CN103173552A

CN103173552A - Foxp3基因 TSDR位点甲基化检测方法

Info

Publication number: CN103173552A
Application number: CN2013100916066A
Authority: CN
Inventors: 陆前进; N·欧文; 梁功平; 赵明; 余鑫海
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2013-03-21
Publication date: 2013-06-26

Abstract

本发明公开了一种检测Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法。该方法依次包括下述步骤：（1）从全血中提取基因组DNA；（2）DNA的亚硫酸氢盐处理；（3）MS-HRMPCR；（4）经HRM-PCR检测，读取样本Tm值，根据样本Tm值判断Foxp3基因TSDR甲基化水平。该方法相对于现有的MS-HRM方法，更加简单易行，有望成为评估Foxp3基因TSDR位点甲基化的精确、廉价、快速的工具，并为临床指导评价SLE活动性、疗效和预后提供帮助。

Description

Foxp3基因 TSDR位点甲基化检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因位点甲基化检测方法。

背景技术

SLE是一种由于自身免疫反应引起的慢性炎性疾病，以多个器官、组织受累和血清中有多种自身抗体为特征，但其发病机制尚未明了，大量资料证明是在遗传、环境、感染和性激素等因素的影响下出现的细胞免疫功能失调所致。SLE患者临床异质性大，病情迁延，反复波动。因此，在诊断SLE 时，应进行包括其活动性与严重程度的病情判断，以利于选择治疗方案。但是对于SLE活动度的判定并非易事，活动性与重症度并非是平行关系，且SLE是多脏器受害的疾病，受侵犯脏器损害不同，对疾病活动性的评价也会发生变化。包括对感染性疾病在内的其他疾病进行鉴别，进一步加大了活动性判定的难度。

现行的SLE活动性判定依据主要有：SLE病情活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)、狼疮活动测量标准(systemic lupus activity measure，SLAM)、欧洲统一狼疮损伤指数(European consensus lupus damage index，ECLAM)和大不列颠群岛狼疮评估组指数(British Isles lupus assessment group，BILAG)，其中SLEDAI和BILAG是目前狼疮随机临床试验最常用的两个评估工具。但上述各种评分方法仍不完美,各有优缺点。单独使用，有时并不能对活动性给出准确的评判。因此，需要一种更为有效、更为精准判定方法。

CD4+ CD25+ 调节性T细胞（Treg）首次由日本学者Sakaguchi等于1995年所报道，这类T细胞介导的免疫调节作用是维持自身免疫耐受的关键，此发现引起了免疫学界的广泛关注。Treg的免疫抑制性是指经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD4+ CD25- T细胞的活化和增殖。大量研究表明，Treg不仅在自身耐受的获得和维持及自身免疫的防御中起重要作用，在肿瘤、移植耐受甚至是病原体感染等免疫反应调节中也扮演重要角色。虽然其机制至今还不是十分明确，但大量研究表明Treg细胞的发育、功能的发挥与一个蛋白质分子——Foxp3有着密切的联系。Foxp3是一种转录因子，它能通过调控特定基因的表达，从而控制Treg细胞的分化成熟。

有研究发现与非活动性SLE患者和健康对照组相比，活动性SLE患者外周血CD4+ T细胞表面CD69 表达增多，而CD25 的表达明显减少，这一现象提示，活动性SLE患者中T 细胞被大量激活，却没有诱导出免疫调节性Treg细胞。进一步研究显示SLE患者外周血Foxp3的表达也明显低于对照组，它的表达水平与CD4+ CD25+ 调节性T细胞数量存在依赖关系。Treg细胞在发挥抑制作用机制中起着重要作用。因此，活动性SLE患者体内缺乏CD4+CD25+ T细胞可能会导致机体抑制自身免疫反应的功能减弱，并与SLE 的发生发展密切相关。

目前，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-High Resolution Melting Curve Analyse，简称MS-HRM）是一种不需要 PCR 产物后续操作的，简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法在甲基化修饰位点附近设计实时定量PCR引物，对来自经重亚硫酸盐修饰的DNA的相关区进行特异性PCR扩增。重亚硫酸盐修饰DNA，让非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5－甲基胞嘧啶保持不变，随后使用含饱和DNA结合染料的PCR体系扩增，扩增后通过比较曲线的熔解温度和峰形进行分析。MS-HRM因其高敏感性，可以区分扩增产物中少至1个碱基变化的序列差异，从而通过尿嘧啶/胞嘧啶的差异判断扩增子来源的初始模板的甲基化修饰差异。但MS-HRM的数据一直没有一种公认的分析方法，目前结果分析大多采用标准曲线法，将甲基化和非甲基化对照DNA（经过重亚硫酸盐修饰）以不同比例混合，创建一系列甲基化梯度标准品。结合标准品的特征熔解曲线和温度，用专门软件进行计算分析，从而得出样本中的DNA甲基化比率。这种方法使得实验更加繁琐，增加了实验环节，在标准品在配置的过程中极易因操作原因，导致标准品配比不准确，使得实验准确性和重复性大打折扣。且加大了实验成本，延长了实验时间。因此限制了MS-HRM技术在临床诊断的推广应用。

