CN112852822B - 一种基于适体的Na+、K+同时检测荧光纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学纳米材料技术领域，具体公开了一种基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针及其制备和应用。以DNA链为骨架；以适体为主要识别单元，可以特异性识别待检测物；修饰有荧光响应基团，对待测物响应荧光变化；修饰细胞膜锚定元件，以用于检测细胞周围的Na⁺、K⁺的浓度变化。本发明方法制备的纳米探针性质稳定，安全无毒，并且制备简便、成本较低，在体外对于溶液中的Na⁺、K⁺能够实现高灵敏度、高选择性的检测识别，同时能有效地锚定在细胞膜上，对细胞微环境中Na⁺、K⁺能够进行实时成像，可视化效果较好。

Description

一种基于适体的Na+、K+同时检测荧光纳米探针及其制备方法 和应用

技术领域：

本发明属于生物化学纳米材料技术领域；具体涉及一种能同时检测Na⁺、K⁺的DNA荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

金属离子在各种生化过程中起着至关重要的作用，缺乏和过剩都会扰乱正常功能。钠离子(Na⁺)和钾离子(K⁺)作为生物体内最重要的两种阳离子，在许多生理事件中起着重要作用，如神经元信号转导、维持心肌细胞的稳态、酸碱平衡和细胞渗透压等。一个活的细胞，其细胞内外Na⁺和K⁺的浓度有很大差别。由于Na⁺/K⁺-ATPase的存在，细胞内外呈现膜内高钾、膜外高钠的不均匀离子分布。这种持续的浓度梯度对许多器官的生理过程至关重要，并在维持细胞渗透平衡、稳定细胞静息膜电位、调节细胞体积和细胞信号转导方面持续发挥作用。考虑到Na⁺和K⁺在细胞环境中的重要作用、Na⁺/K⁺-ATPase在维持细胞内外钠钾离子浓度分布的重要作用，因此，评估监测Na⁺/K⁺-ATPase的活性、检测细胞微环境中的Na⁺和K⁺具有重要意义。

据悉，直接评估Na⁺/K⁺-ATPase的活性是比较困难的，但可以通过检测 Na⁺/K⁺-ATPase发生作用过程中产生的Na⁺和K⁺的含量变化来进行间接评估。随着研究的发展，各种分析技术已被用于检测Na⁺和K⁺。然而，锚定在细胞表面以同时阐明Na⁺/K⁺-ATPase对细胞外Na⁺和K⁺的调节作用的荧光探针在很大程度上尚未被探索；现有技术需要开发一种制备简便、靶向准确、灵敏性高、选择性好的荧光探针来检测和定位细胞外的Na⁺和K⁺。

发明内容：

本发明第一目的在于，提供一种基于适体的DNA荧光纳米探针(本发明也简称为探针)，旨在能同时检测Na⁺、K⁺。

本发明旨在创新性地将核酸适体的高度特异性结合能力与荧光探针的高灵敏性、可视化功能(动态检测)相结合，设计了一种以Na⁺、K⁺特异性适体为识别单元的双色荧光纳米探针，其可以通过修饰细胞膜锚定元件，以将探针组装到细胞膜上，用于同时、动态检测细胞表面的Na⁺和K⁺。

一种基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针，包含Na⁺和K⁺两套检测元件，Na⁺检测元件包括修饰有荧光响应基团的特异性识别Na⁺的核酸适体；K⁺检测元件包括修饰有荧光响应基团的特异性识别K⁺的核酸适体；优选所述的特异性识别Na⁺和K⁺的核酸适体基于碱基互补配对原理组装在一起。

上述探针还能通过修饰细胞膜锚定元件，以将探针组装到细胞膜上，用于细胞外Na⁺、K⁺成像，优选细胞膜锚定元件为亲脂性的物质，基于与细胞磷脂层之间的疏水相互作用自组装到细胞膜上；进一步优选细胞膜锚定元件包括胆固醇。

进一步地，所述的细胞膜锚定元件连接在特异性识别Na⁺或K⁺的核酸适体序列的延长序列末端；优选地，核酸适体序列的延长序列选择为不干扰检测的无关序列。

本发明以荧光共振能量转移对为信号报告器，包括有荧光供体基团和荧光受体基团；检测Na⁺的和检测K⁺的两部分荧光响应信号互不干扰。

本发明特异性识别Na⁺的核酸适体包括：能对Na⁺特异性识别的DNA酶链和DNA底物链；底物链包含单个腺苷核糖核苷酸位点rA，酶链在Na⁺的存在下能催化裂解底物链中rA位点；

优选以下3对能对Na⁺特异性识别的DNA酶链和DNA底物链：

酶链E1链：5’-GGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTACGTGATCC-3’；见SEQ ID NO.1；

底物链S1链：5’-GGATCACGTAT/rA/GGAAGTACCGCC-3’，见SEQ I D NO.2；

酶链E2链：5’-GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG-3’，见SEQ ID NO.3；

底物链S2链：5’-CTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGC-3’见SEQ I D NO.4；

酶链E3链：5’-CACGTCCATCTCCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGTGAGT-3’，见SEQ ID NO.5；

底物链S3链：5’-ACTCACTAT/rA/GGAAGAGATGGACGTG-3’，见SE Q ID NO.6。

进一步优选酶链E2链和底物链S2链。

特异性识别K⁺的核酸适体包括：对K⁺特异性识别的G四聚体链；在没有 K⁺时，为一条DNA单链，在K⁺存在下，单链与K⁺形成椅型四聚体结构。

优选以下3条对K⁺特异性识别的G四聚体链：

G1链：5’-TACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，见SEQ ID NO.7；

G2链：5’-TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-3’，见SEQ ID NO.8；

G3链：5’-TCTACGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA-3’，见SEQ ID NO.9。

