CN111380932A - 一种比率型离子选择性微电极阵列及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种比率型离子选择性微电极阵列及其制备方法，将K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体分别修饰在钨丝微电极上，并将其整合制备得到所述比率型离子选择性微电极阵列。本发明还公开了所述比率型离子选择性微电极阵列在体内和体外同时检测K⁺、Ca²⁺、Na⁺及pH的应用。本发明的比率型离子选择性微电极阵列具有时空分辨率、高选择性及长期稳定性的优点；用于同时测定体内的K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH及场电位，可实现同时、原位、实时的在体电化学及电生理信号采集、自由移动在体电化学分析、鼠脑电化学成像及离子通道药物作用机制解析。本发明比率型离子选择性微电极阵列，对于进一步阐明K⁺、Ca²⁺、Na⁺及pH在生理病理中的作用，以及离子通道药物筛选、机理研究方面具有重要意义。

Description

一种比率型离子选择性微电极阵列及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析技术领域，具体涉及一种比率型离子选择性微电极阵列及其制备方法和应用。

背景技术

在生物体中，各种离子参与多种生理过程，特别是在大脑中，离子在动作电位产生、神经递质释放和传递等方面发挥重要的作用。各种离子通过离子通道相互调节以维持正常脑功能，然而，当神经元过度兴奋、抑制或能量衰竭时，离子浓度发生显著变化，进而引发多种脑疾病，如扩散性抑制、中风、癫痫等。癫痫是一种常见的神经系统疾病，伴有特征的猝发性放电。研究表明癫痫活动影响语言组织能力，更糟糕的是，癫痫患者过早死亡的风险增加，然而具体机制尚不清楚。电生理技术通常被用于研究大脑功能。Erwin Neher和BertSakmann在20世纪70年代末和80年代初发展了膜片钳技术，这使得记录单个离子通道电流成为可能，从而提高了人们对离子通道参与细胞基础过程，如动作电位和神经活动等的理解。Neher和Sakmann在1991年被授予诺贝尔生理学或医学奖。然而膜片钳技术只能用于研究离体细胞或组织切片，为了记录动物在正常活动过程中神经元的放电活动，科学家采用在体电生理技术解析神经元编码机制。John O'Keefe在海马体内发现了一种锥体神经元，当动物进入环境中的特定位置时便会变得活跃起来，就像GPS定位系统一样，它被称为位置细胞，John O'Keefe也因此获得了2014年诺贝尔生理学或医学奖。虽然电生理技术为解析大脑功能做出了突出贡献，然而，电生理技术只能记录神经元与神经元间的电信号传递，而电信号的产生依赖于神经递质的释放和离子的变化。因此，要充分了解大脑的生理和病理过程，必须获取大脑活动过程中化学物质的变化。电化学方法因其高时空分辨率，可实现原位、实时、快速检测的优点，备受关注。然而现有技术中，迄今为止尚无有效的电化学方法，可实现同时且准确地对各种离子，如K⁺、Ca²⁺、Na⁺、H⁺进行检测。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种比率型离子选择性微电极阵列用于同时检测K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH的方法，所述K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体可有效结合在性能优异的钨丝微电极上，制备得到高选择性、高抗蛋白吸附能力的可用于同时检测K⁺、Ca²⁺、Na⁺及pH的比率型离子选择性微电极阵列。本发明结合微电极技术，可同时实现自由移动生物活体内比率型K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH的电化学分析及电化学生物成像分析。

本发明提出了一种比率型离子选择性微电极阵列，此比率型离子选择性微电极阵列为膜电极微阵列，是利用膜电势的变化同时测定溶液中K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH浓度的电化学传感器。该比率型离子选择性微电极阵列由包含有K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体的离子选择性膜和微电极组装而成，具有选择型高、响应速度快、韧性好、易于组装的特点，结合内参比电极通道，可实现K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH的同时准确定量分析。

其中，所述K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体分别如以下式(I-IV)所示：

其中，所述微电极指钨丝微电极。

其中，所述比率型离子选择性微电极阵列为可用于K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH同时检测的离子选择性微电极阵列。

本发明还提出了一种双模态微电极阵列，其包含所述的比率型离子选择性微电极阵列。

本发明还提出了一种8通道比率型离子选择性微电极阵列，所述8通道比率型离子选择性微电极阵列的8通道中，7个通道为离子选择性通道，即一个通道含有一个K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH离子选择性微电极，7个通道为相同的K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH离子选择性微电极通道；另一通道为内参比电极通道。

