CN108367098B - 灭活生物组织中异种抗原的方法 - Google Patents

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Abstract

一种灭活生物组织中、特别是能够用于制造生物假体替代品的组织中和/或已经制备的且旨在用于人或兽医临床应用的生物假体替代品中的异种抗原的方法。这种方法包括以下步骤：‑提供基于酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物的溶液，用于灭活来自这些组织中的至少一部分异种表位；‑在受控条件下在基于酚/多酚的各种溶液中温育待处理的样品；‑使处理的组织经受一系列洗涤。

Description

灭活生物组织中异种抗原的方法
技术领域
本发明涉及用于灭活生物组织中的异种抗原，特别是用于灭活能够用于制造生物假体替代品、旨在用于人或兽医临床领域的组织中的异种抗原的方法。
具体地，本发明涉及用于通过利用酚化合物、多酚化合物和它们的衍生物定义的生物活性保证天然的和/或固定的、异源的或同源的结缔组织中、特别是α-Gal表位、特别是心血管组织中的异种抗原的灭活的方法。
背景技术
生物假体替代品的生产目前在市场上正在经受重要扩张。手术程序的临床改善、减少术后并发症、新的免疫调制医学的发展和管理，与对移植物和受体之间的相互相用机制的深入认知，都有助于促进通过动物或同源组织组成的生物假体的可能应用。在这种意义上讲，代表性但非限制性的一个部分是心血管部分，尤其是就建立的心脏瓣膜替换术的实践能够导致的社会和健康的影响而言。
生物医学技术能够发展以及在手术上应用于替换目的、能够效仿机能障碍的天然瓣膜的打开和闭合功能的瓣膜假体。
理想的瓣膜假体应该能够允许反瓣膜流动，该反瓣膜流动能够重叠类似的原始的、健康的瓣膜的那些流动，保证长寿命且不产生溶血的或凝血酶原的效果。
最常用的瓣膜替代品是源自异种组织、特别是源自猪瓣膜或由牛或马心包膜产生的瓣膜的生物假体。
这种瓣膜假体和替代品具有它们遇到钙化发育不全的退化过程和/或尖端破损的劣化的缺点，表现出对心脏内感染发作的更大的敏感度。为了改善它们的机械特征、降低它们内在的抗原性以及使能够保存它们，常见地利用交联/杀菌化学试剂诸如(为了非排他性示出)戊二醛处理它们。另外，能够使它们经受根据脱钙或解毒程序的处理。
术语“异种组织”是指属于除人之外的物种的有机体的组织；这种材料具有在源物种内可容许，但是当植入到人中不兼容的特定的表面抗原，如果处理不恰当，它们能够触发血小板聚集导致的补体级联的激活，产生与在存在血型不合的情况下发生的类似的情形。
通过术语“超急性排斥反应”知晓这种现象。这种机制发作的主要原因是存在α-Gal异种抗原。这种表位是存在于膜糖蛋白和糖脂(主要是内皮细胞的)以及不同的细胞类型诸如单核细胞、粒细胞和红血细胞上以及重要的组织区域诸如心肌和骨头区域中的二-半乳糖苷(半乳糖-α-1,3-半乳糖)。这种关键抗原基本在所有哺乳动物中表达，除了高等灵长类和人类。
由于肠道细菌群的持续刺激，人体从出生开始表达直接针对这种表位的抗体。
现今，通过用上述的戊二醛处理获得旨在用于制造生物假体的异种组织的生物兼容性。
尽管这种程序，α-Gal表位已经示出在目前市售的瓣膜替代品中保持应答，导致在植入之后小儿患者和成年人两者中循环的抗-α-Gal抗体增加。
此外，形成的抗原-抗体复合体看起来直接涉及促进钙盐的沉积，有利于形成瓣膜的钙化发育不全的情况。
发明内容
本发明的目的是提供能够克服常规处理的局限性的用于灭活生物组织中的异种抗原的方法。
出于该目标，本发明的一个目的是提供能够应用于天然的和/或固定的、异源的或同源的结缔组织的方法，其能够用于制造用于人或兽医临床领域的生物假体替代品。
本发明的进一步的目的是提供用于灭活生物组织中的异种抗原的方法，其适于保证灭活心血管组织中的α-Gal表位。
本发明的另一个目的是提供用于灭活生物组织中的异种抗原的方法，通过其来灭活上述的表位，因此保证有效处理，能够应用于目前市场上的各种不同类型的生物假体替代品。
本发明的另一个目的是提供在植入之后不利于增加循环抗-α-Gal抗体的方法。
本发明的另一个目的是提供不会促进钙盐的沉积的方法，因此限制瓣膜的钙化发育不全的表位的形成。
本发明的另一个目的是提供能够利用常规的设备和机器进行的方法。
通过用于灭活生物组织中、特别是能够用于制造生物假体替代品的组织中和/或已经制备的且旨在用于人或兽医临床应用的生物假体替代品中的异种抗原的方法，实现了将在下文中变得更明显的该目标及这些和其他目的，特征在于其包括以下步骤：
