EP2430182A1 - Diagnostische marker für die bestimmung der prädisposition der entwicklung von gebärmutterhalskrebs und für die bestimmung eingesetzte oligonukleotide - Google Patents

Diagnostische marker für die bestimmung der prädisposition der entwicklung von gebärmutterhalskrebs und für die bestimmung eingesetzte oligonukleotide

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EP2430182A1
EP2430182A1 EP10718615A EP10718615A EP2430182A1 EP 2430182 A1 EP2430182 A1 EP 2430182A1 EP 10718615 A EP10718615 A EP 10718615A EP 10718615 A EP10718615 A EP 10718615A EP 2430182 A1 EP2430182 A1 EP 2430182A1
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EP
European Patent Office
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markers
hpv
human
diagnostic
sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10718615A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Iftner
Frank Stubenrauch
Anna Manawapat
Susanne Krueger Kjaer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Original Assignee
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard Karls Universitaet Tuebingen, Universitaetsklinikum Tuebingen filed Critical Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Publication of EP2430182A1 publication Critical patent/EP2430182A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57411—Specifically defined cancers of cervix
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Definitions

  • the present invention relates to the use of diagnostic markers for predicting the predisposition of a human for the development of cervical cancer and / or cancer precursors in human papillomavirus infection and for detecting persistent infection with the human papillomavirus.
  • the invention further relates to a method for predicting the predisposition of a human to the development of cervical cancer and / or cancer precursors an infection with the human papillomavirus (hereinafter also: HPV), in which diagnostic markers are detected, as well as the provision of suitable oligonucleotides.
  • HPV human papillomavirus
  • Papillomaviruses are widespread, small, double-stranded DNA viruses that contain cells in the basal layer of the epidermis or cervical epithelium and the like. of humans. While most infections are temporally limited and asymptomatic, persistent infection of the genital mucous membranes with certain papillomaviruses can lead to the formation of cervical intraepithelial neoplasia (CIN), which in turn can develop into cervical carcinoma.
  • CIN cervical intraepithelial neoplasia
  • Cervical cancer is the second most common cancer in women worldwide, and the worldwide prevalence of human papillomavirus in cervical carcinoma is 99.7%. Infection with certain genital HPV types is a necessary risk factor for the development of cervical carcinoma.
  • HPV infections are very common, in most cases an infection is transient and spontaneously blocked. Persistence of HPV infection is a necessary risk factor for the development and progression of cervical precancerous lesions, but only about 10% of women with HPV infection show progression to such lesions; Of these, approximately 20 to 50% of women, untreated, develop precancerous or cervical cancer within a period of up to 12 years, depending on the persistent HPV type.
  • Previous cancer screening detects cancer precursors with a cytological screening, in which a smear from the cervix and the endocervical canal is stained according to Papanicolaou and assessed microscopically (Papanicolaou smear or Pap test). Furthermore, there are tests for the detection of human papillomavirus DNA and RNA levels, which can not differentiate between the frequent transient infections and the rather rare persistent infections and therefore only a small positive predictive value (PPV) of 15 to 25% for Have cancer precursors.
  • PSV positive predictive value
  • the genetic marker pl ⁇ is described, which is a surrogate marker for HPV infection, but shows in studies too low specificity and also only low PPV for cancer precursors.
  • the object of the present invention is therefore to provide a test by means of which the predisposition of a human to the development of cervical cancer in the case of an infection with the human papillomavirus can be predicted.
  • diagnostic markers which are selected from at least one of the diagnostic markers listed in Table 1 below.
  • the object is further achieved by providing a novel method for predicting a person's predisposition to developing cervical cancer and / or precancerous lesions in human papillomavirus (HPV) infection and / or detecting a persistent HPV infection that causes the human papilloma virus Step of detecting at least one of the diagnostic markers listed in Table 1 or fragments thereof in a sample isolated from a human.
  • HPV human papillomavirus
  • the object is achieved by the oligonucleotides which are used in the inventive use and the method according to the invention, and with which at least one of the diagnostic markers shown in Table 1 can be detected, and by a kit for carrying out the invention.
  • Method according to the invention which contains at least one oligonucleotide according to the invention.
  • the inventors have been able to show in elaborate experiments that it is possible on the basis of the investigated markers to detect these markers, for example in a sample taken from a human to be examined, and in their presence, either alone or in combination with one or more of the other listed markers, to determine a human predisposition to the development of cervical cancer. This determination can be made, for example, on the basis of the comparison of the markers according to the invention with the corresponding markers from corresponding HPV-negative samples and / or HPV-positive, but not progressive samples.
  • the present invention provides an excellent tool for improved cervical cancer screening because the markers identified in the present invention on the basis of persistent HPV infection up to 12 years previously predict the development of high-grade high-grade cancer precursors can.
  • the markers provided also offer the possibility of distinguishing between women who do not have HPV infection and women who have a persistent one Own HPV infection.
  • progressive and “progressive” are used interchangeably, and are intended - as well as the term “progressors” - to mean the development of dysplasias or cancer precursors and cancer / tumors.
  • the names reproduced in Table 1 are the official - also in Germany - official gene names, or their official abbreviation, whose translation into German is neither expedient nor recommended in order to avoid confusion.
  • the markers are selected from the group comprising the markers with the official gene names SERPINB5, CNAD1, CPSF2, CCRL2, TNFAIP6, CD44, TMEM45A, WDR43, NBN, ERMP1, LRPIII, CDKN2A, HPV16E4, HPV16E7, SERPl, ASAHI, HIGDIA, PGHI, which are also listed in Table 2 below with their respective sequences, as well as the specific for each marker primers (see also Table 3) and the respective product size.
  • the official gene names SERPINB5, CNAD1, CPSF2, CCRL2, TNFAIP6, CD44, TMEM45A, WDR43, NBN, ERMP1, LRPIII, CDKN2A, HPV16E4, HPV16E7, SERPl, ASAHI, HIGDIA, PGHI which are also listed in Table 2 below with their respective sequences, as well as the specific for each marker primers (see also Table 3) and the respective product size.
  • the inventors were able, in particular for the markers listed in Table 2, whose sequences are also shown in the table, to investigate and prove their suitability for determining the prediction of a person's predisposition to the development of cervical cancer and / or precancerous tumors. In our own experiments, the inventors showed that it is possible to achieve a high positive predictive value of the diseases, in particular by means of these markers.
  • diagnostic markers are understood to be any diagnostic gene provided or the protein encoded by this gene and the RNA transcribed from the gene, or any sequence fragment characteristic of the gene or protein or mRNA.
  • characteristic sequence fragment is meant any sequence portion of the gene, the protein encoded thereby, or the mRNA transcribed from the gene which is specific for the particular gene, protein, mRNA, i. in this sequence is not found in other genes, proteins, mRNAs.
  • marker genes derived / transcribed mRNA, and in turn Proteins encoded by the marker genes. These are therefore referred to herein as “marker mRNA” and “marker proteins”.
  • the demonstration of the gene expression of the diagnostic markers offers the advantage that when a human sample is examined a comparison can be made with the gene expression of the corresponding markers in a healthy or a nonprogressive sample. On the basis of the comparison, an upregulation or a downregulation of these marker genes may then be determined for the individual marker genes, according to which in this case the predisposition to the development of cervical cancer can be predicted.
  • telomere length telomere length
  • the real-time quantitative PCR is a method for amplification / amplification of nucleic acids, based on the principle of conventional polymerase chain reaction (PCR), and in addition allows the quantification of the DNA thereby obtained. Quantitation is typically performed by fluorescence measurements taken during a PCR cycle, with fluorescence increasing proportionally with the amount of PCR products. At the end of a run consisting of several cycles, quantification is carried out in the exponential phase of the PCR on the basis of fluorescence signals obtained.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the quantitative real-time PCR is thus an excellent tool for the quantification of nucleic acids.
  • the mRNA of the diagnostic marker is first transcribed into cDNA and then used for the quantitative real-time PCR, whereby the transcripts of the diagnostic markers can be quantified and based on which a prediction of the predisposition for the development of cervical cancer can be made.
  • sequences or sequence sections of the diagnostic markers are detected which represent fragments or sections characteristic of the respective diagnostic marker, i. that is, sections which can be found or proven to be very specific with the given sequence only in the respective marker.
  • oligonucleotide preferably an oligonucleotide pair
  • the quantitative real-time PCR which is selected from at least one of the following:
  • oligonucleotide / s are understood as meaning oligomers constructed from a few nucleotides (DNA or RNA) as in the prior art and in the relevant field in general, the nucleotide sequence generally consisting of about 10 to 100 nucleotide units.
  • the oligonucleotides are also used in the polymerase chain reaction, which is why the claimed and disclosed oligonucleotides are also referred to as "primers".
  • the general designation of certain oligonucleotides with “forward” (forward) or “reverse” (reverse) given in Table 3 also represent common names of primers / oligonucleotides in the relevant technical field, so that in the present case these English terms are also selected to clarify.
  • hybridization under stringent conditions is meant herein that the hybridization is performed in vitro under conditions that are stringent enough to ensure specific hybridization.
  • oligonucleotide sequences hybridize specifically at higher temperatures.
  • stringent conditions are selected such that the temperature is about 5 ° C below the thermal melting point (Tm) for the specific oligonucleotide sequence.
  • Tm is the temperature (under defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) at which 50% of the molecules complementary to the target sequence hybridize to the target sequence in the equilibrium state.
  • stringent conditions are those in which the salt concentration is at least about 0.01 to 1.0 M sodium ion concentration (or another salt) at a pH between 7.0 and 8.3 and the temperature is at least 30 ° C for shorter Molecules (ie, for example, 10-50 nucleotides).
  • stringent conditions can be achieved by adding destabilizing agents such as formamide.
  • hybridization may take place under the following conditions: hybridization buffer: 2x SSC, 10x Denhardt's solution (Ficoll 400 + PEG + BSA, ratio 1: 1: 1), 0.1% SDS, 5 mM EDTA, 5 mM Na 2 HPO 4 , 25011g / ml herring sperm DNA; 50 ⁇ g / ml tRNA or 0.25M sodium phosphate buffer pH 7.2, ImM EDTA, 7% SDS at a hybridization temperature of 65 ° C to 68 ° C; Wash buffer: 0, 2x SSC, 0.1% SDS at a wash temperature of 65 ° C to 68 ° C.
  • the oligonucleotides listed under c) have a sequence identity of at least 80%, preferably of at least 90% and most preferably at least 95% to the oligonucleotides or parts thereof specified under a), based on the sequences shown in a below a ) indicated oligonucleotides.
