ES2881603T3 - Método para inactivar xenoantígenos en tejidos biológicos - Google Patents

Abstract

Método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos, particularmente en tejidos que pueden usarse para fabricar sustitutos bioprotésicos y/o en sustitutos bioprotésicos que ya están preparados y destinados para uso clínico humano o veterinario, caracterizado porque implica las siguientes etapas: - proporcionar una disolución a base de ácido cafeico para la inactivación de al menos parte del antígeno alfa- Gal en dichos tejidos; - incubar las muestras que van a tratarse en dichas disoluciones en condiciones controladas; - someter los tejidos tratados a una serie de lavados.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para inactivar xenoantígenos en tejidos biológicos

La presente invención se refiere a un método para inactivar xenoantígenos en tejidos biológicos, en particular para inactivar xenoantígenos en tejidos que pueden usarse para fabricar sustitutos bioprotésicos, destinados a su uso en el campo clínico humano o veterinario.

En particular, la invención se refiere a un método para asegurar la inactivación de xenoantígenos en tejidos conjuntivos nativos y/o fijados, heterólogos u homólogos, en particular del epítopo alfa-Gal, en particular en tejidos cardiovasculares mediante el uso de actividades biológicas identificadas en compuestos fenólicos, compuestos polifenólicos y derivados de los mismos.

La producción de sustitutos bioprotésicos es actualmente un mercado en importante expansión. La mejora clínica de los procedimientos quirúrgicos, la disminución de las complicaciones posquirúrgicas, el desarrollo y manejo de nuevos medicamentos inmunomoduladores, combinados con un conocimiento más profundo de los mecanismos de interacción entre injerto y huésped, contribuyen a facilitar, en la medida de lo posible, al uso de prótesis biológicas constituidas por tejido animal u homólogo. En este sentido, un sector representativo pero no limitativo es el sector cardiovascular, especialmente en cuanto al impacto social y sanitario que puede ocasionar la práctica establecida de reemplazo de válvula cardiaca.

La tecnología biomédica puede desarrollar y aplicar quirúrgicamente, con fines de reemplazo, prótesis valvulares que pueden imitar la función de apertura y cierre de válvulas nativas disfuncionales.

Las prótesis valvulares ideales deben poder permitir un flujo transválvula que pueda superponerse al de la válvula analógica original sana, asegurar una larga vida útil y no generar efectos hemolíticos o trombogénicos. Los sustitutos valvulares que se usan con mayor frecuencia son las prótesis biológicas derivadas de tejidos xenogénicos, en particular de válvulas de cerdo o válvulas producidas con pericardio bovino o equino.

Tales prótesis y sustitutos valvulares tienen el inconveniente de que experimentan procesos degenerativos de calcificación distrófica y/o deterioro con rotura de las valvas, presentando una mayor sensibilidad frente a la aparición de infecciones endocárdicas. Con el fin de mejorar sus características mecánicas, disminuir su antigenicidad intrínseca y permitir su conservación, se tratan habitualmente con agentes químicos reticulantes/esterilizantes tales como, con el fin ejemplo no exclusivo, glutaraldehído. Además pueden someterse a tratamientos según protocolos de descalcificación o desintoxicación.

El término “tejido xenogénico” significa un tejido que pertenece a un organismo de una especie distinta a la humana; tales materiales tienen antígenos de superficie específicos que son tolerables dentro de la especie de origen, pero que son incompatibles cuando se implantan en seres humanos donde, si no se tratan adecuadamente, pueden desencadenar la activación de la cascada del complemento con agregación plaquetaria, produciendo una situación similar a la que se produce en el caso de una incompatibilidad de grupo sanguíneo.

Tal fenómeno se conoce con el término “rechazo hiperagudo”. La principal causa del inicio de tal mecanismo es la presencia del xenoantígeno alfa-Gal. Este epítopo es un di-galactósido (galactosa-alfal,3-galactosa) presente en glicoproteínas y glicolípidos de membrana (principalmente de células endoteliales), así como en diferentes tipos de células tales como monocitos, granulocitos y glóbulos rojos y en importantes distritos tisulares tales como las regiones miocárdica y ósea. Tal antígeno crucial se expresa constitutivamente en todos los mamíferos, excepto en los primates superiores y en los seres humanos.

El cuerpo humano, desde el nacimiento, expresa anticuerpos dirigidos contra tal epítopo como resultado de la estimulación continua de la flora bacteriana intestinal.

