CN108703958A - 一种协同链黑菌素制备抗肿瘤纳米组合药物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种协同链黑菌素制备抗肿瘤纳米组合药物的方法，将TEMPOL与STN一起镶嵌在MSNs中形成一种由链黑菌素和氮氧自由基组合的纳米抗肿瘤药物，该纳米材料可以很好的容纳链黑菌素活性分子，起到靶向运输，使其能够在最大程度上减小毒副作用；同时，通过氮氧自由基再次对链黑菌素进行解毒；另外，利用来那度胺分子特异性地修饰到纳米分子表面，与整合素结合靶向输送组合药物到肿瘤细胞，起到高效利用链黑菌素和消除其对他正常细胞的毒副作用的效果。

Description

一种协同链黑菌素制备抗肿瘤纳米组合药物的方法
技术领域
本发明属于医药制造领域，具体涉及一种协同链黑菌素制备抗肿瘤纳米组合药物的方法。
背景技术
链黑菌素(Streptonigrin，STN)是由绒毛链霉菌所产生的抗肿瘤抗生素，呈咖啡色至黑色片状结晶，微溶于水、乙醇、乙酸乙酯、氯仿，溶于二氧六环及吡啶。STN可选择性地抑制DNA合成，一个分子的STN可与2000个分子的脱氧核苷酸稳定地结合，并能使肿瘤细胞染色体继裂，使已形成的DNA降解。因此它具有广谱的抗肿瘤活性，特别是对恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和慢性粒细胞白血病具有较好的临床疗效。在STN分子中具有氨基醌的结构，有利于保持其生物活性。STN在抗癌活性上比目前临床使用的抗癌药物依托泊苷和替尼泊苷高很多，但由于其较强的毒性曾一度停止使用，临床表现为有很强的骨髓抑制作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种协同链黑菌素制备抗肿瘤纳米组合药物的方法，制备的产品在利用链黑菌素高效治疗肿瘤的同时，减少对其它正常细胞的毒副作用，更好的发挥链黑菌素在肿瘤治疗方面的疗效。
本发明采取的技术方案为：
一种协同链黑菌素制备抗肿瘤纳米组合药物的方法，包括以下步骤：
步骤一、载体的制备
(1)MSNs的制备
首先利用间苯二酚-甲醛树脂、福尔马林水溶液和NaOH水溶液制得酚醛树脂；然后将三嵌段共聚物PluronicF127(模板剂)溶解于蒸馏水中得到浓度为2％～10％的模板剂水溶液，并将pH调至6～8；在调节了pH值的模板剂水溶液中加入制得的酚醛树脂，在60℃下以320rpm搅拌1.5～2h，然后加入40mL水，反应12～14小时；将得到的溶液用3倍体积的水稀释，再转移到高压釜中，115℃下加热24小时，最后将所得产物进行离心收集，并用蒸馏水洗涤后干燥得到孔径为3～5nm的MSNs；
(2)双层介孔的碳-氧化硅复合核-壳结构纳米球的合成
采用法在MSNs上涂覆一层无孔二氧化硅壳(nSiO2)，然后采用表面活性剂辅助的溶胶-凝胶法在氨溶液中涂覆一层介孔二氧化硅，最后，用弱碱性溶液选择性蚀刻中间无定形二氧化硅层，获得均匀的棘状核-壳纳米结构，在600℃下，N 2气中煅烧，使内部聚合物芯碳化，得到纳米球载体；
步骤二、载体的表面修饰
(1)载体的表面氧化
用高浓度强酸(体积比为3∶1的H2SO4和HNO3混酸)处理纳米球载体，并用水洗涤至中性，再真空干燥得氧化载体，然后通过二亚胺活化的酰胺化反应将聚乙烯亚胺(PEI)共价键接合到氧化后的纳米球载体上；
(2)连接来那度胺分子
准备两份二甲基亚砜(DMSO)溶液，在其中一份中混合来那度胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，25℃下搅拌0.5小时形成溶液A，同时，将连接了PEI的氧化载体分子分散在另一份DMSO中形成溶液B，然后，将溶液B加入到溶液A中，搅拌，再将得到的固体离心并依次用DMSO、水和乙醇洗涤，最后在60℃下真空干燥12小时；
步骤三、抗肿瘤组合药物的上载
将纳米颗粒载体悬浮于含磷酸盐缓冲液的STN水溶液中，然后在黑暗中搅拌，离心收集纳米颗粒，并用缓冲液洗涤直至上清液变为无色，之后进行过滤、干燥；将干燥后含有STN分子的纳米颗粒载体悬浮于含磷酸盐缓冲液的TEMPOL水溶液中，然后在黑暗中搅拌，离心收集纳米颗粒，并用缓冲液洗涤直至上清液变为无色，再次进行过滤、干燥得到颗粒状产物。
