JPH05501259A

JPH05501259A - 生物活性化合物と部位特異的化合物の界面縮合およびそれらの複合体

Info

Publication number: JPH05501259A
Application number: JP2515513A
Authority: JP
Inventors: ラシドロ、ウルフガング・ジェイ
Original assignee: ブランズウイック・コーポレイション
Priority date: 1989-10-10
Filing date: 1990-10-02
Publication date: 1993-03-11
Also published as: AU6710890A; EP0494998A1; WO1991005806A1; CA2067210A1; US5166319A; EP0494998A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】生物活性化合物と部位特異的化合物の界面縮合およびそれらの複合体産業上の利用分野本出願の技術分野は、縮合反応において活性結合部位を保護しつつ、界面縮合によって化合物間の共有結合を形成する、生物活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ）化合物と部位特異的（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）化合物の複合体に関する。

この技術分野はさらに、生物活性化合物と部位特異的化合物との複合体に関する。複合体を形成する成分は互いに直接連結していても、または様々なリンカ−（ｌｉｎｋｅｒ）分子を介して連結していても良い。

さらに詳細には、本発明はモノクローナル抗体と細胞毒性物質を界面縮合反応によって複合させた治療剤の製造に関する。

発明の背景本発明は生物活性化合物と生物学的部位特異的化合物との共有結合複合体を作成する方法に関する。生物活性化合物は、化粧用、治療用または医療用化合物であり、薬品、ホルモン類、細胞毒性化合物のようなものである：部位特異的化合物は好ましくは抗体であり、特にモノクローナル抗体およびその類似物である。この方法による複合体は、反応体の生物活性および部位特異的性質を保持している。

本発明はまたこのような方法の製造物である化学物質、特に生物活性分子と部位特異的タンパク質との共有結合複合体に関する。更に詳しくは、高いレベルの生物活性作用と部位特異性と共に、投与した場合に宿主生体に対し、ての副作用および全身作用が最少である高度に均質な化合物に関する。

本発明はまたかような複合体を医学的処置あるいは個人的な特別の美容上の要求のために、宿主生体に投与する方法を含有する。

患者を医学的に治療する場合において主要な問題は、強力であると予想される薬品が、その患者の身体の他の部分へのダメッジを与える副作用が強すぎるために使用できないことである。天然物、合成品両方の多数の化学物質は最初、広く様々な病気に対して新しい薬品となる可能性を示す。しばしば、化学物質の最初のスクリーニング試験は良好な毒性、成育制御作用、免疫刺激あるいは抑制、またはその他のイン・ビトロ（卸匝）において有用な性質を示す。

しかしながら生きている生物で試験を行った時には、これらの活性薬物の大部分の隠された有効性は、全く検出されないかあるいはイン・ビポ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）において判明した副作用で厳しく制限されるかである。しばしば問題は、適量判定にある。希望する治療効果を示すのに必要な薬物の量あるいは濃度は、処置される生体によて寛容されるには多すぎる。これはヒトおよび他の動物における癌の化学療法において特に顕著である。重篤な副作用が一般に抗癌治療と共に起こる。多くの薬物はたとえ、現在使用されているものより強い抗癌活性を得ることができても通常の細胞毒の使用のもと、これらの薬物の使用が患者を癌より先に殺してしまうことになる。　強い薬物の毒性問題を避けて通るために、多くのアプローチがなされている。これらのうちで最も魅力的なアプローチは、作用部位に特異的に薬物を投与する方法として化学的複合体を使用することを含む方法である。ゴールは薬物を部位特異的な化合物と反応させて複合体を作成し、この治療的および部位特異的性質の組み合わせを使用することにある。効果的な特異的ターゲツティングの結果、低濃度の複合体によって、例えば癌細胞内、寄生生物内または分泌細胞内においては薬物を高濃度とし、一方で身体全体にかかる負担を小さくする。初期段階の成功を示しており、強い効果が期待されるターゲツティングの道具は、特異的タンパク質、特にモノクローナｌし抗体および抗体フラグメントである。もとの状態においては、これらは特定の抗原に結合する。選択されたモノクローナル抗体を含有する複合体の強い有効性およびこれらの複合体の癌細胞に対する治療効果の説明は、ヤンとレイスフエルド（Ｙａｎｇ、　＋ｌ、　Ｍ、　ａｎｄＲｅｉｓｆｅｌｄ、　Ｒ，Ａ、）のブロック・ナチュール・アカド・サイ、ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｕｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）第８５巻第１１８９〜１１９３頁（１９８８年２月）およびヤンとレイスフエルドのジエイ・ナショナル・キャンサー・インスティテユート（Ｊ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）第８０巻第１４号第１５４〜１５９頁（１９８８年９月）の記事に示されている。

適当なスクリーニング手法によって調製された場合、モノクローナル抗体はそのターゲットに対して鋭敏な特異性を有する。医学的に大変重要なターゲットはヒト固形癌抗原である：これらの癌は化学療法薬剤の投与に対して大変強い抵抗性である。これらの癌に対して部位特異的であることが知られているモノクローナル抗体がいくつか存在する。

活性な治療用部位特異的薬剤化合物を製造しようとする際の主な問題は、薬剤− 抗体複合体の調製時に発生する。薬剤および関連物質を、直接またはリンカ−分子を介して抗体に結合する従来の化学的方法には、以下に示すような４つの大きな問題点がある：すなわち、連結反応は抗体分子の活性基にランダムにおこり、しばしば分子の部位特異的領域の近辺あるいは内部にある活性基に連結反応がおこり、複合体の特異性を深刻に変化あるいは減少させる結果となっている：連結は通常、生理的条件下においては一部不安定であり、このため複合体が加水分解して薬物がターゲットに到達する前に、全身に対して少なくともい（らかは遊離してしまう；この薬物に使用される活性化物質のほとんどは水によりて不活性化してしまうため、反応体と複合反応の調節をする反応物との割合を水溶液中で化学当量とするのは非常に困難である：親油性薬物は、抗体類と連結して均質な複合体となるのが非常に困難であるかまたは不可能である。

生物学的に部位特異的な化合物は、ターゲット抗原とのみ結合する能力を決定する、ひとつあるいはそれ以上の活性な結合部位をその分子に有している。これは、抗体によって最も良く例証される。

治療用化合物を抗体に複合させる伝統的な方法においては、抗体を構成しているアミノ酸の特定の基、例えばリジンのイプシロン（ε−）アミノ酸、と反応することに関しては特異性を示すが、抗体構造中のこのアミノ酸の位置に関しては特異性がない。アミノ酸は抗体構造中に殆どランダムに分散しているため、複合反応は、分子の定常領域内と同様、変異領域の活性結合部位内の反応性基にも形成される。従来の方法で調製した抗体複合体は、生物活性物質が抗体の活性結合部位内に結合したために不活性化した、あるいはその特異性が変化した分子を一部含有する。望みのターゲットに結合する能力が減少した抗体分子の割合は結合部位内にある反応性基の位置および数と、選択した反応条件による。例えば、抗体の結合部位内にひとつの反応性基があれば、その反応性基を介して複合した薬物はターゲットに対する抗体の結合を全て妨げるので、抗体溶液の徹底的な複合体は形成されるが、ターゲットに対する特異性が全くな（なったものとなる。もしこれを全く調節しながった場合、製造された物質の特異的な活性が減少し、全身的な毒性が上昇するという結果は避は難い。ジョーズ（Ｊ、ｆ、　Ｇｏｅｒｓ）らによる欧州特許願第０１７５６１７号には、治療用薬剤との反応中に抗体の部位特異性が減少するという理由でこの分野に起こった問題を開示している。

白金ベースの化学療法剤を製造する際の同様の問題は、ヘラファーマン（Ｊ、　Ｇ、　Ｈ６ｆｆｅｒｍａｎ）が欧州特許願第０１６７３１０号および第０１６９６４５号において論じている。

本発明は上に挙げた４つの問題をそれぞれ解決して、より安定で、より均質で、他の方法で調製した場合より特異的で、ターゲット細胞に対するより強い特異性を有し、より少ない副生成物を有し、より少ない副作用を与え、そのため患者に対してより毒性が少ない生物活性物質−抗体複合体を得る。

本発明には抗体、特にモノクローナル抗体と生物活性物質の複合体も含有する。

これらの複合体は一方の親物質の生物活性と、他方の親物質の部位特異性を示す、あるいはもたらす。生物活性化合物の語はここでは化粧品用化合物および薬理作用剤、毒、細胞毒素、アルキレート剤、酵素、抗生物質、抗代謝剤、ホルモン類、神経伝達物質、放射線不透過染料、放射性同位元素、発蛍光剤、バイオ−マーカー、レクチン、フォトケミカル（ｐｈｏｔｏｃｈｅｉｉｃａｌｓ）、細胞膜調節物質、抗増殖剤および重金属のような治療用、診断用化合物を示す。これらの化合物は化粧および治療目的に使用され、典型的には薬物、特に細胞毒性および細胞活性化合物、放射線トレーサー、放射性核種および発蛍光剤や類似物のような診断薬、ホルモン、重量増加および重量減少化合物および他の生物活性タンパク質、および関連する生物的に合成される化合物および類似物であって、その反応において、その化合物自身は部位特異的でない化合物である。

