KR0154120B1 - 자기단백질접합체 - Google Patents

자기단백질접합체

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KR0154120B1
KR0154120B1 KR1019900008921A KR900008921A KR0154120B1 KR 0154120 B1 KR0154120 B1 KR 0154120B1 KR 1019900008921 A KR1019900008921 A KR 1019900008921A KR 900008921 A KR900008921 A KR 900008921A KR 0154120 B1 KR0154120 B1 KR 0154120B1
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헤르멘틴 페테르
뎅게스 라이너
프라센 우도
엔쓸레 카롤하인쯔
프리센 하인쯔-외르겐
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수타인, 부크
베링베르케 아크티엔게젤샤프트
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Abstract

내용없음.

Description

자기 단백질 접합체
본 발명은 일반식(Ⅰ)의 자기(magnetic)단백질 접합체에 관한 것이다.
M-NH-CO-(CH2)n-S-P (Ⅰ)
상기식에서,
n은 1 내지 6, 바람직하게는 1 또는 2, 특히 바람직하게는 1이고,
M은 아미노 그룹을 갖는 분산성 자기반응성 물질 또는 입자이며,
P는 단백질이다.
P는 하나 이상의 설프하이드릴 그룹이 천연의 상태로 존재하거나 디설파이드 결합의 환원에 의해 생성되거나 화학반응으로 도입되는 단백질일 수 있다.
P는 특히, 면역글로불린 또는 면역글로불린 잔기, 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편, 항원 또는 효소, 호르몬, 렉틴 또는 성장인자의 잔기이다.
P는 바람직하게, lgG 또는 lgM 부류의 모노클로날 항체 특히, 체액 또는 수성 염 용액중에 용해된 형태로 존재하는 항원에 대한 모노클로날 항체, 또는 세포상에 발현된 항원에 대한 모노클로날 항체이며, 이때 항원을 발현시키는 세포는 특히, 척수 또는 임파계의 세포, 말초혈액세포 특히, B 임파구, T 임파구 또는 이의 전구세포, 또는 종양세포 특히 골수종양세포이다. 이들 세포는 또한 적혈구, 세균, 마이코플라즈마 또는 원생동물일 수 있다. 그러나, 바이러스도 본 발명의 범주에서는 세포로 간주된다.
M은 바람직하게는 메탈 옥시이드 코어 및 아미노 그룹을 갖는 외피막을 지닌 분산성 입자이며, 메탈 옥시이드 코어 중에 상자성(paramagnetic) 물질의 그룹이 함유될 수 있으며, 바람직하게는, 직경이 약 0.1μ 내지 약 100μ, 바람직하게는 약 0.1μ 내지 약 1.5μ인 입자이다.
본 발명은 또한, 일반식(Ⅰ)의 자기 단백질 접합체의 제조 방법 및 수성 염용액 또는 체액으로부터 세포 또는 가용성 항원, 수용체, 기질, 보조인자 또는 탄수화물 결정인자를 특이적으로 제거하기 위한 일반식(Ⅰ)의 접합체의 용도 및 진단 보조제의 일부로서 또는 진단 보조제로서의 용도 특히, 골수고갈 또는 HLA 타이핑에 사용하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
골수이식은 특히 특정 유형의 백혈병 및 범골수병(척수염)치료에 단지 치료상의 선택에 지나지 않는다.
백혈병 및 특정의 임파성 종양을 지닌 환자들은 종종 극도로 높은 투여량으로 전신 방사선 조사 및/또는 고통스러운 화학요법을 받기 쉽다. 이런 유형의 치료는 골수의 정상적인 지주세포(모든 혈액세포의 전구체)를 완전히 파괴하게 된다. 그러므로, 환자는 적절한 공여자로부터 골수를 재주입 받아야 하며, 이로부터 세포들은 수용자의 골수강(bone marrow cavity)에 콜로니를 형성하게 되고, 조혈 및 면역계가 새롭게 발생할 수 있게 된다. 이 방법을 대립인자성(allogenic) 골수이식이라 한다.
