KR0142876B1 - 자성 단백질 결합체, 이의 제조방법, 및 이의 용도 - Google Patents

자성 단백질 결합체, 이의 제조방법, 및 이의 용도

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KR0142876B1 KR1019890002941A KR890002941A KR0142876B1 KR 0142876 B1 KR0142876 B1 KR 0142876B1 KR 1019890002941 A KR1019890002941 A KR 1019890002941A KR 890002941 A KR890002941 A KR 890002941A KR 0142876 B1 KR0142876 B1 KR 0142876B1
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필립 스타인, 해리베르트 부흐
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Abstract

내용없음

Description

자성 단백질 결합체, 이의 제조방법, 및 이의 용도
제1도는 BMA 041 BMA 081 자성비드를 사용한 T세포 아집단의 제게를 나타낸다.
PBL: 최초 세포 집단
CD4-: BMA 041 자성비드로 제거한 후의 집단
CD8-: BMA 081 자성비드로 제거한 후의 집단
제2도는 대조용 배지와 비교된, 결합되지 않은 자성 입자(BioMag M4100, SebakR)로 배양하고 식물혈구응집소(PHA) 또는 포우크위드(pokeweed) 유사분열 물질 (PWM)로 자극시킨 후의 배양물중의 T세포의 증식을 나타낸다.
제3도는 대조용 배지와 비교된, 결합되지 않은 자성 입자(BioMag M4100, SebakR)의 존재하에 식물혈구응집소 (PHA), 아티-CD3 모노클로날 항체 BMA 030, 또는 스타피로코커스 아우레우스 캡시드(SAC)로 자극시킨 후의 배양물중의 T세포의 증식을 나타낸다.
본 발명은 일반식(I)의 자성 단백질 결합체, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기식에서,
M은 아미노 그룹을 갖는 분산성 자기 반응성 물질 또는 입자이고,
P는 1개 이상의 머캅토 그룹을 갖는 단백질이며,
X는 화학적 방법으로 2개의 리간드를 연결하는 유기 화학적 구조이다.
X는 바람직하게는 각각의 경우 적합한 방법으로 임의로 치환될 수 있는 지방족, 방향족, 지환족, 지환족-지방족 또는 방향족-지방족 스페이서, 바람직하게는-(CH2)n-(여기에서, n은 1 내지 8, 바람직하게는 1 내지 5, 특히 바람직하게는 2 또는 3이다)이거나,
X는 바람직하게는 페닐렌 또는 치환된 페닐렌이고, 2개의 리간드는 오르토, 메타 또는 파라 위치로 존재할 수 있으며, 페닐렌 환에 임의로 존재하는 치환체는 메틸, 하이드록실, 메톡시, 아세톡시, 니트로 또는 시아노 그룹 또는 염소 또는 브롬 원자일 수 있거나,
X는 바람직하게는 페닐렌-(CH2)n-(여기에서, n은 1내지 5, 바람직하게는 3이며, 이페닐렌 그룹은 석신이미딜 그룹에 연결된다)이거나,
X는 바람직하게는 -CHR-(여기에서, R은 아미노산 측쇄, 바람직하게는 아미노산 알라닌, 세린, 트레오닌 또는 메티오닌의 측쇄 및 특히 바람직하게는 알라닌의 측쇄이다)이거나,
X는 바람직하게는메틸렌사이크로헥실 (여기에서, 메틸렌 그룹은 석신이미딜 그룹에 연결되며, 사이클로헥실 환에 연결되는 카보닐 그룹에 대하여는, 바람직하게는 사이클로헥실 환의 4번 위치에 연결된다)이다.
X의 특성은 또한 화학적 방법 또는 효소적 방법으로 절단될 수 있는 것이다.
P는 머캅토 그룹이 천연 상태로 존재하거나 디설파이드 결합의 환원에 의해 생성되거나 화학적 반응으로 도입되는 단백질일 수 있다.
P는, 특히, 면역글로불린 또는 면역글로불린 잔기, 바람직하게는 모노클로날항체 또는 Fab, Fab' 또는 F(ab')2단편, 항원 또는 효소, 호르몬, 렉틴 또는 s성장 인자의 잔기이다.