进一步优选G2链。

进一步地，对Na⁺特异性识别的能催化裂解RNA的DNA酶选择在酶链和底物链互补同一侧分别修饰荧光供体基团和荧光受体基团，以保证荧光供体基团和荧光受体基团足够靠近产生能量转移，进而实现荧光信号变化；优选，Na⁺特异性识别的DNA酶链的3’端修饰荧光供体基团FAM，Na⁺特异性识别的DNA底物链的5’端修饰荧光受体基团BHQ1；

对K⁺特异性识别的G四聚体链保证在K⁺存在下形成的椅型四聚体能使荧光供体基团和荧光受体基团足够靠近产生能量转移，进而实现荧光信号变化；优选，对K⁺特异性识别的G四聚体链在3’端修饰荧光受体基团Cy5，在中间修饰荧光供体基团Cy3；进一步优选，根据G四聚体链有效序列长度确定荧光受体基团和荧光供体基团之间间隔25～29个碱基。

进一步地，DNA底物链的3’端先延长6～12个碱基作为缓冲过渡序列，然后延长能与K⁺检测元件中适配体延长序列互补配对的无关序列12～20个碱基；优选最后再延长12～18个碱基作为缓冲过渡序列后连接胆固醇。

在G四聚体链的5’端先延长6～12个碱基作为缓冲过渡序列，再延长与底物链延长序列碱基互补配对的无关序列12～20个碱基。

本发明所述的一种基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针，以DNA链为骨架，以核酸适体为主要识别单元，利用针对目标离子特异性识别的核酸适体，实现较高灵敏度、强亲和力(检测限低)的识别Na⁺和K⁺；同时，识别单元因为能特异性识别目标检测离子，故该探针有较强的选择性，能对细胞外其他金属离子有较强的抗干扰能力。

本发明的所述的检测Na⁺的部分和检测K⁺的部分延长DNA碱基序列，细胞膜锚定元件接在Na⁺检测元件和K⁺检测元件的部分任意一个的延长序列末端，基于碱基互补配对原则，创新性的将两个分别能特异性识别Na⁺、K⁺的核酸适体单元、细胞锚定元件连接，构建成能同时检测Na⁺、K⁺的双功能检测探针。

本发明中，探针以荧光共振能量转移(FRET)对为信号报告器，包括有荧光供体基团和荧光受体基团；因为考虑要同时检测Na⁺、K⁺，并不产生重叠干扰信号，所以检测Na⁺的和检测K⁺的两部分荧光基团的选择依赖于对它们光谱重叠的考虑；荧光基团标记位置依赖于确保荧光共振能量转移的效果，检测Na⁺、 K⁺两部分的荧光基团之间保有一定的碱基序列距离，以保证两部分荧光信号互不干扰。

本发明第二个目的在于提出了一种基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针的设计思路和制备方法，在Na⁺、K⁺识别单元一端分别延长一段碱基互补配对的无关序列，其中一条链末端再修饰上胆固醇，所有DNA链通过碱基互补配对原则组装，制得所述的基于核酸适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针。

该方法制备的纳米探针性质稳定，安全无毒，并且制备简便、成本较低，在体外对于溶液中的Na⁺、K⁺能够实现高灵敏度、高选择性的检测识别，同时能有效地锚定在细胞膜上，对细胞微环境中Na⁺、K⁺能够进行实时成像，可视化效果较好。

具体包括以下步骤：

步骤(1)：对Na⁺特异性识别的核酸适体部分修饰：

步骤(1-1)：在对Na⁺特异性识别的DNA酶链的3’端修饰上荧光供体基团，得到M1链；

步骤(1-2)：在对Na⁺特异性识别的DNA底物链的5’端修饰上荧光受体基团，其3’端依次延长缓冲序列1、与对K⁺特异性识别的G四聚体链的延长序列互补配对的无关序列1、缓冲序列2，然后在3’端尾端修饰上胆固醇，得到 M2链；

步骤(2)：对K⁺特异性识别的核酸适体部分修饰：

步骤(2-1)：在对K⁺特异性识别的G四聚体链的3’端修饰荧光受体基团；

步骤(2-2)：在对K⁺特异性识别的G四聚体链的中间修饰荧光供体基团；

步骤(2-3)：在对K⁺特异性识别的G四聚体链的5’端延长缓冲序列3和与Na+检测元件中底物链延长的无关序列1碱基互补配对的无关序列2，最终得到M3链；

步骤(3)：各条链组装：

取一定比例的M1链、M2链、M3链溶于缓冲液中，避光搅拌；将混合均匀的溶液置于高温条件下的避光退火一定时间；缓慢冷却，即得所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针；

如果无需进行对基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针进行细胞锚定，则无需在对Na⁺特异性识别的DNA底物链的3’端延长缓冲序列2，进而无需在 3’端尾端修饰上胆固醇。

上述的制备方法，进一步优选：

所述的检测Na⁺的酶链和底物链的浓度配比为1:0.8～1:1.5；

所述的检测Na⁺的底物链和检测K⁺的G四聚体链的浓度配比为1:0.7～1:1.3；

退火过程中的温度为90～100摄氏度；时间为5～10分钟；

缓冲液为不含Na⁺、K⁺，但含Li⁺的Bis-Tris水溶液；

缓冲液的pH为5～8；

缓冲液中Li⁺的浓度70～120mM；

缓冲液中Bis-Tris的浓度为40～70mM。

在步骤(1-1)中，在DNA酶链的3’端修饰上荧光供体基团FAM，在步骤 (1-2)中，对DNA底物链的5’端修饰上荧光受体基团BHQ1，以保证酶链和底物链互补形成双链时，使荧光供体基团和荧光受体基团距离合适发生荧光共振能量转移，并且在Na⁺存在条件下，酶链催化底物链rA位点裂解，荧光受体基团BHQ1随着底物裂解链离开探针，使得荧光供体基团FAM荧光恢复。

