PT94398B - Processo para preparacao de conjugados proteinicos magneticos - Google Patents

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Peter Hermentin
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Behringwerke Ag
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Description

X presente isvasçãc refere-·· a conjugados proteínleos nagnítlaos ecs a f&resla geral Σ t
n - «a - co - Cca2>n - s - ? (i) na qual a · 1 a 6» de preferfncia a · 1 ea 2 « « especial a · 1, · Μ I van partícula ou snterial aagndtlco dlsperaanta» que possui grupo· aaizto» · P & uaa proteína· ? pode ser una proteína que apresenta naturalnenta os cn aala grupos tiol» ou na/qual esse· grupos foraa orlados através da redução de lijução dlsaulfídicas ou foral introduuidos através de reacção quíaic*· ? é β?. especial uaa iaunoglobulina ou ua radical de iunnoglobullna» txa anticorpo nonodonal ou ua fragaento ?ab» ?ab*» ou PCab*)^* ua «ntigéaio ou tra radical 2e θηeiaa» horsosa» lactlna ou factor do croaolaanto·
- 1 ? i prefertaala um Anticorpo «oaoclo» nal Aa elaaae Asa XgG ouXgs* aa aapacial «a anticorpo aonocXof nal AlrlglAo contra u» anti&inio qua aa encontra praeaate Aio» solvlAe noa llqulAos ozgSniooo ou aaaolaçAes salinas aquosa»* ou aa anticorpo aonoclonal AlrlglAo contra «* aatlgAuie expraejso eebraeúXnlas* seaAo assas cúlulas que/saprlasa o aatlgAnto a* oapaolaX oAlulas Ao aiataaa aiaXAl&a ca linfítleo* cAlalaa Ao sangao perlXlrleo* aa aapacial B-llafocitos» t»Xlnfocitoa oa saae cHaXas pracarssraa* oa aúXaXaa tuaorai·* «a aapaalaX eAluíaa toaoral· Aa aaAaXa Aaaaa* Teia «AXuXaa poAaa taabAa aritrocitoa* baotíriai» alcopXaasaa oa pretosoírioe* Bõ Sablte Aa^praaeate InvançXo Aovaa tsa&Aa aa» oa viras considerados ao ao ellulas*
X
Μ A Ao preferAasla aaa partícula Alapar» santa aaa núcleo Aa AadAo ostÚllee a aipáala aarolraBta apraaaataaAo grapoa aalao* poAaaAo o aSolèo Ao éxl&o oetAXlco en» globar aa grupo Aa aubatãncla· paraaagnítieas* Aa prafarAaala aaa partícula cujo Atlaetre so altas antra apràzXaaAaaaat· 0*1 ja · aproxiaaAaaeate /100 jc* aaa Ao preferencia antra aproxiuaAa^ santa 1*5 ja* m presente invenção refeca«ee ainda a ua pzocaeso para preparação da us conjugado proteico aagnftloo Aa fAraaXa geral X» baa como â utilização Aa aa conjugado Aa fúraula gorai X para alialnaçâo específica da diluías ou antigãaios* raceptorea* subetrctoe* co»factoras ou daterBinaatea blâia tos d» carbono solúvel· Ae ecluçAea salln&s aquosa ou ia líqul Aos orgânico·« bea coso A sua utilização no Sabito Aa AlagnúatL co* beacoso ea espacial a sua utilização para a deplaeçã» Aa aedula Aasea ou tlpiaaçso de £LA.
Ua transplante Aa cédula ús&ea ú* entre outros casos* no trataaento Ae Aataxulnadas foxaae Ae leueeala ou Aa panalelopatia (destruição Aa sednla Aaaaa) auites vezes a única possibilidade Ae trataaento* âoa casos da leueeala « d· certaa neoplaeias ilnfáidos, oe doente» tén até egora sido aub&atldes a usa radiação de todo o orgaaleao coa doeea extreaaBeufce elevados ®/ou a une quialoterapls agre salva· ^este tipo de fcrataaeato aSo deatruídso as oélulas~sã« da aedula óssea, as precursoras de todas as cílulaa nanguíneaa. 14eia, é reinfundlda so doente aodala Scnea de ua dador adequado, ds qual se laplantan as oéXula» no espaço aedular do receptor, possibilitando desta fam o âssenvàiviaonto da novo do siateaa henatopolético e iaupolégico. Kete processo é denominado transplante «Ιο^βηΙβο da nedur la 5o.ooa.
