JP2756297B2 - 磁気タンパク質コンジュゲート及びその製造方法 - Google Patents

磁気タンパク質コンジュゲート及びその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、下記の定義を有する式Ｉ の磁気タンパク質コンジュゲート（magnetic protein c
onjugate）に関する。
Ｍは、アミノ基を担持する分散性の磁気反応物質（ma
gnetically reacting material）または粒子（particl
e）であり、Ｐは１またはそれ以上のメルカプト基を担
持するタンパク質であり、Ｘは化学的方法により、２つ
のリガンドに結合する有機化学構造を示す。
Ｘは好ましくは、その場合における適当な方法で場合
により置換し得る脂肪族、芳香族、脂環式、脂環式−脂
肪族または芳香族−脂肪族スペーサーであり、このまし
くは−(CH2)n（式中ｎ＝１〜８で、好ましくはｎ＝１〜
５で、特に好ましくはＮ＝２または３である）である
か、または、 Ｘは好ましくは、フエニレンまたは置換されたフエニレ
ンであり、２つのリガンドがオルト、メタまたはパラ位
に存在することができ、フエニレン環中に場合により存
在しうる置換基がメチル、ヒドロキシ、メトキシ、アセ
トキシ、ニトロもしくはシアノ基または塩基もしくは臭
素原子であることができるか、または Ｘは好ましくは、フエニレン−(CH2)n−（式中ｎ＝１
〜５で、好ましくはＮ＝３である）であり、そのフエニ
レン基がスクシンイミド基に結合するか、または Ｘは好ましくは、−CHR−（式中Ｒはアミノ酸側鎖、
好ましくは、アミノ酸アラニン、セリン、スレオニンま
たはメチオニンの側鎖、特に好ましくはアラニンの側鎖
を示す）であるか、または Ｘは好ましくは、メチレンシクロヘキシルであり、メ
チレン基がスクシンイミジル基に結合し、シクロヘキシ
ル環に結合したカルボニル基に関しては、好ましくはシ
クロヘキシル環の４位に結合する。
Ｘの性質は、化学的または酵素による方法によつて分
解されることができるようなものであつてもよい。
Ｐは、メルカプト基が自然状態で存在するか、ジスル
フイド結合の還元で生成するうか、または化学的方法に
よつて導入されるタンパク質でもよい。
Ｐは特に、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン残基
であり、好ましくはモノクローナル抗体、Fab、Fab′も
しくはＦ（ab′）２フラグメント、抗原または酵素、ホ
ルモン、レクチンもしくは生長因子の残基である。
Ｐは好ましくは、IgGまたはIgMクラスのモノクローナ
ル抗体であり、特に、水性塩溶液または体液中に溶解し
た状態で存在する抗原に対抗するモノクローナル抗体、
または細胞上に発現された抗原に対抗するモノクローナ
ル抗体であり、抗原を発現させる細胞は特に、骨髄また
はリンパ系の細胞、末梢血液の細胞、特にＢリンパ球、
Ｔリンパ球もしくはそれらの前駆細胞、または腫瘍細
胞、特に骨髄の腫瘍細胞でもよい。このような細胞はま
た、赤血球、細菌、マイコプラズマまたは原生動物であ
つてよい。しかし、ウイルスもまた、本発明の範囲にお
いて細胞であると理解される。
Ｍは、好ましくは、金属酸化物のコアとアミノ酸を担
持する包被を有する分散性の粒子であり、前記金属コア
は一群の常磁性物質を含有することができ、前記粒子の
径は、約0.1〜約100μであるが、好ましくは約0.1〜約
1.5μである。
本発明はまた、一般式Ｉの磁気タンパク質コンジュゲ
ートの製造方法、水性塩溶液または体液から細胞、可溶
性抗原、受容体、基質、補因子または炭水化物決定基
（carbohydrate determinants）を特異的に除去するた
めの式Ｉのコンジュゲートの使用、診断方法の枠内で、
または診断の補助材としての使用、及び特に骨髄除去ま
たはHLA類型化に対する使用に関する。
骨髄移植は、しばしば治療上の選択的方法としての
み、特に、ある種の白血病及び汎骨髄ろうの治療におい
て行なわれる。
白血病及びある種のリンパ球腫瘍形成において、従
来、患者は、極めて高線量の全身の放射線照射及び／ま
