CN111455045B

CN111455045B - 系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台和应用

Info

Publication number: CN111455045B
Application number: CN202010557149.5A
Authority: CN
Inventors: 陆前进; 赵明; 张博; 刘立民; 吴海竞
Original assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Shenzhen Sciarray Biotech Co ltd
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2040-06-18
Also published as: CN111455045A

Abstract

本发明涉及系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台和应用，特别是涉及一种基于高分辨率熔解曲线（HRM）法的系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台，所述试剂包括SEQ ID No.2上游引物5'‑GAAATGAAAGTAAGGAAGTTAGGAG‑3'和SEQ ID No.3下游引物5'‑AAATCCAATACTATCACTCCATTCC‑3'。本发明通过采用特定的引物，配合高分辨率熔解曲线（HRM）法检测平台，使得检测过程更加简便，易于临床推广应用。

Description

系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台，特别是涉及一种基于高分辨率熔解曲线（HRM）法的系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台。

背景技术

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。临床表现为肾脏、神经精神系统、血液系统等多器官受损。如果能够在SLE患者出现重要器官受累前进行早期诊断对于SLE的防治、改善患者的生活质量、提高患者生存率具有重大意义。然而，目前的生物学诊断标志物大多是在器官受损后出现的生化和免疫学改变，无法对SLE患者器官受累进行早期诊断。

近年来，表观遗传学标记物研究发展迅速，许多表观遗传标志物如DNA甲基化标记物、血清microRNA标记物被筛选和鉴定，这些标记物对于疾病的早期诊断和预后判断具有重要价值。己有大量文献证实DNA低甲基化在SLE患者CD4+T细胞异常活化及SLE发生发展中发挥重要的作用。目前，已经鉴定的在SLE患者CD4+T细胞中发生低甲基化的基因包括CDlla、CD70、CD40L和Perforin等。这些基因的低甲基化导致其过度表达，从而诱导T细胞自身反应性活化，导致SLE发生。其中CDlla和CD70基因启动子调控序列的甲基化已经被证明可以用于SLE的辅助诊断。然而，这种方法限制在检测外周血CD4+T细胞基因组中的CDlla和CD70基因甲基化水平。这就要求我们首先要收集较多的患者外周血样本（约20ml左右），然后利用密度梯度离心法和免疫磁珠分边法分离外周血中的CD4+T细胞。由于抽取患者血液样本较多，患者的医从性较低：而且CD4+T细胞分边的实验成本较高、实验耗时较长，增加了患者的负担。另外，检测CDlla和CD70基因甲基化以往采用克隆测序法、自制芯片法，耗时较长，且无法给出一个精确的甲基化定量水平，给临床上推广应用带来了困难。

在本申请人的授权专利CN105316404B中，已经发现一种用于系统性红斑狼疮早期诊断的生物标记物，其特征在于该生物标记物为位于人IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内的一段DNA序列，该段DNA序列位于人类基因组1号染色体79,085,190-79,085,311段，其所包含的两个CG位点的低甲基化水平指示所述系统性红斑狼疮的存在，DNA序列如SEQ NO.1所示。

SEQNO.1：AATCCGCTGTCACTCCACAGACAGACCGAAATACGGATGGCCCTGATGACACCGTGTTCTCGACTTCCTTGCTTTCATTTCATGTCAGTTTAAACTGATTTGCTAGCA。

但是，在该授权专利中，实验步骤包括：（1）抽提受试者外周血全基因组DNA；（2）测定抽提的基因组DNA浓度；（3）亚硫酸盐处理基因组DNA；（4）特异性PCR引物扩增SEQ IDNO.1所示的待测DNA片段；（5）电泳检测PCR产物；（6）对PCR产物进行测序；（7）分析测序结果，获得待测序列中包含的两个CG位点的甲基化水平。