細胞あるいは宿生生体効果に関しては、生物活性化合物の細胞崩壊、細胞増殖の抑制、ホルモン治療、遺伝子治療、細胞の状態の診断、細胞の位置のトレース、細胞重量の同定、健康な細胞の処置および健康な細胞の修飾の機能を応用する。

上に述べた機能を利用する生物活性、部位特異的複合体は、癌治療、風疹、グラム陰性菌の感染、Ｂ型肝炎、血塊、破傷風、感染性の風邪、リューマチ様関節炎、心臓血管病および敗血症的ショックの治療に使用される。これらはまた移植拒絶防止において、レニン阻害のために、プロドラッグとして、非治療的診断薬としておよび金属連結化合物として使用することができる。

生物学的部位特異性化合物の語はここでは、タンパク質、抗体、抗体のフラグメント、リポソーム、ウィルス、ファージおよびステロイドホルモンを含有する。

これらの化合物は典型的には水溶性あるいは水混和性であり、少なくとも一つの、固有のそして特定の抗原に結合する結合部位を有する。抗原は、治療処置あるいは生物活性機能が作用する細胞あるいは細胞性生体を、唯一あるいはそれに近く特徴づけるものである。部位特異的化合物は生物活性化合物と共有結合を形成する適当な官能基を有し、その共有結合は部位特異的化合物の複合部位と呼ばれる部位にあるだろうということわかる。

加えて、活性結合部位は部位特異的化合物がそのターゲット分子あるいは抗原に結合する部位のことをいう。

生物活性、部位特異的複合体の語は、ここでは生物活性化合物と部位特異的化合物との縮合の生成物を指すように使われ、この複合体はそれ自身で、あるいは加水分解に調節されて親化合物の生物活性と部位特異性を示す。分子レベルにおいては、この２種の親化合物の間に縮合反応により形成された、少なくともひとつの共有結合があるということになる。複合体は生物活性化合物の部位特異的化合物に対する化学当量的割合が１より低くてもかまわない。典型的には、部位特異的化合物１モルに対して、２モルまたはそれ以上の生物活性化合物がある。

特に重要な生物活性化合物のクラスは、高度に親油性で、身体脂肪分に可溶でかつ水分に不溶であるために、モノクローナル抗体や他のタンパク質との複合体に関しての本格的な研究や適応から除外されてきた、強力な細胞毒性および細胞活性化合物である。このような興味ある化合物はかなりの数にのぼるが、モノクローナル抗体や類似物と複合体を作製しようとする試みは、タンパク質の非可逆的変性をひきおこし、そして複合体は部位特異性を無くしてしまっていた。これらの化合物のうち、典型的なそして代表的なものとしては、カロチノイド類（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）とレチノイド類（ｒｅｔｉｎｏｊｄｓ）がある。

カロチノイド類およびレチノイド類は大変類似している化合物であり、ヒトを含む殆どの生命体中に様々な化学的類縁体が認められる。これらの本来の機能は殆ど分かっていないが、これらの化学物質のファミリー、特にレチノイド類は細胞分化に関する効果を有することがわかっている。様々なレチノイド類は新生細胞を非増殖性のものに変える力を有している。殆どの実験結果はイン・ビトロで行ったものから得た。動物およびヒトにおける研究およびレチノイドおよびカロチノイドの薬としての開発は、有効量における化合物の毒性のために妨げられていた。様々なレチノイド製剤の局所投与は、明らかに癌性あるいは前癌性皮膚病巣を冶癒した。データーの優位性は、カロチノイド類およびレチノイド類が、少なくとも外胚葉山来の癌に対しての抗癌剤として非常に強い力を有しており、多分、より異なった薬理的適応が可能であろうことを示す。発生して（る基本的な問題は、特異的効果は臨床的に確かめることが難しく、レチノイド類（ぞして多分カロチノイド誘導体も）は陽性の結果を引き出すのに十分な血中濃度では毒性であるということである。複合体の形にしてこれらの分子のターゲツティングを効果的に行わないと、これらは効果の不明確な食物からの摂取と非常に制限された局所投与剤にとどまるであろう。

レチノイド類とカロチノイド類の非常に強い親油性のため、これらをモノクローナル抗体や他のタンパク質とうまく連結させ、レチノイドあるいはカロチノイドを含有する治療用部位特異的複合体とする化学反応を遂行することは実際には不可能であった。生物活性化合物を抗体に結合するのに本発明の新規な技術を使用すると、新規なレチノイド−抗体複合体を製造することが可能である。これらの複合体は化合物を直接抗体に結合するか三者の間にリンカ−分子を挿入するかして調製することができる。レチノイドとリンカ−分子または抗体との連結部は、特定の研究あるいは他の治療目的のための所望により不安定にも安定にもできる。カロチノイド−抗体化合物は同様にして製造することができ、これらの化合物およびその誘導体の研究方法及びその効果を使用する方法を提供する。

抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方が、複合体における部位特異的ターゲツティング基剤として、大変好ましい。

そのターゲットに対する高い特異性、近年におけるその大量生産の進歩、およびその文献に示されたさまざまな実験的および臨床試験における抗癌に対する有効性からこれらをターゲツティング手法へと選択した。とりわけ、癌細胞においてカロチノイド類およびレチノイド類をターゲツティングすると、付随して血清中に高レベルとなったり、全身作用を引き起こしたりする危険性なしにターゲット部位における高濃度を導（ことができる。レチノイド類およびカロテンイド類の部位特異的複合体のターゲット癌細胞上における実際の効果は、肝臓の調節機構およびそれに続（毒性の干渉なしに確かめられた。治療効果の改善のためにレチノイド類およびカロチノイド類の新しい誘導体を調製し、研究することができ、新種の癌に対して部位特異的な治療剤の攻撃ができるがどうかを試験することができる。問題は、抗体を薬物と複合させる従来の方法がカロチノイド類またはレチノイド類には通用しないということである。これらの分子は、高度に水に溶けにくい一方で、抗体は簡単に有機溶媒中で変性してしまう。

本発明は、界面縮合と多相反応系によって治療用で部位特異的な複合体を細胞毒性、特に親油性細胞毒性化合物、代表的にはカロチノイド、レチノイド化合物と抗体の複合体を製造することができるという開示も含有する。これらの複合体の製造はここに述べた方法で可能となる。本発明にはさらに、高い効果を有する生物活性、部位特異的複合体の製造方法であり、化合物を薬理学的に受け入れ可能なものとする精製段階を簡単にしながら、所望の化合物の収率を上げる方法も含有する。この方法によって、効果的な治療用部位特異的複合体を作成する他の試みに伴い、これを深刻に危険なものとする副生成物の生成と副作用の発生を減少するという有用性を有する。またこの方法は望みの生物活性、部位特異的複合体の均一性を本質的に改善する。これらの理由のため、この方法による生産物は、ターゲット細胞の治療的処置に使用した場合にはより少ない副作用しか示さない。そして、化学的修飾物に対する自然な身体の反応は、その製造物の均一性が改善されているために実質的には少ない。かようにして、新規な生物活性、部位特異的複合体を得ることができるだけでなく、一般的な生物活性、部位特異的複合体の製造において有意に改善された方法を提供する。

生物学的に部位特異的な化合物と生物活性化合物との複合体を、これらの間に共有結合を界面縮合反応を用いて形成することによって製造することが、本発明のひとつの目的である。

部位特異的化合物の活性結合部位を保護し、この活性な結合性が生物活性効果と共に複合体中で発現するような方法で、生物学的に部位特異的な化合物と生物活性化合物の複合体を製造する方法は、本発明の別の目的である。

界面縮合を用いて反応を行い、それぞれの化合物に対する物理的な相に各化合物に対して化学的に最も好ましい環境を選択することを含む、生物学的に部位特異的な化合物と生物活性物質との複合体を製造する方法を提供することも本発明のさらなる目的である。

化合物間の共有結合が、化合物間に原子空隙を与えるため、または化合物上に共有結合に対しての選択的反応部位を化合物に与えるために適応する基を化合物間に含有してもよく、また必要であればターゲット抗原の選択部位において生物活性化合物を遊離させるために生理学的に分裂する基を含有させても良い。

生物活性物質と空隙生成あるいは連結あるいは生理学的に分裂する基を生物学的部位特異性化合物との縮合前に反応させることによって修飾して生物活性、部位特異的複合体を界面縮合により製造する方法を提供することも本発明の目的である。

他の目的は、本発明の方法による製造物である生物活性、部位特異的化合物を提供することである。

またその他の目的は、生物活性物質とタンパク質、特に抗体と、より詳しくはモノクローナル抗体である部位特異的化合物との複合体である、生物活性、部位特異的化合物の提供である。

まだそのほかの目的は、親油性生物活性化合物とモノクローナル抗体および他のタンパク質との生物活性、部位特異的共有結合複合体である。

さらなる目的は、宿主生体にこの本発明の複合体を処置することである。

発明の要約要約すると、本発明は生物活性、部位特異的複合体を界面縮合法によって、縮合反応から活性結合部位を保護しながら、生物活性化合物と生物学的部位特異的化合物との間に共有結合を形成させ、複合生成物を回収する、生物活性、部位特異的化合物の製造である。