  • sequence identity of oligonucleotides according to c) is determined by comparison with the sequences given in Table 1.
  • sequence identity refers to the percentage of nucleotide residues of the shorter sequence that are identical to the corresponding nucleotide residues of the longer sequence.
  • Sequence identities are usually via different alignment programs, such. B. CLUSTAL detected.
  • suitable algorithms are available to those skilled in the art for determining sequence identity, e.g.
  • diagnostic marker according to the invention is preferred if the prediction is carried out by the detection of the encoded by the diagnostic marker proteins.
  • proteins encoded by the diagnostic markers does not always have to take place for the entire protein, but can also take place via specific, specific sections in each case.
  • the proteins can be detected, for example, via specific antibodies, ie antibodies which bind specifically to the proteins / protein fragments or sections, for example using Western blots and enzyme-linked immunosorbent assays. Methods for the quantitative detection of proteins are well known in the art, in this regard reference is made, for example, to "Using Antibodies: A laboratory Manual, Ed Harlow / David Lane 1999, CoId Spring Harbor Laboratory Press” corresponding textbook and contains instructions on the procedures described.
  • only one diagnostic marker is used to predict the predisposition of a human to develop cervical cancer, whereas in other embodiments it is preferred that two or more of the diagnostic markers listed in Table 1 or 2 are used in combination for prediction become.
  • markers corresponding to the markers to be tested herein is meant that, for example, if the marker TMEM45A (or any of the other markers of the invention disclosed herein) is to be used in a sample to be assayed for predicting predisposition, then in one corresponding (known) sample, which has been shown to be HPV-negative or HPV-positive, but at least not progressive, also the marker TMEM45A, in particular its gene expression is determined.
  • the prediction is carried out by detecting a change, in particular a downregulation and / or upregulation, of the gene expression of the diagnostic markers in comparison to the gene expression of at least one of the markers a) to c): a) the markers corresponding to the tested diagnostic markers from a corresponding HPV-negative human sample; b) markers corresponding to the tested diagnostic markers from an HPV-positive, non-progressive human sample; and / or c) Reference markers that occur at a constant level in various human tissues / fluids.
  • a change in particular a downregulation and / or upregulation
  • the inventors have demonstrated in their own experiments that, on the one hand, certain of the marker genes are either upregulated or downregulated in their gene expression compared to the corresponding markers from an HPV-negative or HPV-positive but non-progressive sample, and that these differ Gene expression of the marker can be used to predict the predisposition of a human to developing cervical cancer.
  • the step of detecting the determination of the gene expression of the diagnostic markers in the isolated sample and in particular if he on the determination of the transcripts of the diagnostic marker and / or encoded by the diagnostic marker proteins he follows.
  • an oligonucleotide which is selected from the sequences listed in Table 3 is used to detect the diagnostic markers.
  • the method according to the invention comprises the following steps:
  • step (a) isolating mRNA from a sample contained by the human;
  • step (b) rewriting the mRNA isolated in step (a) into cDNA;
  • step b) contacting the cDNA probe obtained in step b) with at least one oligonucleotide selected from the oligonucleotides listed in Table 3;
  • step (e) determination of the amplification products obtained in step (d).
  • step (f) matching the amplification products determined in step (e) with these respective amplification products from corresponding comparison markers from an HPV negative corresponding human sample and / or a corresponding HPV positive but nonprogressive human sample, wherein a change, in particular a down and / or upregulation, which shows gene expression of diagnostic markers compared to the comparison markers of a human predisposition to develop cervical cancer.
  • the isolation of the mRNA can be carried out by means known in the art, for example by means of the RNeasy® mini kit from Qiagen, Hilden, Germany.
  • the description of the thus isolated mRNA can also be carried out by means known in the art, for example by means of the reverse transcriptase kit from Qiagen. It is understood that other means and methods of other companies are suitable for use in the method according to the invention; In this regard, reference is made to the standard work of Sambrook and Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, January 2001 Edition). Incidentally, in the method according to the invention, as well as in the use according to the invention, it is preferred if reference markers are detected parallel to the detection of the diagnostic markers.
  • reference marker is intended to mean any diagnostic marker or human gene that is ubiquitous and is expressed at a constant level in various genes, the expression of the genes remaining constant under various conditions.
  • ASAH1 N-acylsphingosine amide hydrolase 1, HIGD1A (HIG1 domain family member IA, Hyoxie-inducible Gen 1), SERPl (stress-associated endoplasmic reticulum protein 1), PGKl (phosphoglycerate kinase).
  • the transcription patterns of the mRNA can be standardized between different samples, and thus the relative amounts obtained can be compared with one another.
  • the sample to be examined isolated from a human is a tissue or body fluid sample, and in particular a biopsy sample, a cervical cell sample and / or a Papanicolaou smear.
  • oligonucleotides In the case of the oligonucleotides according to the invention, it is preferred if they are selected from at least one of the following:
  • oligonucleotides that hybridize under stringent conditions to the oligonucleotides defined in (a), or fragments thereof; and (C) oligonucleotides having a sequence homology of at least 80%, preferably of at least 85%, 90%, 95%, 98% to the oligonucleotides defined in (a) and with which the diagnostic markers can also be detected
  • oligonucleotides listed under the alternatives a), b) and c), their determination or definition and / or finding apply the determinations, definitions, means for finding outlined above for the use according to the invention.
  • the kit according to the invention for carrying out the method according to the invention comprises at least one oligonucleotide according to the invention, preferably an oligonucleotide pair listed in Table 3, or the oligonucleotide pairs listed in Table 3, which hybridize under stringent conditions to the oligonucleotide pairs listed in Table 3, or fragments thereof , on.
  • reagents and / or substances known for the process according to the invention may be present, and thus therefore agents with which the process according to the invention can be carried out.
  • agents, reagents, substances are in particular means for carrying out a polymerase chain reaction, that is to say, for example, the necessary buffer and enzymes, nucleotides.
  • oligonucleotide / oligonucleotide pairs present in the kit according to the invention also apply the determinations, definitions and means for finding outlined above for the use according to the invention.
  • the kit may further contain oligonucleotides for detecting at least one reference marker, in particular at least one of the following: ASAHI (N- Acyl-sphingosine amide hydrolase 1, HIGD1A (HIG1 domain family member IA, hypoxia-inducible gene 1), SERPl (stress-associated endoplasmic reticulum protein 1), PGK1 (phosphoglycerate kinase) or gene expression products thereof.
  • ASAHI N- Acyl-sphingosine amide hydrolase 1
  • HIGD1A HG1 domain family member IA, hypoxia-inducible gene 1
  • SERPl stress-associated endoplasmic reticulum protein 1
  • PGK1 phosphoglycerate kinase
  • the invention relates to the use of antibodies which bind to proteins expressed by genes listed in Table 1 for the detection of a persistent infection with the human papillomavirus (HPV), especially one directed against Temem45A, SerpinB5 or Cdkn2A antibody
  • FIG. 3 is a bar graph showing the correlation of microarray experiments in which changes in gene expression in samples were determined and quantitative real-time PCR experiments which also examined the changes in gene expression in samples, graphically presented, and for the creation of the results of the group of HPV-positive progressors and HPV-positive non-progressors were compared.
  • Biopsy material normal cervix or cervical carcinoma (HPV16-pos)
  • TEMEM45A antibodies P-18
  • Santa Cruz: A and C-13 Santa Cruz: B
  • SERPINB5 / maspin antibody 554292
  • BD Pharmingen C.
  • FIG. 1 shows an overview of the sample material used in the present application.
  • samples of endo- and ectocervix were taken from about 11088 Danish women, as well as pap smears made; both samples were buffered and tested for whether they were HPV negative or HPV positive.
  • the second study was performed on 78% of previously studied women, and ten years later, in 2005, it was linked to the pathology database, identifying women with mild to severe dysplasia / Carcinomas developed.
  • Fig. 1 also illustrates schematically that a transient infection HPV infections are to be understood that after a certain period of time (2 years) are no longer detectable and thus after the period no HPV infection is present, (ie: HPV positives the first study was diagnosed as HPV negative in the second study). In these cases, as with the HPV negatives already diagnosed with the first examination, no progression occurred. In contrast, HPV positives also showed progression in the second study.
  • genes were identified which showed a different expression in HPV negative samples than the HPVl ⁇ positive sample, and on the other hand genes were identified whose expression was different between women who had no histological changes during the follow-up , and women who subsequently developed dysplasia and carcinoma.
  • the samples were analyzed by quantitative real-time (real-time) polymerase chain reaction. So far, the following samples have been examined: 19 samples HPV negative (no dysplasia until the second examination), and a total of 81 samples HPV16 positive, of which 37 non-progressive (without dysplasia development) and 44 progressive, of which 10 samples with mild dysplasia, 20 Samples with severe dysplasia, 12 with CIS and 2 with cancer / carcinoma.
  • RNA of the samples frozen at -80 ° C was isolated by means of a modified RNeasy mini-kit (Qiagen, Hilden, Germany), for which the samples were briefly and carefully thawed.
  • RNA isolated in this way was then transcribed directly into cDNA by means of the reverse transcription kit (Qiagen), or initially amplified to generate cRNA, and then transcribed into cDNA.
  • primers were designed which are specific for the individual genes.
  • the finally developed primers thus fulfilled the following properties: a) the sequence to which the primer binds occurs only once in the human genome; b) the hybridizing sequence was 18 to 23 nucleotides long; c) the melting temperature was between 58 0 C and 62 ° C (optimum: 60 0 C); d) the GC content of the complete sequence was between 30% and 80% (optimum: 50%).
  • the finally generated primers are listed in Table 2, right column, as well as in Table 3.
  • Quantitative real-time PCR was performed in the LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germany) using the specific primers and SYBER Green, which inserts into double-stranded DNA. Through this binding we amplified the emitted fluorescence at the same excitation intensity many times. In the LightCycler, fluorescence is measured during each amplification cycle at the end of the elongation phase.
  • the respective approach for the real-time PCR was as follows:
  • the crossing point (CP) value ie the cycle at which the signal intensity of the cDNA sample differs from the background fluorescence, could be determined.
  • This CP value serves as an indirect indicator of gene expression, ie, samples with high gene expression of a gene show smaller CP values than a sample with lower gene expression.
