IT201600115523A1 - Metodo per l'inattivazione ed il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni in alimenti di origine animale, particolarmente per latte e derivati, e in alimenti di origine vegetale, particolarmente per succedanei di latte a base di soia e/o riso - Google Patents

Metodo per l'inattivazione ed il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni in alimenti di origine animale, particolarmente per latte e derivati, e in alimenti di origine vegetale, particolarmente per succedanei di latte a base di soia e/o riso

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IT201600115523A1
IT201600115523A1 IT102016000115523A IT201600115523A IT201600115523A1 IT 201600115523 A1 IT201600115523 A1 IT 201600115523A1 IT 102016000115523 A IT102016000115523 A IT 102016000115523A IT 201600115523 A IT201600115523 A IT 201600115523A IT 201600115523 A1 IT201600115523 A1 IT 201600115523A1
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Description

METODO PER L'INATTIVAZIONE ED IL CONTROLLO DI AVVENUTA INATTIVAZIONE DI XENOANTIGENI IN ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE, PARTICOLARMENTE PER LATTE E DERIVATI, E IN ALIMENTI DI ORIGINE VEGETALE, PARTICOLARMENTE PER SUCCEDANEI DI LATTE A BASE DI SOIA E/O RISO
DESCRIZIONE
Il presente trovato ha per oggetto un metodo per l'inattivazione ed il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni in alimenti di origine vegetale e animale.
In particolare, il trovato riguarda un metodo per l'inattivazione ed il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni in alimenti di origine vegetale e animale, in particolare dell’epitopo alpha-Gal, in particolare per latte vaccino intero, latte di soia e latte di riso, e derivati, attraverso l’impiego di attività biologiche individuate in composti fenolici, polifenolici, o loro derivati, compresi i fenilpropanoidi, di seguito indicati per semplicità con l'acronimo FPF.
Ad oggi sono stati identificati più di 170 tipi di alimenti in grado di favorire l’insorgenza di fenomeni allergici e/o intolleranze.
Tra tali alimenti, i più comuni sono il latte e i suoi derivati, la soia e la carne rossa, seguiti da uova, arachidi, frutta secca, crostacei e molluschi.
Oggigiorno le allergie alimentari interessano complessivamente il 6% dei bambini e il 4 % degli adulti residenti in Europa, Oceania e Stati Uniti. Recentemente sono stati evidenziati nuovi casi di fenomeni allergici innescati dalla specifica assunzione di carne rossa o latte (vaccino o caprino) in grado di sviluppare una serie di eventi che vanno dalle classiche reazioni quali orticaria, disturbi gastrointestinali, ritardo di crescita nel bambino e anafilassi sistemica, fino alla possibile morte del soggetto.
Tale fenomeno è determinato dalla presenza negli alimenti in oggetto di una particolare molecola denominata alpha-Gal.
Questa specifica forma allergica preoccupa particolarmente il mercato americano e australiano al punto che in tali Paesi sono state istituite specifiche squadre di sorveglianza denominate rispettivamente “Alpha-Gal National Surveillance” e “TIARA – Tick Induced Allergies Research and Awareness” dedicate al monitoraggio e all’educazione sanitaria in merito a tale fenomeno.
Il 30% dei pazienti ricoverati in seguito all’insorgenza di allergie di tipo alimentare negli Stati Uniti è infatti interessato allo sviluppo di una forma di intolleranza e/o allergia verso la molecola alpha-Gal.
In Europa simili reazioni sono state riscontrate in Danimarca (5.6% della popolazione), Spagna (8.1% della popolazione), Svezia, Germania, Francia e Svizzera.
La molecola denominata alpha-Gal è un determinante antigenico costituito da due residui di galattosio legati uno all’altro attraverso un legame alphaglicosidico, la sua presenza è stata riscontrata in tutti i mammiferi ad eccezione dell’uomo e dei primati più evoluti.
Tale molecola è prevalentemente espressa sulle glicoproteine e sui glicolipidi di membrana grazie all’azione di un enzima denominato alphagalattosiltransferasi.
L’uomo durante il proprio processo evolutivo a seguito di mutazioni naturali, ha perso la funzionalità di tale enzima sviluppando fin dall’infanzia anticorpi diretti proprio contro l’antigene alpha-Gal e costituenti l’1% di tutte le immunoglobuline circolanti (IgG, IgA, IgM ed IgE).
Nel latte di mammifero (ad eccezione dell’uomo), l’epitopo alpha-Gal è presente in quanto nelle ghiandole mammarie il citoplasma apicale degli elementi secernenti viene eliminato assieme al prodotto di secrezione.
In tal modo, nel liquido secreto sono presenti anche frammenti di membrane cellulari esponenti xenoantigeni alpha-Gal reattivi in grado di instaurare fenomeni che possono variare da stati di intolleranza fino a vere e proprie manifestazioni di tipo allergico.
La presenza dell’epitopo alpha-Gal nel latte, oltre al contributo della secrezione di tipo apocrino, è influenzata anche dal fenomeno della glicosilazione delle proteine.
Per glicosilazione si intende una modificazione post-traduzionale di una proteina, che vede l'aggiunta di zuccheri alla catena peptidica.
La maggior parte delle proteine che vengono glicosilate nelle cellule eucariotiche, sono destinate a diventare proteine di membrana.
L’allergia alle proteine del latte vaccino è una condizione ben diversa dall’intolleranza al lattosio, in quanto non si tratta di una difficoltà digestiva da deficit enzimatico, ma di una vera e propria reazione immuno-mediata diretta verso la componente proteica/glucidica, totalmente assente o diversa per struttura nel latte umano e dunque estranea alla nostra fisiologia.
La dieta di eliminazione, così come la successiva dieta terapeutica, prevedono l'assoluta assenza di tali glico-proteine del latte vaccino, come pure di tutti gli alimenti che le contengono anche in bassissima quantità (è il caso di molti insaccati, di vari tipi di biscotti, di molti tipi di pane comune, di dadi, ecc.).
A questo fine possono essere somministrati tipi di latte altamente idrolisato o latte di soia.