-提供基于酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物的溶液，用于灭活所述组织中的至少一部分异种表位；
-在受控条件下在基于酚/多酚的各种溶液中温育待处理的样品；
-使处理的组织经受一系列洗涤。
本发明还涉及利用上述的根据本发明的用于灭活生物组织中的异种抗原的方法获得的结缔组织，其特征在于其具有至少一些以灭活形式的抗原组分。
本发明还涉及利用上述的根据本发明的用于灭活生物组织中的异种抗原的方法获得的结缔组织用于制造在人或兽医临床领域使用的生物假体替代品和/或已经制备的生物假体替代品的部件的应用。
本发明还涉及用于实施上述的根据本发明的灭活生物组织中的异种抗原的方法的试剂盒，其特征在于，该试剂盒至少包括：
-一个或多个包含缓冲液的容器，最合适剂量的酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物待溶解于该缓冲液中；
-一个或多个包含粉末形式的待与缓冲液结合的所述剂量的酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物的容器；
-一个或多个包含洗涤缓冲液的容器；
-说明书，包含步骤应用的时间和模式的说明。
附图说明
从之后的根据本发明的用于灭活生物组织中的异种抗原的方法的一个优选但非排他性的实施方式的详细说明，本发明的进一步的特征和优势将变得更显而易见。在附图中：
-图1是应用根据本发明的方法于第一应用变体的百分比结果的图；
-图2是应用根据本发明的方法于第二应用变体的百分比结果的图；
-图3是应用根据本发明的方法于第三应用变体的百分比结果的图；
-图4是应用根据本发明的方法于第四应用变体的百分比结果的图。
具体实施方式
定义
术语“酚化合物”是指至少其一部分的特征为存在与一个或多个羟基官能团结合的芳香族核(苯环)的分子。出于非排他性示出的目的，上述化合物包括：单酚(具有单个苯环并仅包含羟基基团作为取代基的分子，例如酚和对苯二酚)、酚醛(包含酚基团和醛基团两者，例如aldeide vanillica)、酚酸(例如肉桂酸)、苯胺(包含弱酸基团和强碱基团的两性分子，例如苯丙氨酸)、酚化合物(酚环结合至另一个苯环或其他具有羟基/内酯/酮官能团的杂环化合物，例如香豆素和呫吨酮)、类黄酮(由通过具有三个碳原子的链连接的两个苯环组成，链构成氧化杂环，例如儿茶酸、二氢黄酮(flavonon)、黄酮、查尔酮、黄烷酮醇、黄烷醇、无色花色素、花色素)、苯丙素(其特征在于存在具有含三个碳原子的脂肪族侧链的芳族环，例如羟基肉桂酸)和鞣酸。在本发明中，术语“酚”和“多酚”可以具有相同的含义，并可以一起使用或彼此替换用于组合目的。
术语“异种抗原”是指能够被免疫识别并能够诱发人受体有机体中的抗体/免疫介导的/炎症反应的动物来源的分子。在本发明中，术语“异种抗原(xenoantigen)”、“抗原”、“异种的抗原(xenogeneic antigen)”、“表位”和“关键抗原”可以具有相同的含义，并可以一起使用或彼此替换。
术语“结缔组织”包括：血管、心脏瓣膜、肌腱、韧带、心包膜、肌肉筋膜、硬脑膜、鼓膜、肠粘膜下层、软骨、脂肪组织和骨组织。
术语“固定”组织包括经受化学或生物试剂作用的组织，诸如出于非限制性示出的目的：戊二醛、甲醛和槲皮苷。
术语“固定的”组织包括经受化学或生物试剂作用，发展了具有以下功能的组织内交联的组织：稳定蛋白质、脂质和细胞结构以及降低受体的潜在抗原作用。在本发明的描述中，术语“固定的”和“交联的”可以描述相同类型的处理和/或具有相同的含义，并可以一起使用或彼此替代。
术语“异源”组织是指非人类来源的组织。能够将这种组织天然的或非处理的而不是经受了提高它们的再生性质的处理(诸如出于纯粹示例性的目的，去细胞化程序或用于细胞组分的促再生/防腐物质的涂覆/吸附的程序)来用于临床应用。在本发明的描述中，术语“异源”可以具有与“异种”相同的含义，并可以将它们一起使用或彼此替代。
术语“同源”组织是指人类来源的组织。能够将这种组织天然的或非处理的而不是经受了防腐处理(诸如出于纯粹示例性的目的，低温贮藏)或提高它们的再生性质的处理(诸如出于纯粹示例性的目的，去细胞化程序或用于细胞组分的促再生/防腐物质的涂覆/吸附/的程序)来用于临床应用。
术语“去细胞化程序”是指利用作为非限制性实例的盐水溶液(高渗、等渗或低渗)、洗涤液(离子、非离子或两性离子)和酶的所有单独的或多重的处理，以及其目的是部分、选择性或总体除去原始组织中存在的细胞组分。