Reaponslvels pelo elevado risco dos trans plantes alegénloos de aedula 5asea são, entro outros os T-lin* fooltos do dador que sSo transferidos eoa s aedala dessa para o doente, s que reoo^haoea as células do receptor ooao estranhas • asei» as ataesa e destros»· Seta incoapatlhllidads da aedula que aultaa vexes p5a «a riaoo a vida do doente d denoalnada reacção graft-versus-hoat ou doença graft-vereus-host* (GVH3). Os riscos desta doença graft*versus«host* podes por ua lado ssr dialnufdos pelo fasto ds ss rsinfundlr so doente as possível uaa asdnla dessa sxactaassts tlplsada de ua dador adequado, de preferência de entre o circulo faailiar do doenteU ?or outro lado, pedea taahéa ser redaeidos através da elialnação selectiva de populaçSes oelularss indesejáveis, tais ooao os T~llnfeeitos do sedais éesaa do dador, antes da relnfusSo no doente· Esta ellainação das células T de dador pode ser fel' ta, por ezeaplo, através de lise seXeetlva das células * eliainar na presença do coaplsaente, ou através de destruição selsctiva das células ? cos o auxílio das chaaadas lausotoxlnas, oa através ds ua outro processo, por sxsaplo através da dspleoçãc oelulsr aagaétloa da aedala ésssa· *
Uaa tal deplecçSo celular da osdala dsut* poda ser re&lleada da fora* relativaaeata eiaplee, incubando n// Badala dssaa ooa aa anticorpo aoncolonal do ratinho, que por •xoaplo d dirigido eapeeialuente ooxxtra aa cilulaa Φ da aodolh éssea a que portanto apossa «· liga I* células Φ. Tala cllulan T ligada* ao* anticorpos aosoclonaiat do ratinho poda* aer aa» tão olisinada* nua segundo poseo, por axeaplo isoubosdo-aa coii iauaaglobulins anti-ratínho do coelho, çu* aa encontro ligada a partícula* aagaftica·, san&o detta fora* o* T~ltnfeeito* 11« gado* aspaolílocaast* ao aataxial aagaãtleo· paio ç» poda* «ar alialsado* da Badala Aaaaa coa «a aagneto (ver, * este rain» peite, Tarfedal at al·, Sranaplantatloa (1$87), <3, 366-371 o bibliografia aí citada).
For proeeseo «ailego^l taabfà- poeaível ellaiaar d* aadala 6***a outra* populaqSa* atlaXara·, talo aoao odlvla* tutorai*, o que ta* laporfetaeta para a.oheaada tranfiulantação autolégic* da^ sedala 6«**a (vár, a «ata ra*pai«« to, Svalbaia at al.', Canear Baaaarcb (1987), <?, 846-851 o bibliografia aí citada)· Sal eoso deeorito portiralheia at al·, ibld., o* anticorpo* aosoolonal* recoshscedore* da* célula* tonsurais poda» taabéa eer ligados direetauesta ds partículas asgnétieas, pelo oue deixa d* ser necessário o segundo anticorpo eeiaa referido (coelho acti-ratinbo)· processo eeiaa descrita da deplseção da aedala Sssea coa o auxílio da aatieorpoe Boooclocals ou pollelonals cu© se encontres ligado· a partículas magnéticas, é eiada salto recente e carece de desenvolviaanto posterior experiaentaçSo. is partícula* ss age. ética» adequadas para o efel to sao hoje ooaercializadaa sob as aaie diversas foruas, e e sua preparação foi cuneroeas veres descrita na bibliografia Ao patentes (ver p.e. Chagnoa et al·, EP 0125995 Λ2 (priorida4 de U5 *95991 de 12.O5-.85)» Advanced &egnetlce, ou Ughelstad •t al., tO 8303920 do 10.11.8?, 3Ι5ΤΕΓ). 1 respeito deates partículas magnética» sabe-se que são coapostos. por ua ndolec
I de dxido aetille», no qual poàea oetar substâncias paragagnitlcat, e»ndô o nácleo envolvido por una cápsula, que pode^aprih sentar grupos reactivoa, tala coao por exsaplo grupos aninofeallo, ealno, carboxilo, bidrixl, oa eulfidrilo, e que ^podea «er utillsadoa pare acoplar proteína» (Chagnon st al·, E? 0125995 12).