Recentemente è inoltre emersa una importante relazione che correla una anomala sovraespressione di anticorpi anti alpha-Gal nelle forme altamente infiammatorie delle cosidette Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). Questo gruppo di patologie comprende malattie come colite, retto-colite ulcerosa e morbo di Crohn. Significative correlazioni tra anticorpi anti alpha-Gal circolanti e lo sviluppo di patologie di tipo infiammatorio sono state evidenziate anche per malattie quali l’artrite reumatoide, l’esofagite eosinofila e la sindrome del colon irritabile (in generale tutte le forme autoinfiammatorie che determinano una variazione della permeabilità intestinale). In tutti questi casi l’ingestione di alimenti contenenti quantità variabili di epitopo alpha-Gal è potenzialmente in grado di stimolare ulteriormente un sistema immunitario già sovraccarico, contribuendo in maniera decisiva ad aggravare lo stato infiammatorio e favorire la cronicizzazione della malattia.
Lo sviluppo di un efficace trattamento in grado di abbattere le proprietà pro-allergeniche delle proteine/ oligosaccaridi del latte, è quindi una scelta perentoria, indispensabile ed economicamente attrattiva.
Il compito del presente trovato è quello di realizzare un metodo per l'inattivazione e il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni da alimenti di origine vegetale e animale.
In particolare, in tale ambito, è scopo del trovato quello di mettere a punto un metodo per l'inattivazione dell’epitopo alpha-Gal, in diversi tipi di latte.
Un altro scopo del trovato è quello di mettere a punto un metodo per inattivare i suddetti epitopi garantendo una efficace bonifica applicabile ai diversi tipi di latte attualmente in commercio.
Un ulteriore scopo del trovato è quello di mettere a punto un metodo realizzabile con attrezzature e macchine di tipo noto.
Questo compito, nonchè questi ed altri scopi che meglio appariranno in seguito, sono raggiunti da un metodo per l'inattivazione ed il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni in alimenti di origine vegetale e animale, secondo la rivendicazione 1.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi del trovato risulteranno maggiormente dalla descrizione di una forma di esecuzione preferita, ma non esclusiva, del metodo secondo il trovato, i cui passaggi ed esiti sono esemplificati, a titolo indicativo e non limitativo, negli uniti disegni, in cui:
- la figura 1 rappresenta un primo grafico relativo al metodo secondo il trovato applicato ad un campione di un alimento trattato con un estratto vegetale titolato in Verbascoside o una sua isoforma o suo derivato, ad una prima concentrazione;
- la figura 2 rappresenta un secondo grafico relativo al metodo secondo il trovato applicato ad un campione di un alimento trattato con un estratto vegetale titolato in Verbascoside o una sua isoforma o suo derivato, ad una seconda concentrazione;
- la figura 3 rappresenta un grafico relativo al metodo secondo il trovato applicato ad un campione di un alimento con un derivato dell'Acido Cinnamico;
- la figura 4 rappresenta un grafico relativo al metodo secondo il trovato applicato ad un campione di un alimento con un derivato del tannino o un estratto vegetale titolato in Teupolioside o una sua isoforma o un suo derivato;
- la figura 5 rappresenta un grafico relativo al metodo secondo il trovato applicato ad un campione di succedaneo del latte, in particolare di soia e di riso, trattato con un estratto vegetale titolato in Verbascoside o una sua isoforma o un suo derivato e un derivato dell'Acido Cinnamico.
DEFINIZIONI
Con il termine “composti fenolici” si identificano molecole caratterizzate, almeno in loro parte, dalla presenza di un nucleo aromatico (anello benzenico) legato a uno o più gruppi funzionali ossidrilici.
Tra i suddetti sono da considerare, come esempio non limitante:
- i fenoli semplici (molecole con un solo anello benzenico e contenenti come sostituenti solo gruppi ossidrilici, es. fenolo ed idrochinone),
- le aldeidi fenoliche (contenenti sia il gruppo fenolico che il gruppo aldeidico, es. aldeide vanillica),
- gli acidi fenolici (es. acidi cinnamici), le fenilammine (molecole di natura anfotera contenenti un gruppo debolmente acido e uno particolarmente basico, es. fenilalanina),
- i fenoli composti (l’anello fenolico è legato ad un altro anello benzenico o ad altri composti eterociclici aventi gruppi funzionali ossidrilici/lattonici/chetonici, es. cumarine e xantoni),
- i flavonoidi (composti da due anelli benzenici collegati mediante una catena a tre atomi di carbonio costituente un anello eterociclico ossigenato, es. catechine, flavononi, flavoni, calconi, flavanonoli, flavanoli, leucoantocianidine, antocianine, antocianidine, proantocianidine e betalaine),
- i fenilpropanoidi (caratterizzati dalla presenza di un anello aromatico con una catena alifatica laterale a tre atomi di carbonio, es. acidi idrossicinnamici),
- i tannini, le porfirine e i carotenoidi (caroteni e xantofille).
Nel presente trovato i termini “fenoli”, “polifenoli” e “fenilpropanoidi” sottendono allo stesso significato e possono essere utilizzati singolarmente, sotto forma di miscela o in sostituzione uno dell’altro per gli scopi preposti.
Con il termine “xenoantigene” si identificano molecole di origine animale in grado di essere riconosciute dal sistema immunitario e capaci di indurre una risposta di tipo anticorpale, immunomediata, infiammatoria o allergica nell’organismo umano ospite.
Nel presente trovato i termini “xenoantigene”, “antigene”, “antigene xenogenico”, “epitopo” e “determinante antigenico” sottendono allo stesso significato e possono essere utilizzati assieme o in sostituzione uno dell’altro.
Con riferimento alle figure citate, un metodo per l'inattivazione ed il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni in alimenti di origine vegetale o animale è applicato, a titolo esemplificativo e non limitativo del trovato stesso, alla inattivazione dell'epitopo alpha-Gal dal latte vaccino, dal latte di soia e dal latte di riso.
Tale metodo comprende le seguenti fasi:
- realizzare una soluzione con un alimento di origine vegetale o animale come solvente, ad esempio latte vaccino, o latte di soia, o latte di riso, ed uno o più composti fenolici, polifenolici, e loro derivati, compresi i fenilpropanoidi, di seguito FPF, come soluto, per l'inattivazione di almeno parte degli epitopi xenogenici da detto alimento; l'epitopo xenoantigenico è, nel presente esempio realizzativo, l'epitopo alpha-Gal.