  • n-fold expression was calculated using the following formula:
  • n-fold expression (efficiency target gene) ⁇ cpZid 8 en (control sample) 7
  • Chemokine (CC motif) receptor-like protein 2 (CCRL2), tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6 (TNFAIP6), both of which were expressed in expression; CD44 antigen, KIAA1815, and transmembrane protein 45A (TMEM45A), all of whose expression was induced.
  • CCRL2 Chemokine (CC motif) receptor-like protein 2
  • TNFAIP6 alpha-induced protein 6
  • CD44 antigen KIAA1815
  • TMEM45A transmembrane protein 45A
  • Serpin peptidase inhibitor, member 5 (SERPINB5), cullin-associated and neddylation-dissociated protein 1 (CANDl), cleavage and polyadenylation-specific factor 2 (CPSF2), splice factor 3b, subunit 3 (SF3B3), their gene expression was all induced, and SEC14-like protein 1 (SEC14L1), whose gene expression was reduced.
  • SERPINB5 Serpin peptidase inhibitor, member 5
  • CANDl cullin-associated and neddylation-dissociated protein 1
  • CPSF2 cleavage and polyadenylation-specific factor 2
  • SF3B3 subunit 3
  • ASAH1 N-acyl-sphingosine amide hydrolase 1, HIGD1A (HIG1 domain family member IA, hypoxia-inducible gene 1), SERPl (stress-associated endoplasmic reticulum protein 1), PGK1 (phosphoglycerate kinase), or gene expression products thereof.
  • RNAs extracted from the samples showed a low concentration
  • a two-round amplification of the RNA for generating con cRNA was carried out for the microarrays and also for a test batch of the qRT-PCR in order to amplify the amounts of RNA.
  • the amplified RNA (and also non-amplified RNA) was transcribed into cDNA and used for qRT-PCR.
  • the altered expression of the individual genes was calculated using an alternative method: for this purpose, the median of the CP values of the individual samples in a group calculated.
  • the median of the PGKl values of the respective groups serves as a reference.
  • Figure 4 shows the results of this statistical evaluation of the qPCR data for pI6 / CDKN2A, SERPINB5, TEMEM45A, using PGK1 as the reference gene. It was found that all differences in expression are highly significant.
  • Figure 2 shows the correlation of data from microarray experiments with data from qRT-PCR experiments.
  • the bar graph shown in Figure 2 in the comparison of HPV negative with HPV16 positive samples, the extent of gene expression changes in qPCR experiments correlated with cRNA, the original RNA, and the microarray analyzes on TMEM45A and CD44.
  • TMEM45A and CD44 For TNFAIP6 and CCRL2, deregulation was observed in the microarray analyzes, which could not be confirmed in the qPCR experiments of the original RNA.
  • CANDl is in cRNA and original RNA similarly strongly regulated
  • SERPINB5 is more deregulated in the original RNA than in the cRNA.
  • ROC analysis (“receiver operator characteristics”) of the qPCR data was performed, in which analysis strategies are evaluated and optimized.
  • the ROC curve visually illustrates the dependence of efficiency on the error rate for various parameter values. If the area under the curve (AUC) value is> 0.5, this indicates that it is is not a random distribution, but that the different expression of the genes is suitable as a test. This could be shown for pI6 / CDKN2A, SERPINB5 and TEMEM45A (see Fig. 5).
  • transcript levels of CDKN2A encoding two structurally distinct proteins, pl6 and pl4ARF, as well as SERPINB5 and TMEM45A were examined.
  • There was also a significant difference between the groups for the expression of the CDKN2A gene 0.00029).
  • N no progression
  • P severe dysplasias
  • u.a. for CDKN2A, SERPINB5, and TMEM45A the differences in expression are significant.
  • FIG. 7 shows, analogously to FIG. 5, the ROC analysis of the qPCR data of pI6 / CDKN2A, SERPINB5, TMEM45A, where again an AUC value> 0.5 indicates that it is not a random distribution, but that the different expression of the genes is suitable as a test, including in the three genes shown was the case.
  • frozen sections of biopsy material normal cervix or cervical carcinoma (HPVI 6 positive) were prepared and subjected to immunohistochemistry with the primary antibody (TEMEM45A antibody (P-18, Santa Cruz, sclOO197 and C-13, Santa Cruz, sclOO196 SERPIN / MASPIN antibody (554292 BD Pharmingen) at 0.005 mg / ml was used as a control, a keratin antibody was used as a detection system using a commercially available kit (Vectastain ABC AK-5002, Vector Labs). The results of these immunohistochemical studies are shown in Figures 8A and B (TEMEM45A) and C (SERPINB5 / maspin).
  • TMEM45A is expressed more strongly in cervical carcinomas than in normal cervix. This suggests that TMEM45A can not only be used at the RNA level as a progression marker, but also at the protein level via antibodies as a prevalence marker.
  • serpinB5 can not only be used as a progression marker at the RNA level, but also at the protein level via antibodies as a prevalence marker.
  • the tested and tested genes are not only suitable surrogate markers for the presence of persistent HPV infection, but also that a change in the gene expression of certain markers is a prognostic marker for the development of cervical cancer and precancerous lesions such as dysplasia represents.
  • CDKN2A SERPINB5
  • TMEM45A RNA is a marker for HPV infection and a marker for the prognosis for the development of cervical cancer.
  • E6 / E7 RNA or an increase in early viral transcription (E4 primer) was a prognostic marker for the progression of persistent HPVl 6 infected humans.
  • the primer pairs suitable for this purpose are localized in the 3 'region of the early viral transcription so that, in addition to the E6 / E7 transcripts, E1 ⁇ E4 transcripts can also be detected.
  • the identified genes are also suitable as a prevalence marker at the protein level, for example via antibodies directed against them.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft diagnostische Marker zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV) und/oder zum Nachweis einer persistierenden HPV-Infektion. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV) und/oder zum Nachweis einer persistierenden HPV-Infektion, die den Schritt des Nachweisens der diagnostischen Marker oder Fragmente davon in einer von dem Menschen isolierten Probe aufweisen, sowie Oligonukleotide, mithilfe derer die diagnostischen Marker nachgewiesen werden können, und Kits, die für den Nachweis der diagnostischen Marker geeignet sind.

Description

Diagnostische Marker für die Bestimmung der Prädisposition der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und für die Bestimmung eingesetzte Oligonukleotide
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von diagnostischen Markern zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus sowie zum Nachweis einer persistierenden Infektion mit dem humanen Papillomvirus.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (im Folgenden auch: HPV), bei dem diagnostische Marker nachgewiesen werden, sowie die Bereitstellung von hierfür geeigneten Oligonukleotiden.
Papillomviren sind weit verbreitete, kleine doppelsträngige DNA- Viren, die Zellen in der Basalschicht der Epidermis bzw. des zervikalen Epithels u.a. des Menschen infizieren können. Während die meisten Infektionen zeitlich begrenzt sind und einen asymptomatischen Verlauf haben, kann eine persistierende Infektion der genitalen Schleimhäute mit bestimmten Papillomviren zu einer Bildung einer zervikalen intraepithelialen Neoplascie (CIN) führen, welche sich wiederum zu einem Zervix-Karzi- nom entwickeln kann.
Gebärmutterhalskrebs ist weltweit der zweithäufigste Krebs bei Frauen, und die weltweite Prävalenz von humanen Papillomviren in Zervix- Karzinomen beträgt 99,7 %. Die Infektion mit bestimmten genitalen HPV-Typen ist ein notwendiger Risikofaktor für die Entstehung eines Zervix- Karzinoms.
Obgleich HPV-Infektionen sehr häufig sind, verläuft eine Infektion in den meisten Fällen transient und wird spontan abgewehrt. Die Persistenz einer HPV-Infektion ist ein notwendiger Risikofaktor für die Entstehung und Progression von zervikalen präkanzerösen Läsionen, jedoch nur ca. 10 % der Frauen mit einer HPV-Infektion zeigen eine Progression zu solchen Läsionen; von diesen entwickeln unbehandelt ca. 20 bis 50 % der Frauen, abhängig vom persistierenden HPV-Typ, innerhalb eines Zeitraums von bis zu 12 Jahren Krebsvorstufen oder Gebärmutterhalskrebs.
Gegenwärtig sind im Stand der Technik keine diagnostischen Tests bekannt, die zwischen persistent mit HPV infizierten Frauen und Frauen, die gesund bleiben, diskriminieren.
Die bisherige Krebsfrüherkennung detektiert Krebsvorstufen mit einem zytologischen Screening, bei dem ein Abstrich vom Muttermund und dem Endozervikalkanal ent- nommen wird, nach Papanicolaou gefärbt und mikroskopisch beurteilt wird (Papani- colaou- Abstrich bzw. Pap-Test). Des Weiteren gibt es Tests zum Nachweis von humanen Papillomviren auf DNA- und RNA-Ebene, die jedoch nicht zwischen den häufigen transienten Infektionen und den eher selteneren persistenten Infektionen unterscheiden können und daher nur einen geringen positiven Vorhersagewert (PPV) von 15 bis 25 % für Krebsvorstufen haben.
Ausgehend von einem solchen HPV-Test alleine würden bzw. werden viele Frauen zu Nachsorgeuntersuchungen geschickt, was eine erhöhte Übertherapie zur Folge hat.
Auf Protein ebene ist der genetische Marker plό beschrieben, der einen Surrogatmar- ker für die HPV-Infektion darstellt, der in Studien jedoch eine zu geringe Spezifität und ebenso einen nur geringen PPV für Krebsvorstufen zeigt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Test bereitzustellen, anhand dessen die Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus vorhergesagt werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verwendung von diagnostischen Markern gelöst, die ausgewählt sind aus zumindest einem der in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker.
Tabelle 1: Diagnostische Marker
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV) und/oder zum Nachwies einer persistierenden HPV-Infektion gelöst, das den Schritt des Nachweisens von zumindest einem der in Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker oder Fragmente davon in einer von dem Menschen isolierten Probe aufweist.
Ferner wird die Aufgabe gelöst durch die Oligonukleotide, die bei der erfindungsgemäßen Verwendung und dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, und mit denen zumindest einer der in Tabelle 1 dargestellten diagnostischen Marker nachgewiesen werden kann, sowie durch einen Kit zur Durchführung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens, der zumindest ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid enthält.