P는 바람직하게는 IgG 또는 IgM 부류의 모노클로날 항체, 특히 염 수용액 또는 체액에 용해된 형태로 존재하는 항원에 대한 모노클로날 항체, 또는 세포상에서 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체이며, 항원을 발현하는 세포는, 특히, 골수계 또는 림프계의 세포, 말초 혈액의 세포, 특히 B-림프구, T-림프구 또는 이들의 전구 세포, 또는 종양 세포, 특히 골수의 종양 세포일 수 있다. 이러한 세포는 또한 적혈구, 세균, 마이코플라스마 또는 원생동물일 수 있다. 그러나, 비루스도 또한 본 발명의 범위내의 세포로 이해될 수 있다.
M은 바람직하게는 금속 산화물 핵 (core) 및 아니노 그룹을 갖는 외피를 포함하는 분산성 입자이며, 금속 산화물 핵은 상자성(paramagnetic) 물질의 그룹, 바람직하게는 직경이 약 0.1 μ 내지 약 100μ, 바람직하게는 약 0.1μ 내지 약 1.5μ인 입자를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 일반식(I)의 자성 단백질 결합체의 제조방법 및 염 수용액 또는 체액으로부터의 세포 또는 가용성 하원, 수용체, 기질, 조인자 또는 탄수화물 결정기(determinant)의 특이적 제거를 위한 일반식 (I)의 결합체의 용도, 및 진단방법에 또는 진단 보조물로서 사용하기 위한 용도, 특히, 골수 제거 또는 HLA 타이핑(typing)을 위한 용도에 관한 것이다.
골수 이식은 종종, 특히 특정형의 백혈병 및 범골수병(무형성성빈혈)의 치료를 위한 유일한 치료적 선택이다.
백혈병 및 특정한 림프성 신형성의 경우, 이제까지는 환자가 극히 고 용량을 사용한 전신 조사 및/또는 침해적 화학적 치료를 받아왔다. 이러한 유형의 치료에서, 골수의 정상적 간세포, 모든 혈액 세포의 전구체는 완전히 파괴된다. 따라서 적합한 공급자로부터의 골수를 환자에게 재주입하여, 이로부터의 세포가 수령자의 수강을 콜론화하여 조혈계 및 면역계를 재생성시킨다. 이 방법은 동종유전적(allogeneic) 골수 이식이라 부리운다.
동종유전적 골수 이식의 높은 위험성은, 특히, 공급자의 T-림프구로부터 유도되며, 이는 환자에게 재주입된 골수로 운반되어 수령자의 세포를 외인물로 인식하여 이를 공격하고 파괴시킨다. 종종 환자의 생명을 위협하는 이러한 골수 과민성은 이식-대-숙주 반응 또는 이식-대-숙주 질환(GVHD)이라 불리운다. 이러한 이식-대-숙주 질환의 위험은, 판편으로는, 가능한 경우, 환자에게 종종 친척중의 특히 적합한 공급자로부터 정확히 타입된 골수를 재주입시켜 감소시킬 수 있다. 그러나, 다른 한편으로는, 이들을 환자에게 재주입하기 전에, 원하지 않는 세포 집단, 예를 들어 공급자 골수의 T-림프구를 선택적으로 제거함으로써 감소시킬 수 있다. 이러한 공급자 T세포의 제거는, 예를 들어, 보체의 존재하에 제거할 세포의 선택적 붕괴에 의하거나, 소위 면역독소를 사용하여 T세포를 선택적으로 죽이거나, 또 다른 방법, 예를 들어 골수의 자성(magnetic) 세포 제거에 의해 수행할 수 있다.
이러한 유형의 골수 세포 제거는 비교적 간단한 방법으로 수행할 수 있으며, 이러한 방법은 골수를, 예를 들어 골수의 T세포에 대해 특이적이어서 결국 T세포에만 결합하는 모노클로날 마우스 항체와 함께 배양하는 것이다. 모노클로날 마우스 항체가 결합된 이러한 유형의 T세포는, 자성 입자에 결합된, 예를 들어 래비트 안티-마우스 면역그로불린과 함께 배양하여 제2단계에서 제거할 수 있으며, 이 방법에 의해 자성 물질은 T-림프구에 특이적 방법으로 결합되어 이들을 자석을 사용하여 골수로부터 제거할 수 있다[참조: Vartdal et al., Transplantation(1987), 43, 366-371 및 여기에 인용된 문헌].