Un estratto vegetale ad alto contenuto di fenilpropanoidi, per l'inattivazione di almeno parte di detti epitopi xenogenici da detto alimento, è costituito da estratti vegetali ad alto titolo di almeno uno tra Verbascoside e Teupolioside.
In particolare, i composti fenolici, polifenolici o loro derivati sono costituiti da estratti vegetali ad alto contenuto di fenilpropanoidi ed in particolare, a titolo esemplificativo, estratto vegetale titolato in Verbascoside nel range tra il 50% – 95%, la titolazione utilizzata per gli esempi del trovato è del 93%, ottenuto da piante di "Lippia citriodora" ed un estratto vegetale titolato in Teupolioside nel range tra il 50% -85%, la titolazione utilizzata per gli esempi del trovato è del 50%, ottenuto da piante di “Ajuga reptans” oltre a derivati fenilici dell’Acido Cinnamico, in particolare Acido Caffeico, e del tannino, in particolare Acido Tannico; in sintesi, tali FPF per l'inattivazione di almeno parte di epitopi xenogenici da detto alimento, comprendono: estratti vegetali titolati in Verbascoside al 93%, estratti vegetali titolati in Teupolioside al 50%, almeno un derivato fenilico dell’Acido Cinnamico, almeno un derivato fenilico del tannino;
- incubare campioni di latte con aggiunta di un anticorpo diretto contro l'epitopo alpha-Gal presente nel latte; in tale esempio realizzativo, l'anticorpo è ad esempio un anticorpo monoclonale murino M86; sono da intendersi utilizzabili tutti gli anticorpi mono o policlonali e/o appartenenti a diversi isotipi, che abbiano evidenziato una comprovata specificità nei confronti dell'antigene in questione; in generale, detto anticorpo anti xenoantigene è un anticorpo specificamente diretto contro l'epitopo alpha-Gal;
- separare, mediante centrifugazione, l'immunocomplesso creatosi per il legame tra antigene ed anticorpo;
- allestire una piastra a 96 pozzetti per test E.L.I.S.A. con coating comprendente detto epitopo xenoantigenico, ovvero un coating alphaGal/albumina sierica umana;
- aggiungere in detti pozzetti surnatante prelevato dai campioni di latte centrifugati; il surnatante contiene la parte di anticorpo anti alpha-Gal che non si è legata con epitopi; come noto, una colonna di pozzetti è atta alla definizione di un valore di riferimento, in gergo 'valore bianco', corrispondente al massimo segnale tra anticorpo ed epitopi,
- completare la piastra con un anticorpo secondario coniugato ad un enzima, o altra molecola per la valutazione qualitativa o quantitativa attraverso metodica colorimetrica, atta ad evidenziare cromaticamente l'eventuale presenza di detto anticorpo anti alpha-Gal; nel presente esempio realizzativo, l'anticorpo secondario è costituito da un anticorpo policlonale da coniglio anti-topo, coniugato all'enzima perossidasi, o ad altre tipologie enzimatiche e non, in grado di fornire indicazioni qualitative o quantitative attraverso metodica colorimetrica;
- eseguire la lettura della piastra determinando la presenza di anticorpo anti alpha-Gal rimasto libero nelle soluzioni dei campioni;
- confrontare i valori di assorbanza rilevati nella colonna definente i valori di riferimento con i valori rilevati nelle altre colonne di campioni della piastra.
In particolare, tale metodo per l'inattivazione degli epitopi alpha-Gal in campioni di latte vaccino è di seguito descritto nel dettaglio di un primo esempio realizzativo.
Si preparano due soluzioni a diverse concentrazioni di fenilpropanoide, utilizzando il latte come solvente in un volume totale di 50 ml. Nell’esempio specifico, da intendersi ovviamente non limitativo del trovato, si è utilizzato un estratto di "Lippia Citriodora" titolato in Verbascoside al 93%.
Le diverse concentrazioni utilizzate per la preparazione dei campioni di latte sono: 0.01 /-0.005% e 0.005 ± 0.002% p/v.
Tali soluzioni sono lasciate agire sotto moderata, ma costante agitazione, per un totale di 4 ± 0.1 ore a 25 ± 5°C.
Sono effettuati prelievi a 30 ± 2 minuti, 1 ± 0.1 ora e 3 ± 0.1 ore.
Da ogni campionatura viene prelevata un’aliquota di latte compresa tra 200 uL e 500 uL, e preferibilmente di 300 uL, a cui è aggiunto del tampone Na3C6H5O7 0.2M a pH 7.0 ± 0.5 fino ad un volume finale compreso tra 1000 uL e 1500 uL, e preferibilmente un volume finale di 1500 uL.
Viene quindi aggiunto un anticorpo murino diretto contro l'epitopo alpha-Gal, e nel presente esempio si tratta di un clone IgM chiamato M86, alla concentrazione preferibile di [1:50] p/v e incubato il tutto per 120 ± 10 minuti a 37 ± 2°C sotto costante ma moderata agitazione.
Al termine i campioni vengono sottoposti a centrifugazione a 10.000 x g per 30 ± 2 minuti a 4 ± 2°C.
Durante l’incubazione con l’anticorpo M86 si allestisce una piastra a 96 pozzetti con 100 ul per pozzetto di alpha-Gal/HSA(Human Serum Albumin) a 5ug/ml in tampone PBS (pH 7.0 ± 0.5).
La piastra così allestita viene incubata per 60 ± 10 minuti ad una temperatura compresa tra 30°C -40°C, anche se è preferibile stabilizzare il tutto a 37°C ± 2,0°C.
Vengono quindi effettuati 3 lavaggi con 300 ul per pozzetto di PBS (pH fisiologico) a temperatura ambiente.
Il primo lavaggio viene lasciato agire per 5 minuti, i due successivi per 3 minuti ciascuno.
Il blocking viene effettuato con 300 ul per pozzetto di 2 ± 0.5% di albumina sierica in PBS, seguito dalla copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione per 60 ± 10 minuti a temperatura ambiente, al buio.
Successivamente si eseguono 3 lavaggi come sopra. Per ogni singolo pozzetto vengono aggiunti 100 ul di surnatante prelevato dai campioni precedentemente centrifugati; il carico in piastra viene eseguito occupando almeno 4 pozzetti per colonna per ogni tipo di campione.
