JPH02152997A - 磁気タンパク質コンジュゲート及びその製造方法 - Google Patents

磁気タンパク質コンジュゲート及びその製造方法

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JPH02152997A JP1055265A JP5526589A JPH02152997A JP H02152997 A JPH02152997 A JP H02152997A JP 1055265 A JP1055265 A JP 1055265A JP 5526589 A JP5526589 A JP 5526589A JP H02152997 A JPH02152997 A JP H02152997A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、下記の定義を有する式Ｉ の磁気タン１５り質フンシュゲート（ｍａｇｎｅｔｉ。
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｏｎｊｕｇａｔｅ　）に関する。
Ｍは、アミノ基を担持する分散性の磁気反応物質（ｍａ
ｇｎｓｔｉａａｌｌｙ　ｒｓａｏｔｉｎｇｍａｔｅｒｉ
ａｌ　）または粒子（ｐａｒｔｉａｌ・）であり、Ｐは
１またはそれ以上のメルカプト基を担持するタンパク質
であり、Ｘは化学的方法により、２つのリガンドに結合
する有機化学構造を示す。
Ｘは好ましくは、その場合における適当な方法で場合に
より置換し得る脂肪族、芳香族、脂環式、脂環式−脂肪
族または芳香族−脂肪族スは−サーであり、好ましくは
＝（ＣＨ２）！１（式中ｎ＝１〜８で、好ましくはｎ−
１〜５で、特に好ましくはｎ　＝　２または５である）
であるか、または、 Ｘは好ましくは、フェニレンまたは置換されたフェニレ
ンであり、２つのリガンドがオルト、メタまたはノぞう
位に存在することができ、フェニレン環中に場合により
存在しつる置換基がメチル、とドロキシ、メトキシ、ア
セトキシ、ニトロもしくはシアノ基または塩基もしくは
臭素原子であることができるか、または Ｘは好ましくは、フェニレン−（ＣＨ２）。−（式中ｎ
＝ｘ　１〜５で、好ましくはｎ　＝　３である）であす
、ソのフェニレン晟がスクシンイミド基に結合するか、
または Ｘは好ましくは％　＜ａＲ−（式中Ｒはアミノ酸側鎖、
好ましくは、アミノ酸アラニン、セリン、スレオニンま
たはメチオニ′ンの側鎖、特に好ましくはアラニンの側
鎖を示す）であるか、または Ｘは好ましくは、メチレンシクロヘキシルでアリ、メチ
レン基がスクシンイ建すルＭＫ結合し、シクロヘキシル
ＩＫ結合したカルボニル轟ＶＣｒｊ４シては、好ましく
はシクロヘキシル環の４位に結合する。
Ｘの性質は、化学的または酵素による方法によって分解
されることができるようなものであってもよい。
Ｐは、メルカプト基が自然状態で存在するか、ジスルフ
ィド結合の還元で生成するか、または化学的方法によっ
て導入されるタンパク質でもよい。
Ｐは特に、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン残基で
あり、好ましくはモノクローナル抗体、Ｆａｂ　、　Ｆ
ａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、抗原また
は酵素、ホルモン、レクチンもしくは生長因子の残基で
ある。
Ｐは好ましくは、工ｇＧまたはＩｇＭクラスのモノクロ
ーナル抗体であり、特に、水性塩溶成または体液中に溶
解した状態で存在する抗原に対抗するモノクローナル抗
体、または細胞上に発現された抗原に対抗するモノクロ
ーナル抗体であり、抗原を発現させる細胞は特に、骨髄
またはリンパ系の細胞、末梢面層の細胞、特にＢ　リン
パ球、７９７２球もしくはそれらの前駆細胞、または膿
瘍細胞、特に骨髄の膿瘍細胞でもよい。
このような細胞はまた、赤血球、細菌、マイコプラズマ
または原生動物であってよい。しかし、ウィルスもまた
、本発明の範囲において細胞であると理解される。
Ｍは、好ましくは、金属酸化物のコアとアミノ酸を担持
する包被を有する分散性の粒子であり、前記金属コアは
一群の常磁性物質を含有することができ、前記粒子の径
は、約０．１〜約１００μであるが、好ましくは約０．
１〜約１．５μである。
本発明はまた、一般式Ｉの磁気タンノック質フンシュゲ
ートの製造方法、水性塩溶層または体液から細胞、可溶
性抗原、受容体、基質、補因子または炭水化物決定基（
ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｃｌｅ−ｔｅｒｍｉｎａｎ