Saberes por sxcaplo que aa partículas apresentando grupos carboxllà pode* ssr levadas * reagir, na presença de uaagente 4a eoadenaeçSo, con os grupos aalao Ae proteínas {OSuigBOA et al·, S? £125995 A2).
Conhecida i teahia * aeoplaçào de protei nas a partículas uagnitlcas portadora* de grupos «sino, utillf fasenlo-ee s aeoplaçSo rea^ectivaaente atrevia doa grupos ealno (Chagnon et «X·· E? 0125995 12)·
Ssbt-se taabia que ea partículas portadoras de grupo· hidrixl podes ser ectlva&as atrevia de reacçl^ coa cloreto de p-tolusso-sulfonilo, e çae ea partículas asais aotlvadaa pedes aer levadas a reagir co^oe grupes aalne de proteínas (avelheis et al·, Câncer Research {19o7), a?, 346-351)·
Todos estes processos de acoplaçao tis es eosua o lacto de a proteína ser ligada às partículas atrevia doa seus grupos »iso· Se entanto, usa tal acoplarão atra| via dos grupos aaino pode ter grandes desvantagens co caso doa anticorpos aoaoclocals, pois desta forna © por vezes prejudicada 4 especificidade e & reactividaâe doe anticorpos· Isto i uaa consequincla do fa^to de inoa anticorpos os grupas aaino se encontrares distribuídos de forna por «saia dlser eetstiati ca por toda a aolicula, localla&ndowHt assla tasabia nos pontoa de ligação do entiginio dos fragnenfcos^rab, o que iaplica uaa perca d» especif Vaidade ea caso de cooplação através destes grupos «nino·
Saba-ae ainda çua oa anticorpo· ee po— dea fixarsebra aa partícula» aagnéticaa »♦« ligações çufsicaa» puraaaata por adaorção» Quendo ea partícula· m eompSsat d» m copollatarixado da aatirol * divinil-benaano qua contenha éxl&o da ferro» pol· cano ea sabe as proteinas llgaa-ae ' da for·· xdEo específica so polisatirano*
So entanto» taabéat neet» processo h£ qm contar eoa «taat par·· da éapaelfiaidad· a reactivl&a&e do anticorpo* ftata outra daavantagea lMpartant» desta procasao resida no entanto no facto da o« ^anticorpos ligados por adeor ção ae/libertara» da. boto darantS .a daplaeçS» da «adula danai podando portanto aar adalaiatrados ao doente durante a raiaffcsfe danedala daaaa daplacoioSada» ó <ua podarí* condoais s efeitaa aaaun&ãrica gravas an aspacial ea asso da ensaio terapêutico prévio ooa anticorpo· nonoolonais. Esta probleaa yê no entanto cacha eido» devendo aar ultrapassado através de -ligação covaiente dos anticorpos às partícula» uagnétleas*
£ taabén conhecido ςα· as partícula· aagnéticaa à basa da poliestireno têa a dasvaatagea da tenderes para a foraaçao de agregados» e ca ligara» de forna não específica às célplaa· ?artindo destas dedos conhecidos» constitui objectivo da presente invenção» o^eaanvolviaanto da un «étodo através do çuel os anticorpo» aonoclonaia eaja» acc piados às partículas da forna a) ooralecte a b) não através doe seus 5rapoo anino» ?or outra» palavras» o objetivoa da presente invenção consiste an descobrir ua processo da acopla Ção co çual não aejaa alta rado a os pontoe da ligação io antigénio no anvlcorpo» cu eaja» ea çae a acoplação io anticorpo seja falta fora i$« ventos de ligação do antigénio» objectivo da presente invenção é aolt oionada através ia preparação da conjugados proteínicos aagné ticos da féraula garal X
- 6 4 *
I «u — «ά — ?oi jã .-roposta * transf jrisção de ysrcí- j cuias na^nétícss que apresentes jruoofl aaino e.i articulas la»- j ti·· ;áfci ca a gue apresentea cono ;jru.-o reactivos funções nalei&ido» conju^ando-óõ coa protel.ia£> que a^r-eseaten /xu/os tiol, cacautrando-se oe _ra.3s tiol jí or.^inx ir.ee te ca ?roteina, ou sendo introdusidoe quiaidejseute ou produzidos através ca redução de libações di3sulf£áicfts existentes.