たは攻撃的化学療法を受けてきた。この種の治療によ
り、骨髄の通常の幹細胞及び全血液細胞の前駆体が完全
に破壊される。従つて、適当な供与者から得た骨髄を患
者に再び注入し、それから得られる細胞が受容者の髄腔
に入植し、それにより造血系及び免疫系が再び発生す
る。この方法は、同種骨髄移植と称される。
同種骨髄移植の高い危険性は、特に、供与者からのＴ
リンパ球が骨髄内に再注入された時患者内に持ち越さ
れ、受容者の細胞を異物であると認識して、それを攻
撃、破壊してしまうことに由来する。しばしば患者の生
命を脅かすこの骨髄の不寛容性は、対宿主移植片反応ま
たは対宿主移植疾患（GVHD）と呼ばれる。この対宿主移
植疾患の危険性は、一方では、可能であれば、特に適当
な供与者、通常は、親族、からの厳格に類型した骨髄を
患者へ再注入することによつて減じることができる。し
かし一方では、患者に再注入する前に、供与者の例えば
骨髄のＴリンパ球によつて示されるような、望ましくな
い細胞集団を選択的に除去することによつても減じられ
ることができる。供与Ｔ細胞のこの除去は、例えば、補
体の存在下での、除去されるべき細胞の選択的溶菌、い
わゆる免疫毒素の作用によるＴ細胞の選択的死滅、また
は例えば骨髄の磁気的な細胞除去によるようなその他の
方法によつて行なわれる。
この種の骨髄細胞除去は、骨髄を、例えば骨髄のＴ細
胞に特異的に対抗しそれ故にＴ細胞のみに結合するモノ
クローナルマウス抗体とともにインキュベートする方法
のように比較的簡単な方法で実施することができる。モ
ノクローナルマウス抗体が結合するこの種のＴ細胞は、
例えば磁気粒子に結合するラビツト抗−マウス免疫グロ
ブリンとともにそれをインキュベートすることによる第
二の過程により除去することができ、その方法によつて
磁気粒子は、Ｔリンパ球に特異的に結合し、それらは磁
石の使用により骨髄から除去されることができる（Vart
dalらによる「Transplantation」（1987）、43、366〜3
71及びその中に引用されている文献参照）。
骨髄から他の細胞集団、例えば腫瘍細胞を類似の方法
で除去することも可能であり、それはいわゆる自己移植
骨髄移植によつて重要である（Kvalheimらの「Cancer R
esearch」（1987）、47、846〜851及びその中に引用の
文献参照）。さらに、Kvalheimらによつて上記文献に記
載されているように、腫瘍細胞を認識するモノクローナ
ル抗体を磁気粒子上に直接結合させ上記の第二抗体（ラ
ビツト抗−マウス）を不要とすることも出来る。
磁気粒子に結合するモノクローナルまたはポリクロー
ナル抗体の使用による骨髄除去のための上記方法は、ま
だ非常に新しく、さらなる開発及び試験を必要とする。
この目的のために適した非常に多種類の磁気粒子が最近
市販されており、その製造方法は、特許文献に複数回記
載されている（例えばChangnonらによるEP 0,125,995 A
2（1983年５月12日のUS 493,991を優先権主張の基礎と
するもの、Advanced Magnetiocs、または1983年11月10
日のWO8,303,920、SINTEF参照）。これらの粒子は、常
磁性物質が含まれていてもよい金属酸化物のコアからな
り、しかもそのコアが反応基、例えばアミノフエニル、
アミノ、カルボキシル、ヒドロキシルまたはスルフヒド
リル基を担持しうる包被によつて囲まれており、タンパ
ク質の結合に用いられることができることが公知である
（ChangnonらによるEP0,125,995A2）。
例えばカルボキシル基を担持する粒子は、誘導されて
縮合剤の存在下でタンパク質のアミノ基と反応すること
が公知である（ChagnonらによるEP0,125,995A2）。
グルタルアルデヒドを使用するアミノ基を担持する磁
気粒子へのタンパク質の結合、そしてその結合が各場合
においてアミノ基を経て起こることも公知である（Chan
gnonらによるEP 0,125,995A2）。
さらに、ヒドロキシル基を担持する粒子がｐ−トルエ
ンスルホニルクロライドとの反応によつて活性化される
ことができ、このようにして活性化された粒子が誘導さ