Die Erfinder konnten in aufwendigen Versuchen zeigen, dass es anhand der untersuchten Marker möglich ist, beispielsweise in einer von einem zu untersuchenden Menschen entnommenen Probe diese Marker nachzuweisen, und bei deren Vorhandensein, entweder alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren der anderen aufgeführten Marker, eine Prädisposition des Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs zu bestimmen. Diese Bestimmung kann bspw. anhand des Vergleichs der erfindungsgemäßen Marker mit den entsprechenden Markern aus entsprechenden HPV-negativen Proben und/oder HPV-positiven, aber nicht progressiven Proben erfolgen.
Mit der vorliegenden Erfindung wird daher ein hervorragendes Werkzeug für eine verbesserte Früherkennung für Gebärmutterhalskrebs bereitgestellt, da mit Hilfe der in der vorliegenden Erfindung identifizierten Marker auf dem Boden einer persistierenden HPV-Infektion bis zu 12 Jahre vorher die Entwicklung von hochgradigen Krebsvorstufen mit hoher Signifikanz vorhergesagt werden kann.
Ferner bieten die bereitgestellten Marker, neben der Möglichkeit zur Diskriminierung zwischen Frauen mit progredientem Verlauf und Frauen, die trotz einer HPV-Infektion gesund bleiben, auch die Möglichkeit, zwischen Frauen zu unterscheiden, die keine HPV-Infektion aufweisen, und Frauen, die eine persistierende HPV-Infektion besitzen.
Damit lässt sich auch das Riskio von Frauen, ausgehend von einer persistierenden HPV-Infektion Gebärmutterhalskrebs zu entwickeln, hervorsagen.
Vorliegend werden dabei die Begriffe "progredient" und "progressiv" synonym verwendet, und sollen - so wie auch der Begriff "Progressoren" - die Entwicklung von Dysplasien bzw. Krebsvorstufen und Krebs/Tumoren bedeuten. Die in Tabelle 1 wiedergegebenen Namen sind die - auch in Deutschland - offiziellen Gennamen, bzw. deren offizielle Abkürzung, deren Übersetzung ins Deutsche weder zweckdienlich noch empfohlen ist, um Verwechslungen zu vermeiden. Weitere Informationen zu den genannten Genen, deren Sequenzen und Namen, sind über deren angegebene Abkürzungen bspw. in der Datenbank des National Center für Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) unter dem Suchwerkzeug "Gene" zu finden, wo die Informationen öffentlich zugänglich und dauerhaft gespeichert angelegt sind.
Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn die Marker ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die Marker mit den offiziellen Gennamen SERPINB5, CNADl, CPSF2, CCRL2, TNFAIP6, CD44, TMEM45A, WDR43, NBN, ERMPl, LRPIl, CDKN2A, HPV16E4, HPV16E7, SERPl, ASAHl, HIGDlA, PGHl,die auch in der nachstehenden Tabelle 2 mit ihren jeweiligen Sequenzen, sowie den für die Marker jeweils spezifischen Primern (siehe auch Tabelle 3) und der jeweiligen Produktgröße, aufgeführt sind.
Tabelle 2: ausgewählte diagnostische Marker
Den Erfindern war es möglich, insbesondere für die in Tabelle 2 aufgeführten Marker, deren Sequenzen ebenfalls in der Tabelle angegeben sind, deren Geeignetheit für die Bestimmung der Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen zu untersuchen und nachzuweisen. In eigenen Versuchen zeigten die Erfinder, dass es insbesondere anhand dieser Marker möglich ist, einen hohen positiven Vorhersagewert der Erkrankungen zu erreichen.
Vorliegend wird dabei unter "Diagnostische Marker" jedes bereitgestellte diagnostische Gen bzw. das durch dieses Gen codierte Protein sowie die ausgehend von dem Gen transkribierte RNA verstanden, bzw. auch jedes für das Gen oder das Protein oder die mRNA charakteristisches Sequenzfragment. Dabei wird unter "charakteristisches Sequenzfragment" jeder Sequenzabschnitt des Gens, des hierdurch codierten Proteins bzw. der von dem Gen transkribierten mRNA verstanden, der für das jeweilige Gen, Protein, mRNA spezifisch ist, d.h. in dieser Sequenz nicht in anderen Genen, Proteinen, mRNAs zu finden ist.
Dementsprechend ist in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt, wenn die Vorhersage durch die Bestimmung der Genexpression der diagnostischen Marker erfolgt.
Unter "Genexpression" sind dabei, wie weiter oben ähnlich erläutert, die von den Markergenen abgeleitete/transkribierte mRNA zu verstehen, sowie die wiederum durch die Markergene codierten Proteine. Diese werden vorliegend daher auch als "Marker-mRNA" und "Marker-Proteine" bezeichnet.
Der Nachweis der Genexpression der diagnostischen Marker bietet den Vorteil, dass damit bei der Untersuchung einer menschlichen Probe ein Vergleich zu der Genexpression der entsprechenden Marker in einer gesunden oder einer nichtprogressiven Probe gezogen werden kann. Anhand des Vergleichs kann dann für die einzelnen Markergene ggf. eine Hoch- oder eine Herunterregulierung dieser Markergene bestimmt werden, wonach in diesem Fall die Prädisposition zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs vorhergesagt werden kann.
Dementsprechend ist in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt, wenn die Vorhersage durch den Nachweis von mRNA-Transkripten von zumindest einem der diagnostischen Marker erfolgt, und insbesondere, wenn der Nachweis der mRNA-Transkripte über eine quantitative RT-PCR (Real Time (Echtzeit) Polymerase-Ketten-Reaktion) erfolgt.
Die Real-Time-quantitative-PCR (vorliegend auch kurz qRT-PCR) ist ein Verfahren zur Amplifizierung/Vervielfältigung von Nukleinsäuren, das auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht, und zusätzlich die Quantifizierung der hierdurch gewonnenen DNA ermöglicht. Die Quantifizierung wird in der Regel mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die während eines PCR- Zyklus erfasst werden, wobei die Fluoreszenz proportional mit der Menge der PCR- Produkte zunimmt. Am Ende eines aus mehreren Zyklen bestehenden Laufs wird anhand von erhaltenen Fluoreszenzsignalen die Quantifizierung in der exponentiel- len Phase der PCR vorgenommen.
Die quantitative Real-Time-PCR ist damit ein hervorragendes Werkzeug zur Quantifizierung von Nukleinsäuren.
In bevorzugten Ausführungsbeispielen wird also die mRNA der diagnostischen Marker zunächst in cDNA umgeschrieben und dann für die quantitative Real-Time- PCR eingesetzt, wodurch die Transkripte der diagnostischen Marker quantifiziert werden und basierend hierauf eine Vorhersage zur Prädisposition für die Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs getroffen werden kann.
Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn Sequenzen bzw. Sequenzabschnitte der diagnostischen Marker nachgewiesen werden, die für den jeweiligen diagnostischen Marker charakteristische Fragmente bzw. Abschnitte darstellen, d.h. also Abschnitte, die ganz spezifisch mit der angegebenen Sequenz nur in dem jeweiligen Marker zu finden bzw. nachzuweisen ist.
Hierbei ist insbesondere bevorzugt, wenn bei der quantitativen Real-Time-PCR zumindest ein Oligonukleotid, vorzugsweise ein Oligonukleotidpaar, eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden:
(a) ein in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführtes Oligonukleo- tid/Oligonukleotidpaar oder dessen komplementärer Strang;
(b) Oligonukleotide, die unter stringenten Bedingungen an die in (a) definierten Oligonukleotide hybridisieren, oder Fragmente davon; und
(c) Oligonukleotide, die eine Sequenzhomologie von mindestens 80% zu den Oligonukleotiden aus Tabelle 3 aufweisen, und die wie die Oligonukleotide aus (a) zum Nachweis der hierin offenbarten diagnostischen Marker geeignet sind.
Tabelle 3: Eingesetzte Oligonukleotide/Primer
Unter "Oligonukleotid/-en" werden vorliegend - wie auch im Stand der Technik und im betreffenden Gebiet allgemein - aus wenigen Nukleotiden (DNA oder RNA) aufgebaute Oligomere verstanden, wobei die Nukleotidsequenz in der Regel aus ca. 10 bis 100 Nukleotideinheiten besteht.
Vorliegend werden die Oligonukleotide auch in der Polymerase-Ketten-Reaktion eingesetzt, weshalb die beanspruchten und offenbarten Oligonukleotide auch als "Primer" bezeichnet werden. Auch die in der Tabelle 3 wiedergegebene allgemeine Bezeichnung bestimmter Oligonukleotide mit "forward" (vorwärts) oder "reverse" (rückwärts) stellen im relevanten technischen Gebiet auch in Deutschland übliche Bezeichnungen von Primern/Oligonukleotiden dar, so dass vorliegend auch diese englischen Begriffe gewählt werden, um Klarheit zu verschaffen. Unter "Hybridisierung unter stringenten Bedingungen" wird vorliegend verstanden, dass die Hybridisierung in vitro unter Bedingungen durchgeführt wird, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten. Solche stringenten Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können bspw. der Literatur entnommen werden (siehe Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York). Allgemein bedeutet vorliegend "spezifisch hybridisieren", dass ein Molekül, vorliegend insbesondere ein Oligonukleotid, unter stringenten Bedingungen präferenziell an eine bestimmte Nukleotidsequenz bindet, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von DNA oder RNA vorliegt, und somit nicht, oder zu einem deutlich geringerem Ausmaß, an andere Sequenzen. Stringente Bedingungen sind unter Anderem Sequenz-abhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere (Oligonukleotid-)Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Temperatur etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Oligonukleotidsequenz liegt. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der zu der Zielsequenz komplementären Moleküle zu der Zielsequenz im Gleichgewichtszustand hybridisieren. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens ungefähr 0, 01 bis 1,0 M Natriumionen-Konzentration (oder ein anderes Salz) bei einem pH zwischen 7,0 und 8,3 beträgt und die Temperatur mindestens 30°C für kürzere Moleküle (also z. B. 10-50 Nukleotide) beträgt. Zusätzlich können stringente Bedingungen durch Zugabe destabilisierender Agenzien, wie beispielsweise Formamid, erreicht werden.
So kann die Hybridisierung etwa unter den folgenden Bedingungen stattfinden: Hybridisierungspuffer: 2x SSC, 10x Denhardt's Lösung (Ficoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1 : 1 : 1), 0,1% SDS, 5mM EDTA, 5OmM Na2HPO4, 25011g/ml Heringssperma-DNA ; 50μg/ml tRNA oder 0,25M Natriumphosphatpuffer pH 7,2, ImM EDTA, 7% SDS bei einer Hybridisierungstemperatur von 65°C bis 68°C; Waschpuffer: 0, 2x SSC, 0,1% SDS bei einer Waschtemperatur von 65°C bis 68°C. Die unter c) aufgeführten Oligonukleotide weisen eine Sequenzidentität von mindestens 80%, vorzugsweise von mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu der unter a) angegebenen Oligonukleotide oder Teilen davon auf, bezogen auf die in der Tabelle 3 gezeigten Sequenzen der unter a) angegebenen Oligonukleotide.