Nella prima colonna della piastra vengono caricati 100 uL prelevati da un batch costituito da un’aliquota compresa tra 1000 e 1500 uL di tampone (preferibilmente è utilizzata una dose di 1500 uL) in cui è disciolta l’aliquota di anticorpo anti alpha−Gal alla concentrazione preferibile di [1:50] v/v senza la presenza del campione di latte.
Tale campione costituisce il valore di riferimento, detto anche “bianco”, e corrisponde al massimo legame in piastra tra anticorpo anti alpha-Gal ed epitopi alpha-Gal legati alla HSA ed esposti sul fondo dei pozzetti.
Segue copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione a 37 ± 2°C per 120 ± 10 minuti.
Vengono quindi effettuati 3 lavaggi con PBS come sopra ed aggiunti 100 ul per pozzetto di una soluzione di anticorpo secondario (policlonale da coniglio anti-topo) coniugato all’enzima perossidasi in tampone fosfato a pH 7.0 ± 0.5 (le soluzioni di tale anticorpo ideali sono risultate essere [1:1000], [1:500] e [1:100] v/v, preferibilmente è stata adottata quella intermedia [1:500] v/v).
La piastra viene quindi coperta nuovamente con pellicola protettiva ed incubata a 37 ± 2°C al buio per 60 ± 10 minuti.
Seguono 3 lavaggi come sopra.
Successivamente vengono aggiunti 100 ul per pozzetto di una soluzione di sviluppo per l’enzima perossidasi, a cui segue la copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione per 5 ± 1 minuti al buio.
Vengono quindi aggiunti 50 uL per pozzetto della soluzione di STOP costituita da H2SO4 2M e si procede con la lettura della piastra in lettore di piastre alla lunghezza d'onda di 450 nm.
Il test di controllo dell'avvenuta inattivazione si basa sul confronto tra i valori di assorbanza della colonna costituente il valore bianco (100% di anticorpo disponibile) e le relative colonne dei campioni.
Nel caso in cui l’assorbanza (Abs) rilevata nei campioni di latte trattato corrisponda all’Abs rilevata nella prima colonna (batch del bianco) si può affermare che gli anticorpi anti alpha-Gal lasciati incubare con il latte non hanno identificato strutture antigeniche.
L’anticorpo non legato non ha potuto creare le interazioni con le componenti lipo-proteiche del latte responsabili della formazione dell’immunocomplesso.
Di conseguenza, l'anticorpo non legato non è stato sequestrato dal processo di centrifugazione ma è rimasto libero e disponibile per interagire con l’epitopo alpha-Gal legato all’HSA ed esposto sul fondo dei pozzetti.
In figura 1 è rappresentato un grafico relativo al trattamento di campioni di latte vaccino (tre set sperimentali, n=8 per ogni set sperimentale) con un estratto vegetale titolato in Verbascoside utilizzato alla concentrazione dello 0.01% a temperatura ambiente (RT).
L'estratto vegetale somministrato alla concentrazione dello 0.01% p/v si è dimostrato in grado di inattivare il 33.8 ± 2.4% degli antigeni dopo 30 minuti, il 42.1 ± 2.5% dopo 1 ora e il 55.6 ± 2.3 % dell’antigene dopo almeno 3 ore di incubazione.
In figura 2 è rappresentato un grafico relativo al trattamento di campioni di latte vaccino (quattro set sperimentali, n=8 per ogni set sperimentale) con un estratto vegetale titolato in Verbascoside utilizzato alla concentrazione dello 0.005% a temperatura ambiente (RT).
L'estratto vegetale somministrato alla concentrazione dello 0.005% p/v è in grado di inattivare il 38.2± 5.9% degli antigeni dopo 30 minuti, il 55.8 ± 3.7% degli antigeni originariamente presenti dopo 1 ora di incubazione arrivando ad una percentuale del 64.5 ± 7.1 dopo almeno 3 ore.
Di conseguenza, si è verificato come detto estratto vegetale titolato in Verbascoside al 93% sia efficace se presente in soluzione in quantità non inferiore allo 0,005 ± 0.001% p/v.
Il metodo secondo il trovato per l'inattivazione degli epitopi alpha-Gal in campioni di latte vaccino, di latte di soia e di latte di riso è di seguito descritto nel dettaglio di un secondo esempio realizzativo, con l'applicazione di derivati fenilici per la rimozione degli epitopi alpha-Gal in campioni di latte vaccino intero.
Si allestisce una soluzione con un derivato fenilico dell’Acido Cinnamico, nello specifico con Acido Caffeico, utilizzando il latte come solvente in un volume totale di 50 ml.
La concentrazione preferibile da utilizzare è dello 0.5 ± 0.05% p/v.
La preparazione viene lasciata agire sotto moderata, ma costante agitazione per un totale di 4 ± 0.1 ore a 25 ± 5°C.
Vengono effettuati prelievi a 30 ± 2 minuti, 1 ± 0.1 ora e 3 ± 0.1 ore.
Da ogni campionatura viene prelevata un’aliquota di latte compresa tra 200 uL e 500 uL, e preferibilmente una dose di 300 uL, a cui è aggiunto del tampone NA3C6H5O70.2M a pH 7.0 ± 0.5 fino ad un volume finale compreso tra 1000 e 1500 uL, e preferibilmente un volume finale di 1500 uL. Viene quindi aggiunto un anticorpo murino diretto contro l’epitopo alpha-Gal, nel caso specifico un clone IgM chiamato M86 alla concentrazione di [1:50] v/v e lasciato incubare per 120 ± 10 minuti a 37 ± 2°C sotto costante ma moderata agitazione. Al termine i campioni vengono sottoposti a centrifugazione a 10.000 x g per 30 ± 2 minuti a 4 ± 2°C.
Durante l’incubazione dei campioni con l’anticorpo M86 si allestisce una piastra a 96 pozzetti con 100 ul per pozzetto di alpha-Gal/HSA a 5ug/ml in tampone PBS (pH 7.0 ± 0.5).
La piastra viene successivamente incubata per 60 ± 10 minuti ad una temperatura compresa tra 30°C -40°C, anche se è preferibile stabilizzare il tutto a 37°C.
Vengono effettuati 3 lavaggi con 300 ul per pozzetto di PBS sterile (pH fisiologico) a temperatura ambiente.
Il primo lavaggio viene lasciato agire per 5 minuti, i due successivi per 3 minuti ciascuno.