また、本発明にはこの製造物およびそのような製造物の生物活性作用を利用することも含有する。この方法による複合体は、個々の反応体の部位特異性および生物活性を有する。大変多くの可能な適応のうち、本発明はまたその分子を反応に適応させ、活性化化合物、複合体中間体および薬物または接続される他の生物活性分子の不活性化を防ぐことができる。界面縮合は、個々の化合物が分離した相に存在し、その相開の界面あるいはその近辺で反応するどのような多相システムを採用してもよい。通常、２相が使用される：これらは、以下に限定するものではないが、同一液系、液−気系および有機性−水性系を含有する。特定のシステムで使用される特別な物理的相および反応体は、部位特異的化合物と結合させる生物活性化合物の物理的性質および化学的性質および所望の連結形態によって選択される。

生物活性分子と、抗体のような部位特異的化合物とを複合させるこの新規なアプローチの使用から生じる実際の利益は、共有結合が抗体の活性結合部位に接続しないことであり、このため複合体の部位特異的な活性を保存し、非特異的毒性を減少させている。薬物の（例えば）抗体への連結はより均質でより安定となる：部位特異的化合物、生物活性化合物、連結、空隙あるい分裂官能基および複合体は常に、それぞれの相内の適合する溶媒の間の界面内の反応部位において、正しい方向を向いているため、化合物あるいは複合体の部位特異的領域の変性は問題とはならない：そして実際、親油性の非常に高いものを含む全ての種類の分子は部位特異的化合物と複合体を作成することができ、その場合にも両方の構成要素に対する溶媒による有害な影響はない。

本発明は複合させる生物的部位特異的化合物と生物活性化合物の異なる化学的性質、複合反応のパラメーター、活性結合部位の立体構造および構成が最適となる条件下に導くことによってこれらの利益を到達した。

発明の構成本発明を、その原理の詳しい適応と実施例の説明を参考にして述べる。界面縮合は化学化合物を、非混和性バルク（ｂｕｌｋ）相内で、それぞれの相に反応体を含有させて反応させる方法である；反応体は界面に存在し、反応は界面領域にて行われる。この方法の最も有名な工業的使用は、ナイロンを製造するための重合反応である。本発明のバルク相は、通常部位特異的化合物のための水性液体相と生物活性化合物のための固体、有機液体あるいはガス相からなる。

抗体のような、生物的部位特異的化合物の活性結合部位は、アミノ酸配列および大変ユニークな形状を規定する立体パラメーターの両方によって性格づけられる独特の抗原特異的構造を有する。立体パラメーターは一般的に、分子の一部の分子表面の襞あるいは「凹部」である部分の存在によって特徴付けられる。残りのタンパク質鏑はむしろ自由な、変異する立体的形態をとる。活性結合部位がその立体構造およびアミノ酸配列を残存している限り、分子はそのために形成された抗原を認識してそれに結合することができる。すでにかなり多（の、良く知られ、公表されている特別な抗原−抗体の組み合わせがある。

化学的反応性に関しては、分子中の襞領域および自由で変異性の領域の両方の配列中におけるアミノ酸は生物活性化合物と反応することが可能である。縮合反応の間、両方の領域内のアミノ酸は生物活性化合物と共有結合を形成することができる。本発明の反応条件は活性結合部位のアミノ酸配列を、他のアミノ酸配列に共有結合反応が起こっている間保護するであろう。

本発明は界面縮合反応を用い、生物活性化合物が部位特異的化合物と非混和性の構造あるいは相に含有されることが必要である。界面縮合反応は一般に、少なくとも２つの非混和性の相中の反応体を含有する。反応体間の縮合反応は、相の間の界面にて起こる。それゆえ、相間に界面の部分が多い程好ましい。この理由のため、２相系においては、一つの相（分散相）を、もうひとつの相（連続相）内へ分散させているものが普通である。分散相は一般に小滴、小さな固体粒子あるいは泡の形で連続相中に分散している。しかしながら、もし分散相の小滴、粒子あるいは泡が小さくなりすぎると、溶液となってし２まい、反応体の２相という性質が失われる。この理由のため、これらの小滴、粒子、あるいは泡の大きさは、混和できず、そのため連続相と界面を形成できるものでな（ではならないので、規定される。

前述のことは本発明において重要な点である。各特異的抗体は特有の唯一の特性および性質を有するが、殆どの場合活性結合部位のコンフォメーション中の襞はある範囲の大きさであるため、生物活性化合物反応体の非混和性の小滴あるいは結晶は、例えば約１０から好ましくは約２０オングストローム、およびそれ以上の突出部の半径を有するもののように、ひだを通ってそのをひだの近辺あるいは内部にある反応性アミノ酸配列部と相互作用することができないものであればどのような構造のものであってもよい。界面縮合の間、それぞれの非混和性の相の状態は、活性結合部位を縮合反応から保護するように保たれる。これは分散相が、２相が非混和性のままでいるような大きさに制限されるため保たれている。活性結合部位に適合するかもしれない小滴、粒子、あるいは泡は、その大きさにするとその相は非混和性を失ってしまうため作製しようとされない。

生物活性化合物を含有する非混和性の小滴、粒子あるいは泡が活性結合部位内に適合するには大きすぎるため、反応界面から活性結合部位は物理的に除かれている。この方法によって活性結合部位が保護されているので、生物活性反応体はそれゆえ、タンパク質分子の自由で変異性の領域にある他のアミノ酸配列と反応する結果となる。

それゆえ、複合部位あるいは化合物間の結合部位は活性結合部位を犯さない。その結果、生物活性で部位特異的な複合体を得る。

本発明の界面縮合の条件は、物理的に抗体の活性結合部位あるいはその近辺に起こる複合反応を防いでいる。他の化学的に反応性の基は複合反応することができる；一方で活性結合部位の中あるいはその近辺にある官能基は保護きれている。

生物活性化合物と部位特異的化合物の非混和性の相において、小滴あるいは粒子の大きさおよび表面張力は、薬物のような反応性生物活性化合物を含有する非混和性の構造を形成するように調節できる。先に述べたように、これらは活性結合部位内のどの活性基の近辺からも物理的に離れており、これらの活性基は反応から保護されている。例えば活性化薬物を含有する有機相は抗体を含有する水相内へ分散することができる；これは有機小滴が分散できるよう、十分小さく、そしてまた抗体の活性結合部位内へ透過しないよう、十分大きくあるよう最適化される。分散された有機小滴はその後活性化薬物に関してのバルク相となり、連続水相は抗体に関してのバルク相となる。

加えて、界面に存在する表面張力は、所望の活性結合部位の物理的な保護ができるように十分強くなくてはならないが、抗体や他のタンパク質を変性するほど強くてはならない。

もう一方で、活性化薬剤はそれらが分散できる程度の大きさであれば、抗体水溶液中に分散することはできるが、物理的に抗体あるいは他のタンパク質の結合部位に透過することができないよう、十分大きな結晶子（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅｓ）でなくてはならない。結晶子は大変細かくあるべきである：激しい撹拌による分散は結晶子あるいは結晶が粗大である時に用いる。

生理的条件下において、制御可能な加水分解することのできる共有結合を複合体に付与する困難さは、今日までのほとんどの複合体形成の試みにおいて実質的な問題であった。従来技術の方法で作製した複合体の部分的不安定さく加水分解）の問題の一部分は、複合体を製造する間におこる副反応による。これらの副反応により、様々な条件下で分裂し、治療あるいは診断への使用において制御できない混合体が得られる。これらの複合体は均質ではない。これらの副反応によって、希望していた反応部位で抗体の結合とともに分裂するのではなく、生物活性化合物が速めに分裂し、全身作用を引き起こす。一方で、あまりに低い不安定性は不活性あるいは限られた活性しかなくなり、薬物および抗体が特定の活性結合部位が実質的に複合の間に保護されていた場合であっても、薬物および抗体がむだになる。

生物活性、部位特異的複合体を形成するためのこの新規なアプローチは、各反応体を、反応体にとって最適な環境である相に含有させ、一方で好ましくは、所望の反応性基のみを界面の反応条件下へさらすよう、２あるいはそれ以上の非混和性の相をそのシステムに用いる。それゆえ、一般に唯一の反応ルートで唯一の生成物が形成される。最終的に、非常に均一な複合生成物とともに非常に高い特異性を有する大変あざやかな化学反応となる。

界面縮合反応の２相性の性質から、所望の反応体および生成物にあわせて反応条件を選択できる。例えば液体有機相−水相システムにおいては、水相に溶解した反応体上の疎水性基は反応体を、疎水性基が有機相の近辺のあるいはその中の界面にくるような方向へ向ける。その反対に、有機相に溶解された反応体の親水性基は反応体を、親水性基が水相の中あるいは近辺の界面へくるような方向へ向ける。これらの官能基はその後、共に反応して所望の複合体を形成する位置にくる。様々な溶媒、反応体、活性剤あるいはリンカ−およびもしあればその他の反応条件を注意深く調節することにより、特定の基が一貫して反応部位にあり、均質な複合体生成物が形成さ薬物あるいは他の生物活性化合物がある相、例えば有機相で活性化され、一方で抗体が水相に止どまるような特別な反応条件を選択することができる。活性化剤の化学当量は注意深く調節される、というのはこれは、水によって不活化されないため、副反応体および薬剤と抗体の未反応体を除かなくてはならないからである。この系は、所望の反応性基を、非混和性の界面に反応させるために存在させる他の適応形態においてもさらに精製することができる。例えば、有機液体−水性系においては、アミン基は他の分子中の官能基より１　選択的に反応する。反応はそれゆえ、アミン基に選択的に向かうことができる。