En la actualidad, la biocompatibilidad de los tejidos xenogénicos destinados para su uso en la fabricación de bioprótesis se obtiene mediante el tratamiento con el glutaraldehído mencionado anteriormente.

A pesar de tal procedimiento, se ha demostrado que el epítopo alfa-Gal sigue siendo sensible en los sustitutos valvulares comercializados actualmente, provocando, después del implante, un aumento de los anticuerpos antialfa-Gal circulantes tanto en pacientes pediátricos como en adultos.

Además, el complejo antígeno-anticuerpo que se forma parece estar directamente implicado en promover el depósito de sales de calcio, favoreciendo la formación de episodios de calcificación distrófica de la válvula. El documento US 2015/087611 A1 da a conocer métodos para estabilizar implantes elaborados de tejido conjuntivo mediante el tratamiento del tejido conjuntivo con compuestos fenólicos que incluyen: ácido tánico, taninos, hidroxitirosol, oleuropeína.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos que puede superar las limitaciones de los tratamientos convencionales.

Dentro de este objetivo, un objeto de la invención es proporcionar un método, tal como se define en la reivindicación 1, que puede aplicarse a tejidos conjuntivos que son nativos y/o fijados, heterólogos u homólogos, que puede usarse para fabricar sustitutos bioprotésicos, para su uso en el campo clínico humano o veterinario. Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método, tal como se define en la reivindicación 1, para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos que está adaptado para asegurar la inactivación del epítopo alfa-Gal en tejidos cardiovasculares.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método, tal como se define en la reivindicación 1, para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos con el cual inactivar los epítopos mencionados anteriormente asegurando así un tratamiento eficaz que puede aplicarse a los diversos tipos de sustitutos bioprotésicos actualmente en el mercado.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método, tal como se define en la reivindicación 1, que no favorezca, después de un implante, un aumento de anticuerpos anti-alfa-Gal circulantes.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método, tal como se define en la reivindicación 1, que no promueve el depósito de sales de calcio, limitando por tanto la formación de episodios de calcificación distrófica de la válvula.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método, tal como se define en la reivindicación 1, que puede llevarse a cabo con dispositivos y máquinas convencionales.

Este objetivo y estos y otros objetos que se harán más evidentes a continuación en el presente documento se logran mediante un método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos, particularmente en tejidos que pueden usarse para fabricar sustitutos bioprotésicos y/o en sustitutos bioprotésicos que ya están preparados y destinados para uso clínico humano o veterinario, caracterizado porque implica las siguientes etapas:

- proporcionar una disolución a base de ácido cafeico para la inactivación de al menos parte del antígeno alfa-Gal en dichos tejidos;

- incubar las muestras que van a tratarse en dichas disoluciones en condiciones controladas;

- someter los tejidos tratados a una serie de lavados.

La divulgación también se refiere a un tejido conjuntivo obtenido con un método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos según la invención tal como se describió anteriormente, caracterizado porque tiene al menos parte del componente antigénico en forma inactiva.

La divulgación también se refiere a un uso de tejido conjuntivo, obtenido con un método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos según la invención tal como se describió anteriormente, para la fabricación de sustitutos bioprotésicos y/o partes de sustitutos bioprotésicos que ya están preparados, para su uso en el campo clínico humano o veterinario.

La invención también se refiere a un kit para llevar a cabo un método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos según la invención como se describió anteriormente, caracterizado porque comprende al menos:

- uno o más recipientes que contienen el tampón en el que va a disolverse la dosis más adecuada de ácido cafeico;

- uno o más recipientes que contienen la dosis de ácido cafeico en forma de polvo que va a combinarse con el tampón;

- uno o más recipientes que contienen los tampones de lavado;

- un folleto de instrucciones que contiene la descripción de los tiempos y modos de aplicación del procedimiento.

Características y ventajas adicionales de la invención resultarán más evidentes a partir de la descripción detallada que sigue de una realización preferida, pero no exclusiva, del método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos según la invención. En los dibujos adjuntos:

- la figura 1 es una vista de los resultados, en porcentajes, de la aplicación de un método según la invención en una primera variación de aplicación del mismo;

- la figura 2 es una vista de los resultados, en porcentajes, de la aplicación de un método según la invención en una segunda variación del mismo;

- la figura 3 es una vista de los resultados, en porcentajes, de la aplicación de un método según la invención en una tercera variación del mismo;

- la figura 4 es una vista de los resultados, en porcentajes, de la aplicación de un método según la invención en una cuarta variación de aplicación del mismo.

