사한다. 특히, 근적외선 조사군(G4 및 G6)에서 화학 요법 및 광열 요법의 조합에 의해 종양 성장이 현저히 억제되었고, 이는 근적외선이 종양 부위에서 독소루비신 방출을 유도하고, 또한 고열로 인한 종양 제거를 유발하기 때문이다(도 25의 A; G1: 대조군, G2: 독소루비신 단독 투여군, G3: PB-Dpeg 투여군, G4: PB-Dpeg(NIR) 투여군, G5: PB-Dpeg@nGO 투여군 및 G6: PB-Dpeg@nGO(NIR) 투여군). 체중은 독소루비신 단독 투여군에서 유의미하게 감소하고, 다른 투여군(G3-G6)에서는 증가하는 것으로 나타나 상기 종양 부피 모니터링 결과와 일치하였다(도 25의 B). 상기 종양 부피 및 체중 모니터링 결과는 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO가 생체 내에서 현저한 전신 독성을 유발하지 않으면서 항종양 활성을 나타낼 수 있음을 의미한다.
헤마토자일린&에오신 염색 결과 또한 본 발명의 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO가 주목할만한 독성이 없음을 뒷받침한다(도 26의 A 및 표 1). PB-Dpeg 투여군(G3 및 G4) 또는 PB-Dpeg@nGO 투여군(G5 및 G6)에서 세포사멸 마커인 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP를 명확히 확인할 수 있었고, 세포사멸 마커는 근적외선 조사 조건(G4 및 G6)에서 더욱 강하게 나타났다. 그러나 세포 증식 마커인 Ki-67과 혈관신생 마커인 CD-31의 수준은 감소하였고, 이러한 경향은 근적외선 조사 조건에서 더욱 강화되어 췌장 종양 세포에 대한 PB-Dpeg 및 PB-Dpeg@nGO의 항종양 효과를 확인할 수 있었다.
Figure pat00001
조직병리학적 변화를 확인한 결과, 심장, 간, 비장, 폐 및 신장에서 현저한 변화는 확인할 수 없었다(도 26의 B 및 표 2).
Figure pat00002
한편, PB-Dpeg에 대한 nGO 부착의 생물학적 안전성을 조사하기 위해 용혈 실험을 수행하였다. 그 결과, 독소루비신 자체가 명확하게 적혈구의 용혈을 유도함에도 불구하고, 독소루비신을 포함하는 PB 나노케이지 처리군에서 현저한 용혈 현상은 일어나지 않았으며, 독소루비신 함량이 증가하여도 용혈 여부에는 차이가 없었다(도 27; PC=양성 대조군, NC=음성 대조군, 1=독소비신 (10 ㎍/㎖), 2=PB-peg (50 ㎍/㎖), 3=peg@nGO (50 ㎍/㎖), 4=PB-peg@nGO (50 ㎍/㎖), 5=Dpeg@nGO (독소루비신 10 ㎍/㎖), 6=PB-Dpeg@nGO (독소루비신 10 ㎍/㎖), 7=Dpeg@nGO (독소루비신 200 ㎍/㎖) 및 8=PB-Dpeg@nGO (독소루비신 20 ㎍/㎖)).

Claims (12)

  1. (a) 프러시안 블루로 이루어진 나노케이지; 및
    (b) 상기 나노케이지에 로딩된 목적물질 및 스텔스 성분을 포함하는 목적물질 전달체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 나노케이지는 0.5 내지 10 ㎚ 직경의 공극이 형성된 것인, 목적물질 전달체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 목적물질 및 스텔스 성분은 나노케이지의 공극에 로딩되는 것인, 목적물질 전달체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 목적물질은 약물, 항체, 핵산, 세포, 펩티드, 효소 및 호르몬으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 목적물질 전달체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 약물은 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 픽산트론, 사바루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에르다피티닙, 아벨루맙, 악시티닙, 라무시루맙, 트라스트주맙, 펨브롤리주맙, 다롤루타미드, 알펠리십, 폴라투주맙, 아테졸리주맙, 펙시다티닙, 베네토클락스, 셀리넥소, 엔코라페닙, 두벨리십, 글라스데깁, 아팔루타미드, 세미플리맙, 렌바피닙, 로라티닙, 목세투모맙, 니볼루맙, 모가물리주맙, 탈라조파립, 이보시데닙, 라로트렉티닙, 다코미티닙, 길테리티닙, 코판리십, 브리가티닙, 이노투주맙 오조가미신, 아칼라브루티닙, 에나시데닙, 이브루티닙, 더발루맙, 리보시클립, 네라티닙, 미도스타우린, 아베마시클립, 시타라빈, 니라파립, 카보잔티닙, 올라라투맙, 루카파립, 그라니세트론 및 베네토클락스로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 목적물질 전달체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 스텔스 성분은 생체적합성 고분자인 것인, 목적물질 전달체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜, 글리콜 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-코-글리콜산, 알지네이트, 히알루론산, 폴리-L-리신, 젤라틴 및 콜라겐으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 목적물질 전달체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 목적물질 전달체는 나노케이지 표면에 나노크기 그래핀 옥사이드가 부착된 것인, 목적물질 전달체.
  9. (a) 프러시안 블루로 이루어진 나노케이지; 및
    (b) 상기 나노케이지에 로딩된 항암제 및 스텔스 성분을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  10. (a) 프러시안 블루 및 폴리비닐피롤리돈의 용액을 수열반응시켜 프러시안 블루 나노케이지를 제조하는 단계;
    (b) 프러시안 블루 나노케이지 분산액에 목적물질 및 스텔스 성분을 첨가하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)의 분산액을 진동 노즐 장치로 분사시키는 단계를 포함하는 목적물질 전달체의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (a)의 수열반응은 50 내지 100℃에서 3시간 내지 50시간 동안 수행되는 것인, 목적물질 전달체의 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 제조 방법은 단계 (b)의 프러시안 블루 나노케이지 분산액에 나노크기 그래핀 옥사이드를 추가로 첨가하는 것인, 목적물질 전달체의 제조 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114984245A (zh) * 2022-05-31 2022-09-02 华侨大学 负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统及其制备方法和应用
CN115072740A (zh) * 2022-06-23 2022-09-20 齐齐哈尔大学 一种核壳结构普鲁士蓝纳米球的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Black-Phosphorus-Incorporated Hydrogel as a Sprayable and Biodegradable Photothermal Platform for Postsurgical Treatment of Cancer. Adv. Sci. 2018, Mar 3;5(5):1700848.
2. Indocyanine Green-Conjugated Magnetic Prussian Blue Nanoparticles for Synchronous Photothermal/Photodynamic Tumor Therapy. Nano-Micro Lett. 2018;10(4):74.
Theranostics, 6(1), 2016, pp.40-53* *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114984245A (zh) * 2022-05-31 2022-09-02 华侨大学 负载青蒿琥酯和亚甲基蓝的中空普鲁士蓝纳米载药系统及其制备方法和应用
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