进一步的，步骤二中，在氧化载体上接枝聚乙烯亚胺(PEI)的方法为：将20mg氧化的载体分子溶解于2-(4-吗啉代)乙磺酸(MES，50mM，pH＝6.0)的40mL缓冲水溶液中，25℃下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，40mg，1mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，35mg，2.5mmol)后放置0.5小时；将分散在MES溶液(5mL)中的PEI(60mg，1mmol)加入到活化的氧化载体溶液中，在25℃下搅拌24小时，使聚乙烯亚胺(PEI)共价键接合到氧化后的纳米载体球上；最后，用水重复洗涤材料数次，除去过量的EDC、NHS和PEI，并在60℃下将PEI接枝的载体真空干燥12小时。
本发明的有益效果：
1.该技术中采用双层介孔的碳-氧化硅复合核-壳结构纳米球来嵌入两种药物，内核与疏水性STN结合，外核与亲水性基团氮氧自由基TEMPOL结合，这样既能稳定地与载体结合，又能使STN对肿瘤发挥药效的同时通过TEMPOL对其进行解毒。
2.该技术中运用了来那度胺作为肿瘤细胞表面能够识别的特异性分子，使载体和药物能够靶向运输到肿瘤细胞区域。从而使肿瘤区域药物浓度升高，药效更高，而到达其他正常细胞的药物减少，减小对正常细胞的毒副作用，并且来那度胺可以用于肿瘤治疗后复发的多发性骨髓瘤的治疗，与STN联合使用能发挥更好的治疗效果。
综上，本发明将TEMPOL与STN一起镶嵌在MSNs中形成一种由链黑菌素和氮氧自由基组合的纳米抗肿瘤药物。这种纳米材料可以很好的容纳链黑菌素活性分子，通过氮氧自由基与二价铁离子发生反应可以阻断毒性分子(羟基自由基)的产生，并且氮氧自由基还具有捕捉羟基自由基的能力，从而达到降低链黑菌素毒副作用的效果；同时，利用介孔二氧化硅纳米粒子表面易修饰的特点，使用来那度胺分子修饰MSNs，与整合素结合靶向输送组合药物到肿瘤细胞，起到高效利用链黑菌素和消除其对其它正常细胞的毒副作用的效果。
附图说明
图1为本发明实施例1不同处理方式下肿瘤细胞存活率与药物浓度的关系图；
图2为本发明实施例1不同处理方式下肿瘤细胞存活率与温度的关系图；
图3为本发明实施例2不同处理方式下肿瘤细胞存活率与药物浓度的关系图；
图4为本发明实施例2不同处理方式下肿瘤细胞存活率与温度的关系图。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
一种协同链黑菌素制备的高效无毒抗肿瘤纳米组合药物，由下述步骤组成：
步骤一、载体的制备
1.MSNs的制备
首先，将间苯二酚-甲醛树脂(0.6g)，福尔马林水溶液(2.1mL，37wt％)和NaOH水溶液(15mL，0.1M)在70℃下混合并搅拌，保温0.5小时制得酚醛树脂。将F127(2.6g)溶解于蒸馏水(15mL)中，pH调至6.5。加入酚醛树脂，在60℃下以320rpm搅拌1.5h，然后加入水(40mL)，反应12小时。将得到的溶液用体积比为1比3的水稀释，转移到高压釜中，115℃下加热24小时。离心收集产物并用水洗涤三次，在真空下干燥。
2.双层介孔的碳-氧化硅复合核-壳结构纳米球的合成
在溶液(10mL)中使MSNs涂覆一层无孔二氧化硅壳(nSiO2)。然后采用表面活性剂辅助的溶胶-凝胶法在氨溶液(15mL)中涂覆一层介孔二氧化硅。最后，用弱碱性溶液选择性蚀刻中间无定形二氧化硅层，获得均匀的棘状核-壳纳米结构。在600℃下，N 2气氛中煅烧，使内部聚合物芯碳化。
步骤二、载体的表面修饰
1.载体的表面氧化
将纳米球载体加入到浓硫酸(98％)和浓硝酸(70％)的混合溶液(两种酸的比例为3:1)中，35℃超声处理4小时，离心收集氧化的纳米球载体，用水洗涤至pH中性，真空干燥过夜。