本发明还提供了一种比率型离子选择性微电极阵列的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：在溶剂中，在10-25℃条件下，将K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体分别与聚氯乙烯(PVC)、塑化剂、阴离子交换剂按比例混合，配置形成不同的K⁺、Ca²⁺、Na⁺及pH离子选择性母液，然后将该离子选择性母液分别涂覆在钨丝微电极上，制备得到分别有K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH离子选择性膜修饰的微电极；

步骤二：将分别有K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH离子选择性膜修饰的微电极、内参比电极整合为微电极阵列，制备得到所述比率型离子选择性微电极阵列。

具体地，本发明通过将本发明中分别有K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH离子选择性膜修饰的微电极、内参比电极在显微镜下通过快干胶小心的粘合在一起，制备得到所述比率型离子选择性微电极阵列。

进一步地，将前述制备得到的比率型离子选择性微电极阵列与电生理测定电极结合，制备得到双模态微电极阵列。

进一步地，将所述步骤一制备得到的K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH离子选择性膜修饰的微电极与内参比电极整合为8通道比率型离子选择性微电极阵列。

其中，所述8通道中的7个通道为离子选择性通道，即一个通道含有一个K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH离子选择性微电极，7个通道为相同的K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH离子选择性微电极通道；另一通道为内参比电极通道，将8支微电极在显微镜下小心整合构成8通道比率型离子选择性微电极阵列。

具体地，所述7个通道具体指7支K⁺或Ca²⁺、Na⁺、pH离子选择性膜修饰的微电极构成的7个通道。

本发明所述“比率型离子选择性微电极阵列”可用于K⁺、Ca²⁺、Na⁺及pH的检测，所述“8通道比率型离子选择性微电极阵列”可用于K⁺或Ca²⁺、Na⁺、pH成像的检测。

本发明中，所述内参比电极的制备方法如下：将聚氯乙烯(PVC)、塑化剂、阴离子交换剂按比例混合配置形成内参比电极的参比母液，然后将参比母液修饰在钨丝微电极上，得到内参比电极。

本发明中，所述钨丝微电极的直径为10～25μm，优选地，由直径15μm钨丝制成。

本发明中，所述K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体如式(I-IV)所示：

本发明中，所述配置得到的离子选择性母液中包含K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体、PVC、塑化剂、阴离子交换剂。

其中，所述塑化剂选自邻苯二甲酸、癸二酸二丁酯、邻硝基苯辛醚、二辛酯、二壬酯等中的任意一种或多种；优选地，K⁺、Ca²⁺、Na⁺离子选择性母液中塑化剂为邻硝基苯辛醚，pH离子选择性母液中塑化剂为癸二酸二丁酯。

其中，所述阴离子交换剂选自四(4-氯苯基)硼酸钾、四苯硼钠、四苯硼钾、四正丁基四苯基硼酸铵等中的任意一种或多种；优选地，为四(4-氯苯基)硼酸钾。

本发明中，所述Na⁺识别配体或K⁺识别配体或Ca²⁺识别配体、PVC、塑化剂、阴离子交换剂的质量比为(0.5-2):(50-80):(120-150):(0.5-2)；优选地，为1:66:132:1。

本发明中，所述pH识别配体、PVC、塑化剂、阴离子交换剂的质量比为(0.5-3):(40-60):(80-120):(0.5-2)；优选地，为2:50:100:1。

本发明中，所述内参比电极的参比母液中，PVC、塑化剂、阴离子交换剂的质量比为(40-60):(80-120):(0.5-2)；优选地，为50:100:1。

本发明中，所述溶剂选自环己酮、二氯乙烷、四氢呋喃、丙酮、水等中的任意一种或多种；优选地，为四氢呋喃。

本发明中，所述修饰的时间为10分钟-2小时；优选地，为30分钟-1小时；进一步优选地，所述时间为30分钟。

本发明中，优选地，所述钨丝微电极在修饰前，需先进行清洗，将钨丝依次浸泡在丙酮，3M硝酸，10M氢氧化钾和超纯水中分别超声5分钟，进行清洗后使用。

本发明中，所述电生理测定微电极选自铱、铂铱合金、铂金铱合金、镍铬合金、钨微电极等中的任意一种或多种；优选地，为镍铬合金微电极。

其中，所述电生理测定微电极的直径为10～25μm；优选地，为13μm。

本发明还提出了由所述方法制备得到的比率型离子选择性微电极阵列。

本发明还提出了由所述方法制备得到的8通道比率型离子选择性微电极阵列。

本发明还提出了由所述方法制备得到的双模态微电极阵列。

本发明还提供了所述比率型离子选择性微电极阵列在体外测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH或同时测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH中的应用。