재주입된 골수와 함께 환자에게 전이되고 수용자의 세포를 외래(foreign)로 인지함으로써 이를 공격하여 파괴하는 공여자의 T임파구는 특히,대립인자성 골수이식과 관련하여 상당한 위험성을 부여한다. 이처럼 종종 환자의 생명을 위협하는 골수 거부반응(intolerance)은 이식체-숙주 반을 또는 이식체-숙주질환(graft-versus-host disease; GVHD)으로 불린다. 한편, 상기한 이식체-숙주질환과 연관된 위험은 적절한 공여자로부터, 통상적으로는 친척으로부터의 환자와 정확하게 동종인 골수를 재주입시킴으로써 감소시킬 수 있다. 그러나, 다른 한편으로, 상기 질환은 예를 들어, 환자에게 재주입하기전에 공여자의 골수중에서 T임파구 세포로 대표될 수 있는 바람직하지 않은 세포군을 선택적으로 제거함으로써 감소시킬 수 있다. 이런 공여자의 T세포제거는 예를 들어, 제거되어야할 세포를 보체의 존재하에 선택적으로 용해시키거나 또는 소위 말하는 면역독소를 사용하여 T세포를 선택적으로 살상하거나 또는 예를 들어, 골수의 자기 세포 고갈법(magnetic cell depletion)등의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.
이런 유형의 골수세포 고갈은, 골수와 뮤린 모노클로날 항체(예를 들어 골수의 T세포에 대해 특이적으로 관련되어 있으며 그 결과 T세포에만 결합하는)를 배양하는 비교적 직접적인 방법으로 수행할 수 있다. 뮤린 모노클로날 항체를 가지고 있는 상기 T세포들은, 예를 들어, 자기 입자와 결합된 래빗 항-마우스 면역 글로불린과 함께 배양시킴으로써 두 번째 단계에서 제거될 수 있으며, 이 결과 T임파구가 특수한 방법으로 자기 물질을 적재하게되며 따라서 이들은 자석을 사용하여 골수로부터 제거될 수 있게 된다[참조; Vartdal dt al., Transplantation(1987), 43, 366-371, 본원에 참조로 인용된다].
유사한 방법으로, 골수로부터 종양세포와 같은 다른 세포 군을 제거하는 것이 역시 가능한데, 이는 소위 자기 유래성 골수이식에서 중요한 것이다[참조:Kvalheim et al., Cancer Research (1987), 47, 846-851, 본원에 참조로 인용된다]. 이는 또한 자기 입자에 직접적으로 결합하는 종양세포를 인지하는 모노클로날 항체를 수반하며 이에 따라 상기 언급한 2차 항체(래빗 항-마우스)가 더 이상 필요없게 된다[Kvalheim et al., 상기 참조].
자기 입자에 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 이용한 상기의 골수 고갈법은 아직까지는 새로운 것으로서, 더 많은 개발과 검정이 요구된다. 당해 목적에 적합한 자기 입자는 현재 광범위한 형태로 상업적으로 시판되며 이들의 제조는 특허 문헌에서 수회 기술된바 있다.(참조:Chagnon et al., EP 0125995 A2(1983년 5월 12일 미국 우선권 제493991호), Advanced Magnetics, 또는 Ughelstad et al., 1983년 11월 10일 WO 제8303920호, SINTEF). 자기 입자는 상자성 물질이 포함될 수 있는 메탈 옥시이드 코어로 구성되어 있으며, 코어는 예를 들어, 아미노페닐, 아미노, 카복실, 하이드록실 또는 설프하이드릴 그룹등 단백질 결합에 이용될 수 있는, 반응성 그룹을 지닐 수 있는 외피막(enveloping coat)으로 둘러싸여 있는 것으로 공지되어 있다[참조:Chagnon등, 유럽 특허원 제0125995 A2호].
예를 들어, 카복실 그룹을 갖는 입자가 축합제 존재하에 단백질의 아미노 그룹과 반응할 수 있다는 것은 공지되어 있다[참조:Chagnon등, 유럽 특허원 제0125995 A2호].
또한, 글루타르알데하이드를 사용하여 단백질과 아미노 그룹을 갖고 있는 자기 입자를 결합시키는 것이 공지되어 있으며, 이때 결합은 각각의 경우 아미노 그룹을 통해 발생한다[참조:Chagnon등, 유럽 특허원 제0125995 A2호].
또한, 하이드록실 그룹을 갖는 입자는 p-톨루엔 설포닐 클로라이드와 반응하여 활성화될 수 있음이 공지되어 있으며, 이런 방법으로 활성화된 입자는 단백질의 아미노 그룹과 반응할 수 있다.[참조: Kvalheim등. Cancer Research(1987), 47, 846-851].