由此可见，上述授权专利的步骤过于复杂，不适用与广泛的临床推广应用。

发明内容

基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测步骤简单，并且更适合临床使用的检测试剂以及检测平台。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种系统性红斑狼疮的诊断试剂，所述试剂包括SEQ ID No.2上游引物5'-GAAATGAAAGTAAGGAAGTTAGGAG-3'和SEQ ID No.3下游引物5'-AAATCCAATACTATCACTCCATTCC-3'。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的诊断试剂还包括HRM标准品，所述标准品包括不同甲基化程度的质粒，所述甲基化是指SEQ ID NO.1中两个CG位点的甲基化。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的不同甲基化程度的质粒包括甲基化为0%的质粒和甲基化为100%的质粒，其分别具有如下序列为

SEQ ID NO.4 ：

GAAATGAAAGTAAGGAAGTTAGGAGAATAUGGTGTTATTAGGGTTATTTAAGTATTTUGGTTTGTTTGGAATGGAGTGATAGTATTGGATTT（模拟完全去甲基化被转化）

SEQ ID NO.5：

GAAATGAAAGTAAGGAAGTTAGGAGAATACGGTGTTATTAGGGTTATTTAAGTATTTCGGTTTGTTTGGAATGGAGTGATAGTATTGGATTT (模拟完全甲基化不被转化)。

在本发明的一个优选实施方式中，其还包括从外周血中提取DNA的试剂。

本发明另一方面还涉及一种系统性红斑狼疮的诊断平台，其包括上述诊断试剂以及高分辨率熔解曲线测试仪器。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的高分辨率熔解曲线测试仪器包括加热部件、温度控制部件和荧光强度检测部件。

本发明的另一方面还涉及上述诊断试剂在制备系统性红斑狼疮的诊断试剂中的应用。本发明还涉及上述诊断试剂在制备系统性红斑狼疮与其它临床表现相似的疾病或与目的基因甲基化水平改变相关的疾病相区分的诊断试剂中的应用，其中，所述其它临床表现相似的疾病或与目的基因甲基化水平改变相关的疾病是指选自成人STILL病、银屑病、过敏性紫癜、血管炎、骨关节炎、乙肝、社区获得性肺炎、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌中的一种或者多种疾病。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的应用是以外周血全基因组DNA作为检测样本。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的应用无需进行焦磷酸测序。

有益效果

本发明通过采用特定的引物，配合高分辨率熔解曲线（HRM）法检测平台，使得检测过程更加简便，能够实现与焦磷酸测序法相同或者相似的敏感度和特异性，并且易于推广应用。特别是，本发明通过采用特定引物检测目的CG位点甲基化水平，有助于将系统性红斑狼疮与其它临床表现相似的疾病或与目的基因甲基化水平改变相关的疾病进行区分，从而有助于医生对症治疗。

附图说明

图1. 本方法所含引物SEQNO.2和SEQNO.3及三组对照组引物PCR后产物进行琼脂糖凝胶电泳图。

图2. HRM未修饰熔融曲线，横坐标为温度，纵坐标表示荧光值。

图3. 截掉首尾后稍微拉伸后的熔融曲线。

图4. CG位点的甲基化平均值水平用于SLE诊断的ROC曲线图（与健康对照相比）。

图5. CG位点的甲基化平均值水平用于SLE诊断的ROC曲线图（与RA相比）。

图6. CG位点的甲基化平均值水平用于SLE诊断的ROC曲线图（与SS相比）。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：系统性红斑狼疮的诊断试剂的制备

包括：（1）抽提全血DNA的试剂：Thermo Scientific GeneJET Whole BloodGenomic DNA Purication Mini Kit,#K0782,Lot 00239303

表1

（2）亚硫酸盐处理所需试剂：EZ DNA Methylation^TM Kit, #D5002

表2

（3）荧光定量PCR所需的试剂：LightCycler®480 High Resolution MeltingMaster,ref 04909631001

表3

实验所用材料和仪器

材料：GeneJET Genomic DNA Purication Columns pre-assembled withCollection Tubes; Collection Tubes(2mL)；Pipettes and pipette tips；1.5mLmicrocentrifuge tubes;Zymo-Spin^TM IC Columns； Zymo-Spin^TMI-96 Binding Plates(D5004)；Conversion Plates w/Piercesble Cover Film;；Collection Plates;ElutionPlates