术语“生物假体替代品”等同为适于替代有机体的缺失部分(四肢、器官或组织)或整合损伤的部分的旨在用于人或兽医临床应用的生物设备。在本发明的描述中，术语“生物假体替代品”、“生物假体(bioprosthese)”、“生物学假体(biological prosthese)”或“设备”可以具有相同的含义，并可以一起使用或用于彼此替换。
术语“敲除α-Gal抗原的动物”是指其中编码α-半乳糖基转移酶的基因沉默的动物。这种酶负责攻击α-Gal表位的膜糖蛋白和脂蛋白。其缺乏导致产生完全缺乏讨论的表位且在这方面与人体的组织可完全媲美的组织。在本发明中，将α-Gal抗原敲除的动物维管组织用作绝对的阴性对照。
以下是根据本发明的方法的应用的一些非限制性的实例。
一种根据本发明灭活生物组织、特别是能够用于制造生物假体替代品的组织和/或已经制备的且旨在人或兽医临床应用的生物假体替代品中的异种抗原的方法，包括以下步骤：
-提供基于酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物的溶液，用于灭活这些组织中的至少一部分异种表位；
-在受控条件下在基于酚/多酚的各种溶液中温育待处理的样品；
-使处理的组织经受一系列洗涤。
该方法还包括通过比较处理的/未处理的组织和敲除猪的组织的α-半乳糖基转移酶的基因对α-Gal表位的有效灭活进行评估的后续程序。
例如如在意大利专利号0001409783和EP2626701中公开的，能够提供这种程序。
生物组织由可以是天然的、或天然的和固定的、或固定的结缔组织组成。
生物组织可以是异源的或同源的。
抗原表位由α-Gal抗原组成。
温育步骤的受控条件包括在40±2℃的温度下的至少一次处理。
用于灭活来自这种组织的至少一部分异种表位的酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物由肉桂酸、丹宁酸和橄榄苦苷的衍生物组成。
具体地，以及举例来说，肉桂酸衍生物由咖啡酸组成。
具体地，以及举例来说，鞣酸衍生物由丹宁酸组成。
具体地，以及举例来说，橄榄苦苷衍生物由羟基酪醇组成。
具体地，以及举例来说，肉桂酸的至少一种苯基衍生物由咖啡酸组成。
具体地，以及举例来说，鞣酸的至少一种苯基衍生物由丹宁酸组成。
具体地，以及举例来说，橄榄苦苷的至少一种苯基衍生物由羟基酪醇组成。
通过本发明的非限制性实例来说，将根据本发明的用于灭活生物组织(是指能够用于制造生物假体替代品的组织)中的异种抗原的方法应用于构成以下生物假体替代品的模型的组织中的α-Gal表位的灭活：
-Hancock IITM猪心脏瓣膜(mod.T510，Medtronic Inc.，Minneapolis，USA)，在附图中以'HANCK'表示；
Figure BDA0001678708820000091
主动脉根心脏瓣膜(mod.995，Medtronic Inc.，Minneapolis，USA)，在附图中以'FREE'表示；
-Carpentier-Edwards S.A.V.(mod.6650，Edwards Lifesciences LCC，California，USA)，
-Carpentier-Edwards Perimount Plus(mod.6900P，Edwards LifesciencesLCC，California，USA)，在附图中以'PERI'表示；
-CardioCel Cardiovascular Patch(mod.C0404，Admedus Regen Pty Ltd，Perth，Australia)，在附图中以'CC'表示。
以下在实施方式的细节中描述了用于灭活生物组织中的异种抗原、以及特别地用于灭活生物假体替代品样品中的α-Gal表位的方法。
按照目前市场上可获得的上述模型，从生物假体替代品中提取组织样品。在轻滤纸遮盖(范围30-50mg)之后减幅(damp，潮湿)称重这种样品，以及将其切成小块以增加其暴露表面。
对于每种生物假体替代品，制备4组不同的样品(每组n＝8)。
每组将经受不同的方法。
基于酚衍生物制备4种不同的溶液，对应于根据本发明的方法的4种不同的应用变体，样品将最终是5ml的体积，具体是：
-方法Tl：5mM和50mM之间浓度的咖啡酸(在本发明中，采用20mM浓度)/磷酸钠与600±50U/ml酪氨酸酶的比值为[1:20]的缓冲液；