또한 유사한 방법으로 골수로부터 다른 세포 집단, 예를 들어 종양 세포를 제거할 수 있으며, 이는 소위 자기성(autologous) 골수 이식에 중요하다[참조: Kvalheim et al., Cancer Research (1987), 47, 846-851 및 여기에 인용된 문헌]. 더욱이, Kvalheim 등의 상기 문헌에 기술되어 있는 바와 같이, 종양 세포를 인지하는 모노클로날 항체를 직접적으로 자성 입자상에 결합시킬 수 있으며 이로써 상술한 제2항체(래비크 안티-마우스)는 더 이상 필요하지 않다.
자성 입자에 결합된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용한 골수 제거를 위한 상술한 방법은 여전히 매우 새로운 것이며 더욱 진전된 개발 및 시험이 필요하다. 이러한 목적에 적합한 매우 다양한 유형의 자성 입자가 현재 구입가능하며, 이의 제조방법이 특허 문헌[참조: Chagnon et al., EP 0,125,995, A2 (우선권 US493,991, 1983.5.12), Advanced Magnetics, Ughelstad et al., WO 8,303,920. 1983.11.10, SINTEF]에 1회 이상 기술되어 있다. 이들 자성 입자는, 상자성 물질이 포함될 수 있는 금속 산화물 핵을 포함하고, 이 핵은 단백질 결합에 사용될 수 이Tssm 반응성 그룹, 예를 들어 아미노페닐, 아니노, 카복실, 하이드록실 또느 설프하이드릴 그룹을 갖는 외피에 의해 감싸여져 있다[참조: Chagnon et al., EP 0,125,995 A2].
예를 들어, 카복실 그룹을 갖는 입자가 축합제의 존재하에 단백질의 아미노그룹과의 반응을 유도할 수 있음이 알려져 있다[참조:Chagnon et al., EP 0,125,995 A2].
또한 단백질을 글루타르알데하이드를 사용하여 아미노 그룹을 갖는 자성 입자에 결합시키며, 이 결합이 각각의 경우에서 아미노 그굽을 통하여 생성됨이 알려져 있다[참조: Chagnon et al., EP 0,125,995 A2].
또한, 하이드록실 그룹을 갖는 입자를 p-톨루엔설포닐 콜로라이드와 반응시켜 활성화시킬 수 있으며, 이러한 방법으로 활성화된 입자를 단백질의 아미노 그룹과 반응시킬 수 있음이 알려져 있다[참조:Kvalheim et al., Cancer Research (1987), 47, 846-851].
모든 이러한 결합 방법에서 각각의 경우에 단백질을 이의 유리 아미노 그룹을 통하여 입자에 연결시키는 것이 통상적이다. 그러나, 아미노 그룹을 통한 이러한 유형의 결합은, 이러한 경우, 종종, 항체의 특이성 및 반응성이 손상되므로 모노클로날 항체에 상당히 불리할 수 있다. 이는 항제중의 아미노 그룹이 전체 분자 상에서 다소 무작위로 분포되어 Fab 딴편의 항원-결합 부위에 위치하여, 이로써 이들 아미노 그룹을 통한 결합이 일어나는 부위의 특이성을 상실하게 하기 때문이다.
또한, 단백질은 포리스티렌에 비-특이적으로 결합한다는 것이 알려졌으므로, 입자가 스티렌/디비닐벤젠 공중합체로 둘러싸이는 경우, 항체를 화학적 결합이 없이, 단순히 흡착시켜 자성 입자상에 취할 수 있음이 알려져 있다.
그러나, 이러한 방법조차도, 항체의 특이성 및 만응성의 손상이 야기된다. 그러나 이러한 방법의 또다른 결점은 흡착에 의해 결합된 항체가 골수 제거 동안 다시 분리되어, 제거된 골수의 재주입시 환자에게 또한 투여되어, 특히 모노클로날 항체를 사용한 치료에서 사전 시도가 있었던 경우 심각한 부작용을 초래할 수 있다는 가능성을 포함한다. 그러나, 이러한 문제점이 알려져 있으므로 자성 입자에 대한 항체의 공유 결합으로 이를 극복하는 것이 목표이다.