仪器：Vortex Mixer；Thermomixer； Disposable gloves；微孔板迷你离心机Mini-P25；DH-Ⅱ混合仪；Thermo centrifuge FERAEU 21；水浴箱；杂交炉；LightCycler^®96仪

实施例2：系统性红斑狼疮的诊断试剂的应用

步骤1：系统性红斑狼疮患者外周血基因组DNA抽提（采用商品化的全血DNA抽提试剂盒）：

（1）取0.5ml全血至1.5ml离心管，然后加入1ml冰蒸馏水，上下充分颠倒混匀数次；（2）室温静置5min，800g（3000rpm）离心5min；（3）取出后弃上清，加入1×PBS 150ul 后涡旋、重悬细胞沉淀；（4）加入20ul Proteinase K,涡旋；（5）加入400ul Lysis Solution，涡旋或颠倒混匀；（6）56℃水浴10min，期间将样本颠倒混匀3次；（7）水浴取出加入200ul无水乙醇，颠倒混匀、点离；（8）将混合液转移到新离心吸附柱中，6000g（8000rpm）离心1min；（9）将吸附柱转移到新废液管；（10）加500ul wash Buffer 1，8000g(1000rpm)离心1min、弃废液；（11）加500ul wash Buffer 2，≥20000g(≥14000rpm)离心3min、弃废液；（12）≥20000g(≥14000rpm)空离心1min，将吸附柱转移到新的1.5ml离心管；（13）加60ul ElutionBuffer，杂交炉37-42℃静置孵育8-10min；（14）8000g(1000rpm)离心1min；（15）收集基因组DNA。

步骤2. 测定抽提的基因组DNA浓度；

采用Thermo Scientific公司的NanoDrop 2000检测，吸取1μl DNA样本，点样到检测板上，从仪器上读取样本的浓度。

步骤3.亚硫酸盐处理基因组DNA；

（1）根据DNA浓度，计算亚硫酸盐处理所需DNA量200ng的取样体积；（2）避光配制Conversion Reagent(CT)：750ul无酶水+210μl M-Dilution Buffer涡旋混匀避光15min；（3）加入无酶水、DNA体积和5ul M-Dilution Buffer的混合液共50μl反应液，用tip头吸打混匀、点离；（4）将溶液置37℃温箱孵育15min；（5）避光条件下加入100ul ConversionReagent(CT)，混匀、点离；（6）将以上反应体系置于50℃水浴锅避光水浴12-16h；（7）将水浴过夜产物取出后放4℃冰箱10min；（8）准备好吸附柱并加入400μl的 M-Binding Buffer 湿润吸附柱；（9）将放置在0-4℃冰箱里冷却的样本加入到吸附柱内，盖上盖子颠倒混匀；（10）≥10000g离心1min；（11）加入100ul的M-Wash Buffer，≥10000g离心1min，弃废液；（12）加200ul的M-Desulphonation Buffer至20-30℃温箱放置18min；（13）≥10000g离心1min；（14）加200μl M- Wash Buffer，≥10000g离心1min；（15）重复上一步骤一次，弃废液；（16）≥10000g空管离心1min，弃废液管；（17）将吸附柱转移到1.5ml新离心管中收集产物；（18）加10μl的M-Elution Buffer,杂交炉孵育10min,再10000g离心1min；(19)重复上一步骤一次，弃吸附柱，离心管内收集的即为亚硫酸盐处理后的DNA。

步骤4. 测定亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA浓度；

采用Thermo Scientific公司的NanoDrop 2000检测，吸取2μl DNA样本，点样到检测板上，从仪器上读取样本的浓度。将待测样本DNA浓度稀释至1ng/μl。