Vorzugsweise wird die Sequenzidentität von Oligonukleotiden gemäß c) durch Vergleich mit den in Tabelle 1 angegebenen Sequenzen bestimmt. Wenn zwei unterschiedlich lange Nukleinsäuresequenzen miteinander verglichen werden, bezieht sich die Sequenzidentität vorzugsweise auf den prozentualen Anteil der Nukleotidreste der kürzeren Sequenz, die identisch sind mit den entsprechenden Nukleotidresten der längeren Sequenz. Sequenzidentitäten werden üblicherweise über verschiedene Alignment-Programme, wie z. B. CLUSTAL festgestellt. Allgemein stehen dem Fachmann zur Bestimmung der Sequenzidentität geeignete Algorithmen zur Verfügung, z. B. auch das Programm, das unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (z. B. der Link "Standard nucleotide-nucleotide BLAST") öffentlich zugänglich und ständig zugänglich ist.
In einer anderer Ausführungsform der erfindungsgemäßen diagnostischen Marker ist bevorzugt, wenn die Vorhersage durch den Nachweis der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine erfolgt.
Es versteht sich, dass dieser Nachweis der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine dabei nicht immer für das gesamte Protein erfolgen muss, sondern auch über bestimmte, jeweils spezifische Abschnitte erfolgen kann. Die Proteine können bspw. über spezifische Antikörper, d.h. Antikörper die spezifisch an die Proteine/Proteinfragmente bzw. -abschnitte binden, detektiert werden, bspw. unter Einsatz von Western-Blots und Enzym-gekoppelten Immunabsorptionsassays. Verfahren zum quantitativen Nachweis von Proteinen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt, diesbezüglich wird bspw. auf "Using Antibodies: A laboratory Manual. Ed Harlow/David Lane 1999, CoId Spring Harbor Laboratory Press" verwiesen, das ein entsprechendes Lehrbuch darstellt und Anleitungen zu den beschriebenen Verfahren enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei lediglich ein diagnostische Marker für die Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs verwendet, wohingegen es in anderen Ausführungsformen bevorzugt ist, wenn zwei oder mehrere der in Tabelle 1 oder 2 aufgeführten diagnostischen Marker in Kombination für die Vorhersage verwendet werden.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist bevorzugt, wenn die Vorhersage im Vergleich zu mindestens einem den folgenden Markern erfolgt:
a) dem/ den zu testenden Mar kern entsprechenden Mar kern aus einer entsprechenden HPV-negativen menschlichen Probe; b) dem/den getesteten Markern entsprechenden Markern aus einer HPV- positiven, nicht-progressiven menschlichen Probe; und/oder c) Referenzmarker, die auf konstantem Level in verschiedenen menschlichen Gewebe/Flüssigkeiten vorkommen.
Mit "dem/den zu testenden Markern entsprechenden Markern" ist vorliegend gemeint, dass, wenn in einer zu untersuchenden Probe bspw. der Marker TMEM45A (oder einer der anderen hierin offenbarten erfindungsgemäßen Marker) für die Vorhersage zur Prädisposition verwendet werden soll, dann in einer entsprechenden (bekannten) Probe, die nachweislich HPV-negativ oder die HPV-positiv, aber zumindest nicht progressiv ist, ebenfalls der Marker TMEM45A, insbesondere dessen Genexpression, bestimmt wird.
Insbesondere ist bevorzugt, wenn die Vorhersage durch den Nachweis einer Veränderung, insbesondere einer Herunter- und/oder Hochregulierung, der Genexpression der diagnostischen Marker im Vergleich zu der Genexpression von zumindest einem der Marker a) bis c) erfolgt: a) dem/den getesteten diagnostischen Markern entsprechenden Markern aus einer entsprechenden HPV-negativen menschlichen Probe; b) dem/den getesteten diagnostischen Markern entsprechenden Markern aus einer HPV-positiven, nicht-progressiven menschlichen Probe; und/oder c) Referenzmarker, die auf konstantem Level in verschiedenen menschlichen Gewebe/Flüssigkeiten vorkommen.
Die Erfinder haben in eigenen Versuchen nachgewiesen, dass einerseits bestimmte der Markergene im Vergleich zu den entsprechenden Markern aus einer HPV- negativen bzw. HPV-positiven, aber nicht-progressiven Probe, in ihrer Genexpression entweder hoch- oder herunterreguliert sind, und dass diese unterschiedliche Genexpression der Marker zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs eingesetzt werden kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist bevorzugt, wenn der Schritt des Nachwei- sens über die Bestimmung der Genexpression der diagnostischen Marker in der isolierten Probe erfolgt, und insbesondere wenn er über die Bestimmung der Transkripte der diagnostischen Marker und/oder der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine erfolgt. Hierbei ist bevorzugt, wenn zum Nachweis der diagnostischen Marker ein Oligonukleotid eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus den in der Tabelle 3 aufgeführten Sequenzen.
Die weiter oben für die erfindungsgemäße Verwendung dargestellten Begriffsdefinitionen und Vorteile gelten auch für das erfindungsgemäße Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Schritte auf:
(a) Isolieren von mRNA aus einer von dem Menschen enthaltenen Probe; (b) Umschreiben der in Schritt (a) isolierten mRNA in cDNA; (c) In-Kontakt-Bringen der in Schritt b) gewonnenen cDNA Probe mit zumindest einem Oligonukleotid, das ausgewählt ist aus den in der Tabelle 3 aufgeführten Oligonukleotiden;
(d) Durchführen einer quantitativen Real-Time-PCR zur Herstellung von Amplifizierungsprodukten der in cDNA umgeschriebnen mRNA der diagnostischen Marker; und
(e) Bestimmung der in Schritt (d) gewonnenen Amplifizierungsprodukte.
Dabei ist in einer Weiterbildung bevorzugt, wenn das Verfahren den zusätzlichen Schritt (f) aufweist:
(f) Abgleichen der in Schritt (e) bestimmten Amplifizierungsprodukte mit diesen entsprechenden Amplifizierungsprodukten von entsprechenden Vergleichsmarkern aus einer HPV-negativen entsprechenden menschlichen Probe und/oder einer entsprechenden HPV-positiven, aber nichtprogressiven menschlichen Probe, wobei eine Veränderung, insbesondere eine Herunter- und/oder Hochregulierung, der Genexpression der diagnostischen Marker im Vergleich zu den Vergleichsmarkern die Prädisposition eines Menschen, Gebärmutterhalskrebs zu entwickeln, zeigt.
Die Isolierung der mRNA kann dabei mit im Stand der Technik bekannten Mitteln erfolgen, bspw. mittels des RNeasy® Mini- Kits der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland. Die Umschreibung der so isolierten mRNA kann ebenfalls mit im Stand der Technik bekannten Mitteln erfolgen, bspw. mittels des Reverse-Transkriptase-Kits der Firma Qiagen. Es versteht sich, dass auch andere Mittel und Verfahren von anderen Firmen zum Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind; diesbezüglich wird auf das Standardwerk von Sambrook und Maniatis verweisen (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausgabe Januar 2001). Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, im Übrigen wie auch bei der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt, wenn parallel zum Nachweis der diagnostischen Marker Referenzmarker nachgewiesen werden.
Dabei soll vorliegend "Referenzmarker" jeder diagnostische Marker bzw. jedes menschliche Gen bedeuten, das ubiquitär vorkommt und auf konstantem Level in verschiedenen Genen exprimiert wird, wobei die Expression der Gene unter verschiedenen Bedingungen konstante bleibt.
Vorliegend sind für die erfindungsgemäße Verwendung sowie für das Verfahren insbesondere zumindest eines der folgenden Referenzgene, bzw. deren Genexpressionsprodukte bevorzugt, die die folgenden offiziellen Gennamen besitzen: ASAHl (N- Acylsphingosin-Amidhydrolase 1, HIGDlA (HIGl Domain Family Member IA; Hyoxie-induzierbares Gen 1), SERPl (Stress-assoziiertes Endoplasmatisches Retikulum-Protein 1), PGKl(Phosphoglyceratkinase).
Anhand der Referenzgene können bspw. die Transkriptionsmuster der mRNA zwischen verschiedenen Proben standardisiert werden, und somit dann die erhaltenen relativen Mengen miteinander verglichen werden.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung sowie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ferner bevorzugt, wenn die zu untersuchende, von einem Menschen isolierte Probe eine Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe ist, und insbesondere eine Biopsie-, eine Zervixzellenprobe und/oder ein Papanicolaou-Abstrich ist.
Bei den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden ist bevorzugt, wenn sie ausgewählt sind aus zumindest einem der folgenden:
(a) ein in Tabelle 3 aufgeführtes Oligonukleotid oder dessen komplementärer Strang;
(b) Oligonukleotide, die unter stringenten Bedingungen an die in (a) definierten Oligonukleotide hybridisieren, oder Fragmente davon; und (c) Oligonukleotide, die eine Sequenzhomologie von mindestens 80%, vorzugsweise von mindestens 85%, 90%, 95%, 98% zu den in (a) definierten Oligonukleotiden besitzen und mit denen die diagnostischen Marker ebenfalls nachgewiesen werden können
Zu den unter den Alternativen a) , b) und c) aufgeführten Oligonukleotiden, deren Bestimmung bzw. Definition und/oder Auffinden gelten die weiter oben für die erfindungsgemäße Verwendung ausgeführten Bestimmungen, Definitionen, Mittel zum Auffinden.
Der erfindungsgemäße Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist dabei zumindest ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, vorzugsweise ein in Tabelle 3 aufgeführtes Oligonukleotidpaar, oder die in Tabelle 3 aufgeführten Oligo- nukleotidpaare, die unter stringenten Bedingungen an die in der Tabelle 3 aufgeführten Oligonukleotidpaare hybridisieren, oder Fragmente davon, auf.