단백질이 각각의 경우 그들의 유리 아미노 그룹을 통해 입자와 결합한다는 것은 이들 모든 결합 방법에서 통상적인 것이다. 그러나, 아미노 그룹을 통한 이런 결합은 모노클로날 항체에 있어서는 상당히 불리할 수 있는데 왜냐하면, 이런 결합이 종종 항체의 특이성과 반응성에 해를 주기 때문이다. 이것은, 항체중의 아미노 그룹이, 말하자면, 분자전체에 무작위로 분포하여 또한 Fab 단편의 항원-결합부위에 위치할 수도 있고 이로인해 아미노 그룹을 통한 결합에서의 특이성 상실을 유발시키기 때문이다.
또한, 입자가 산화철을 함유한 스티렌/디비닐 벤젠 공중합체로 구성되어 있을 때 항체는 또한 어떤 화학적 연결 없이 오로지 흡착에 의해서만 자기 입자상에 인출될 수 있음이 공지 되어 있는데, 이는 단백질이 폴리스티렌과는 비-특이적으로 결합하는 것으로 공지되어 있기 때문이다.
그러나, 이 방법에도 역시 항체 특이성 및 반응성의 손상이 필히 예상된다. 그러나, 이 방법의 다른 심각한 단점은 흡착에 의해 결합된 항체가 골수의 고갈에 따라 점차 다시 떨어지며, 그에따라 환자에게 고갈된 골수를 재주입할 때 환자에게 투여될 수도 있으며, 이는 특히, 앞서 모노클로날 항체로 치료를 시도했던 부위에서 심각한 부작용을 유발하게 된다. 그러나, 이런 문제점은 공지되어 있고, 항체를 자기 입자에 공유결합으로 부착시킴으로써 극복된다.
폴리스티렌계 자기 입자들은 이들이 웅집하기도 하는 심각한 부작용을 지니고 있고, 게다가, 이들 스스로 세포에 비특이적으로 결합한다고 공지되어 있다.
기술의 이런 상태로부터 출발하여, 본 발명의 목적은 모노클로날 항체 a)공유결합으로 및 b)이들의 아미노 그룹을 통하지 않고 자기 입자와 결합되는 방법을 개발하는데 있다. 그러므로, 다시말하자면, 본 발명의 목적은 항체의 항원-결합 부위가 변화하지 않은 결합 방법을 찾거나 또는 항체의 결합이 항원-결합위치로부터 떨어져 발생하는 결합방법을 찾는 것이다.
본 발명에 따른 이 목적은 일반식(Ⅰ)의 자기 단백질 접합체을 제조함으로써 성취된다.
M-NH-CO-(CH2)nS-P (Ⅰ)
아미노 그룹을 갖는 자기 입자를, 반응성 그룹으로써 말레이미도 작용기를 갖는 자기 입자로 전환시키고, 후자를 설프하이드릴 그룹을 갖는 단백질과 접합시키기 위해서, 단백질중의 설프하이드릴 그룹이 천연적으로 이미 존재하거나 또는 화학적 방법으로 도입되거나 또는 이미 존재하던 디설파이드 결합의 환원으로 발생되는 것이 가능하다고 이미 제안되어 왔다.
현재, 반응성 그룹으로써 유리 아미노 그룹을 갖는 자기 입자는 또한 반응성 그룹으로써 요오드아세틸 또는 브로모아세틸 작용기를 갖는 자기 입자로 곧바로 전환될 수 있음이 밝혀졌다. 이런 타입의 입자는 신규한 것이다.
요오드아세틸 또는 브로모아세틸 작용기를 갖는 자기 입자가 아무런 어려움없이 설프하이드릴을 갖는 단백질과 접합 할 수 있고, 단백질의 설프하이드릴 그룹이 이미 천연적으로 존재하거나 또는 화학적 방법으로 도입되었거나 또는 이미 존재 던 디설파이드 결합의 환원으로 발생되는 것이 가능하다고 밝혀졌다.
특히, 요오드아세틸 또는 브로모아세틸 작용기를 갖는 자기 입자는, 항체의 쇄내 디설파이드 결합이 선택적 환원에 의해 유리 SH 그룹으로 전환될 때 어려움 없이 모노클로날 항체와 접합 할 수 있으며, 유리 SH 그룹은 티오에테르 결합을 형성하면서 자기 입자의 요오드아세틸 또는 브로모아세틸 작용기와 반응 하도록 유도될 수 있다. 이런 양상의 모노클로날 항체와 자기 입자의 결합은 마찬가지로 신규한 것이다.
