JPH06504274A - 微細粒子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 微細粒子 この発明は、細胞感染または機能不全が関与する病的状態の治療的または予防的 処置への微細粒子剤の使用に関する。

多くのヒトおよび動物疾患は、たとえばウィルス感染、細菌感染（たとえば、マ イクバクテリア感染）または原生動物感染または癌性機能不全により、体細胞の 感染または機能不全が関与している。一般に生体の免疫系は外来物質に対処する ことができるが、感染した細胞または機能不全を示し始めた細胞を認識し破壊す ることは常にできるとは限らない。このことは、病原体が感染細胞内に長期間休 眠状態で止どまる場合や、またＨＩＶ感染の場合がそうであるように、免疫系の 細胞に感染することによって該疾患が生体の自己防御畦を弱める場合などのある 種の感染の場合に特に深刻である。

寄生体が宿主細胞内で複製を余儀なくされるウィルス感染に加えて、知られてい る細胞内病原体の範囲は広く、結核、リステリア、クローン病および癩病に係る 病原体並びにプルセラ、リケッチアおよびレジオネラが含まれる。

そのような疾患の治療のための治療剤の開発に向けられた研究努力の殆どは、複 雑な有機化学物質の製造に向けられてきたが、これらは全体として感染細胞また はリスクにある細胞にそれほど効率的に送り込まれない。

本発明は、活性な無機剤を組み込んだ微細粒子剤（該微細粒子は、エンドサイト ーシス、さらに詳しくは食作用を可能とするサイズである）を投与することによ り、無機活性剤の有効な送達を達成できるという理解に基づいている。この投与 経路は、とりわけ魅力的である。というのは、複雑で化学的に一層デリケードな 有機薬剤と違って無機剤、とりわけ金属カチオンおよび放射性核種は一般に、エ ンドサイトーシスによる粒子の取込みの間または取込みの後に通常起こる比較的 激しい化学的環境に暴露された結果としての活性の喪失に対してそれほど感受性 はないからである。

それゆえ、一つの観点において、本発明は、治療学的または予防学的に有効な元 素の原子またはイオンを含有する生理学的に許容し得る好ましくは無機の材料を 該元素を含有する微細粒子剤の製造に使用することを提供するものであり、層剤 は、該粒子またはその断片をエンドサイト−シスによって該生体の細胞中に送り 込むことを包含する、ヒトまたは動物の生体の治療的または予防的処置に使用す るものである。

他の観点において、本発明は、ヒトまたは動物、好ましくは哺乳動物の生体の予 防的または治療的処置法を提供し、該方法は、治療学的または予防学的に有効な 元素の原子またはイオンを含有する生理学的に許容し得る好ましくは無機の材料 の粒子からなる微細粒子剤を該生体に投与して、該粒子またはその断片を該生体 内の細胞中にエンドサイト−シスによって送達することを特徴とする。

さらに別の観点において、本発明は、少な（とも１種の薬理学的担体または賦形 剤とともに、治療学的または予防学的に有効な元素の原子またはイオンを含有す る生理学的に許容し得る好ましくは無機の材料の細胞内に取り込まれ得る粒子を 含有してなる医薬組成物を提供する。

エンドサイトーシスによる「活性な」元素の体細胞中への送達が達成されるよう に、該活性な元素の担体として有効に働く該粒子は、生体内への投与と標的細胞 によるエンドサイト−シスとの間に出会えるように、一般に体液中で実質的に不 溶性であろう。もちろん、粒子サイズの多少の減少は許容できるし、また、エン ドサイト−シスによる取込みが望まれる生体ゾーンにてまたは生体ゾーンを通ま れ得る粒子がそのような部位に長期間存在するのを確実にするため、所望なら該 粒子は、もちろん、保護コーティングまたは崩壊剤を用いてもよい。

投与経路は、標的細胞によるエンドサイト−シスが起こる生体部位に該粒子が送 達されるようなものであればいかなる経路によってもよい。このことは、もちろ ん、標的とする細胞のタイプに依存し、このことはまた処置しようとする状態ま たは予防的処置をしようとする状態に依存する。しかしながら、一般に、全身の 脈管系中、筋組織中、局所的または外部排泄管を有する生体腔中（とりわけ、膣 中、または吸入により、肺胞マクロファージに接近するために肺中）への投与が 好ましい経路である。

粒子がヒトまたは動物中に静脈内注射されると、該粒子は単核細胞およびマクロ ファージによるエンドサイト−シスによって比較的速やかに（たとえば数時間以 内に）血流から除かれるか、または循環末梢血の単核細胞によって細胞内に取り 込まれる。このことは、ウサギ内に注射した混合粒子サイズ（２０〜１０１００ ｎの５ｅＦｅ標識粒子について示されている。一連の１ｍｌ血液試料を耳静脈か ら取り、図７に減少する放射性カウントによって示されるように、約５０％クリ アランスが２時間以内に達成された。膵臓、肝臓、リンパ節、肺による、および ランゲルハンス細胞による、局所投与後の膣マクロファージによる、および骨髄 中の単核系細胞による、中枢神経系のミクログリアによる、および胃腸管リンパ 組織によるこのような仕方での粒子の取込みはよく知られた現象であり、ある場 合には、微細粒子コントラスト剤、たとえば肝臓および膵臓腫瘍の磁気共鳴像に おいてＴ！コントラスト剤として用いられる超常磁性フェライト粒子の投与によ る診断造影技術において種々の器官の像コントラストを改良する手段として利用 されている。この観点から、これまで、他のタイプのマクロファージおよび単核 細胞への粒子の分布およびゆっくりとした分解は、粒子の生体分布の望ましくな い観点として考えられてきた。

しかしながら、感染に係る疾患または粒子を取り込む細胞の機能不全に係る疾患 の場合には、もし該粒子を治療的または予防的に有効な剤をこれら細胞中に送達 するのに用いるなら、この分布パターンは全く偶然によるものであるとみること ができる。

このことは、マクロファージが感染（たとえば、ＨＩＶ感染）したときに、Ｃ３ またはＦｃを有する構造を選択的に消化する能力を失ってから長期間経った後に も粒子の「非特異的」な食作用を依然として有することが知られているので、マ クロファージが感染（とりわけ、マイコバクテリアおよびレトロウィルス感染） しやすい疾患の細胞レベルでの治療または予防において特に重要である。

それゆえ、マクロファージおよび単核細胞（主要な病原体保有宿主、インキュベ ージジン部位およびＨＩＶなどの疾患の発病攻撃対象である）は、病的変化の最 も遅い段階に至るまで、本発明に従って用いる粒子を摂取する能力、従って該粒 子中に含まれる治療的または予防的に活性な元素を細胞中に受け入れる能力を保 持している。

本発明に従って用いる粒子の標的細胞への送達は、投与経路によって影響される のみならず、該粒子を投与する媒体の修飾、該粒子のサイズ、コーティングもし くはバッキング、または特定細胞タイプによる取込みを促進するための該粒子の 表面の修飾によっても影響される。

それゆえ、たとえば静脈内投与した粒子が中枢神経系のマクロファージに接近で きるように、たとえば該粒子の投与と同時または好ましくは該粒子の投与の前に マンニトールなどの剤を静脈内投与することにより脳血管関門の有効性を減少さ せるのが望ましい。この目的のため、たとえば２０％水溶液中、１ｇ／ｋｇ体重 の投与量にてマンニトールを都合よく投与することができる。

同様に、標的細胞による取込みを促進するために細胞付着分子（ＣＡＭｓ）また は分子断片を該粒子の表面にカップリングすることができる。標識ＣＡＭの適当 な選択により、またはＣＡＭｓの範囲の選択により、非感染（しかし感染しやす い）細胞によりまたは異なる感染段階の感染細胞により優先的に取込まれる（食 作用される）ようにすることができる。

種々の活性元素が種々の細胞毒性または病原体複製抑制作用を示すので、このこ とは、組み合わせた治療的および予防的処置を達成するための手段としてまたは 病原体の組み合わせに対するもしくは幾つかの複製段階にある一つの病原体に対 する治療的処置を行うための手段として用いることができる。

ＣＡＭｓは典型的に、粒子取込みの選択性を向上させ、それゆえ実際に感染して いるまたは感染していないマクロファージの亜集団に向けるように、２通りの仕 方で用いることができる。あるものはＣＤ４　（またはｇｐ１２０結合部位）を 結合してあり、他のものは結合していないかまたはＦｃを結合しである粒子の混 合物を投与する場合、第一のセットはＨＩＶ感染細胞によって食作用を受けやす いであろうし、第二のセットは非感染細胞によって取り込まれやすいであろう。

別の態様として、食作用を受けるとしても遥かにゆっ（りと食作用を受ける一層 小さな粒子を用い、これらにイムノアドヘシン（ｉｓ■ｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ） または抗ｇｐ１２０抗体を結合させ、食作用と同様に免疫経路によって感染細胞 中に導入させる。さらに、ｇｐ１１６タンパク質自体またはｇｐ４１の融合ペプ チド中に変異を有するかまたは有しないｇｐ１２０／ｇｐ４１　ＨＩＶエンベロ ープ複合体またはｇｐ１２０タンパク質のＣＤ４結合部位のみを該粒子に結合さ せて、ＨＩＶウィルスの選択性をまね、ＣＤ４陽性細胞中に優先的に導入される ようにする。

マクロファージおよび単核細胞によって取り込まれ得ることに加えて、本発明に 従って用いる粒子は他の感染細胞またはリスクにある細胞または癌性（機能不全 の）細胞によっても取り込まれてもよい。とりわけ興味深いことに、治療的／予 防的に有効な粒子は、神経細胞、肉腫細胞およびＴ細胞（ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝 子を安定に発現するジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）　Ｔ細胞を含む）などの細胞 によって取り込まれることが示されている。

本発明に従って用いる粒子中の「活性な元素」は、一般に粒子／放射線放出に対 して細胞毒性作用を示し得る放射性核種、一層好ましくは所定の細胞感染の開始 もしくは進行または機能不全細胞の代謝をカチオンの形態にて妨害する金属であ る。この後者の場合のカチオン細胞療法では、この技術の効力は、感染生物が治 療用カチオンから防御する能力が比較約２しいのと比較して宿主動物（たとえば 、ヒト）細胞が治療用金属カチオンに対して耐性があるまたは不活化する（たと えば、キレート化または単離によって）ための比較的有効な機構の間にある差異 と密接に関連している。この効力はまた、少な（とも部分的には、該治療用カチ オンのための種々の酵素、タンパク質または他の生体分子の平衡定数または親和 定数の差異によっている。

細胞感染（たとえば、レトロウィルス感染またはマイコバクテリア感染）の場合 、感染因子の代謝または複製を妨害する（たとえば、レトロウィルスの複製にと って極めて重要な逆転写（ＲＴ）酵素の機能を妨害することによって）金属カチ オンを細胞内崩壊により放出する本発明による粒子を用いることができる。それ ゆえ、ＲＴのＭｇ２４依存性、ＲＮアーゼＨのＭｎ”７Ｍｇ”依存性およびｇａ ｇタンパク質の保存されシスティンに富んだ／ＣＣＨＣｒジンクフィンガー」部 位およびｔａｔタンパク質のシスティンに富んだ２量体部位はすべて、ＨＩＶ感 染性を抑制するためのカチオン細胞療法の可能な攻撃対象である。

無機クリスタライト（たとえば、エンドサイト−シスを行う細胞内で出（わす化 学的環境中で徐々に崩壊するセラミック金属酸化物結晶性マトリックス）の使用 により、比較的非毒性の機構による生理学的に活性な元素の逐次の遅い細胞内放 出が可能となる。そのような遅放出機構は、「薬剤」投与が比較的頻繁でない、 たとえば１週間毎、２週間毎、または１力月毎であってよいことを意味する。

下記では特にＨＩＶ療法に関してカチオン細胞療法を例示するが、他の細胞内病 原体もまたそのような治療に対して感受性であり、適当なカチオン、カチオン混 合物および本発明に従って用いる粒子内のカチオン負荷レベルの選択が、比較的 直接的な実験室試験、たとえば問題とする金属イオン／金属イオン混合物に対す る特定病原体の応答を示すインビトロ試験に基ついてなすことができることを理 解すべきである。それゆえ、例示として、ＨｒＶ以外のレトロウィルス、たとえ ばＳＩＶ、ＭｏＭｕＬＶおよびＡＭＶの応答をＲＴアッセイによりインビトロで モニターすることができる。

本発明に従ってカチオン細胞療法を行うためのエンドサイトーシスを受け得る粒 子に負荷することのできる金属の範囲は極めて広く、実際、実質的にいかなる金 属をもこのようにして送達することができる。標的細胞中に天然に存在する金属 、並びに天然に存在するカチオンと競合する金属または他の仕方で病原体に対し て抑制作用を示す金属を考慮することができる。それゆえ、カチオン細胞療法は 、たとえば通常存在するカチオンの濃度を変化させることによりまたは別のカチ オンを供することにより、広範囲の選択的に変化させた細胞内カチオン環境を得 るのに用いることができ、研究は多くの場合、感染因子がそのような操作に対し て宿主細胞よりも一層感受性であることを示唆している。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）による ある種のヒト細胞タイプの感染により引き起こされる。このウィルス感染および 発病経緯の種々の局面を攻撃する種々の薬剤戦略が開発されている；しかしなが ら、ＡＩＤＳ感染の有効な治療または治癒は存在しない。感染した者はすべて該 疾患のために死亡すると予測され、現在、感染者は世界中で１０００万の人々を 含む。

現在研究中の最新の単−剤治療には、ヌクレオシド類似体またはタンパク質抗体 などの小さな分子が関与している。しかしながら、ＨＩＶにより特に感染した細 胞は大きな粒子（該ウィルスと同様のサイズの粒子を含む）を攻撃する本来的活 性を有しており、本発明の抗ＨＩＶ治療粒子はこれら細胞のこの天性の性質を利 用している。さらに、ＨＩＶが高い病原性を有し比較的速やかに変化する能力を 有するので、単一の治療における複数の攻撃経路に注意が向けられるべきであり 、この発明は単一の微細粒子剤において複数の攻撃点を組み合わせる別の仕方を 提供する。実際、一般に本発明に従って用いる粒子は１または２以上の有機薬剤 を含むコーティングを有していてもよく、それゆえ組合せ治療に用いて該粒子中 に含まれる活性元素と協力してまたは相乗的に該有機薬剤を作用させることがで きる。

ＨＩＶはレトロウィルスであり、このことは遺伝情報がＤＮＡではなくＲＮＡに コードされていることを意味する。ＨＩＶは、構造が極めて変化しやすい糖タン パク質のコートを有する。しかしながら、ｇｐ１２０と呼ばれるコートタンパク 質の一つはＣＤ４と呼ばれる抗原を認識および結合する非可変領域を有し、この ことが該疾患の進行の鍵であると思われる。

ＣＤ４は、Ｔヘルパーリンパ球上および単核細胞グループ中の種々の関連細胞上 に存在する。これら単核細胞としては、血液単核細胞、膵臓マクロファージ、肝 臓クツペル細胞、リンパ節樹状細胞、種々の位置にあるランゲルハンス細胞、肺 にある肺胞マクロファージ、および中枢神経系にあるミクログリアおよび関連食 作用細胞などの細網内皮系（ＲＥＳ）細胞が挙げられ、−緒になってＨＩＶ感染 の主要な位置を形成する。

ＨＩＶウィルスｇｐ１２０コートタンパク質がＣＤ４＋細胞と接触すると、互い に結合し、かくして立体配置変化を引き起こし、ヒトＣＤＪ＋細胞の細胞膜と融 合する関連ｇｐ４１エンベロープ糖タンパク質の融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ） 　ドメインを暴露し、かくして該ウィルスが該細胞中に導入される。そこで、該 ウィルスの逆転写（ＲＴ）酵素が活性化され、該ウィルスＲＮＡのＤＮＡコピー が作られ、該ウィルスＤＮＡが該細胞の正常なりＮＡ中に挿入される。挿入され たら、該ウィルスＤＮＡはウィルスのｒｔａｔＪ　（転写のトランス作用因子） タンパク質およびウィルスのｒｅｖ　（ピリオン発現のレギュレーター）タンパ ク質の転写制御下で繰返し読み取られ、大量のウィルスタンパク質転写物および ウィルスＲＮＡを産生ずる。一連のプロテアーゼおよびタンパク質修飾工程を経 て、新たなウィルス粒子が生成する。

この過程の間、複数のコピーのｇｐ１２０が細胞膜中に現れ、未感染のマクロフ ァージ上のＣＤ４抗原に結合する。ついで、感染細胞が未感染細胞に結合および 融合し、該細胞の運命をも定める。このようにして複数の捕捉された単核細胞の ンンンチウムが生成される。また、この過程の間にＣＤ４を有するＴ細胞および 他のＴ細胞が感染単核細胞に接近し、かくして接触により該ウィルスに感染する ようになる。

今日、ＨＩ　Ｖ感染の唯一の成功した医薬治療はＡＺＴであり、これは該ウィル スの遺伝子物質の構成ヌクレオシドの一つの類似体である。この薬剤はウィルス の複製過程を妨害し、かくして該疾患の進行を遅（する。しかしながら、これは 治療するものではなく、その毒性のため、それと相乗的に機能し得る薬剤のさら なる鋭！研究が必要である。また、ＡＺＴに耐性を示すＨＩＶの新規株が報告さ れている。同様に効力のある他の種々のジデオキシヌクレオシド類似体が存在し 、これらは精力的に研究されている。

３つの主要な新規薬剤戦略が存在する。一つは、多数の化合物から抗ウィルス活 性を探求する広範囲のスクリーニングプログラムの間に発見されたベンゾジアゼ ピン薬剤群の幾つかの類似体が関与する。この作用の正確なメカニズムは不明で あるが、ＡＺＴの場合のように、逆転写酵素によるウィルスＤＮＡの生成が作用 の核心であると思われる。これら薬剤および関連薬剤が精力的に探求されている 。

第二の新規戦略は、硫酸デキストラン分子がウィルス粒子に不可逆的に結合する という知見に基づいている。このことは、ウィルス粒子に吸着することのできる 多数の硫酸ポリマーの関連する知見をもたらした。そのような剤を使用する最良 法は明らかでない：それら薬剤がウィルスに結合するが、ついで該ウィルスとと もに単核細胞中に一掃されるのであれば、それら薬剤は実際、該ウィルスの感染 性を促進する。

戦略の第三のグループは、免疫学およびＣＤ４＋タンパク質およびｇｐ１２０分 子上のレセプターに焦点を合わせた遺伝子工学タンパク質が関与する。ＣＤ４タ ンパク質またはその関連部分はＨＩＶに付着し、感染細胞の表面上に呈示されて いるｇｐ１２０に付着するであろう。可溶性のＣＤ４を投与するだけでｇｐ１２ ０認識部位がブロックされ、それゆえ個々のウィルスによる細胞感染を防ぐ。