Il blocking si effettua con 300 ul per pozzetto di 2 ± 0.5% di albumina sierica in PBS e incubazione per 60 ± 10 minuti a temperatura ambiente, al buio.
Successivamente si eseguono 3 lavaggi come sopra. Per ogni singolo pozzetto vengono aggiunti 100 ul di surnatante prelevato dai campioni precedentemente centrifugati, ed il carico in piastra viene eseguito occupando almeno quattro pozzetti per colonna per ogni tipo di campione.
Nella prima colonna della piastra vengono caricati 100 ul prelevati da un batch costituito da un’aliquota compresa tra 1000 e 1500 uL di tampone, e preferibilmente è utilizzata una dose di 1500 uL, in cui è disciolta l’aliquota di anticorpo anti alpha−Gal alla concentrazione preferibile di [1:50] v/v senza la presenza del campione di latte.
Tale campione costituirà il valore di riferimento detto anche “bianco” e corrisponde al massimo legame in piastra tra anticorpo anti alpha-Gal ed epitopi alpha-Gal legati alla HSA ed esposti sul fondo dei pozzetti.
Segue copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione a 37 ± 2°C per 120 ± 10 minuti.
Vengono quindi effettuati 3 lavaggi con PBS come sopra ed aggiunti 100 ul per pozzetto di una soluzione di anticorpo secondario (policlonale da coniglio anti-topo) coniugato all’enzima perossidasi in tampone fosfato a pH 7.0 ± 0.5 (le soluzioni di tale anticorpo ideali sono risultate essere [1:1000], [1:500] e [1:100] v/v, preferibilmente è stata adottata quella intermedia [1:500] v/v).
La piastra viene quindi coperta nuovamente con pellicola protettiva ed incubata a 37 ± 2°C al buio per 60 ± 10 minuti.
Seguono 3 lavaggi come sopra.
Successivamente vengono aggiunti 100 ul per pozzetto di una soluzione di sviluppo per l’enzima perossidasi, a cui segue la copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione per 5 ± 1 minuti al buio.
Vengono quindi aggiunti 50 uL per pozzetto della soluzione di STOP costituita da H2SO4 2M e si procede con la lettura della piastra in lettore di piastre alla lunghezza d'onda di 450 nm.
Nel caso in cui l’assorbanza rilevata nei campioni di latte trattato corrisponda all’assorbanza rilevata nella prima colonna (batch del bianco) significa che gli anticorpi lasciati incubare con il latte sono stati recuperati e di conseguenza non hanno identificato strutture antigeniche. L’anticorpo non legato non ha potuto creare le interazioni con le componenti del latte responsabili della formazione dell’immunocomplesso, di conseguenza non è stato sequestrato dal processo di centrifugazione ed è stato recuperato attraverso il surnatante, andando a legare l’antigene alpha-Gal che si trova processato assieme alla HSA sul fondo dei pozzetti.
In figura 3 è rappresentato un grafico relativo al trattamento di campioni di latte vaccino (3 set sperimentali, n=8 per ogni set sperimentale) con Acido Caffeico alla concentrazione dello 0.5% p/v a temperatura ambiente (RT).
Dal confronto con la colonna BLANK emerge come si possa raggiungere un’inattivazione del 51.2 ± 4.2% degli antigeni dopo 30 minuti, del 61.1 ± 2.6% dopo almeno un’ora di incubazione, tale soglia innalzandosi fino alla percentuale di 72.3 ± 2.8% dopo 3 ore di incubazione.
Tale trattamento, risulta ottimale per una significativa bonifica del latte trattato.
Il metodo secondo il trovato per l'inattivazione degli epitopi alpha-Gal in campioni di latte vaccino, di latte di soia e di latte di riso è di seguito descritto nel dettaglio di un terzo esempio realizzativo, con l'applicazione di derivati fenilici per la rimozione degli epitopi alpha-Gal in campioni di latte vaccino intero.
Si allestiscono diverse soluzioni con un derivato fenilico del tannino e con un fenilpropanoide utilizzando il latte come solvente in un volume totale di 50 ml. Nell’esempio specifico, da intendersi ovviamente non limitativo del trovato, si utilizzano Acido Tannico ed un estratto vegetale di “Ajuga reptans” titolato in Teupolioside al 50%, preferibilmente presenti in soluzione alla concentrazione dello 0,5 ± 0.05% p/v.
Preferibilmente, l'Acido Tannico è presente in soluzione alla concentrazione dello 0.5 ± 0.05% p/v. La preparazione viene lasciata agire sotto moderata, ma costante agitazione per un totale di 4 ± 0.1 ore a 25 ± 5°C.
Vengono effettuati prelievi a 30 ± 2 minuti, 1 ± 0.1 ora e 3 ± 0.1 ore.
Da ogni campionatura viene prelevata un’aliquota di latte compresa tra 200 uL e 500 uL, e preferibilmente una dose di 300 uL, a cui è aggiunto del tampone Na3C6H5O70.2M a pH 7.0 ± 0.5 fino ad un volume finale compreso tra 1000 e 1500 uL, e preferibilmente un volume finale di 1500 uL. Viene quindi aggiunto un anticorpo murino diretto contro l’epitopo alpha-Gal, nel caso specifico un clone IgM chiamato M86 alla concentrazione di [1:50] v/v e lasciato incubare per 120 ± 10 minuti a 37 ± 2°C sotto costante ma moderata agitazione. Al termine i campioni vengono sottoposti a centrifugazione a 10.000 x g per 30 ± 2 minuti a 4 ± 2°C.
Durante l’incubazione dei campioni con l’anticorpo M86 si allestisce una piastra a 96 pozzetti con 100 ul per pozzetto di alpha-Gal/HSA a 5ug/ml in tampone PBS (pH 7.0 ± 0.5).
La piastra viene successivamente incubata per 60 ± 10 minuti ad una temperatura compresa tra 30°C -40°C, anche se è preferibile stabilizzare il tutto a 37°C.
Vengono effettuati 3 lavaggi con 300 ul per pozzetto di PBS sterile (pH fisiologico) a temperatura ambiente.
Il primo lavaggio viene lasciato agire per 5 minuti, i due successivi per 3 minuti ciascuno.