Verificou-se a^ora gue partículas Α’ΐ^ηέΐίcas gue aprssentaa cJxo èrupoe rs&ctivos grupos exino podea façil&ente ser transi orao^ne ea partículas xa^n^tlc&e que apresente» coxo grupos reactivos funções iodo-acetilo ou bxoxo-aeetilo. Tale partículas «So novas·
Fora alia disso» verificou-se que as partículas sagnétlcas coa funções iodo^acetilo ou? broxo-ecetilo ' pode» se» qualquer problaaa aer conjugadas co» protein&s que apresente» grupds. tiol» encontrando-·· ce grupos/tiol já origiaalaente nas proteina» ea/eeago Istródnxidos quiaiceaente ou produsidoe etrevisde redação de ligações disenlfídicas exiatex^tes.
Verifiepu—se ea especial que -as partículas aagnftloes oo» funções iodo-scotilo ou bro&e-acetllo pedra ser conjugadas era probleaas coa anticorpos aonoclonsis, se «e ligações diesulfídic&s entre cadeias do anticorpo fores transforaadas ea grupos 33 livres atr^véa de rtdaç“o velectiva» oç çuati pode» ser levados a reagir coa ae funções iodo—acetilo ou bi-oio-aoetilo &Π3 psxtículea eeguéticee 3e solo ® íorxar une ligação tio-éter. Lste tipo de acoplação dos a~tioarpo3 aonoclonais ãs partículas e iguel^ente novo.
— 9 —
Surpreonxenteceate, verificau-ae çue a /especificidade e reactividade doa anticorpos ligados às partícula» aagnéticae através de <ilações tio-éter s© -aaatês inalteradas, pois através úa acoplação ao «..ticorpo atrwér; m sua relão ce ,Λΰ-e ;.s; é n .dificcda ou ?re. uciocia a s u zcrc: íc li,açso íj cnli.é^ii. ;.qui rrciie uca *c:,ccial vcntagcn ir. . resenjte xnvençío riln..ivx.er*tô soa ^rocesros ie aco.Aq;*5o até s^ors c-n-fcecidos, not çu&ia, coníorae ac.ssis descrito, oo tnticorpos são aúlic^doa 80*02.'« ao. >artícules -sgnótlca» proce-co pu. >-ente • aieorçeo ou <través de reacção dos seus graoo8 sr.ino, .©lati vnr,e.-;te à f.u- oieçco aãaortivn, ?; .rcsente ii:v<;t»ç~o o. xnccnta uiiiõe a vnttaoen le os anticur/Ofí .-ertrt libados Ac/oarticult-e xagnéticas por vit. quínics, e uert»nto ziao pe -©. . ; ;.re£ df-a per uículaa çuaud.0 da utilisução dos conjugados de ítuLícor.-os, por exeaplo para a úeplecção da aedola 5'<?ea.
Para aléat dlsao, v-rif lcou-se que' a edaorção até agora por vezes não específica dos anticorpos és partículas pôde ser impedida owinvertida através da adição de ub detergente adequado»
Concluiu-se' ainda que o» conjugados de anticorpos Magnéticos a que sa refaze a presente invenção aão particular&enta vantajosos por eartaplo na-depl«cç5o da medula éssea, devido 2. sua «levada especificidade.
Verificou—ae taabén que os conjugados aaS&étloos de anticorpos azqu© se refere a/presente Invenção se revelas vant^jesoai devido à oua elevada ©specificiindc Casibéa ' ao Snbito da. ropeasos disgrísticoa -ou couo aeio de diagnéstico , ea especial por çxçaslo na tipi zação ELI.
processo >ara p.eparação ao» conjugados cargéticos de· anticorpos « qie s© r«fere & presente rnvenção é descrito ec «e^uida & título re ©xe&plo pars diferentes anticorpo» aonoclonsis, dirigidos c»ntra células d& medulo éesea, beu cóhq .-ara UAt· inuttôi.loVvliE.e ..oliclorel do coelto; co «Qt-.nto, oír referidos t-xevnlo ns® li-.itn^ c --r*-pente in/^nçêo· :ara eláa disso, é iguelxeute iescritr- β tícjlo le e<«iplo a utiliração doe con α;.Λάο» sr». a'ticor ce e-.-tioor.os ;'qÚ02 nos exeaplos |.s<r& a .tegiecçso :-e célales .«dulo 5 ren, sea Ii i·} ** ‘S 0 tar a sus. jciíia.jso so*, exez.-ta.* ti.Fíoo. ·.
s-Z *Ί . 1 ,-v r- A / r- »1 : Λ Ζ· ύ £ .1 £5*0 ri ta a titulo .-<- e.<e.«r>lo e cio“u *·♦. .'uotive io ’. i-_.-ç“c xi*sulí£dice do *s_*acer* atr&rée õe inoobeçõo co- iitioti\.-itol, aea no entanto liaiter e. pre senta icv-ençàc.