ＣＤ４はまた、感染細胞に選択的に細胞毒性剤を送達するための送達ビヒクルと して用いることもできる。それゆえ、一つの方法において、組換えＣＤ４をシュ ードモナス外毒素に付着させて、この強力な細胞毒素を感染細胞に送達させるよ うにする。同様の試みとして、ＣＤ４をリジン（有毒植物レクチン）に付着させ る。ジエネンテックは、ｇｐ１２０に結合するＣＤ４の領域とヒト抗体Ｆｃ領域 （たとえば細菌感染において抗体結合後に細胞毒性攻撃を引き起こす部分）から の細胞毒性部分とからなる認識／ターゲティング部分とのハイブリッドである「 イムノアドヘンン」分子を提唱している。

これらＣＤ４関連戦略のすべてにおいて、患者をあまり重篤に害することな（投 与毒素により充分な細胞毒性を供与する問題、またはイムノアドヘシンの場合に は、患者のＦｃに基づく細胞毒性系が危険にさらされているときに（ＡＩＤＳの 正に本質）感染単核細胞に対する激しい攻撃をいかにして刺激するかという問題 がある。

ＡＩＤＳの治療のために研究されている多数の薬剤が存在するけれども、また微 細粒子剤（たとえば金属粒子）の種々の先使用が存在するけれども、細胞取込み による細胞レベルのカチオ）／療法貸たは短飛程の放射線療法を達成するための 粒子の使用についてはこれまで示唆されていない。それゆえ、たとえば、これは ウィルス感染の治療のための金属酸化物粒子の最初の使用である；これはまた、 ＨＩＶ感染の治療のためのβ−エミッター粒子またはオージェ電子放射の最初の 使用である。これはまた、逆転写酵素の遅放出選択的金属カチオンインヒビター を送達する手段としての金属酸化物セラミック粒子の最初の使用である：さらに 、これはまた、ＡＩＤＳの治療へのスピネル媒体マイクロ波シアチルミーの最初 の応用である。

本発明に従って用いる粒子は、実質的にいかなる生理学的に許容し得る材料であ ってもよい：しかしながら、上記のように、該粒子は一般に細胞外体液、とりわ け血清または血漿に実質的に不溶性の材料からできている。有機マトリックス（ たとえは、デキストランコーティングマイクロスフイアまたはラテックスナノス フイアなどの天然または合成の本質的に不活性な有機ポリマー粒子）を用いるこ ともできるが、特に好ましくは該粒子は無機のとりわけ合金および金属硫化物ま たは酸化物であろう（これらは細胞内で自然に崩壊して本発明に係るカチオン細 胞療法において活性な金属カチオンを放出するので）。

多くの金属酸化物構造を無機粒子として利用でき、この点に関してスピネル、ざ くろ石およびペブロスキー石が特に有用であることがわかった。しかしながら、 他のよく知られた不活性な好ましくは本質的に水不溶性の金属化合物を用いるこ とができ、とりわけ所望の金属カチオンまたは放射性同位元素を包含させ得るも のなどの格子を有するものを用いることができる。合金により、混合した金属も もちろん含まれる。

好ましい態様において、該粒子は、所望ならたとえばデキストラン炭水化物でコ ーティングした、たとえばスピネルまたはざくろ石構造のコア金属酸化物結晶を 含み、該粒子の全サイズは５ｎｍ〜１５μｍ、好ましくは１０ｎｍ〜５μｍ、と りわけ１０ｎｍ〜１μｍ、特に１０〜１１００ｎ、さらに詳細には〕０〜５０ｎ ｍおよび最も詳細には２０〜３０ｎｍであり、ターゲティング残基（ＴＭ）は任 意に粒子当たりＴＭの濃度（たとえば、約１＝１の低さであってよい）にてコー ティングに結合している。特定の細胞タイプによる、特定の因子の感染した細胞 による、または感染の特定の段階にある感染細胞による該粒子の高度に特異的な 取込みを達成するためにＴＭＩＩ識を用いる場合には、核剤は活性なＴＭを欠く 粒子を実質的に有しないのが望ましい。１１００ｎよりも小さい粒子の場合は、 最後の合成、アフィニティー精製および濃縮の後に０．２または０．１ミクロン マイクロ濾過により粒子組成物を滅菌するのが好ましい。他の仕方としては、タ ーゲティング残基（たとえば、タンパク質またはタンパク質断片）に結合させる 前に軌滅菌を使用することができる。

所定の態様の微細粒子金属酸化物剤の使用は、金属酸化物結晶コアを沈澱させる 最初の沈澱工程に使用する元素および同位元素（放射性核種）、および使用する コーティングおよびターゲティンク残基の種類に依存する。各使用の場合につい て金属／核種、コーティングおよびターゲテイング残基を選択して、調製法の簡 単さの一般的利点、およびこのようにして調製した材料により達成することので きる新たなタイプの薬剤分布の利点の両方を得ることができる。

本発明によるレトロウィルス感染のカチオン細胞療法において、２つの平行した 戦略でＲＴのＭ　ｇ２“依存性に攻撃することができるーヌクレオチドのリン酸 残基に結合していないまたは結合したシトツル（ｃｙｔｏｓｏｌ）中に競合金属 イオンを送達することにより。生理学的ｐＨにある殆どの金属イオンは加水分解 を引き起こす傾向があり、その結果、該金属イオンはポリマー性の含水酸化物と して沈澱する。しかしながら、幾つかの酵素系においてスカンジウムをマグネシ ウムアンタゴニストとしてインビトロで使用できることがわかった。この３価の 第一系列遷移金属は実際上非毒性であるが、その唯一の知られた臨床的使用は静 菌剤としてのものである。

第１［ＩＢ族中のスカンジウム（Ｓｃ）、イツトリウム（Ｙ）およびランタン（ Ｌａ）を含む３価ランタン系列元素並びにランタン系列の１４の化学的に類似し た希土類元素は、２価金属とその生理学的酵素基質との間の相互作用の研究にお いて過去２０年間に広範に開発されてきた。スカンジウムを除いて殆どはカルシ ウムと類似のイオン半径を有し、種々の活性部位の研究において有用であった。

それは漸増形の電荷／表面密度（ｇｒａｄｕａｌｌｙ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ 　ａｒｒａｙ　ｏｆ　ｃｈａｒｇｅ／５ｕｒｆａｃｅ　ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ）を 与えるからである。

しかしながら、スカンジウムは全グループの中で最も毒性が少ないことに加えて 、イオン半径、還元電位、および電気陰性度がマグネシウムと類似しており、そ の安定な３＋酸化状態が主として異なっている。スカンジウムは最近、アルミニ ウムとの類似性ゆえに開発されており、この仕事によりその溶液化学が一層高く 評価されている。

筋肉アクチンにおけるＭｇ２−とＳｃ”の置換が示されている。しかしながら、 マウスＳ４９リンパ腫細胞のβ−アドレナリンレセプター−アデニレートシクラ ーゼ複合体上の２つのＭ　ｇ２一部位の一方においてＳｃ”がＭ　ｇ２−の競合 アンタゴニストとして働くという証拠もまた非常に興味深い。Ｓｃ”とＬａ３４ とはＡＴＰに対して類似の親和性を有するがアゾニレ−トンクラーゼに対して異 なる作用を有するので、抑制の原因としての非産生性（ｎｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｖｅ）　Ｓ　ｃ　Ａ　Ｔ　Ｐ−の生成を除外することができた。アゴニスト選 択性に係るＭ　ｇ２“部位ではなく活性化に係るＭｇ”部位における作用もまた 、Ｓｃ’＋による抑制が、ある種の非特異的な金属／タンパク質相互作用による ものではなく該酵素上のＭ　ｇ２一部位における特異的な相互作用によるもので あることを示していた。

ある種の細菌ＤＮＡポリメラーゼにおいては、２価カチオンに対して酵素分子当 たり２１もの多くの部位が存在し、その結合親和性および酵素機能に対する重要 さは各部位で大きく異なっている。ＨＩＶまたは他のレトロウィルスのＲＴカチ オン部位の数および機能は完全には理解されていないが、密接に関連したグルー プＣのレトロウィルスにおいてカチオン選択（ｃａｔｉｏｎ　ｐｒｅｆｅｒｅｎ ｃｅ）において差異があること、およびＨＩＶＲＴの不完全な２量体構造のため にそのようなカチオンの特有の役割となることは明らかである。カチオン依存の 可能性は、ＨＩＶＲＴタンパク質のＲＮＡ５ｅＨ部分における２つのマンガン／ マグネシウムカチオン部位の証拠によってさらに拡大される。

これらの理由のため、本発明によるカチオン細胞療法のためには、Ｓｃ”。

Ｙ３′″、およびＬａ”、並びに幾つかの他の一層重いランタン系列元素、およ びＭｇトよりもＭｎ”のためには他のポリメラーゼ酵素が好ましいため、第一お よび第二系列の遷移金属の他の金属イオンの使用に考慮が払われてよい。目的イ オンとしては、Ｃｏ”、Ｎｉ”、Ｃｕ”、およびＺｎ”および第二系列がらはＲ ｕ”、およびＰｄ２”が挙げられる。リチウムおよびストロンチウムもまた考慮 に値する。

従って、本発明の一つの態様において、崩壊してレトロウィルス複製抑制（たと えばＲＴ活性抑制）金属イオンを放出する粒子をカチオン細胞療法粒子のための 粒子として用いる。ＲＴ不活性及ぼす種々の金属イオンの影響に関する実験を行 い、大部分の１価、２価および３価金属カチオンがＲＴ不活性影響を及ぼすこと がわかった。この影響は、元素およびその濃度並びに研究している特定のウィル ス感染に依存する。ＨＩＶＲＴについては、２価イオン、とりわけＰｄ。

Ｚｎ、ＣｕおよびＮｉ１これらのうちでも特にＰｄが効力を有するように思われ る。スカンジウムおよび第六系列の３価金属イオンも幾つかのウィルスに対して ＲＴ活性抑制作用を示すが、それらはＨＩＶに対しては効力が低いように思われ る。　カチオン細胞療法はまた、亜鉛結合部位を妨害することによっても行うこ とができる；それゆえ、幾つかのＨＩＶタンパク質中に存在するＣｙｓ−Ｘ、− Ｃｙｓ−Ｘ、−Ｈｌｓ−Ｘ、−Ｃｙｓ　（ＣＣＨＣ）および他のシスティンに富 む金属結合保存配列であると推定されるものの機能および構造を特徴付ける試み において、種々の研究者によって金属イオンのパネル（たとえば、Ｃｄ５Ｃｏ、 Ｃｕ。

Ｆｅ、Ｈｇ、Ｍｎ、Ｚｎ）が以前に探求されている。これら部位の幾つかへの亜 錯結合の機能的重要性は明らかでない。

ｇａｇタンパク質中のＣＣＨＣ配列における変異は、ゲノムＲＮＡを有しない非 感染性のウィルス粒子の産生をもたらす。ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ上のＮＦ−、Ｂ部 位に結合してウィルス活性化を引き起こすエンハンサ−タンパク質ＨＩＶ−ＥＰ １およびＨＩＶ−ＥＰ２は、ともに古典的なゼノブス（Ｚｅｎｏｐｕｓ）　ＴＦ 　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ａ亜鉛結合部位を有する。ｔａｔタンパク質は保存されたシステ ィンに富む領域における亜鉛またはカドミウムの作用により２量体化し、該領域 での変異はウィルスの複製を妨害する。本発明者らはまた、Ｐｄ”などの代用金 属カチオンを有する粒子をジャーカット−ｔａｔ　Ｔ細胞が取込み消化したとき にｔａｔ機能が変化することをも明らかにした。このような亜鉛を必要とするか または保存されているが生理学的または病理学的に亜鉛を結合する種々の部位が 複合して複数関与しているため、標的ウィルスを選択した後、該感染生物のタン パク質および病理作用に対する有効な妨害を最適にするために金属カチオンの適 当な濃度および混合を選択するための比較的直接的なインビトロ試験を行う必要 がある。

この理由およびその他の理由から、導入カチオン源としての消化された粒子に対 する全体的な細胞の応答を用い、該消化細胞が感染するかまたは選択された病原 体生物にその後に暴露されたときの該粒子の有効性を評価した。このことは、培 養ヒト単核細胞または培養Ｔ細胞による食作用に対して非結合またはＣＤ４結合 粒子の調製物を用い、これら細胞をついで、たとえばＨＩＶで感染させることに より都合よく行った１選択した細胞株がシンシチウム生成に感受性のものである 場合は、このことを感染性の評価として用いることができる。

競合の第一の候補は、その４座配位子銘体のイオン半径が４座配位結合した亜鉛 と類似している金属カチオンである。これらにはＰｄ”およびＬｉ”が含まれ、 これらはともに一定範囲のイオン半径を提供する。以前に評価された金属パネル は、余りにも小さいイオンよりも大きいイオンの方が一層容易に収容されること を示唆している。

パラジウムはマンガンと極めて類似したイオン半径および配位子化学を有してお り、有機キレート錯体に含まれた場合に、レトロウィルスの逆転写酵素を抑制す ることが長い間知られている。しかしながら、パラジウムカチオンを臨床に使用 することはなかった。というのは、非常に高い全身レベルを引き起こすことなく 充分な量で感染細胞に選択的にそのようなカチオンを送達する方法がなかったか らである。

ＨＩＶ感染した患者に投与する粒子中にパラジウムを含ませると、非常に有用な 分布が達成される。特別の指向抗原がなくとも、これら粒子はマクロファージ系 によって飲み込まれるであろう。このようにして、未感染マクロファージは該粒 子を摂取し、ゆっくりと分解するであろう。それゆえ、これら細胞は、細胞内パ ラジウムの長期間にわたる定常状態放出を有するようになる。このことは、種々 の他の作用を有することに加えて、侵入してきたウィルスの逆転写酵素の機能を 抑制するであろうから、レトロウィルス感染に対して有効な防御を付与するであ ろう。

このようにして、最も攻撃を受け易い細胞において、この防御元素の比較的高い 細胞内レベルを達成することができる。β線放出粒子との組合せ療法において、 感染患者の未感染細胞において有用であるので未分化（ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ）抗原またはＦｃを結合した粒子の混合物の一部としてパラジウムを用いる。

種々の濃度の活性なカチオン（たとえば活性な遷移金属カチオン）を逆転写酵素 活性のアッセイに用いた場合、３つの一般的な応答パターンが認められる。

（１）カチオンが酵素と無関係で活性化しないが、その後のマグネシウムの添加 による完全な活性化をも可能にする：　（２）カチオンが酵素を完全にまたは部 分的に活性化し、その後のマグネシウムの添加が全（または殆ど効果がないかま たは該酵素活性を実際に減少させる。または（３）カチオンが酵素を活性化せず 、その後のマグネシウムによる活性化を防ぐ。いま一つのパターンがカチオンに よって示される、（４）低濃度で存在する場合には酵素を活性化するが、高濃度 で存在する場合には該酵素を実際に抑制し、マグネシウムによる活性化を防ぐ。

同じことはＡｇｔ”および他の種々の金属カチオンにも適用される。

これら４つのパターンは種々のカチオンによって示されるが、所定のカチオンが ＲＴ活性に及ぼす作用は関与するウィルスの株および種に依存する。レトロウィ ルス七ロ二−マウス白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）で得られる結果は、リチウ ムおよびストロンチウムに対してはパターン１を、コバルトおよびマンガンに対 してはパターン２を、銅、ニッケル、パラジウム、スカンジウムおよびランタン 系列元素に対してはパターン３を、亜鉛に対してはパターン４を示す。

ヒト免疫不全ウィルスについては異なる活性系列が認められる。ＨＩＶについて は、アルミニウムはパターン１を示し、リチウムおよびコバルトはパターン２を 示し、銅、亜鉛、パラジウム、ニッケルおよびルテニウムはパターン３を示し、 マンガンはパターン４を示す。

Ｍｎ”、Ｐｄ”およびＮｉ”を２価カチオンとしてスピネル結晶中で用いてデキ ストランコーティングカチオン源を結晶化し調製すると、ウィルス活性に対して 重要な作用が認められる。１ｍｇ／ｍｌの３価カチオン塩化物水和物に等価な粒 子の濃度を培養ヒトマクロファージ細胞（ＴＨＰ−１株）に１または２時間暴露 して粒子を取り込ませ、その後、細胞を洗浄し新たな借地中に入れた。２４時間 後、ＨＩＶのＲＦ株の小さな感染性接種物を種々の培養ウェル中に導入し、種々 の未感染コントロールについても観察した。３．７．１１および１４日の間隔で 細胞をカウントし、トリパンブルーで生存力を評価し、逆転写酵素アッセイのた めに細胞不含上澄み液を回収した。

得られたデータから、コントロールと比較してＦ　ｅ／Ｆ　ｅ粒子（すなわち、 ２価および３価金属がともに鉄であるフェライト）は宿生細胞の増殖を促進する がウィルスの広まりまたは複製には影響を及ぼさないことが明らかになった。Ｆ ｅ／Ｍｎ粒子は細胞の生存力を幾らか損なうが、ＨＩＶ感染を完全に抑制する。

最も有用なことに、Ｆｅ／Ｎｉおよび最も驚くべきことにＦｅ／Ｐｄ粒子は細胞 の生存力に対して最小の影響を有するかまたは実際に細胞の生存力を向上させる が、ＨＩ　Ｖ感染を劇的かつほぼ完全に抑制し、それゆえ治療的または予防的に 用いることができる。

ＨＩＶなどによる細胞内感染の細胞レベルカチオン療法（核酸複製に対するカチ オン競合妨害による）の手段を提供することに加えて、微細粒子エンドサイト− シス経路は、感染のあらゆる選択された段階を妨害するために感染細胞または感 染感受性細胞中にカチオンを投与する手段を提供する。それゆえ、カチオンは核 酸に直接結合し、異常な基質を形成しくたとえば、Ｍｇ”　ＡＴｐの代わりにＭ ｅ”　ＡＴＰ　（Ｍｅ’＋は治療的または予防的金属カチオンである））、また は該カチオンは細胞骨格またはヌクレオカプシドのタンパク質の重合を妨害し、 膜の特性を変化させ、タンパク質／核酸相互作用を妨害しまたは病原体の増殖に 必要な反応物の利用可能性を減少させる。

無機粒子（たとえば、スピネル粒子）は、デキストラン溶液中で金属塩から沈澱 させることにより安定な水性コロイドとして挙動するようにすることができる。

沈澱後に該デキストランを硫酸化することにより、またはアクリル酸／ポリビニ ルアルコール硫酸を用いて沈澱を行うことにより、これら分子の特別の）（ＩＶ 付着特性を該粒子に付与することができる。そのような粒子、またはＣＤ４また は抗ｇｐ１２０を結合した類似の粒子を静脈内注射した場合、これら粒子は循環 しているあらゆる遊離のウィルスを飲み込み、すでに感染しているマクロファー ジ中に運んでいくであろう。該粒子が分解するにつれ、コーテイング物質は細胞 内でウィルスの複製に対する抑制作用を有し続けるであろう。