れて、タンパク質のアミノ基と反応することも公知であ
る（Kvalheimらによる「Cancer Research」（1987）、4
7、846〜851）。
これら全ての結合方法において、どの場合でも、タン
パク質がその遊離アミノ基を介して粒子に結合すること
は共通している。しかし、アミノ基を介するこのような
結合は、この場合に、たまに抗体の特異性と反応性が損
なわれることがあるので、モノクローナル抗体にとつて
は相当に不利である。それは、抗体中のアミノ基が全分
子上に多少無秩序に分散しており、従つて、Fabフラグ
メントの抗原結合部位中にも位置し、それがこのような
アミノ基を介する結合が起こる特異性の損失をもたらす
からである。
さらに、粒子がスチレン／ジビニルベンゼンコポリマ
ーで包被されている場合、タンパク質はポリスチレンに
非特異的に結合することが知られているので、抗体は化
学的結合のない場合でさえも純粋に吸着によつても磁気
粒子上に集め得ることが知られている。
しかし、この方法によつても、抗体の特異性と反応性
の損傷は、必ず起こりうる。この方法のもう一つの重大
な欠点は、吸着により結合した抗体が骨髄除去中に再び
脱着して、除去された骨髄の再注入時に患者へ投与さ
れ、それが特にモノクローナル抗体による治療を先に試
みられていた場合に重大な副作用の原因となる可能性が
あるということである。しかし、この問題点は既知であ
り、抗体の磁気粒子への共有結合によつてそれを解決す
ることが目標とされている。
またポリスチレン包被を有する磁気粒子は、凝集し、
さらに非特異的に細胞へ付着（attach）するという重大
な欠点を有している。
この従来技術に基づいて、本発明の目的は、モノクロ
ーナル抗体をａ）共有結合的に、そしてｂ）そのアミノ
酸を介してではなく、磁気粒子へ結合させる方法を提供
することにある。従つて、言い換えると、本発明の目的
は、抗体の抗原結合部位が変化せず、または抗体の結合
が抗原結合部位を離れて起こるような結合方法を見出す
ことにある。
本発明の目的は、前記一般式Ｉの磁気タンパク質コン
ジュゲートの製造により達成される。
本発明者らによつて、反応性基として遊離のアミノ基
を担持する磁気粒子が、簡単な方法によつて、反応性基
としてマレイミド基を担持する磁気粒子に転化され得る
ことが見出されたのである。この種の粒子は新規なもの
である。
さらに、マレイミド基を担持する磁気粒子は、困難な
く、メルカプト基を有するタンパク質とコンジュゲート
することが出来、タンパク質中のメルカプト基は自然状
態ですでに存在しているか、化学的方法により導入され
るか、または存在するジスルフイド結合の還元によつて
生成させることができることが見出された。
特に、抗体の隙間ジスルフイド結合が選択的還元によ
り遊離のSH基へ転化され、これが磁性粒子のマレイミド
基と反応し安定なチオエーテル結合を形成できるよう誘
導されるならば、マレイミド基を担持する磁気粒子は、
困難なく、モノクローナル抗体とコンジュゲートし得る
ことを見出した。この磁気粒子へのモノクローナル抗体
の結合方法も、同様に新規である。
驚くべきことに、ヒンジ部を介する抗体の結合は、抗
原結合部位を変化または損傷させないので、チオエーテ
ル結合を介して磁性粒子に結合した抗体の特異性及び反
応性は、完全に保持されることが見出された。抗体が、
上記のように、純粋に吸着によりまたはそのアミノ基の
反応のどちらかにより磁気粒子に集まり、その結果コン
ジュゲートされた抗体の特異性と反応性を損うことがあ
るという前記の従来の結合方法と比較した、本発明の特
別の利点がここにある。さらに、吸着による結合と比較
して、本発明は、抗体が磁気粒子へ化学的に結合し、そ
してその結果、本発明の磁気抗体コンジュゲートが例え
ば骨髄除去に用いられる場合に、粒子から脱着しないと
いう利点を有している。
さらに、本発明の磁気抗体コンジュゲートは、その高
い特異性のために、例えば骨髄除去に対して、特に有利
であることが証明された。
さらに、本発明の磁気抗体コンジュゲートは、また診
断方法の観点において、または特に、例えばHLA類型化
に対する診断補助として特異性が高いので有利であるこ
とが見出された。