Definiciones

El término “compuestos fenólicos” se refiere a moléculas caracterizadas, al menos en parte de las mismas, por la presencia de un núcleo aromático (anillo de benceno) unido a uno o más grupos funcionales hidroxilo. Los compuestos mencionados anteriormente incluyen, a efectos de ejemplo no exclusivo: fenoles simples (moléculas con un solo anillo de benceno y que contienen solo grupos hidroxilo como sustituyentes, por ejemplo, fenol e hidroquinona), aldehídos fenólicos (que contienen tanto el grupo fenólico como el grupo aldehído, por ejemplo, aldehído vainíllico), ácidos fenólicos (por ejemplo, ácidos cinámicos), fenilaminas (moléculas anfóteras que contienen un grupo débilmente ácido y un grupo fuertemente básico, por ejemplo fenilalanina), compuestos fenólicos (el anillo fenólico está unido a otro anillo de benceno o a otros compuestos heterocíclicos que tienen grupos funcionales hidroxilo/lactona/cetona, por ejemplo, cumarinas y xantonas), flavonoides (constituidos por dos anillos de benceno conectados por una cadena con tres átomos de carbono que constituye un anillo heterocíclico oxigenado, por ejemplo, catequinas, flavononas, flavonas, calconas, flavanonoles, flavonol, leucoantocianidina, antocianidina), fenilpropanoides (caracterizados por la presencia de un anillo aromático con una cadena lateral alifática con tres átomos de carbono, es. ácidos hidroxicinámicos) y taninos. En la presente invención, los términos “fenoles” y “polifenoles” pueden tener el mismo significado y pueden usarse juntos o como sustitutos entre sí para los objetivos establecidos. En el método y kit según la invención, se usa ácido cafeico.

El término “xenoantígeno” se refiere a moléculas de origen animal que puede reconocer el sistema inmunitario y pueden inducir una respuesta inflamatoria/mediada por el sistema inmunitario/anticuerpo en el organismo huésped humano. En la presente divulgación, los términos “xenoantígeno”, “antígeno”, “antígeno xenogénico”, “epítopo” y “antígeno crucial” pueden tener el mismo significado y pueden usarse juntos o como sustitutos entre sí.

El término “tejido conjuntivo” comprende, entre otros: vasos, válvulas cardiacas, tendones, ligamentos, pericardio, fascias musculares, duramadre, membrana timpánica, submucosa intestinal, cartílago, tejido adiposo y tejido óseo.

El término tejidos “fijados” comprende tejidos sometidos a la acción de agentes químicos o biológicos tales como, a efectos de ejemplo no limitativo: glutaraldehído, formaldehído y quercitina.

El término tejidos “fijados” comprende tejidos que, sometidos a la acción de agentes químicos o biológicos, desarrollan reticulaciones intra-tisulares con la función de estabilizar estructuras proteicas, lipídicas y celulares así como disminuir la potencial acción antigénica del huésped. En la descripción de la presente invención, los términos “fijado” y “reticulado” pueden describir un mismo tipo de tratamiento y/o tener el mismo significado y pueden usarse juntos o como sustitutos entre sí.

El término tejidos “heterólogos” significa tejidos de origen no humano. Tales tejidos pueden presentarse para su uso clínico como nativos o no tratados, en lugar de someterse a tratamientos que potencien sus propiedades regenerativas (tales como, a efectos de ejemplo puramente ilustrativo, procedimientos de descelularización o procedimientos de recubrimiento/absorción de sustancias prorregenerativas/conservantes para el componente celular). En la descripción de la invención, el término “heterólogo” puede tener el mismo significado que “xenogénico”, y pueden usarse juntos o como sustitutos entre sí.

El término tejidos “homólogos” significa tejidos de origen humano. Tales tejidos pueden presentarse para su uso clínico como nativos o no tratados, en lugar de someterse a tratamientos conservantes (tales como, a efectos de ejemplo puramente ilustrativo, crioconservación) o tratamientos que potencian sus propiedades regenerativas (tales como, a efectos de ejemplo puramente ilustrativo, procedimientos de descelularización o procedimientos de recubrimiento/absorción de sustancias prorregenerativas/conservantes para el componente celular).

El término “procedimientos de descelularización” significa todos los tratamientos individuales o múltiples que usan, como ejemplos no limitativos, soluciones salinas (hiper, iso o hipotónicas), disoluciones detergentes (iónicas, no iónicas o bipolares) y enzimas, y cuya finalidad es la retirada parcial, selectiva o total del componente celular presente en el tejido original.