単一細胞カチオン療法に加え、本発明はまた細胞レベル放射線療法をも包含する 。

一般的に言って、これまで放射線療法剤の静脈内投与は小さな分子の使用に限ら れていた。免疫ターゲティングを望む場合は、現在の技術は一般に限られた数の 放射性原子（通常、わずかに１または２）を抗体にカップリングさせることを含 む。しかしながら、本発明は高濃度の放射線放出原子を有する微細粒子剤（たと えば、スピネル）を合成する可能性を提供する。

大きな粒子、たとえばスピネル陽電子エミッター（ＳＰＥ）などの陽電子エミッ ターまたはβ電子エミッターを含有する金属酸化物を構築することにより、放出 された大部分の陽電子や電子の飛程の大きな減少を達成することが可能になる。

細胞毒性イオン化の殆どは実際の粒子の位置の１００〜３００ミクロン内で起こ り、５０％は１００ミクロン未満以内で起こるであろう。さらに、ブラッグピー ク効果のため、該粒子中でエネルギーの大部分を失った陽電子からも実質的なイ オン化収率が得られるであろう。

それゆえ、陽電子エミッター念有粒子に付着したウィルスは非常に高線量率のイ オン化放射を受け、多くはこのようにして破壊されるであろう。粒子が単核細胞 により摂取されると、そのような細胞の多く（すでに感染を運命付けられている ）は放射線効果のために速やかに死ぬであろう。エミッターの半減期が２〜４時 間の範囲のもの（たとえば、スカンジウム４３）を選択した場合、活性の殆どは 細胞が死ぬ前に使い果たされ、９該粒子は他の食作用細胞による消化のために放 出されるであろう。必要なら、一層大きな毒性のためにｐｌｕｇなどのα−放出 核種を用いることもできる。α−エミッターの特別の価値は、非常に小さな非減 速粒子を合成した場合でさえも該粒子の周囲の非常に短い飛程でしか有効でない ことである。最後に、パラジウム１０３などの電子捕捉核種を高線量／崩壊、非 常に短い飛程オージェ電子細胞毒性効果のために用いることができる。多（の放 射性核種の崩壊特性は知られており、適当な放射性核種を比較的容易に選択する ことができるーたとえば、［ピアリオデインク・テーブル・オブ・ザ・エレメン ツ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ　ｔａｌ）ｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）　Ｊ 　、ブラッグ（Ｆ　１ｕｃｋ）およびホイマン（Ｈｅｕｌｌｌａｎｎ）　ｍ、Ｖ ＣＨ１１９８６参照。

ＨＩ　Ｖ感染の治療は極めて重要であるが、以前に注目された上記方法はまた広 範囲の他の細胞内病原体に適用できる。これら病原体の多くはＡＩＤＳのセット （ｓｅｔｔｉｎｇ）に非常に重要であり、それゆえ、ＡＩＤＳウィルス並びに他 の病原体を同時に攻撃できる治療が特に有用であろう。危険にさらされた宿主中 において重要性の増大している細胞内病原体としては、ヒストブラスマ症、トキ ソブラスマ症、リステリア、カンジダ、およびマイコバクテリウムアビウム細胞 間複合体が挙げられる。マクロファージによって消化される粒子による治療に供 することのできる他の細胞内病原体としては、トリパノゾーマ、ナイセリア、マ イコバクテリウム・チューバキュローシス、リーシュマニア、サルモネラ・ティ フィ、レンオネラ、プルセラ症、リケッチア、サイトメガロウィルス、クラミジ ア、シゲラ、幾つかのスタフィロコッカス、スローウィルスまたはクロイッフェ ルドーヤコブなどのブリオン（ｐｒｉｏｎｓ）　、マイコプラズマ、単純ヘルペ ス、ＥＢＶ、水痘帯、またはＪｃ梨型進行多病巣性白質脳症に付随するバポバウ ィルスが挙げられる。

本発明者らは、たとえば、培養中のヒト細胞のＨＴＬＶ−１ウイルス（血液癌お よび巣状を髄障害の両方を引き起こす）による感染経路に影響を与えるようにカ チオン源粒子を用いた。

いかなる細胞内病原体についても、適切な細胞内投与量を達成することが多く・ の薬剤で比較的できにくいために通常の療法は面倒である。それゆえ、細胞外液 中の高い抗生物質濃度に暴露する必要がなくマクロファージによる消化の後も生 き残ることのできる病原体は、感染宿主に対して深刻な危険を呈示する。実際、 上記パラグラフで言及した生物の多くは、抗生物質の現代においてさえも恐ろし い災難を与え続けている。

これら種々の細胞内生物に対する攻撃には、リポソームなどの種々の薬剤担体の 使用が含まれる。しかしながら、これら剤の疎水性のコーティングおよびターゲ ティングの困難さのため、これまでのところ成功していない。問題の一つは、殆 どの微細粒子剤が膵臓および肝臓のマクロファージによって飲み込まれてしまっ て他のマクロファージ区画に到達することができない傾向があることである。本 発明に従って用いる粒子は、あるサイズまたは一連のサイズまたはある範囲のサ イズを有し、一層全身的なまたは一層特異的なエンドサイトーソスが起こるよう にターゲティング残基を運ぶ。それゆえ、任意に親水性コーティング（たとえば 、デキストランコーティング）を有する比較的小さな（たとえば、約１０〜５０ ｎｍ）粒子を用いることにより、一層広範囲のマクロファージ部位に対して有効 な細胞内送達ビヒクルを提供することができる。さらに、これら生物の多くは、 宿主細胞に比べて金属カチオンの異常な濃度に対する耐性が低い。それゆえ、Ｈ ＩＶのカチオン療法のために上記で説明した考慮の多くはこれら生物に対しても 同様に適用できる。

別の考慮として、デキストランコーティングとともにまたはデキストランコーテ ィングの代わりに粒子コーティング中に種々の抗生物質薬剤を含ませる可能性で ある。ＡＩＤＳ、！’、者においては、このことにより、日和見同時感染生物に 対する特異的抗生物質の細胞内高投与量の投与と同時にＨＩＶのカチオン細胞療 法を行うことが可能となる。さらに、種々のカチオンがウィルス、細菌／酵母、 および宿主の機能を妨害する場合には、特定の抗生物質剤または抗ウィルス剤（ たとえば、ＡＺＴ）を添加することにより、感染生物に対しては相乗的に攻撃し ながら宿主細胞は完全な２つの攻撃を受けないようにすることができる。

種々の混合金属粒子調製物に対するコントロール細胞培養の感受性を探求してい るうちに、本発明者らはＦｅ／Ｍｎ混合金属酸化物などのある種の調製物が細胞 の生存力を減少させることなく宿主細胞の増殖を抑制する傾向があることを見い だした。この種の薬理効果は、癌治療にとって望ましい化学療法剤の機能である 。これら粒子は骨髄に容易に接近することができるので、適当な食作用が存在す るかまたは誘発することができる種々の癌のための細胞内療法（ターゲティング および非特異的の両刃）を行うための容易な手段を提供する。本発明者らの実験 は、１肉腫細胞において細胞培養増殖力学におけるこの変化を確認した。さらに 、５１　Ｆｅ標識デキストラン−コーティング金属酸化物粒子および電子顕微鏡 を用い、肉腫細胞が確かに該粒子を摂取することが確認された。本発明による細 胞レベル癌療法において、臨床効力は、速やかに分裂する細胞およびその有糸分 裂機構のカチオン置換に対する感受性に部分的に基づく。さらに、多くの癌の場 合、ウィルスとりわけレトロウィルスが原因であるので（ツール・ハウゼン（Ｚ Ｕ＋−Ｈａｕｓｅｎ）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２５４　：　１１６７〜１１７３　 （１９９１）参照）、本発明によるカチオン細胞療法の効力は、ウィルス性発癌 の種々の段階に対する該治療カチオンの効果を包含するであろう。同様の考慮は 、たとえば多発性硬化症などの他のウィルス感染疾患の治療的または予防的処置 にも適用できる。

同様の考慮はまた、移植のために宿主の免疫機能を抑制したり宿主の疾患に対し て移植片を防ぐために組織を処理する意図がある場合にも適用できる。微細粒子 カチオン療法は、過度の毒性を有することなく限定した期間細胞分裂を抑制する 機会を提供する。

ウィルス性肝炎の治療への使用に関する適用可能性の考慮は、種々の亜型に対す る異なる戦略を含む。Ｂ型肝炎においては、肝臓障害は他の面では比較的健康で あるが感染している肝細胞の表面に呈示されている抗原に対する炎症応答に実質 的に由来する。カチオン源を局所マクロファージおよび他の炎症性細胞中に導入 することにより、炎症過程の局所抑制を達成することができるが、そのような肝 細胞の表面上のウィルスタンパク質の呈示がとくに有効である。ＣおよびＤなど の他の型のウィルス性肝炎においては、ウィルス感染は肝細胞にとって細胞変性 であり、カチオン源のための脂質コート中の細胞表面レセプターは該粒子を肝細 胞よりもマクロファージ細胞中に向けるのように働くであろう。

治療的および予防的使用に加えて、本発明に従って用いる粒子は造影法において も有用である。これまて、ＨＩＶ感染の造影はＡＩＤＳに関連した特徴的な感染 の研究に王として限られていた。しかしながら、本発明による微細粒子剤は、Ｘ 線コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャニングまたは磁気共鳴造影（ＭＲＩ） によりコントラスト剤として視覚化できるように設計することができ、磁気共鳴 分光学（ＭＲ３）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）または単光子放出コンピュー ター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）により検出することができるので、その分布を極め て厳密に追跡することが可能になる。そのような使用のため、超常磁性の粒子ま たは適当な金属原子または放射性核種を組み込んだ粒子を都合よく用いることが できる。感染部位を造影したり該粒子が取り込まれた体の領域中の像コントラス トを一層正確に増したりする機会は、疾患を研究したり診断したりする上のみな らず治療の経過の追跡や実際の展開やこれら剤の最適化においても興味がもたれ る。

生化学的分離のための磁気粒子の使用は長い歴史を有する。未感染細胞に対立す るものとして感染細胞に対する該粒子の選択性のインビトロ研究のため、磁気／ ＣＤ４粒子と混合すべき非磁気粒子をｍ製することができるであろう。ついで、 。

該粒子を摂取した標的細胞を粒子を摂取しなかった細胞から分離することができ 、ついでウィルスの存在についてアッセイすることができる。

種々のアッセイのために放射能を用いる必要のある場合は、該粒子自体の非干渉 （ｎｏｎ−ｊ、ｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）評僅のためにＭＲ分光学的特性を用いる ことができる。

インビボでは、房中の中心カテーテルなどの磁化カテーテルを用いて注射後の粒 子を回収することができるであろう。このようにして、遊離のウィルス粒子をコ ーティングした粒子は、該粒子を摂取した循環単核細胞がそうするように循環系 から除くことができる。このことは白血病細胞の分離に用いる技術と類似してい るが、ＡＩＤＳのウィルス感染に対しては新規な使用であろう。

ある場合には、フェリ磁性粒子、強磁性粒子または超常磁性粒子を、選択した波 長の放射に応答して温度が増加するように合成することができることが知られて いる。この方法は、実際の医学用途に適用することは困難であった。なぜなら、 殺す必要がある細胞中で該粒子の細胞内分布を達成するための一貫した動機また は手段がなかったからである。しかし戸から、そのような粒子をＨＩＶ感染した 細胞にターゲティングすることができれば（たとえば、ＣＤ４で表面標識するこ とにより）、分布の問題は充分に解決されるであろう。これら粒子を酔脈内に導 入し、ＣＤ４結合のため、感染した単核細胞およびマクロファージにより選択的 に食作用を受けることができる。適当な分布が達成された後（注射後１〜２時間 ）、ＣＤ４標識を有する粒子を活性化するように向けられたマイクロ波周波数の 全生体放射を轡者に受けさせることができる。これら粒子は充分に加熱して有意 の細胞毒性効果をもたぜるとともに、同時に行った他の細胞毒性治療との相乗効 果を得るようにすることができる。

本発明の無機粒子の金属酸化物、硫化物まｔ；は合金マトリックスの金属は天然 に存在する放射性同位元素を有してもよいが、細胞レベル放射線療法のためまた は組合せ療法およびシンチグラフィーまたはＰＥＴ造影のために（放射性核種が 、該粒子を摂取した細胞のための診断マーカーとして働く）本発明に従って用い る粒子は、天然のものに比べて有意に高い放射性同位元素の発生含量を有する、 たとえば、陽電子エミッターの場合、１１００ｎ結晶当たり平均して少なくとも １、おそら＜１０またはそれ以上の原子を有するであろう。多（のβ１エミッタ ーの天然の発生は１０！６中に１未満であり、粒子当たり１の放出原子でも充分 である。

本発明の他の新規な「塗付（ｄｏｐｅｄ）　Ｊ粒子には、治療的または予防的に 活性なまたはマーカー核種は、たとえば、天然の酸化物、硫化物または合金中の 不純物のような、天然に存在する同位元素であってよい一部の場合も、本発明に よる粒子は一般に天然の値よりも高い値でそのような原子を含有することによっ て識別されるであろう（たとえば、１１００ｎ粒子中に１００またはそれ以上） 。

本発明の粒子はコーティングしてもコーティングしなくてもよく、該粒子の生理 学的耐性は少なくとも一部はそのようなコーティングに由来してよい。さらに、 本発明の粒子は、生体ターゲティング残基、たとえば抗体、抗体断片、ＣＡＭま たは標的病原体のタンパク質またはタンパク質断片、たとえばＨＩＶのｇｐ１２ ０からのものなどのコーティングタンパク質断片にカップリングしてよい。

本発明の粒子はスピネルまたはざくろ石構造であるのが好ましい−これらタイプ の粒子の製造はすでによく知られており、ここでさらに記載する必要はない。

しかしながら、興味のため、このタイプの超常磁性結晶をＭＲＩコントラスト剤 として使用することがナイコムド（Ｎｙｃｏｍｅｄ　ＡＳ）　、ンエリング、ア ドバンスト・マトリックス（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ　Ｉ　ｎｅ 、　）などの種々の特許公報（たとえば、ＵＳ−Ａ−４８６３７１５（ヤコブセ ン（Ｊ　ａｃｏｂｓｅｎ）　）およびＵＳ−Ａ−４８２７９４５（グロマン（Ｇ ｒｏｍａｎ）　）　）　ｌ：おいて提唱されテイル。

本発明に従って用いることのできる広範囲のターゲテイング残基またはＣＡＭが 存在する。これらには、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、レセプター、エ ンドルフィンなどのペプチド、ステロイド分子、ウィルス断片またはコートタン パク質、種々の炭水化物を含む細胞表面抗原、レクチン、イムノアトへシン、神 経伝達物質分子、増殖因子、イムノモデュレータ−（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａ ｔｏｒｓ）　、プロスタサイクリン、プロスタグランジン、インターロイキン、 ロイコトリエン、および標的細胞による該医薬剤のエンドサイト−シスまたは他 の経路による取込みを促進するタンパク質または他の分子が含まれる。ターゲテ イング残基を有しない非コーテイング粒子（たとえば、パラジウムフェライト） の使用は、それにも拘わらず非常に興味がもたれる。

安定な水溶液中の微細粒子としての金属酸化物結晶の合成は、結晶学および塗料 染料工業において興味がもたれてきた。しかしながら、関連する進歩の多くは磁 性の研究の外部でなされてきた。

本明細書に記載する剤の多くは、特別に合成した磁鉄鉱（ＦｅｓＯ４）を含む。

磁鉄鉱の結晶構造は、スピネルＭｇＡ＋２０４と呼ばれる鉱物に基づく。しかし ながら、金属イオンとしてマグネシウムおよびアルミニウムの代わりに鉄（Ｉ［ ［）および鉄（ＩＩ）イオンを特定の比率で格子・Ｆｅ（Ｉ［）（Ｆｅ（Ｉ［［ ））２０４において用いた場合は、特定のセットの電子配列および交換が生じ、 その結果、自然磁気が発生する。

磁鉄鉱の基本構造は、酸素原子の最密面心立方結晶であり、金属イオンは該結晶 中の隙間空間に位置している。これら隙間は、酸素原子配置に関して異なる隙間 位置を有するｒＡＪ部位およびｒＢＪ部位に分けられ、それゆえ該結晶内で２つ の識別される部分格子を生成する。天然に存在する鉱物「スピネル」（ＭｇＡ　 Ｉ　２０４）　１．：おいてハ、Ａ！位はＭｇ（ＩＩ）で満たサレ、Ｂ部位１； ！Ａｌ（ｍ）で満たされている。部分格子中への原子の割り当ては、部分的には サイズによって決定される。へ部位は半径０３〜０６オングストロームの原子を 受け入れ、一方、Ｂ部位は０６〜１．０オングストロームの原子を受け入れる。

通常のスピネル結晶ではへ部位は２価原子で充填され、一方、Ｂ部位は３価原子 で充填される。

磁鉄鉱は、へ部位に３価鉄を有し、Ｂ部位に２価鉄と３価鉄との混合物を有する ので「逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）スピネル」結晶である。各結晶サブユニットは、３ ２個の酸素、８個のＡ部位Ｆｅ（ｍｌ）原子、８個のＢ部位Ｆ　ｅ　（ｍ）原子 および８個のＢ部位Ｆｅ（ＩＩ）原子を有する。スピネル磁鉄鉱の一般式はＭ　 ｔ　（ＩＩ）　＋　（Ｆ　ｅ　（Ｉ［［））ｚ（Ｏ）、で表され、式中、Ｍｔは ２価遷移金属または適当なイオン半径の１価および３価金属の電荷の平衡した混 合物である。

Ａ部分格子中のＦｅ（ＩＩ［）原子は、Ｂ部分格子中のＦｅ（ｍ）のスピン磁気 に対峙し打ち消すような位置にある。しかしながら、この打ち消しの後、Ｂ部分 格子中に残留する８個のＦｅ（Ｉ［）は全く対峙されないスピン磁気を有する。

各Ｆｅ５０゜化学式単位に対して、対峙されないＦｅ（ＩＩ）原子のために４ボ ーア磁子の正味の磁気が存在する。それゆえ、各結晶サブユニットは、長さが８ ３７ｐｍの面を有する立方体中に充填された３２ボーア磁子の磁気を有する。

フェライトの磁気は、種々の隙間中に異なる金属を置換することにより変化させ ることができる。たとえば、Ｍｎ（ｎ）は５ボーア磁子の磁気を有するので、式 Ｍｎ（Ｉ［）（Ｆｅ（ｍ））ｚｏ４の逆スピネルを生成させるとユニット当たり ５ボーア磁子の磁気を生成するはずである。Ｚｎ（ＩＩ）の使用は全く異なる効 果を有する。

これは未充填のｄ軌道を有せず、それゆえ磁気モーメントは０である。しかしな がら、亜鉛はへ部位中に入り込み、結晶に対して通常のスピネル構成を起こさせ る傾向がある。それゆえ、各式ユニットにおいて、０モーメントの亜鉛が５ボー ア磁子のモーメントを有するＦｅ（ｍ）と対峙する結果、各ベアについて正味の モーメントは５となり、残留するＦｅ（ＩＩＩ）もまた対峙しないため式ユニッ ト当たりの正味のモーメントは１０ボーア磁子となる（結晶サブユニット当たり ８０ボーア磁子）。