놀랍게도, 항체의 힌지(hinge) 영역을 통한 항체의 결합이 그의 항원-결합부위에 어떤 변화나 손상이 없는 것을 의미하기 때문에 자기 입자의 티오에테르 결합을 통해 결합된 항체의 특이성 및 반응성은 완벽하게 유지된다고 밝혀졌다. 이같은 사실은 본 발명이 지금까지 기술한 결합방법에 비해 특별한 장점을 나타내고 하는 것인데, 전술한 방법에 있어서 항체는 상기 기술한 바와 같이, 전적으로 흡착에 의해서 또는 이들의 아미노 그룹의 반응을 통해서 자기 입자에 인출되는데, 이는 접합된 항체의 특이성 및 반응성 모두에 손상을 끼칠 수도 있다. 게다가, 본 발명은 흡착에 의한 결합과 비교하여 항체가 자기 입자에 화학적으로 결합한다는 장점을 가지며, 결과적으로, 예를 들어 골수 고갈을 위해 본 발명에 따른 자기 항체 접합체를 사용했을 때 , 항체가 입자로부터 떨어지지 않는다.
추가로, 종종 발생하는 자기 입자상에 항체의 비-특이적인 흡착은 접합한 계면활성제의 첨가에 의해 방지 또는 탈착시킬 수 있다고 밝혀졌다.
또한, 본 발명에 따른 자기 항체 접합체는, 예를 들어 골수의 고갈에 있어서, 이들의 높은 특이성 때문에 특히 유익한 것으로 판명되었다.
또한, 본 발명에 따른 자기 항체 접합체는 또한 이들의 높은 특이성 때문에 특히, 예를 들어 HLA타이핑에서 진단방법의 한 부분으로써 또는 진단 보조제로 유익한 것으로 입증됐다.
본 발명에 따른 자기 항체 접합체의 제조는, 골수세포에 대한 다양한 모노클로날 항체에 대해서 및 폴리클로날 래빗 면역 글로불린에 대해서 이후의 실시예를 통해 기술되지만, 상기 실시예가 본 발명을 제한하진 않는다. 또한, 골수세포의 고갈을 위해 제조된 자기 항체 접합체의 실시예 용도는 마찬가기로 실시예를 통해 기술했으며, 상기 실시예에 대한 용도에 제한을 두지 않았다.
일반식(Ⅰ)의 자기 단백질 접합체 제조방법:
적절한 용매 중에서, 아미노 그룹을 갖는 자기 입자 M을, 아미노 그룹과 반응하는 일반식(Ⅰ)의 할로게노아실 스페이서 화합물과 반응시켜 아미드 결합을 생성시킴으로써, 일반식(Ⅲ)의 화합물을 수득하며, 이를 예를 들어, 생리학적 염용액 또는 인산염-완충시킨 염용액과 같은, 단백질을 변성시키지 않는 적절한 수성 염-함유 용매 중에서, 설프하이드릴 그룹을 갖는 단백직 P와 반응시켜 일반식(Ⅰ) 화합물을 수득하고, 이후 생성된 일반식(Ⅰ)의 화합물을 예를 들어, 트윈(Tween) 같은 적절한 계면 활성제를 가하여 존재하는 어떤 비-공유적으로 결합한 단백질을 제거한다.
Figure kpo00001
M-NH-CO-(CH2)n-X (Ⅲ)
상기식에서,
n은 1 또는 2이고,
X는 염소, 브롬 또는 요오드 원자이다.
일반식(Ⅱ)의 화합물과 자기 입자의 결합에 적합한 용매는 사용된 용매에 의해 각각의 경우 결합을 위해 사용된 자기 입자의 물리적 특성 및 자기특성, 특히 크기, 분산성 및 이들의 표면 특성등에 손상을 끼치지 않는 조성이어야만 한다. 예를 들어, 유럽 특허원 제0125995 A2호 또는 WO 83033920에서 기술된 바와 같이 자기 입자에 적합한 용매의 예는 물과 디메틸 포름아미드의 혼합물로 밝혀졌다.
[결합도의 측정(항체 ug / 철 mg)]
철은 원자흡착으로 질소는 크젤다흘(Kjeldahl)방법으로 측정한다. 결합한 단백질 질소에 대한 값은 하기식으로 계산하였다.