ｔｓ　）を特異的に除去するための式Ｉのフンジュケ゛
−トの使用、診断方法の枠内で、または診断の補助材と
しての使用、及び特に骨髄除去またはＨＬＡ類型化に対
する使用ＫＭする。
骨髄移着は、しばしば治療上の選択的方法としてのみ、
特に、ある種の白血病及び汎骨髄ろうの治療において行
なわれる。
白血病及びある種のリンパ球腫瘍形成において、従来、
患者は、極めて高線量の全身の放射線照射及び／または
攻撃的化学療法を受けてきた。この種の治療により、骨
髄の通常の幹細胞及び全血液細胞の前駆体が完全に破壊
される。
従って、適当な供与者から得た骨髄を患者に再び注入し
、それから得られる細胞が受容者の髄腔に入植し、それ
により造血系及び免疫系が再び発生する。この方法は、
同種骨髄移植と称される。
同種骨髄移植の高い危険性は、特に１供与者からのＴＩ
Ｊンパ球が骨髄内に再注入された時患者内に持ち越され
、受容者の細胞を異物であると認識して、それを攻１１
破壊してしまうことに由来する。しばしば患者の生命を
脅かすこの骨髄の不寛容性は、対宿主＃植片反応または
対宿主移植疾患（ＧＶＨＤ）と呼ばれる。この対宿主移
植疾患の危険性は、一方では、可能であれば、特に適当
な供与者、通常は、親族、かうの厳格に類型した骨髄を
患者へ再注入することによって減じることができる。し
かし一方では、患者に再注入する前に、供与者の例えば
骨髄の７９７２球によって示されるような、望ましくな
い細胞集団を選択的に除去することＫよっても減じられ
ることができる。
供与Ｔ細胞のこの除去は、例えば、補体の存在下での、
除去されるべき細胞の選択的ｆｌ！ｊ菌、いわゆる免疫
ａ素の作用によるで細胞の選択的死滅、または例えばｆ
鑓の磁気的な細胞除去によるようなその他の方法によっ
て行なわれる。
この種の骨髄細胞除去は、骨髄を、例えば骨髄のＴ細胞
に特異的に対抗しそれ故ＫＴ細胞のみに結合するモノク
ローナルマウス抗体とともにインキュベートする方法の
ように比較的簡単な方法で実施することができる。モノ
クローナルマウス抗体が結合するこの種のＴ細胞は、例
えば磁気粒子に結合するラビット抗−マウス免疫グロブ
リンとともにそれをインキュベートすることによる第二
の過程により除去することができ、その方法によって磁
気粒子は、７９７２球に特異的に結合し、それらは磁石
の使用により骨髄から除去されることができる（　Ｖａ
ｒｔｄａｌらＫよる「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
Ｊ　（１９８７）、４３．３６６〜３７１及びその中に
引用されている文献参照）。
骨髄から他の細胞集団、例えば腫瘍細胞を類似の方法で
除去することも可能であり、それはいわゆる自己移植ｆ
髄移植にとって重要である（　Ｋｖａｌｈｅｉｍらの「
Ｃａｎｏ＠ｒ　Ｒｅ５ｅａｒｏｈＪ　（１９８７）、４
７．８４６〜８５１及びその中に引用の文献参照）。
さらＩｃ１Ｋｖａｌｈ・１ｍらによって上記文献に記載
されているよう釦、腫瘍細胞を認識するモノクローナル
抗体を磁気粒子上に直接結合させ上記の第二抗体（ラビ
ット抗−マウス）を不要とすることも出来る。
磁気粒子に結合するモノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体の使用による骨髄除去のための上記方法は、まだ
非常に新しく、さらなる開発及び試験を必要とする。こ
の目的のために適した非常に多種類の磁気粒子が最近市
販されており、その製造方法は、特許文献に複数回記載
されている（例えばＣｈａｎｇｎｏｎらＫよるＥＰＯ，
１２５，９９５Ａ２（１９８３年５月１２ＥＩ７）Ｕｓ
　４９５，９９１を優先権主張の基礎とするもの、Ａｄ
ｖａｎｏ＠ｄＭａｇｎｅｔｉａｓ　、または１９８３年
１１月１０日のＷＯ８，３０４９２０ｓ　８ＩＮＴＦｉ
Ｆ　参ｍ　）　ｏ　？：、、ＦＬ　ラ’）粒子は、常磁
性物質が含まれてい【もよい金属酸化物のコアからなり
、しかもそのコアが反応基、例えばアミノフェニル、ア
ミノ、カルボキシル、ヒドロキシルまたはスルフヒドリ
ル基を担持しうる包被によって囲まれており、タンパク
質の結合に用いられることができることが公知である（
　Ｃｈａｎｇｎｏｎ　ｇ）Ｋよるｚｐｏ、１２５：９９
５Ａ２）。
例えばカルボキシル基を担持する粒子は、誘導されて縮
合剤の存在下でタンパク質のアミノ基と反応することが
公知である（　ＣｈａｇｎｏｎらによるＥＰｏ、１２５
，９９５Ａ２）。
グルタルアルデヒドを使用するアミ７基を担持する磁気
粒子へのタンパク質の結合、そしてその結合が各場合に