Es versteht sich, dass neben dem zumindest einen Oligonukleotid bzw. dem Oligo- nukelotidpaar weitere, für das erfindungsgemäße Verfahren im Stand der Technik bekannte Reagenzien und/oder Substanzen enthalten sein können, mithin also Mittel, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann. Solche Mittel, Reagenzien, Substanzen sind insbesondere Mittel zum Durchführen einer Polymerase-Ketten-Reaktion, also bspw. die hierfür notwendigen Puffer und Enzyme, Nukleotide. Dem Fachmann wird klar sein, welche Reagenzien zusammen mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden in dem Kit enthalten sein müssen, um das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich durchführen zu können.
Auch für die im erfindungsgemäßen Kit vorliegenden Oligonukleotide/Oligonukleo- tidpaare gelten die weiter oben für die erfindungsgemäße Verwendung ausgeführten Bestimmungen, Definitionen, und Mittel zum Auffinden.
Der Kit kann ferner Oligonukleotide zum Nachweis von zumindest einem Referenz- marker enthalten, insbesondere zumindest eines der folgenden: ASAHl (N- Acylsphingosin-Amidhydrolase 1, HIGDlA (HIGl Domänen Familienmitglied IA; Hypoxie-induzierbares Gen 1), SERPl (Stress-assoziiertes Endoplasmatisches Retikulum-Protein 1), PGKl (Phosphoglyceratkinase) bzw. Genexpressionsprodukte davon.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von Antikörpern, die an Proteine binden, die von Genen exprimiert werden, die in der Tabelle 1 aufgeführt sind, zum Nachweis einer persistierenden Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV), insbesondere eines gegen Temem45A, SerpinB5 oder Cdkn2A gerichteten Antikörpers
Es versteht sich, dass die obenstehend beschriebenen und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird in der nachfolgenden Beschreibung der Beispiele bzw. Ausführungsbeispiele sowie anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Übersicht über die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Kohortenstudie
Fig. 2 ein Balkendiagramm, das die Korrelation von Microarray-
Experimenten, bei denen Veränderungen in der Genexpression in Proben bestimmt wurden, und quantitativen Real-Time-PCR-Experimen- ten, mit welchen ebenfalls die Veränderung der Genexpression in Proben untersucht wurden, graphisch darstellt, und für dessen Erstellung die Ergebnisse der HPV-negativen und HPV-positiven Proben verglichen wurden; und
Fig. 3 ein Balkendiagramm, das die Korrelation von Microarray-Experimen- ten, bei denen Veränderungen in der Genexpression in Proben bestimmt wurden, und quantitativen Real-Time-PCR-Experimenten, mit welchen ebenfalls die Veränderung der Genexpression in Proben untersucht wurden, graphisch darstellt, und für dessen Erstellung die Ergebnisse aus der Gruppe der HPV-positiven Progressoren und der HPV- positiven nicht-Progressoren verglichen wurden.
Fig. 4 die statistische Auswertung der qPCR-Daten von pl6/CDKN2A,
SERPINB5, TMEM45A, mit PGKl als Referenzgen, wobei HPV-negativ (N, n=19) mit HPVl 6 persistent (P, n=81) verglichen wurde (Mann- Whitney-Test (zweiseitig));
Fig. 5 die ROC-Analyse der qPCR-Daten von pl6/CDKN2A, SERPINB5,
TMEM45A, wobei HPV-negativ (N, n=19) mit HPV16 persistent (P, n=81) verglichen wurde (Mann -Whitney-Test (zweiseitig));
Fig. 6 die statistische Auswertung der qPCR-Daten von pl6/CDKN2A,
SERPINB5, TMEM45A, mit PGKl als Referenzgen, wobei keine Progression (N, n=37) mit schweren Dysplasien (P, n=20) verglichen wurde (Mann- Whitney-Test (zweiseitig));
Fig. 7 die ROC-Analyse der qPCR-Daten von pl6/CDKN2A, SERPINB5,
TMEM45A, wobei keine Progression (N, n=37) mit schweren Dysplasien (P, n=20) verglichen wurde (Mann- Whitney-Test (zweiseitig)); und
Fig. 8 Immunhistochemische Untersuchungen an Gefrierschnitten von
Biopsiematerial (normale Zervix oder Zervixkarzinom (HPV16-pos)), mit TEMEM45A-Antikörpern: P-18, Santa Cruz: A und C-13, Santa Cruz: B, SERPINB5/Maspin-Antikörper: 554292, BD Pharmingen: C.
Detaillierte Beschreibung der Figuren und der Ausführungsbeispiele
Material und Methoden: Wie bereits weite oben erwähnt, stammt das Untersuchungsmaterial für die vorliegende Erfindung aus einer dänischen Kohorten-Studie, für die Frauen zwischen 20 und 29 Jahren zufällig ausgewählt wurden. Figur 1 zeigt eine Übersicht des in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Probenmaterials. So wurden, in den Jahren 1991 bis 1993 Proben von Endo- und Ektozervix von ca. 11088 dänischen Frauen entnommen, sowie Pap-Abstriche vorgenommen; beide Proben wurden in Puffer überführt und dahingehend untersucht, ob diese HPV-negativ oder HPV-positiv waren. In den Jahren 1993 bis 1995 erfolgte die zweite Untersuchung von 78% der zuvor untersuchten Frauen, und zehn Jahre später, im Jahr 2005, erfolgte die Verlin- kung mit der Pathologie-Datenbank, wonach die Frauen identifiziert wurden, die leichte bis schwere Dysplasien/Karzinome entwickelten.
Fig. 1 erläutert auch schematisch, dass unter einer transienten Infektion HPV- Infektionen zu verstehen sind, die nach einem bestimmten Zeitraum (2 Jahre) nicht mehr nachweisbar sind und damit nach dem Zeitraum keine HPV-Infektion mehr vorliegt, (also: HPV-Positive bei der ersten Untersuchung wurden bei der zweiten Untersuchung als HPV-Negative diagnostiziert). Bei diesen kam es dann, ebenso wie bei bereits mit der ersten Untersuchung diagnostizierten HPV-Negativen, zu keiner Progression. IM Gegensatz hierzu zeigten die auch bei der zweiten Untersuchung HPV-Positiven eine Progression.
Für die Genexpressionsanalyse mittels Microarray, mit dem die Genexpression vieler Gene aus einer geringen Menge Probenmaterial gleichzeitig bestimmt werden kann, wurden Profile von 52 Proben (entnommen in der zweiten Phase) der dänischen Kohorte bestimmt und untereinander verglichen. Die Analyse wurde bezüglich HPV- Negativen gegen HPV-Positive, HPVlό-positive ohne Progression, d.h. ohne zytologi- sche Auffälligkeiten nach zehn Jahren Follow-up) gegen HPV16-positive Progresso- ren, d.h., während des 10-Jahres Follow-ups (Weiterverfolgung) wurde eine leichte Dysplasie, eine schwere Dysplasie, ein Carcinoma in situ (im Folgenden Auch: CIS), oder Krebs/ein Karzinom diagnostiziert. Die Gene, für die eine differentielle Genexpression nachgewiesen wurde, sind in den obigen Tabellen 1 und 2 mit ihrem jeweiligen Gennamen aufgeführt. Durch den Vergleich der Gruppen wurden einerseits Gene identifiziert, die in HPV- Negativen Proben eine andere Expression zeigten als die HPVlό-positiven Probe, und andererseits wurden Gene identifiziert, deren Expression unterschiedlich war zwischen Frauen, die keine histologische Veränderungen während des Follow-ups aufwiesen, und Frauen, die im weiteren Verlauf Dysplasien und Karzinome entwickelten.
Um die mittels der Microarray-Analyse gewonnenen Erkenntnisse über die differen- tielle Genexpression zu validieren, wurden die Proben mittels quantitativer Real- Time-(Echtzeit) Polymerase Kettenreaktion untersucht. Hierzu wurden bisher die folgenden Proben untersucht: 19 Proben HPV-negativ (keine Dysplasie bis zur zweiten Untersuchung), sowie insgesamt 81 Proben HPV16-positiv, davon 37 nichtprogressive (ohne Dysplasieentwicklung) und 44 progressive, davon wiederum 10 Proben mit leichten Dysplasien, 20 Proben mit schweren Dysplasien, 12 mit CIS und 2 mit Krebs/Karzinom.
Die Gesamt-RNA der bei -80°C eingefrorenen Proben wurde mittels eines modifizierten RNeasy Mini-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert, wofür die Proben kurz und vorsichtig aufgetaut wurden.
Entweder wurde die so isolierte RNA dann direkt mittels des Reverse-Transcription- Kits (Qiagen) in cDNA umgeschrieben, oder aber zunächst noch zur Generierung von cRNA amplifiziert, und dann in cDNA umgeschrieben.
Für die quantitative Real-Time-PCR wurden Primer entworfen, die für die einzelnen Gene spezifisch sind. Die schließlich entwickelten Primer erfüllten demnach die folgenden Eigenschaften: a) die Sequenz, an die der Primer bindet, kommt im menschlichen Genom nur einmal vor; b) die hybridisierende Sequenz war 18 bis 23 Nukleotide lang; c) die Schmelztemperatur lag zwischen 580C und 62°C (Optimum: 600C); d) der GC-Gehalt der Komplettsequenz war zwischen 30% und 80% (Optimum: 50%). Die schließlich generierten Primer sind in Tabelle 2, rechte Spalte, sowie in Tabelle 3 aufgeführt.
Die quantitative Real-Time-PCR wurde im LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Deutschland) durchgeführt, wofür die spezifischen Primer und SYBER Green verwendet wurde, das sich in doppelsträngige DNA einlagert. Durch diese Bindung wir die emittierte Fluoreszenz bei gleicher Anregungsintensität um ein Vielfaches verstärkt. Im LightCycler wird während der Amplifikation nach jedem Zyklus am Ende der Elongationsphase die Fluoreszenz gemessen. Der jeweilige Ansatz für die Real-Time- PCR war wie folgt:
20 μl Ansatz: 10 μl SybrGReen I Master (Roche)
2 μl forward Primer (3 μM) 2 μl reverse Primer (3 μM) 1 μl H2O (DEPC-behandelt)
Anschließend wurden jeweils 5 μl der entsprechenden cDNA hinzugefügt und folgendes Programm durchgeführt:
Initialer Aktivierungsschritt: 950C 5 min
Denaturierung: 94°C 15 sec
Primerbindung: 550C 30 sec
Produkt-Amplifikation: 72°C 30 sec
Schmelzkurve: 95°C 5 min
65°C 1 min
72°C Ende 4°C Mittels der dazugehörigen Software (Roche) konnte der Crossing Point (CP-)-Wert, also der Zyklus, an dem sich die Signalintensität der cDNA-Probe von der Hintergrundfluoreszenz abhebt, bestimmt werden. Dieser CP-Wert dient als indirekter Indikator der Genexpression, d.h. Proben mit einer hohen Genexpression eines Gens zeigen kleinere CP- Werte als eine Probe mit geringerer Genexpression.