将氧化的载体分子(20mg)溶解于2-(4-吗啉代)乙磺酸(MES，50mM，pH＝6.0)的40mL缓冲水溶液中，25℃下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，40mg，1mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，35mg，2.5mmol)后放置0.5小时。将分散在MES溶液(5mL)中的PEI(60mg，1mmol)加入到活化的氧化载体溶液中，在25℃下搅拌24小时，使聚乙烯亚胺(PEI)共价键合到氧化后的MSNs分子上。最后，用水重复洗涤材料几次，除去过量的EDC，NHS和PEI。最后，在60℃下将PEI接枝的载体真空干燥12小时。
2.连接来那度胺分子
在二甲基亚砜(DMSO，25mL)中混合来那度胺(22mg，0.5mmol)、EDC(42mg，0.5mmol)和NHS(70mg，1.25mmol)，25℃下轻轻搅拌0.5小时。然后，加入预先分散在DMSO中的连接了PEI的氧化载体分子(25mg)，室温下搅拌24小时。将得到的固体离心并依次用DMSO，水和乙醇洗涤，60℃下真空干燥12小时。
步骤三、抗肿瘤组合药物的上载
将纳米颗粒载体(1mg)悬浮于含磷酸盐缓冲液的STN水溶液中(5mL，120mg·mL-1，pH＝7.4)。然后在黑暗中搅拌24小时，离心收集药物与载体的复合物，并用缓冲液仔细洗涤直至上清液变为无色。用同样的方法将TEMPOL上载。
实施例1药物的释放(验证试验)
接种在铺满80％汇合度的96孔板上的HeLa细胞用不同浓度的纳米颗粒和载有STN与TEMPOL的纳米颗粒处理8小时。通过用磷酸缓冲盐溶液漂洗除去未结合的纳米颗粒。将新鲜培养基加入孔中后，分别用808nm激光(每次处理25分钟，处理三次)照射细胞，进行光热和化学-光热处理。之后，将细胞在37℃再培养12小时。通过CCK8测定法测量细胞活力。比较以下各组实验结果如图1和图2，可以看到通过NIR激光照射和上载了药物的纳米颗粒同时处理HeLa细胞对细胞的杀伤率最高。
实施例2
步骤一、载体的制备
1.MSNs的制备
首先，将间苯二酚-甲醛树脂(0.8g)，福尔马林水溶液(2.1mL，37wt％)和NaOH水溶液(18.2mL，0.1M)在75℃下混合并搅拌，保温0.5小时制得酚醛树脂。将F127(3.4g)溶解于蒸馏水(25mL)中，pH调至7.0。加入酚醛树脂，在66℃下以340rpm搅拌2h，然后加入水(70mL)，反应16小时。将得到的溶液用体积比为1比3的水稀释，转移到高压釜中，130℃下加热24小时。离心收集产物并用水洗涤三次，在真空下干燥。
2.双层介孔的碳-氧化硅复合核-壳结构纳米球的合成
在溶液(20mL)中使MSNs涂覆一层无孔二氧化硅壳(nSiO2)。然后采用表面活性剂辅助的溶胶-凝胶法在氨溶液(25mL)中涂覆一层介孔二氧化硅。最后，用弱碱性溶液选择性蚀刻中间无定形二氧化硅层，获得均匀的棘状核-壳纳米结构。在650℃下，N 2气氛中煅烧，使内部聚合物芯碳化。
步骤二、载体的表面修饰
1.载体的表面氧化
将纳米球载体加入到浓硫酸(98％)和浓硝酸(70％)的混合溶液(两种酸的比例为3:1)中，35℃超声处理4小时，离心收集氧化的纳米球载体，用水洗涤至pH中性，真空干燥过夜。
将氧化的载体分子(30mg)溶解于2-(4-吗啉代)乙磺酸(MES，50mM，pH＝6.0)的55mL缓冲水溶液中，25℃下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，55mg，1mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，50mg，2.5mmol)后放置0.5小时。将分散在MES溶液(15mL)中的PEI(75mg，1mmol)加入到活化的氧化载体溶液中，在25℃下搅拌24小时。最后，用水重复洗涤材料几次，除去过量的EDC，NHS和PEI。最后，在60℃下将PEI接枝的载体真空干燥12小时。
2.连接来那度胺分子