反応体のうちの一方、あるいはもう一方、しばしば生物活性化合物である反応体を縮合反応を行う前に活性化することは、しばしば好ましい。生物活性化合物の活性化とは、一般的な語としては例えば、中間体の形成を通して、抗体あるいは他のタンパク質の反応部位、例えば抗体のアミン基と高反応性であって他の有機相にて得られるどんな反応部位とも反応性でないような、特異的反応部位の形成をいう。本発明の界面縮合条件下においては、活性結合部位内にある強力な反応部位は、タンパク質分子中にある他の強力な反応部位と共に反応してしまうことから物理的に保護されているため、縮合反応の共有結合はこれらのタンパク質の他の反応部位と生物活性化合物中間体の反応部位との間に起こる。そして、本発明の条件のおかげで、本反応が進行する唯一の反応となる。生物活性化合物の中間体は、触媒の作用により、あるいはこの生物活性化合物より好ま（−い反応部位を有する連結化合物と反応させて、またはこの生物活性化合物の特定の官能基を活性化、例えばイオシ化またはそのような反応を経て、あるいは縮合反応において一般的に行われる他の反応を行って調製しても良い。生物活性化合物の中間体にはまた、宿主生体中のターゲット部位において化合物が遊離できるようにする、生理的条件下で不安定となる分裂可能な基を有していても良い。

これらのリンカ−および分裂可能リンカ−は、先に引用したジョージらＪ″、よる文献中に詳紀に記載されている。

抗体あるいは他の生物学的部位特異的化合物、または薬物あるいは他の生物活性化合物のどちらかを活性化あるいは連結する基を形ｈｉ！ｉするために、大変にさまざまな化合物が使用できる。活性化あるいは連結化工程を用いるときには、その後の複合体反応に対して最適を保証するように条件設定を行わなくてはならない。これらの活性化あるいは連結化合物のそれぞれは特異的な性質を有しており、それぞれに対する反応条件は各最適な反応効率および特異性に合致するように調整しな（ではならない。

本発明の生物活性、部位特異的複合体を製造する界面縮合方法の他の利点は、各反応化合物の反応条件をより制御しやすいということである。例えば、１あるいはそれ以上の反応体を反応中に徐々に添加することができる。反応条件を制御することにより、副反応および、良くて複合体の収率を下げ、悪くすると複合体の部位特異性を破壊する副生成物の生成を大幅に減少、そして実質的に削除することが可能である。この工程における高い選択性は、反応に使用したモノクローナル抗体の量に対する収量を増やすことのみならず、反応生成物の精製も簡単にする。これが、全ての成分に対して可能な限り最も平均的な最適条件しか選ぶことができず、その結果全ての成分の化学当量および濃度は、系のどこかに存在する最も感受性の強いまたは不安定な化合物が分解するのを防ぐために厳密に維持せねばならないという従来の縮合反応と対照的な点である。個々の化合物を高濃度にすると、感受性薬物、抗体または他のタンパク質そして生物反応性分子のより多くの副反応や変性を引き起こす結果となる。

本発明の界面縮合反応によって複合体を調製するのに使用する非混和性の多相系において、各分離したバルク相は、相内の反応体の個々の要求に対して条件を最適化した化学的環境を提供することができる。一つのバルク相に関する溶媒は他の相から独立して選択することができる。それゆえ、溶媒はその相内に溶解させようとする分子の安定性を保証するように選択される。バルク相内で、連結あるいは活性化反応をも行おうとする場合には、縮合界面における複合体は本来生物活性化合物と部位特異的化合物の正しい向きと濃度を提供し、そしてこれが複合反応における律速段階とならないという事実のため、これらの濃度は相内で反応体に対して正確に最適化学当量に合わせることができる。加えて、選択された唯一の基が界面における複合反応へとさらされるように系をデザインしであるので、副反応は除かれる。反応は生物活性、部位特異的複合体を出来る限り完全に、最高の収率を上げるように、界面を残し、残りの反応体が反応できるような、より多くの界面領域を与える力をかけることによって行われる。界面縮合反応の速度は、溶媒速度と比較すると非常に速く、複合反応は迅速に進む。複合体組成物は高濃度の活性反応体にさらされても変性されないので、最終生成物には高い特異的活性を有し、より少ない副反応及び副作用を有する。活性化された中間体はまた加水分解による活性の低下を被る事なくその有機溶媒中に保存できる。

従来の方法においての水性溶媒反応系を使用する必要性によって、多くの強い親油性生物活性化合物を抗体または他のターゲツティングタンパク質に結合させることが排除されてきた。これは多くの最も興味深い治療化合物、例えば薬がその治療的性質もまた大変親油性であるため、細胞物質の脂性領域に可溶で水性領域に不溶であるという厳しい制限である。本発明は溶媒条件を各反応成分に対して最適化し、そしてこの２相の界面においてのみ相互作用する。それ故、親水性および親油性分子はそれぞれ、反応に関与するまでは各相の溶液中に止どまる：反応のパラメーターは各反応性分子が界面において適当な反応基として存在するように調節する。本発明を適当に適応することによって、殆どどの生物活性化合物とどの部位特異的化合物との複合体であっても、それぞれの物理的、化学的性質を考慮しないで生物活性、部位特異的複合体を製造することができる。

縮合反応から活性結合部位を保護しながら、界面縮合反応を行うにあたっては、特定の化合物量の複合反応がうまく行くために要求される特定の条件に到達されるべきさまざまなパラメーターがある。

一般的にはこれらのパラメーターは以下のようなものである：１）反応における化合物の分子量およびそれらの多様な溶解性は反応のデザインにおいて重要な点である。タンパク質は有機相には有意といえる量はほとんど溶けてはいけないし、゛生物活性化合物およびその活性化中間体は有機相に特によ（溶けなくてはならないため、反応体が各厚相に止どまるということは、希望する特異性を得るためには重要なことである。もし溶媒粘度が高過ぎれば、分子の移動度の低さが反応速度の律速となるかもしれない。

２）各相の粘度は系の界面における分子の入れ換え速度を決定するのに重要な役割を示す。反応速度は直接、両方の相における分子の運動性のなさに影響される。上記に述べたように、高い溶媒粘度は律速段階となる分子の運動性の低下という結果を導く。

３）２相の分配力または混和性は、反応の特異性が失われるのを防ぐために調節せねばならない。加えて、もし分離層が混和するようになれば、抗体の結合部位の保護は危険にさらされるかあるいは消失してしまう。

４）界面張力は、中間値を有していなくてはならない。界面張力は、ターゲツティング分子として使用される部位特異性化合物の活性結合部位に起こる複合反応を防ぐが、それを変性するほど強くてはいけないという必要性からセットされた限界内のどこかに位置する。界面張力は、分離相の反応性成分が物理的に活性結合部位の領域から除かれるよう、離れた相がタンパク質へ浸潤するのを防ぐのに十分強くなければならない。一方で界面張力は、各化合物の所望の反応性部位が界面でお互いに複合体を作成することができなくなる程強くなってはならない。

界面張力調節剤は、一般的には界面活性剤であり、界面張力を調節するために系に添加することができる。

５）反応体の濃度比は、反応を完全に行うときには一方が過剰に存在するため、重要な考慮事項である。一般的には、モノクローナル抗体は通常大変高価で入手困難であるため、実際には過剰の生物活性化合物が使用される。さらに、複合体中の生物活性化合物の部位特異的化合物に対する最終的な比率は、生物活性化合物の濃度を最高にするが、部位特異的化合物の部位特異性の低下あるいはその変性を起こす割合以下Ｉこしなくてはならない。

６）反応体の濃度は確実に反応速度に影響を及ぼし、また、系内での相の維持にも影響を及ぼす。反応体にかかる化学的推進力を増加するため、反応生成物を界面から除くのが望ましい。反応生成物を迅速に界面から移動させるには、可能であるときには、溶媒の組成を反応生成物が界面あるいは有機相に対して低いアフィニティーを有するよう選択し、生成物が界面から除かれ、反応がこのために追加されたフリーの界面表面を使用できるようにすることによって増強されるようにするとよい。

一般的な方法は、典型的な生物学的部位特異的化合物であるタンパク質を、安定な溶液を維持するのに便利な濃度で水性溶媒中に溶解することである。タンパク質の沈澱を防ぎ、界面における分子の適当な運動性を与えるような粘度を与え反応性基を界面そして反応に暴露することの両方のためには、高分子量であれば低濃度の溶液でよい。

タンパク質溶液には他の成分を含有しても良いが、最も好ましい反応はアミン基によるものであり、反応は界面の有機相側で行われるため、水相の含有物は反応において活性となることも直接反応に拘わることも無い。複合生成物を界面から回収する手助けとして共溶媒を含有させると好ましい。