El término “sustitutos bioprotésicos” identifica dispositivos biológicos que están adaptados para sustituir una parte faltante del organismo (una extremidad, un órgano o un tejido) o para integrar una parte dañada, destinados para uso clínico humano o veterinario. En la descripción de la presente invención, los términos “sustitutos bioprotésicos”, “bioprótesis”, “prótesis biológicas” o “dispositivo” pueden tener el mismo significado y pueden usarse juntos o como sustitutos entre sí.

El término “animal con genes inactivados para el antígeno alfa-Gal” significa un animal en el que se ha silenciado el gen que codifica para la enzima alfa-galactosiltransferasa. Tal enzima es responsable de atacar las glicoproteínas y lipoproteínas de la membrana del epítopo alfa-Gal. Su ausencia provoca la producción de tejidos que carecen por completo del epítopo en cuestión y que, a este respecto, son totalmente comparables al tejido del cuerpo humano. En la presente invención, se han usado tejidos vasculares de animales con genes inactivados para el antígeno alfa-Gal como control negativo absoluto.

A continuación se muestran algunos ejemplos no limitativos de aplicación del método según la invención.

Un método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos según la invención, particularmente en tejidos que pueden usarse para fabricar sustitutos bioprotésicos y/o en sustitutos bioprotésicos que ya están preparados y destinados para uso clínico humano o veterinario, caracterizado porque implica las siguientes etapas:

- proporcionar una disolución a base de ácido cafeico para la inactivación de al menos parte del antígeno alfa-Gal en dichos tejidos;

- incubar las muestras que van a tratarse en dichas disoluciones en condiciones controladas;

- someter los tejidos tratados a una serie de lavados.

El método también comprende un procedimiento posterior para evaluar la inactivación eficaz del epítopo alfa-Gal mediante la comparación de tejidos tratados/no tratados y tejidos porcinos con el gen de la enzima alfagalactosiltransferasa inactivado.

Un procedimiento de este tipo puede proporcionarse, por ejemplo, tal como se da a conocer en la patente italiana n.° 0001409783 y en el documento EP2626701.

Los tejidos biológicos están constituidos por tejidos conjuntivos que pueden ser nativos, o nativos y fijados, o fijados.

Los tejidos biológicos pueden ser heterólogos u homólogos.

Las condiciones controladas de la etapa de incubación comprenden al menos un tratamiento a la temperatura de 40±2°C.

Un método para inactivar xenoantígenos en tejidos biológicos según la invención, es decir, tejidos que pueden usarse para fabricar sustitutos bioprotésicos, se aplica a la inactivación del epítopo alfa-Gal en tejidos que constituyen los siguientes modelos de sustitutos bioprotésicos:

- válvula cardiaca porcina Hancock II™ (mod. T510, Medtronic Inc., Mineápolis, EE.UU.) indicada en las figuras como “HANCK”;

- válvula cardiaca de raíz aórtica Freestyle® (mod. 995, Medtronic Inc., Mineápolis, EE. UU.) indicada en las figuras como “FREE”;

- Carpentier-Edwards S.A.V. (mod. 6650, Edwards Lifesciences LCC, California, EE. UU.) indicado en las figuras como “SAV”;

- Carpentier-Edwards Perimount Plus (mod. 6900P, Edwards Lifesciences LCC, California, EE. UU.) indicado en las figuras como “PERI”;

- parche cardiovascular CardioCel (mod. C0404, Admedus Regen Pty Ltd, Perth, Australia) indicado en las figuras como “CC”.

El método para inactivar epítopos de alfa-Gal en muestras de sustitutos bioprotésicos se describe a continuación en los detalles de una realización.

Las muestras de tejido se toman de los sustitutos bioprotésicos según los modelos mencionados anteriormente disponibles actualmente en el mercado. Tales muestras se pesan húmedas después de secarlas con papel de filtro ligero (intervalo de 30 a 50 mg) y se cortan en trozos pequeños para aumentar su superficie de exposición. Para cada sustituto bioprotésico, se preparan 4 conjuntos diferentes de muestras (n = 8 para cada conjunto). Cada conjunto se someterá a un método diferente.