Figure kpo00002
상기식에서의 용어는 하기 의미를 갖는다:
P - N : 단백질 질소
Tot - N : 총 질소
Fe : 철
입자에 결합한 단백질의 양(단백질 ug/ 철 mg)은 철 mg당 단백질 질소의 양에 인자 6.25를 곱하여 계산한다. 계산된 결합율은 표 1과 같다.
[세포고갈 방법]
염-함유한, 바람직하게는 생리학적 수용액 또는 체액 중에서 고갈시켜야할 세포 혼합물의 현탁액은 바람직하게 진탕시키면서 일반식(Ⅰ)의 화합물과 함께 적절한 온도 예를 들어, 0℃ 내지 40℃ 사이에서, 마찬기지로 바람직하게 멸균조건 하에서 적절한 기간 동안 배양시키고, 그후 자기 입자는 적절한 자석을 사용하여 용액으로부터 제거한다.
적절한 온도의 예로써는 0℃, 실온 또는 37℃이나, 실온이 바람직하다. 배양 지속 시간은 각각의 경우 사용한 배양 온도 및 항체의 결합 반응성에 의존하며 예를 들어 수분부터 2시간까지 가능하다. 배양은 바람직하게 예를 들어, 실온에서, 10 내지 20분간 실시한다.
[가용성 생체 유기분자의 분리법]
근본적으로 이 방법은 세포고갈 방법을 따른다.
[실시예]
하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하고자 하며 이에 한정되지 않는다.
상술한 방법 중에서 모노클로날 항체와 반응시킨 자기 입자는 이후로 각각의 경우 특정한 항체명을 접두시켜 나타낸 특이성과 함께 마그네토비드(magnetobead)로 명명한다.
[실시예 1]
유럽 특허원 제0125995 A2호에 기술된 자기 입자와 N-하이드록시 숙신이미딜 요오도아세테이트의 접합.
시판되고 있는 자기입자 (BioMag
Figure kpo00003
, Advabced Magnetics 제조)의 현탁액 4x300ul를 각각 매번 pH7.2의 10ml PBS(인산염 완충 염용액)로 3회 세척하고, 각각을 3ml의 PBS중에 재현탁시킨다. 이들 각각의 현탁액에 각각의 경우 2ml의 무수디메틸포름아미드중에서 신선하게 제조된 N-하이드록시숙신이미딜요오도아세테이트[참조:NHIA; Rector et al., J. Immunol. Meth. (1978), 24, 321-336]의 10mg 용액을 가하고 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 진탕시킨다. 3000xg에서 원심분리하여 입자를 제거하고 각각의 경우 매번 10ml의 PBS로 3회 세척하고 pH 7.2의 PBS용액 a) 5ml, b) 4.3ml c) 3.6ml d) 2.9ml에 재현탁시킨다.
[실시예 2]
유럽 특허원 제0125995 A2호에 기술된 자기입자와 N-하이드록시 숙신이미딜 브로모아세테이트의 접합.
접합은 N-하이드록시 숙신이미딜 브로모아세테이트(NHBrA)를 사용하여 실시예1과 유사하게 수행하며 NHBrA는 본문 중에서 렉토르(Rector)등의 방법에 의한 NHIA의 제조와 유사하게 제조 한다.
[실시예 3]
폴리클로날 래빗 항-마우스 면역글로불린(RAM)과 실시예 1에서와 같이 활성화된 입자의 결합.
인산염-완충시킨 염용액(500ul) 중에서 3mg의 폴리클로날 래빗 항-마우스 면역글로불린을 3mg의 디티오트레이톨과 혼합하고 실온에서 30분간 배양한다. 환원된 항체는, 인산염-완충시킨 염 용액 pH 7.2중에서 용출 용적 4.2ml로 세파덱스 G25(Sephadex G25)를 통해 겔 여과하여 분리시키고, 실시예 1에서와 같이 제조한 하기의 입자현탁액 a 내지 d에 가한다:
a : 첨가하지 않음(대조군)
b : 0.7ml 첨가(약 0.5mg의 단백질)
c : 1.4ml 첨가(약 1.0mg의 단백질)
d : 2.1ml 첨가(약 1.5mg의 단백질)
혼합물(각 5ml)을 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 배양한다. 입자를 3000xg에서 원심분리로 제거하고 매번 10ml의 PBS로 세척하며 pH 7.2인 PBS 5ml에 재현탁시키고 4℃에 보관한다. 분석 데이터는 표 1과 같다.