本发明还提供了所述双模态微电极阵列在制备测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH，或同时测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH及场电位的产品中的应用。

本发明还提供了所述8通道比率型离子选择性微电极阵列在制备实现K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH电化学成像的产品中的应用。

本发明还提供了所述双模态微电极阵列在制备在离子通道药物机理研究的产品中的应用。

本发明的有益效果包括，本发明以K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体、钨丝微电极，制备得到一种新的比率型离子选择性微电极阵列。其中，K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体分别与聚氯乙烯(PVC)等混合形成的离子选择性母液可有效地结合在钨丝微电极上，结合内参比电极，制备得到所述比率型离子选择性微电极阵列；将比率型离子选择性微电极阵列与电生理测定电极结合，制备得到双模态微电极阵列；将7支K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH离子选择性膜修饰的微电极与内参比电极整合，制备得到8通道比率型离子选择性微电极阵列。本发明方法制备得到的比率型离子选择性微电极阵列可同时检测K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH，制备方法具有简单、成本低、绿色可靠的优点，制备的比率型离子选择性微电极阵列具有高选择性(如附图2所示)、高时空分辨率和长期稳定性的优点。本发明的比率型离子选择性微电极阵列用于测定生物活体内K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH时，可实现同时、原位、实时的在体电化学检测；可实现在自由移动生物活体内测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH及场电位；可实现K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH电化学成像；可实现离子通道药物作用机理的研究。本发明通过制备高选择性、高时空分辨率的比率型离子选择性微电极阵列，对于进一步阐明各种离子在生理及病理中的作用具有非常重要的意义；为解析K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH在生理病理活动中的作用提供可靠的方法，为解析相关疾病的致病机理提供高效、可行的分析方法；为离子通道相关药物的粗筛选、药物代谢动力学研究提供简单、可行的方法。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的比率型离子选择性微电极阵列在Tris缓冲盐溶液中的电位-时间响应曲线：a为K⁺离子选择性微电极的电位-时间响应曲线，b为Na⁺离子选择性微电极的电位-时间响应曲线，c为Ca²⁺离子选择性微电极的电位-时间响应曲线，d为pH离子选择性微电极的电位-时间响应曲线。

图2为本发明实施例1制备的比率型离子选择性微电极阵列对K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH检测的选择性实验，其中，a为金属离子干扰、b为氨基酸干扰、c为神经递质干扰，d为活性氧干扰。

图3为本发明实例3制备的双模态微电极阵列在大鼠颈动脉缺血试验中K⁺(图3a)、Na⁺(图3b)、Ca²⁺(图3c)、pH(图3d)和场电位(图3e)变化的检测。

图4为本发明实例2制备的8通道比率型离子选择性微电极阵列在大鼠颈动脉缺血试验中K⁺(图4a)、Na⁺(图4b)、Ca²⁺(图4c)、pH(图4d)电化学成像。

图5为本发明实例3制备的双模态微电极阵列在自由移动大鼠癫痫试验中K⁺(图5a)、Na⁺(图5b)、Ca²⁺(图5c)、pH(图5d)及场电位(图5e)变化的检测。

图6为本发明实例2制备的8通道比率型离子选择性微电极阵列在自由移动大鼠癫痫试验中K⁺(图6a)、Na⁺(图6b)、Ca²⁺(图6c)、pH(图6d)电化学成像。

图7为本发明实例3制备的双模态微电极阵列在自由移动大鼠癫痫治疗试验中K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH变化的检测及抗癫痫作用机理研究，其中，a为施用抗癫痫药物瑞替加滨后，K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH及LFP信号的变化；b为施用抗癫痫药物唑尼沙胺后，K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH及LFP信号的变化；c为电刺激方法治疗癫痫时K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH及LFP信号的变化。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明做进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1制备比率型离子选择性微电极阵列

比率型离子选择性微电极阵列制备过程如下：采用PVC板用于支撑和固定离子选择性电极，根据所需在PVC板上钻孔，并将连接器连接到PVC板的侧面；在显微镜下将K⁺、Ca^{2 +}、Na⁺、pH离子选择性膜修饰的微电极和内参比电极小心地穿入PVC板上的孔，将电极的尖端调节到相同的高度，用快干胶固定；电极的自由端分别缠绕在连接器蝇角上，并用银漆增强其导电性能，制备得到比率型离子选择性微电极阵列。