在步骤(1-2)中，DNA底物链的3’端先延长6～12个碱基作为缓冲过渡序列，再延长与K⁺识别单元延长链互补配对的无关序列12～20个碱基，既保证多个荧光基团之间距离合适互不干扰，又实现了探针组装稳定。

进一步优选地，继续在DNA底物链的无关序列之后延长12～18个碱基的缓冲序列，然后将胆固醇修饰在底物链的3’端尾端。因为在一条链进行多修饰需要考虑合成的可行性和成本要求，尽量不超过70个碱基，酶链(已有61个碱基) 太长，G四聚体链已经修饰了两个荧光基团，故考虑在底物链尾端修饰胆固醇。

DNA底物链的3’端延长12～18个碱基序列作为与细胞锚定元件的缓冲过渡序列，以保证探针锚定在细胞膜上时不影响识别元件的检测效果。

本发明中，在步骤(2-1)和步骤(2-2)中，考虑修饰的可行性，在G四聚体链的3’端修饰荧光受体基团Cy5，中间修饰荧光供体基团Cy3。

作为优选，K⁺特异性识别单元确定荧光受体基团和荧光供体基团间隔25～29 个碱基，保证在K⁺存在下形成的椅型四聚体能使荧光供体基团和荧光受体基团足够靠近产生能量转移，进而实现荧光信号变化。

作为优选，在步骤(2-3)中，在G四聚体链的5’端先延长6～12个碱基作为缓冲过渡序列，再延长与DNA底物链延长序列碱基互补配对的无关序列12～20 个碱基，考虑原因同上。

作为优选，步骤(1)和步骤(2)的所有核酸链均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，采用HPLC方法纯化，具体序列如下：

M1链：5’-GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG/6-FAM/-3’，见SEQ ID NO.10；

M2链：5’-/BHQ1/CTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGCTTTTTTTTTTTAAACATTGATGCAATTTTTTTTTTTTTTT/Cholesteryl/-3’，见SEQ ID NO.11；

M3链：5’-ATTGCATCAATGTTTATTTTTT/iCy3/TCTACGGGTTAGGGTTA GGGTTAGGGT/Cy5/-3’，见SEQ ID NO.12；

M4链：5’-/BHQ1/CTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGCTTTTTTTTTTTAAACATTGATGCAATTTTTTTTTTTTTTT-3’，M4链与M2链的不同仅为未连接胆固醇。

本发明研究意外发现，在合成双链之前进行高温退火，可以有效提升双链结合效果。据悉，DNA单链具有一定的柔性、弯曲程度和空间结构，两条DNA单链可以通过碱基互补配对结合成为双链。加热单链DNA分子使其受热变性，可打开二级结构充分伸展，若再将其缓慢冷却至室温(这一过程称为退火)，可使变性DNA的两条核苷酸链重新聚合成双链螺旋结构，恢复其本来的理化性质和生物学功能。此过程有利于单链之间碱基互补配对有效结合，从而提升识别单元的检测效果和荧光共振能量转移效果，另外还需要合理控制各条链的浓度配比。

作为优选，所述的检测Na⁺的DNA酶链和DNA底物链的浓度配比为 1:0.8～1:1.5。研究意外发现，控制在该范围下，可以使得底物链和酶链很好的结合，同一端的荧光供体基团和受体基团靠近距离合适，有较高的荧光共振能量转移效果，不仅如此，此配比合成的探针还对于检测Na⁺具有较高的灵敏度和亲和性，检测效果优良。

作为优选，所述的检测Na⁺的延长有碱基互补配对的DNA底物链和检测K⁺的G四聚体链的浓度配比为1:0.7～1:1.3。研究发现，控制在该范围下，可以使得两部分检测链能有效的结合形成整体探针，也没有造成其中一种原材料过量浪费，利用率高、合成效果好。

本发明研究发现，退火过程的温度、时间、降温方式也会影响双链结合效果，故需要合理控制退火的条件。

作为优选，退火过程中的温度为90～100摄氏度。温度过低可能会使得双链的核酸变性不彻底，单链伸展不到位，对单链之间碱基互补配对造成阻碍；温度过高可能会对核酸和荧光基团造成一定程度的损伤，影响材料性能和荧光效果。研究发现，控制在该范围下，能有效保证单链伸展较为彻底，也不损伤核酸链和荧光基团。

作为优选，高温退火后，可以立即关闭机器缓慢降到室温或者快速降温到 25摄氏度左右；进一步优选地，高温退火后，立即关闭机器缓慢降到室温。

本发明研究发现，探针的合成设计要考虑两个识别单元在检测过程中是否互相干扰，同时在考虑各条链的浓度配比、检测基团序列长短(也可理解为一对荧光基团的修饰距离)、缓冲过渡序列碱基数目等方面进行了一系列的实验探索，才得到了本发明DNA荧光探针的最终设计序列。本发明主要考虑和探索了以下几个因素：

1、M2链和M3链延长的缓冲过渡序列的碱基数目，如果缓冲段过短则两个识别单元会在空间距离上过近，导致构象变化受限或产生能量传递，干扰检测结果；如果缓冲段过长则增加合成难度与成本。

2、M2链和M3链互补配对的碱基数目，如果互补配对的碱基数目过少，则 M2链和M3链的结合力不足，探针合成失败；如果碱基数目过多则增加合成难度与成本。

3、细胞膜锚定元件延长的碱基数目，细胞膜锚定元件和探针有效检测部分应保有一定的距离，如果距离过近则可能使检测部分过于靠近细胞膜表面，干扰了其构象变化。

4、修饰的荧光基团的选择和位置确定，本发明设计的探针包括两组荧光基团，两组之间应互不干扰，而组内的两个荧光基团应能发生荧光能量共振转移。

5、探针合成的条件，探针的合成条件应在不影响其检测性能的前提下尽可能简便，故优先考虑室温孵育、高温退火。

本发明中构建成能同时检测Na⁺、K⁺的双功能检测探针(结构示意见图1)