Il blocking si effettua con 300 ul per pozzetto di 2 ± 0.5% di albumina sierica in PBS e incubazione per 60 ± 10 minuti a temperatura ambiente, al buio. Successivamente si eseguono 3 lavaggi come sopra.
Per ogni singolo pozzetto vengono aggiunti 100 ul di surnatante prelevato dai campioni precedentemente centrifugati, ed il carico in piastra viene eseguito occupando almeno quattro pozzetti per colonna per ogni tipo di campione.
Nella prima colonna della piastra vengono caricati 100 ul prelevati da un batch costituito da un’aliquota compresa tra 1000 e 1500 uL di tampone, e preferibilmente è utilizzata una dose di 1500 uL, in cui è disciolta l’aliquota di anticorpo anti alpha−Gal alla concentrazione preferibile di [1:50] v/v senza la presenza del campione di latte.
Tale campione costituirà il valore di riferimento detto anche “bianco” e corrisponde al massimo legame in piastra tra anticorpo anti alpha-Gal ed epitopi alpha-Gal legati alla HSA ed esposti sul fondo dei pozzetti.
Segue copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione a 37 ± 2°C per 120 ± 10 minuti.
Vengono quindi effettuati 3 lavaggi con PBS come sopra ed aggiunti 100 ul per pozzetto di una soluzione di anticorpo secondario (policlonale da coniglio anti-topo) coniugato all’enzima perossidasi in tampone fosfato a pH 7.0 ± 0.5 (le soluzioni di tale anticorpo ideali sono risultate essere [1:1000], [1:500] e [1:100] v/v, preferibilmente è stata adottata quella intermedia [1:500] v/v).
La piastra viene quindi coperta nuovamente con pellicola protettiva ed incubata a 37 ± 2°C al buio per 60 ± 10 minuti.
Seguono 3 lavaggi come sopra.
Successivamente vengono aggiunti 100 ul per pozzetto di una soluzione di sviluppo per l’enzima perossidasi, a cui segue la copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione per 5 ± 1 minuti al buio.
Vengono quindi aggiunti 50 uL per pozzetto della soluzione di STOP costituita da H2SO4 2M e si procede con la lettura della piastra in lettore di piastre a 450 nm.
Nel caso in cui l’assorbanza rilevata nei campioni di latte trattato corrisponda all’assorbanza rilevata nella prima colonna (batch del bianco) si può affermare che gli anticorpi anti alpha-Gal lasciati incubare con il latte sono stati recuperati e di conseguenza non hanno identificato strutture antigeniche. L’anticorpo non legato non ha potuto creare le interazioni con le componenti del latte responsabili della formazione dell’immunocomplesso, di conseguenza non è stato sequestrato dal processo di centrifugazione ed è stato recuperato attraverso il surnatante, andando a legare l’antigene alpha-Gal che si trova processato assieme alla HSA sul fondo dei pozzetti.
In figura 4 è rappresentato un grafico relativo al trattamento di campioni di latte vaccino con un estratto vegetale titolato in Teupolioside e con Acido Tannico alla concentrazione dello 0.5% p/v a temperatura ambiente (RT).
Dal confronto con la colonna BLANK si può notare che attraverso l’impiego di un estratto vegetale titolato in Teupolioside è possibile raggiungere una limitata capacità di inattivazione dell’antigene alpha-Gal pari al 19.1 ± 1.5% dopo 30 minuti, del 22.6 ± 1.1% dopo 1 ora e del 45.0 ± 1.9% dopo 3 ore di incubazione. L’attività dell’Acido Tannico si è dimostrata in grado di inattivare il 67.7 ± 7.1% degli antigeni dopo 30 minuti, il 71.8 ± 2.2% dopo 1 ora e il 80.6 ± 1.8% dopo 3 ore di incubazione.
Il trattamento di detto alimento con tali composti si è dimostrato in grado di abbassare significativamente la reattività degli epitopi alpha-Gal con una spiccata attività in riferimento all’Acido Tannico.
Il metodo secondo il trovato per l'inattivazione degli epitopi alpha-Gal in campioni di latte vaccino, di latte di soia e di latte di riso è di seguito descritto nel dettaglio di un quarto esempio realizzativo, con applicazione di estratti cellulari vegetali ad alto contenuto in fenilpropanoidi, ad esempio superiori al 93%, e di loro derivati fenilici per la inattivazione degli epitopi alpha-Gal in campioni di succedanei del latte a base di riso e soia.
Si preparano tre diverse soluzioni utilizzando un succedaneo del latte a base di riso e soia come solvente, ad esempio un succedaneo comprendente 17% riso, 17% semi di soia, in un volume totale di 50 ml.
Nel presente esempio, non limitativo del trovato, si utilizzano estratti di "Lippia citriodora" titolati in Verbascoside al 93%.
Le concentrazioni utilizzate per la preparazione dei campioni di latte sono: 0.01 ± e 0.005% p/v e 0.005 ± e 0.001% p/v. In aggiunta viene preparata una soluzione allo 0.5 ± 0.05% p/v di un derivato fenilico dell'Acido Cinnamico, ovvero di Acido Caffeico.
Tali soluzioni vengono lasciate agire sotto moderata, ma costante agitazione per un totale di 3 ± 0.1 ore a 25 ± 5°C.
Si effettuano prelievi a 30 ± 2 minuti, 1 ± 0.1 ora e 3 ± 0.1 ore.
Da ogni campionatura si preleva un’aliquota di latte compresa tra 200 e 500 uL, e preferibilmente una dose di 300 uL, a cui si aggiunge del tampone Na3C6H5O7, a pH 7.0 ± 0.5, fino ad un volume finale compreso tra 1000 e 1500 uL, e preferibilmente un volume finale di 1500 uL.
Si aggiunge quindi un anticorpo murino diretto contro l’epitopo alpha-Gal, ad esempio un clone IgM chiamato M86, alla concentrazione preferibile di [1:50] p/v e si incuba il tutto per 120 ± 10 minuti a 37 ± 2°C sotto costante ma moderata agitazione.
Al termine, i campioni vengono sottoposti a centrifugazione a 10.000 x g per 30 ± 2 minuti a 4 ± 2°C.