实施例2制备8通道比率型离子选择性微电极阵列

8通道比率型离子选择性微电极阵列制备过程如下：采用PVC板用于支撑和固定离子选择性电极，根据所需在PVC板上钻孔，并将连接器连接到PVC板的侧面；在显微镜下将7根K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH离子选择性膜修饰的微电极和内参比电极小心地穿入PVC板上的孔，将电极的尖端调节到相同的高度，用快干胶固定；电极的自由端分别缠绕在连接器蝇角上，并用银漆增强其导电性能，制备得到8通道比率型离子选择性微电极阵列。

实施例3制备双模态微电极阵列

双模态微电极阵列制备过程如下：采用PVC板用于支撑和固定离子选择性电极，根据所需在PVC板上钻孔，并将连接器连接到PVC板的侧面；在显微镜下将K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH离子选择性膜修饰的微电极、内参比电极和电生理测定电极小心地穿入PVC板上的孔，将电极的尖端调节到相同的高度，用快干胶固定；电极的自由端分别缠绕在连接器蝇角上，并用银漆增强其导电性能，制备得到双模态微电极阵列。

实施例4

利用DropsensμSTAT 8000电化学工作站对本发明实施例1制备的比率型离子选择性微电极阵列的K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH的响应性能进行检测。在0.1M Tris缓冲溶液中加入KCl，NaCl，CaCl₂，HCl溶液，同时记录五通道离子选择性微电极阵列的电位-时间曲线。如图1所示，各离子选择性微电极电位(E_X ⁿ⁺)随K⁺、Ca²⁺、Na⁺、H⁺浓度的升高而逐步增加，而内参比电极(E_re)的电位几乎保持恒定，构成比率型同时测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH离子选择性微电极阵列。E_X ^{n +}和E_re之间的电位差ΔE_X ⁿ⁺(ΔE_X ⁿ⁺＝E_X ⁿ⁺-E_re)在K⁺浓度为50μM-140mM，Na⁺浓度为0.13-200mM，Ca²⁺浓度为5μM-160mM，pH为4.5-9.0范围内展现良好线性，斜率分别为53mV/lg K⁺，57mV/lg Na⁺，26mV/lg Ca²⁺和57mV/pH，接近于能斯特方程理论计算值，检测限K⁺为5μM，Na⁺为10μM，Ca²⁺为1μM，pH为0.05，可满足生物体内K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH变化测定的要求。证明本发明实施例1制备的比率型离子选择性微电极阵列可用于K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH的有效检测。

实施例5

为了评估本发明实例1制备的比率型离子选择性微电极阵列的选择性和抗干扰能力，分别考察常见金属离子，氨基酸，活性氧，神经递质存在时，记录比率型离子选择性微电极阵列电化学信号的变化。由图2可知，相比于前后加入2.5mM，25mM KCl溶液(图2a，曲线i)，2.5mM，25mM NaCl溶液(图2a，曲线ii)，0.5mM，5mM CaCl₂溶液(图2a，曲线iii)，pH前后均改变0.5(图2a，曲线iv)，在加入潜在干扰物如其他金属离子(图2a)、氨基酸(图2b)、神经递质(图2c)和活性氧(图2d)时，ΔE_X ⁿ⁺基本保持恒定，表明潜在干扰物对K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH检测基本无干扰。选择性和抗干扰实验说明本发明实施例1制备的比率型离子选择性微电极阵列具有很好的选择性和抗干扰能力。

实施例6大鼠颈动脉缺血试验中K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH及场电位变化的检测

活体鼠的实时检测：

动物模型的草案是由华东师范大学的公共动物护理和使用委员会批准通过的。实验所用Wistar大鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司。

a.活体实验前的准备工作

麻醉老鼠：将老鼠称重，10％水合氯醛，根据每100g老鼠注射0.3ml的麻药，麻醉老鼠。在整个实验过程中，根据老鼠的需要适时补充麻醉药，每次补加0.3ml。

手术器械消毒：配制75％乙醇，将手术器械浸泡在乙醇中消毒待用。

b.颈动脉缺血

颈动脉缺血的手术方法是根据之前的文献报道的方法进行的，即进行双侧颈动脉暴露和周围的缔结组织分离。准备缺血时，利用中型止血夹的重力拉着手术线，阻止大动脉中的血流，造成缺血。