또한 폴리스티렌 외막을 갖는 자성 입자는, 이들이 응집하려고 하며, 더욱이 세포에 대해 비특이적으로 결합하는 심각한 단점을 갖는다는 것이 알려져 있다.
선행 기술에 기초하여, 본 발명의 목적은 항체를 a)공유적으로 b)이들의 아미노 그룹을 통하지 않고, 자성 입자에 결합시키는 방법을 개발하는 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은, 다시 말하면 항체의 항원 결합 부위가 변형되지 않거나, 항체 결합이 항원 결합 부위로부터 격리되어 일어나는 결합 방법을 밝히는 것이다.
본 발명에 따른 이러한 목적은 제3면 일반식 (I)의 자성 단백질 결합체를 제조함으로써 성취된다.
본 발명에 이르러, 반응성 그룹으로서 유리 아미노 그룹을 갖는 자성 입자를 간단한 방법으로 반응성 그룹으로서 말레이미도 그룹을 갖는 자성 입자로 전환시킬 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 종류의 입자는 신규한 것이다.
또한, 말레이미도 그룹을 갖는 자성 입자를 어려움 없이 머캅토 그룹은 천연 상태로 이미 존재하거나 화학적 방법으로 도입되거나 존재하는 디설파이드 결합의 환원에 의해 생성될 수 있음이 밝혀졌다.
특히, 말레이미도 그룹을 갖는 자성 입자를, 항체의 쇄간 디설파이드 결합이 자성 입자의 말레이미도 그룹과 반응을 유도할 수 있는 유리 SH 그룹으로 선택적 환원에 의해 전환되어 안정한 티오에테르 결합을 형성하는 경우, 어려움 없이 모노클로날 항체와 결합시킬 수 있음이 밝혀졌다. 마찬가지로 자성 입자에 대한 모노클로날 항체의 이러한 결합 방법은 신규한 것이다.
놀랍게도, 티오에테르 결합을 통하여 자성 입자에 결합되는 항체의 특이성 및 반응성은, 항체의 힌지(hinge) 영역을 통한 항체의 결합이 이의 항원-결합 부위를 변형시키거나 손상시키지 않으므로, 완전히 유지된다는 것이 밝혀졌다. 여기에, 상술한 바와 같이 항체가 자성 입자상에 단지 흡착 또는 이들의 아미노 그룹의 반응에 의해 취해져 이로써 결합된 항체의 특이성 및 반응성이 모두 손상될 수 있는 이제까지의 결합 방법에 비해, 본 발명의 특별한 잇점이 있다. 또한, 흡착에 의한 결합과 비교하여, 본 발명은 항체가 자성 입자상에 화학적으로 결합하여, 이로써 본 발명에 따른 자성 항체 결합체를, 예를 들어 골수 제거용으로 사용하는 경우 입자로부터 분리되지 않는 잇점을 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 자성 항체 결합체는, 예를 들어 이의 높은 특이성 때문에 골수 제거에 특히 유리하다는 것이 밝혀졌다.
또한, 본 발명에 따른 자성 항체 결합체는, 이들의 높은 특이성 때문에 진단 방법에 또는 진단 보조제로서, 특히, 예를 들어 HLA 타이핑에 유리한 것으로도 밝혀졌다.
본 발명에 따른 자성 항체 결합체의 제조방법을 하기에서 골수 세포에 대한 다양한 모노클로날 항체를 예로 들어 기술하였으나, 특정화된 실시예가 본 발명을 제한하지는 않는다. 또한, 골수 세포 제거 또는 HLA 타이핑을 위한, 실시예의 방법으로 제조되는 자성 항체 결합체의 용도도 마찬가지로 특정화된 실시예로 기술하였으나, 이에 제한하지 않는다.
일반식(I)의 자성 단백질 결합체의 제조방법
아미노 그룹을 갖는 자성 입자 M을 적합한 용매 내에서, 아미드 결합을 형성하면서 아미노 그룹과 반응하는 일반식(II)의 말레이미도 스페이서와 반응시켜 일반식(III)의 화합물을 생성시키고, 이를 최종적으로 단백질을 변성시키지 않는 적합한 염-함유 수용액 (예: 생리적 식염수 또는 인산염 완충액 염수)중에서 머캅토 그룹을 갖는 단백질 P와 반응시켜 일반식(I)의 화합물을 수득한다.