步骤5. 实时荧光定量PCR扩增目的DNA获高分辨率溶解曲线HRM；

作为对比，申请人设计了三组对照引物，目的片段均包含SEQ NO.1：中两个CG位点，并用三组对照引物及SEQNO.2和SEQNO.3进行实验：

阳性对照组1引物

阳性对照组2引物

阳性对照组3引物

实验结果如图1所示，从图1中可以看出：使用三组对照引物进行PRC后，除引物二聚体外，均无明显特异性条带产生，证明三组对照引物均无法扩增出特异的目的基因片段。而使用SEQ ID NO.2和 SEQ ID NO.3作为引物进行PCR，有明亮的特异性条带存在，证明SEQID NO.2和SEQ ID NO.3的配合可以扩增出特异的目的基因片段，该组引物具有特异性。因此，接下来将使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3作为特异性引物进行实验。

HRM标准品的制备：

A液：甲基化为0%的质粒，序列为SEQ ID NO.4

B液：甲基化为100%的质粒，序列为SEQ ID NO.5

配制甲基化程度为0%、25%、50%、75%、100%的五种标准品，配制成分如下表4

表4

（1）配制步骤：

将A液和B液按表所示比例加入PCR管中，每个浓度做一复孔，上机检测。

（2）实验结果：

原始实验结果如图2所示，横坐标为温度，纵坐标表示荧光值，通过LightCycler^®96 SW软件将熔解曲线标准化后得出图3所示，横坐标表示DNA的双螺旋结构降解时的温度，纵坐标表示荧光差值。图中曲线从上往下依次为100%、 75%、50%、25%、0%的标准品甲基化检测结果，纵坐标零刻度处表示五个标准品之间荧光差值的平均值（纵坐标可自行设定）。

（3）检测结果判读:

将待测样本曲线与标准品曲线位置进行比较即可得出待测样本甲基化的大致结果。例如：待测样本的曲线的最低点在标准管0%和25%之间，则待测样本的甲基化结果为0%~25%。但若待测样本的曲线最右端没有和标准品曲线一样汇聚在零刻度线附近，而是与零刻度线有一定距离，则表明检测的样品结果不准确，检测结果无效，需重新检测。

在实验时，标准品初始荧光过高，可能是由于模板浓度过高，扩增并不充分，建议将标准品至少稀释至样本的1/1000的浓度进行实验。·每个样本的复孔建议加在相邻2孔，标准品与样本隔得尽量远。

LightCycler^®96检测待测样品

qPCR的反应体系见表5；

表5 qPCR反应体系

qPCR反应的条件见表6；

表6 甲基化特异性qPCR反应条件

实施例3：本发明系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台敏感性和特异性的检验

利用以上方法检测1024例SLE患者、512例健康对照、388例RA患者和374例PSS患者外周血IFI44L基因转录起始位点上游-2000bp内的DNA序列SEQ ID No.1所包含的两个CG位点的甲基化水平，检测结果显示，健康对照组这两个CG位点平均值呈高甲基化，SLE患者组两个CG位点甲基化平均值水平与健康对照、RA患者和SS患者相比均显著较低；

利用ROC曲线评价统计量计算两个CG位点甲基化平均值水平在诊断SLE中的敏感性和特异性，ROC曲线下面积（AUC）实际的取值范围为0.5～1，而一般认为：对于一个诊断试验，ROC曲线下面积在0.5～0.7之间时诊断价值较低，在0.7～0.9之间时诊断价值中等，在0.9以上时诊断价值较高（如图4-6所示）。

CG位点甲基化水平区分SLE患者与健康对照的特异性96.10895%、敏感性91.67513%;

CG位点甲基化水平区分SLE患者与RA患者的特异性83.72549%、敏感性89.44162%;

CG位点甲基化水平区分SLE患者与SS患者的特异性95.91440%、敏感性93.50254%;

