CN105143882A - 使用细胞学和免疫学的生物学样本评估方法 - Google Patents

Abstract

将从生物学样本获得的细胞因子和细胞学信息组合为预测不典型增生会进展到癌症的风险的方法。本文公开方法以说明对用于癌症的所测试的来自受试者的生物学样品的评估。除了在样本的基于形态的细胞学筛选中所习惯上考虑的细胞类型，本文公开的方法在筛选过程中添加对某些习惯上不考虑或忽视的细胞类型和细胞因子的评估。

Description

使用细胞学和免疫学的生物学样本评估方法

本申请要求2013年4月11日提交的美国临时申请61/811,034的权益，其内容通过引用整体并入本文。

背景技术

将从生物学样本获得的细胞因子和细胞学信息组合为预测不典型增生会进展到癌症的风险的方法。

1.不典型增生(dysplasia)的筛查

临床医学中一个众所周知的问题是，虽然癌前病变(不典型增生)是比较常见的，但是只有这些病变的一小部分进展到真正的癌症。

在缺乏可靠手段去区分有可能和不能进展到癌症的病变的情况下，临床医生通常采取保守方法，并积极治疗超出某些异常阈值的所有病变。这种保守的方法的一个缺点是相当一部分的患者接受不必要和/或过度积极的治疗，其中许多已知产生严重的副作用。第二个缺点是，这种不必要的治疗消耗大量有限的医疗资源，从而将这些资源从别的病人转开，而所述别的病人从这些资源可以获益更多。因此需要一种手段来将有可能进展到癌症的癌前病变和那些不能的区分开。

疾病筛查方案的一个挑战在于，所用测试必须能够迅速、准确、有效地检查大量无症状的个体，以便检测出那些少数呈现具有所述疾病或前兆状况的亚临床迹象。换句话说，疾病筛查是在罕见的事件检测中的工作，其中所使用的测试必须足够灵敏以检测出疾病的亚临床表现，和具有足够特异性以准确地将这些表现与其它原因导致的相似表现区分开。另外的因素是，特别是在癌症筛查领域，开始后，该疾病并不总是进展到成为有症状的点，而可能会停止在某一点，甚至退行恢复正常。

宫颈癌筛查和后续追踪异常筛查结果提供了癌症筛查成功的有纪录的可论证地最佳例子。与大多数筛检类似，对大量无症状的患者人群进行宫颈癌筛查，以鉴定这些人中的有可能受益于治疗或其他适当干预那少数成员。因为大量的无症状个体必须进行筛选，以鉴定表现出目标疾病状态的少数，物流和经济学在筛选程序的部署和操作中发挥关键作用。特别是，被筛选的大量个体决定了样品收集和测试的物流是高效率的。异常筛查结果确认相关的高成本以及甚至更高的治疗成本(如果异常结果被确认)也对筛选过程施加严格的要求，包括筛选测试是高度特异的，并且筛选成本的最小化。

20世纪40年代中期以来，宫颈癌筛查已经使用巴氏试验进行，其中从各个体收集的细胞进行细胞学检查，以鉴定含有表现出预示不典型增生或癌症存在的形态学异常的细胞的那些样品。从其获得细胞学异常样本的病人接受追踪检查，通常是通过对活检获得的组织样品进行组织学检查，以确认该异常的存在，并且如果确认，诊断存在的特定的疾病状态。接着，此诊断提供治疗计划和递送的基础。

目前，宫颈癌筛查是基于从子宫颈获得的鳞状上皮细胞以及，在某些情况下，颈管细胞的形态评估。在该检查的最初形式中，细胞是子宫颈已脱落细胞，但自从20世纪40年代晚期以来，细胞已经通过用抹刀、刷子或扫帚装置刮子宫颈获得。样品收集方法的这一改变的主要原因是要获得富含宫颈鳞状上皮细胞的“更干净”的样品，用于形态学评估。直到90年代初，这些样品通常涂到载玻片上以准备细胞学评估。虽然这种玻片制备方法简单而有效，然而所得到的样本通常含有细胞簇和细胞丛、黏液、细菌、真菌、酵母以及可能损害具有临床价值的上皮细胞检查的非上皮细胞。

在20世纪90年代后期，涂片开始被“单层”(或“液体基”)制备物取代，所述制备物通过更好地分散上皮细胞帮助样品评估，同时通过玻片制备过程中的纯化步骤，消除或显著减少载玻片上粘液的量和非上皮细胞的数目。当前这些由世界范围内的医学会和国家卫生部门认可的单层制备方法，占美国和英国的宫颈癌筛查样本的80％以上，以及占世界范围的宫颈筛查样本的很大部分，且正在增长。

由世界卫生组织公布的统计数据表明，宫颈癌的发病率因国家而异，一般在0.02-0.1％的范围内。巴氏试验是迄今为止世界范围内宫颈癌筛查使用的主要方法。在此检测中，从子宫颈收集的鳞状上皮细胞在细胞学上检查，观察到的此中任何形态异常的细胞，按国际公认标准(Bethesda)分类。