发明内容

，本发明的目的在于基于并改进现有MS-HRM方法，提供一种更为简单的检测Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法。

本发明提供的检测Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法依次包括下述步骤：（1）从样本全血中提取基因组DNA；（2）DNA的亚硫酸氢盐处理；（3）MS-HRM PCR：MS-HRM PCR反应中，Foxp3 基因 TSDR位点的特异性扩增引物序列为：

F：5′-TTGGGGGTAGAGGAGGATTTAGAGGGTC-3′，

R：5′-CAACACCCATATCACCCCACCTAAA-3′ ；

（4）经HRM-PCR检测，读取样本Tm值，根据样本Tm值判断Foxp3基因TSDR甲基化水平。

本发明改进了传统用于检测基因甲基化水平的MS-HRM方法，基于MS-HRM的高灵敏性，直接使用MS-HRM检测系统性红斑狼疮外周血基因组DNA中Foxp3基因TSDR的Tm值，以此为指标，反应活动性SLE患者Foxp3基因TSDR甲基化水平。因为直接使用Tm值进行统计学分析，不用标准曲线进行后续的甲基化百分比计算。这样我们省去了标准品制备和软件分析环节，大大节省了时间和成本，简化了实验步骤，使得实验操作更简单且减少了实验误差。特别是无需甲基化计算软件分析，使得很多没有配备甲基化分析软件的HRM实时定量PCR仪均能开展此实验。该方法相对于现有的MS-HRM方法，更加简单易行，有望成为评估Foxp3基因TSDR甲基化的精确、廉价、快速的工具，并为临床指导评价SLE活动性、疗效和预后提供帮助。

TSDR（Treg-specific demethylated region）是Foxp3基因中的一个高度保守的位点，其在自然Treg细胞中完全去甲基化，但在效应T细胞中是甲基化的。Foxp3 基因 TSDR的甲基化使得相关转录因子不能结合至其启动子区，导致Foxp3低表达。本发明研究得到：以慢性感染性疾病作为疾病对照，与非活动性SLE患者，慢性感染性疾病患者以及正常人群相比，活动性SLE患者。Foxp3的TSDR区甲基化水平明显升高，且与SLE活动性呈高度正相关。因此，通过检测Foxp3 基因 TSDR的甲基化水平，对评价SLE病人的活动性提供帮助。

附图说明

图1：各组样本MS-HRM PCR检测Tm值示意图，其中HC：健康对照；CMI：慢性感染性疾病；In SLE：:非活动性SLE；Ac SLE：活动性SLE；

图2： SLEDAI分值与Tm值间相关性图；

图3：MS-HRM PCR反应条件；

图4：HRM-PCR原理和特点。

具体实施方式

实施例 1 ： Foxp3 基因 TSDR 位点甲基化检测

1、从300ul全血中提取基因组DNA

(1) 裂解1：取300ul全血放入到1.5ml的离心管中，加入900ul裂解液1。上下颠倒混匀，涡旋混匀15秒后放入离心机中离心，离心速率为8000rpm，1min。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。重复上述裂解步骤一次，最后去除上清, 使离心管底部沉淀无残留裂解液1；

(2) 裂解2：在上步所得沉淀中加入1ml裂解液2。上下颠倒混匀，彻底重悬沉淀。涡旋混匀15秒后8000rpm，离心1min。去上清，可见离心管底部有微量淡红色沉淀。重复此裂解步骤一次，最后彻底去除上清，离心管底部的灰白色沉淀无残留裂解液2；

(3) 消化：吸取蛋白酶K 10ul ( = 0.2mg )加入到上面的离心管中，使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后，加入320ul消化液，上下颠倒混匀，使沉淀充分重悬。58℃水浴消化15分钟，最后可见澄明的消化液体；

(4) 纯化：在上面的消化液体中加入110ul纯化液，上下颠倒混匀，15000rpm, 离心1min。吸取上清液放入到装有1000ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻柔上下翻转10次，可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到100ul 70%乙醇中来回漂洗20次，钩出DNA，在空气中凉干后放入到100ul溶解液中。4℃溶解过夜，提取完成。提取的DNA可于-20℃长期保存。

如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA溶解液放在58℃水浴中，保温30分钟, 手指轻弹混匀离心管，使DNA充分溶解即可。