本発明による磁気抗体コンジュゲートの製造について
は、以下、骨髄の細胞に抗体する種々のモノクローナル
抗体に対する実施例によつて説明するが、特記された実
施例は本発明を限定するものではない。さらに、骨髄細
胞の除去及びHLA類型化に関する、実施例によつて製造
された磁気抗体コンジュゲートの用途は、同様に実施例
によつて説明するが、その用途を記載された実施例に限
定するものではない。
一般式Ｉの磁気タンパク質コンジュゲートの製造方法 アミノ基を担持する磁気粒子Ｍを、アミノ基と反応し
かつ下記式中のＺがアミノ結合の生成を伴う適当な反応
性脱離基である一般式II のマレイミドスペーサーと適当な溶媒中で、反応させ、
一般式III の化合物を得、それを最後に、タンパク質を変成させな
いような適当な水性塩含有溶媒、例えば生理食塩水また
はリン酸塩緩衝食塩水中で、メルカプト基を担持するタ
ンパク質Ｐと反応させて式Ｉの化合物を得る。
磁気粒子へ式IIの化合物が結合するために適した溶媒
の性質は、用いられる溶媒が、場合ににおいて結合のた
めに用いられる磁気粒子の物理的及び磁気的特性、特に
寸法、分散性及び表面特性を損傷しないような溶媒でな
ければならない。例えばEP0,125,995 A2またはWO 8,30
3,920号に記載された上記磁気粒子に対して適当である
と考えられる溶媒の例は、水とジメチルホルムアミドの
混合物であり、式II中の置換基Ｚは、例えば及び好まし
くは、スクシンイミジルオキシである。しかし、他に考
えられる適当な溶媒の例は、無水アセトンであり、その
場合において式II中の置換基Ｚは、スクシンイミジルオ
キシの他に、ハロゲン、例えば塩素もしくは臭素または
擬ハロゲン化物、例えばシアニドまたはアシル基例えば
アセチルもしくはｐ−ニトロベンゾイル、またはその他
の反応性脱離基例えばトシル基であつてもよく、Ｚがス
シンイミジルオキシでない全ての場合において、反応は
好ましくは適当な塩基、例えば炭酸ナトリウムの存在下
で行なわれる。
細胞除去方法 塩を含有した好ましくは生理水性溶液または体液中の
細胞混合物を除去するために懸濁液を式Ｉの化合物とと
もに、例えば０〜40℃の間の適当な温度において、好ま
しくは撹拌しながら、同様に好ましくは滅菌条件下で、
適当な時間インキュベートし、次いで磁気粒子を適用な
磁石を用いて除去する。
適当な温度の例は、０℃、室温または37℃であるが、
室温が好ましい。インキュベートの継続時間は、各場合
において、用いられるインキュベート温度及び抗体の結
合反応性によつて決まり、例えば数分から例えば２時間
迄であることができる。インキュベートは、例えば10〜
20分の時間で、例えば室温において行なうことが好まし
い。
可溶性の生物有機粒子の単離方法 この方法は、実質的には、細胞除去方法に従つて行な
う。
実施例 以下、実施例によつて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらは本発明を限定するものではない。
モノクローナル抗体と上記方法によつて反応するよう
に誘導された磁気粒子は、以下「磁気ビード」と呼び、
各場合においてそれらの特性は、特定の抗体名を接頭辞
として付けることによつて示す。
実施例１ γ−マレイミドブチレートスペーサーを用いるEP0,125,
995A2による磁気粒子のコンジュゲート 商業的に入手可能な磁気粒子（Bio Mag M4100,SeBa
kR）の懸濁液0.5mlをリン酸塩で緩衝された食塩水（Pho
sphate−Buffered Saline）（PBS）pH7.2により３回洗
浄し、PBS 6ml中に再び懸濁した。この懸濁液に、乾燥
ジメチルホルムアミド4ml中のＮ−（γ−マレイミドブ
チリルオキシ）スクシンイミド（GMBS,Calbiochem）20m
gの製造直後の溶液を加え、次いでこの混合物を室温で
１時間振蕩した。次いで粒子を3000×ｇで遠心で落とし
（spun down）各回20mlのPBSで３回洗浄し、次いでPBS
6ml中に再び懸濁した。
実施例２ 実施例１で得られたマレイミド基を担持する磁気粒子へ
モノクローナル抗体*)を結合する一般的方法 ＊：用いられる全てのモノクローナル抗体は、0.1モル/