这些类别是：

(a)在正常范围内(WNL)：没有显著异常。

(b)显著性待定的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)：主要在美国使用的类别，细胞呈现不落入其它分类的相对较小的形态异常

(c)低度鳞状上皮内病变(LSIL或LGSIL)：与不典型增生一致的中度形态学异常。呈现出与病毒感染一致的形态变化的细胞也可包含在此类中。

(d)高度鳞状上皮内病变(HSIL或HGSIL)：重度不典型增生形态异常。这一级别的护理标准通常规定积极医疗干预。

(e)癌症。

虽然数字某种程度根据患者人群有所不同，现实的粗略估计是，发达国家中，宫颈癌筛查结果由大约90％的WNL、9％的ASCUS+LSIL、0.9％的HSIL以及0.1％的癌症组成。这一数字表明，仅有一小部分宫颈不典型增生实际上会进展到癌症。这受到得到确认的观察支持，大部分不典型增生被人体自发清除而无需治疗性干预。需要准确预测不典型增生可能进展为癌症的方法，以最好地运用稀缺的医疗资源。还得到确认的是，当活检用于确认时，灵敏度(被检测出不典型增生的百分比)(特异性是照此正确鉴定的哺乳动物的百分比；特别是假阳性率为1)。

从操作角度来看，70％的灵敏度意味着所筛查人群中大约1/3有宫颈非典型增生或宫颈癌的个体没有由巴氏试验检测出来。由此明显需要提高用于宫颈癌筛查的测试灵敏度。与此类似，70％的特异性意味着，大约1/3测试分类为具有不典型增生或癌症的情况，不能确认以及通常重新分类为WNL。除了这种误分类的情感影响，这些假阳性结果具有显著的经济影响，因为鉴定该组中的真阳性案例所需要的跟踪测试在所要求金钱和医疗资源上远远贵于最初的筛查。考虑到世界范围内的可用医疗资源的严重限制，在追踪假阳性筛查结果花费资源意味着，可以筛查的个体更少，用于治疗真阳性的不典型增生或癌症的个体的可利用资源更少。需要提高宫颈癌筛查测试的特异性。

尽管前面的描述集中于宫颈癌筛查，这些和其他类似的考虑和需要适用于其它癌症的筛查程序，例如，但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌和膀胱癌。

以前的提高灵敏度和特异性的尝试集中在开发用于检测可以与不典型增生的存在相关的“标志物”的测定，改进的形态评估的方法，以及使用替代指标。标志物是细胞表面或胞内分子，如果细胞过程被破坏，这些分子的浓度显著增加或减少。到目前为止已使用的标记物几乎全是蛋白质，但是偶尔探索使用少量别的类型分子，如脂质和寡核苷酸。虽然许多这些以标记物为基础的测试提供高灵敏度，但其特异性往往受限，因为这些标志物是细胞的正常组分和在正常和常规细胞过程中发挥作用。这些标记物也不孤立表达，而是作为一个高度互连的细胞进程网络中的元件，其中引起一个标记物表达变化的因素可对许多其他标志物的表达有多重影响。在这一方面，参与常规细胞维持和修复的网络已被证明是特别麻烦的。当前最有成效的以标志物为基础的方法集中在多个标志物的表达的相关性，而不是在一个单一的标志物的表达。有限的成功有时也通过精确定量单个细胞中标志物表达水平来实现。除了进行必要的定量测定的众多技术挑战，正常的个体间甚至样本内可变性使确定所需标志物表达的真正背景或参照水平(用于确定是否测量的表达变化是显著的)非常具有挑战性。类似的挑战和限制存在于使用改进形态评估方法，其大部分是基于各种自动图像分析的方法。这一方法中，修复细胞过程以及对在样本制备和成像中异乎寻常严格的工艺控制的需要是特别麻烦和苛刻。

上述的挑战和限制，导致探索使用替代标志物检测癌变和癌前状态。可以说这些方法中最先进的是使用HPV测试进行子宫颈癌筛查。此用途是基于所观察到的一个或多个HPV病毒的“高风险”(致癌)毒株感染，和HSIL/癌症()之间的强相关性(>90％)。支持这种方法的论据是，因为HPV病毒本身，以及由它在细胞中产生的各种蛋白质和其他分子，都是外来的，所以基于此方法的测试不受许多上述限制的约束。虽然由一个或多个致癌毒株造成的HPV感染和不典型增生直到并包括癌之间有很强的相关性，但本领域众所周知，只有极少数的这类感染实际上进展到HSIL阶段及更少的进展到癌症。因而虽然HPV检测是高度灵敏的，它们的假阳性率通常报道是在40-60％的范围。在文献中的几个报道最近建议，HPV诱发不典型增生进展为癌症不是感染本身的直接结果，而可能是发生在细胞内的病毒传播过程中，比较少见的随机误差的反映。这转而又导致建议用HPV蛋白E6和E7表达增加作为标志物，所述E6和E7似乎与HSIL及癌症具有更好的相关性。然而这种方法受到与上述类似的限制，因为E6和E7的表达是HPV的生命周期的正常部分，因而其本身本质上不决定细胞将进展到癌症。