Zusätzlich zu den Genen, die in den Microarrays eine unterschiedliche Expression zwischen den zu untersuchenden Gruppen zeigten, wurden auch Referenzgene gemessen, die fast keine Unterschiede zeigten. Mittels der Referenzgene wurden die untersuchten Gene normalisiert. Jede PCR umfasste mindestens eine Template- Kontrolle und zwei Positivkontrollen. Für den Vergleich der Ergebnisse aus den Microarray-Tests und der qRT-PCR wurde die n-fache Expression mit Hilfe der folgenden Formel berechnet:
n-fache Expression = (Effizienz Zielgen) ΔcpZid8en (Kontroiie-probe) 7
(Effizienz Referenz) ΔcpReferenz (Kontroiie-probe)
Ergebnisse
In der Tabelle 2 sind in der linke Spalte diejenigen Namen der Markergene aufgeführt, deren Expression mittels der qRT-PCR untersucht wurden. In der zweiten Spalte findet sich die Sequenz dieser Gene, und in der dritten Spalte die für die Amplifikation eines bestimmten, charakteristischen bzw. spezifischen Abschnitts der Markergene eingesetzten Oligonukleotide. Ferner ist in der dritten Spalte auch die Größe des Reaktionsproduktes angegeben.
Ausgewählt wurden die folgenden Marker, bzw. Gene:
Chemokin (C-C Motiv) Rezeptor-ähnliches Protein 2 (CCRL2), Tumornekrosefaktor, alpha-induziertes Protein 6 (TNFAIP6), die beide in der Expression verringert waren; CD44-Antigen, KIAA1815 und das Transmembran-Protein45A (TMEM45A), deren Expression sämtlich induziert war. Die vorstehenden Gene wurden beim Vergleich von HPV-positiven Proben gegen HPV-negativen Proben identifiziert.
Ferner wurden die folgenden Marker beim Vergleich der HPV16-positiven, nichtprogressiven Proben mit den HPVlό-positiven, progressiven Proben identifiziert:
Serpin-Peptidase-Inhibitor, Member 5 (SERPINB5), Cullin-assoziiertes und Neddylie- rungs-dissoziiertes Protein 1 (CANDl), Spaltungs- und Polyadenylierungs-spezifischer Faktor 2 (CPSF2), Splice-Faktor 3b, Untereinheit 3 (SF3B3), deren Genexpression sämtlich induziert war, und SEC14-ähnliches Protein 1 (SEC14L1), dessen Genexpression verringert war.
Als Referenzgene, die zur Normalisierung der Proben verwendet wurden, wurden die folgenden Gene eingesetzt:
ASAHl (N-Acylsphingosin-Amidhydrolase 1, HIGDlA (HIGl Domänen Familienmitglied IA; Hypoxie-induzierbares Gen 1), SERPl (Stress-assoziiertes Endoplasmatisches Retikulum-Protein 1), PGKl (Phosphoglyceratkinase), bzw. Genexpressionsprodukte davon.
Weitere Informationen zu den genannten Genen sind, wie bereits weiter oben erwähnt, über deren angegebene Abkürzungen bspw. in der Datenbank des National Center für Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) unter dem Suchwerkzeug "Gene" zu finden.
Da viele der aus den Proben extrahierte RNAs eine geringe Konzentration zeigten, wurden für die Microarrays und auch für einen Versuchsansatz der qRT-PCR eine zwei-Runden-Amplifikation der RNA zur Generierung con cRNA durchgeführt, um die RNA-Mengen zu vervielfältigen. Die amplifizierte RNA (und auch nicht- amplifizierte RNA) wurde in cDNA umgeschrieben und für die qRT-PCR eingesetzt. Um die n-fache Expression eines Gens aus den Microarray-Experimenten mit denen der qRT-PCR vergleichen zu können, wurde die veränderte Expression der einzelnen Gene mit einer alternativen Methode berechnet: Hierzu wurde der Median der CP- Werte der einzelnen Proben in einer Gruppe berechnet. Als Referenz dient der Median der PGKl-Werte der jeweiligen Gruppen.
a) Es zeigte sich, dass diejenigen Gene, welche in den Microarrays zwischen HPV- negativen und HPV-positiven Proben eine unterschiedliche Expression aufgezeigt hatten, eine annähernd gleiche Veränderung der Expression in der qRT- PCR zeigten.
Die qPCR Daten der cRNA wurden zusätzlich auf statistische Relevanz getestet. Es zeigte sich, dass in der Gruppe der HPV-negativen gegen die HPVl 6- positiven Proben alle Gene, die in den Microarrays identifiziert wurden, einen signifikanten Expressionsunterschied zeigten, also in allen statistischen Tests p-Werte < 0,05 oder im Fall von TMEM45A sogar < 0,000.
In Fig. 4 sind die Ergebnisse dieser statistischen Auswertung der qPCR-Daten für pl6/CDKN2A, SERPINB5, TEMEM45A gezeigt, wobei PGKl als Referenzgen verwendet wurde. Es zeigte sich, dass alle Expressionsunterschiede hoch- signifikant sind.
In Fig. 2 ist die Korrelation von Daten aus Microarray-Experimenten mit Daten von qRT-PCR-Experimenten gezeigt. Wie dem in Fig. 2 dargestellten Balkendiagramm gezeigt, korreliert beim Vergleich von HPV-negativen mit HPV16- positiven Proben das Ausmaß der Genexpressionsveränderungen in qPCR- Experimenten mit cRNA, der Original-RNA und den Microarray-Analysen bei TMEM45A und CD44. Bei TNFAIP6 und CCRL2 wurde eine Deregulation in den Microarray-Analysen beobachtet, die nicht in den qPCR-Experimenten der Original-RNA bestätigt werden konnte. CANDl ist in cRNA und Original-RNA ähnlich stark reguliert, SERPINB5 ist in der Original-RNA stärker als in der cRNA dereguliert.
Ferner wurde eine sogenannte ROC Analyse ("Receiver-Operator- Characteristics") der qPCR-Daten durchgeführt, bei der Analyse-Strategien bewertet und optimiert werden. Die ROC-Kurve stellt visuell die Abhängigkeit der Effizienz mit der Fehlerrate für verschiedene Parameterwerte dar. Ist der dabei ermittelte AUC-W ert ("Area under the curve"; Fläche unterhalb der Kurve) > 0,5, zeigt dies, dass es sich um keine Zufalls Verteilung handelt, sondern dass die unterschiedliche Expression der Gene als Test geeignet ist. Dies konnte für pl6/CDKN2A, SERPINB5 und TEMEM45A gezeigt werden (siehe Fig. 5).
Beim quantitativen Vergleich der Gruppe der Progressoren mit den Nicht- Progressoren zeigte sich für SERPINB5 und TMEM45A ein deutlicher Expressionsunterschied (siehe Fig. 3). CANDl zeigte im Gegensatz zu Microarray und cRNA-Analyse keine Deregulation in der Original-RNA. Im Einklang mit der Signifikanzanalyse konnte keine Deregulation für CCRL2, CD44 oder TNFAIP6 beobachtet werden.
In weiteren Versuchen sollten weitere Marker für die Progression und Persistenz von HPV-Infektionen untersucht werden. So wurden in einem Versuchsansatz die Mengen an E6/E7-Transkripten bestimmt. Hierzu wurde ein E7-spezifisches Primerpaar, welches den 5'-Bereich der viralen RNA detektiert und ein E4-spezifisches Primerpaar, welches den 3'-Bereich der HPV16 Transkripte detektieren kann, entwickelt (siehe Tabelle 2, linke Spalte und Tabelle 3, rechte Spalte)
Zusätzlich wurden die Transkriptmengen an CDKN2A, das für zwei strukturell unterschiedliche Proteine, pl6 und pl4ARF, codiert, sowie an SERPINB5 und TMEM45A untersucht. In der Original-RNA wurden die relativen mRNA-Mengen von HPVl 6E4, HPV16E7 und CDKN2A durch qPCR bestimmt. Die Auswertung erfolgte nach Normalisierung mit PGKl. Statistische Unterschiede wurden, wie bereits für die anderen, weiter oben geschilderten Versuche, mittels des Wilcoxon-Tests berechnet. Die Auswertung ergab für die viralen Transkripte E4 und E7 eine erwartet hohe Signifikanz zwischen HPV-positiven und HPV-negativen Proben (p = 0,0002). Auch für die Expression des CDKN2A Gens war ein signifikanter Unterschied zwischen diesen Gruppen festzustellen (p = 0,00029). Auch zwischen den beiden HPV-positiven Gruppen (Progressoren/Nicht-Progressoren) war für E4 und für CDKN2A ein signifikanter Unterschied festzustellen (p = 0,02 bzw. p = 0,0053).
Fig. 6 zeigt ferner die Ergebnisse der statistischen Auswertung der qPCR-Daten mit PGKl als Referenzgen beim Vergleich zwischen keiner Progression (in Fig. 6: N; n = 37) und schweren Dysplasien (in Fig. 6: P; n = 20). Hier zeigte sich, dass u.a. für CDKN2A, SERPINB5, und TMEM45A die Expressionsunterschiede signifikant sind.
In Fig. 7 ist analog zu Fig. 5 die ROC-Analyse der qPCR-Daten von pl6/CDKN2A, SERPINB5, TMEM45A gezeigt, wobei wiederum ein AUC-Wert >0,5 anzeigt, dass es sich um keine Zufallsverteilung handelt, sondern dass die unterschiedliche Expression der Gene als Test geeignet ist, was u.a. bei den gezeigten drei Genen der Fall war.
Im Weiteren wurden Gefrierschnitt von Biopsiematerial (normale Zervix oder Zervixkarzinom (HPVl 6-positiv) angefertigt, und immunhistochemische Untersuchungen damit durchgeführt. Dabei wurde der Primärantikörper (TEMEM45A Antikörper (P-18, Santa Cruz, sclOO197 und C-13, Santa Cruz, sclOO196); SERPIN/Maspin Antikörper (554292 BD Pharmingen) mit 0,005 mg/ml eingesetzt; al Kontrolle diente ein Keratinantikörper. Als Detektions- system wurde ein kommerziell erhältliches Kit (Vectastain ABC AK-5002, Vec- tor Labs) verwendet. Die Ergebnisse dieser immunhistochemischen Untersuchungen sind in Fig. 8A und B (TEMEM45A) und C (SERPINB5/Maspin) gezeigt. Die unterschiedliche Färbung belegte, dass TMEM45A stärker in Zervixkarzinomen als in normaler Zervix exprimiert wird. Dies legt nahe, dass TMEM45A nicht nur auf RNA Ebene als Progressionsmarker verwendet werden kann, sondern auch auf Proteinebene über Antikörper als Prävalenzmarker geeignet ist.