-方法T2：0.2±0.1M的NaOH中的5mM和50mM之间浓度的咖啡酸(在本发明中，采用20mM的浓度)；
-方法T3：磷酸钠缓冲液中的0.1M和1.5M之间浓度的丹宁酸(在本发明中，采用1M的浓度)；
-方法T4：0.2±0.1M的NaOH中的0.3mM和10mM之间浓度的羟基酪醇(在本发明中，采用6mM的浓度)。
在40±2℃的温度下将这些溶液在中度但持续的搅拌下作用总共12±2小时。
在温育最后，用等渗溶液使样品经受两次洗涤，每次持续15分钟，以及第三次洗涤是在专用缓冲液(TP)中持续15分钟。
在处理样品的表面上仍活跃的任何表位的存在的评估是基于发明人对示例性的方法的变更，并在意大利专利号0001409783和EP2626701中进行了描述。
简要地，将处理的和洗涤的组织样品放置在测试管中，向其中添加TP缓冲液直到1000uL和1500uL之间的最终体积。
然后，添加优选的[1:50]v/v的浓度的直接针对α-Gal表位的单克隆小鼠抗体(在本实施例中，是称为M86的IgM克隆)，并在37±2℃下在持续的但中度的搅拌下温育整体120±10分钟。
最后，在环境温度下使样品经受14,750x g的离心30±5分钟。
在用M86抗体温育期间，准备96孔板，其中孔的底部每室填充100uLα-Gal/血清清蛋白为5ug/ml的磷酸盐缓冲液。将因此准备的板在30℃和40℃的温度下温育60±10分钟，但是其优选的在37℃下稳定一切。然后在环境温度下用每孔300uL的磷酸盐缓冲液进行3次洗涤。
将第一次洗涤作用5分钟，两次随后的洗涤持续3分钟。
用每孔300uL的血清清蛋白进行封闭，随后在暗处在环境温度下温育60±10分钟。随后，进行如上的3次洗涤。
对于每个单独的孔，添加从每个处理的样品离心后提取的100uL上清液。
将样品加载到板中，每类样品占用整列的孔。随后在30℃-40℃之间的温度下温育板120±10分钟，但是优选的是在37℃下将一切稳定。
然后，进行如上的3次洗涤，每孔将添加100uL与过氧化物酶共轭的二次抗体(兔子多克隆抗-鼠)溶液(发现这种抗体的理想溶液是[1:1000]、[1:500]和[1:100]，优选地采用中间值[1:500])。
然后将板再次在30℃-40℃的温度下温育60±10分钟，但是其优选的在37℃下稳定一切。
然后进行如上的3次洗涤。每孔添加100uL的用于过氧化物酶的显色液，随后在暗处温育板5±1分钟。
随后，每孔添加50uL的由H2SO4 2M组成的终止溶液，然后在板阅读器中在450nm下记录板。
可以通过比较以下获得的表位的数目确定讨论的表位的百分比灭活：在由敲除α-Gal抗原的动物的维管组织组成的对照组织中，在未处理的生物假体组织中，以及在经受了上述的各种处理的组织中。
由图1清楚的是根据处理的各种不同的生物假体组织，以其变体应用T1的方法显示了明显的效果可变性。
T1方法示出了明显对于另一研究方案的更低的效力，示出其最好的灭活结果限于表位的约43％。
在图2中，可以看出利用肉桂酸衍生物的以其变体应用T2的方法仅示出了针对所述抗原的优异的灭活行为，灭活百分比包括在90％和98％之间，与T3变体(图3，灭活百分比包括在80％和100％之间)和T4变体(图4，灭活百分比包括在89％和95％之间)中的方法示出的结果类似。
本发明还涉及通过上述的方法获得的结缔组织。
这种结缔组织的特征在于其具有至少一些灭活形式的抗原组分。
本发明还涉及上述的结缔组织制造用于人或兽医临床领域的生物假体替代品和/或已经制备的生物假体替代品的应用。
本发明还涉及用于实施上述的灭活生物组织中的异种抗原的方法的试剂盒。
这种试剂盒至少包括：
-一个或多个包含缓冲液的容器，最合适剂量的酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物待溶解于该缓冲液中；
-一个或多个包含粉末形式的待与缓冲液结合的所述剂量的酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物的容器；
-一个或多个包含洗涤缓冲液的容器；
-说明书，包含步骤应用的时间和模式的说明。
试剂盒的预设应用是利用上述的根据本发明的方法针对已经制备的生物假体替代品的自主处理，可用于健康设施诸如诊所和医院。
实际上，已经发现本发明充分实现了预期的目的和目标。
具体地，在本发明中，已经设计了用于灭活生物组织中的异种抗原、以及特别是旨在生产用于临床和/或兽医应用的生物假体代替品的组织中的α-Gal表位的方法。