lのクエン酸ナトリウム緩衝液pH6.6と50g/lスクロース
との溶液中に1mg/ml濃度で凍結乾燥した。
凍結乾燥したモノクローナル抗体1mgを水0.5ml中に溶
解し、ジチオスレイトール2mgを加え、次いでこの混合
物を室温で30分間インキュベートした。還元された抗体
を、等浸透圧食塩水pH7.2を用いて溶離容積4mlでセフア
デツクスG25上のゲル過により単離し、次いで実施例
１において製造された磁気粒子の懸濁液へ加えた。この
混合物（10ml）を室温で45分間振蕩しながらインキュベ
ートした。その後粒子を3500×ｇで遠心で落とし、PBS
各回20mlで３度洗浄し、PBS（pH7.2）10ml中に再び懸濁
し、次いで４℃で保存した。
好適には、0.2％ナトリウムアジドまたは0.2％ナトリ
ウムアジド＋0.1％BSA（ウシ血清アルブミン）＋0.2％T
ween20をこの懸濁液を加える。
実施例２のようにして結合されたモノクローナル抗体
を表１にまとめた。
実施例３ BMA 041磁気ビードとＴ細胞との正の反応 実施例２と同様にして得られたPBS中のBMA 041磁気ビ
ードの懸濁液40μｌを、室温で10分間振蕩しながら、Ｔ
細胞懸濁液120μｌ（クローン5/87−７−A3;CD4+、CD
8-、CD2+、CD3+、Ｔ−細胞受容体−正;1×104細胞／μl
RPMI 1640中）とともにインキュベートし、次いで遅滞
なく計数室内の顕微鏡で検査し次いで撮影した。細胞は
磁気粒子とともにロゼツトまたは集塊を形成していた。
実施例４ BMA 041磁気ビードとＢ細胞との負の反応 実施例２のようにして得られたPBS中のBMA 041磁気ビ
ードの懸濁液40μｌを、実施例３のようにして得られた
Ｂ細胞の懸濁液120μｌ（Ｂ細胞系GR、１×104細胞／μ
l RPMI 1640中）とともにインキュベートし、次いで顕
微鏡で検査し、撮影した。ロゼツト及び集塊は認められ
なかつた。
実施例５ BMA 081磁気ビードとＴ細胞の正の反応 実施例２のようにして製造されたBMA 081磁気ビード
の懸濁液40μｌを、Ｔ細胞（クローン5/87−４−B6;CD8
+、CD4-、CD2+、CD3+、Ｔ−細胞受容体−正）ととも
に、実施例３のようにしてインキュベートし、その後顕
微鏡で検査し、撮影した。負の対照を実施例４と同様の
Ｂ細胞とした（Ｂ細胞系GR）。このＴ−細胞受容体−正
細胞は、磁気粒子とともにロゼッタまたは集塊を形成し
ていた。負の対照はロゼツタも集塊も形成が認められな
かつた。
実施例６ BMA 031磁気ビードとＴ細胞の正の反応 実施例２のようにして得られたBMA 031磁気ビードの
懸濁液40μｌを、Ｔ細胞（クローン5/87−４−B6;CD
8+、CD4-、CD2+、CD3+、Ｔ−細胞受容体−正）ととも
に、実施例３と同様にしてインキュベートし、次いで顕
微鏡で検査し、次いで撮影した。負の対照を実施例４と
同様のＢ細胞とした（Ｂ細胞系GR）。抗原−正細胞は再
び磁気粒子とともにロゼツトまたは集塊を形成してお
り；抗原−負細胞は結合していなかつた。
実施例７ 単核細胞からの細胞集団の除去 単核細胞（MNC）を、それ自体公知の方法（Boyum,Sca
nd.J.Immunol.（1976）、Suppl.5、９−15）で、Ficoll
グラジェントにより、供与されたヒトの新鮮血液から単
離した。
除去のために、プラスチツク管（Falcon,No.2051）中
の１％BSA（w/v,Seromed）を含むPBS 2ml中の３×107MN
Cを、PBS中の2mg/ml磁気ビードの懸濁液1mlとともに混
合し、室温で振蕩し続けながら15分間インキュベートし
た。磁気ビードとそれに結合した細胞をその後永久石を
用いて除去した。懸濁液中に残留する細胞を、400×ｇ
でペレット化し、適当な溶媒、例えばPBSまたはRPMI 16
40中に再び懸濁した。除去効率を、細胞蛍光間接撮影機
（Ortho）を用いる間接免疫蛍光検査法により測定し
た。
この目的のために、特定の細胞集団の除去の前後に、
１×106の細胞を１〜10μg/mlの第一抗体（各場合にお
いて適当な特異性のモノクローナル抗体）により、その