生物活性化合物を、反応系の中の細か（分離した分散相とすることが好ましい。

これは細かく分離した固体あるいは有機液体相の小滴の形態であってよい。有機液体相が生物活性化合物に関して飽和されている時には、部位特異的化合物と混合すると細かく分散された生物活性化合物の固体粒子がしばしば形成される。この粒子は水相とは混和せず、活性結合部位を反応から保護するために必要な、突出部の半径を有する。生物活性化合物あるいはその活性体は有機相に、通常有機溶媒中に溶解さねている。生物活性化合物の量は好まし５くは縮合に必要な量より過剰に用いる。溶媒は水と殆ど混和性のないものでなくてはならず、反応体が水系へ侵入することを防ぐため、タンパク質に対して強い溶媒であってはならない。同時に、溶媒はタニ、バク質のアミン基とアフィニティーを有し、アミンか界面を通り抜は七れ自身を反応に使用できるものでなくてはならないっまた、有機相の溶媒は複合体に対して低いアフィニティーしか有さないということも重要である。もし複合体が水相より有機相により自由に溶解するのであれば、タンパク質の変性、および特に結合部位の反応領域への暴露が派生する。実際、生成物は比較的有機溶媒に不溶性であるものが好ましい。有機溶媒が限定された、あるいは低いアフィニティーしか複合体から得られる基に官能基に対して有していない場合、界面に未反応アミン基によってアクセスされる自由表面領域を残して反応体が除去されるため、有用である。

関連する規準に合致する適当な有機溶媒は数多（ある。広く公知とされたデータは、これらの生物活性化合物及び活性化剤あるいはリンカ−で修飾された生物活性化合物に対して、適当な溶媒を選択することができるような多くの公表されたデータがある。

本発明の生物活性、部位特異的化合物を調製するための界面縮合反応の界面における反応速度が特に速いことはすでに述べた。反応全体は反応速度および反応体および生成物の透過および吸着と脱着にばかりでなく、反応に利用できる界面の表面領域にも依存する。

これに関連して、反応を高度に遂行するためには、タンパク質分子のその相の溶媒内での運動性を上げ、タンパク質分子上のアミン基が界面の表面上へ出て、反応に参加しやすくすることが重要である。

より大きな表面領域により、反応をより速く進めることができる。

大きな表面領域は通常、タンパク質を含有する連続水相内に細かく分散した非混和性のを機相を形成することＩこよって得られる。その反対は通常には用いられない。他のアプローチとしては、大きな隣接する相内の界面を使用する方法である。両方の場合において、非混和性の有機相が水相に浸透して、タンパク質の活性結合部位と反応することを防ぐことが重要である。水相中のタンパク質の運動性および分散有機相の大きさおよび運動性の調節は激しく撹拌することよって増強することができる；分散安定剤および界面活性剤もまた使用することができる。非混和性固体相として生物活性化合物を有することの利点は、この形態が界面縮合および活性結合部位の保護の両方に有効であるということである。

ある特定の反応を行う時の条件は、最適な結果が出るように調節すればよい。系を熱しても冷却してもよいし、触媒を使用しても、反応時間を変化させても良い。反応は、反応体を一度に、あるいは一つの反応体を徐々に加えて、または両方を連続して添加して混合することによって行っても良い。このような場合に反応体を変成させるような条件を除くことは重要である。例えばモノクローナル抗体は変性されやすい。含有される反応の性質から、高い反応速度のために加熱することは必要とされないことが多い。複合体のための縮合反応を触媒しようとするときは、一般に有機相において可溶、と　活性であり、水性成分によって不活化されない触媒を使用することが必要である。

一般的に、生物活性、部位特異的複合体を、生物活性化合物と生物学的部位特異的化合物との間に共有結合を形成する縮合反応によって製造する場合において、大変興味深いカテゴリーに属する縮合反応を行う。既に指摘したように、アミン基、一般に部位特異的化合物のリジンのアミン基と生物活性化合物の適当な基との間の縮合は、さまざまなアミンとの縮合のなかにあって、その容易さおよびフレキシビリティ−のため、本発明の方法に有利に使用される。リジンのアミンは、広く多様な縮合反応において、広く多様な反応性種と反応することができる。

これらのアミン縮合は、生物活性化合物の中間体の活性化、中間体の連結においての高度な選択と特定の生物活性化合物と共有結合するための要求される性質に合致する、広範囲のインビボ性質を提供する。

リジンのアミン基の共有結合は好ましくはアミド、ウレタン、ウレア、チオウレア連結部を複合体中の共有結合部位に形成する。同じカテゴリーに入る反応は、マレイミドと部位特異的化合物のタンパク質分子に特宵なシスティンのスルフヒドリル基との縮合反応を行ってチオエーテル連結部を作成したり、チロシンのフェノール基と縮合したりする反応にも同様に用いられる。アクリレート化剤の使用によって、部位特異的化合物のヒドロキシル共有結合部位がエステル連結部を作成する。

リジンのアミンと縮合して、複合体中で共有結合を形成することのできる良く研究されている反応種が非常に多くある。例えば、アミド類はカルボン酸との直接縮合によって、あるいは混合無水物およびその類縁体の縮合によって形成される。ウレタンはクロロホルメートとの縮合から最も簡便に作成され、一方ウレア類およびチオウレア類は一般にイソシアネートおよびチオイソシアネートとの縮合により形成される。

実質的にどのような薬物の部分あるいは生物活性化合物であっても、これらのうちの一つあるいはもう一つの反応性種を有していれば、あるいは中間反応生成物としてかような反応性部位を付加する適当な修飾を施すことによって、本発明に適応することができる。

複合体中の部位特異的化合物に対する生物活性化合物のモル比は、ターゲット細胞において生物活性化合物の濃度が最高になるように選択されるべきである。この比は複合体が各生物活性化合物につきひとつ以上の部位特異的化合物を有するとき、あるいは反応生成物が生物活性、部位特異的複合体だけでなく未反応部位特異的化合物を有するときには１以下であってもよい。治療剤に適応する場合には、複合体と未反応部位特異的化合物の混合物も使用することができる。通常の化学療法剤においては、この複合体中の比は概ね約３から約２０の間である。

本発明の特に有用な点のひとつは、好ましい具体例のひとつにおいて、縮合される生物活性種がこの縮合反応に先立って、タンパク質フリーの系中にて単離され精製されるということにある。生物活性化合物は、もし必要であれば反応性種を作成するために活性化剤あるいは連結分子と形成し、あるいは処理しその後に精製してもよい。この実質的に純粋な反応体は反応系へ供給され、本発明の界面縮合反応の特長のため、副反応および副生成物の生成はこの系から実質的に除かれている。

本発明は、親油性生物活性化合物とモノクローナル抗体との複合体を形成することを可能にすることに特別な有用性を発見した。このような複合体はこれまで全く得ることができず、あるいは部位特異性および／または活性が失われてその有用性が厳しく限定されたものであった。加えて本発明は、実質的にすべての生物活性化合物、そして特に、実質的にすべてのクラスの細胞毒性剤に対して、突出的に精製されており、副反応および副生成物が無いという利点を有する。特異的結合部位に対する選択性と活性をそのまま保存している、薬剤および診断薬において主に有用である生物活性複合体を供給する、これらの反応を可能にそしてさらに容易にすることが本発明の中心点である。このように本発明は、今までの技術によって得られなかった全く新しいカテゴリーに属する縮合反応を提供するものである。

本発明の生物活性、部位特異的化合物複合体内の共有結合は以下の２つの形態が上げられる：Ａ）生物活性化合物の部位特異的化合物への直接複合で、しばしば活性化中間体の生成をを経る、Ｂ）中間リンカ−分子を２つの主構成分子の間に挿入することによる、生物活性化合物の部位特異的化合物への間接複合。いずれの形態においても、生物活性化合物への連結は細胞性条件下で不安定となり、ターゲットにおいて生物活性剤をａｍできるようにしているか、あるいは複合体がそのままで生物活性の場合には、細胞性条件下において安定であるかのどちらかである。生物活性化合物および生物学的部位特異的化合物の語は、主構成化合物と同様、関連して示したようなそれらの活性化剤あるいはリンカ−をも含有する。

これらの形態の共有結合の化学的性質は良く確立されており、以下により詳細に述べるように、部位特異的化合物の活性結合部位は、先に本発明の実施のために述べた原理で保護されていることがわかるであろう。こうして、活性結合部位の反応性基は、界面縮合条件を用いることによって共有結合反応から除かれる。

直接複合体−生物活性化合物および部位特異的化合物は直接共有結合によって連結され、複合体を形成している。直接複合体は活性化中間体の形成を経て製造される。生物活性化合物あるいは部位特異的化合物のどちらかをこの活性化中間体を形成するのに用ることができる。この複合体の例は５生物活性化合物のアルコール基を通しての複合−代表的な化合物はレチノール（ビタミンＡ）である。ビタミンＡおよびその誘導体は■花屋応性基で表し、例えばレチノールはＶ、−ＣＨ２０Ｈとする。例えば、レチノールはシアノ−ケンプロミド（ＣＮＢｒ）と反応して活性化イソシアネート中間体を形成する。この活性化中間体はその後抗体（Ａｂ）のりジン残基の末端のアミノ基と縮合する。

その結果イソウレア結合が形成されるが、これは細胞性条件下においては少なくともその一部が不安定となり、レチノールを細胞による内部移行において、抗体から分裂することができる。この種の連結部の他の例としては、レチノールをトシルクロライドで活性化し、抗体のりジン残基の末端のアミノ基とこの中間体が反応させて、抗体とのアミン連結部を作成するものがある。

レチノールはまた、水溶性あるいは脂溶性カルホンイミドと反応させて活性化中間体を形成してもよい。活性化中間体はその後、抗体上のりシン残基の末端のアミノ基と反応する。その結果ウレタン結合が形成され、これは細胞による内部移行においても安定である。

直接、非分裂性連結をレチノールのアルコール誘導体と形成するのに有用な他の活性化化合物は、アゾ化合物とＮａ　Ｉ　Ｏ４−Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４である。