本发明第三个目的在于，提供一种所述的基于适体的DNA荧光纳米探针的应用，以用于同时检测Na⁺、K⁺的浓度变化。

将所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针用缓冲液稀释得到分散液，用于检测溶液体系中不同浓度的Na⁺或K⁺，根据荧光信号变化，得到Na⁺或K⁺的浓度指示。待测液中Na⁺和K⁺的最终浓度不超过300mM。

或者修饰了胆固醇的探针与细胞孵育一定时间，洗去未结合的探针，得到负载有检测探针的细胞，根据细胞成像系统成像荧光变化，得到细胞微环境中Na⁺或K⁺的浓度变化指示。

有益效果：

本发明所合成的Na⁺、K⁺同时检测的双色荧光纳米探针，将核酸适体的高度特异性结合能力与荧光探针的高灵敏性、可视化功能相结合，以DNA链为骨架，由Na⁺、K⁺检测识别单元、细胞膜锚定元件组成，修饰有荧光基团，一方面利用针对目标离子特异性识别的适体，实现较高灵敏度、高选择性的识别Na⁺和K⁺，一方面又通过碱基互补配对原则将两个检测识别单元有效组合，实现了同时检测两种目标离子的双功能检测探针，并且两部分检测互相独立、效果互不干扰。利用荧光共振能量转移(FRET)原理，通过在适体探针上双重标记合理设计的荧光猝灭对，实现纳米探针“关闭”状态和“打开”状态的转换，从而实现检测的可视化和定量化，检测效果好。本发明制备的荧光探针，制备方法简单、安全无毒、重复性好，通过胆固醇锚定在细胞表面，实现了对细胞微环境中Na⁺、K⁺含量的实时监测和可视化成像，从而为监测重要的生理事件(Na⁺/K⁺-ATPase的活性和神经元的信号转导等方面)提供了一种有效的普遍策略。

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

附图说明

图1为本发明制得的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针的结构示意图。

图2为本发明对比案例1制得的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针的凝胶成像结果图。

图3为本发明对比案例2制得的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针的凝胶成像结果图。

图4A中的上图为本发明实施例2提供的双色荧光探针检测Na⁺的荧光发射图谱，下图为本发明实施例2、对比案例3、对比案例5提供的以Na⁺浓度为横坐标、517nm(FAM的最佳发射波长)的荧光强度为纵坐标的数据分析曲线。其中，曲线点表示溶液中的Na⁺浓度分别是0mM，2mM，6mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，70mM，90mM，120mM，140mM，160mM，200mM，300mM，激发光的波长选择为485nm，从505nm至600nm收集荧光光谱，激发和发射狭缝宽度均为10nm。

图4B中的上图为本发明实施例2提供的双色荧光探针检测K⁺的荧光发射图谱，下图为本发明实施例2、对比案例4、对比案例6提供的以K⁺浓度为横坐标、 665nm的荧光强度与565nm的荧光强度的比值F_A/F_D(受体基团Cy5与供体基团 Cy3最佳发射波长处荧光强度的比值)为纵坐标的数据分析曲线。其中，曲线点表示溶液中的K⁺浓度分别是0mM，2mM，6mM，10mM，20mM，30mM，40mM， 50mM，70mM，90mM，120mM，140mM，160mM，200mM，300mM，激发光的波长选择为530nm，从550nm至700nm收集荧光光谱，激发和发射狭缝宽度均为10nm。

图5A为本发明实施例3提供的双色荧光探针检测细胞外Na⁺的荧光成像结果图。

图5B为本发明实施例3提供的双色荧光探针检测细胞外K⁺的荧光成像结果图。

图6为本发明实施例3、对比案例7提供的双色荧光探针的荧光成像结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特别说明，本发明实施例中使用的细胞、药品及试剂均来源为正规而易购渠道。其中，所有核酸链均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并进行相应修饰，具体序列如下：

M1链：5’-GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG/6-FAM/-3’

M2链：5’-/BHQ1/CTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGCTTTTTTTTTTTAAACATTGATGCAATTTTTTTTTTTTTTT/Cholesteryl/-3’

M3链：5’-ATTGCATCAATGTTTATTTTTT/iCy3/TCTACGGGTTAGGGTTA GGGTTAGGGT/Cy5/-3’

M4链：5’-/BHQ1/CTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGCTTTTTTTTTTTAAACATTGATGCAATTTTTTTTTTTTTTT-3’，M4链与M2链的不同仅为未连接胆固醇。

实施例1基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针的构建

取浓度为100μM的M1链2.5μL、100μM的M2链2.5μL、100μM的M3链 2.5μL溶于242.5μL缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)中，避光搅拌；将混合均匀的溶液置于95摄氏度条件下避光退火5分钟；关闭仪器使其缓慢冷却到室温(1.5小时)，即得所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针(1μM)。因修饰了胆固醇的M2链凝胶成像时会到受胆固醇的部分影响，故参考对比例1的凝胶成像结果作为合成情况的评估。

实施例2体外检测Na⁺、K⁺

取浓度为1μM的实施例1提供的DNA荧光探针250μL，分成10μL每管，然后每管分别加入100μL含有不同浓度Na⁺、K⁺的缓冲液A(50mM Bis-Tris， 90mM LiCl，pH 7.0)，各溶液的最终体积为110μL，Na⁺和K⁺的最终浓度均分别为0mM，2mM，6mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，70mM，90mM， 120mM，140mM，160mM，200mM，300mM，避光混匀后，于37摄氏度下孵育一个小时，然后在37摄氏度条件下用荧光分光光度计检测加入不同浓度Na⁺、 K⁺的荧光能量转移状态。检测Na⁺时激发波长为485nm，从505nm至600nm收集荧光光谱，检测K⁺时激发波长为530nm，从550nm至700nm收集荧光光谱，激发和发射狭缝宽度均为10nm。结果如图4A、图4B。