为了进一步说明本发明的创造性，下表描述了本发明与CN105316404B专利的对比效果。

为了进一步说明本发明的试剂盒所使用的引物的特异性及本试剂用系统性红斑狼疮的鉴别诊断具有极高的使用价值，用HRM法检测多种疾病对照样本外周血IFI44L基因转录起始位点上游-2000bp内的DNA序列SEQ ID No.1所包含的两个CG位点的甲基化水平。疾病对照包括：自身免疫病（成人STILL病等）；感染性疾病（乙肝等）；恶性肿瘤（白血病等）；病毒相关性肿瘤（宫颈癌等）。以甲基化水平0%~25%为阳性，25.5%—100%为阴性，各疾病样本数及阴性率如下表所示。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> 系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台和应用

<130> CP19465

<141> 2020-06-11

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 108

<212> DNA

<213> Systemic Lupus Erythematosus，SLE

<400> 1

aatccgctgt cactccacag acagaccgaa atacggatgg ccctgatgac accgtgttct 60

cgacttcctt gctttcattt catgtcagtt taaactgatt tgctagca 108

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Systemic Lupus Erythematosus，SLE

<400> 2

gaaatgaaag taaggaagtt aggag 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Systemic Lupus Erythematosus，SLE

<400> 3

aaatccaata ctatcactcc attcc 25

<210> 4

<211> 92

<212> DNA/RNA

<213> Systemic Lupus Erythematosus，SLE

<400> 4

gaaatgaaag taaggaagtt aggagaatau ggtgttatta gggttattta agtatttugg 60

tttgtttgga atggagtgat agtattggat tt 92

<210> 5

<211> 92

<212> DNA/RNA

<213> Systemic Lupus Erythematosus，SLE

<400> 5

gaaatgaaag taaggaagtt aggagaatac ggtgttatta gggttattta agtatttcgg 60

tttgtttgga atggagtgat agtattggat tt 92

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Systemic Lupus Erythematosus，SLE

<400> 6

agatagaaat atttggatgg ttttgatgat 30

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Systemic Lupus Erythematosus，SLE

<400> 7

acctcatcca atcttaaaac acttat 26

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Systemic Lupus Erythematosus，SLE

<400> 8

tagatagaaa tatttggatg gttttgatga 30

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Systemic Lupus Erythematosus，SLE

<400> 9

gatagaaata tttggatggt tttgatgat 29

Claims

1.一种系统性红斑狼疮的诊断试剂，其包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物。

2.根据权利要求1所述的诊断试剂，所述的诊断试剂还包括HRM标准品，所述标准品包括不同甲基化程度的质粒，所述甲基化是指SEQ ID NO.1的甲基化。

3.根据权利要求2所述的诊断试剂，所述的不同甲基化程度的质粒包括甲基化为0%的质粒和甲基化为100%的质粒。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的诊断试剂，其还包括从外周血中提取DNA的试剂。

5.一种系统性红斑狼疮的诊断平台，其包括权利要求1~4任意一项所述的诊断试剂以及高分辨率熔解曲线测试仪器。

6.根据权利要求5所述的诊断平台，所述的高分辨率熔解曲线测试仪器包括加热部件、温度控制部件和荧光强度检测部件。

7.权利要求1~4任意一项所述的诊断试剂在制备系统性红斑狼疮的诊断试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，所述的应用是以外周血全基因组DNA作为检测样本。

9.根据权利要求7或8所述的应用，所述的应用无需进行焦磷酸测序。

10.权利要求1~4任意一项所述的诊断试剂在制备系统性红斑狼疮与其它临床表现相似的疾病或与目的基因甲基化水平改变相关的疾病相区分的诊断试剂中的应用，其中，所述其它临床表现相似的疾病或与目的基因甲基化水平改变相关的疾病是指选自成人STILL病、银屑病、过敏性紫癜、血管炎、骨关节炎、乙肝、社区获得性肺炎、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌中的一种或者多种疾病。