在二甲基亚砜(DMSO，34mL)中混合来那度胺(22mg，0.5mmol)、EDC(56mg，0.5mmol)和NHS(87mg，1.25mmol)，25℃下轻轻搅拌0.5小时。然后，加入预先分散在DMSO中的连接了PEI的氧化载体分子(40mg)，室温下搅拌24小时。将得到的固体离心并依次用DMSO，水和乙醇洗涤，60℃下真空干燥12小时。
步骤三、抗肿瘤组合药物的上载
将纳米颗粒载体(5mg)悬浮于含磷酸盐缓冲液的STN水溶液中(20mL，120mg·mL-1，pH＝8)。然后在黑暗中搅拌24小时，离心收集药物与载体的复合物，并用缓冲液仔细洗涤直至上清液变为无色。用同样的方法将TEMPOL上载。
实施例2药物的释放
接种在铺满80％汇合度的96孔板上的HeLa细胞用不同浓度的纳米颗粒和载有STN与TEMPOL的纳米颗粒处理8小时，设置空白对照(不加任何试剂，其他条件同实验组相同)。通过用磷酸缓冲盐溶液漂洗除去未结合的纳米颗粒。将新鲜培养基加入孔中后，分别用808nm激光(每次处理25分钟，处理三次)照射细胞，进行光热和化学-光热处理。之后，将细胞在37℃再培养12小时。通过CCK8测定法测量细胞活力。比较以下各组实验结果如图3和图4，可以看到通过NIR激光照射和上载了药物的纳米颗粒同时处理HeLa细胞对细胞的杀伤率最高。
药物的释放原理和过程
通过疏水相互作用和超分子π-π堆积作用与抗肿瘤药物链黑菌素相结合，制备具有pH响应性的DDS。药物的上载和释放依赖于pH值的改变。在中性和弱碱条件下，STN处于非电离状态，易脱盐从而变得疏水，可以与MSNs紧密结合，完成药物的上载；在较低pH值下，STN因为分子结构中的-NH2发生质子化，处于电离状态，亲水性增强，导致在溶液中的溶解度更高，减弱了与MSNs的疏水作用，从孔材料中游离出来，从而实现药物的释放。温度也是释药的触发机制。载体在正常体温时能够稳定携带药物在体内长期循环，一旦到达肿瘤加热部位，温度升高，载体稳定性改变，在加热部位沉积下来或将其中携带的药物渗漏出来，导致肿瘤部位药物浓度增加，从而达到高效治疗的目的。
氮氧自由基、介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)、整合素、来那度胺的介绍：
氮氧自由基可以渗透细胞，是与顺磁物质(如过渡金属或短寿命自由基)反应的稳定自由基。氮氧化物可经历单电子选择性氧化还原反应，从而潜在地修饰细胞毒性药物的活性。稳定的氮氧自由基可用来作为信号传递的官能团，来研究药物和其他生物大分子配体的相互作用，这种基团在生理pH值水溶液系统很稳定。另外氮氧自由基还具有清除体内自由基的能力，保护细胞大分子免受氧化损伤。4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-N-烃氧基(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl，TEMPOL)是一种稳态的高活性自由基，一旦遇到聚合或由热和氧所产生的各种自由基(如R·或ROO·)时，迅速与其结合成为稳定分子，其氮氧自由基与还原铁离子的反应如下。
Fe(II)+R'RN-O·+H+→
Fe(III)+R'RN-OH,
新型功能性纳米材料在设计和制备技术方面的进步为纳米医学的发展提供了很大的机遇。作为一种新型无机材料体系，介孔碳纳米材料结合了介孔的结构以及碳质组成的特点，显示出不同于传统介孔二氧化硅以及其它一些碳基材料体系(碳纳米管、石墨烯、富勒烯等)的优越特性。介孔碳纳米材料在药物的吸附与控释、光热治疗、协同治疗、肿瘤细胞的荧光标记、催化、生物传感、生物大分子的分离等诸多领域表现出其他多孔材料难以达到的优越性和应用潜力。介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)是最具代表性的被开发用于生物医药的介孔材料，其具有很高的生物相容性、可调的生物降解性质、持续的药物释放行为以及表面易修饰等特点。