(II)
(III)
일반식(II)의 화합물을 자성 입자에 결합하기에 적합한 용매의 특성은 사용되는 용매가 각 경우에 결합에 사용되는 자성 입자의 물리적 및 자기적 특성, 특히 이들의 크기, 분산력 및 표면 특성을 손상시키지 않는 용매이어야 한다. 예를 들어 특허 문헌[참조: EP 0,125,995 A2 또는 WO 8,303,920]에 기술된 자성 입자에 적합한 것으로 밝혀진 용매의 예는 물과 디메틸포름아미드의 혼합물이며, 이 경우 일반식(II)에서 치환체 Z는 예를 들면 바람직하게는 석신이미딜옥시이다. 그러나, 또다른 가능한 적합한 용매의 예는 무수 아세톤이며, 이 경우에는 일반식 (II)에서 치환체 Z는 석신이미딜옥시 외에 할로겐 (예: 염소 또는 브롬), 또는 슈도할라이드(예: 시아나이드), 또는 아실 그룹 (예 아세틸 또는 p-니트로벤조일), 또는 또다른 반응성 이탈 그룹 (예: 토실)이며, Z가 석신이미딜옥시가 아닌 모든 경우에 반응은 바람직하게는 예를 들어 탄산 나트륨과 같은 적합한 염기의 존재하에서 수행한다.
세포 제거 방법
염-함유, 바람직하게는 생리적 수용액 또는 체액 중의 제거될 세포 혼합물의 현탁액을 예를 들어 0℃ 내지 40℃의 적합한 온도에서, 바람직하게는 진탕시키며, 또한 바람직하게는 무균 조건하에서 적합한 기간동안 일반식(I)의 화합물과 함께 배양한 후, 자성 입자를 적합한 자석을 사용하여 용액으로부터 제거한다.
적합한 온도의 예를 들면 0℃, 실온 또는 37℃이나, 실온이 바람직하다. 배양 기간은 각 경우에 사용된 배양 온도 및 항체의 결합 반응에 따라 다르며, 예를 들면 수분 내지 2시간일 수 있다. 배야은 바람직하게는 예를 들면 실온에서 10 내지 20분 동안 수행한다.
가용성 생유기(bioorganic) 분자의 분리 방법
본 방법은 세포 제거 방법 뒤에 필수적으로 따르는 것이다.
[실시예]
하기 실시예는 본 발명을 예를 들어 더 설명하는 것이며 본 발명을 제한하려 함은 아니다.
기술된 방법으로 모노클로날 하어체와의 반응을 유도하는 자성 입자를 이하에서 자성비드(magnetobeads)라고 칭하며, 이들의 특이성은 각 경우에 특정 항체명에 접두사를 붙여 나타낸다.
[실시예 1]
Υ-말레이미도부티레이트 스페이서를 사용한 EP 0 제 0,125,995 A2에 따른 자성 입자의 결합체
시판되는 자성 입자(BioMag M4100, SebakR)의 현탁액 0.5㎖를 pH 7.2의 인산염 완충액 염수(PBS)로 3회 세척하여 PBS 6㎖ 중에서 재현탁시킨다. 이 현탁액에 새로이 제조된 무수 디메틸포름아미드 4㎖ 중의 20mg N-(Υ-말레이미도부티릴옥시) 석신이미드 (GMBS, Calbiochem)의 용액을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 진탕시킨다. 이어서 입자들을 3000 x g에서 회전시키고, 매회 PBS 20㎖로 3회 세척하여 pbs 6㎖ 중에서 재현탁시킨다.
[실시예 2]
모노클로날 항체를 실시예 1의 말레이미도 그룹을 갖는 자성 입자에 결합시키는 일반적 공정
*) 주: 사용된 모든 모노클로날 항체는 0.1mol/ℓ나트륨 시트레이트 완충제(pH 6.6) 및 50g/ℓ 수크로즈의 용액 중에서 1mg/㎖의 농도로 동결건조시킨다.