おいてアミ７基を経て起こることも公知である（　Ｃｈ
ａｎｇｎｏｎらＫよるＢＰ０ｊ２５，９９５Ａ２）。
さらに、ヒドロキシル基を担持する粒子がｐ−トルエン
スルホエルクロライドとの反応ニヨって活性化されるこ
とができ、このようにして活性化された粒子が誘導され
て、タンパク質のアミノ基と反応することも公知である
（　ＫｖａｌｈｅｉｍらＫよる「Ｃ’ａｎｏｅｒ　Ｒｅ
５ｅａｒｏｈＪ　（１９８７）、４７．８４６〜８５１
）。
これら全ての結合方法において、どの場合でも、タンパ
ク質がその遊離アミノ基を介して粒子に結合することは
共通している。しかし、アミノ基を介するこのような結
合は、この場合に、たまに抗体の特異性と反応性が損な
われることがあるので、モノクローナル抗体にとっては
相当Ｖこ不利である。それは、抗体中のアミノ基が全分
子上に多少無秩序に分散しており、従って、Ｆａｂフラ
グメントの抗原結合部位中にも位置し、それがこのよう
なアミノ基を介する結合が起こる特異性の損失をもたら
すからである。
さらに、粒子がスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー
でα波されている場合、タンパク質はポリスチレンに非
特異的に結合することが知られているので、抗体は化学
的結合のない場合でさえも純粋に吸着によっても磁気粒
子上に渠め得ることが知られている。
しかし、この方法によっても、抗体の特異性と反応性の
損傷は、必ず起こりうる。この方法のもう一つの重大な
欠点は、吸着により結合した抗体が骨髄除去中に再び脱
看して、除去された骨髄の再注入時に患者へ投与され、
それが特にモノクローナル抗体による治療を先に試みら
れていた場合に重大な副作用の原因となる可能性がある
ということである。しかし、この間層点は既知であり、
抗体の磁気粒子への共有結合によってそれを解決するこ
とが目標とされているＯ またポリスチレン包被を有する磁気粒子は、ｌＩ／８嘱
し、さらに非特異的に細胞へ付着（ａｔｔａａｈ）する
という重大な欠点を有している。
この従来技術に基づいて、本発明の目的は、モノクロー
ナル抗体をａ）共有結合的に、そしてｂ）そのアミノ酸
を介してではなく、磁気粒子へ結合させる方法を提供す
ることＫある。従って、言い換えると、本発明の目的は
、抗体の抗原結合部位が変化せず、または抗体の結合が
抗原結合部位を離れて起こるような結合方法を見出すこ
とにある。
本発明の目的は、前記一般式Ｉの磁気タンパク質フンシ
ュゲートの製造により達成される。
本発明者らによって、反応性基として遊離のアミ７基を
担持する磁気粒子が、簡単な方法によって、反応性基と
してマレイミド基を担持する磁気粒子に転化され得るこ
とが見出されたのである。この種の粒子は新規なもので
ある。
さらに、マレイミド基を担持する磁気粒子は、困迩なく
、メルカプト基を有するタンパク質とコンジュゲートす
ることが出来、タン７ぞり質中のメルカプト基は自然状
態ですでに存在しているか、化学的方法により導入され
るか、または存在するジスルフィド結合の還元によって
生成させることができることが見出された。
％に１抗体の瑣間すスルフィド結合が選択的還元により
遊離の８ＨＩ＆へ転化され、これが磁性粒子のマレイミ
ド基と反応し安定なチオエーテル結合を形成できるよう
誘導されるならば、マレイミド基を担持する磁気粒子は
、困難なく、モノクローナル抗体とコンジュゲートし得
ることを見出した。この磁気粒子へのモノクローナル抗
体の結合方法も、同様に新規である。
驚くべきことに、とンジ部を介する抗体の結合は、抗原
結合部位を変化または損傷させないので、チオエーテル
結合を介して磁性粒子に結合した抗体の特異性及び反応
性は、完全に保持されることが見出された。抗体が、上
記のように、純粋に吸着によりまたはそのアミ７基の反
応のどちらかにより磁気粒子に集まり、その結果コンジ
ュゲートされた抗体の特異性と反応性を損うことがある
という前記の従来の結合方法と比較した、本発明の特別
の利点がここＫある。
さらに１吸着による結合と比較して、本発明は、抗体が
磁気粒子へ化学的に結合し、そしてその結果、本発明の
磁気抗体コンジュゲートが例えば骨頭除去に用いられる
場合に、粒子から脱着しないという利点を有している。
さらに、本発明の磁気抗体コンジュゲートは、その高い
特異性のために、例えばｆ鑓除去に対して、ｆｉｌＶｃ
有利であることが証明された。
さらに、本発明の磁気抗体コンジュゲートは、また診断
方法の観点において、または特に、例えばＨＬＡ類型化
に対する診断補助として特異性が高いので有利であるこ
とが見出された。