整合素为细胞黏附分子家族的重要成员之一，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互黏附，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导。αvβ3可以表达于多种细胞类型，并与多细胞活动过程中的多种配体结合，参与肿瘤的血管生成，侵袭转移、炎症、伤口愈合和凝血等生理和病理过程。整合素在多种肿瘤表面和新生血管内皮细胞中有高表达，对肿瘤血管生成起着重要作用，其中αvβ3的作用尤为重要。因此，整合素αvβ3成为许多抗肿瘤血管生成药物的靶点。含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的多肽(Arg-Gly-Asp，RGD)可为整合素αvβ3受体识别。
来那度胺(lenalidomide)化合物为黄色固体，化学名为3-(7-氨基-3-氧代-1H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮，由该化合物制得的抗肿瘤药物具有抗肿瘤、免疫调节和抗血管生成等多重作用。能够与肿瘤细胞表面高度表达的整合素受体特异性结合。可以用于肿瘤既往治疗后复发的多发性骨髓瘤。

Claims (2)

1.一种协同链黑菌素制备抗肿瘤纳米组合药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、载体的制备
(1)MSNs的制备
首先利用间苯二酚-甲醛树脂、福尔马林水溶液和NaOH水溶液制得酚醛树脂；然后将模板剂三嵌段共聚物PluronicF127溶解于蒸馏水中得到浓度为2％～10％的模板剂水溶液，并将pH调至6～8；在调节了pH值的模板剂水溶液中加入制得的酚醛树脂，在60℃下以320rpm搅拌1.5～2h，然后加入40mL水，反应12～14小时；将得到的溶液用3倍体积的水稀释，再转移到高压釜中，115℃下加热24小时，最后将所得产物进行离心收集，并用蒸馏水洗涤后干燥得到孔径为3～5nm的MSNs；
(2)双层介孔的碳-氧化硅复合核-壳结构纳米球的合成
采用法在MSNs上涂覆一层无孔二氧化硅壳(nSiO2)，然后采用表面活性剂辅助的溶胶-凝胶法在氨溶液中涂覆一层介孔二氧化硅，最后，用弱碱性溶液选择性蚀刻中间无定形二氧化硅层，获得均匀的棘状核-壳纳米结构，在600℃下，N2气中煅烧，使内部聚合物芯碳化，得到纳米球载体；
步骤二、载体的表面修饰
(1)载体的表面氧化
用体积比为3∶1的H2SO4和HNO3制成的高浓度强酸处理纳米球载体，并用水洗涤至中性，再真空干燥得氧化载体，然后通过二亚胺活化的酰胺化反应将聚乙烯亚胺共价键接合到氧化后的纳米球载体上；
(2)连接来那度胺分子
准备两份二甲基亚砜溶液，在其中一份中混合来那度胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，25℃下搅拌0.5小时形成溶液A，同时，将连接了PEI的氧化载体分子分散在另一份DMSO中形成溶液B，然后，将溶液B加入到溶液A中，搅拌，再将得到的固体离心并依次用DMSO、水和乙醇洗涤，最后在60℃下真空干燥12小时；其中，PEI是聚乙烯亚胺的简称，DMSO是二甲基亚砜的简称；
步骤三、抗肿瘤组合药物的上载
将纳米颗粒载体悬浮于含磷酸盐缓冲液的STN水溶液中，然后在黑暗中搅拌，离心收集纳米颗粒，并用缓冲液洗涤直至上清液变为无色，之后进行过滤、干燥；将干燥后含有STN分子的纳米颗粒载体悬浮于含磷酸盐缓冲液的TEMPOL水溶液中，然后在黑暗中搅拌，离心收集纳米颗粒，并用缓冲液洗涤直至上清液变为无色，再次进行过滤、干燥得到颗粒状产物。
2.如权利要求1所述的一种协同链黑菌素制备抗肿瘤纳米组合药物的方法，其特征在于，步骤二中，在氧化载体上接枝聚乙烯亚胺的方法为：将20mg氧化的载体分子溶解于2-(4-吗啉代)乙磺酸的40mL缓冲水溶液中，25℃下加入EDC和NHS后放置0.5小时；将分散在MES溶液中的PEI加入到活化的氧化载体溶液中，在25℃下搅拌24小时，使PEI共价键接合到氧化后的纳米载体球上；最后，用水重复洗涤材料数次，除去过量的EDC、NHS和PEI，并在60℃下将PEI接枝的载体真空干燥12小时，其中，MES是2-(4-吗啉代)乙磺酸的简称。
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