동결건조된 모노클로날 항체 1mg을 물 0.5㎖ 중에 용해시키고,디티오트레이톨 2mg을 가하고, 그 혼합물을 실온에서 30분간 배양한다. 환원된 항체를 용출 용량 4㎖롤 pH 7.2의 등장성 염수 중에서 세파덱스 G25 상에서 겔여과시켜 분리하고, 실시예 1에서와 같이 제조된 자성 입자의 현탁액에 가한다. 혼합물(10㎖)을 실온에서 45분동안 진탕시키면서 배양한다. 이어서 입자를 3500 x g에서 회전시키고, 매회 PBS 20㎖로 3회 세척하고, PBS pH 7.2 10㎖ 중에서 현탁시켜, 4℃에서 저장한다.
필요에 따라, 0.2% 트윈 20을 현탁액에 가한다.
실시예 2에서와 같이 결합된 모노클로날 항체를 표 1에 요약하였다.
표 1: 실시예 2에서 제조된 자성비드
약자의 설명은 표 2를 참조한다.
[실시예 3]
BMA 041 자성비드의 T세포와의 양성 반응
실시예 2에서와 같이 제조된 PBS중의 BMA 042 자성 비드의 현탁액 40㎕를 T세포 현탁액 (클론 5/87-7-7A3; CD4+, CD8-, CD2+, CD3+, T-세포 수용체-양성; RPMI 1640중의 1×104세포/㎕)120㎕와 함께 실온에서 10시간 동안 진탕시키며 배양한후, 지체없이 계수 챔버에서 현미경으로 검사하여 촬영한다. 세포는 자성 입자와의 로제트 또는 응집체를 형성한다.
[실시예 4]
BMA 041 자성비드의 B세포와의 음성 반응
실시예 2에서와 같이 제조된 PBS중의 BMA 041 자성비드의 현탁액40㎕를 실시예 3에서와 같이 BTPVH 현탁액(B세포주 GR, RPMI 1640중의 1×10+4세포/㎕) 120㎕와 함께 배양한 후 현미경으로 검사하여 촬영한다. 로제트 또는 응집체의 형성은 관찰되지 않는다.
[실시예 5]
BMA 081 자성비드의 T세포와의 양성 반응
실시예 2에서와 같이 제조된 BMA 081 자성비드의 현탁액40㎕를 실시예 3에 서와 같이 T세포(클론 5/87-4-B6; CD8+, CD4-, CD2+, CD3+, T-세포 수용체-양성)와 함께 배양한 후 현미경으로 검사하여 촬영한다. 음성 대조군은 실시예 4와 유산한 BTPVH(세포주 GR)이다. T-세포 수용체-양성 세포는 자성 입자와의 로제트 또는 응집체를 형성한다. 음성 대조군에서는 로제트 또는 응집체의 형성은 관찰되지 않는다.
[실시예 6]
BMA 031 자성비드와 T세포와의 양성 반응
실시예 2에서와 같이 제조된 BMA 031 자성비드의 현탁액 40㎕을 실싱예 3과 유사하게 T세포(클론 5/87-7-7A3; CD4+, CD8-, CD2+, CD3+, T-세포 수용체-양성)와 함께 배양한 다음, 현미경으로 검사하여 촬영한다. 음성 대조군은 실시예 4와 유사한 B세포(B세포주 GR)이다. 항원-양성 세포는 자성 입자와의 로제트 또는 응집체를 다시 형성하였으며, 항원-음성 세포는 관련되지 않았다.
[실시예 7]
단핵 세포로부터 세포 집단의 제거
단핵 세포(MNC)를 문헌[참조: Boyum, Scand. J. Immunol. (1976), Suppl. 5, 9-15]에 공지된 방법으로 피콜(Ficoll) 구배상에서 신선하게 제공된 살마 혈액으로부터 분리한다.
제거용으로, 플라스틱 튜브(팔콘: Faclcon 제 2051호)중의 1% BSA (w/v, Seromed)을 함유한 PBS 2㎖ 중의 3×107MNC를 PBS중의 2mg/㎖ 자성 비드의 현탁액 1㎖와 혼합시키고 연속적으로 진탕시키면서, 실온에서 15분간 배양한다. 그 다음, 자성비드 및 이에 결합된 세포를 영구 자석을 사용하여 제거한다. 현탁액중에 잔존하는 세포를 400 x g으로 펠렛시키고 적합한 배지, 예를 들면 PBS 또는 RPMI 1640중에서 재현탁시킨다. 제거 효율을 세포형광사진(Ortho)을 사용한 간접적 면역 형광법으로 측정한다.