実際には、この状況は大きな結晶中の全数の部位のうち低い割合でしか行き渡ら ない。Ｚｎ（ＩＩ）は実際にはへ部位には大きすぎるため（半径０．７７オング ストローム）、亜鉛濃度が５０％を越えると逆スピネル構造への変換が起こる。

この配列においては、Ｆｅ（Ｉ［［）はＦｅ（Ｉ［［）と対峙して互いに打ち消 し合い、対峙していないＺｎ（Ｕ）はモーメントを有さないため、このフェライ トの正味の磁気は０である。このことは、下記に記載する異核トレーサーなどの 応用（磁気が必ずしも望ましくない）において時々有用である。

１９５５年に極めて小さな磁気粒子の挙動を記載するために超常磁気という用語 が提唱された。基本的な考え方は、小さな粒子では充分な熱振動が存在するため 、磁気双極子軸が種々の方向に飛び移る傾向の方が干渉性ドメインとして単一の 固定軸と並列させる傾向よりも大きいということである。

粒子のサイズが１０＠原子の範囲の臨界サイズを越えて増大すると、安定になり 自発的に磁化した単一のドメインとして干渉的に並列されるようになる。この臨 界ザイズ以下では、磁化しやすさは温度およびサイズに依存する。一層高い温度 での小さい粒子は、検出可能に磁化されるには強力な外部場を必要とする。しか しながら、いったん磁化が達成されたら、全磁気は該粒子のサイズに直接的に関 係付けらねる。

超常磁性粒子の挙動は緩和寧（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ）によって記載 され、これは該粒イ内の局所磁気モーメントが自発的に飛び移る率を反映する。

飛び移るには、該粒子の容量および該物質の異方性に正比例するエネルギーｌＩ ！！壁を克服しなければならない。ドメインサイズの粒子では、実験温度でフ１ ルソビング（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）を起こすにはエネルギー障壁が大きすぎるので 磁気は一つの単一の軸に沿って安定化する。サブドメインサイズではエネルギー 障壁が低すぎてフリラビング速度が速くなりすぎる。この転移が起こるサイズは 温度依存性であり、該粒子の組成にも依存する。（本発明の目的のためには、物 質が超常磁性であるかどうかを決定する関連温度は体温である）。

格子中の幾つかのＦｅ（ＩＮ）の代わりにコバルトなどのある種の金属で置換す ることにより、結晶の異方性が一層大きくなり、このことがフリツピングの速度 を遅くし、それゆえ安定なトメ−インのための臨界サイズを小さくする傾向があ る。

結晶マトリックス中に一層大きなイオンが含まれている場合には、スピネル構造 はそれらを収容することができない。このことは、ランタン系列の元素を用いる に際して特に重要である。しかしながら、ランタン系列元素はざくろ石結晶構造 により収容することができる。この結晶の天然の形態は、Ｃａ５ＡＩ！　（Ｓｉ ０４）ｓまたは３ＣａＯ，Ａ］ｔＯ，，３ＳｉＯ，である。組成Ｌｎ３ＦｅｂＯ ＋ｔ　（式中、Ｌｎはランタン系列元素である）でも類似の構造が得られる。（ イツトリウムを用いて得られる共通の例はＹＩＧまたはイツトリウム−鉄−ざく ろ石と呼ばれ、たとえばレーザーに用いられる）。少量のランタン系列元素はス ピネル結晶内に収容されるが、ざくろ石生成に有利な化学量論の方が一層大きな パーセントのランタン系列元素が含まれるので一層重要である。

新規なタイプのスピネル結晶では、コーティングしたコロイド状スピネル結晶の 調製においてアルミニウムの代わりにスカンジウムを用いる。これらのうちで最 も安定なのはＭｇ（ｎＸＳＣ（Ｉ［［））２０４またはマグネシウムスカンダイ ト（ｓｃａｎｄｉｔｅｓ）である。これらは本明細書に記載する幾つかの応用に おいて有用なビヒクルである。これら結晶は磁性を有しない。スカンジウムは安 定な３価の化学を有するが、イツトリウムおよびランタン系列元素と違って残り の遷移金属とイオンサイズが類似している。

金属塩からフェライトを沈澱させる方法は１８００年代にさかのぼり、改良され た鉄流体（ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄｓ）を開発する試みのなかで幾人かの研究者が これら方法を修飾している。エルモア（Ｅ　１ｍｏｒｅ）は、Ｐｈｙｓ、　Ｒｅ ｖ、　５４　：　３０９〜３１０（１９３８）において、水溶液中での超微細フ ェライト粒子のアンモニア沈澱を探求しており、該粒子が適用磁場に接近したと きにその凝集が増加することを初めて示した。

安定なコロイド鉄流体を開発するための次のステップは、磁気材料を細かな粉末 に破砕し、ついで該粉末を超音波処理によりオレイン酸中に懸濁する方法の開発 とともに１９６５年に現れた（ｔＪｓ−Ａ−３２１５５７２を参照）。タカダ（ Ｔａｋａｄａ）およびキヤ？　（Ｋｉｙａｍａ）は、Ｐｒｏｃ、　Ｉｎｔ、Ｃｏ ｎｆ、　（ＩＣＦ−１）　、Ｕ。

トーキジ−プレス（Ｕ、Ｔｏｋｙｏ　Ｐｒｅｓｓ）　（ホシノ（Ｈｏｓｈｉｎｏ ）ら編）、６９〜７１頁（１９７０）のなかで、磁鉄鉱の超微細結晶を沈澱する 方法を再研究し新規な酸化法を開発しているが、この仕事は該粒子を懸濁液中に 保持する問題とは取り組んでいない。

１／イマース（Ｒｅｉｍｅｒｓ）およびカラフ７う（ＫｈａｌａｆａｌＬａ）は 、Ｂｕ　ＭｉｎｅｓＴＰＲ５９・１３　（１９７２）において、破砕粒子の水性 懸濁液を得るためにアンモニアベブチゼーション法を用いた。彼等の最初の方法 においては、酸処理の後に超音波処理して溶媒分子との相互反応を誘発さゼ、該 粒子の凝集を防ぎ懸濁を維持している。その後、彼等は一層安定で希釈できる懸 濁液を得るためにエルモアのアンモニア沈澱法の修飾法を開発している（その際 、ドデカン酸の分子が磁鉄鉱粒子の表面上に化学的に吸着されている）（カラフ ァラおよび１ノイマース、ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎｓ　Ｍａｇ　１６　：　１７８〜 １８３　（１９８０）参照）。これにより、超常磁性粒子の希釈−安定な溶液が 得られた。

生物学者は生化学的分離を行う可能な手段として小さな磁性粒子に興味をもって おり、ドメインサイズの粒子をビーズ中に組み込む種々の手段を開発している。

これらは、最初に用いた形態においては可溶性である必要はなかった。しかしな がら、電子顕微鏡のための密な免疫特異的標識を得るために用いた方法に基づき 、モルディ（〜Ｉｏｌｄａｙ）による水性法（ＵＳ−Ａ−４４５２７７３および Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈ　５２　：　３５３−３６７　（１９８２） ）が種々の生物学的応用への道を開いた。

上記モルディの方法は、磁鉄鉱をコーティングするためにデキストランを用いた ア／モーア沈殿合成を含む。この結果、該懸濁液を用いて抗体を含む種々のタイ プの分子に結合させることができ、それゆえ種々のタイプの分離を行うのに用い ることができる超常磁性粒子の水性懸濁液が得られる。モルディ粒子の超常磁性 の利【へは、該粒子が適用磁場中にない限り磁気的に凝集する傾向がないことで ある。Ｊ−のことにより、一層精巧な化合物の調製が容易となり、一方、合成が 完了した後に必要な場合に磁気的性質を回復することができる。

ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら（ＵＳ−Ａ−４５５４０８８）は、そ れぞれサイズが約３Ｑｎｍの超常磁性磁鉄鉱粒子の集団が直径が約５００ｎｍの 一層大きな粒子１；群れをなして結合するノラン結合法を開発した（現在、ｒＡ ＭＩ−２５−１として市販）。この７ランマトリノクスにおいて小さな粒子は互 いに離れたままであり、それゆえ超常磁性を保持している。それゆえ、これら粒 子は凝集せず、比較的可溶性のままである。しかしながら、全体の大きな粒子の 全磁気モーメントは極めて大きく、生物学的分離を行うことができる。

サブミクロンコーティング鉄酸化物粒子の血管内Ｘ線コントラスト剤としての使 用が提唱されており、フィステルおよび動脈瘤の血栓症の磁性包含、感染治療の ための病巣ジオチルミーの生成における使用、骨髄からの腫瘍細胞の選択的除去 、およびＭＨＩコントラスＩ・剤としての使用を含む多数の他の医学的使用が他 の超常磁性粒子について記載されている。

治療的／予防的微細粒子剤の分野において、本発明は、合成の間の繰り返し精製 工程の使用が生化学的試薬としての粒子の性能を著しく向上させるという知見に より、特に改良された特性を達成するものである。これら精製により合成の間に 現れる溶解した金属イオンを除くことができるが、それは合成の間の調製物のゲ ル流特性（ｇｅｌ　ｆｌｏｗ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を損なう含水 酸化物として沈殿し得るからである。加えて、最初の調製後に一連の濾過工程を 用いることにより、標的細胞によるエンドサイト−シスに適したサイズの粒子を 選択することができる（たとえば、サイズが５００オングストロ一ム未満（デキ ストランコーティングを含む）のデキストランコーティングスピネル）。このこ とにより、合成の残りの部分中での粒子の流れ特性が保証され、１００〜５００ オングストロームの粒子（生理学的に多（の利点を有する）のみが製造される結 果となる。

最後に、ターゲティング残基を用いた場合、これらすべての措置をとるときに、 ターゲティング残基に結合しなかったすべての粒子を除去するとともに結合した ターゲティング残基が不活化するかまたは他の仕方で合成過程の間にその特異性 を喪失したすべての粒子を廃棄するために、再使用可能なアガロースペースのア フィニティークロマトグラフィー媒体の用途の広さおよび便利さを利用すること ができる。これら媒体の使用の可能性は極めて重要である。というのは、このこ とによって広範囲の標的粒子を相応じて精製するのに用いることのできる広範囲 のリガンドを有するアフィニティー媒体を調製することが可能になるからである 。

最ｒ結果は、粒子当たりほぼ完全に一つの活性なターゲティング残基を有する剤 である（すべての粒子は選択的に活性であり、有効に使用するに充分なほど小さ い）。ついで、これを所望により濃縮才たは調合し、必要なら小容量にて濾過滅 菌することができる。最後の滅菌は細菌の排除のための通常の０．２ミクロンフ ィルターを用い、または小さなマイコバクテリア汚染の除去を保証するための０ ．１ミクロンフィルターを用いて行うことができる。

高特異活性を得る別の方法は、調製物中の粒子のすべてを多数のターゲテイング 残基の分子で実際にコーティングすることである。これは、ターゲテイング残基 の製造が高価である場合に生成物の費用を著しく増加させること、粒子の抗原性 を増加させること、および多くの場合に該粒子の分布を望ましくない仕方で変化 させるという望ましくない効果を有する。固相支持体上のアフィニティークロマ トグラフィーにおける仕事から、アフィニティーリガンドのスペーシングおよび 密度が効力の重大な決定因子であることがよく知られている。

種々のタイプの微細粒子治療剤または診断剤の医学的使用に対して相当の関心が もたれている。

それゆえ、ライラダ−（Ｗｉｄｄｅｒ）（ＵＳ−Ａ−４８４９２１０）およびヤ コブセン（ＵＳ−Ａ−４８６３７１５）は、種々の合成法を用いて静脈内ＭＲ＋ コントラスト剤としての強磁性粒子の懸濁液の有効性を示している。グロマン（ ＵＳ−Ａ−４８２７９４５）は、超常磁性粒子の多数の別の合成方法を提供して おり、モルディによりインビトロ使用について開示されたものと類似した広範囲 のｆｉｆｆｋ粒子のＭＲ血管内使用を示唆している。彼らが記載する化合物はモ ルディ（ＵＳ−Ａ−４４５２７７３）により開示されたものと非常に類似してい るが、彼らは滅菌法および診断ＭＲ＋の関与する使用法を論じている。しかしな がら、グロマノの方法により製造される粒子はサイズが１００から５．０００オ ングストロームにわたっており、濃縮した最終形態において濾過滅菌することが できず、まｔ−モルディの化合物のように、調製の後半段階でアカロースペース のアフィニティー媒体を容易に通過しない多くの成分を含有するためにアフィニ ティークロマトグラフィーによって有効に精製することができない。グロマンの 生成物はオートクレーブする必要があるため、壊れ易いタンパク質リガンドの使 用は大幅に制限される。というのは、そのようなリガンドはオートクレーブに耐 えられないからである。生成物の最終滅菌が重要でな（なるようにグロマンの合 成を完全無菌設備を用いて行うこともできるが、このことは製造費用を著しく増 大させる。

他のタイプの微細粒子剤、たとえばミクロスフイアやナノスフイアもまた多（の 関心を呼んでいる。そのような粒子の組成には、種々のメック１月ノートからの ラテックスポリマー、ポリ乳酸、タンパク質／アルブミン、脂質および種々の他 の材料が含まれる（たとえば、Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｅ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｍｅｄ、５８　：１４　］、〜１４６　（１９７８）　、ＡＪＲ１４９：　８３ ９〜８４３　（１９８７）　、Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．６４　：　７５〜８８　 （１９７５）　、Ｊ、Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓ、　５　：１４７〜１５７　（１ ９８８）　、Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　５０７　：　１４１〜１．５４ 　（１９８７）　、Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　５０７　：　１２０〜１ ４０　（１，９８７）　、Ａｎｎ　ＮＹ　ＡｃａｄＳｃｉ５０７：　１０４〜１ １９　（１９８７）およびＲａｄｉｏｌ、　１６３　：　２５５〜２５８　（１ ９８７）参照）。これら粒子は、有機薬物送達システムとして、造影剤として、 および軸索移動の組織学的研究のために用いられている。これら粒子は独特の代 謝および生体内分布パターンを示し、多くの研究者のグループによる熱心な研究 の対象となってきている。そのような粒子の軸索移動のインビボ診断造影のため の使用または神経内経路および軸素移動を利用した薬物送達システムの一部とし ての使用もまたＰＣＴ／ＥＰ９１１０１７８０に記載されている。本明細書に言 及するこれらおよび他の公報および特許出願を、参照のため本明細書中に引用す る。

本発明に従って用いる粒子は、治療的または予防的に負荷するおよび任意に診断 のためにマークを付した無機結晶、たとえば放射性核種含有金属酸化物からなる のが好ましい。粒子が特定のターゲティング残基を有する本発明の方法において は、放射性核種は２つの役割（該粒子を摂取した感染細胞を殺す細胞毒性剤とし て、および検出すべきおよび可能なら造影すべき粒子の分布（および暗に疾患分 布）を可能にする診断マーカーとして）を有するこ゛とが思い起こされるであろ う。適当な放射性核種としては陽電子および電子β粒子を放出する多数の核種が 挙げられ、これらはすべて結晶格子中の置換分としてかまたはフェライトスピネ ル殻内の種子（ｓｅｅｄｓ）として（たとえば、Ｚ　ｒ　０２）　、金属酸化物 （たとえば、フェライトなどのスピネル）中に含まれる。一つの態様において、 マンガン（２５Ｍｎ”）　、鉄（ｚａＦｅＳす、コバルト（２７ＣＯ５５）　、 またはロジウム（４５Ｒｈ”）の陽電子放出同位元素をスピネル粒子、たとえば サブドメインサイズのフェライト粒子の合成に用いる。このタイプのフェライト 中にコバルトまたはマンガンを含有させることは以前は有効に行うのが困難であ ったが、所望の結晶構造（たとえば、ざくろ石またはスピネル）の化学量論を注 意深く考慮し、好ましくは日常的な実験による最適化の後にｐＨ１温度、前駆体 金属塩およびコーティング化合物の濃度、および沈殿後の加熱インキュベーショ ンの持続時間などの因子を注意深く制御するならば、コバルト、マンガン、また は他の金属を式ユニツト当たりの金属元素の数の１７３までの量を確実に導入し 、たとえば残りの２／３をＦｅ（ＩＩ＋）とすることができる。それゆえ、たと えばデキストランコーティング粒子については、一般に飽和デキストラン溶液か ら沈殿させるのが有利であるのがわかった。それゆえ、グロマン（ＵＳ−Ａ−４ ８２７９４５）により示唆されるように２価金属原子を１７２またはそれ以下に 対峙するものとして置換してよい。

ニオ１ら粒子は、デキストランまたは他の親水性分子で安定にコーティングし、 ついて所望ならコーティングを活性化し、抗体または本発明の方法に従って処理 すべき細胞による該粒子の取り込みを促進するあらゆるタイプの細胞付着分子に 共有結合的に結合させるような仕方で合成することができる。このようにして調 製した粒子は、陽電子源として陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）により、および超 克磁性粒子として磁気共鳴造影（ＭＲＩ）により検出することができるであろう 。

これら粒子の幾つかは、選択された周波数にて高感受性核として磁気共鳴分光器 （＼ｊＲ５）により、または２数または粒子濃度が充分である場合にＸ線ＣＴス キャニングにより検出することができるであろう。

、３Ｍｎ”でできた陽電子フェライトでは、放出検出は、半減期が５．５９日の 陽電子崩壊（β＋２７．９％、０．５７５ＭｅＶ、Ｅ、Ｃ，７２，１１％）およ び付随する（１００％、１．４３４ＭｅＶ；９４．５％、０．９３５ＭｅＶ；　 ９０％、０．７４４ＭｅＶ；　５％、１．３３ＭｅＶ；４％、１．２５ＭｅＶ； ３％、０．８５ＭｅＶ）の安定な、４Ｃｒ５２へのガンマ放出による０、５１１ ＭｅＶ消減光子に基づく。これは、長い神経移動、および腫瘍研究のための全モ ノクローナル抗体分布、およびＣＤ４陽性細胞の種々の集団の中での粒子分布の 評価に極めてよく適した崩壊半減期である。さらに、ちょうど０．５７５ＭｅＶ の比較的低い陽電子エネルギーでは、空間的解離が、ｐＨを含む活性な臨床使用 における陽電子エミッターに比べて実質的に良好である。高いガンマ線放出は幾 つかの状況において２、Ｍｎ５２の臨床使用にとって魅力ないものにしているが 、多くの代用が存在する。