後10〜50μg/mlの第二抗体（ラビツト抗−マウス免疫グ
ロブリン、F(ab)2フラグメント、FITC−標識、ベーリン
グベルケ製）により、それ自体公知の方法で標識し、次
いで細胞蛍光間接撮影機で評価し、除去効率を測定した
ところ、各場合において95％を越えていた。
実施例７のようにして除去された細胞を表２に示す。
BMA 041（抗−CD4、ベーリングベルケ社製）磁気ビー
ド及びBMA 081（抗−CD8、ベーリングベルケ社製）によ
る除去により得られた結果を、第１図中に例として示
す。これには、BMA 031（抗−Ｔ−細胞受容体、ベーリ
ングベルケ社製）、BMA 041またはBMA 081による各場合
における未結合の細胞集団を標識することによつて測定
された除去効率が含まれる。FITC−標識第二抗体（前記
参照）によるインキュベート後、各場合における蛍光強
度を線形増幅を用いる細胞蛍光間接撮影機を用いて評価
した。
実施例８ 未結合の磁気粒子（Bio Mag M4100,SebakR）とのインキ
ュベート後における培養基中のＴ細胞の増殖の検出 単核細胞を実施例７と同様にしてヒトの血液から単離
し、次いで実施例７と同様にして未結合の磁気粒子（Bi
oMag M4100,SebakR）の懸濁液とともにインキュベート
した。この磁気粒子をその後、永久磁石を用いて除去し
た。残りのMNCをCO2インキュベーター中で、37℃におい
て、64時間、ポークウイードマイトゲン（PWM,Gibco;1:
3000最終希釈）または10μg/ml植物凝集素（PHA,Wellco
me）の存在下で、無血清培養基（Iscove,ベーリングmod
ification）中各場合において１×105 MNC/ウエルの濃
度で、96−ウエル平底タイタープレート（Nunc）におい
てインキュベートした。48時間の培養時間後に、14C−
チミジン（Amersham）2.7×103Bqを各培養基へ加えた。
さらに14時間の培養後に、細胞を細胞採集機（Innote
c）を用いて、ガラス繊維フイルターデイスク上での吸
引により過した。フイルターの放射能を、シンチレー
シヨン液の添加後にβ計数器（Packard製）で測定し
た。
第２図はこの種の実験の評価を示すものであり、PHA
またはPWMによるMNCの刺激は、未結合の磁気粒子（BioM
ag M4100,SebakR）による除去によつて損なわれないこ
とを明らかにしている。
実施例９ 未結合磁気粒子（BioMag M4100,SebakR）の存在下にお
ける培養基中のＴ細胞増殖の検出 様々の量の未結合磁気粒子（BioMag M4100,SebakR）
をMNCに加え、その後それを96−ウエルプレート中に分
散し、実施例８と同様にして、PHA（10μg/ml）、BMA 0
30（ベーリングベルケ製、Ｔリンパ球のマイトゲン）
（0.01μg/ml）またはスタフイロコツカスアウレウスキ
ヤプシツド（SAC,ベーリングベルケ製、Ｂリンパ球のマ
イトゲン、最終希釈1:3000）とともに培養した。
第３図より、２〜20μg/mlの濃度において、磁気粒子
（BioMag M4100,SebakR）は、Ｂ及びＴ細胞の増殖に悪
影響を与えないことが明らかである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、BMA 031、BMA 041及びBMA081磁気ビードによ
るＴ細胞の部分集団の除去を示すグラフである。グラフ
中、PBLは、最初の細胞集団を、CD4-は、BMA 041磁気ビ
ードによる除去後の集団を、CD8-は、BMA 081磁気ビー
ドによる除去後の集団を示す。 第２図は、未結合の磁気粒子（BioMag M4100、SebakR）
によるインキュベート及び植物凝集素（PHA）またはポ
ークウイードマイトゲン（PWM）による刺激後の培地中
のＴ細胞の増殖を対照培地と比較して示すグラフであ
る。 第３図は、植物凝集素（PHA）、抗−CD3モノクローナル
抗体BMA 030またはスタフイロコツカスアウレウスキヤ
ツプシツド（SAC）による刺激後の、未結合磁気粒子（B
ioMag M4100、SebakR）存在下における培地中のＴ細胞