本発明による磁気抗体フンシュゲートの製造については
、以下、骨髄の細胞に対抗する種々のモノクローナル抗
体に対する実施例によって説明するが、特記された実施
例は本発明を限定するものではない。さらに、骨髄細胞
の除去及びＨＬＡ類型化に関する、実施例によって製造
された磁気抗体コンジュゲートの用途は、同様に実施例
によって説明するが、その用途を記載された実施例に限
定するものではない。
一般式Ｉの磁気タン／Ｊり質コンジュゲートの製造方法 アミノ基を担持する磁気粒子Ｍを、アミ７基と反応しか
つ下記式中の２がアミノ結合の生成を伴う適当な反応性
脱離轟である一般式■のマレイミドスペーサーとａ当な
溶媒中で、反応させ、一般式■ の化合物を得、それを最後に１タンパク質を変成させな
いような適当な水性塩含有溶媒、例えば生理食塩水また
はリン酸１１１食塩水中で、メルカプト基を担持するタ
ンパク質Ｐと反応させて式Ｉの化合物を得る。
磁気粒子へ式■の化合物が結合するために適した溶媒の
性質は、用いられる溶媒が、各場合において結合のため
に用いられる磁気粒子の物理・的及び磁気的特性、ＩＴ
ＩＶＣ寸法、分散性及び表面特性を損傷しないような溶
媒でなければならなイ。例えばＥＰｏ、１２５，９９５
Ａ２またはＷＯ８，３０へ９２０号に記載された上記磁
気粒子に対して適当であると考えられる溶媒の例は、水
とジメチルホルムアミドの混合物であり、式■中のＩｆ
換基２は、例えば及び好ましくは、スクシンイミジルオ
キシである。しがし、他に考えられる適当な溶媒の例は
、無水ア七トンであり、その場合において式■中の！ｆ
換基２は、スクシンイミジルオキシの他に、ハロゲン、
例えば塩素もしくは臭素または擾ハロゲン化物、例えば
シアニドまたはアシル基例えばア七チルもしくはｐ−ニ
トロベンゾイル、またはその他の反応性脱ｉ１１基例え
ばトシル基であってもよく、Ｚがスシンイミジルオキシ
でない全ての場合において、反応は好ましくは適当な塩
基、例えば炭酸ナトリウムの存在下で行なわれる。
細胞除去方法 塩を含有した好ましくは生理水性溶液または体１夜中の
細胞混合物を除去するために懸濁１便を式■の化合物と
ともに、例えば０〜４０℃の間の過当な温度において、
好ましくは攪拌しながら、同様に好ましくは滅菌条件下
で、適当な時間インキュベートし、次いで磁気粒子を適
当な磁石を用いて除去する。
適当な温度の例は、０℃、室温または３７℃であるが、
室温が好ましい。インキュベートの継続時間は、各場合
において、用いられるインキュベート温度及び抗体の結
合反応性によって決まり、例えば数分から例えば２時間
迄であることができる。インキュベートは、例えば１０
〜２０分の時間で、例えば室温において行なうことが好
ましい。
可溶性の生物有機粒子の単離方法 この方法は、実質的には、細胞除去方法に従って行なう
。
実施例 以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが
、これらは本発明を限定するものではない。
モノクローナル抗体と上記方法によって反応するように
誘導された磁気粒子は、以下「磁気ビード」と呼び、各
場合においてそれらの特性は、特定の抗体名を接頭辞と
して付けることによって示す。
実施例　１ γ−マレイミドプチレートスは−サーを用いるｇＰＯ，
，１２５，９９５Ａ２による磁気粒子のコンジュゲート 商業的に人手可能な磁気粒子（ＢｉｏＭａｇＭ４　ｊ　
００．５ｅｂａｋ　　）の懸濁液［Ｌ５ｓｓｇをリン酸
塩で磯衝された食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆ
ｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）（ＦＢ！３）ｐＨ７，２によ
り３回洗浄し、ＰＢＢ６−中に再び懸濁した。この懸濁
液に１乾燥ジメチルホルムアミド４−中のＮ−（ｒ−マ
レイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢ８　
、　Ｃａ１ｂｉｏｃｈ＠ｍ）２０ｑｆ）製造直後のｍ液
を加え、次いでこの混合物を室温で１時間１蕩した。次
いで粒子を５０００Ｘ９で遠心で落としく　５ｐｕｎ　
ｄｏｗｎ　）各回２０ｍのＰＢＢで３Ｌｇｌ洗浄し、次
いでＰＢＢ　６−中に再び懸濁した。
実施例　２ 実施例１ｉで得られたマレイミド基を担持する磁気粒子
へモノクローナル抗ｆ）を結合する一般的方法 ４ｆ−：用いられる全てのモノクローナル抗体ハ、０．
１モル／ｌのクエン酸ナトリウム４１衝ｄｐＨ６，６と
５０ｇ／ｌスクロースとの溶液中ＫＩＭｇ／−濃度で凍