如图4A所示，在一定的范围内，随着Na⁺浓度的加大，517nm(FAM的最佳发射波长)的荧光强度逐渐增强，DNA酶链催化DNA底物链裂解，荧光受体基团BHQ1离去，使得荧光供体基团FAM的荧光逐渐恢复，强度逐渐增强，在 Na⁺浓度为1～50mM范围内呈线性增长最快，之后增速减慢，于Na⁺浓度为200mM 左右趋于稳定。

如图4B所示，在一定的范围内，随着K⁺浓度的加大，形成的椅型四聚体能使荧光供体基团和荧光受体基团靠近产生能量转移，565nm(Cy3的最佳发射波长)的荧光强度逐渐减弱，665nm(Cy5的最佳发射波长)的荧光强度逐渐增强，两个荧光强度的比值F_A/F_D(受体基团Cy5与供体基团Cy3的荧光强度比值)逐渐增大，说明DNA荧光探针能量转移逐渐增大，之后增速减慢，于K⁺浓度为 200mM左右趋于稳定。

由图说明，DNA荧光探针在较低浓度目标离子时即能有效检测，对Na⁺和 K⁺有较高的灵敏性和亲和力；检测数据与理论分析相吻合，证明了此发明设计的 DNA荧光探针检测Na⁺和K⁺的优良性能，并可以由此拟合出检测离子浓度与荧光信号的标准曲线，从而将Na⁺和K⁺的定性分析转为定量分析，为后续检测带来一定参考。

实施例3细胞外的Na⁺、K⁺成像检测

在细胞环境中加入不同浓度的Na⁺和K⁺，是为了进一步证明在细胞环境里，本发明设计的DNA荧光探针对不同浓度的Na⁺和K⁺也会有响应的荧光信号变化。

选择对数生长的A549细胞，弃去DMEM培养基(10％胎牛血清，1％青霉素、链霉素，89％DMEM培养基，后面此种培养基简称为DMEM培养基)，用 PBS缓冲溶液洗涤2～3次，用400μL胰酶将细胞消化下来，加入1mLDMEM培养基制成细胞悬浮液并移至离心管中离心，离心后弃去上层培养基，加入4～6mL 新鲜DMEM培养基，用血球计数板计数，如果细胞密度过大可进一步稀释。最后将细胞悬浮液混合均匀，取100μL细胞悬浮液逐一加入至96孔板中，再将96 孔板的四周围上PBS缓冲液，在37摄氏度恒温培养箱培养24h后，移除培养基，用PBS缓冲液洗2～3遍，每孔加入实施例1制备的DNA荧光探针40μL浸没细胞，并置于4摄氏度条件下避光孵育10分钟，移除培养基，用缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)洗2～3次，加入100μL含有不同浓度Na⁺、K⁺的缓冲液，Na⁺和K⁺的浓度分别均为0mM，10mM，50mM，90mM，150mM， 200mM，在高内涵细胞成像系统中观察成像。结果如图5A、图5B。

图5A表示，在一定范围内，随着Na⁺浓度的增加，DNA荧光探针的绿色通道(FAM)的荧光信号从无到有并逐渐增强，荧光从被淬灭到恢复；图5B表示，随着K⁺浓度的增加，DNA荧光探针的黄色通道(Cy3)的荧光信号逐渐减弱，红色通道(Cy5)的荧光信号逐渐增强，黄色与红色叠加通道的颜色也发生了从黄到红的变化。这与在体外检测实验结果的响应情况一致，说明在细胞膜上修饰并不影响DNA荧光探针检测Na⁺和K⁺的能力。

对比案例1

和实施例1相比，区别在于，不使用修饰有胆固醇的M2链，改为未修饰胆固醇的M4链，具体操作如下：

取浓度为100μM的M1链2.5μL、100μM的M3链2.5μL、100μM的M4 链2.5μL溶于242.5μL缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)中，避光搅拌；将混合均匀的溶液置于95摄氏度条件下避光退火5分钟；关闭仪器使其缓慢冷却到室温(1.5小时)，即得未修饰胆固醇的荧光纳米探针(1μM)，凝胶成像结果如图2。条带1：M3链；条带2：Marker1链(为了区分碱基数较为相近的M1链和M2链，本发明选取了与M1链碱基数相同的无关序列作为 Marker1链)；条带3：M1链；条带4：M2链；条带5：M1链+M2链(退火后产物)；条带6：M1链+M2链+M3链(退火后产物)。

由图2可见，与条带1～4相比，条带5～6的迁移速度慢得多，表示M1能和 M2结合，M1、M2和M3能互相结合，符合我们的构想。条带2的Marker1链与条带3的M1链位置相同，迁移速度比条带4的M2链快，说明确实分子量大的迁移速度慢，碱基数相近的两条链在此电泳条件下也能有效分开。条带6迁移速度最慢，代表它的分子量最大，与其他三条单链相比，这个新的条带在一定程度上证明了DNA荧光探针的成功组装，且目的条带比较单一、亮度较亮，没有多余的杂带，说明本发明设计的DNA荧光探针可完成预期的组装合成且组装纯度很高。

对比案例2

和实施例1相比，区别在于，不使用修饰有胆固醇的M2链，改为未修饰胆固醇的M4链，且合成过程不经过退火，具体操作如下：

取浓度为100μM的M1链2.5μL、100μM的M3链2.5μL、100μM的M4 链2.5μL溶于242.5μL缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)中，避光搅拌1.5小时，即得未经退火、未修饰胆固醇的荧光纳米探针(1μM)，凝胶成像结果如图3。