Durante l’incubazione con l’anticorpo M86 si allestisce una piastra a 96 pozzetti con 100 uL per pozzetto di alpha-Gal/HSA (Human Serum Albumin) a 5ug/ml in tampone PBS (pH 7.0 ± 0.5). La piastra così allestita viene incubata per 60 ± 10 minuti ad una temperatura compresa tra 30°C 40°C, anche se è preferibile stabilizzare il tutto a 37 ± 2.0°C.
Vengono quindi effettuati 3 lavaggi con 300 uL per pozzetto di PBS (pH fisiologico) a temperatura ambiente.
Il primo lavaggio viene lasciato agire per 5 minuti, i due successivi per 3 minuti ciascuno.
Si effettua il blocking con 300 uL per pozzetto di 2 ± 0.5% albumina sierica in PBS sterile, seguito dalla copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione per 60 ± 10 minuti a temperatura ambiente, al buio.
Successivamente si eseguono 3 lavaggi come sopra. Per ogni singolo pozzetto si aggiungono 100 uL di surnatante prelevato dai campioni precedentemente centrifugati.
Il carico in piastra viene eseguito occupando almeno 4 pozzetti per colonna per ogni tipo di campione.
Nella prima colonna della piastra si caricano 100 uL prelevati da un batch costituito da un’aliquota compresa tra 1000 e 1500 uL di tampone, e preferibilmente si utilizza una dose di 1500 uL, in cui è disciolta l’aliquota di anticorpo monoclonale anti alpha−Gal alla concentrazione preferibile di [1:50] v/v senza la presenza del campione di latte.
Tale campione costituisce il valore di riferimento, detto anche “bianco”, e corrisponde al massimo legame in piastra tra anticorpo anti alpha-Gal ed epitopi alpha-Gal legati alla HSA ed esposti sul fondo dei pozzetti.
Segue copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione a 37 ± 2°C per 120 ± 10 minuti.
Vengono poi effettuati 3 lavaggi con PBS come sopra ed aggiunti 100 uL per pozzetto di una soluzione di anticorpo secondario, ad esempio policlonale da coniglio anti-topo, coniugato all’enzima perossidasi in tampone fosfato a pH7.0 ± 0.5; le soluzioni di tale anticorpo ideali sono [1:1000], [1:500] e [1:100] v/v, e preferibilmente si adotta quella intermedia [1:1000] v/v.
La piastra viene coperta nuovamente con pellicola protettiva ed incubata a 37± 2°C al buio per 60 ± 10 minuti.
Seguono 3 lavaggi come sopra.
Successivamente si aggiungono 100 uL per pozzetto di una soluzione di sviluppo per l’enzima perossidasi, a cui segue la copertura della piastra con pellicola protettiva e incubazione per 5 ± 1 minuti al buio.
Si aggiungono 50 uL per pozzetto della soluzione di STOP costituita da H2SO42M e si procede con la lettura della piastra in lettore di piastre alla lunghezza d'onda di 450 nm.
Il test di controllo si basa sul confronto tra i valori di assorbanza della colonna numero 1 costituente il valore bianco (100% di anticorpo disponibile) e le relative colonne dei campioni. Nel caso in cui l’Abs rilevata nei campioni di latte trattato corrisponda all’Abs rilevata nella prima colonna (batch del bianco) si può affermare che gli anticorpi anti alpha-Gal lasciati incubare con il latte non hanno identificato strutture antigeniche.
L’anticorpo non legato non ha potuto creare le interazioni con le componenti lipo-proteiche del latte responsabili della formazione dell’immunocomplesso.
Di conseguenza non è stato sequestrato dal processo di centrifugazione ma è rimasto libero e disponibile per interagire con l’epitopo alpha-Gal legato all’HSA ed esposto sul fondo dei pozzetti. In figura 5 è rappresentato un grafico relativo al trattamento di campioni di succedanei del latte a base di riso e soia con un estratto vegetale titolato in Verbascoside utilizzato alla concentrazione dello 0.01 % e 0.005 % p/v e con Acido Caffeico 0.3% p/v (n=8 per ogni set sperimentale) a temperatura ambiente.
Dal confronto con la colonna BLANK si nota che il trattamento con un estratto vegetale titolato in Verbascoside e utilizzato alla concentrazione dello 0.01 ± 0.005% p/v ha evidenziato una limitata capacità di inattivare il 29.3 ± 2.1% degli antigeni dopo 30 minuti, il 42.5 ± 3.4% dopo 1 ora e il 51.7 ± 2.7% dopo 3 ore di incubazione. Il trattamento con un estratto vegetale titolato in Verbascoside e utilizzato alla concentrazione dello 0.005 ± 0.001% p/v, ha evidenziato una attività capace di inattivare il 44.9 ± 1.9% di antigeni dopo 30 minuti, il 58.3 ± 2.5% dopo 1 ora e il 63.8 ± 3.1% dopo 3 ore di incubazione. L’attività dell’Acido Caffeico si è dimostrata significativamente più efficace ed in grado di inattivare il 61.8 ± 2.8% degli antigeni dopo 30 minuti, il 78.3 ± 4.1% dopo 1 ora e l’89.2 ± 1.8% dopo 3 ore di incubazione.
Tale trattamento risulta quindi efficace per una significativa bonifica di succedanei del latte a base di riso e soia.
E' da intendersi oggetto del trovato anche una miscela dei suddetti composti FPF per la inattivazione di almeno parte di detti epitopi xenogenici da detti alimenti.
E' da intendersi oggetto del trovato anche un latte di origine animale, caratterizzato dal fatto di presentare almeno parte della componente animale costituita dall'antigene in forma inattivata.
Si è in pratica constatato come il trovato raggiunga il compito e gli scopi preposti.
In particolare, con il trovato si è messo a punto un metodo per l'inattivazione ed il controllo d'inattivazione dell’epitopo alpha-Gal, in diversi tipi di latte.
Inoltre, con il trovato si è messo a punto un metodo per inattivare almeno parte dei suddetti epitopi garantendo una significativa bonifica applicabile ai diversi tipi di latte attualmente in commercio.
Non ultimo, con il trovato si è messo a punto un metodo realizzabile con attrezzature e macchine di tipo noto.
Il trovato, così concepito, è suscettibile di numerose modifiche e varianti, tutte rientranti nell'ambito del concetto inventivo; inoltre, tutti i dettagli potranno essere sostituiti da altri elementi tecnicamente equivalenti.