c.活体开颅手术

把老鼠固定在大鼠脑立体定位仪上，底下放上恒温加热垫，控制其体温在37℃。然后，利用圆头手术刀在脑部正中位置竖直划出长度约为1cm的创口，用止血钳固定好创口，用生理盐水轻轻擦洗，清理干净，露出颅骨。最后参照脑图谱说明，利用立体定位仪确定海马体(AP＝4mm，L＝3mm，V＝2.9mm)，皮层(AP＝0.2mm，L＝5.6mm，V＝1.8mm)以及纹状体(AP＝2.5mm，L＝2.5mm，V＝7.0mm)的位置。用记号笔把该处位置标出来，利用颅骨钻进行开颅手术。孔径约为5mm，用于放置工作电极。在距工作电极2cm处开一个孔径为2mm的小孔，用于放置参比电极和本发明实施例3制备的双模态微电极阵列。

d.再灌：松开手术线即可再灌。

实验结果如图3所示，本发明实施3制备的双模态微电极阵列在活体鼠内对K⁺、Ca^{2 +}、Na⁺和pH检测非常灵敏。图3a-d分别表示缺血及再灌注过程中鼠脑中K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH离子选择性电极的电位-时间曲线，由图3可知，随着缺血的进行，K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH离子选择性电极的电位随之变化，而参比电极电位保持稳定。从图3a可以看出，钾离子初始浓度约为2.75±0.26mM，缺血一旦开始，脑外液中K⁺浓度便开始缓慢升高，大约2分钟后，K⁺浓度迅速升高至最大值31.14±3.05mM，缺血过程中K⁺变化速率约为9.2±0.4mV/min(4.86±0.51mM)；Na⁺初始浓度约为148.13±3.74mM，在缺血开始的1-2分钟内，Na⁺浓度保持不变，随后以4.4±0.4mV/min(16.32±2.2mM/min)速率急剧下降至71.93±6.65mM；Ca²⁺变化与Na⁺变化相似，在缺血最初的1-2分钟内维持在1.23±0.08mM，随后以5.6±0.4mV/min(0.22±0.03mM/min)速率快速下降至0.11±0.02mM；pH在缺血开始后便持续下降，大约7分钟后下降至最低值6.65±0.05。再灌注过程中，K⁺与Na⁺在5分钟内恢复至初始浓度，而Ca²⁺与pH的恢复需要更长时间，这有可能是由于Ca²⁺更加微妙的调节系统及在充足氧气供应条件下，相对较慢的乳酸去除速率所致。由图3e可知随着缺血的延长，场电位放电变弱，表明在缺血期间，神经元的放电活动大大减少。

实施例7大鼠颈动脉缺血试验中K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH电化学成像

将K⁺(或Ca²⁺、Na⁺、pH)离子选择性微电极与参比电极整合为8通道K⁺(或Ca²⁺、Na⁺、pH)离子选择性微电极阵列，用于大鼠颈动脉缺血试验中K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH电化学成像。基于SPLINE和SPLINT功能，使用内部书面计算机程序进行计算，使用插值法来平滑体内实验的测量结果。图4为缺血再灌注过程中不同时间点时，鼠脑海马区K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH电化学成像结果。在静息状态下，大鼠脑中K⁺的浓度约为2.75±0.26mM(5min，图4a)。缺血开始后，电位强度由0.141V缓慢增加至0.151V，K⁺的浓度升高至约5.52±1.0mM(8min，图4a)，2分钟后，电位强度从0.151V急剧上升至0.196V，相应的K⁺浓度增加至31.14±3.05mM(18min，图4a)，该过程中K⁺的平均变化率为约9.2±0.4mV/min(4.86±0.51mM)；再灌注过程中，电位强度急剧下降至初始水平(30min，图4a)。Na⁺的初始浓度约为148.13±3.74mM，并且在缺血开始1-2min内基本保持恒定(5min，图4b)；随后电位强度由0.225V急剧下降至0.207V(18min，图4b)，相应的Na⁺浓度由基础水平迅速下降至71.93±6.65mM，之后趋于稳定，该过程中Na⁺的平均变化率为4.4±0.4mV/min(16.32±2.2mM/min)；再灌注过程中，Na⁺浓度迅速上升并在5分钟内恢复至基础水平(30min，图4b)。与Na⁺变化相似，在缺血的前1-2min(5min，图4c)，Ca²⁺浓度维持在1.23±0.08mM，随后电位强度由0.141V迅速下降到0.115V(18min，图4c)，相应的Ca²⁺浓度迅速下降至0.11±0.02mM，此过程中Ca²⁺的平均变化率为5.6±0.4mV/min(0.22±0.03mM/min)。鼠脑平均pH值为7.25±0.04(5min，图4d)，缺血开始后，随着电位强度的升高，pH值逐渐下降至6.65±0.05(18min，图4d)，变化率为5.8±0.5mV/min(0.10±0.02pH/min)。