の増殖を対照培地と比較して示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/575 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/18 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｃ１２Ｐ 21/08 37/46 (72)発明者 ローラント・クルレ ドイツ連邦共和国デー‐3550 マルブル ク．シエン ケンドルフヴエーク 18 (72)発明者 フリードリヒ・ローベルト・ザイラー ドイツ連邦共和国デー‐3550 マルブル ク．オーベ ラーアイヒヴエーク 10 (56)参考文献 特開 昭58−208238（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−134763（ＪＰ，Ａ) 国際公開87／2063（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 17/00 A61K 37/46

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の式Ｉ （式中、Ｍはアミノ酸を担持する分散性の磁気的反応物
    質又は粒子であり、Ｐは１またはそれ以上のメルカプト
    基を担持するタンパク質であり、Ｘは化学的方法によっ
    て２つのリガンドに結合する有機化学構造である） の磁気タンパク質コンジュゲート。
  2. 【請求項２】式中Ｘが、場合によりその場合における適
    当な方法により置換し得る脂肪族、芳香族、脂環式、脂
    環式−脂肪族または芳香族−脂肪族スペーサーである請
    求項１に記載の磁気タンパク質コンジュゲート。
  3. 【請求項３】タンパク質Ｐのメルカプト基が、天然の状
    態で存在するか、ジスルフィド結合の還元によって生ず
    るか、または化学反応により導入される請求項１に記載
    の磁気タンパク質コンジュゲート。
  4. 【請求項４】Ｐが、免疫グロブリンまたは免疫グロブリ
    ン残基で、好ましくはモノクローナル抗体、Fab、Fab′
    もしくはＦ（ab′）２フラグメント、抗原または酵素、
    ホルモン、レクチンもしくは成長因子の残基である請求
    項１に記載の磁気タンパク質コンジュゲート。
  5. 【請求項５】Ｐが、細胞、特に骨髄もしくはリンパ系ま
    たは末梢血液の細胞、特にＢリンパ球、Ｔリンパ球、そ
    れらの前駆細胞または腫瘍細胞、特に骨髄の腫瘍細胞上
    に発現する抗原に対抗するモノクローナル抗体を示す請
    求項４に記載の磁気タンパク質コンジュゲート。
  6. 【請求項６】Ｐが抗原を示す請求項１に記載の磁気タン
    パク質コンジュゲート。
  7. 【請求項７】Ｍが、金属酸化物のコアとアミノ基を担持
    する包被を有する分散性の粒子であり、上記金属酸化物
    コアが、一群の常磁性物質を含有することができる請求
    項１に記載の磁気タンパク質コンジュゲート。
  8. 【請求項８】アミノ基を担持する磁気粒子Ｍを、アミノ
    基と反応し式II （式中、Ｚは反応性脱離基である） を有するマレイミドスペーサーと反応せしめ、アミノ結
    合の生成を伴って、式III の化合物を得、それが最後にメルカプト基を担持するタ
    ンパク質Ｐと反応して式Ｉの化合物を得ることからなる
    式Ｉ の磁気タンパク質コンジュゲートの製造方法。
  9. 【請求項９】式Ｉ （式中、Ｍはアミノ酸を担持する分散性の磁気的反応物
    質又は粒子であり、Ｐは１またはそれ以上のメルカプト
    基を担持するタンパク質であり、Ｘは化学的方法によっ
    て２つのリガンドに結合する有機化学構造である）の磁
    気タンパク質コンジュゲートからなる、水性塩溶液また
    は体液からの細胞、溶解した抗原、抗体、受容体、基
    質、補因子、炭水化物決定基の除去剤。
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