Se preparan 4 disoluciones diferentes a base de derivados fenólicos, correspondientes a 4 variantes diferentes de aplicación del método según la divulgación, a las que se someterán las muestras en un volumen final de 5 ml, específicamente:

- método T1 (según las reivindicaciones): ácido cafeico a una concentración comprendida entre 5 mM y 50 mM (en la invención se adoptó la concentración de 20 mM)/tampón de fosfato de sodio con 600±50 U/ml de tirosinasa en una razón de [1:20];

- método T2 (según las reivindicaciones): ácido cafeico a una concentración comprendida entre 5 mM y 50 mM (en la invención se adoptó la concentración de 20 mM) en 0,2±0,1 M de NaOH;

- método T3 (no según las reivindicaciones): ácido tánico a una concentración comprendida entre 0,1 M y 1,5 M (en la divulgación se adoptó la concentración de 1 M) en un tampón de fosfato de sodio;

- método T4 (no según las reivindicaciones): hidroxitirosol a una concentración comprendida entre 0,3 mM y 10 mM (en la divulgación se adoptó la concentración de 6 mM) en 0,2±0,1 M de NaOH.

Estas disoluciones se dejan actuar con agitación moderada pero constante durante un total de 12±2 horas a la temperatura de 40±2°C.

Al final de la incubación, las muestras se someten a dos lavados con disolución isotónica, de 15 minutos de duración cada uno, y un tercer lavado en un tampón dedicado (TP) de 15 minutos de duración.

La evaluación de la presencia de cualquier epítopo todavía activo en la superficie de las muestras tratadas se basa en una modificación del método ilustrado por los inventores y descrito en la patente italiana n.° 0001409783 y en el documento EP2626701.

Brevemente, las muestras de tejido tratadas y lavadas se colocan en tubos de ensayo a los que se añade tampón TP hasta un volumen final comprendido entre 1000 ul y 1500 ul.

Luego se añade un anticuerpo monoclonal de ratón, dirigido contra el epítopo alfa-Gal (en el presente ejemplo, se trata de un clon de IgM denominado M86), a la concentración preferible de [1:50] v/v y el conjunto se incuba durante 120±10 minutos a 37±2°C con agitación constante pero moderada.

Al final, las muestras se someten a centrifugación a 14.750 x g durante 30±5 minutos a temperatura ambiental. Durante la incubación con el anticuerpo M86, se prepara una placa de 96 pocillos, en la que el fondo de los pocillos se recubre con 100 ul por célula de alfa-Gal/albúmina sérica a 5 ug/ml en tampón fosfato. La placa así preparada se incuba durante 60±10 minutos a una temperatura comprendida entre 30°C y 40°C, aunque es preferible estabilizar todo a 37°C. Luego se realizan 3 lavados con 300 ul por pocillo de tampón fosfato a temperatura ambiental.

El primer lavado se deja actuar durante 5 minutos, los dos lavados posteriores durante 3 minutos.

El bloqueo se realiza con 300 ul por pocillo de albúmina sérica, seguido de incubación durante 60±10 minutos a temperatura ambiental, en la oscuridad. Posteriormente se realizan 3 lavados como antes.

Para cada pocillo individual, se añaden 100 ul de sobrenadante, tomado después de la centrifugación de cada muestra tratada.

Las muestras se cargan en la placa, ocupando cada tipo de muestra los pocillos de una columna completa. Sigue la incubación de la placa durante 120±10 minutos a una temperatura comprendida entre 30°C y 40°C, aunque es preferible estabilizar todo a 37°C.

Luego se realizan 3 lavados como antes y se añaden 100 ul por pocilio de una disolución de anticuerpo secundario (anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de ratón) conjugado con enzima peroxidasa (se ha encontrado que las disoluciones ideales de tal anticuerpo son [1:1000], [1:500] y [1:100], preferiblemente se adoptó la intermedia [1:500]).

Luego vuelve a incubarse la placa durante 60±10 minutos a una temperatura comprendida entre 30°C y 40°C, aunque es preferible estabilizar todo a 37°C.

Luego se realizan 3 lavados como antes. Se añaden 100 ul por pocillo de una disolución de desarrollo para la enzima peroxidasa, seguido de la incubación de la placa durante 5±1 minutos en la oscuridad.

Posteriormente, se añaden 50 ul por pocillo de una disolución de parada constituida por H²SO⁴2M, y luego se lee la placa en un lector de placas a 450 nm.