In pratica, i materiali impiegati, purché compatibili con l'uso specifico, nonché le dimensioni e le forme contingenti, potranno essere qualsiasi a seconda delle esigenze e dello stato della tecnica.
Ove le caratteristiche e le tecniche menzionate in qualsiasi rivendicazione siano seguite da segni di riferimento, tali segni sono stati apposti al solo scopo di aumentare l'intelligibilità delle rivendicazioni e di conseguenza tali segni di riferimento non hanno alcun effetto limitante sull'interpretazione di ciascun elemento identificato a titolo di esempio da tali segni di riferimento.

Claims (17)

  1. RIVENDICAZIONI 1) Metodo per l'inattivazione ed il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni in alimenti di origine vegetale e animale, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi: - realizzare una soluzione con un alimento di origine vegetale o animale come solvente ed uno o più composti fenolici, polifenolici e loro derivati, compresi i fenilpropanoidi, come soluto, per l'inattivazione di almeno parte di epitopi xenogenici da detto alimento; - incubare campioni di detto alimento di origine vegetale o animale con aggiunta di un anticorpo diretto contro un epitopo xenoantigenico presente in detto alimento; - separare l'immunocomplesso creatosi per il legame tra antigene ed anticorpo; - allestire una piastra a pozzetti per test E.L.I.S.A. con coating comprendente detto epitopo xenoantigenico, - aggiungere in detti pozzetti surnatante prelevato da detti campioni, detto surnatante contenendo la parte di anticorpo anti xenoantigene che non si è legata con epitopi, una colonna di pozzetti essendo atta alla definizione di un valore di riferimento corrispondente al massimo segnale tra anticorpo ed epitopi, - completare detta piastra con un anticorpo secondario coniugato ad un enzima, o altra molecola, atto ad evidenziare cromaticamente l'eventuale presenza di anticorpo anti xenoantigene, - eseguire la lettura di detta piastra determinando la presenza di anticorpo anti xenoantigene rimasto libero nelle soluzioni dei campioni, - confrontare i valori di assorbanza rilevati nella colonna definente i valori di riferimento con i valori rilevati nelle altre colonne di campioni della piastra.
  2. 2) Metodo secondo la rivendicazione 1, che si caratterizza per il fatto che detto alimento è latte vaccino, o latte di soia, o latte di riso, detto epitopo xenoantigenico è l'epitopo alpha-Gal, e detto anticorpo anti xenoantigene è un anticorpo specificamente diretto contro l'epitopo alpha-Gal.
  3. 3) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, che si caratterizza per il fatto che detto estratto vegetale ad alto contenuto di fenilpropanoidi, per l'inattivazione di almeno parte di detti epitopi xenogenici da detto alimento, è costituito da estratti vegetali ad alto titolo di almeno uno tra Verbascoside e Teupolioside.
  4. 4) Metodo secondo la rivendicazione precedente che si caratterizza per il fatto che detti estratti vegetali ad alto contenuto di fenilpropanoidi contengono Verbascoside titolato nel range 50% -93%.
  5. 5) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, che si caratterizza per il fatto che detti estratti vegetali titolati in Verbascoside al 93% sono presenti in soluzione in una quantità non inferiore allo 0,005 ± 0,001% p/v.
  6. 6) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti che si caratterizza per il fatto che detti estratti vegetali ad alto contenuto di fenilpropanoidi contengono Teupolioside titolato nel range 50% - 85%.
  7. 7) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, che si caratterizza per il fatto che detti estratti vegetali titolati in Teupolioside al 50%, sono presenti in soluzione alla concentrazione dello 0,5 ± 0.05% p/v.
  8. 8) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, che si caratterizza per il fatto che detti uno o più composti fenolici, per la rimozione di almeno parte di detti epitopi xenogenici da detto alimento, comprendono almeno uno tra un derivato fenilico dell'Acido Cinnamico e un derivato fenilico del tannino.
  9. 9) Metodo secondo la rivendicazione precedente, che si caratterizza per il fatto che detto derivato fenilico dell'Acido Cinnamico è costituito da Acido Caffeico.
  10. 10) Metodo secondo la rivendicazione precedente, che si caratterizza per il fatto che detto Acido Caffeico è presente in soluzione con una concentrazione dello 0.5 ± 0.05% p/v.
  11. 11) Metodo secondo la rivendicazione 8, che si caratterizza per il fatto che detto derivato fenilico del tannino è costituito da Acido Tannico.
  12. 12) Metodo secondo la rivendicazione precedente, che si caratterizza per il fatto che detto Acido Tannico è presente in soluzione alla concentrazione dello 0.5 ± 0.05% p/v.
  13. 13) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, che si caratterizza per il fatto che detti uno o più composti fenolici, polifenolici e loro derivati, compresi i fenilpropanoidi, per l'inattivazione di almeno parte di epitopi xenogenici da detto alimento, comprende - estratti vegetali titolati in Verbascoside al 93%, - estratti vegetali titolati in Teupolioside al 50%, - almeno un derivato fenilico dell’Acido Cinnamico, - almeno un derivato fenilico del tannino.
  14. 14) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, che si caratterizza per il fatto che detto almeno un derivato fenilico dell'Acido Cinnamico è costituito da Acido Caffeico.
  15. 15) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, che si caratterizza per il fatto che almeno un derivato fenilico del tannino è costituito da Acido Tannico.
  16. 16) Miscela di composti fenolici, polifenolici e loro derivati, compresi i fenilpropanoidi, come ad una o più delle rivendicazioni precedenti, per la inattivazione di almeno parte di detti epitopi xenogenici da alimenti di origine vegetale e animale.
  17. 17) Latte di origine animale, caratterizzato dal fatto di presentare almeno parte della componente animale costituita dall'antigene in forma inattivata.
IT102016000115523A 2016-11-16 2016-11-16 Metodo per l'inattivazione ed il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni in alimenti di origine animale, particolarmente per latte e derivati, e in alimenti di origine vegetale, particolarmente per succedanei di latte a base di soia e/o riso IT201600115523A1 (it)

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IT102016000115523A IT201600115523A1 (it) 2016-11-16 2016-11-16 Metodo per l'inattivazione ed il controllo di avvenuta inattivazione di xenoantigeni in alimenti di origine animale, particolarmente per latte e derivati, e in alimenti di origine vegetale, particolarmente per succedanei di latte a base di soia e/o riso
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