此外，在本发明中，已经设计了用于灭活上述的抗原的方法，因此保证可以将有效的处理应用于各种不同类型的目前市场上的组织生物假体。
因此，在本发明中，已经设计了潜在地能够在植入用这种方法处理的组织之后没有导致抗-α-Gal抗体循环增加的方法。
此外，在本发明中，已经设计了能够限制钙盐的沉积，因此不利于形成瓣膜的钙化发育不全的表位的方法。
最后但并非最不重要的，在本发明中，已经设计了可以用常规的设备和机器实施的方法。
因此设想的本发明容许许多的更改和变体，所有都在所附权利要求的范围内。此外，可以通过其他技术上相当的元件来替换所有细节。
实际上，采用的组分和材料可以是根据要求和现有技术水平的任一种，条件是它们与具体应用和临时的尺寸和形状兼容。
意大利专利申请号102015000078236(UB2015A006019)中的公开内容，通过引用将其全部内容结合于此。
参考文献
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Claims (12)

1.一种灭活生物组织中和/或已经制备的且旨在用于人或兽医临床应用的生物假体替代品中的异种抗原的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
-提供基于酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物的溶液，用于灭活来自所述组织的至少一部分异种表位；
-在受控条件下在基于酚/多酚的各种溶液中温育待处理的样品；
-使处理的组织经受一系列洗涤，
其中，所述抗原的表位是α-Gal抗原，
用于灭活来自所述组织的至少一部分所述异种表位的所述酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物由肉桂酸和橄榄苦苷的衍生物组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物组织是能够用于制造生物假体替代品的组织。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述生物组织由天然的、或天然的和固定的、或固定的结缔组织组成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述生物组织是异源的或同源的。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述受控条件至少包括在40±2℃的温度下的处理。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述肉桂酸的衍生物由咖啡酸组成。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述橄榄苦苷的衍生物由羟基酪醇组成。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于肉桂酸的至少一种苯基衍生物由咖啡酸组成。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于橄榄苦苷的至少一种苯基衍生物由羟基酪醇组成。
10.利用根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的结缔组织，其特征在于所述结缔组织具有至少一部分灭活形式的抗原组分。
11.根据权利要求10所述的结缔组织用于制造在人或兽医临床领域应用的生物假体替代品和/或已经制备的生物假体替代品的部件的应用。
12.一种用于实施根据权利要求1-9中任一项所述的灭活生物组织中的异种抗原的方法的试剂盒，其特征在于所述试剂盒至少包括：
-一个或多个包含缓冲液的容器，最合适剂量的酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物待溶解于所述缓冲液中；
-一个或多个包含粉末形式的待与所述缓冲液结合的所述剂量的酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物的容器；
-一个或多个包含洗涤缓冲液的容器；
-说明书，包含步骤应用的时间和模式的说明，
其中，所述抗原的表位是α-Gal抗原，
用于灭活来自所述组织的至少一部分所述异种表位的所述酚化合物、多酚化合物或它们的衍生物由肉桂酸和橄榄苦苷的衍生物组成。
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