. rocesso pera urspararão de c jc^u^cbpí· proteínicoft α.-.gíiétic jc da fóraula geral ií
Sus solvente adeçuaioe, faae.n-ao reagir partícalaa assnátices _que apresectan grupos cdw, con ua. coaposto cpacer uciOcXm-ceHo ia ícr/.ula ^err.l II çue resji coa grupoa aalao
-χ x J?5-<=ap S—* * /
XI
-·%. /
V, zxa qual a » 1 ou 2, · 'X representa uk ãtouo d·' oloro, broao ou lodo, do aedo aforemr na* libação aoidica e «««ia/obter ua coapoato d* XÚrsauI* gerál III ~-v
III que por Xis se fss reagir- «uu »>1 * 5 Ãxtr» salino cdeçusdo, çne não provoca a desnaturação das piOteinat, tal coto por exeaplo solução ceuina Í.eioi50ica ou sue solução s-.lina tsxiodada coa foeí&toe, con una protela* :* çue apresente cruo2s tiol, de nodo a obter ua c/svosto da féraula oeral I, larsndo-se «a segui da o coaposto da fúraula geral Σ asssia .ootido ia 'roteina não ligada de foraa co valente, adicionando «a detergente adequado, p.e. Teeen.
Ga solventes adequados para a acopleção de um coaposto da fdrsals geral IX da partículas magndtlc» dava* ser constituído· d* tal forna que as /partículas sagafticos respeofcivaawabe ntilize&e para a accplaçSe s?s eajea prejudicada· paio solvente nas suas propriedades físicas e sagaf» tloss, as especial na,sua dimensão, oapaeldade de dispersão 9 estrutura ds superfície» Pãra as partículas sagaãtlcas, tais «oao foras descritas por paesaplo aaíP 0125995 12 cu to 0505923* descobri»-» co» solvente adequado per exemplo asa la tu» de ãgua · iíí satí T f nnieal ftt ' Λ
Peteralnacão do ama deaccplacãc £ag. deanfelccrpcZ» ds farreH ferro d dateradLnade por absorção at£* ales e o asatc pelo aítode £» fjeldabl* Os valores pera jis proteínas acopladas feran oeleuladoa segunde a fdrasla ug P-S ag fcMS ug/fot-C / (amostra) * / ../(controle), ag Pe ag Te ag Te na qual as abreviaturas t$s as seguintes definlçSes: j?~M - azoto da proteína
Tot~J» « azoto total
Fe · ferro
À quantidade de proteína ligada ds partículas (ug de proteina/ag de ferro) fel calculada a partir da quantidade de azoto proteico por ag de ferro, atrevia de multiplicação cos o factor 6,25. la Taxas de acoplação celcu ladas são apresentadas na Tabela 1·
- 10 Processo pax^a ?> he;lccção dc células:
Ihcuber una su3'*5nsão da ai© tura de células s suo^-ter a deoleoçSo nuas solução salina aquosa, de preferência fisíolS^ica, ou r.uz or^*r«ico, cor. as co-.-osto la férauls ;· ei’tl Σ, » una ve-sp^ríiSum «.IcguscI^ entre .or exemplo C°3 a 4, ^3, ie preferência sob agitação', e i^ualuente de prefe·' réneia ea coudiçÕeo estéreis, durante uo neriodo de tenpc adequado, e ea seguida separar as ..articulas d:iUnêtic.as da solução strrvéc dc u: sa^nebo tdeqoado·
Veapersturaa adequadas são exenolo os 0°C a temperatura anoiente ou 3^0, zsg de z-eferência. & teaperatur* ambiente. l duração da incubação depende seapre da temperatura de incubação eeleccionada e da resetividade de libação do anticorpo, e pode ir de por exe&.plo alguns aí nu tos, a por exce· pio 2 hora©· D· preferência fas-ce a in-cubação por exemplo & teaperatura ambiente, por exeaplo/durante ua período de t^mpo de 10 a 20 minutos· '
Processo sara isolamento da moléculas bio-orsãnic&g solúveis:
Ά·'
Sete processo segue eaieucíalaente o processo de deplecção daa células·
S£E&?LQ3
0« seguintes exemplos destinas—se a aelhop ilustrar a presente invenção, ©ea no entanto a linlter.