結乾燥した。
凍結乾燥したモノクローナル抗体１岬を水０．５−中に
溶解し、ジチオスレイトール２ＩＩＮＦヲ加工、次いで
この混合物を室温で６０分間インキエベートした。還元
された抗体を、等浸透圧食塩水ｐ！（７，２を用いて溶
離容４１４−でセファデックスＧ２５上のゲル濾過によ
り単離し、次いで実施例１において製造された磁気粒子
の懸濁液へ加えた。この混合物（１０１ａｔ）を室温で
４５分間振１しながらインキ二に一部した。その後粒子
を５５００１で遠心で落とし、ＰＢ８各回２０ｍｇで５
度洗浄し、ＰＢＳ　（ｐＨ７，２）　１０−中に再び懸
濁し、次いで４℃で保存した。
好適には、α２−ナトリウムアジドまたは０，２饅ナト
リウムアジド＋０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
＋α２１帽ｅｅｎ　２０をこの懸濁液を加える。
実施例２のようＫして結合されたモノクローナル抗体を
表１にまとめた。
異　１ ＢＭＡ　　０１１０ ＢＭＡＯｌｌｌ ＢＭＡ　　０３０ ＢＭＡ　　０３３ ＢＭＡ　０３１ ＢＭＡ　０４１ ＢＭＡＯ１１７ ＢＭＡ　０８１ ＩＬ−ＡＩ ＳＶ３９３ ＢＭＡ　　０２２ １ｇ０２ｔ） 　ｇＧＩ ｇＧ２ａ 　ｇＧ５ ｇＧ２ｂ ｇＭ ｇＧ２ａ 工ｇＧ２ａ ｇＭ 　ｇＧＩ ｇＧ２ａ ＣＤ２ ＣＤ２ Ｃ’Ｄ３ ＣＤ３ ＣＲ ＣＤ４ ＣＤ７ ＣＤ８ ＣＤ１０ β−２−Ｍ ＬＡ−ＤＲ モノクローナル ＨＭＡ０２１０ ８４−２４／９１−８ Ｂ１０ ＢＭＡ　０１６０ ＢＭＡＯ１１２ ７０４／１５２１５ ５７５／９５１／２ Ａ−ｈ−ＴＥ３Ｈ５４０４ ３８３／４４ ８４−９／６ ２０９／２ クラス及び ｇＭ 　ｇＧＩ ＩｇＧ２ｔ） ｇＭ Ｉ　＆ＧＩ ｇＧ３ ｇＧＩ ｇＧＩ ｇＧ１ １ｇＧ２ｔ） ｇＧ２ａ ｇＧ２ａ 単核白血球 ５Ｈ ＣＤ１０／ＣＡＬＬＡ グリコホリンＡ ＣＤ７ 神経芽細胞腫 ＣＬＣ ＢＨ ｇＥ ｇｇ ｇＥｉ ＣＤ２ 略語の説明については嚢２譲照 実施例　３ ＢＭＡ　Ｑ　４　ｊ磁気ビードとＴ細胞との正の反応実
施例２と同様にして得られたＰＢＥＩ中のＢＭＡ０４１
磁気ビードの懸濁液４０μｔを、室温で１０分間振ａｌ
Ｌながら、Ｔａｍ！１ｉｔＫ１２０ｐＬ（クローン５／
８７−７−Ａ３；ＣＤ４　　　ＣＤ８”’　　ＣＤ２＋
ＣＤ３”　　Ｔ−細胞受容体一正；ｌＸ１０４．ｌｔ［
ｌ胞／μｔＲＰＭＩ　１６４０中）とともにインキュベ
ートし、次（・で４滞なく計数室内のＩＡは誂で検査し
次いでｍ影した。細胞は磁気粒子とともにロゼツトまた
は集塊を形成していた。
実施例　４ ＢＭＡ　０４１磁気ビードとＢ」胞との負の反応実施例
２のようにして得られたＰＢＳ中のＢＭＡ０４１磁気ビ
ードのＳ濁液４０μＬを、実施例３のようにして得られ
たＢ、ｌ胞の＠濁液１２０μｔ（Ｂ細胞系ＧＲ，ｌＸ１
０’４１１胞／ｐＬ　ＲＰＭＩ　ｊ　６４０中）ととも
にインキュベートシ、次いで顧は鏡で検査し、撮影した
。ロゼツト及び集塊は認められなかった。
実施例　５ ＢＭＡ　Ｏ８１磁気ビードとＴＩａ胞の正の反応実施例
２のようにして製造されたＢＭＡ　Ｏ８１磁気ビードの
懸濁？ｇ、４０μｔを、τ細胞（クローン５　／　８７
−４−　Ｂ　６　；　ＣＤ８　　ＣＤ４−１Ｃ’Ｄ２　
　ＣＤ３＋Ｔ−細胞受容体一正）とともに１実施例６の
ようにしてインキ二に一部し、その後顕微鏡で検査し、
撮影した。負の対照を実施例４と同様のＢｉ胞とした（
Ｂ細胞系（）Ｒ）。このＴ−細胞受容体一正細胞は、磁
気粒子とともにロゼツタまたは集塊を形成していた。負
の対照はロゼツタも集塊も形成が認められなかった。
実施例　６ ＢＭＡ　Ｏ３１磁気ビードとＴ細胞の正の反応実施例２
のようにして得られたＢＭＡ　０５１磁気ビードの懸濁
液４０　ｐｔを、’ｒ、１ｌｌｌ胞（クローン５７８７
−４−　Ｂ　６　；　ＣＤ８”、ＣＤ４−　　ＣＤ２”
　　ＣＤ！ｌ”　、Ｔ　−細胞受容体−正）とともに、
実施例３と同様にしてインキュベートし、次いで顕ｆｌ
［で検査し、次いで撮影した。負の対照を実施例４と同
様のＢ細胞とした（Ｂ細胞系（）Ｒ）。抗原−正細胞は
再び磁気粒子とともにロゼツトまたは集塊を形成してお
り；抗原−負細胞は、結合していなかった。
実施例　７ 単核細胞からの細胞集団の除去 単核細胞（ＭＮＣ）を、それ自体公知の方法（Ｂｏｙｕ
ｍ、　８ｏａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｚｕｎｏｌ、　（１９
７６）、５ｕｐｐｌ。
５．９１５）で、Ｆｉｏｏｌｌグラジェントにより、供
与されたヒトの新鮮血液から単離した。
除去のために、プラスチックｆ　（Ｆａｌｏｏｎ、　Ａ