除条带2为对比案例1中条带2的Marker1链加上某条已知分子量的Marker2 链(为了估算条带6中杂带的分子量的大致范围)，其他条带归属与对比案例1 相同。由图2可见，条带6出现杂带，且存在拖尾现象，根据条带2的Marker2 链可推算其分子量范围，可能是某些双链不同的二级结构，说明此条件下各条链没有进行有效的互补配对结合，探针组装效果较对比案例1差。

对比案例3

和实施例2相比，区别在于，检测Na⁺部分的M1链和M2链的浓度配比为 1:0.6。

取浓度为100μM的M1链4.2μL、100μM的M2链2.5μL、100μM的M3链 2.5μL溶于240.8μL缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)中，避光搅拌；将混合均匀的溶液置于95摄氏度条件下避光退火5分钟；关闭仪器使其缓慢冷却到室温(1.5小时)，即得所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针(1μM)。

取上述制得的DNA荧光探针250μL，分成10μL每管，然后每管分别加入 100μL含有不同浓度Na⁺的缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)，各溶液的最终体积为110μL，Na⁺的最终浓度为0mM，2mM，6mM，10mM，20mM， 30mM，40mM，50mM，70mM，90mM，120mM，140mM，160mM，200mM， 300mM，避光混匀后，于37摄氏度下孵育一个小时，然后在37摄氏度条件下用荧光分光光度计检测加入不同浓度Na⁺的荧光能量转移状态。检测Na⁺时激发波长为485nm，从505nm至600nm收集荧光光谱，激发和发射狭缝宽度均为 10nm。结果如图4A的下图(标注为对比案例3)。

对比实施例2，对比案例3在Na⁺浓度为0时，517nm的起始荧光值较高，说明荧光淬灭效果较差，这可能是因为带有荧光受体基团BHQ1的M2链的浓度较带有荧光供体基团FAM的M1链的浓度低很多，使得游离的M2链和未被 BHQ1淬灭的FAM较多，FAM的背景荧光值较高，同时随着Na⁺浓度的逐渐加大，荧光供体基团的荧光逐渐恢复，强度逐渐增强，但因为M1链浓度高，有较高的FAM背景荧光信号的存在，与实施例2相比，荧光最大稳定值要高很多，检测的整体信噪比偏低。

对比案例4

此案例主要考虑检测基团序列长短(也可理解为一对荧光基团的修饰距离) 的对比探索，和实施例2相比，区别在于，检测K⁺部分M3链中两个荧光基团距离为24个碱基的序列，定为M5链，具体序列如下：

M5链：5’-ATTGCATCAATGTTTATTTTTT/iCy3/ACGGGTTAGGGTTAGGG TTAGGGT/Cy5/-3’，见SEQ ID NO.13。

取浓度为100μM的M1链2.5μL、100μM的M2链2.5μL、100μM的M5链 2.5μL溶于242.5μL缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)中，避光搅拌；将混合均匀的溶液置于95摄氏度条件下避光退火5分钟；关闭仪器使其缓慢冷却到室温(1.5小时)，即得所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针(1μM)。

取上述制得的DNA荧光探针250μL，分成10μL每管，然后每管分别加入 100μL含有不同浓度K⁺的缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)，各溶液的最终体积为110μL，K⁺的最终浓度为0mM，2mM，6mM，10mM，20mM， 30mM，40mM，50mM，70mM，90mM，120mM，140mM，160mM，200mM， 300mM，避光混匀后，于37摄氏度下孵育一个小时，然后在37摄氏度条件下用荧光分光光度计检测加入不同浓度K⁺的荧光能量转移状态。检测K⁺时激发波长为530nm，从550nm至700nm收集荧光光谱，激发和发射狭缝宽度均为10nm。结果如图4B的下图(标注为对比案例4)。

对比实施例2，对比案例4在K⁺浓度为0时，两个荧光强度的比值F_A/F_D(受体与供体的荧光比值)较高，这可能是因为G四聚体链变短，使得荧光供体基团和荧光受体基团距离接近，有一定的荧光能量共振转移，产生较高的背景信号，同时，较实施例2提前达到平台期，且F_A/F_D最大稳定值较低，说明能量共振转移效率较低，这可能是因为链的缩短使得在K⁺存在条件下形成的构象两个荧光基团还有一定距离，不足以发生有效的能量共振转移，所以F_A/F_D值较低，可检测范围变窄。

对比案例5(对比实施例2)

此案例主要考虑检测Na⁺部分的缓冲过渡序列碱基数目的对比探索，和实施例2相比，区别在于，检测Na⁺部分M2链中的缓冲过渡序列1碱基数缩短为4 个，定为M6链，具体序列如下：

M6链：5’-/BHQ1/CTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGCTTTTTAAACATTGATGCAATTTTTTTTTTTTTTT/Cholesteryl/-3’，见SEQ ID NO.14。

取浓度为100μM的M1链2.5μL、100μM的M6链2.5μL、100μM的M3链 2.5μL溶于242.5μL缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)中，避光搅拌；将混合均匀的溶液置于95摄氏度条件下避光退火5分钟；关闭仪器使其缓慢冷却到室温(1.5小时)，即得所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针(1μM)。

取上述制得的DNA荧光探针250μL，分成10μL每管，然后每管分别加入 100μL含有不同浓度Na⁺的缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)，各溶液的最终体积为110μL，Na⁺的最终浓度分别为0mM，2mM，6mM，10mM， 20mM，30mM，40mM，50mM，70mM，90mM，120mM，140mM，160mM， 200mM，300mM，避光混匀后，于37摄氏度下孵育一个小时，然后在37摄氏度条件下用荧光分光光度计检测加入不同浓度Na⁺的荧光能量转移状态。检测 Na⁺时激发波长为485nm，从505nm至600nm收集荧光光谱，激发和发射狭缝宽度均为10nm。结果如图4A的下图(标注为对比案例5)。