El porcentaje de inactivación del epítopo en cuestión puede determinarse mediante comparación entre el número de epítopos obtenidos: en un tejido de control constituido por tejido vascular de animales con el gen del antígeno alfa-Gal inactivado, en tejidos bioprotésicos no tratados y en los tejidos sometidos a los diversos tratamientos descritos anteriormente.

Resulta evidente a partir de la figura 1 que el método en su variación de aplicación T1 muestra una marcada variabilidad de efecto según los diversos tejidos bioprotésicos tratados.

El método T1 ha mostrado una eficacia marcadamente menor que los otros protocolos estudiados, mostrando como su mejor resultado una inactivación limitada a aproximadamente el 43% de los epítopos.

En la figura 2 puede observarse que el método en su variación de aplicación T2 con ácido cafeico solo presenta una excelente acción inactivante frente al antígeno, con porcentajes de inactivación comprendidos entre el 90% y el 98%, similar al resultado mostrado por el método en la variación T3 (figura 3, porcentajes de inactivación comprendidos entre el 80% y el 100%) y variación T4 (figura 4, porcentajes de inactivación comprendidos entre el 89% y el 95%).

La divulgación también se refiere a un tejido conjuntivo obtenido con un método tal como se describió anteriormente.

Un tejido conjuntivo de este tipo se caracteriza porque tiene al menos parte del componente antigénico en forma inactiva.

La divulgación también se refiere a un uso del tejido conjuntivo tal como se describió anteriormente, para la fabricación de sustitutos bioprotésicos y/o partes de sustitutos bioprotésicos que ya están preparados, para su uso en el campo clínico humano o veterinario.

La invención también se refiere a un kit para llevar a cabo un método para inactivar xenoantígenos en tejidos biológicos tal como se define en la reivindicación 5. j

El uso previsto del kit está dirigido al tratamiento autónomo de sustitutos bioprotésicos que ya están preparados, con un método según la invención tal como se describió anteriormente, útil para instalaciones sanitarias como clínicas y hospitales.

En la práctica, se ha descubierto que la invención logra totalmente los propósitos y objetivos previstos.

En particular, con la invención se ha ideado un método para inactivar el epítopo alfa-Gal en tejidos destinados a la producción de sustitutos bioprotésicos para uso clínico y/o veterinario.

Además, con la invención se ha ideado un método para inactivar los antígenos mencionados anteriormente, asegurando así un tratamiento eficaz que puede aplicarse a diversos tipos de bioprótesis de tejidos actualmente en el mercado.

Por tanto, con la invención se ha ideado un método que puede potencialmente no provocar, después de un implante de un tejido tratado con tal método, un aumento de los anticuerpos anti-alfa-Gal circulantes.

Además, con la invención se ha ideado un método que puede limitar el depósito de sales de calcio, no favoreciendo, por tanto, la formación de episodios de calcificación distrófica de la válvula.

Por último, pero no menos importante, con la invención se ha ideado un método que puede llevarse a cabo con dispositivos y máquinas convencionales.

En la práctica, los componentes y los materiales empleados, siempre que sean compatibles con el uso específico, y las dimensiones y formas contingentes, pueden ser cualesquiera según los requisitos y el estado de la técnica.

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Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos, particularmente en tejidos que pueden usarse para fabricar sustitutos bioprotésicos y/o en sustitutos bioprotésicos que ya están preparados y destinados para uso clínico humano o veterinario, caracterizado porque implica las siguientes etapas:

- proporcionar una disolución a base de ácido cafeico para la inactivación de al menos parte del antígeno alfa-Gal en dichos tejidos;

- incubar las muestras que van a tratarse en dichas disoluciones en condiciones controladas;

- someter los tejidos tratados a una serie de lavados.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos tejidos biológicos están constituidos por tejidos conjuntivos nativos, o nativos y fijados, o fijados.

3. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichos tejidos biológicos son heterólogos u homólogos.

4. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichas condiciones controladas comprenden al menos un tratamiento a la temperatura de 40±2°C.

5. Kit para llevar a cabo un método para inactivar el antígeno alfa-Gal en tejidos biológicos según una o más de las reivindicaciones 1 a 4 anteriores, caracterizado porque comprende al menos:

- uno o más recipientes que contienen el tampón en el que va a disolverse la dosis más adecuada de ácido cafeico;

- uno o más recipientes que contienen la dosis de ácido cafeico en forma de polvo que va a combinarse con el tampón;

- uno o más recipientes que contienen los tampones de lavado;

- un folleto de instrucciones que contiene la descripción de los tiempos y modos de aplicación del procedimiento.