２０５１　）中のｊ　％　ＢＳＡ　（ｗ／ｖ、　Ｓｅｒ
ｏｍ＠ｄ　）を含むＰＢＳ２　ｍｌ中の３Ｘｊ０７ＭＭ
Ｃ’を、ＰＢＥＩ中の２　ｑ／ｍｌ磁気ビードの懸濁液
１−とともに混合し、室温で振−し続けながら１５分間
インキエベートした。
磁気ビードとそれに結合した細胞をその後永久石を用い
て除去した。懸濁液中に残留する細胞を、、４００ｘり
で深レット化し、適当な溶媒、例えばＰＢＳまたはＲＰ
Ｍ１１６４０中に再び懸濁した。
除去効率を、細胞蛍光間接撮影機（０ｒｔｈｏ　）を用
いる間接免疫蛍光検査法により測定した。
この目的のために、特定の細胞集団の除去の前後に、ｌ
Ｘ１０’の細胞を１〜１０μ９／−の第一抗体（各場合
において適当な特異性のモノクローナル抗体）により、
その後１０〜５０μ９／−の第二抗体（ラビット抗−マ
ウス免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＦＩ
ＴＣ−ｆｉｆｉ、ベーリングベルケ製）Ｋより、それ自
体公知の方法でａｉｌ識し、次いで細胞蛍光間接撮影機
で評価し、除去効率を測定したところ、各場合において
９５チを魂えていた。
実施例７のようにしてｉｉｌされた細胞ｔ−表２に示す
。
ＢＭＡ　Ｏ４１（抗−ｃＤ４、−ｊ−リングイルケ社＃
）磁気ビード及びＢＭＡ　Ｏ８１（抗−ＣＤ８　、ベー
ジング（ルケ社双）による除去により優られた結果を、
第１図中に例として示す。これには、ＢＭＡ０３１（抗
−Ｔ−細胞受容体、（−リングベルケ社製）、ＢＭＡ　
Ｏ４１またはＢＭＡＯ８１による各場合における未結合
の細胞集団を標識することによって測定された除去効率
が含まれる。ＦＩＴＣ−標識第二抗体（前記参照）によ
るインキュベート後、各場合における蛍光強度を線形増
重を用いる細胞蛍光間接撮影機を用いて評価した。
ＢＭＡＯｌｌｌ ＢＭＡ、０３０ ＢＭＡ　　０５３ ＢＭＡ　　０３１ ＢＭＡ　　０４１ ＢＭＡＯ１１７ ＢＭＡ　　０８１ ＩＬ−Ａ１ ８Ｖ　　３９′５ ＢＭＡ　　０２２ ＢＭＡ　　０２１０ ＢＩＯ ＢＭＡＯ１６０ ＢＭＡＯ１１２ 表　　２ ＣＤ２ ＣＤ３ ＣＤ５ ＣＲ ＣＤ４ ＣＤ７ ＣＤ８ ＣＤ１０ Ｂｅｔａ−２−Ｍ ＨＬＡ−ＤＲ 単核白血球 ＣＤ１０／ＣＡＬＬＡ ＣＤ２−Ｔ−細胞 ＣＩ）５”　−Ｔ−細胞 ｃｒ：ｔ５＋−Ｔ−細胞 ｒｃＲ＋−Ｔ−細胞 ＣＤ４＋−Ｔ−細胞 ＣＤ７＋−Ｔ−細胞 ＣＤ８−Ｔ−細胞 ＣＤ１０　−Ｂ−細胞 ＨＬＡ−クラスエ　１ｄ胞 ＨＬＡ−クラス■＋−細胞 クラス単核白血球 ＣＤ１０”−または ＣＡＬＬ＋−細胞 グリコホリンＡ　赤血球 ｃｐ７　　　　　ＣＤ７−１ａ胞 ７０４／１５２１５　　　神経芽細胞腫　　神経芽細胞
腫−細胞２０９／２　　　　　　　ＣＤ２　　　　　Ｃ
Ｄ２”−細胞ＣＤ　　　　二分化のクラスター ＴＣＲ：Ｔ−細胞受容体 Ｂｅｔ＆−２−Ｍ：β２−ミクログロブリンＨＬＡ−Ｄ
Ｒ：ヒト白血球抗原、サブクラスＤＲ’ｒ１３Ｈ：甲状
腺刺激ホルモン ＣＡＬＬＡ　　　：共通急性リンパ芽球性白血病抗原８
ＣＬＣ：小細胞肺ガン ｒｇＥ　　　　：免疫グロブリンＥ ＲＡＭ　　　　ニラビット抗−マウス 実施例　８ 未結合の磁気粒子（ＢＬｏ　Ｍａｇ　Ｍ４１００．５ｓ
ｂａｋ”）とのインキュに一部後における＠養基中のＴ
＠胞の増殖の検出 単核細胞を実施例７と同様にしてヒトの血痕から単離し
、次いで実施例７と同様にして未結合の磁気粒子（Ｂｉ
ｏＭａｇ　Ｍ４１００　、　Ｂｅｂａｋ　）の懸濁液と
ともにインキュベートした。この磁気粒子をその後、永
久磁石を用いて除去した。残りのＭＮＣをｃｏ２インキ
ュベーター中で、３７℃において、６４時間、ポークラ
イードマイトゲン（ＰＷＭ、　Ｇｉｂｏｏ　；１　：　
３０００　ｊｌ終希釈）または１０００ｇ／−植物凝集
素（ＰＨＡ、　Ｗｅｌｌｏｏｍｅ　）の存在下で、無血
清培養基（Ｉａａｏｖｅ、−ニーリングｍｏｄｉｆｉｏ
ａ、−ｔｉｏｎ）申告場合においてｊ　Ｘ　ｊ　Ｏ’　
ＭＮＣ／ウェルの濃度で、９６−ウェル平底タイタープ
レート（Ｎｕｎｏ　）においてインキュベートした。４
８時間の培養時間後ｗ、　　１４ｃｍチミジン（Ａｍｓ
ｒｓｈａｍ）２．７　Ｘ　１０’　Ｂ（１を各培養基へ
加えた。さらに１４詩間の椿養後に、細胞を細胞採集機
（Ｉｎｎｏｔｅａ　）を用いて、ガラス１誠維フイルタ
ーデイスク上テの吸引により濾過した。フィルターの放
射能を、シンチレーション液の添加後にβ計数器（Ｐａ
ｏ−ｋａｒｄ製）で測定した。
第２図はこの種の実験の評価を示すものであり、ＰＨＡ
またはＰＷＭによるＭＮＣの刺激は、未結合ノｔｊｉ気
粒子（ＢｉｏＭａｇ　Ｍ４１００　、５ｅｂａｋＲ）　