陽電子フェライトはまた。、ｐｓｚを用いても作ることができ、ＺＪ”は半減期 が８．２７５時間の陽電子崩壊（β＋５６％、０．８０４ＭｅＶ；ＥＣ４３，５ ％）および付随するガンマ線放出（９９２％、０．１６９ＭｅＶ）を行ってＨＭ ｎ”″となり、２５Ｍｎ””は準安定であり半減期２１．１分で陽電子崩壊（β ＋９６．２７％、２．６３１ＭｅＶ；ＥＣ１，５３％）および付随するガンマ線 放出（９７゜８％、１．４３４ＭｅＶ）により崩壊して安定な２４Ｃｒ　Ｓ　２ となり、異性体内部変換（２２％、０．３７８ＭｅＶ）によって２５Ｍｎ”とな る。

このタイプの陽電子フェライトは、注入の日の間に強力な陽電子放出シグナルを 発し、半減期が５．７日の２５Ｍｎ５２の継続する陽電子放出に向かってかなり 迅速に減衰していくという利点を有する。

中間の半減期は、　Ｃｏ　Ｓ　５で作った陽電子フェライトにより提供すること ができ１、　Ｃｏ　５５は半減期１７５時間の陽電子崩壊（β＋７７％、１．５ ４ＭｅＶ：　ＥＣ２３％）および付随するガンマ線放出（７５％、０．９３Ｍｅ Ｖ；　１６．５％、１．４１ＭｅＶ：２０．３％、０．４７７ＭｅＶ；７％、１ ．３２ＭｅＶ：３％、１３７ＭｅＶ）を行って、、Ｆｅ５５となる。ついで、こ の鉄の核種は半減期２．７年のに殻電子捕捉（０，００６ＭｅＶ）によりゆっく りと崩壊して安定な２５Ｍｎ”となる。

このコバルト陽電子エミッターの半減期は幾つかの場合に有用であるが、その使 用は３．）”ｅ５５の崩壊パターンによって抑制されている：光子のエネルギー は極めて低いが、放射は長期間続き、実質的にすべてのエネルギーが非貫通放射 として組織内に沈積する。

第四のタイプの陽電子フェライトは＜ｓＲｈ”を用いて合成することができ１、 、Ｒｈｅ＊はガンマ線放出の付随しない半減期１６．０日の陽電子崩壊（１，０ ３ＭｅＶ）を行って安定な、４ＲｕＨとなる。しかしながら、これは一般に必要 とされるのに比べて半減期が長すぎる。

２１５Ｃ”（β＋７８％、１．２２ＭｅＶ：　ＥＣ２２％）および付随するガン マ線放出（２２％、０．３７３ＭｅＶ）の安定なｔａｃａ４３への崩壊（半減期 ３．９時間）は、このことを非常に有望にする。イオン半径の実質的な増加およ びＳｃがらＣａへの転移による３価から２価へ変化する傾向はスピネル結晶に対 して破壊的であるが、このことが該粒子の一層迅速な代謝を助け、それゆえ該粒 子に負荷した治療的または予防的に有効な元素の標的細胞内への一層迅速な放出 を助けることになる。

カルシウムを除き、これら核種のすべてをスピネルフェライト結晶中に収容する ことができるが、２５Ｍｎ”および２ｓＦ６３ｚがらのクロム崩壊生成物が逆ス ピネルフェライト（Ｍ　ｔ　［Ｉ［］Ｏ：　Ｆ　ｅ　［Ｉ［［］ｚｏｓ）結晶内 のスピネルクロム鉄鉱（ＦｅＣｒ２ＣＬ）の幾つかの領域中に生成するであろう 。同様に、チタン鉄鉱、ベロブスキー石、およびチタンスピネルの幾つかの領域 が、たとえば２３Ｖ　４　＠崩壊の結果として生成するであろう。

２６Ｆｅ５５汚染が最小である２、　Ｆｅ　５２を製造する最適法は、サイクロ トロン生成した３８ＭｅＶ　２Ｈｅ’ビームを用いて２４（、ｓｏに富んだクロ ムの放射を行い（２４Ｃｒ”　（ａ、　２　ｎ）　２６Ｆ　ｅ５２）　、その後 に酸抽出、酸化、蒸発乾燥、エーテル相分離、再乾燥および滅菌濾過を行うこと である（ツバイト（Ｚｖｅｉｔ）、ＩｎｔＪ、　Ｒａｄｉａｔ、Ａｐｐｌ、　Ｉ ｎｓｔｒｕｍ、　Ｐａｒｔ　Ａ、、Ａｐｐｌ、　Ｒａｄｉａｔ、　ｌ５ｏｌ　３ ９　：１１９７〜１２０１　（１９８８）参照）。２．ｐ６５１の製造のために 利用できる他の反応としては、ｚｓＭｎ”　（ｐ、４ｎ）ｔａＦｅ”１，４ｃｒ ａｗｌ　（α、ｘｎ）ｚｓＦｅ”、ｔ４ｃｒ”’　（２Ｈｅ３、Ｘｎ）ＨＦｅ” 、ｔａＮ　ｉ　用（ｐ、５ｐａｌｌ）　ｔｓＦ　ｅ　”が挙げられ、その後に酸 抽出およびアニオン交換クロマトグラフィーによる精製を行う（，４（ｒｍａｔ としては！４Ｃｒ　”　（４，３５％）　、ｘ＜Ｃｒ”　（８３，７９％）、ｚ ４Ｃｒ”（９，５０％）、および、、Ｃｒ５４（２，３６％）が含まれる）。

”Ｍｎ”はまた、バナジウムの、Ｈｅ”活性化ｚｓ％”　（ｚＨｅ’、２ｎ）　 ２５Ｍｎ５２（サストリ（Ｓ　ａｓｔｒｉ）、Ｉｎｔ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｒａｄ、 　ｌ５ｏ１．３２　＋２４６〜２４７　（１９８１））を含む標準法または、、 Ｃｒ”　（ｐ、ｎ）　２．Ｍｎ”、２４Ｃｒ”　（ｄ、　２　ｎ）、、Ｍｎ”を 含む他のサイクロトロン反応により合成することもできる。１ｙｃｏ”の方法に は、ＢＦｅ”　（ｄ、ｎ）２？ＣＯ”、ｚａＦｅ”　（ｐ、２ｎ）２７ＣＯ”、 ｚａＦｅ”’　（、Ｈｅ’、ｘｎｐ）２ｔＣｏ”１．、Ｍｎ”　（、Ｈｅ３．３ ｎ）ｚｔｃｏ”。

２６Ｍｎ”　（ａ、４ｎ）ｕｃｏＳ５が含まれる（ｕＦｅ…はｚｓＦ　ｅ　”　 （５，８２％）、ｚａＦｅ”　（９１，８％）　、２８Ｆ　ｅ”　（２，１％） 、および２Ｊｅ”　（０，２％）からなる）。

長い半減期の親核種を合成して臨床部位に移動させ、使用する直前に臨床的に有 用な娘核種をその後に抽出する発生機（ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）法は、幾つかの有 用な金属にも応用することができる。これらには、４６Ｐ　ｄ”’　（４，Ｏｄ 　Ｋ、γ）功＜５ＲｈＩ００（２０ｈ　β＋）　、　７４Ｗ””　（６９ｄ　β −：　１８８ｍ、１８ｍ　γ）＝３７ＳＲｅ””　（１６，７ｈ　β−）　、お 、及び、Ｏｓ”’　（６，Ｏｙ　Ｂ　）−ｈｔＩ　ｒ”’（１７，４ｈ　β−） が含まれる。

提唱されるサイクロトロン、、　５０４３合成には、２゜ｃａ４ｏ（熱中性子断 面積＝領４３バーン）のα粒子衝撃に応用される下記式が含まれる。

１６ｃａ”　（α、ｎ）２．Ｔｉ”　９β十（０，５６ｓ）　３ｎＳｃ”２ｏｃ ａ”　（ａ、ｐ）ＨＳＣ” ２゜Ｃａ１０（ａ、ｄ）２．５ｃ４２　＝＞β十（０，６８ｓ）　−ｚｏｃ　ａ ”、。（ａｌｌ’　（ａ、２ｎ）ｚ２Ｔｉ”　＝＞β＋（０，２ｓ）　６２．Ｓ ｃ”　＝＞β＋（０゜６８ｓ）　−ｚｏｃａ” ２、Ｃａ”　（α、ｘｎ）、、Ｔｉ’ ２０Ｃａ　”　（１２，３ｎ）　２２Ｔ　＋　”　＃β十（０，０９ｓ）　ｅ２ １Ｓｃ”　＝＞β＋（０，６Ｑｓ）　ｚ、ｏＣａ” ｔｏｃａ’°　Ｃａ、４　ｎ）　［２２Ｔ　ｉ　”コカルシウムおよびスカンジ ウムは、相分離（ハラ（Ｈａｒａ）、Ｉ　ｎｔ、　Ｊ　、　ＡＩ）Ｊ）ＩＲａｄ 、２４　：　３７３−３７６　（１９７３）参照）かまたはり０７トグラフイー （り０ダ（Ｋｕｒｏｄａ）　、Ｊ、Ｃｈｒｏｍ　２２　：１４３〜１４８　（１ ９６６）参照）（これによってチタンを分離することもできる）のいずれかによ り容易に分離される。

これらおよび他の遷移金属またはランタン系列核種を、照射による腫瘍のモノク ローナル抗体に基づく治療に使用するための放射能金属化合物（たとえば、金１ ＲｒＩＩ化物、金属硫化物または合金、フェライトなど）の合成に用いることが できる。この場合も、送達した放射性核種の生体内分布およびクリアランスは、 タンパク質にキレート結合した単一原子と極めて異なっている。記載したタイプ のＦｅ５Ｇ標識粒子の血管内注射は、投与量の約３／４が１〜２時間で膵臓、肝 臓、骨髄、およびわず力１に肺に一掃されるが、該投与量の実質的な画分は多く の時間の極めて長期間の血漿半減期を有するという２相血漿半減期を示した。所 望の核種の数百から数千の原子の送達を行い、かくして高い局所投与量を達成す るために各抗体分子を用いることができる。また、複数のエミッター原子の単一 のタンパク質分子への結合が、該タンパク質を迅速に破壊することが知られてい ることにも注意すべきであるーこの問題は本発明による粒子により実質的に解決 することができる。なぜなら、ターゲティング残基からの放出核の距離がたとえ ば１００オングストロームまでであり−それゆえ、電子、陽電子またはγ線が該 ターゲティング残基と相互反応する機会が数次の大きさで減少するからである。

３９Ｙ”の抗体送達のために開発した方法は、結合体フェライト中に該核種がは るかに高い濃度で含まれるようにして応用することができる。

該粒子の磁気的特性はまた、ＭｆｌＪ送達を助けるのにも用いることができる。

ＰＥＴ像解像度に話を移すと、スキャニング解像の制限の一つは、崩壊事象の後 で電子−陽電子消滅の前に陽電子が移動する距離の結果である。この距離は、所 定の核種について特徴的なβ放出のエネルギーに依存する。０．６４ＭｅＶで放 出される＊Ｆ”Ｒ１１子の最大飛程は２．６ｍｍであるが、一方、３．３５Ｍｅ 　Ｖで放出される３、Ｒｂ＠’崩壊からの粒子は消滅する前に１６．５ｍｍまで 移動する。

この行路に沿い、該陽電子が通過する原子の電子と相互反応することによりエネ ルギーを失い、種々のイオン化および励起を引き起こす。陽電子が物質−反物質 消減反応において電子と相互反応して、互いに約１８０’で移動する２個の０゜ ５１１ＭｅＶ光子が生成するのは、運動エネルギーの大部分が使い果たされたと きのみである。消滅の時点での陽電子の残留モーメントは放出された光子に並進 モーメントを付与し、その結果、これら２つの光子間の角度が１８０６とは異な るようになる。この角度の測定値は、核種、およびエネルギーが喪失しその後に 消滅が起こる媒体を反映する。

ある場合には、消滅前に陽電子が移動する距離は該媒体の密度に正比例すること が知られている。磁鉄鉱の密度は５．１８０　ｋ　ｇ／ｍ’であり（殆どの動物 組織よりもちょうど５倍以上大きい）、電子飛程測定に基づ（古典的な計算によ れば、組織中を移動する陽電子に比べて磁鉄鉱中を移動する陽電子による最大移 動距離は８０％増加する可能性がある。磁鉄鉱の有効なＺ数（＝５２）に正比例 する制動放射ブレーキング（ｂｒａｋｉｎｇ）放射の増加が存在するが、これは 陽電子の集団のエネルギー喪失の１％を説明するにすぎない消滅前の陽電子の移 動についての上記数は、上限を反映している。実際、陽電子放出の間に崩壊エネ ルギーは陽電子とニュートリノとの間で分割され、この分割は変わり得るので、 その結果、エネルギーの集団となる。所定の核種がらの陽電子の平均エネルギー は、粒子エネルギーとして通常与えられる最大値の約１／３である。、、Ｍｎ” からの平均陽電子エネルギーは０．１９ＭｅＶであり、磁鉄鉱中では、移動が完 全に磁鉄鉱中であるならば、これにより古典的に約２０ミクロノの飛程という結 果になるであろう。

しかしながら、種々の元素が特徴的な陽電子親和性を有しており、これらは陽電 子の寿命に対して大きく影響する。それゆえ、一般的な密度測定との関係におけ る陽電子飛程の古典的見解は、実質的に単純に過ぎることがわかる。

それゆえ、リチウムなどの高親和性核種をβ−エミッター負荷粒子中に用いるこ とにより、陽電子飛程をさらに減少させることができることがわかる。

加えて、結晶中の欠陥が陽電子の捕捉を引き起こし得ることもわかっている。

ＹＢａＣｕＯ，ベロブスキー石結晶中の欠陥は、これら物質が超伝導状態にない 場合でも特に有効であるが、金属中の機械応力の欠陥でさえもかなり有効である 。

また、移動する陽電子により生成する磁場および磁鉄鉱などの物質の自然場との 相互作用による効果、並びに微細粒子シールドのために用いた特定のスピネル中 のｄまたはｆ軌道からの非共有アンチスピン適合（ａｎｔｉ−ｓｐｉｎ　ｍａｔ ｃｈｅｄ）電子の数による電子相互反応促進効果も存在する。

これら考膚の結果として、エミッターの数千の原子を含む陽電子放出核種の結晶 種から開始し、ついで陽電子放出コアの周りにリチウムまたは亜鉛の混じった欠 陥のある磁鉄鉱シールドを沈澱させることが可能である。このシールドは、放出 された陽電子の非常に大きな部分にイオン化のすべてを起こさせて該粒子内で衝 突喪失を生じさ也それゆえ、該粒子を離れることな（消滅させる。反射または表 面捕捉効果の影響を受けずに該粒子の表面から出て（る陽電子は、非常に減少し たエネルギー分布を有し、標準的な非遮断陽電子エミッターに比べて、組織中を はるかに短い距離を移動し、崩壊事象当たりに生成する組織中のイオン化もはる かに少ないであろう。

消滅光子自体は、その環境中にある組織とは違って、フェライトの存在によって は比較的影響を受けない。それゆえ、組織イオン化は非常に大きく減少するが、 光子放出はごくわずかにしか減少しないであろう。さらに、光子放出はすべて実 際のトレーサー原子の位置にはるかに近くで起こり（典型的にミリメーター内よ りも数ミクロン内）、このためＰＥＴスキャンの空間的解像度が向上するであろ う。さらに、母集団として、消滅は一層低いモーメントを有し、このことが母集 団消滅角を１８０°近（にシフトし、スキャンの解像度がさらに向上する。

それゆえ、このシールド効果は、極めて限られた範囲の細胞毒性イオン化障害を 達成するのに用いることができる。そのような超短飛程β放出粒子の使用例は、 ＡＨ）Ｓの治療におけるものである。この場合、感染ＣＤ４＋マクロフアージ、 単核細胞、およびＴ細胞に向けられた抗体または他の付着分子を有する粒子を用 い、該粒子の選択的なエンドサイト−シスを起こさせる。大きな粒子はリンパ節 、膵臓、肝臓および肺中の単核細胞および固定化ＲＥ細胞により１〜２時間で血 流から一掃されるが、冷未分化（ｃｏｌｄ−ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）抗体粒子 の同時注入により、感染ＣＤ４細胞の細胞表面上で検出可能なｇｐ１２０抗原（ ＣＤ４結合抗原など）に向けられたβ放出粒子の選択的な取込みが可能となる。

このβ放出粒子は、危険にさらされている患者が供することのできない細胞毒性 を提供する。感染単核細胞を殺すことにより、該細胞による循環ＩＬ−２の過剰 な取込みを防ぎ、接近するＴ細胞に対する接触感染を防ぎ、未感染マクロファー ジとの破壊的なノンシチウム融合を行わせなくする。放出されるβ放射線の飛程 は単一の標的細胞のサイズよりも大きくならないように設計することができ、そ れゆえ、有効な照射を実際に該粒子を摂取した細胞だけに限ることがてき、消滅 直前に低エネルギー陽電子についてイオン化率を増加させる最終ブラッグピーク 効果を利用することができる。コーティングの消化（幾日かを要する）とともに 増加する暴露範囲の効果を最小にするために短い半減期のエミッターを用いるこ とができ、ついで複数の処理を行うことができた。磁性の小さい核種で殻を構成 することにより、磁気凝集なしで一層大きな粒子を用いることができる。

本発明に従って用いる粒子（たとえば、混合スピネル）は、磁気共鳴分光トレー ノング法およびヘテロ核種造影法を用い、その分布を詳細にできるように診断的 にさらにマーキングすることができる。、ＬＬ　２１３Ｃ％　ｚｙｃｏｌ、、Ｍ ｎ、２９Ｃｕ％　５ＩＰｒｓ　７１Ｃｕまたは、、Ｒｅをフェライト結晶中に大 きな割合で導入すると、これらはこれら原子の大きな原子団を所望の部位に送達 するビヒクルとなる。これら元素およびその種々の同位元素は適当な酸化状態お よび電子／化学環境にあるときに高い核共鳴受容性（ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｓｏ ｎａｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｉｖｉｔｙ）を有し、それゆえ、これら結晶の存在を検 出するために分光計としてＭＲ器械を用いることができる。混乱させる緩和を電 子が生成しない酸化状態にある高受容性金属（たとえば、Ｍｎ”、Ｃｏ’つまた はｄ−電子軌道が完全に空白であるか（Ｓｃ”）または完全に満たされている（ Ｚｎ２つ酸化状態にある高受容性金属が特に分析できる。Ｉ＞１／２の核種に対 しては四極子緩和の効果を最小にするために化学的環境も重要である。

Ｆ１９や１０１１５などの核種、すなわちｐ＋９またはＩｎ”’ＭＲ造影のマー カーを化合物中に含ませることができ、ついで該化合物をラテックス、タンパク 質、ポリ乳酸または他のポリマー中および金属化合物粒子のコーティング中（該 コーティング中にはターゲティング残基も存在する）に含ませるか埋め込むこと ができる。

上記粒子タイプおよび送達ターゲテイングシステムを用い、β−エミッターの代 わりに種々のグループの金属を用いて非常に短い飛程放射線療法効果を達成する ことができる。これらは、崩壊かに殻捕捉によるところの種々の核種である。