이와 같은 목적을 위하여, 특정한 세포 집단 제거 전 및 제거 후에, 1×106) 세포를 공지된 방법으로 1 내지 10㎍/㎖의 제1 항체 (각각의 경우에 있어서 적합한 특이성의 모노클로날 항체)로 표지시킨 다음, 10 내지 50㎍/㎖의 제2 항체(래비트항-마우스 면역글로불린, F(ab)2단편, FITC-표지됨, 베링베르케사 제품)로 표지시키고 세포형광사진으로 평가하여, 제거 효율을 측정하면 각각의 경우에 있어서 95%이상이 된다.
실시예 7에서와 같이 제거된 세포를 표 2에 나타내었다.
BMA 041(항-CD4, 베링베르케 아크티엔게젤샤프트사 제품) 자성 비드 및 BMA 081 (항-CD8, 베링베르케 아크티엔게젤샤프트사 제품) 자성 비드로의 제거시 수득된 결과를 제1도의 예를 통하여 도시하였다. 이로써 각각의 경우에 있어서 결합되지 않은 세포 집단을 BMA 081로 표지시켜 제거 효율을 측정할 수 있다. FITC-표지된 제2 항체와 함께 배양시킨 후 (상기 참조) 각각의 경우에 있어서 형광강도를 선형 증폭을 갖는 세포 형광 사진으로 평가한다.
표 2: 실시예 2에서와 같이 제조된 자성비드에 의한 세포의 제거약어 설명
CD:분화 집락
TCR:T-세포 수용체
β-2-M:β₂-마이크로글로불린
HLA-DR: 사람 백혈구 항원, 아종 DR
TSH:티로이드-자극 호르몬
CALLA:일반 급성 림프아구 백혈병 항원
SCLC:작은 세포 페암
IgE:면역 그로불린 E
RAM:래비트 안티-마우스
[실시예 8]
결합되지 않은 자성 입자(bIOmAG m4100, SebakR)와 함께 배양시킨 후 배양물중의 T세포 증식의 탐지
단핵 세포를 실시예 7과 유사하게 사람 혈액으로부터 분리시키고 결합되지 않은 자성 입자(BioMag M4100, SevakR)의 현탁액과 함께 실시예 7과 유사하게 배양한다. 그 다음, 자성 입자를 영구 자석을 사용하여 제거한다. 잔여 MNC을 37℃하 CO₂배양기 중에서 64시간동안 포크위드 유사분열 물질(PWM, Gibco; 1:3000 최종 희석) 또는 10㎍/㎖ 실물현구응집소(PHA, Wellcome)의 존재하에서 각각의 경우혈청-유리 배양 배지(Iscore, Behringqus형)중의 웰당 1×105MNC의 농도로 96-웰 플랫-기저 역가 플레이트중에서 배양항다. 48시간 동안 배양한 후14C-티미딘(Amersham)의 2.7×103Bq를 각각의 배양물에 가한다. 추가로 14시간 동안 배양한 후, 세포를 세포 수거기(Innotec)를 사용하여 유리 섬유 여과기 디스크상에서 흡입시켜 여과한단. 섬광 유체를 첨가한후 여과기사의 방사능을 β-계수기 (Packard)로 측정한다.
제2도는 이와 같은 유형의 실험에 대한 평가를 나타내며, MNC를 PHA 또는 P주으로 자극한 것이 결합되지 않은 자성 입자(BioMag M4100 SebakR)로 제거함으로써 전혀 손상된지 않음을 입증해준다.
[실시예 9]
결합되지 않은 자성 입자(BioMag M4100, SebakR)의 존재하에 배양물중의 T세포 증식의 탐지
실시예 8과 유사하게 다양한 양의 결합되지 않은 자성 입자(BioMag M4100, SebakR)를 MNCDP 가한 다음, 96-웰 플레이트에 분배시키고, PHA(10㎍/㎖), BMA 030(베링베르케사 제품, T림프구에 대한 유사분열 물질) (0.01㎍/㎖), 또는 스타필로코커스 아우레우스 캡시드(SAC, 베링베르케사 제품, B림프구에 대한 유사분열물질, 최종 희석 1:3000)와 함께 배양한다.