2、 DNA的亚硫酸氢盐处理

采用Qiagen公司的EpiTect® Bisulfite试剂盒处理全血基因组，DNA标本来自第一部分实验提取所得，操作步骤按试剂盒说明书进行：

(1) 缓冲液BW中加入30ml无水乙醇

(2) 缓冲液BD中加入30ml无水乙醇

(3) 将310ul无酶水加入310ug carrier RNA中，得到1ug/ul的carrier RNA溶液

(4) 按1：100体积往缓冲液BL中加入1ug/ul的carrier RNA溶液，使缓冲液BL中carrier RNA的浓度为10ug/ml

(5) 根据需要处理的样本多少溶解Bisulfite Mix，每管Bisulfite Mix中加入800ul的无酶水，剧烈震荡5分钟至完全溶解

(6) 在200ul的PCR管中依次加入表2-1中的各成分，充分震荡混匀；反应体系见表1。

表1：DNA亚硫酸氢盐处理步骤（6）的反应体系

(7) 在PCR仪中按表2的条件进行亚硫酸氢钠转换；

表2： DNA亚硫酸氢盐处理反应条件

(8) 反应结束后将PCR管简短离心，将所有的反应液体转至干净的1.5ml EP管中；

(9) 加入560ul缓冲液BL（含10ug/mlcarrier RNA，见第4步），震荡混匀，简短离心；

(10) 将上一步所得的所有液体全部转入带有收集管的EpiTect spin吸附柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

(11) 往离心柱中加入500ul缓冲液BW，13000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

(12) 往离心柱中加入500ul缓冲液BD，室温孵育15分钟，13000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

(13) 13000rpm离心1分钟，将吸附柱转入一个新的1.5ml的EP管中，加20ul缓冲液EB, 12000rpm离心1分钟洗脱DNA，所得的液体即为纯化了的亚硫酸氢钠处理后的DNA。

3. MS-HRM检测样本Foxp3基因TSDR甲基化水平

使用Rotor-Gene 6000 cycler (Corbett) 实时定量PCR仪进行MS-HRM PCR，根据EpiTect HRM-PCR kit (Qiagen)试剂盒说明书步骤进行。

(1) 反应体系的建立在200ul的PCR管中依次加入以下各组分，所有PCR均采用10µl反应体系，具体见表3。

表3：MS-HRM PCR反应体系

Foxp3 基因 TSDR特异性扩增引物序列如下：

Forward primer5′-TTGGGGGTAGAGGAGGATTTAGAGGGTC-3′

Reverse primer 5′-CAACACCCATATCACCCCACCTAAA-3′

(2) 上机检测按EpiTect HRM-PCR kit说明书推荐进行反应条件设置，条件如图3所示。

HRM-PCR原理和特点如图4所示。

4. 结果及统计学分析

不同疾病和正常对照组样本经HRM-PCR检测，读取各样本的Tm值。

用方差分析法（ANOVA方法）对实施例1最后获得的各样本的Tm进行组间比较，所有分析均使用SPSS 18.0 软件进行。以Tm各组均值±标准差（摄氏度）的形式绘图，结果见附图1。

附图1显示：正常人与非活动性SLE病人间的Tm值无显著性差异(78.44±0.25 vs. 78.49±0.29, p=0.464)；正常人与活动性SLE病人间Tm值有显著性差异 (78.44±0.25 vs. 79.00±0.28, p<0.001)；非活动性SLE与活动性SLE间病人间Tm值也具有显著性差异(78.49±0.29 vs. 79.00±0.28, p<0.001) 。

慢性皮肤微生物感染的病人和正常人相比，Tm值有统计学差异 (78.28±0.21 vs. 78.44±0.25, p<0.05)，但仍不及活动性SLE病人与非活动性SLE病人和正常人之间差异显著。在所有的研究组中，活动性SLE病人的熔点最高，慢性皮肤微生物感染病人的熔点最低。所有Tm值检测结果和差异显著性见表4。

表4：检测结果和统计学差异显著性

注：表中↑表示升高； ↓表示降低； N表示正常

将活动性病人的SLEDAI 分值与其对应的HRM-PCR检测Tm值做相关性分析，如附图 2 所示。我们发现SLEDAI 分值与Tm值间具有高度相关性(p<0.001) (r=0.830)。SLEDAI值高时，Tm值往往也高，反之亦然。

因此，通过本发明的方法取得待测样本的HRM-PCR检测Tm值，能够很好地反映待测样本的Foxp3基因TSDR位点甲基化水平，从而结合临床提示SLE患者SLE的活动性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> Foxp3基因 TSDR位点甲基化检测方法

<130> CSU20131-3005

<140> 201310091606.6

<141> 2013-03-21

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<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ttgggggtag aggaggattt agagggtc 28

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

caacacccat atcaccccac ctaaa 25

Claims

1.Foxp3 基因TSDR位点甲基化检测方法，其特征在于依次包括下述步骤：

（1）从样本全血中提取基因组DNA；

（2）DNA亚硫酸氢盐处理；

（3）MS-HRM PCR；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）MS-HRM PCR反应时，Foxp3 基因 TSDR位点的PCR特异性扩增引物序列为：

F：5′-TTGGGGGTAGAGGAGGATTTAGAGGGTC-3′，

R：5′-CAACACCCATATCACCCCACCTAAA-3′ 。

3. 根据权利要求1或2所述的化检测方法，其特征在于：在步骤（4）中，样本Tm均值达到或超过79.00时，判断Foxp3基因TSDR位点甲基化水平高。