これら核種における崩壊には電子の核中への崩壊も含まれるが、その結果生じる 空白は残留する電子の間でオージェおよびコスター−クロニッヒ（Ｃｏｓｔｅｒ −Ｋｒｏｎｉｇ）電子放出となる効果を生じる。これらは極めて低いエネルギー を有し、その結果、飛程もミクロンおよびサブミクロンの距離であるが、幾つか のそのような電子は各車−の崩壊事象毎に放出される。この挙動を有する核種で ＨＩＶ療法に最適のものは４．ｐｄ＋０３であり、これは半減期が１７日の純粋 なに一捕捉核種である。　２．（ｒ　５＋も有利に用いることができる。

使用する粒子は、一般に、安定なコロイドに沈澱することができ、細胞の取込み に適したサイズを有し、好ましくは生化学的に有用な物質（たとえば、炭水化物 やタンパク質）でコーティングまたは結合できる表面を有する金属化合物でなけ ればならない。

本発明による方法に有用な粒子は、比較的直接的な方法により製造することがで きる一治療的または予防的に活性な元素および任意に診断マーカーからなるマト リックス材料の粒子を、たとえば沈澱（たとえば、適当な緩衝溶液からの）によ り生成し：それから所望のサイズ範囲の粒子を分離し；生理学的に許容し得る任 意に生分解し得るコーティング材料（たとえば、ラテックス、ポリ乳酸、タンパ ク質、アルブミン、多糖類、デンプン、デキストラン、重合糖アルコールなどの 天然または合成のポリマーまたはその誘導体（たとえば、ＥＰ−Ａ−１８４８９ ９（ヤコブセン）参照））で該粒子を適宜コーティングし二ついで該粒子を細胞 付着分子に適宜結合させ（任意に該コーティングにカップリングすることにより 、任意にそれを適当に誘導体化して、たとえば結合部位を生成したり過剰の結り わけ１まで、最も好ましくは約１のＣＡＭ：粒子比）：好ましくはサイズ分離に より、とりわけ好ましくはサイズ分離を繰り返した後に少な（とも１回アフィニ ティー精製を行うことにより、かくして生成したＣＡＭ−結合粒子を未結合粒子 から適宜分離し、薬理学的担体および適宜通常の薬理学的賦形剤（たとえば、粘 性促進剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤など）とともに調合した後に所望なら該Ｃ ＡＭ−結合粒子を任意に滅菌する。

上記のように、使用するマトリックス材料は無機マトリックス（たとえば、金属 酸化物）、または有機マトリックス（たとえば、架橋デンプンやデキストランな どのポリマー）であってよく、これは治療的または予防的に活性な元素または診 断マーカーの担体として働くであろう。

活性な元素またはマーカーの担体マトリックス内への組込みは、通常の方法、た とえば、共沈により、多孔質マトリックス材料を浸漬して所望の剤またはマーカ ーを染み込ませることにより、超音波により懸濁した非コーテイング金属酸化物 粒子に核剤を暴露することにより、または本明細書に記載する緩衝沈澱法により 行うことができる。

マトリックス粒子は、たとえば上記の範囲内の比較的均一な大きさであるのが望 ましく、このことは、たとえば通常のスクリーニング法または粒子沈澱法により 達成することができる。単分散粒子が好ましいであろう。

他の観点において、本発明は、本発明による微細粒子製剤の調製方法を提供し、 該方法は、治療的または予防的に活性な元素からなるエンドサイト−シスを受け 得る粒子を少なくとも１種の薬理学的担体または賦形剤と混合することを特徴と する。

さらに別の観点から、本発明はまた、本発明による修飾スピネル、ざくろ石およ びベロブスキー石粒子の調製方法を提供し、該方法は、スピネル、ざくろ石また はベロブスキー石構造を生成させ得るようなイオン半径の２価または３価金属イ オンを沈澱させ、該沈澱は所望の治療的または予防的活性を有する元素（とりわ け、パラジウム）を含有しおよび粒子サイズの制御を可能とし該粒子の食作用後 の細胞内崩壊速度を調節するために該沈澱結晶の結晶構造を修飾すべく選択した 元素をも適宜含有する溶液からのものであり；ついで、任意にサイズ分離および コーティングの後、得られた粒子を細胞付着分子（好ましくはｇｐ１２０）に任 意に結合させることを特徴とする。

本発明による粒子沈澱法において、該粒子内に組み込むべき活性元素またはマー カーは、それ自体溶液中にあってもよいし、または別の態様として細かな「種」 結晶中に含ませ、該結晶を沈澱する粒子中に含ませるようにしてもよい。

インヒポ投与するため、使用する投与量は患者の体重、ＴＭまたはＣＡＭの特異 性（ＴＭまたはＣＡＭ−結合剤の場合）、該製剤の活性元素または診断マーカー 成分の性質、処置しようとする疾患の性質の程度または重篤度などの広範囲の因 子に明らかに依存するであろう。しかしながら、これら因子を考慮に入れる−と により適当な投与量を容易に決定することができるであろう。一般に、投与量は 体重１ｋｇ当たり治療用カチオン５０マイクロモルのオーダーが期待されてよい 。

エンドサイト−シスを受け得る粒子はまた、一般に細胞機能の探求の研究手段と （，７て用いることもでき、その際、該粒子は、たとえばその放射性崩壊または 核る。それゆえ、該粒子は、金属結合タンパク質および他の生体分子をマーキン グしてカチオン代謝およびそのようなタンパク賀および生体分子の他の活性を研 究するために、完全な細胞中、または完全な動物中の標的群細胞中で、検出不能 な生理学的カチオンを外部から検出可能なカチオンで置き換えるために用いるこ とができる。この観点から、本発明は、エンドサイト−シスを受けることができ その後に金属カチオンを細胞内放出することのできる粒子からなる組成物を提供 し、該金属カチオンは該エンドサイト−シスを受けることができる細胞にとって 元からあるカチオンと競合し、該細胞の外部から検出することができる。

本発明に従って有用なパラジウム含有鉄酸化物粒子は、それ自体新規であり、さ らに他の観点から本発明は鉄酸化物マトリックス内に沈積したパラジウムからな る結晶性材料を提供する。

本発明を下記実施例によりさらに詳しく説明する。

！産男 フェライト粒子の合成は、２４時間以内に有効に行うことができる。２＋および ３＋酸化状態の金属の塩化物、たとえばＦｅＣ１＊、ＦｅＣ１，、Ｍ　ｔ　Ｃｌ 　ｔ、ＭｔＣｌ、（式中、Ｍｔは治療的または予防的に活性な金属または診断マ ーカーテアル）を１．５００〜１０．ＯＯＯＭＷ　（好まシくハ、１０．ＯＯＯ ＭＷ）デキストランの飽和または過飽和溶液中に、はぼＭｔ（Ｉ［）１．０　： Ｆｅ（ｍ）２．０の辻率で、０２〜１．０モルの濃度にて、最終の所望粒子サイ ズ分布に依存して０〜６０℃の温度（しかしながら、好ましくは５０℃）にて溶 解する（Ｍｔは遷移金属または遷移金属の混合物の２価カチオンである）。代表 的な開始量は、４，５ｍｌのｄＨ！Ｏ中に５４０ｍｇ　ＦｅＣ１，，２３０ｍｇ 　ＦｅＣｌ２，３ｍｇデギストランＩＯＫである。再結晶またはスラッジ（ｓｌ ｕｄｇｉｎｇ）を防ぐため、このデキストラン溶液をごく短い時間加熱すべきで ある。（しがしながら、パラジウムフェライトの場合は、このようなデキストラ ンコーティングは実際の食作用およびその後の細胞内パラジウム放出には必要で はないことに注意すべきである。）１価金属塩（好ましくは、ＬｉＣ１）と化学 量論的にバランスがとれるならば、３価カチオン（Ｓｃ（Ｉ［［）など）を低い 比率で用いることができる。５〜１０％、好ましくは７５％のＮＨ，水溶液を加 えてｐＨを９〜１２、好ましくはｐＨ１１とすることにより（デキストラン／金 属塩溶液７．５ｍｌに約１５ｍ１添加）、フェライトが沈澱する。この溶液を金 属／デキストラン溶液に加える前に６０℃に加熱することができる。

種々のサイズ、たとえば１，５に〜４０ＫＭＷのデキストランを用いることがで きるが、これら合成においてはＩＯＫデキストランが最も信頼性があることがわ かっている。外のコーティングの変化も粒子の崩壊（ｔｕｍｂｌｉｎｇ）挙動に 影響を及ぼし、このことが粒子のある種の共鳴挙動および粒子と水分子との相互 作用に影響を及ぼす。また、細胞内での処理速度を変化させるため、たとえばシ アノアクリレートモノマーなどからの非代謝ラテックスで粒子をコーティングす ることもできる。ポリ乳酸あるいはタンパク質／アルブミンコートなどの他の生 体内分解性コーティングを適用することができる。平均結晶コアサイズの小サイ ズの方向へのシフトは、合成反応の温度を低下することにより、またはｐＨを上 昇させることにより得ることができる。しかしながら、サイズ分布調整して所望 のサイズ範囲を選択するために種々の分離法が必要である。

加えて、種々の特定の最適化を達成するために、スピネル結晶を種々の量の混合 金属で構成することができる。種々の有用な遷移系列金属および適宜ある種のラ ンタン系金属を含む混合スピネルは、アルカリ沈澱の前に金属塩化物を飽和デキ ストラン溶液に直接加えることにより製造することができる。

反応の生成物を１．０００ｇｘ１０分で２回、１．５００ｇＸ１０分で１回、遠 心分離にかけて微細粒子を除去し沈澱中に廃棄する。遊離の金属イオン、微細粒 子、鉄（ＩＩ）水和酸化物、塩化物およびアンモニアを除くため、得られた懸濁 液を０．１．ＭＮａ酢酸緩衝液（ｐＨ６５）中で平衡化したセファデックスＧ− ２５Ｍ／１５０Ｒ（ファルマノア）の２．５ｃｍｘ４０ｃｍカラムに通す。

ついて、セファデックス溶出液を一層細かいマイクロフィルターに連続的に通す 。０２２ミクロンナイロンフィルターに２回通し、ついで０．１ミクロンナイロ ンフィルターに２回通す。第三の濾過はゆっくりだが、ミリボア’ＶＭＷＰ−０ ４７００セルロースＭＦフィルターなどの５０ｎｍフィルターを用い（ナイロン またはポリカーボネートフィルターが好ましいカリ、吸引漏斗上の１００ｍｍま たは４７ｍｍ直径のフィルターを用いて行うことができる。この工程のスピード および一般的な成功は、最初の沈澱条件に大きく依存する一一層小さな粒子サイ ズ分布を用いるのが最も効力がある。（水および沈澱媒体のイオン含量および使 用したデキストランの調製および精製の仕方もまた粒子サイズ分布に影響をおよ ぼすことに注意すべきである）。これら濾過はまた、遠心フィルターを用いて行 うこともできる。

この透明な脱塩しついでサイズ調整した（ｓｉｚｅ　ｔｒｉｍｅ＋ｅｄ）生成物 をセントリプレプ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）　−３０’　（アミコン）ウルトラ フィルターを用いて１，５００ｇで４５分間濃縮して最終容量を５〜７ｍｌとす る。ついで、この試料を、０゜ＬＭ　Ｎａ酢酸緩衝Ｆ＆（ｐＨ６，５）で平衡化 したセファクリル−２００’（ファルマシア）の２．５ｃｍｘ２Ｓｃｍカラムに 適用し、同緩衝液で溶出する。これによりデキストランおよび小さな鉄（ｎ）水 和酸化物を捕捉し、一方、粒子は排除した非分画の容量中に通過させた。この両 分の最後の部分は水和酸化物をたくさん含んでいるので廃棄すべきである。得ら れた溶出液を結合のためセントリブレブー３０濃縮器（１，５００ｇで１５分間 ）で４ｍｌに濃縮する。

４ｍｌの容量の上記粒子試料に１ｍｌの２０ｍＭ　ＮａＩＯ４を２３℃にてゆっ くりと加えて酸化する。この混合物を暗所にて６０分間撹拌（非磁気撹拌のみ） しながら反応させる。

２０ｍＭＮａホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）で平衡化した２つのＰＤ−１０セファ デックスＧ−２５Ｍ／１５０カラムに試料を通し、セントリプレブー３０ウルト ラフイルターで１〜２ｍｌに濃縮し、ついでセファデックスＧ−２５Ｍ／１５０ の第三のＰＤ−１０カラムに試料を通して未反応過ヨウ化物を完全に除くことに より、過ヨウ素酸反応を停止させる。ホウ酸緩衝液を用いて最終容量を４ｍｌま でとする。

２〜］、Ｏｍｇの抗体、レクチン、増殖因子、または他の選択的細胞付着分子を １〜］の２０ｍＭＮａホウ酸（ｐＨ８，５）中に溶解したタンパク質溶液を調製 する。可能ならば、活性／認識部位を保護するためのブロッキング分子をこの時 点で加えるべきである（ブロッカ−が過ヨウ素酸活性化デキストランによって結 合されないならば）。たとえば、１ｍＭ　Ｃａ　Ｃ１＊／Ｍｎ　Ｃ］　２の添加 は、ある種のレクチン上の結合部位を保護するのに役立つ。ついで、この溶液を 粒子溶液に加え、混合し、関与する分子および粒子当たりに望まれる付着分子数 に依存して４−１２時間インキュベートする。２００μｌの０．５Ｍグリシンを 加え、さらに２時間インキコベートすることにより反応を停止させる。

ついで、Ｑ、５〜］の０．２５Ｍ　ＮａＢＨ４を添加して共有結合を還元する（ Ｈ、ガスが発生する）。１時間反応させた後、この混合物を２０ｍＭＨＥＰＥＳ 緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍ／１５０の３つの ＰＤｉＯカラムに通してグリノン、Ｎ’ａＢＨ，および■４２を除去１．１、つ いでセントリブ１ノブ−１００濃縮器（５００ｇで６０分間）を用いて１〜２ｍ ｌ容量に濃縮して未結合の付着分子および一層小さな未結合粒子を除く。ついで 、この生成物をセファクリル２００の１．６Ｘ３５ｅｍカラムに負荷し、２０ｍ Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝１ｆｆｌ（ｐＨ７，４）で溶出する。このカラム操作により 未結合のターゲティング分子がさらに除かれ、新たに生成した水和酸化物が捕捉 される。溶出液を回収し、セントリブレブー１００濃縮器を用いて５００ｇＸ３ ０分間にて濃縮し、最終容量を４〜］とする。

ツＬ　Ｎ　”［’、反応生成物（４〜］）を、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７，４）で平衡化したジビニルスルホン結合を有するアフィニティーリガンドセ ファロース６Ｂ（ある種の［ツクチンについてはシグマＡ２２７８など）の４ｍ ｌカラムに負荷する。結合を最大にするために通常意図される条件は回避するの が好ましい。

というのは、このことによって特定の画分を溶出することが不可能になるかもし れないからである。ついで、カラムを４〜５容量の緩衝液で充分に洗浄し、つい で同緩衝液中の１モルアフィニティー溶出液２ｍｌ容量を負荷する。これにより 、活性画分がかなりシャープなバンドで溶出される。

特定の両分を回収し、ＰＤ−１０セファデックスＧ−２５Ｍ／１５０カラムに通 してアフィニティー溶出物を除（のを助け、ついで小容量のセントリコン（Ｃｅ ｎｔｒｉｃｏｎ）　−３Ｑ遠心濃縮器（１，５００ｇｘ２０分間）で１〜］に濃 縮する。

この生成物を第二のＰＤ−１０カラムに通し、ついで最終の生成物をセントリコ ン−３０濃縮器（１，５００ｇｘ６０分間）で３００〜５００μｍの容量に濃縮 する。ついで、この最後の生成物をコスタ−１ｍ１遠心マイクロフイルターを用 いて０．２２または０．１ミクロン濾過により滅菌し、使用のため貯蔵する。

フェライト粒子も同様の手順で得ることができる。たとえば、（ａ）　フェライ ト粒子は、モルディの方法（Ｊ　、　Ｉ　ｎ＋ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　５２　 ：　３５３〜３６７　（１９８２））の修飾法により合成する（２４時間未満で 有効に行うことができる）　。１０〜１００ｍＣｉ／μＭ　（３７０ＭＢｑ　〜 ３．７ＧＢｑ／μＭ）の比活性の陽電子核種を有する２＋酸化状態の金属の塩化 物を、１．０．ＯＯＯＭＷデキストランの過飽和溶液中に、はぼＭｔ（ｎ）１． ０　：　Ｆｅ（ＩＩ［）２．０の比率、０．５＋１．０モルの濃度にて、所望の 最終粒子サイズ分布に依存して２０〜６０℃の温度で溶解し、８％ＮＨ３水溶液 を加えてｐＨを１１とする（２〜］のテキストラン／金属塩溶液に約４ｍｌ添加 ）ことによりフェライトを沈澱させ、１゜０００ｇで遠心分離にかけて微細粒子 を除き、分離し、所望の場合に濾液中の小さな粒子を回収するためにセントリブ レブー３０（アミコン）濃度器を用いて２゜０００ｇで濃縮する。

この濃縮／分離工程の生成物（濾液（セントリブレブー１０濃縮器で再濃縮）ま たは保持物のいずれか）を、遊離の金属イオン、塩化物およびアンモニアを除く ために、０．１ＭＮａ酢酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化したセファデックスＧ −２５Ｍ　（１５０）の分取カラムに通す（負荷試料の少なくとも４倍の容量） 。

この脱塩試料を再びセントリブレブー３０濃縮器（２，５００ｇで１時間）で濃 縮して３〜４ｍｌ容量とし、ついで０．１ＭＮａ酢酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平 衡化したセファクリル−３００（ファルマシア）の２．５ｅｍｘ２５ｃｍカラム に通し、Ｑ、１ＭＮａ酢酸１０．１５ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６，５）および０ ．１５ＭＮａＣ＋で溶出して未結合のデキストランを分離し、得られた両分をセ ントリブレブー３０濃縮器（２，５００ｇｘ１５分間）で４〜］に濃縮し、暗所 にて６０分間撹拌（非磁気撹拌のみ）しながら１〜］の２０ｍＭ　Ｎａ１０４と ２３℃にて反応させて活性化する。

２０ｍＭＮａホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）で平衡化したセファデックスＧ−２５ Ｍ（１５０）カラムにフェライト試料を通し、セントリブレブー３０で１〜２〜 ］に濃縮し、ついでセファデックスＧ−２５Ｍ　（１５０）の第二のカラムに試 料を通して未反応通ヨウ化物を完全に除くことにより、過ヨウ素酸反応を停止さ せる。ついで、２〜１．０ｍｇの抗体、レクチン、増殖因子、または他の選択的 細胞付着分子を１〜］の２０ｍＭＮａホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）に溶解したタ ンパク質溶液をフェライト溶液に加え、混合し、関与する分子およびフェライト 分子当たりに所望の付着分子数に依存して４〜１２時間インキュベートする。２ ０Ｑ７１１の０．５Ｍグリシンを加え、さらに２時間インキュベートすることに より反応を停止させる。