Ｋヨル除去によって損なわれないことを明らかにしてい
る。
実施例　９ 未ｔｉｅ＋ａ気粒子（ＢｉｏＭａｇ　Ｍ４１　ＤＯ、Ｓ
＠ｂａｋ勺）存在下における培養基中のＴ細胞増殖の検
出様ｋ　１７）１ノ未結合磁気粒子（ＢｉｏＭａｇ　Ｍ
４１００　。
８ｅｂａｋ　）をＭＭＣに加え、その後それを９６−ウ
ェルプレート中に分散し、実施例８と同様にして、ＰＨ
Ａ　（１０ｐ’！／ｍ）、ＢＭＡ　Ｏ３０（ベーリング
ベルケ製、Ｔリンフ２球のマイトゲン）（α０１１ｔ９
／ｗｄ）またはスタフィロコッカスアウレウスキャブジ
ッド（８ＡＣ，ベーリングベルヶａ、Ｂリンノ５球のマ
イトゲン、最終希釈１：３０００）とともに′４！！し
た。
第３図より、２〜２０７７ｇ／−の濃度において、磁気
粒子（ＢｉｏＭａｇ　Ｍ　４　ｆ　００　、８ｅｂａｋ
Ｒ）　ｌｉ、Ｂ及びＴ細胞の増殖にｄ影響を与えないこ
とが明らかである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＢＭＡ　０３　ｊ、ＢＭＡ　Ｏ４ｊ及びＢＭ
Ａ　０８１磁気ビードにょるＴ細胞の部分集団の除去を
示すグラフである。グラフ中、ＰＢＬは、！＆初の細胞
集団を、ＣＤ４−は、ＢＭＡ　０４１磁気ビードによる
＃＊後の集団を、ＣＤ８’″は、ＢＭＡ　０８１磁気ビ
ードによる除去後の集団を示す。 第２図は、未結合の磁気粒子（ｌＤｉｏＭａｇ　Ｍ４１
０［ｋＳｅｂａｋ　）によるインキュベート及び植物凝
集素（ＰＨＡ　）またはポークライードマイトゲンｃ　
ＰＷＭ）Ｋよる刺激後の培地中のＴ＃胞の増殖を対照培
地と比較して示すグラフである。 第３図は、植物凝集素（ＰＨＡ　）、抗−ＣＤ３モノク
ロ一ナル抗体ＢＭＡ０５０またはスタフイロフツ力スア
ウレウスキャップシツド（ＳＡＣ）による刺ｄｉの、未
結合磁気粒子（ＢｉｏＭａｇ　Ｍ４１００．５ｅｂａｋ
Ｒ）存在下における培地中のＴ細胞の増殖を対照培地と
比較して示すグラフである。 特許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外 名

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）次の式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ I （式中、Ｍはアミノ酸を担持する分散性の磁気的反応物
    質又は粒子であり、Ｐは１またはそれ以上のメルカプト
    基を担持するタンパク質であり、Ｘは化学的方法によつ
    て２つのリガントに結合する有機化学構造である） の磁気タンパク質コンジュゲート。 ２）式中Ｘが、場合によりその場合における適当な方法
    により置換し得る脂肪族、芳香族、脂環式、脂環式−脂
    肪族または芳香族−脂肪族スペーサーである請求項１に
    記載の磁気タンパク質コンジュゲート。 ３）Ｘが−（ＣＨ＿２）＿ｎ−（式中、ｎ＝１〜８であ
    り、好ましくはｎ＝１〜５であり、特に好ましくはｎ＝
    ２または５である）である請求項２に記載の磁気タンパ
    ク質コンジュゲート。 ４）Ｘが、フェニレンであり、２つのリガントがオルト
    、メタまたはパラ位に存在し得る請求項２に記載の磁気
    タンパク質コンジュゲート。 ５）Ｘがフェニレン−（ＣＨ＿２）＿ｎ−（式中ｎ＝１
    〜５であり、好ましくはｎ＝３である）であり、フェニ
    レン基がスクシンイミジル基に結合する請求項２に記載
    の磁気タンパク質コンジュゲート。 ６）Ｘが−ＣＨＲ−（式中Ｒがアミノ酸側鎖を示し、好
    ましくはアミノ酸アラニン、セリン、スレオニンまたは
    メチオニンの側鎖を示し、特に好ましくはアラニンの側
    鎖を示す）である請求項２に記載の磁気タンパク質コン
    ジュゲート。 ７）Ｘがメチレンシクロヘキシルであり、メチレン基が
    スクシンイミジル基に結合し、シクロヘキシル環に結合
    したカルボニル基については、シクロヘキシル環の４位
    に好適に結合する請求項２に記載の磁気タンパク質コン
    ジュゲート。 ８）Ｘが請求項４の定義と同様であるが、そのフェニレ
    ン環はメチル、ヒドロキシル、メトキシ、アセトキシ、
    ニトロもしくはシアノ基によるか、または塩素もしくは
    臭素原子により置換されている請求項２に記載の磁気タ
    ンパク質コンジュゲート。 ９）タンパク質Ｐのメルカプト基が、自然状態で存在す
    るか、ジスルフィド結合の還元によつて生ずるか、また
    は化学反応により導入される請求項１に記載の磁気タン