对比实施例2，对比案例5在Na⁺浓度为0时，517nm的起始荧光值较高，说明荧光淬灭效果较差，这可能是因为缓冲过渡序列过短导致M1链的5’端与 M6链互补配对位置太靠近M6链和M3链互补配对位置，受到M3链的空间影响，使得M6链结合较少，修饰有BHQ1的M1链相对较多，初始荧光淬灭效果较好，荧光供给基团FAM的荧光强度较高，随着Na⁺浓度的逐渐加大，荧光供体基团的荧光恢复到的最大值较低，这是因为修饰有FAM的M6链结合较少，导致最终完全恢复荧光的FAM浓度较低，同时可检测范围变窄。

对比案例6(对比实施例2)

此案例主要考虑检测K⁺部分的缓冲过渡序列碱基数目的对比探索，和实施例2相比，区别在于，检测K⁺部分M3链中的缓冲过渡序列碱基数缩短为3个，定为M7链，具体序列如下：

M7链：5’-ATTGCATCAATGTTTATTT/iCy3/TCTACGGGTTAGGGTTAGGG TTAGGGT/Cy5/-3’，见SEQ ID NO.15。

取浓度为100μM的M1链2.5μL、100μM的M2链2.5μL、100μM的M7链 2.5μL溶于242.5μL缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)中，避光搅拌；将混合均匀的溶液置于95摄氏度条件下避光退火5分钟；关闭仪器使其缓慢冷却到室温(1.5小时)，即得所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针(1μM)。

取上述制得的DNA荧光探针250μL，分成10μL每管，然后每管分别加入 100μL含有不同浓度K⁺的缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)，各溶液的最终体积为110μL，K⁺的最终浓度分别为0mM，2mM，6mM，10mM， 20mM，30mM，40mM，50mM，70mM，90mM，120mM，140mM，160mM， 200mM，300mM，避光混匀后，于37摄氏度下孵育一个小时，然后在37摄氏度条件下用荧光分光光度计检测加入不同浓度K⁺的荧光能量转移状态。检测K⁺时激发波长为530nm，从550nm至700nm收集荧光光谱，激发和发射狭缝宽度均为10nm。结果如图4B的下图(标注为对比案例6)。

对比实施例2，对比案例6在K⁺浓度为0时，两个荧光强度的比值F_A/F_D(受体与供体的荧光比值)较高，这可能是因为G四聚体链上修饰的Cy3基团更靠近左边Na⁺检测部分的荧光基团，互相受影响的程度加大，导致荧光强度有一定的变化，同时，比较实施例2，F_A/F_D最大稳定值变低，说明能量共振转移效率较低，这可能是因为G四聚体有效检测部分更靠近与M2链碱基互补配对位置，导致空间构象变化受阻，不足以发生有效的能量共振转移，所以F_A/F_D值较低，可检测范围变窄。

对比案例7(对比实施例3)

和实施例3相比，区别在于，加上一组所使用的DNA荧光探针为对比实施例1制备，未修饰胆固醇，具体操作如下：

选择对数生长的A549细胞，弃去DMEM培养基(10％胎牛血清，1％青霉素、链霉素，89％DMEM培养基)，用PBS缓冲溶液洗涤2～3次，用400μL胰酶将细胞消化下来，加入1mLDMEM培养基制成细胞悬浮液并移至离心管中离心，离心后弃去上层培养基，加入4～6mL新鲜DMEM培养基，用血球计数板计数，如果细胞密度过大可进一步稀释。最后将细胞悬浮液混合均匀，取100μL 细胞悬浮液逐一加入至96孔板中，再将96孔板的四周围上PBS缓冲液，在37摄氏度恒温培养箱培养24h后，选取两孔移除培养基，用PBS缓冲液洗2～3遍，然后用10μg/mL的hoechst33258染色15分钟，15分钟后用PBS缓冲液清洗，一孔加入实施例1制备的DNA荧光探针40μL浸没细胞，一孔加入对比实施例1 制备的DNA荧光探针40μL浸没细胞，并置于4摄氏度条件下避光孵育10分钟，移除两孔培养基，用缓冲液A(50mM Bis-Tris，90mM LiCl，pH 7.0)洗2～3 次，加入100μL含有90mM浓度Na⁺和90mM浓度K⁺的缓冲液(Na⁺和K⁺的浓度选取考虑为较为合适的随机浓度)，在高内涵细胞成像系统中观察成像。结果如图6。

通过对带有胆固醇和不带胆固醇的DNA荧光探针进行荧光成像对比，证明不带胆固醇的DNA荧光探针不能固定于细胞膜上，也证明了胆固醇是一个靶向基团。给细胞核染色是为了给细胞进一步定位，能更加清晰地辨别细胞所处的位置。从图中可以看出，带有胆固醇的荧光探针能清晰定位在细胞膜上，而不带胆固醇的镊子可能在洗掉剩余探针的时候被缓冲液清洗掉，故只能看到被染色的细胞核。这可以说明，DNA荧光探针确实能靶向并锚定于细胞膜上。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种基于适体的Na+、K+同时检测荧光纳米探针及其制备方法和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcggtacca ggtcaaaggt gggtgagggg acgccaagag tccccgcggt tacgtgatcc 60

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatcacgta taggaagtac cgcc 24

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggcggtac caggtcaaag gtgggtgagg ggacgccaag agtccccgcg gttacataga 60

g 61

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctctatgtat aggaagtacc gccgc 25

<210> 5

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacgtccatc tccaggtcaa aggtgggtga ggggacgcca agagtccccg cggttagtga 60

gt 62

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actcactata ggaagagatg gacgtg 26

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tacgggttag ggttagggtt agggt 25

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctacgggtt agggttaggg ttagggt 27

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tctacgggtt agggttaggg ttagggtta 29