つ（・で、Ｑ、５〜］の０．２５Ｍ　ＮａＢＨ４を添加して共有結合を還元する （Ｈ、ガスが発生する）。１時間反応させた後、この混合物を２０ｍＭ　ＨＥＰ ＥＳ緩衝ｅ　（ｐＨ７，４）で平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍ　（１５０ ）のカラムに通してＮａＢＨ４およびＨ，を除去し、ついでセントリブレブー３ ０濃縮器（２゜５００ｇで３０分間）を用いて１〜２ｍｌ容量に濃縮し、未結合 の付着分子を除くために、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化 したセファクリル−３００の１．５　ｃｍｘ　４０　ｃｍカラムに適用しくその 後に２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳｌｏ、　１５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１緩衝液（ｐＨ７，４） 　で溶出）、ツイテ投与のためセファデックスＧ　２ＤＭを介して０．１Ｍリン 酸緩衝液（ｐＨ７，４）中に通した。

ついて、得られた両分を使用のためにセントリブレブー３０濃縮器を用いて１ｍ ｌ容量に濃縮するか、またはアフィニティークロマトグラフィーで精製し必要な ときにさらに精製することができる。所望なら、凍結乾燥後に再構成を用いるこ ともできる。

別のやり方として、沈澱反応の生成物を：１．．０００ｇにて３回遠心分離に付 して微細粒子を除き、これを沈澱中に廃棄してもよい。遊離の金属イオン、塩化 物およびアンモニアを除くため、得られた懸濁液を０７１Ｍ　Ｎａ酢酸緩衝液（ ｐＨ６，５）で平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍ／１５０”　（ファルマシ ア）の分取カラムに少なくとも通す（適用試料の少なくとも５倍の容量）。

ついで、この透明になり脱塩した生成物をセントリブレブー１００１１（アミコ ン）ウルトラフィルターを用いて１．５００ｇで２時間濃縮し、再懸濁し、再び ４ｍｌ容量に濃縮する。これにより５ｎｍ未満の粒子および廃棄のための未結合 デキストランの濾液中への良好なりリアランスが得られ、これが微細粒子剤のた めの好ましい方法である。

一層小さな粒子を含む粒子サイズの範囲を処理すべき場合は、この濃縮１稈をセ ントリブレブー３０濃縮器を用いて行う。この場合、３〜４ｍｌ容量としての試 料をＱ、１ＭＮａ酢酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化したセファクリル−２００ １１（ファルマシア）の２．５　ｃｍｘ　２５　ｃｍカラムに適用し、０．１Ｍ Ｎａ酢酸１０．１５ＭＮａＣ１緩衝液（ｐＨ６，５）および０．１５Ｍ　ＮａＣ ］Ｔ溶出することにより、未結合デキストランを除去する必要があるであろう。

結合のため、得られた画分をセントリブレブー３０濃縮器（２，５００ｇに１５ 分間）を用いて４〜］に濃縮する。

非常に小さな粒子のみが望ましい場合は、最初の濃縮をセントリブレブー１００ ウルトラフイルターを用いて行うが、その後さらに処理するのは濾液の方である 。この濾液をセントブレブー３０ウルトラフイルターを用いて３回再濃縮して透 明なデキストランとする。

主として一層大きな粒子（５０〜３００　ｎ　ｍ範囲）が望ましい場合は、脱塩 しウルトラフィルターにかけた試料をセントリブレブー１００濃縮器（２，５０ ０ｇで１時間）を用いて４ｍｌ容量に濃縮し、ついで０．１ＭＮａ酢酸緩衝液（ ｐＨ６５）で平衡化Ｌ７たセファクリル−４０ＯＲ（ファルマシア）の２．５　 ｃｍｘ２５ｃｍカラムに適用し、０．］、ＭＮａ酢酸１０．１５Ｍ　Ｎａ　Ｃ１ 緩衝液（ｐＨ６５）および０．１５ＭＮａＣ＋で溶出する。結合のため、得られ た両分をセントリブレブー３０　（２，５００ｇで１５分間）を用いて４ｍｌに 濃縮する。

幾つかの用途のためには、粒子を５０ｎｍ未鵬の直径とするのが好ましい。それ ゆえ、セントリプシブ１００生成物をまず０．２ミクロンついで０．１ミクロン のナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）　’ナイロンマイクロフィルターに通すことがで きる。ついで、得られた生成物を２ｍｌ容量に濃縮し、サイズ分画のためセファ クリル−１０００”（ファルマシア）の２．５ｃｍｘ５０ｃｍカラムに適用する 。後の方の両分中の粒子を回収し、さらに処理する。

１ｍｌの２０ｍＭ　Ｎａ　ＩＯ４を２３℃にてゆっくりと加えて、４ｍｌの容量 の粒子試料を酸化する。この混合物を暗所にて６０分間撹拌しながら（非磁気撹 拌のみ）反応させる。

２０ｍＭＮａホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）で平衡化したセファデックスＧ−２５ Ｍ（１５０）カラムに試料を通し、セントリブレブー３０ウルトラフイルターで １〜２ｍｌに濃縮し、ついで試料をセファデックスＧ−２５Ｍ　（１５０）の第 二〇カラムに通して未反応の過ヨウ素酸物を完全に除去することにより、過ヨウ 素酸反応を停止させる。ついで、２〜ＩＱｍｇの抗体、レクチン、増殖因子、ま たは他の選択的付着分子を１ｍｌの２０ｍＭＮａホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）中 に溶解したタンパク質溶液を上記粒子溶液に加え、混合し、関与する分子および 粒子当たりに所望の付着分子数に依存して４〜１２時間インキュベートする。２ ００　ｔｔ　ｌの０．５Ｍグリシンを加え、さらに２時間インキュベートして反 応を停止ｌ−さゼる。

ついＣ１０，５ｍｌの０　、２５　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈａを添加して共有結合を 還元する（Ｈ、カスが発生する）。１時間反応させた後、この混合物を２０ｍＭ 　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐｉ−（７，４）で平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍ 　（１５０）のカラムに通してＮａＢＨ，およびＨ７を除去し、ついでセントリ ブレブー１００濃縮器（１，５００ｇで６０分間）を用いて〕〜２ｍｌ容量に濃 縮して未結合の付着分子および一層小さな未結合粒子を除く。ついで、この生成 物を、投与のためセファデックスＧ−２５Ｍを介して０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，４）中に通すか、または非多孔質ビーズ上のアフィニティークロマトグラ フィーまたはナルケン６アフイニテイー膜によりさらに精製する。

ついで、得られた両分を滅菌緩衝液中で２０ｍ１に希釈し、０．２ミクロンまた は好ましくは０．１ミクロンのマイクロフィルターに通して滅菌することができ る。最終生成物を使用のためセントリブレブー１００濃縮器を用いて１ｍｌ容量 に濃縮する。幾つかの調製物について所望の濃度を達成するため、凍結乾燥後に 再構成を用いることもできる。

別のやり方として、沈澱反応の生成物を１．０００ｇＸ１０分間にて２回、およ び１．５００ｇｘｌＯ分間にて１回遠心分離に付して微細粒子を除き、これを沈 澱中に廃棄する。遊離の金属イオン、微細粒子、鉄（ｎ）水和酸化物、塩化物を 除（ため、得られた懸濁液を０．１ＭＮａ酢酸緩衝液（ｐＨ６，５）中で平衡化 したセファデックスＧ−２５Ｍ／１５０’　（ファルマシア）の２．５ｃｍＸ４ ０ｃｍに通す。ついで、このセファデックス溶出液を連続的に一層細かいマイク ロフィルターに通す。０．２２ミクロンナイロンフィルターに２回通した後に０ ．２ミクロンナイロンフィルターに２回通す。第三の濾過はゆっくりであるが、 ミリポア”ＶＭＷＰ−０４７００セルロ一スＭＦフィルターなどの５０ｎｍフィ ルターを用いた吸引漏斗上で１００ｍｍまたは４７ｍｍ直径フィルターで行うこ とができる。

ついで、この透明な脱塩しサイズ調節した生成物をセントリブレブー３０７（フ ミコン）ウルトラフィルターを用いて１．５００ｇで４５分間濃縮して最終容量 を５〜７ｍｌとする。ついで、この試料をＱ、１ＭＮａ酢酸緩衝液（ｐＨ６，５ ）で平衡化したセファクリル−２００’　（ファルマシア）の２．５ｃｍＸ２５ ｃｍカラムに適用し、同緩衝液で溶出する。これによりデキストランおよび小さ な鉄（■）水和酸化物が捕捉され、一方、粒子は、排除した非分画容量中に通過 する。この画分の後の方の部分は多くの水和酸化物を含有しているので廃棄すべ きである。

得られた溶出液を、結合のためセントリブレブー３０濃縮器（１，５００ｇにて １５分間）を用いて４ｍｌに濃縮する。

４ｍｌの容量の上記粒子試料に１ｍｌの２０ｍＭＮａ１Ｏａを２３℃にてゆっく りと加えて酸化する。この混合物を暗所にて６０分間撹拌（非磁気撹拌のみ）し ながら反応させる。

２０ｍＭＮａホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）で平衡化した２つのＰＤ−１０セファ デンクスＧ−２５Ｍ／１５０カラムに試料を通し、セントリブレブー３０ウルト ラフイルターで１〜２ｍｌに濃縮し、ついでセファデックスＧ−２５Ｍ／１５０ の第三のＰＤ−１０カラムに試料を通して未反応過ヨウ化物を完全に除くことに より、過ヨウ素酸反応を停止させる。ホウ酸緩衝液を用いて最終容量を４ｍｌま でとする。

２〜１０ｍｇの抗体、レクチン、増殖因子、または他の選択的細胞付着分子を１ ｍｌの２０ｍＭＮａホウ酸（ｐＨ８，５）中に溶解したタンパク質溶液を調製す る。可能ならば、活性／認識部位を保護するためのブロッキング分子をこの時点 で加えるべきである（ブロッカ−が過ヨウ素酸活性化デキストランによって結合 されないならば）。たとえば、１ｍＭ　ＣａＣ］２／ＭｎＣｌ、の添加は、ある 種のレクチン上の結合部位を保護するのに役立つ。ついで、この溶液を粒子溶液 に加え、混合し、関与する分子および粒子当たりに望まれる付着分子数に依存し て４〜］２時間インキュベートする。２００μｍの０．５Ｍグリシンを加え、さ らに２時間インキュベートすることにより反応を停止させる。

ついて、Ｑ、５ｍｌの０．２５ＭＮａＢＨ４を添加して共有結合を還元する（Ｈ ２ガスが発生する）。１時間反応させた後、この混合物を２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩 衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍ／１５０の３つのＰ Ｄ−１０カラムに通してグリノン、ＮａＢＨ，およびＨ２を除去し、ついでセン トリプレブー１００濃縮器（５００ｇで６０分間）を用いて１〜２ｍｌ容量に濃 縮して未結合の付着分子および一１小さな未結合粒子を除く。ついて、この生成 物をセファクリル２００の１．６Ｘ３５ｃｍカラムに負荷し、２０ｍＭ　ＨＥＰ ＥＳ緩衝液（ｐＨ７，４）で溶出する。このカラム操作により未結合のターゲテ ィング分子がさらに除かれ、新たに生成した水和酸化物が捕捉される。溶出液を 回収し、セントリブレブー１００濃縮器を用いて５００ｇＸ３０分間にて濃縮し 、最終容量を４ｍｌとする。

ついで、反応生成物（４ｍｌ）を、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，４） で平衡化したジビニルスルホン結合を有するアフィニティーリガンドセファロー ス６Ｂ（ある種のレクチンについてはシグマＡ２２７８など）の４ｍｌカラムに 負荷する。結合を最大にするために通常意図される条件は回避するのが好ましい 。

というのは、このことによって特定の両分を溶出することが不可能になるかもし れないからである。ついで、カラムを４〜５容量の緩衝液で充分に洗浄し、つい で同緩衝液中の１モルアフィニティー溶出液２ｍｌ容量を負荷する。これにより 、活性画分がかなりシャープなバンドで溶出される。

特定の画分を回収し、ＰＤ−１０セファデックスＧ−２５Ｍ／１５０カラムに通 してアフィニティー溶出物を除くのを助け、ついで小容量のセントリコン−３０ 遠心濃縮器（１，５００ｇＸ２０分間）で１ｍｌに濃縮する。この生成物を第二 のＰＤ−１０カラムに通し、ついで最終の生成物をセントリコン−３０濃縮器（ １，５００ｇＸ６０分間）で３００〜５００μＩの容量に濃縮する。ついで、こ の最後の生成物をコスタ−１ｍ１遠心マイクロフイルターを用いて０．２２また は０１ミクロン濾過により滅菌し、使用のため貯蔵する。

（ｂ）　コーティング粒子とりわけフェライト粒子は、新規な緩衝沈澱法により 調製される。このタイプの合成は、他の沈澱法において用いられる強アルカリ条 件に耐えられないデリケートな分子を含むコーティングが必要な場合に特に助け になる。所望の２価および３価金属、好ましくはＦｅ”およびＦｅ”（Ｌかしな がら、他の種々の遷移および他の金属をも含む）の塩化物を８２０中またはデキ ストラン／Ｈ２０溶液中または飽和デキストラン／Ｈ２０溶液中に、化学量論の 指図および特定の適用の条件の指図により示されるように、０．２〜１．０モル の金属濃度にて溶解する。低濃度からは、一般に一層小さい粒子を含む粒子ジイ ズ分奄が生成する傾向があるであろう。

沈澱浴を、Ｈ，Ｏ中の強緩衝液溶液として、たとえば１モルＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓま たは１モルトリスとして調製する。鉄塩化物のみを使用する場合には、この溶液 のｐＨは６，０もの低さであってよいが、７．４のｐＨの溶液が多くのカチオン の場合に有効である。意図するコーティング分子が高いｐＨに耐えられる場合は 、緩衝液溶液は耐えられる最も嶌いｐＨにて調製してよい（８，０または８，５ のｐＨに耐えられる多くのタンパク質の場合のように）。

タンパク質、製剤、ターゲティング残基、または他の生体分子を、１〜１００ｍ ｇ、／ｍｌの濃度または核剤の経費および所定のタイプの分子についての結合効 率に対して最適化した一層高いまたは一層低い濃度にて緩衝溶液中に溶解する。

沈澱浴はまた、薬理学的に活性な剤とともに、ウシ血清アルブミン、ペプチド、 デキストランまたは該粒子のコーティングを助は得る他の分子を含んでいてよい 。

この浴を多くのタンパク質に対しては３７℃に加熱し、または選択したコーティ ング分子により耐えられるように周囲温度にて、または０〜４℃にて、または６ ０℃までの一層高い温度にて使用してよい。

ついで、金属塩化物溶液混合物を選択した反応温度とし、好ましくは非磁気混合 法Ｊ二より連続的または間欠的に撹拌しながら緩衝沈澱／コーティング洛中に滴 下して加える。この緩衝浴のイオン強度は金属溶液のイオン強度に比べて２〜１ ０倍、好ましくは４〜６倍大きい必要がある。このことにより全容量並びに金属 溶液の全濃度が制限されるが、いかなる場合も金属溶液を添加する過程を通じて 耐えられる緩衝範囲にｐＨを保持した沈澱浴が得られる結果となるであろう。

たとえば、０．３３ＭＰｄＣ１＊および０．６６ＭＦｅＣ１，の溶液（１ｍｌ） をＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，８（１モル）溶液（１０ｍｌ）に、１ｍｌ当たり２ｍｇ のＣＤ４（可能なら結合部位を保護するためにｇｐ１２０断片でブロッキングす る）および２０ｍｇ／ｍｌのアジドジデオキシチミジン（Ａ　Ｚ　Ｔ）とともに 加えてよい。

この沈澱混合物を反応温度にて２０〜４０分間インキュベートし、ついで１゜０ ００ｇで３回（各１０分間）遠心分離に付し、上澄み液を残（７て沈澱をすべで 廃棄する。ついで、粒子溶液を、たとえばＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，４）２００ｍ Ｍ（カラムの容量は反応生成物の容量の５倍である）のような選択した最終緩衝 液中で平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍのカラムに通す。排除した画分を回 収４５分間）中で濃縮し、緩衝液中で全２４ｍ１に希釈し、ついでセントリブレ ブー１００ウルトラフイルター中で再濃縮して透明な未結合コーティング分子（ ＭＷｌｏｏ、０００よりも小さい）とする。

このＳ縮物をアフィニティーカラムに適用して活性なターゲティング残基を有す るコーティング粒子を選択的に精製するが（たとえば、固定化ｇｐ１２０上で） 、ターゲティング残基を用いない場合は２００　ｎｍ遠心マイクロフィルター中 で直接濾過滅菌に供する。

細胞内感染の治療におけるある範囲の異なるカチオン細胞療法の効力を、ポツク （Ｐｏｔｔｓ）　（ｒテクニークス・インーＨＩＶ−リザーチ（Ｔｅｅｈｎｉｑ ｕｅｓ　ｉｎ　ＨＩ　Ｖ　ｒｅｓｅａｒｃｌｌ）　Ｊ　、アルトビ＝　（Ａｌｄ ｏｖｉｎｉ）ら、ストックトン、ニューヨーク、１９９０．１．０３〜１０６頁 ）ｌ：ヨリ記載されたアッセイがらのＨＩＶ−ＩＲＴ活性のアッセイをモデルと して用いることにより、および電子顕微鏡によって標的細胞による粒子食作用を 示すことにより、示した。これら研究を添付の図面を参照して下記に論じる。

図１は、ある範囲の金属カチオン（Ｍｅ）単独またはマグネシウム七の組合せが ＨＩＶ−Ｉ　ＲＴ活性に及ぼす影響を示すグラフである：図２は、本発明による 粒子の細胞による取込みを示すＴＨＰ−１（ヒトマクロファージ）細胞の電子顕 微鏡写真である：図３はおよび４は、本発明の粒子が細胞の生存力に及ぼす影響 を示すグラフである； 図５は、異なるカチオンを用いたカチオン細胞療法のＨＩＶ感染に対する効果を 示すグラフである（ＨＩＶ−ＩＲＴ活性により測定）：図６は、静脈内注射した 粒子についての血液クリアランス率を示すグラフである。

図７は、ＨＩＶウィルスの模式図である：図８〜１４は、ＨＩＶ感染および増幅 の模式図である。

実験の詳細を説明する前にＨＩＶウィルスの構造および複製についての簡単な記 載を提供するのが役にたつかもしれない。それゆえ、図７において、外部脂質二 Ｊｉ（３）中１ニーＨＩＶ−１ウィ＃ス（ｌＤｇ＋）１２０／ｇｐ４１：Ｉ−ｔ ［９ンバク１Ｋ（１）が配され、該二層（３）はウィルスコア外殻（２）を取り 囲み、該外殻（２）自体はｐ１８サブユニットからなる。外殻（２）内にｐ２４ サブユニットからなる内部コア（７）があり、この中にヌクレオカプシドｇａｇ タンパク質（４）、ＲＴ酵素（５）およびゲノムＲＮＡ　（６）が存在する。