[실시예 4]
폴리클로날 래빗 항-마우스 면역글로불린(RAM)과 실시예 2에서와 같이 활성화시킨 입자와의 결합.
결합은 실시예 3과 유사하게 수행한다. 분석 데이터는 표 1과 같다.
[실시예 5]
모노클로날 항체 BMA 081(항-CD8; lgG2a)와 실시예 1에서와 같이 활성화된 입자의 결합.
PBS(500ul)중에서 2mg의 BMA 081을 1mg의 디티오트레이톨과 혼합하고 실온에서 30분간 배양한다. 환원된 항체는 인산염-완충시킨 식역수(pH 7.2)중에서 용출 용적 3.6ml로 세파덱스 G25를 통해 겔 여과하여 분리시키고 실시예 1에서와 같이 제조한 하기의 입자 현탁액 a 내지 d에 가한다:
a : 첨가하지 않음(대조군)
b : 0.4ml 첨가(약 0.2mg의 단백질)
c : 1.2ml 첨가(약 0.6mg의 단백질)
d : 2.0ml 첨가(약 1.0mg의 단백질)
상기 혼합물(각기 약 5ml)을 각각 실온에서 1시간 동안 진탕 배양한다. 그후 입자를 3000xg에서 원심 분리로 제거하고 매번 10ml의 PBS로 3회 세척하며 pH 7.2인 PBS 5ml중에 재현탁시키고 4℃에 보관한다. 분석 데이터는 표 1과 같다.
[실시예 6]
모노클로날 항체 BMA 0110(항-CD2; lgG2b)와 실시예 1에서와 같이 활성화된 입자의 결합.
결합은 실시예 5와 유사하게 수행한다. 분석 데이터는 표 1과 같다
[실시예 7]
실시예 5에서와 같이 제조한 마그네토비드를 이용한 단핵 세포로부터 CD+세포의 고갈.
단핵세포(mononuclesr cel :MNC)는 피콜(Ficoll)구배상에서 새롭게 제공된 사람의 혈액으로부터 공지의 방법으로 분리한다[참조:Boyum, Scand. J. Immunol. (1976), Suppl. 5, 9-15].
고갈시키기 위해서, 플리스틱 튜브(Falcon사 제품, No. 2051)에 들어있는. 1% BSA(w/v, Seromed 제품)를 함유한 2ml PBS중의 3 x 107MNC를 PBS중에서 2mg/ml 마그네토비드의 현탁액 1ml와 혼합하고, 계속 진탕하면서 실온에서 15분간 배양한다. 실시예 5에서 제조된 마그네토비드와 이에 결합한 세포는 영구 자석을 사용하여 제거한다. 현탁액에 잔존하는 세포들은 400 xg에서 펠렛화시키고, 적절한 매질 예를 들면, PBS 또는 RPMI 1640 중에 재현탁시킨다. 고갈 효율은 세포형광그래프(Ortho)에서 간접적인 면역 형광으로 결정한다.
이 목적을 위해, 한정된 세포군의 고갈 전후에, 1 x 106세포를 공지된 방법으로 1ug/ml 제1항체 BMA 031(베링베르케 AG 제조)로 표지하고 그후 20ug/ml 제2항체[래빗 항-마우스 면역글로불린, F(ab)2단편, (FITC-표지됨) 베링베르케 제조]로 표지하였으며, 세포형광그래프중에서 평가한바, 고갈 효율은 95% 이상인 것으로 결정됐다.
Figure kpo00004
RMA : 래빗 항-마우스 면역글로불린
폴리 : 폴리클로날
NHIA : N-하이드록시숙신이미딜 요오도아세테이트
NHBrA : N-하이드록시숙신이미딜 요오도아세테이트

Claims (19)

  1. 일반식(Ⅰ)의 자기 단백질 접합체.
    M-NH-CO-(CH2)nS-P (Ⅰ)
    상기식에서, n은 1 내지 6, 바람직하게는 1 또는 2, 특히 바람직하게는 1이고, M은 아미노 그룹을 갖는 분산성 자기반응성 물질 또는 입자이며, P는 단백질이다.
  2. 제1항에 있어서, 단백질 P의 설프하이드릴 그룹 하나 또는 그 이상이 천연의 상태로 존재하거나, 디설파이드 결합의 환원에 의해 생성되거나, 화학 반응에 의해 단백질에 도입된 자기 단백질 접합체.