生物活性化合物上のカルボン酸基を通した複合体−典型的な化合物は、レチノイックアシッド（ＶＡ−ＣＯＯＨ）である。この場合、直接縮合が可能である。結果として形成されるアミド結合は、細胞性条件下においほとんど不安定とはならないが、このような直接共有結合は一般に、複合体が分裂せずともそれ自体で生物活性である場合には大変興味深い。

レチノイックアシッドはカルボンイミドと反応させて活性化中間体を作成してもよい。抗体のりジン残基の末端のアミノ基との反応によって、細胞性条件下でも不安定とならないアミド結合が形成される。酸で不安定とならない直接連結部をレチノイドおよびカロチノイドのカルボン酸誘導体から作成するのに有用な他の活性化化合物は、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ３）である。

中間体リンカ−分子との間接複合体−これらの共有結合を形成するためには、生物活性化合物あるいは部位特異的化合物のどちらかをリンカ−分子と連結すればよい。リンカ−分子は、最終的複合反応に先立って活性化剤を作用させて、活性化リンカ−中間体を作製してもよい。生物活性／リンカ−分子は、以下の式で表される全ての化合物であってもよい：Ａ−Ｌ−Ｃ○−Ｘ［式中、Ｌは脂肪族あるいは芳香族基またはペプチド鎖で、生物活性化合物Ａに連結している、Ｘは：ハロケン。−０−ＮＲ−、アミンエステルニー〇−ＣＯＲ１混合無水物および対称性無水物（Ｘ＝Ｒ）：イソシアネート：チオイソシアネート：マレイミドまたはベンジル基（例えばオルソジケトン頚）である〕。部位特異的化合物、典型的にはタンパク質の反応性部位によって、これらの反応性リンカ−は様々に、アミド、エステル、ウレア、エーテル、ポリウレタン、チオウレア、およびチオエーテル結合の連結部となる。複合体がそれ自身で生物活性でない場合には、ＡとＬ間の連結は宿主生体の細胞中の条件下において不安定となるものが好ましい。当業者には多くのこのような連結部が知られており、そのなかから実質的に宿生生体中のターゲット部位において適当なものであればどれでも使用できる。本発明の特に有用な点は、複合体が特に精製されており、副反応や副生成物の混入が無いので、複合体がヒトあるいは他の宿生生体中のどこかで、ランダムな分解あるいは溶解を引き起こす成分や構成要素を含有しないということである。

間接複合体の代表的な例は：生物活性化合物、例えばレチノールのアルコール基を通しての複合体。レチノールは最初にアコウチック無水物（ａｃｏｕｔｊ、ｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）のようなリンカ−分子と反応させる。これによって細胞による内部移行において不安定になり、分裂されるエステル連結部を形成することになる。リンカ−分子の酸基はその後、ＮＨ３て共に活性化し、抗体上のりジン残基の末端のアミン基と反応させる。

同様の性質を有する連結部のための他のアプローチは、アゾ化合物をリンカ−として用い、塩酸中塩化ナトリウムで活性化させ、抗体のフェノール誘導体の芳香族環と反応させることである。他の、レチノイドおよびカロチノイドのアルコール誘導体から不安定な間接連結体を作成するのに有用な、リンカ−分子−活性化化合物複合体の組み合わせは、どの不飽和三酸無水物、三酸、あるいは酸塩化物とであってもよい。

レチノールはエピクロロヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ）のようなリンカ−分子と反応させてもまい。リンカ−分子のエポキシド基がその後、抗体のりジン残基の末端のアミノ基と反応し、細胞条件下においても不安定とならないヒドロキシアミン連結部を作成する結果となる。同様のタイプの連結部を作製するための他のアプローチとしては、最初にレチノイドをＮａｌ０．によってアルコールから無水物に変換する方法がある。この手法は生物活性化合物のアルデヒド誘導体であれば、どれにも適応できる。例えばレチナールは、その後ＮＨ２ −Ｒ−ＣＯＯＨ（式中、Ｒは脂肪族あるいは芳香族基である）の形のリンカ−分子と反応させる。中間体はＥＥＤＱで活性化し、抗体のりジン残基の末端のアミン基と反応させる。複合体のアミド共有結合は細胞性条件下において不安定にはならない。他の、レチノイドおよびカロチノイド誘導体との間接非不安定化連結部を形成するのに有用な性質を併せ持つリンカ−分子と活性化化合物の組み合わせは、ベンゾキノンおよびトリクロロトリアジンである。

生物活性化合物、例えばレチノイックアシッドのカルボン酸共有結合を経る複合体。アミノ無水物のような連結分子をレチノイックアシッドとＥＥＤＱと反応させる。これによって、細胞性条件下において不安定となる酸アミド連結部を有するリンカ−中間体が形成される。リンカ−中間体はその後続いて抗体のりジン残基の末端のアミノ基と反応させる。

レチノイックアシッドはまた、リンカ−分子ＨＯ−Ｒ−ＯＨ［式中、Ｒは脂肪族あるいは芳香族基である］と反応してもよい。この結果一般的に細胞性条件下において不安定でないエステル連結部ができる。リンカ−中間体はその後、カルボジイミドによって活性化し、抗体のりジン残基の末端のアミノ基と反応させ複合体中にウレタン結合部を形成する。

ジスルフィド結合を有する複合体−典型的なレチノイド類縁体はレチノールである。レチノールは最初にメルカプドールに変換する。

これをその後、抗体の還元形と反応させ、抗体に２分子をノスルフイド結合により連結して複合体を形成する。複合体において好ましい共有結合は、１あるいはそれ以上のＣＳＮ、ＯおよびＳ分子を介して形成されるた基である。これらは、単結合であっても多価結合であってもよい。一般に、これらの結合は１あるいはそれ以上のアミド、酸アミド、ンアバ　ヒトランド、ヒドラジノ、ポリスルフィド、エステル、エーテル、ヒドロキシ−アミン、イソウレア、チオエーテル、チオウレア、ウレアおよびウレタン結合である。親生物活性化合物および部位特異的化合物の関連する反応性基は上に述べたようなものである。

生物活性、部位特異的複合体を調整するために上記の手法の特定の組み合わせを適応することを以下の実施例の説明によって例証するが、これらの実施例は説明のためのものであって本発明の範囲を規定するものてはない。当業者には公知であるモノクローナル抗体ＫＳＩ／４および９．２．２７は、ヒト固形癌抗原に対して部位特異的であるクラスの抗体の例として示した。これらの癌は従来のケモセラピーに対して抵抗性である。

実施例１１ミリグラムのシスーレチノイックアシッドを１００μｌのＮ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ　ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ　；　ＮＭ　Ｐ　）に溶かした。

１ミリグラムのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ３）をこの混合物に添加し、５分間反応させた。次に、１ミリグラムのジメチルアミノプロピルエチルカルポジイミド（ＥＤＴ）を加え、生じた黄色透明の溶液を室温で１時間反応させ、続いて４℃で２時間反応させた。固体スクシンイミックエステル中間体が形成された。

固体中間体の懸濁液を、９２２７と呼ばれるモノクローナル抗体のｌＱｍｇ／ｍｌの濃度の水性溶液内に過剰のモル比にて添加した。

混合物は最初、大変細かい分散形態のレチノイックアシッドーエステル中間体の存在のため大変に濁った状態である。界面縮合反応を促進するために固相と水相を激しく混合するとともに、混合物は反応が進むにつれ、少しづつ透明になり、固形スクシンイミックエステル中間体粒子の濁った懸濁がほとんどなくなった。

懸濁液は複合体を含有する水相を回収するために遠心分離をする。生成した複合体をゲルクロマトグラフィーによって精製した。

分析したところ、生成物は抗体１分子に対して３分子のレチノイックアンッドの複合物であることが分かった。複合体は実質的に、原モノクローナル抗体と同じ結合活性および特異性を有していた。

この実施例は、生物活性化合物と部位特異的化合物との開の界面縮合反応に固− 液界面を利用する場合の例を説明している。

実施例２トランスーレチノイックアシッドは、／オキサン１ｍｌ中に１８、５ｍｇ　（６，Ｉ　Ｘ　１０”モル）程度溶解させた。その後、遮光して速いスピードでかきまぜながら、１６．８ｍｇのカルボニルジイミダゾール（ＩＯＸＩＯ−５モル）をこの溶液の中へ添加した。Ｎ−置換カーバメートが形成された。

第２の溶液は、９２２７と呼ばれるモノクローナル抗体をリン酸緩衝液１１１１につき１０ｍｇ溶解し、ｐＨを８．３にまで上げて調製した。レチノイックアノッドカーハメート溶液を飽和状態にし、２度にわけて添加した。最初ににＮ−レチノイックアシッドカーバメート溶液の１００μＥ分を添加した。激しく振とうし、抗体の水性溶液中にレチノイド類縁体・バメート溶液の細かい分散懸濁液を作成した。これを反応をさせた。その後、レチノイックアシッドカーバメート溶液の第２の１００μβ分は、反応が続く間、懸濁を維持するために激しく振とうし、ているところへ添加した。

およそ１０分後、懸濁液を遠心分離し、複合体を含有している水性フラクションをディアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により精製した。