Is pârticulcs que foram levedes & reagir coo anticorpos ηοηοοίοηδίβ pelo processo acima descrito, passa:i « ©er âeaigaedae aagnetobeads*, 3endo a sua especificidade rcs^ectivsjiente ínàic&áa pelo aposição prévia da x^spectiva de·· cigruição do anticorpo·
Bxaaola 1»
Qonjugagfto de partícula» nagnitica» de acordo coa a BP 0125995 çon iodo-acetato d* B-hl&roglauoclnlaldllo * x 300 ul de ma auapenaSe ooaeralalisada da» partícula» aagndtieas (3102*8% Xdraaoed. tfaagetiaa) ío~ «u/respectlvasente lavado» } vexe» 00a r»»pectivaa»nte 1£ al c / da eolaaS» aaliaa taaponada «oa fosfato* da pB 7>2 (PB8)t a . z r»ap»etiTSB*nte ressaapeaaos aa 3 al da PBS. x esta* *uepen»ft»s fora» adicionada* rsapeetiraes*· aaa soIuqS» fsasea da 10 ag da ledo«e*stato daB-hidroaxeaoeiniaidila (B8XX. Beetor et «l.f d. Iaanaol. X*th« (199B)» J4» 32U9363 aa reepeetlvaaente 2 al da dia«tllfers«ald* anidra ve agitadas darsate 1 hora ft tsspe* ratara asbisate· Sepois eantxifugar as partículas a 3000 x gv lavar «oa reapootlvexent» 3 x 10 al da PBS a ressuspender «a
a) 5 al» b) *»5 al» ·) 5»6 al a d) 2,9 «1 da PBS* pfi ?,2.
££!«2Í2l2í goajugacib d» partícula* sagnítlca* da «corda coa a Jg. 91352% ooa broao-acetato da X-hldroxlgucolniad.dllo
X oonjusaç·^f*z<**« a* analogia oca o •xssplo 1, coa broao-acetato de B-hidroxisuccininidilo (SSBrl), «•ado a prsparaçSo de BBBrl efectuada «a analogia oca o procee•o de pr»p*raçSo da S3JA eegasdo 3ekter et »1·, ibid.
SasuâáJU
Xooplaggg-de ixunoglaballna polloloaal antl-ratlabo do coelho (ZXsQ ft» partíoulaa aotlvadaa d» acordo coa o exeaplo j
X 3 as de lBunoglobullna pollclonal astl-ratlnho do ooelho ex eolu$2o salina tsnpenada eoa fosfato* (500 al) juntar 3 ag da ditictoeitcl » incubar durante 30 aisutoj» • 12 4.