  3. 제1항에 있어서, P가 폴리클로날 면역글로불린인 자기 단백질 접합체.
  4. 제1항에 있어서, P가 모노클로날 항체 또는 Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편인 자기 단백질 접합체.
  5. 제1항에 있어서, P가 항원, 또는 효소, 호르몬, 렉틴 또는 성장인자의 잔기인 자기 단백질 접합체.
  6. 제4항에 있어서, P가 lgG 또는 lgM 부류의 모노클로날 항체인 자기 단백질 접합체.
  7. 제4항에 있어서, P가 수성 염용액 또는 체액중에 용해된 형태로 존재하는 항원에 대한 모노클로날 항체인 자기 단백질 접합체.
  8. 제4항에 있어서, P가 세포상 특히, 척수 또는 임파계의 세포 또는 말초혈액 특히, B 임파구, T 임파구 또는 이들의 전구 세포의 세포상, 또는 종양 세포 특히, 골수의 종양 세포상에서 발현된 항원에 대한 모노클로날 항체인 자기 단백질 접합체.
  9. 제4항에 있어서, P가 박테리아, 마이코플라즈마 또는 원생동물 또는 그외의 바이러스상에서 발현되 항원에 대한 모노클로날 항체인 자기 단백질 접합체.
  10. 제1항에 있어서, P가 항원인 자기 단백질 접합체.
  11. 제1항에 있어서, M은 메탈 옥시이드 코어 및 아미노 그룹을 갖는 외피막을 지니는 분산성 입자이며, 이때, 상자성 물질의 그룹이 메탈 옥시이드 코어에 포함될 수 있는 자기 단백질 접합체.
  12. 제11항에 있어서, 입자의 직경이 약 0.1μ 내지 약 100μ, 바람직하게는 약 0.1μ 내지 약 1.5μ인 자기 단백질 접합체.
  13. 아미노 그룹을 갖는 자기 입자 M을 아미노 그룹과 반응하는 일반식(Ⅱ)의 할로게노아실 스페이서(spacer)와 반응시켜 아미드 결합을 형성시킴으로써 일반식(Ⅲ) 화합물을 설프하이드릴 그룹을 갖는 단백직 P와 최종적으로 반응시켜 일반식(Ⅰ) 화합물을 수득한후; 비-공유결합된 단백질을 세척하여 제거시킴을 특징으로 하여, 일반식(Ⅰ)의 자기 단백질 접합체를 제조하는 방법.
    M-NH-CO-(CH2)nS-P (Ⅰ)
    Figure kpo00005
    M-NH-CO-(CH2)n-X (Ⅲ)
    상기식에서, n은 제1항에서 정의한 바와 같고, X는 염소, 브롬 또는 요오드 원자이다.
  14. 일반식(Ⅲ) 화합물.
    M-NH-CO-(CH2)n-X (Ⅲ)
    상기식에서, M 및 n은 제1항에서 정의한 바와 같고, X는 염소, 브롬 또는 요오드 원자이다.
  15. 수성 염용액 또는 체액을 일반식(Ⅰ)의 적절한 자기 단백질 접합체와 함께 배양하고, 제거하고자 하는 성분을 특이적으로 흡착시킨후, 자기 단백질 접합체를 자기 장치를 이용하여 분리하고, 필요할 경우, 특이적으로 흡착된 성분을 자기 단백질 접합체로부터재용출시킴을 특징으로 하여, 수성 염용액 또는 체액으로부터 용해된 항원, 항체, 수용체, 기질, 보조인자 또는 탄수화물 결정인자를 제거하는 방법.
  16. 세포 현탁액을 일반식(Ⅰ)의 적절한 자기 단백질 접합체와 함께 배양하고, 제거하고자 하는 세포를 특이적으로 흡착시킨후, 자기 장치를 이용하여 자기 단백질 접합체를 분리하고, 필요할 경우, 특이적으로 흡착된 세포 또는 입자를 자기 단백질 접합체로부터 다시 분리시킴을 특징으로 하여, 수성 염용액 또는 체액으로부터 세포를 제거하는 방법.
  17. 제1항에 따른 자기 단백질 접합체를 함유하는 진단 보조제.
  18. 제16항에 있어서, 세포 제거가 골수 고갈(depletion)인 방법.
  19. 제17항에 있어서, HLA타이핑에 사용하기 위한 진단 보조제.
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