    パク質コンジュゲート。 １０）Ｐが、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン残基
    で、好ましくはモノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ′
    もしくはＦ（ａｂ′）＿２フラグメント、抗原または酵
    素、ホルモン、レクチンも しくは成長因子の残基である請求項１に 記載の磁気タンパク質コンジュゲート。 １１）Ｐが、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスのモノクローナ
    ル抗体を示す請求項１０に記載の磁気タンパク質コンジ
    ュゲート。 １２）Ｐが水性塩溶液または体液中に溶解された状態で
    存在する抗原に対抗するモノクローナル抗体を示す請求
    項１０に記載の磁気タンパク質コンジュゲート。 １３）Ｐが、細胞、特に骨髄もしくはリンパ系または末
    梢血液の細胞、特にＢリンパ球、Ｔリンパ球、それらの
    前駆細胞または腫瘍細胞、特に骨髄の腫瘍細胞上に発現
    する抗原に対抗するモノクローナル抗体を示す請求項１
    ０に記載の磁気タンパク質コンジュゲート。 １４）Ｐが細菌、マイコプラズマもしくは原生動物上ま
    たはウィルス上に発現される抗原に対抗するモノクロー
    ナル抗体を示す請求項１３に記載の磁気タンパク質コン
    ジュゲート。 １５）Ｐが抗原を示す請求項１に記載の磁気タンパク質
    コンジュゲート。 １６）Ｍが、金属酸化物のコアとアミノ基を担持する包
    被を有する分散性の粒子であり、上記金属酸化物コアが
    、一群の常磁性物質を含有することができる請求項１に
    記載の磁気タンパク質コンジュゲート。 １７）粒子の径が、約０．１μ〜約１００μであるが、
    好ましくは約０．１μ〜約１．５μである請求項１６に
    記載の磁気タンパク質コンジュゲート。 １８）Ｘが化学的または酵素的方法によつて分解され得
    る請求項１に記載の磁気タンパク質コンジュゲート。 １９）アミノ基を担持する磁気粒子Ｍを、アミノ基と反
    応し式II ▲数式、化学式、表等があります▼II （式中、Ｚは反応性脱離基である） を有するマレイミドスペーサーと反応せしめ、アミノ結
    合の生成を伴つて、式III ▲数式、化学式、表等があります▼III の化合物を得、それが最後にメルカプト基を担持するタ
    ンパク質Ｐと反応して式 I の化合物を得ることからな
    る式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ I の磁気タンパク質コンジュゲートの製造方法。 ２０）水性塩溶液または体液から、溶解した抗原、抗体
    、受容体、基質、補因子、炭水化物決定基を除去する方
    法であつて、その溶液を式 I ▲数式、化学式、表等が
    あります▼ I の適当な磁気タンパク質コンジュゲートとともにインキ
    ュベートし、除去されるべき成分を特異的に吸着させた
    後に、磁気的方法により磁気タンパク質コンジュゲート
    を除去し、好適には、特異的に吸着した成分を再び磁気
    タンパク質コンジュゲートから溶離することからなる方
    法。 ２１）水性塩溶液または体液から細胞を除去する方法で
    あつて、懸濁液を式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ I の適当な磁気タンパク質コンジュゲートとともにインキ
    ュベートし、除去されるべき成分を特異的に吸着した後
    に、磁気的方法により磁気タンパク質コンジュゲートを
    除去し、好的には、特異的に吸着した細胞または粒子を
    磁気タンパク質コンジュゲートから再び脱着することか
    らなる方法。 ２２）請求項１に記載の磁気タンパク質コンジュゲート
    を使用して水性塩溶液または体液から細胞、可溶性抗原
    、受容体、基質、補因子または炭水化物決定基を特異的
    に除去する方法、または診断法の枠内で又は診断の補助
    に使用する方法。 ２６）好適には骨髄除去またはＨＬＡ類型化のための請
    求項１３または１４に定義された細胞を除去するための
    請求項２２に記載の磁気タンパク質コンジュゲートの使
    用方法。
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