实施例8自由移动大鼠癫痫试验中K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH及场电位变化的检测

自由移动活体鼠的实时检测：

动物模型的草案是由华东师范大学的公共动物护理和使用委员会批准通过的。雄实验所用Wistar大鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司。

a.活体实验前的准备工作：

麻醉老鼠：将老鼠称重，10％水合氯醛，根据每100g老鼠注射0.3ml的麻药，麻醉老鼠。在整个实验过程中，根据老鼠的需要适时补充麻醉药。

手术器械消毒：配制75％乙醇，将手术器械浸泡在乙醇中消毒待用。

b.活体开颅手术：将小鼠固定在小鼠脑立体定位仪上，底下放上恒温加热垫，控制其体温在37℃。用圆头手术刀片剪开脑壳上的皮层，用止血钳固定好创口，用生理盐水轻轻擦洗，清理干净，露出颅骨。根据小鼠的脑图谱说明，利用立体定位仪确定海马体(AP＝4mm，L＝3mm，V＝2.9mm)，皮层(AP＝0.2mm，L＝5.6mm，V＝1.8mm)以及纹状体(AP＝2.5mm，L＝2.5mm，V＝7.0mm)的位置，用记号笔把该处位置标出来；另外在远离放置工作电极的位置再标记一点，用于放置参比电极；在放置电极的四周标记四个点形成矩形阵列作为螺丝及牙科水泥的固定位点。利用颅骨钻进行开颅手术，将本发明实施例3制备的双模态微电极阵列及参比电极小心植入脑内并用牙科水泥固定，最终将携有电极的大鼠单独圈养在较深的笼中，并让其恢复至少24小时。

c.癫痫引发：新鲜配置10mg/mL的戊四氮生理盐水溶液，将老鼠称重，按20-35mg/kg的量每隔40-60分钟腹部注射戊四氮生理盐水溶液诱发癫痫产生。

实验结果如图5所示，本发明实施例3制备的双模态微电极阵列在自由移动活体鼠内对K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH检测非常灵敏。图5a-d分别表示癫痫过程中鼠脑中K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH离子选择性电极的电位-时间曲线，由图5可知，癫痫发生时，K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH离子选择性电极的电位随之变化，而参比电极电位保持稳定。从图5a可以看出，随着癫痫的发生K⁺浓度由2.92±0.33mM迅速升高至9.77±1.04mM，并在癫痫结束时恢复至初始水平；Ca²⁺变化滞后K⁺变化2-3秒，Ca²⁺基础水平为1.22±0.09mM，在癫痫中期Ca²⁺浓度降低至最小值0.29±0.10mM，并在癫痫结束时恢复；与K⁺、Ca²⁺变化不同的是，pH值随着癫痫发生逐渐下降，并且在癫痫结束时降低至最小值7.15±0.03，随后逐渐恢复至初始值7.24±0.04；而在此过程中Na⁺浓度基本保持不变。癫痫发生时，大量神经元同步放电，导致场电位放电急剧增加(图5e)，癫痫结束后出现后抑制场电位放电，被认为是导致癫痫发作终止的因素之一。

实施例9自由移动大鼠癫痫试验中K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH电化学成像

将本发明实施例2制备的8通道K⁺(或Ca²⁺、Na⁺、pH)离子选择性微电极阵列，用于自由移动大鼠癫痫试验中K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH电化学成像。基于SPLINE和SPLINT功能，使用内部书面计算机程序进行计算，使用插值法来平滑体内实验的测量结果。图6为癫痫过程中不同时间点时，鼠脑海马区K⁺、Ca²⁺、Na⁺和pH电化学成像结果。在静息状态下，大鼠脑中K⁺的浓度约为2.92±0.33mM(5min，图6a)，随着癫痫的发作，电位强度由0.144V逐渐增加到0.168V，相应的K⁺的浓度升高至9.77±1.04mM(70s，图6a)，随着癫痫的停止，电位强度恢复至初始水平(120s，图6a)。Ca²⁺变化滞后K⁺变化2-3s，随着癫痫状态的产生与发展，电位强度由0.143V迅速下降到0.124V，相应Ca²⁺浓度从1.22±0.09mM急剧下降至其最小值0.29±0.10mM，变化速率约为0.05mM/s(70s，图6c)，癫痫终止时，Ca²⁺浓度恢复至基线水平(120s，图6c)。随着癫痫的发作，pH值开始逐渐下降，电位强度从0.224V逐渐上升到0.231V，相应的pH值由7.24±0.04缓慢变化至7.15±0.03(70s，图6d)，癫痫结束后，pH逐渐恢复至初始状态(120s，图6d)。与此同时，癫痫过程中Na⁺浓度基本保持不变(图6b)。