teaperatosa aabiente, Isolar a anfcioorpo redusldo por aelo do filtração coa gel etraTÍa i» Sephadex 025« aa solução aali» sa teaponada aos fosfatos d* pS 7,2, sua/voluaa d* eluição d* *,2 ulj «a seguida adicionar da seguinte fozaa da suspanadas da partículas a-d preparadas da acorda coa a exasplo li ai sea adição (controle) bi adição da 0,7 al (aprox, 0,5 ag da proteína) adição da 1,0 al (sprcx· 1,0 ag do proteína) dt adição de 2,1 al (aprox· 1,5 bfc ds proteína)·
Incubar as «ISturaa (respactiraaaata 5 al do oada) daraata respsetlvaasn&e 1 hora, M temperatura sabiente d sob agitação· Ba seguida centrlfugar aa partícula* a 5090 a g, lavar 3 rases oca respeetivuasnte 10 al da PB3, res* suspender aa 5 al da &B& da p8 7,2 a amsnassr a 0°C· Oa dados aaalltlees sã» apraaaatados aa Tabela 1·
Sxaaplo <t
Acoplssão da laugogloballna policlona! antl^gçtlnho do coalho (£1H) a partículas estiradas da acorda coa o exsaPlo 2
Á aeopleção faz-ae aa «nalogla coa o exesplo 3· Os dados analíticos são apresentado* na Tabela 1· j&csaplo 5t
Acoplado do anticorpo aonoclonal BSU 051 (anti—038¾ Igw2a) da partículas actlra&aa da acordo coa o axeyplo 1 â 2 ag d» Oõl ca FB3 (500 ul) juntar 1 mg is ditlotreltol e incubar durante 50 ainutos d teapax atura anbleate· Isolar o anticorpo reduzido por saio de filtração coa gel atrevia da Saphadex 025» ·» adução salina coa fosfato, da 7,2, nua rolaste da eluição de 5,6 nlj aa seguida adicio*
- 13 nar da se&uinte forxa ãa auepansSaa da partículas a-d preparadas da acordo/con o axaaplo 1:
i a* «« adição (controla) b; adição da 0*4 sl (aprox. 0*2 sg da proteina) cs adição da 1*2 al (aprox. 0*6 al da proteina) ds adição da 2*0 al (aprox. 1*0 ag da proteina)
Incubar aa aiaturaa (reapeotlvaaente $ al da cada) dosaste raspeotivaneute 1 hora» λ tesperatura. anbiente a sob agitação» Sa saguidn centrífuga? aa partículas a 3000 x g* lavar 3 vasas coa respectlvasest» 10 al da PBS* ressuspaads? ea 5 al da 283 da pS 7*2 a arnasanar a 4®G» Oa dadoa analíticos sã» apraaaatadoa na tabela 1»
SaSBlSLSl
JLcoplação do anticorpo sonooloasl ggi 0110 íantl-CD2i XgGg>) ia partícula» aotivadaa da acordo coa o axanplo 1 acoplação fes-aa ea analogia con o «espio/5* 03 dadoa analítico» são apresentado» na tabela 1»
Sxauplo 7t
Se?IcogSo da cálulag 008+ da oálulaa nononaolearas coa, os *aagnetobaeis» preparado» da acordo coa o exeaplo 5 ia cãlulee nononacleara» (í£S«) «So isolada? por processa aa ei Sê conhecido (3oyus, 3ôand. J. laauna. (19%·) > 3uppl. 2· 9-15) atra vás da ua gradiente de Fiooil* a partir da sangue banano doado de fresco.
Pera a deplecção nisturar 3 x 10? ea 2 al da P33 ©oa 1% da 33i <(p/v» 3ero«ad) aa tubinhoe d» plástico (?alcont 2?e 2551) coa 1 ol de una suspensão da 2 og/al d» aagnatobeads aa P3S, a incubar durante 15 ainatoa à teaperaturu
- 14 i;
}.
atbieata sob aâltação ooaetsafts· Ba seguida, «aparar A>a sagas- t tobeada preparados d* acordo cos o exeaplo 5 · s* odlalas * ele* ligadas» coa o auxílio de aagaeto peruaaeafce· Ae cálulaa resaaeseeates ea euapeaseo sao braasforaadaa e* *pelleta* a 400 g e reesusjxnea* asm selo aâe<esA®, por sxssplo P3S ou i?iíl 1640· A afleKfiola da dapleeçXo 4 detesalaa&a d* iauneíluoresotsela iadireota ao oitofluorograío (Ortho)·
Far* tal» xareeraa-se aate* « depois da depleeçta 1 x 10^ edlulas da uaa datenlnada população da oílulae οοικ 1 ag/al da astlaorpo prisírio BStA 031 (Behrlaswarka AG) · depois coa 20 ug/al ds aatloorpM eeeuadírlos (lsanogloboll&a aakl^rablidio do oealbo» fragseata 7 (ab)^* «areado oo» < 7190» BebrígeerU»)» pelo* proceaeos «a al ji eonheeido^ a / avaliaras-ae ao eitofluordgraío, tendo sido deteralsoda una efioifaela de depleeção da sal* da 95%·