レチノイックアシッドの抗体に対するモル比は８：１であった。複合体は実質的に原モノクローナル抗体と同じ結合活性および選択性を有していた。

実施例３メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと１：１のモル比にて反応させ、メトトレキサートの固体スクシンイミックエステルを、水中の非常に細かい固体分散粒子の形態に調製した。この中間体は、水に不溶である。

１ｍｌ当たり５ＩＩ１ｇのタンパク質を含有する、ＫＳＩ／４と呼ばれるモノクローナル抗体溶液１０ｍ１を冷却し、かきまぜながら、５　ｍｇ／ｍｌの固体スクシンイミックメトトレキサートエステルの水性懸濁液の３０５μ！分を滴下した。各小満を添加するときに、固体粒子が混濁した懸濁液となるが、これは反応が進むにつれ少しづつ透明になる。中間体の全量を滴下したのち、複合体の透明な溶液が得られ、これは０．　９％生理的食塩水を使用してディアフィルトレーションを行った。結果として形成された複合体は、モノクローナル抗体に対するメトトレキサートの割合が１２：１であった。複合体は実質的に原モノクローナル抗体と同じ結合活性および選択性を示した。

この実施例もまた、生物活性化合物と部位特異的化合物の間の界面縮合において、固−液界面の使用の例を説明するものである。

実施例４Ｋ　Ｓ　ｌ／４モノクローナル抗体の水性溶液を調製した。抗体はＩｇＧ１およびＩｇＧ２であり、プロティンＡで精製し、ＯＤ２ｇ。＝３．１５であった。溶液のｐＨは６．８に調製した。

メトトレキサートーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＴＸ−ＮＨ５）のジメチルアセテート（ＤＭＡｃ）溶液を調製した。

この溶液を抗体の水溶液に滴下すると、細かい分散粒子が形成され、水性相中に懸濁される。添加は２分間以上かけて行い、その間ｐＨは６．０まで減少し、これは６．６まで増加させた。モル比で１７倍過剰のＭＴＸ−ＮＨＳを使用した。

添加を完了した後、反応混合物をもう一時間撹拌した；その後、生成複合体をその水溶液から透析によって回収し、濃縮し、フィルターを通して滅菌した。ＭＴＸのＫＳＩ／４に対する比はおよそ７：１であり、複合体は実質的に抗体自身と同じ部位特異性を有した。

実施例５実施例４の手法を１００倍のスケールに上げて、より大量のＭＴＸ−ＮＨ８を用いて行った。反応体のモル比は１８：１とした。複合体においてＭＴＸの抗体に対する比は１０であり、これは実質的に反抗体と同じ部位特異性を有していた。

実施例６（ａ）メトトレキサートをカルボニルジイミダゾールと反応させてメトトレキサートのカルボニルイミダゾール誘導体を調製した。

これをＤＭＡｃへ溶解した。

Ｋ　Ｓ　Ｈ７４（ｍ、　ｖ、およそ１６０．０００）の水溶液を調製した。メトトレキサートイミダゾール溶液をこのモノクローナル抗体の溶液内へ、１７：１の過剰なモル比にて添加した。これによって水相内に液−液懸濁が形成された。

ｐＨは反応を１時間行う間、ＮａＯＨ水溶液にて７．８に調節した。可視固形粒子は観察されなかった。複合体を水溶液から回収し、カラムクロマトグラフィーによって精製した：Ｍ　Ｔ　Ｘ　Ｋ　Ｓ　＋／４の比は６．１であった。

（ｂ）メトトレキサートイミダゾール溶液の量を増やして（ａ）の反応をくりかえした。このため、分散相フラクションの相対量が増加した。反応が進んで行くのにあわせて、かなりの混濁が認められた。複合体を水性溶液から回収し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。

（Ｃ）メトトレキサートイミダゾールの滴下を２分間以上にわたって行って、（ａ）の反応を繰り返した。各小満が水溶液に滴下されるのに従って、固体の細かく分散した粒子が形成される。反応体のモル比は、モノクローナル抗体に対してメトトレキサートが１９：１とした。滴下を完了した後、反応を１時間続けた。

複合体はこの水溶液からディアフィルトレーションを行って回収した。複合体はＵＶ分光検査によって同定した。

実施例７（ａ）　ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　；　Ｄ　Ｘ　Ｒ）をＤＭＡ　Ｃとジオキサンの混合物に溶解した。これをジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ）と反応させた。この溶液のＱ、５ｍｌをゆっ（りと３ｍｌの９．２．２７と呼ばれるモノクローナル抗体（４ｍｇ／ｍｌ）の水溶液中に添加した。１時間かきまぜながら反応を続けた。複合体を回収し、そのＵＶスペクトルはＤＩＲと９．２．２７間の共有結合の割合が低いことを示した。

（ｂ）モノクローナル抗体とＤＩＲ添加物の混合体中にカルボンイミドを添加することによって上記の反応を繰り返した。複合体を回収し、それは実質的に原抗体の部位特異性を有していた。

実施例８ビンプラスティン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）をジオキサン中でカルボニルジイミダゾールと１０分間反応させた。この溶液をモノクローナル抗体９．２．２７の水溶液へ添加した。この溶液を混合した時に、混濁した懸濁液となったが、これは液／液懸濁液である。複合体をこの水溶液から回収し、ＮＡＰ−５カラム内で精製した。この複合体は原モノクローナル抗体と実質的に同じ部位特異性を有していた。

実施例９゛　（ａ）クロロホルム中のレチノイックアンッドをモノクローナル抗体９．２．２７の水溶液中へ添加した。反応体のモル比は１６６：１である。混合していると、クロロホルム溶液は連続水相中において細かく分離した分散相となり、混合体は混濁する。反応は室温で３時間続けた。複合体をカラムフィルトレージョンによって水溶液から回収した。抗体と酸の間の共有結合は、ＵＶ分光検査で同定した。

（ｂ）レチノイックアノッドをジオキサン中へ溶解した。これはカルボニルジイミダゾールと反応し、この酸のイミド誘導体を形成した。

この溶液とｐＨ８，３のモノクローナル抗体９．２．２７水溶液とを２段階で反応させた。このイミドのうち１／３を混合物中へ添加し、振盪して懸濁液を作成した。同様にして残りの２／３を３０分間にわたって添加して反応を続けた。複合体を水溶液から１０ミクロンの膜のディアフィルトレーションによって回収した。この複合体は、レチノイックアシッドの抗体に対するモル比が１０：１であり、原抗体と実質的に同じ部位特異性を有していた。

（Ｃ）レチノイソクアンソトを乾燥クロロホルムへ溶解し、カルボンイミダゾールと反応させてイミドを作成した。これは、透明で深黄色の溶液であり、これをモノクローナル抗体９．２．２７のリン酸緩衝生理的食塩水溶液に添加した。混合すると、混濁し、た液／液懸濁液が生成した。反応は室温で］時間、かきまぜながら行った：その後かきまぜ続けながら、反応温度を４℃に下げた。複合体はＦ−１０ゲルクロマトグラフイーによって回収した：抗体に共有結合したレチノイックアシッドは、モル比で１２：１であった。

（ｄ）レチノイックアシッドを鉱物１伯に懸濁し、その後これをメチレンジクロライドと混合して黄色溶液を調製した。カルボニルジイミダゾールを添加し、反応させてこの酸のイミド体を調製した。

懸濁液はモノクローナル抗体９．２．２７のＰＢＳ溶液（ｐＨ８，２）にこの混合物を添加することにより調製した。反応が完了した後、複合体はゲルクロマトグラフィーによって水溶液から回収した。

実施例１０レチノイックアノットをＮ−ヒドロキシスフノンイミドとエチレンカルホシイミドとの混合物を、ＤＭＡｃとＮ−メチルピロリジンの溶媒内で反応させた。反応は室温で１時間、４℃で４時間行った、透明な黄色の溶液が得られた。

モノクローナル抗体９．　２．　２７の水溶液はＰＢＳに対して膜透過した。治療化合物の黄色透明溶液をＤＭ、Ａｃで９＝１に希釈し、９、２．２７溶液をかきまぜながらそこへ滴下した。各小滴は液／液懸濁を水性溶媒中へ形成する。反応が終了した後、複合体はディアフィルトレーンヨンによって水溶液から回収した。複合体を有する残存物および共有結合はＵＶ分光検査で同定した。

実施例１１メトトレキサートはアジビックヒドラジド（ａｄｉｐｉ（ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）と反応させてモノーヒドラジジニル（ｍｏｎｏ−ｈｙｄｒａｚｉｄｉｎｙｌ）誘導体ＣＮ−ＭＴＸ−（ＣＨ２０Ｈ）−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃｏ−（ＣＨ２）４−ＣＯＮＨＮＨ２を調製した。これは、６．５ｍｇ（１０−５モル）のメトトレキサートを１００μｌのＤＭＡｃに溶かして調製した。その後、１００μｌのＤＭＡｃ／ＬｉＣ１複合体中の１５ｍｇのアジピン酸ヒドラジドをこの溶液に添加した。

これは３μｌの酢酸を加えて酸性化した。反応はかきまぜながら１８時間行った。生成物は茶色の混濁した溶液であり、シリカゲルプラグ（ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　ｐｌｕｇ）を、溶出剤としてメタノールを使用して通した。フィルター透過物の生物活性化合物は、赤い溶液である。これを、およそ３５０μｌまで濃縮した。反応効果はＴＬＣ（１９：　Ｉ　ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）で解析した；これは出発化合物が完全に反応していることを示す。生物活性化合物をその溶液中において、飽和、あるいは飽和に近くあるいは過飽和にして液／液あるいは固／液懸濁液の調製が容易となるようにするのが好ましい。メトトレキサートおよびその誘導体は、たやすく飽和、および過飽和溶液を作成し、これらは上記に述べたように界面縮合反応似おける粒子として使用することが可能である。