实施例10双模态微电极阵列在自由移动大鼠癫痫治疗试验中K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH变化的检测及抗癫痫作用机理研究

抗癫痫药物瑞替加滨和唑尼沙胺用于缓解大鼠癫痫症状，两种药物均以2mg/kg的剂量腹腔注射；50Hz交流电刺激被用于治疗癫痫。

实验结果如图7所示，本发明实施例3制备的双模态微电极阵列在自由移动大鼠癫痫治疗试验中对K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH检测非常灵敏。瑞替加滨作为钾离子通道开放剂，被用于缓解大鼠癫痫症状。由图7a可知，当大鼠癫痫发作时，相比未注射瑞替加滨的对照组而言，K⁺提前变化2-3秒，且K⁺流出速率明显加快(0.41mM/s＞0.36mM/s)(图7a，曲线i)，这是因为瑞替加滨通过靶向K_v7.2钾通道激活M-电流，而M-电流在低于动作电位产生的阈值电位下连续激活，因此影响许多脑区中神经元的静息膜电位及兴奋性，K_v7.2的激活诱导大量K⁺由细胞进入脑外液，使神经元处于超极化状态，从而减少动作电位的产生并将癫痫的持续时间缩短约13秒；K⁺浓度的变化诱导膜电位的改变，进而导致Ca²⁺浓度的降低，由于瑞替加滨的抗癫痫作用，与未使用药物相比，Ca²⁺的变化量缩减为初始值的66％(图7a，曲线ii)；pH值偏移也有所降低(图7a，曲线iv)；药物治疗期间场电位信号的变化仅能提示癫痫持续时间缩短，而不能提供其他信息(图7a，曲线vii)。膜片钳技术通常被用于离子通道研究，然而膜片钳设备复杂，需要将其放置在法拉第笼内，且膜片钳的使用是一个费时费力的过程，需要专业人员操作；膜片钳常被用于研究离体细胞、切片，这可能会改变细胞的功能特性，虽然膜片钳也可以用于在体皮层的研究，然而在体深部脑区的研究是不可行的；此外，研究不同的离子通道时需要钳制不同的电位，并且不可避免地要使用离子通道拮抗剂。由此可见，本发明的双模态微电极阵列生物传感器为离子通道研究提供了一种简单易行的方法，为抗癫痫药物和方法的开发和机理研究开辟了一条普适途径。另一种抗癫痫药物，钠离子通道和T型钙离子通道阻断剂—唑尼沙胺也被用于缓解癫痫症状。在注射唑尼沙胺后，Ca²⁺初始浓度变化与未施用药物相比有细微区别(图7b，曲线ii)，T型电压门控钙通道具有快激活、快失活特征，它们能够使神经元更快、更频繁地去极化，因此在决定神经元兴奋性中起着重要作用。在施加药物后，T型钙离子通道的改变引起了Ca²⁺初始的微小变化和癫痫发作，其他钙离子通道随后开放，导致Ca²⁺大量流如细胞内；与此同时，大量K⁺流出细胞(图7b，曲线i)，使细胞进一步去极化。由于唑尼沙胺的抗癫痫效果，K⁺和Ca²⁺的变化量分别减少了约22％和35％。由于钠离子通道和T型钙离子通道的失活，场电位急促放电时长缩短了约9秒。这再一次证明，本发明的双模态微电极阵列生物传感器为离子通道药物机理研究及粗筛选提供了一个简便可靠的方法。