2 내지 20㎍/㎖ 농도의 자성입자 (BioMag M4100, SebakR)가 B 및 T세포의 증식에 대해 불리한 효과를 나타내지 않음은 제3도로부터 명백히 알 수 있다.

Claims (1)

  1. 일반식(I)의 단백질 결합체.
    (I)
    상기식에서,
    M은 아미노 그룹을 갖는 분산성 자기 반응성 물질 또는 입자이고,
    P는 1개 이상의 머캅토 그룹을 갖는 단백질이며,
    X는 -(CH2)n-이고, 여기서 n은 1 내지 8이다.
    2. 제1항에 있어서, 단백질 P의 머캅토 그룹이 천연 상태로 존재하거나, 디설파이드 결합의 환원에 의해 생성되거나, 화학 반응에 의해 도입되는 자성 단백질 겹합체.
    3. 제1항에 있어서, P가 면역글로불린 또는 면역글로불린 잔기인 자성 단백질 결합체.
    4. 제3항에 있어서, Pr IgG 또는 IgM 부류의 모노클로날 항체를 나타내는 자성 단백질 결합체.
    5. 제3항에 있어서, P가 염 수용액 또는 체액중에 용해된 형태로 존재하는 항운에 대한 모노클로날 하어체를 나타내는 자성 단백질 결합체.
    6. 제3항에 있어서, P가 세포상에서 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체를 나타내는 자성 단백질 결합체.
    7. 제3항에 있어서, P가 세균, 마이코플라스마 또는 원생동물, 또는 비루스상에서 발현되는 항원에 대한 모노클로날 항체를 나타내는 자성 단백질 결합체.
    8. 제1항에 있어서, P가 항원을 나타내는 자성 단백질 결합체.
    9. 제3항에 있어서, M이 금속 산화물 핵 및 아미노 그룹을 갖는 외피를 포함하는 분산성 입자이며, 여기서 금속 산화물 핵이 상자성(paramagnetic) 물질의 그룹을 포함할 수 있는 자성 단백질 결합체.
    10. 제9항에 있어서, 입자의 직경이 약 0.1μ 내지 약 100μ인 자성 단백질 결합체.
    11. 제3항에 있어서, X가 화학적 또는 효소적 방버으로 절단될 수 있는 자성 단백질 결합체.
    12. 아미노 그룹을 갖는 자성 입자 M을, 아미드 결합을 형성하면서 아미노 그룹과 반응하는 일반식(II)의 말레이미도 스페이서와 반응시켜 일반식(III)의 화합물을 생성시키고 이를 최종적으로 머캅토 그룹을 갖는 단백지례와 반응시켜 일반식(I)의 화합물을 수득함을 특징으로 하여, 일반식(I)의 자성 단백질 결합체를 제조하는 방법.
    (I)
    (II)
    (III)
    상기식에서,
    M, X 및 P는 제1항에서 정의한 바와 같고,
    Z는 반응성 이탈 그룹이다.
    13. 염 수용액 또는 체액을 일반식(i)의 자성 단백질 결합체와 함께 배양하고, 제거될 성분의 특이적 흡착 후 자기적 방법으로 자성 단백질 결합체를 제거함을 특징으로 하여, 염 수용액 또는 체액으로부터 용해된 항원, 항체, 수용체, 기질, 조인자 또는 탄수화물 결정기를 제거하는 방법.
    (I)
    상기식에서,
    M, X 및 P는 제1항에서 정의한 바와 같다.
    14. (정정) 염 수용액 또는 체액의 현탁액을 일반식(i)의 자성 단백질 결합체와 함께 배양하고, 제거될 세포의 특이적 흡착 후 자기적 방법으로 자성 단백질 결합체를 제거함을 특징으로 하여, 염 수용액 또는 체액으로부터 세포를 제거하는 방법.
    (I)
    상기식에서,
    M, X 및 P는 제1항에서 정의한 바와 같다.
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