<210> 10

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcggcggtac caggtcaaag gtgggtgagg ggacgccaag agtccccgcg gttagataga 60

g 61

<210> 11

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctctatctat aggaagtacc gccgcttttt ttttttaaac attgatgcaa tttttttttt 60

ttttt 65

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attgcatcaa tgtttatttt tttctacggg ttagggttag ggttagggt 49

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

attgcatcaa tgtttatttt ttacgggtta gggttagggt tagggt 46

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctctatctat aggaagtacc gccgcttttt aaacattgat gcaatttttt ttttttttt 59

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

attgcatcaa tgtttatttt ctacgggtta gggttagggt tagggt 46

Claims (9)

1.一种基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针，其特征在于：

包含Na⁺和K⁺两套检测元件，Na⁺检测元件包括修饰有荧光响应基团的特异性识别Na⁺的核酸适体；K⁺检测元件包括修饰有荧光响应基团的特异性识别K⁺的核酸适体；

特异性识别Na⁺的核酸适体包括：能对Na⁺特异性识别的DNA酶链和DNA底物链；底物链包含单个腺苷核糖核苷酸位点rA，酶链在Na⁺的存在下能催化裂解底物链中rA位点；特异性识别K⁺的核酸适体包括：对K⁺特异性识别的G四聚体链；在没有K⁺时，为一条DNA单链，在K⁺存在下，单链与K⁺形成椅型四聚体结构；

DNA底物链的3’端先延长6～12个碱基作为缓冲过渡序列，然后延长能与K⁺检测元件中核酸适体延长序列互补配对的无关序列12～20个碱基；

在G四聚体链的5’端先延长6～12个碱基作为缓冲过渡序列，再延长与底物链延长序列碱基互补配对的无关序列12～20个碱基。

2.根据权利要求1所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针，其特征在于：DNA底物链的3’端先延长6～12个碱基作为缓冲过渡序列，然后延长能与K⁺检测元件中核酸适体延长序列互补配对的无关序列12～20个碱基；最后再延长12～18个碱基作为缓冲过渡序列后连接胆固醇。

3.根据权利要求1所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针，其特征在于：Na⁺和K⁺两套检测元件均以荧光共振能量转移对为信号报告器，包括有荧光供体基团和荧光受体基团；检测Na⁺的和检测K⁺的两部分荧光响应信号互不干扰。

4.根据权利要求1所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针，其特征在于：

对Na⁺特异性识别的DNA酶链和DNA底物链互补同一侧分别修饰荧光供体基团和荧光受体基团，以保证荧光供体基团和荧光受体基团足够靠近产生能量转移，进而实现荧光信号变化；

对K⁺特异性识别的G四聚体链保证在K⁺存在下形成的椅型四聚体能使荧光供体基团和荧光受体基团足够靠近产生能量转移，进而实现荧光信号变化。

5.根据权利要求4所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针，其特征在于：Na⁺特异性识别的DNA酶链的3’端修饰荧光供体基团FAM，Na⁺特异性识别的DNA底物链的5’端修饰荧光受体基团BHQ1；

对K⁺特异性识别的G四聚体链在3’端修饰荧光受体基团Cy5，在中间修饰荧光供体基团Cy3。

6.根据权利要求4所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针，其特征在于：根据G四聚体链有效序列长度确定荧光受体基团和荧光供体基团之间间隔25～29个碱基。

7.权利要求1～6任一项所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤(1)：对Na⁺特异性识别的核酸适体部分修饰：

步骤(1-1)：在对Na⁺特异性识别的DNA酶链的3’端修饰上荧光供体基团，得到M1链；

步骤(1-2)：在对Na⁺特异性识别的DNA底物链的5’端修饰上荧光受体基团，其3’端依次延长缓冲序列1、与对K⁺特异性识别的G四聚体链的延长序列互补配对的无关序列1、缓冲序列2，然后在3’端尾端修饰上胆固醇，得到M2链；

步骤(2)：对K⁺特异性识别的核酸适体部分修饰：

步骤(2-1)：在对K⁺特异性识别的G四聚体链的3’端修饰荧光受体基团；

步骤(2-2)：在对K⁺特异性识别的G四聚体链的中间修饰荧光供体基团；

步骤(2-3)：在对K⁺特异性识别的G四聚体链的5’端延长缓冲序列3和与Na⁺检测元件中底物链延长的无关序列1碱基互补配对的无关序列2，最终得到M3链；

步骤(3)：各条链组装：

取一定比例的M1链、M2链、M3链溶于缓冲液中，避光搅拌；将混合均匀的溶液置于高温条件下避光退火一定时间；缓慢冷却，即得所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针；

如果无需对基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针进行细胞锚定，则无需在对Na⁺特异性识别的DNA底物链的3’端延长缓冲序列2，进而无需在3’端尾端修饰上胆固醇。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，

所述的检测Na⁺的酶链和底物链的浓度配比为1:0.8～1:1.5；

所述的检测Na⁺的底物链和检测K⁺的G四聚体链的浓度配比为1:0.7～1:1.3；

退火过程中的温度为90～100摄氏度；时间为5～10分钟；

缓冲液为不含Na⁺、K⁺，但含Li⁺的Bis-Tris水溶液；

缓冲液的pH为5～8；

缓冲液中Li⁺的浓度70～120mM；

缓冲液中Bis-Tris的浓度为40～70mM。

9.如权利要求1～6任一项所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针，或权利要求7所述的制备方法制得的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针用于同时检测Na⁺、K⁺；

将所述的基于适体的Na⁺、K⁺同时检测荧光纳米探针用缓冲液稀释得到分散液，用于检测溶液体系中不同浓度的Na⁺或K⁺，根据荧光信号变化，得到Na⁺或K⁺的浓度指示；

或者修饰了胆固醇的探针与细胞孵育一定时间，洗去未结合的探针，得到负载有检测探针的细胞，根据细胞成像系统成像荧光变化，得到细胞微环境中Na⁺或K⁺的浓度变化指示。

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