深部脑区高频电刺激常被用于治疗难治性癫痫，在此，50Hz交流电刺激被用于癫痫治疗。由图7c可知，电刺激时K⁺浓度从2.77±0.34mM迅速上升至4.2±0.74mM，表明大量K⁺从细胞流出进入脑外液，Ca²⁺流入细胞内，致使Ca²⁺浓度从1.28±0.22mM迅速下降至0.73±0.19mM(图7c，曲线ii)；刺激终止后是K⁺和Ca²⁺浓度恢复至初始水平。与此同时，场电位放电处于正常状态(图7c，曲线v)。在电刺激期间，脑外液中K⁺浓度的增加和Ca²⁺浓度的降低使神经元去极化，进而反过来使Na⁺通道灭活，抑制动作电位的进一步发生，从而消除癫痫样放电。通过本发明实施例3制备的双模态微电极阵列用于电刺激治疗癫痫机制的研究，与技术上具有挑战性和低筛选吞吐量的膜片钳技术相比，本发明为解析离子通道相关疾病机制，药物筛选和药代动力学研究提供了简单，直接和全面的信息。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (16)

1.一种比率型离子选择性微电极阵列，其特征在于，所述比率型离子选择性微电极阵列包含K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体和微电极；

其中，所述微电极为钨丝微电极；所述K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体分别如以下式(I-IV)所示：

2.一种双模态微电极阵列，其特征在于，其包含如权利要求1所述的比率型离子选择性微电极阵列。

3.如权利要求1所述的比率型离子选择性微电极阵列，其特征在于，其为一种8通道比率型离子选择性微电极阵列。

4.一种比率型离子选择性微电极阵列的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)在溶剂中，在10-25℃条件下，将K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体分别与聚氯乙烯PVC、塑化剂、阴离子交换剂按比例混合，配置形成不同的K⁺、Ca²⁺、Na⁺及pH离子选择性母液，然后将离子选择性母液分别修饰在钨丝微电极上，得到分别有K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH离子选择性膜修饰的微电极；

(2)然后，将所述分别有K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH离子选择性膜修饰的微电极、内参比电极整合为微电极阵列，制备得到所述比率型离子选择性微电极阵列。

5.一种双模态微电极阵列的制备方法，其特征在于，按权利要求4所述方法制备得到所述比率型离子选择性微电极阵列，进一步地，将所述比率型离子选择性微电极阵列与电生理测定电极结合，制备得到所述双模态微电极阵列。

6.一种如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所述有K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH离子选择性膜修饰的微电极与内参比电极整合为8通道比率型离子选择性微电极阵列，其中，所述8通道中的7个通道为含有K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH离子选择性膜修饰的微电极，另一通道为内参比电极通道。

7.如权利要求4-6之任一项所述的方法，其特征在于，所述K⁺识别配体、Ca²⁺识别配体、Na⁺识别配体、pH识别配体如以下式(I-IV)所示：

8.如权利要求4-6之任一项所述的方法，其特征在于，所述溶剂选自环己酮、二氯乙烷、四氢呋喃、丙酮、水中的任意一种或多种；和/或，所述塑化剂选自邻苯二甲酸、癸二酸二丁酯、邻硝基苯辛醚、二辛酯、二壬酯中的任意一种或多种；所述阴离子交换剂选自四(4-氯苯基)硼酸钾、四苯硼钠、四苯硼钾、四正丁基四苯基硼酸铵中的任意一种或多种。

9.如权利要求4-6之任一项所述的方法，其特征在于，所述Na⁺识别配体或K⁺识别配体或Ca²⁺识别配体、PVC、塑化剂、阴离子交换剂的质量比为(0.5-2):(50-80):(120-150):(0.5-2)；和/或，所述pH识别配体、PVC、塑化剂、阴离子交换剂的质量比为(0.5-3):(40-60):(80-120):(0.5-2)；和/或，所述修饰的时间为10分钟-2小时。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电生理测定电极选自铱、铂铱合金、铂金铱合金、镍铬合金、钨微电极中的任意一种或多种，其直径为10～25μm。

11.如权利要求4所述方法制备得到的比率型离子选择性微电极阵列。

12.如权利要求5所述方法制备得到的双模态微电极阵列。

13.如权利要求6所述方法制备得到的8通道比率型离子选择性微电极阵列。

14.如权利要求1所述的比率型微电极阵列在体外测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH或同时测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH中的应用。

15.如权利要求2所述的双模态微电极阵列在制备测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH，或同时测定K⁺、Ca²⁺、Na⁺、pH和场电位，或在离子通道药物机理研究的产品中的应用。

16.如权利要求3所述的8通道比率型离子选择性微电极阵列在制备实现K⁺、Ca²⁺、Na⁺或pH电化学成像的产品中的应用。

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