Ähnliches gilt für SERPINB5, da auch hier eine unterschiedliche Färbung beobachtet werden konnte, was belegte, dass auch SerpinB5 nicht nur auf RNA Ebene als Progressionsmarker verwendet werden kann, sondern auch auf auch auf Proteinebene über Antikörper als Prävalenzmarker geeignet ist.
Diskussion
Mit den vorliegenden Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass die getesteten und untersuchten Gene nicht nur geeignete Surrogatmarker für das Vorliegen einer persistenten HPV-Infektion sind, sondern auch dass eine Veränderung der Genexpression der bestimmten Marker einen prognostischen Marker für die Entstehung von Gebärmutterhalskrebs und Krebsvorstufen wie Dysplasien darstellt.
So konnte anhand der oben dargestellten Versuche gezeigt werden, dass bspw. die Erhöhung der CDKN2A-, SERPINB5-, TMEM45A- RNA ein Marker für eine HPV- Infektion und ein Marker für die Prognose zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs ist.
Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung der Menge an E6/E7 RNA, bzw. eine Erhöhung der frühen viralen Transkription (E4 Primer) einen prognostischen Marker für die Progression von persistent HPVl 6 infizierten Menschen darstellt. Die hierbei geeigneten Primerpaare sind im 3'-Bereich der frühen viralen Transkription lokalisiert, so dass sich zusätzlich zu den E6/E7 Transkripten auch E1ΛE4 Transkripte nachweisen lassen. Ferner konnte noch belegt werden, dass die identifizierten Gene auch auf Proteinebene - bspw. über gegen diese gerichtete Antikörper - als Prävalenzmarker geeignet sind.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von diagnostischen Markern zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder - Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV) und/oder zum Nachweis einer persistierenden Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV), wobei die Marker ausgewählt sind aus zumindest einem der in Tabelle 1 gezeigten diagnostischen Marker.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker ausgewählt sind aus zumindest einem aus der Gruppe umfassend die in Tabelle 2 aufgeführten Marker.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass einer oder mehrere der folgenden Marker eingesetzt wird: TMEM45A, SERPINB5, CDKN2A.
4. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch die Bestimmung der Genexpression der diagnostischen Marker erfolgt.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch den Nachweis von mRNA-Transkripten von zumindest einem der diagnostischen Marker erfolgt.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der mRNA-Transkripte über eine quantitative RT-PCR (Real Time (Echtzeit) Po- lymerase-Ketten-Reaktion) erfolgt.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur quantitativen RT-PCR zumindest ein Oligonukleotid eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden: (a) ein in Tabelle 3 aufgeführtes Oligonukleotid oder dessen komplementärer Strang;
(b) Oligonukleotide, die unter stringenten Bedingungen an die in (a) definierten Oligonukleotide hybridisieren, oder Fragmente davon; und
(c) Oligonukleotide, die eine Sequenzhomologie von mindestens 80% zu den in (a) definierten Oligonukleotiden besitzen.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch den Nachweis der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine erfolgt.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch den Nachweis von einem der in der Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker erfolgt.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch den Nachweis von einer Kombination aus zwei oder mehreren der in Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker erfolgt.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage im Vergleich zu mindestens einem den folgenden Markern erfolgt:
a) dem/den getesteten Markern entsprechenden Markern aus einer entsprechenden HPV-negativen menschlichen Probe; b) dem/den getesteten Markern entsprechenden Markern aus einer HPV- positiven, nicht-progressiven menschlichen Probe; und/oder c) Referenzmarker, die auf konstantem Level in verschiedenen menschlichen Gewebe/Flüssigkeiten vorkommen.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorhersage durch den Nachweis einer Veränderung, insbesondere ei- ner Herunter- und/oder Hochregulierung, der Genexpression der diagnostischen Marker im Vergleich zu der Genexpression von zumindest einem der Marker a) bis c) erfolgt:
a) dem/den getesteten diagnostischen Markern entsprechenden Markern aus einer entsprechenden HPV-negativen menschlichen Probe; b) dem/den getesteten diagnostischen Markern entsprechenden Markern aus einer HPV-positiven, nicht-progressiven menschlichen Probe; und/oder c) Referenzmarker, die auf konstantem Level in verschiedenen menschlichen Gewebe/Flüssigkeiten vorkommen.
13. Verfahren zur Vorhersage der Prädisposition eines Menschen zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und/oder -Krebsvorstufen bei einer Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV) und/oder zum Nachweis einer persistierenden HPV-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass es den Schritt des Nachweisens von zumindest einem der in Tabelle 1 aufgeführten diagnostischen Marker oder Fragmente davon in einer von dem Menschen isolierten Probe aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Nachweisens über die Bestimmung der Genexpression der diagnostischen Marker in der isolierten Probe erfolgt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Nachweisens über die Bestimmung der Transkripte der diagnostischen Marker und/oder der durch die diagnostischen Marker codierten Proteine erfolgt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis der diagnostischen Marker ein Oligonukleotid eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus den in der Tabelle 2 aufgeführten Sequenzen.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist:
(a) Isolieren von mRNA aus einer von dem Menschen enthaltenen Probe;
(b) Umschreiben der in Schritt (a) isolierten mRNA in cDNA;
(c) In-Kontakt-Bringen der in Schritt b) gewonnenen cDNA Probe mit zumindest einem Oligonukleotid, das ausgewählt ist aus den in der Tabelle 3 aufgeführten Oligonukleotiden;
(d) Durchführen einer quantitativen RT-PCR zur Herstellung von Amplifi- zierungsprodukten der in cDNA umgeschriebnen Transkripte der diagnostischen Marker; und
(e) Bestimmung der in Schritt (d) gewonnenen Amplifizierungsprodukte.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es den zusätzlichen Schritt (f) aufweist:
(f) Abgleichen der in Schritt (e) bestimmten Amplifizierungsprodukte mit diesen entsprechenden Amplifizierungsprodukten von entsprechenden Vergleichsmarkern aus einer HPV-negativen entsprechenden menschlichen Probe und/oder einer entsprechenden HPV-positiven, aber nichtprogressiven menschlichen Probe, wobei eine Veränderung, insbesondere eine Herunter- und/oder Hochregulierung, der Genexpression der diagnostischen Marker im Vergleich zu den Vergleichsmarkern die Prädisposition eines Menschen, Gebärmutterhalskrebs zu entwickeln, zeigt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass parallel zum Nachweis der diagnostischen Marker Referenzmarker nachgewiesen werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Biopsie-, eine Zervixzellenprobe und/oder ein Papanicolaou-Abstrich ist.
22. Oligonukleotid zum Nachweis von zumindest einem der in Tabelle 2 dargestellten diagnostischen Marker.
23. Oligonukleotid nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden:
(a) ein in Tabelle 3 aufgeführtes Oligonukleotid oder dessen komplementärer Strang;
(b) Oligonukleotide, die unter stringenten Bedingungen an die in (a) definierten Oligonukleotide hybridisieren, oder Fragmente davon; und
(c) Oligonukleotide, die eine Sequenzhomologie von mindestens 80%, vorzugsweise von mindestens 85%, 90%, 95%, 98% zu den in (a) definierten Oligonukleotiden besitzen und mit denen die diagnostischen Marker ebenfalls nachgewiesen werden können.
24. Kit zur Durchführung einer der in den Ansprüchen 13 bis 21 beanspruchten Verfahren, wobei der Kit zumindest ein Oligonukleotid gemäß Anspruch 20 oder 21 enthält.
24. Kit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass er die in Tabelle 3 paarweise aufgeführten Oligonukleotidpaare aufweist oder Oligonukleotidpaa- re, die unter stringenten Bedingungen an die in der Tabelle 3 aufgeführten Oligonukleotidpaare hybridisieren, oder Fragmente davon.
25. Kit nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass er ferner Oligonukleotide zum Nachweis eines Referenzmarkers enthält.
26. Kit nach Anspruch 25, Verfahren nach Anspruch 19, oder Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzmarker ausgewählt sind aus zumindest einem von N-Acylsphingosin-Amidhydrolase 1, HIGl Domain Family Member IA (Hypoxie-induzierbares Gen 1), Stress-assoziiertes Endoplasmatisches Retikulum- Protein 1, Phosphoglyceratkinase, bzw. Genexpressionsprodukte davon.
27. Verwendung von Antikörpern, die gegen zumindest eines der Proteine gerichtet sind, die von den in Tabelle 1 aufgeführten Genen exprimiert werden, zum Nachweis einer persistierenden Infektion mit dem humanen Papillomvirus (HPV), insbesondere eines gegen Temem45A, SerpinB5 oder Cdkn2A gerichteten Antikörpers.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5693895B2 (ja) * 2010-08-26 2015-04-01 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 子宮頸がん検査用マーカー及び子宮頸がんの検査方法
EP2708606A1 (de) * 2012-09-14 2014-03-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Neuartige Biomarker für humanen Zervikalkrebs und/oder HPV-Infektion
RU2582979C1 (ru) * 2015-03-19 2016-04-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ульяновский государственный университет" Способ уточнения стадии распространенного рака шейки матки
US10487365B2 (en) 2016-09-20 2019-11-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for detecting expression of lnc-FANCI-2 in cervical cells

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7625697B2 (en) * 1994-06-17 2009-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby
US7510881B2 (en) * 2003-08-25 2009-03-31 Marc Ramael Method and kit for the quantitative and/or qualitative detection of components in a sample
CN1957256B (zh) * 2004-03-24 2013-01-02 三路影像公司 用于子宫颈疾病检测的方法和组合物
US8343738B2 (en) * 2005-09-14 2013-01-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Assay for screening for potential cervical cancer
CA2648580A1 (en) * 2006-04-07 2008-05-02 Xdx, Inc. Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity
WO2009015294A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Biomarkers for human papillomavirus-associated cancers

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2010130809A1 *

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US20120129705A1 (en) 2012-05-24
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DE102009021734A1 (de) 2010-11-18

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