部位特異的化合物は、ＫＳＩ／４の酸化炭化水素付加物である。これは炭化水素の末端グルコース基を過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化させて、ジアルデヒド型として調製した。

生物活性化合物の溶液を部位特異的化合物の水溶液へ添加した。

添加すると、水性溶媒内に細かい固体沈澱が形成される。生物活性化合物の部位特異的化合物に対するモル比は約４０：１であった。

ｐＨを５．６から５．２に下げ、反応を２℃で一晩続けた。免疫複合体を含有する赤色透明の溶液ができ、生物活性化合物中のヒドラジド基が部位特異的化合物のアルデヒド基に付加して、ヒドラジニジル結合によって部位特異的、生物活性免疫複合体が形成されていることを示す。

実施例１２Ｌ−アラニル−Ｌ〜アラニル−Ｌ−アラニンメチルエステルアセテート、Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−し−アラニル−し−ロイシンメチルエステルアセテート、あるいはＬ−ロイシル−し−アラニル〜Ｌ−ロイシル−し一アラニンメチルエステルアセテートのそれぞれとマレイン酸無水物とをＤＭＡｃを溶媒として、Ｅｔ！Ｎを塩基として反応させて３つのリンカ−を合成した。ＦＴ−ＩＲでは、３００Ｍｈ　ｚハイフィールドのＮＭＲ分析と同様、ＨＯ−Ｃｏ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃｏ−ＮＨ−ペプチド−ＣＯＯＭｅの構造を保持していることを示した。

モルホリノドキソルビシン（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ　ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ；Ｍ−ＤＸＲ）およびシアノモルホリノドキソルビシン（ｃｙａｎｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ　ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ；ＣＭ−ＤＸＲ）のＣ−１４位の第一アルコールと反応させることを目的として、どのリンカ−でも酸クロライドに変換して、関連するエステルとすることができる。リンカ−の末端メチルエステル官能基（よ、その後抗体とうまく連結するのに適当な基に変換し、例えｆｆ（Ｃ）Ｍ− ＤＸＲ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド−ＣＯ−ＮＨ−抗体の構造を有するような複合体を形成する結果となるよう１こしてもよＬ）。

実施例１３実施例１２のすべてのリンカ−を、メタノールあるＬＸｌｔＤＭＡｃのどちらかを溶媒として、以下の構造式％式％を与えるようにヒドラジン水和物と処理した。得られた酸ヒドラジドは、シアノモルホリノドキソルビシンと同様、モルホリノドキソルビシンのＣ−１３位のカルボニル基と反応させて、（Ｃ）Ｍ−ＤＸＲ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃｏ−ベプチＦ−ＮＨ −Ｃｏ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨの構造を有するような、関連するヒドラジドを得ても良い。リンカ−の酸基はその後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体へコンバートシても良い。

これらの化合物を抗体のリジンの上のε−アミノ基と反応させて、所望の薬物− リンカー−抗体複合体を作成してもよい。

本発明の製造方法による生産物は、従来技術による物質と比較して幾つかの点において改善されている。反応が完了したとき、複合体は、原抗体の部位特異性へ特異的に関しては、有意に高い部位特異性を有する。反応溶出液中の物質は高比率の目的とする複合体と、低い副反応および副生成物を含有する。反応生成物がこの程度までの精製度の部位特異的複合体を有するので、反応条件の結果として本質的にすべての生物活性高分子量化合物が所望の部位特異的複合体であり、変性した複合体では無いことから、この方法は精製ステップを実質的に減少する。

このような均一な複合体であるため、精製は基本的には不必要な低分子化合物、すなわち未反応生物活性化合物を除けば良い。それゆえ、不要な物質は透析やフィルターやそれに類似の方法で除くことができる。このようにして進めた反応の生成物は、有用な治療剤となっており、必要であればさらに精製すればよい。一方ある場合においては、個々の複合体が目的物であり、これらの生成物を個々の生物活性、部位特異的化合物に分離する必要の無い場合もある。

本発明の基本概念は、生物活性化合物と部位特異的化合物一般に適応できる。界面縮合および上に述べたそのバリエーションを用いると大変純粋な生物活性、部位特異的化合物が得られる。更に、これらの工程は新規な化合物を含む生成物を製造する。本発明はこれらのそして、当業者が本発明の適応することによって得られる同様な誘導体をも含有する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年４月１０日

Claims

【特許請求の範囲】

１．生物的部位特異的化合物のそれぞれが少なくともひとつの活性結合部位を有しており、（ａ）部位特異的化合物の水性溶液を調製してこれを水相とし；（ｂ）生物活性化合物を上記の水相に非混和性である相に調製して、両者の間に界面を形成させ；（ｃ）１またはそれ以上の部位特異的化合物と、１またはそれ以上の生物活性化合物を、部位特異的化合物の活性結合部位を縮合反応から保護して、この部位特異的化合物と生物活性化合物の間に１あるいはそれ以上の共有結合を形成させ、その結果これらの化合物の生物学的に部位特異的で生物活性な複合体を形成するようにこの部位特異的化合物と生物活性化合物の界面縮合反応を行い；（ｄ）この化合物の生物学的部位特異的、生物活性複合体を回収すること；を含む、生物活性化合物と生物学的部位特異的化合物の複合体を製造する方法。
２．上記化合物中少なくともひとつの化合物が、活性化基と連結性基からなる群から選択される基と処理された基を含有しており、この処理された部分が化合物間の共有結合の一部を形成している、第１項記載の方法。
３．連結性基がペプチド鎖あるいはペプチド鎖の誘導体である、第２項記載の方法。
４．部位特異的化合物と生物活性化合物の間の共有結合が生理学的に分裂可能な基を含有する、第１項記載の方法。
５．生物活性化合物が有機液体相に含有される、第１項記載の方法。
６．生物活性化合物が固体相に含有される、第１項記載の方法。
７．水相が連続層である、第１項記載の方法。
８．複合体の部位特異的化合物に対する生物活性化合物のモル比が３以上である、第１項記載の方法。
９．部位特異的化合物が、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、リポソーム、ＤＮＡ、ウイルス、ファージおよびステロイドホルモンからなる群から選択される。第１項記載の方法。
１０．部位特異的化合物がヒト固形癌抗原に対して特異的である、第１項記載の方法。
１１．部位特異的化合物が抗体または抗体のフラグメントである、第１項記載の方法。
１２．抗体がモノクローナルである、第１１項記載の方法。
１３．生物活性化合物が治療用の化合物である、第１項記載の方法。
１４．治療用の化合物が、薬理作用剤、毒、細胞毒素、細胞毒性および細胞活性剤、アルキル化剤、酵素、抗生物質、代謝阻害剤、ホルモン、神経伝達物質、放射線不透過染料、放射性同位元素、発蛍光剤、バイオマーカー、レクチン、フォトケミカルズ、細胞膜調整剤、抗増殖剤および重金属からなる群から選択される一員である、第１３項記載の方法。
１５．細胞毒性剤が親油性細胞毒素である、第１４項記載の方法。
１６．細胞毒性剤がドキソルビシン、ビンブラスチン、メトトレキサート、レチノイド類、カロテノイド類およびこれらの誘導体からなる群から選択される、第１４項記載の方法。
１７．重金属に白金を含有する、第１４項記載の方法。
１８．生物活性化合物が細胞破壊、細胞増殖抑制、ホルモン治療、遺伝子治療、細胞の状態の診断、細胞位置のトレース、細胞重量の同定、健常細胞の処置および健常細胞の修飾からなる群から選択される機能のために適応される化合物である、第１項記載の方法。
１９．生物活性化合物の非混和性相が、部位特異的化合物の活性結合部位あるいは部位群において、少なくとも約１０オングストロームの突出部の部分半径を有している第１項記載の方法。
２０．突出部の部分半径が少なくとも約２０オングストロームである、第１９項記載の方法。
２１．第１〜２０項に記載のいずれかの方法による製造物。
２２．生物的部位特異的化合物のそれぞれが少なくともひとつの活性結合部位を有しており、（ａ）部位特異的化合物の水性溶液を調製してこれを水相とし；（ｂ）生物活性化合物を上の水相に非混和性である相に調製して、両者の間に界面を形成させ；（ｃ）１またはそれ以上の部位特異的化合物と、１またはそれ以上の生物活性化合物を、部位特異的化合物の活性結合部位を縮合反応から保護して、アミド、酸アミド、シアノ、ヒドラジド、ヒドラジジニル、ポリスルフィド、エステル、エーテル、ヒドロキシ−アミン、イソウレア、チオエーテル、チオウレアウレアおよびウレタン結合からなる群から選択される共有結合をこの部位特異的化合物と生物活性化合物の間に１あるいはそれ以上形成し、その結果これらの化合物の生物学的に部位特異的で生物活性な複合体を形成するようにこの部位特異的化合物と生物活性化合物の界面縮合反応を行い；（ｄ）この化合物の生物学的部位特異的、生物活性複合体を回収すること；を含む、生物活性化合物と生物学的部位特異的化合物の複合体を製造する方法。