図８は、マクロファージ細胞表面上の脂質二層（９）中のＣＤ４タンパク質に結 合したｇｐ１２０タンパク質を示す。この図はまた、ｇｐ１２０を結合した完全 なパラジウムフェライトデキストランコーティング粒子（１０）（エンドソーム 中に食作用により取り込まれている）およびマクロファージ中で部分的に消化さ れたフｒライト粒子（１１）をも示している。図９は、ヒトマクロファージ内で のＨＩＶウィルスゲノムのコーティング除去（ｕｎｃｏａｔｉｎｇ）の過程を示 しており、部分的にコーティング除去されたウィルス（１２）がウィルスの脂質 コートを失い、該コートが細胞脂質コート（１３）と融合している。この図はま た、食作用およびそれに引き続くコーティング除去の後の内部の細胞質ヂャネル （１４）へのウィルスの別の侵入経路をも示している。

図１０は、ウィルスの複製における金属カチオンの役割の模式図を提供する。

それゆえ、（１５）はゲノムＲＮＡ鎖（１６）に結合した逆転写酵素に結合した 金属カチオンを示す。この金属／ＲＴ＠素は、逆転写酵（１７）のＲＮＡ依存性 ＤＮＡポリメラーゼ過程の完了の間も残り、ＲＮＡ鋳型を分解するＲＮアーゼＨ 過程の完了および二本鎖ウィルスＤＮＡ（１８）の生成（逆転写酵素のＤＮＡ依 存性ＤＮＡポリメラーゼ機能により完了する）の間も結合したままである。

図１１は、ウィルスＤＮＡを宿主ＤＮＡゲノム中に挿入することによりプロウィ ルスを安定化するインテグラーゼタンパク質（２１）を有する宿主細胞の核層（ ２０）を示す。細胞表面脂質二層中のＣＤ４タンパク質（２２）も示されている 。図１２は、２量体部位に金属カチオン（１５）を有する転写のトランス作用因 子（ｔ　ａ　ｔ）タンパク質（２３）を図示しており、ｔａｔ制御下のｍＲＮＡ ／ゲノムＲＮＡ　（２４）の転写並びに組み込まれたプロウィルスＤＮＡ　（２ ５）を示す。

図１３は、いかにしてヌクレオカプシドタンパク質（４）がウィルスＲＮＡ　（ ６）に結合するかを示す。金属カチオン（１５）は核酸結合部位においてコンホ メーションを保持している。図１４においては、ヌクレオカプシドタンパク質（ ４）がいかにして生成しているｐ２４内部コア（７）中に結合するかを示す。ゲ ノムＲＮＡ　（６）の２つのコピーがヌクレオカプシドタンパク質によりカプシ ドに結合する。カチオン（１５）は、これら２つのＲＮＡ鎮の間の２量化部位に 関与する。

広範囲の金属カチオンを用いた逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを、種々の元素の化 学により課される溶解性についての特別の条件に合致するようにポツプ法（上記 ）を修飾することにより行うことができる。フチオス１／イトール（ＤＴＴ）ま たは上昇したｐＨは遷移金属を直ちに沈澱させるので、アッセイをＯ−４℃で行 った場合にＤＴＴなしで良好な活性を示したチミン（ＴｅＩＩｌｉｎ）ら（Ｎａ ｔｕｒｅ　２２６：１２１１〜１２１３　（１９７０））の示唆に従い、殆どの カチオンによりおよび酵素により耐えられるｐＨ７，３の緩衝液を用いた。銅カ チオンはＨＥＰＥＳ緩衝液中で沈澱するがトリス中では沈澱しない。鉄（ＩＩ） および鉄（ＩＩ［）カチオンは４０以上のｐＨでは不溶性であるため、非常に減 少した有効な濃度の「金属緩衝液」キレート化剤なしではこれらアッセイにおい て鉄を用いることができない。

銅、ニッケルおよび亜鉛の抑制効果はＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウィ ルス）からのＲＴで認められるものと類似していたが、Ｍ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖ におけるパラジウム抑制はマグネシウムによって逆転されなかった。また、マグ ネシウムの存在下で高濃度のマンガンがＨＩＶ酵素を抑制する能力もＭｏＭｕＬ Ｖ中で認められなかった。

カチオン細胞療法のためのデキストランコーティング粒子において、スピネル構 造セラミック酸化物結晶（［Ｆｅ”］　ｔ　［Ｍｔ”］　Ｏ，）を確立するため に鉄（ｍ）イオンを用いることができ、該結晶中の２価金属部位は選択された２ 価カチオン（Ｆｅ”、Ｍｎ”、Ｐｄト、またはＮｉ２つまたは元素の化学量論的 混合物で完全に充填される。幾つかの化合物の結晶構造は確立されず、おそらく 、ざくろ石またはペロブスキー石タイプのいずれかであり、記載した合成からは 所望のサイズ範囲では低収率しか得られない。これら試みにおいて使用する各フ ェライト粒子は約１０’〜１０６金属原子を含有するため、ＴＨＰ−１実験に使 用する３価元素についての３ｍＭの濃度はナノモル範囲の粒子の濃度を反映する 。ｌｌ）’ｅ標識粒子を用いた取込み研究は、２時間にわたって１時間当たりＴ ＨＰ−１細胞当たりに約５Ｘ１０”粒子の取込み割合を示している。これら粒子 は電子顕微鏡により容易に観察することができるので、細胞表面への付着および 細胞内位置の両方の存在を５９Ｆｅ結果と一致する量にて直接確認することがで きた。粒子の５０μモル／ｋｇの丸い塊の静脈内注射から、ウサギにおいて注射 した投与量の７５％の主として膵臓、骨髄、肝臓および肺への４時間血管クリア ランスが明らかとなり、同様のＭＲコントラスト剤についてのヒトデータ（ラネ イ（Ｒａｎｎｅｙ）、Ａｎｎ、ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　５０７　：　１０４〜 １ｉ９　（１９８７））を密接に反映していた。

Ｆｅ／Ｍｎ粒子のみが、未処理の非感染コントロールに比べてまたは未処理の感 染コントロールに比べて有意にＴＨＰ−１細胞の生存力に影響を及ぼした（図３ および４参照）。Ｆｅ／ＭｎおよびＦｅ／Ｐｄの両粒子が該ウィルスの感染を有 効に阻止した。

カチオン源粒子は、デキストランでコーティングし、およびＣＤ４の断片やｇｐ １２０の断片などのターゲテづングタンパク質に結合さゼることができる。デキ ストランコーティングは、共活性な抗ウィルス剤を含むコーティングで増幅しま たは置換することができる。しかしながら、ＨＩＶ治療および急性予防に向けら れたマクロファージのための簡単で非ターゲティングデキストランコーティング パラジウムフェライト粒子の使用に対する大きな可能性が存在する。

図１は、２価遷移金属を用いたＨＩＶ−１逆転写酵素活性を示す。図１のアッセ イは、１５０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）中で行ったＣｕ”以外は１５０ｍＭＨＥ ＰＥＳ　（ｐＨ７，３）中１’ＤＴＴなしでｏ〜４℃ニテ行ツタ。７５ｍＭＫＣ ＬポリーｒＡ　５μｇ／ｍｌ、オリゴｄＴｏ＊−＋ｓ＋　ｓμｇ、’ｍ＋、過酸 化物不含ＮＰ−４００，０５％、および［３！ＰコｄＴＴＰ　５μＣｉ／ｍｌを 用い、種々の完全な緩衝液を脱イオンした金属不含水中で調製した。種々のカク テルを９６ウエルプレートに１００μｌ／ウエルの容量にて移し、ついでプレー トを凍結した。

０、ｌＮＨＣｌ中に２５０ｍＭとして金属溶液を調製し、ついで０．ｌＮＨＣｌ 中に系列希釈して種々の最終濃度の種々の金属を含有する９６ウエルプレートを 調製した。ついで、ＲＴカクテルプレートを解凍し、２０μｌのＨＩＶ感染細胞 不含上澄み液を１セツトのプレートに加え、一方、コントロールのセットには同 じ培養液および培地からの２０μｍの未感染細胞不含上澄み液を加え、各完全緩 衝液チャネルについての内部コントロールには１０単位の精製ＭｏＭｕＬＶＲＴ （ファルマシア）および２０μｍの細胞不含未感染上澄み液の両方を加えた。

マルチ−チャネルピペッタ−を用い、これら種々の金属カチオン希釈液およびＭ ｇｃｌ、希釈液（８μｌ容量）を、各緩衝液／ＤＴＴ／温度条件についてＨＩＶ 、ＭＯＭｕＬＶ、およびコントロールウェル中の適当な位置に移すことにより反 応を開始した。反応の開始から２時間後（３４℃プレート）または４時間後（０ ・〜４℃プレート）、ＤＥ８１ファツトマン（Ｗｈａｔ＋１ａｎ）紙上の前辺て 数字を付したアレイへの５μｍドツト移動を乾燥し、洗浄し、正方形にカッティ ングし、５ｍｌのンンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）中でβ−カウントを 行った。このグラフにおいては各コントロールウェルからの活性を対応アッセイ ウェルについての値から差し引き、ＭｏＭｕＬＶ内部コントロールは示しておら ず、各温度条件についてマグネシウム値は一つしか示していない。

図２において、ＴＨＰ−１細胞（Ｉｎｔ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ７６　：１７１〜 １７６　（１９８０））の電子顕微鏡切片（６０，０００Ｘ）が示されており、 消化されたおよび表面に付着したカチオン含有粒子を示している。ＴＨＰ−１細 胞を３ｍＭＦｅ”に等価な濃度のＦｅ／Ｐｄデキストランコーティング粒子とと もに３７℃にて２時間インキュベートし、ついで洗浄し、グルタルアルデヒド／ ＰＢＳ中に固定し、回転させ、オスミウム酸処理し、包埋し、ついで染色するこ となく薄片にした。各タイプの粒子について、０．３３ｍモルの３価金属塩化物 水和物および０．１７ｍモルの２価塩化物水和物（沈澱前の酸化を考慮して０． ２０ｍモルとして添加したＦｅ”を除く）を、７５０ｕ１のＨ！Ｏ中に５００ｍ ｇの１０，０００ＭＷデキストランを溶解することにより調製した溶液に直接加 えた。ＰｄＣ１２水和物は４ＮＭＣＩ（たとえば、塩化物３５ｍｇに対して１０ ０μｌ）中に完全に溶解するのにゆっくりと１２時間要し、溶液として該デキス トランに加える。

７．５％ＮＨＩ溶液を６５℃に加熱し、各金ｊｌ！／デキストラン溶液をしばら く加熱した後、３ｍｌの熱ＮＨ，溶液を６つの５００μｌアリコートとして各混 合物に加え、４ｍｌがＦｅ／Ｐｄ調製物に必要であった。沈澱したコーティング 粒子を６０℃にて１時間インキュベートすると、その間にＦｅ／Ｐｄ溶液は徐々 に透明になり、ついで得られた懸濁液を１，０００ｇＸ１０分間で２回回転させ て大きな粒子を除いた。１．５ｍｌの各溶液を５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７ ，４）緩衝液中で平衡化したＰＤ−１０セフアデツクス（ファルマシア）カラム 中に通してアンモニアを除去し、未反応のイオンを除いた。２．５ｍｌの溶出液 を５０ｍＭＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，４）を用いて１４ｍ１の容量に希釈し、つい でセントリブレブー１００（アミコン）ウルトラフィルター中、５００μｌ３０ 分および５００μｌ１時間の２工程にて濃縮して最終容量を０．５ｍｌとし、遊 離のデキストランを除いた。ついで、これら濃縮物をＴＨＰ−１感染性試験およ びＥＭ研究のために使用した（Ｆｅ／ＦｅおよびＦｅ／Ｐｄ）ｏ　”Ｆｅを含有 し０．１ミクロン１！過に供した同様のＦ　ｅ／Ｆ　ｅ粒子をＴＨＰ−１取込み 研究および静脈内分布／クリアランス評価に用いた。

図３は、未処理の非感染細胞と比較したカチオン源粒子処理した非感染細胞の相 対的生存力を示し、図４は、未処理の感染細胞と比較した処理した感染細胞の相 対的生存力を示す。図５は、種々の処理からのＲＴアッセイ（８時間の反応時間 ）を示す。ＴＨＰ−１細胞を洗浄し、３価鉄（ｍ）カチオンについて３ｍＭに等 価となるように調節した濃度（ナノモル粒子濃度）の４つのカチオン源粒子懸濁 液の一つとともに２時間インキュベートし、その後、細胞を洗浄し、ついでウユ ル当たり５０．０００細胞の濃度、金属島たり４つの同一のウェルおよび４つの コントロールチャネルにて２４ウエルマイクロタイタープレート中に接種した。

２４時間後、細胞のアリコートを各ウェルがら取り出して生存力を調べ、ついで 同量のＨＩＶＲＦ株を培養の各グループ中の上記４つのウェルの各２つに接種し 、規則的に培地を変えてインキュベートした。３．７．１１および１４日目に上 澄み液のアリコートをを取り出し、その後のボッッ（上記）ＲＴアッセイ（カウ ントのためのドツト移動は２時間後および８時間後に行った）のために−７０℃ にて貯蔵し、それと同時に全細胞カウントおよびトリバンブルー排除にょる％生 存力のために細胞のアリコートを除いた。

ＦＩＧ　２ 注射禮の分 処理後の日 国際調査報告 ｋｍ　ｍ／１ｓＪ１／Ｊ＋ｏ　１Ｍｌ＋ｍｗ＋１ｍｌ　ｓｔｙ　１２トＰｍ２ｍ 　Ｍ国際調査報告 フロントページの続き （３１）優先権主張番号　９１０２２１４６．９（３２）優先日　１９９１年１ 月３１日（３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（３１）優先権主張番号　９ １１０８７６．１（３２）優先日　１９９１年５月２０日（３３）優先権主張国 　イギリス（ＧＢ）（３１）優先権主張番号　９１１６３７３．３（３２）優先 日　１９９１年７月３０日（３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（３１）優 先権主張番号　９１１７８５１．７（３２）優先日　１９９１年８月１９日（３ ３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（３１）優先権主張番号　９１１８６７６ ．７（３２）優先日　１９９１年８月３０日（３３）優先権主張国　イギリス（ ＧＢ）（３１）優先権主張番号　９１１９６６５．９（３２）優先日　１９９１ 年９月１３日（３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（８１）指定国　ＥＰ（ ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、 　ＣＡ、ＪＰ、　Ｎｏ、　ＵＳ（７２）発明者　レバー、アンドリュー・マイケ ル・リンゼイ イギリス国、シービー２・２キユーキユー、ケンブリッジ、ヒルズ・ロード、レ ベル５、アデンブルックス・ホスピタル、デパートメント・オブ・メディシン（ 番地の表示なし）

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．治療的または予防的に有効な元素を含有する微細粒子剤の製造のための該元 素の原子またはイオンを含有する整理学的に許容し得る材料の使用であって、該 剤は、ヒトまたは動物の生体の細胞中へのエンドサイトーシスによる該粒子また はその断片の送達を含む、該生体の治療的または予防的処置における使用のため のものであることを特徴とする使用。
2. ２．該剤が該元素を含有する無機材料の粒子からなる請求項１に記載の使用。
3. ３．該剤が金属合金、酸化物または硫化物からなる請求項１または２のいずれか に記載の使用。
4. ４．該剤がスピネルまたはざくろ石構造を有する無機材料の粒子からなる請求項 １〜３のいずれか一つに記載の使用。
5. ５．該剤が該元素を組み込んだフェライトの粒子からなる請求項１〜４のいずれ か一つに記載の使用。
6. ６．該剤が、そのカチオンが治療的または予防的に有効な金属を組み込んだ粒子 からなる請求項１〜５のいずれか一つに記載の使用。
7. ７．該金属がＰｄ、Ｍｎ、Ｚｎ、ＣｕおよびＮｉから選ばれたものである請求項 ６に記載の使用。
8. ８．該金属がＰｄである請求項６に記載の使用。
9. ９．該剤が放射性核種を組み込んだ無機材料の粒子からなる請求項１〜５のいず れか一つに記載の使用。
10. １０．該放射性核種がＫ殻捕捉により崩壊する同位元素である請求項９に記載の 使用。
11. １１．該粒子がコーティングしてある請求項１〜１０のいずれか一つに記載の使 用。
12. １２．該粒子が、粒子エンドサイトーシスの特異性を増すためにターゲティング 残基を結合した生理学的に許容し得る有機化合物をコーティングしてある請求項 １０に記載の使用。
13. １３．該ターゲティング残基がＨＩＶタンパク質または断片またはそのレセプタ ーである請求項１２に記載の使用。
14. １４．該ターゲティング残基がｇｐ１２０である請求項１３に記載の使用。
15. １５．ヒトまたは動物の生体の予防的または治療的処置方法であって、治療的ま たは予防的に有効な元素の原子またはイオンを含有する生理学的に許容し得る好 ましくは無機の材料の粒子からなる微細粒子剤を該生体内に投与することにより 、該生体内の細胞中に該粒子またはその断片をエンドサイトーシスにより送達す ることを特徴とする方法。
16. １６．該剤が請求項２〜１４のいずれか一つに定められたものである請求項１５ に記載の方法。
17. １７．ＨＩＶ感染の治療または予防のためのものである請求項１５または１６に 記載の方法。
18. １８．少なくとも１種の薬理学的担体または賦形剤とともに、治療的または予防 的に有効な元素の原子またはイオンを含有する生理学的に許容し得る材料のエン ドサイトーシスに供され得る粒子を含有することを特徴とする医薬組成物。
19. １９．請求項２〜１４のいずれか一つに記載の微細粒子剤を含む請求項１８に記 載の組成物。
20. ２０．該粒子の平均最大大きさが５〜１００ｎｍである請求項１８および１９の いずれかに記載の組成物。
21. ２１．静脈内、動脈内、筋肉内、局所、吸入または膣投与のためのものである請 求項１８〜２０のいずれか一つに記載の組成物。
22. ２２．治療的または予防的に活性な元素を含むエンドサイトーシスに供され得る 粒子を少なくとも１種の薬理学的担体または賦形剤と混合することを特徴とする 微細粒子製剤の調製法。
23. ２３．スピネルまたはざくろ石構造の結晶の生成が可能なイオン半径の２価また は３価金属イオンを沈澱させ、該沈澱が所望の治療的または予防的活性を有する 元素を含有する溶液からのものであり、ついで適宜サイズ分離およびコーティン グの後、得られた粒子を細胞付着分子に任意に結合させることを特徴とする、修 飾したスピネルまたはざくろ石粒子の調製法。
24. ２４．細胞内に取り込まれることができ、取り込んだ細胞に元からあるカチオン と競合し該細胞の外部から検出できる金属カチオンをその後に細胞内放出するこ とのできる粒子からなる組成物。
25. ２５．鉄酸化物マトリックス内に配されたパラジウムからなる結晶性材料。