Taxas da aooplsgso da diferentes *aagnetobeadaw preparados
Kxesplo Anticorpo Isotlpo ^dtodo da AooplapSo Texas ds aeoplaçfo proteina/ferro (ug/al)
5b ÀAa poly SíUTâ 7*
5e XAS poly 8SJA 136
5d S.AU poly &HJA 171
4b XAU poly SSBrA 98
4« poly 3Κ3ΓΑ 1*5
4d •ÍA+í áoly SH3rA 167
5b 3-iA 031 l6S2a HHJã 56
5« 3-a 031 IgG 2a SHJA 107
5d 3iíA 031 IgG2a 3HJA U3
6b ã4A 0110 IgG 2b SHJA 76
60 3sA OllO IgOSb SBJA 156
6d 3iIA 0110 IgG2b - 15 SHJA 135
ίλϋι Xauaosloballxut anti-ratinho do coelho polyj pollelcnal &Jli ledo-aoctato de S-hidróxlouceinlzldllo S&3^kt broao-aeatsto dc S-bidróxisaceifei&idile

Claims (4)

  1. Processo para prcparaçãsfds ua coajugs· do protcíaieo aagaftloo da ídraula garal X
    X - SS - 00 - (GSPa - S - P CX) oaraotsrls&do 90T se íasersa reagir partículas aagnítieas X que aprese&taa ue grupo aulno, coa oaa spaear· nalaiaídlco que reaja 00a grupo» aaino, da Xdrwula geral XX s
    Γ* w
    ú* } — '2?n
    II na qual a * 1 a 6, £e preferíneia η » 1 ou 2, a «a especial a · 1, e x re pre Beata ua áto-so d» cloro, broxo ou lodo, forcando oxa ligação aaídica, àe xodo a obter ax oocaposto da fór·· aula geral III
    M — FH - 03 — (0H2)n - X * 16 · (III) que ·· tas ea seguida re&glr coa asa proteína P apresentando grupos tiol» de r.oio a obter ua ooaposto da fÚraule deral X« lavando es seguida α ©ospoeto da fúrsala I asais octilo da pro*» teina/não ligada de fonut covalente.
    ί
  2. «. 2& Processe de acordo coa a reivindicação 1, caracterizado por se utlllsar uaa proteína <jue apresenta us grupo tiol·
  3. - 3* Processo de acordo «a a reivindicação 1, caracterizado por a protelas P eer usa ISEunosloballns policio· sal·
  4. - 4« Proceeeo de acordo co* a reivindicação 1, oerecterlx&do por a proteína P eer ua anticorpo acnoolonal, un Xra&eento ?abt Fab* ou ?(ba’)2> wa antigénio ou on radical de •nslsa, horaona, lectlna ou factor de creoclnento· ··
    Processo caracterizado por ? proteína ? classe des ou Ig*·.,» uc acordo coa a relvlniicBção 1, ser nu anticorpo ~onoclonal de
    Processo do acordo con a reivindicação 1, caracterizado por ser una partícula diopexwnte coa núcleo de 5x1do eetéllco e cápsula envolvente apresentando ^rupoa anl* no· •r»
    - 7a Proceaao de acordo coa a reivindicação I» o&r&cterisado por a ear una partícula dispareante com xuiclao da 5xido aatdlioo a oãpsula envolvente apresentando irosos anino» con u* diSnetro situado aproxio&d&aeate 0,1 ,μ e apraxiaadaaa&te 100 ja*
    X requerente reivindica a prioridade do pedido alesS» apresentado an 19 de junho de 1969, sob o »&
    P 39 19 675.1·
    Lisboa» 18 de Junho de 1990
    Η E S ϋ ií Ο *?ROCBSQQ PARA P?t£PAaAÇÃQ Βώ CQNJOvAPQS PRQT.1íXH1QO5. uIAtjRjSTIgQ^.1
    A invenção refere-se a un processo para i a preparação de tua conjugado magnético da fónuula geral I tf - NH - 00 - (CH2)n - S - Ρ (I) que compreende fazerem-se reagir partículas magnéticas tf que ‘ apresentam um grupo amino , com uma spacer* maleimídico que reaja com grupos amino, da fórmula geral II — C-^G—(σΗ2)η - X
    II na qual n - 1 a 6, de preferencia η * 1 ou 2, e em especial η - 1, e X representa um étomo de cloro, bromo ou iodo, formaido uma ligação amídica, de modo a obter um composto da fórmula geral III tf - iíH - 00 - (CH2)n - X (III) que se faz em seguida reagir com uma proteina P apresentando grupos tiol, de modo a obter um composto da fórmula geral I, lavando em seguida o composto da fórmula I assim obtido da pro teina não ligada de forma covalente.
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