早在19世纪50年代，有人观察到，获得某些危及生命的感染然后痊愈的一些癌症患者中的肿瘤，缩小甚至完全消失。还观察到，，实体瘤的相当大比例，一些情况下超过50％的质量是由白血球组成。最近已确定，这些肿瘤浸润淋巴细胞(TIL类)主要包括T细胞、NK细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和其他组成先天免疫系统的细胞。其它研究已经表明，这些细胞的主要功能是检测、攻击和破坏不需要的、损坏的、外来的、感染的和其它的异常细胞。

2.人体免疫系统的相关方面

虽然人的免疫系统的结构、它的调控、其与癌症的关系尚未被完全理解，但是属于本发明的几个点可以概括为：

(a)免疫系统和癌症之间的相互作用是复杂的，且还未被很好地理解。这些相互作用的范围可以从免疫系统攻击和破坏癌细胞到进入癌症耐受状态，或甚至积极促进的状态。也有一个大的和增长的身体的证据，发展中的癌症可以通过大量的方法调节相应的免疫反应。

(b)新出现的不典型增生和癌细胞最初被检测出，以及通过效应T细胞、NK细胞、巨噬细胞和先天免疫系统的其他细胞中和或破坏。这通常被描述为基于所产生的各种细胞因子的炎症反应。

(c)可以生成对所述癌症的B细胞(抗体、体液)应答。

(d)如果癌症及时清除，免疫应答回复到其静止的监视状态，留下敏化的记忆T细胞和B细胞，如果另一个类似癌症随后被检测出，可以迅速响应。

(e)如果癌症仍然存在并未及时清除，免疫系统的某些细胞可以经历表型转变，所述转变减少或终止在癌症的附近的免疫应答。已被报道的转变包括：

辅助性T细胞从Th1表型转变(表达促炎细胞因子，促进免疫应答)为Th2表型(表达抗炎性细胞因子和抑制免疫应答)。

部分T细胞群采用了调节性(Treg)表型，可以局部抑制先天性免疫应答。关于调节性B细胞(Breg)所知甚少，其似乎是在Tregs之前或同时产生，以及局部抑制免疫应答。

一部分局部巨噬细胞从M1型(积极)转变成M2型(耐受)

除了局部抑制局部免疫反应，Th2辅助T细胞、Treg、M2巨噬细胞和Breg分泌抗炎性细胞因子可以促进血管生成和其它有利肿瘤增殖的方面。

癌细胞可表达抗炎性细胞因子，包括但不限于，白介素-10(IL-10)。这些细胞因子的某几个，尤其是IL-10，通过抑制干扰素γ(IFN-γ)、IL-2和IL-12的生成，下调癌症特异性免疫应答。这导致其它抗炎性细胞因子如IL-4和IL-6表达提高，通过肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合物(MHC)的肿瘤抗原的展示减少，以及通过树突细胞和其他抗原递呈细胞的肿瘤特异性抗原递呈的抑制。

先天免疫系统的某些细胞，尤其是T细胞和NK细胞，各自检查由细胞(包含其附近的组织)展示的细胞表面标记物，以确定它们的状态。检测出展示一系列异常标志物细胞触发T细胞或NK细胞的旨在破坏异常细胞的细胞溶解和细胞毒性反应。同时，这些细胞释放多种细胞因子和趋化因子吸引巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞和先天免疫系统的其它细胞到此，并激活它们继续破坏异常细胞和清除产生的碎片。某些干扰素和与靶细胞直接相互作用的其他分子也可被释放。因而，异常细胞的破坏通常进行得迅速而有效，但是在一些情况下不足以完全消除病变。

具报道(主要来自对自身免疫性疾病的发生的研究)，过长时间的上述类型的炎症免疫应答可导致活化的免疫细胞破坏，随后攻击原发病灶的附近的正常细胞。为了防止这种类型的不良附带损害，当靶细胞被破坏时，或如果炎症反应过长，提供并触发非常有效的终止炎症免疫反应的手段。正如免疫应答的攻击阶段主要是由促炎细胞因子介导，终止阶段很大程度上由抗炎性细胞因子介导，两者之间的平衡由存在的各种类型的免疫细胞之间的相互作用的复杂网络控制。最近对于使用活化的T细胞、NK细胞和树突细胞作为癌症治疗剂的研究，揭示促炎和抗炎性细胞因子之间的平衡也可通过靶细胞本身进行调制。特别是已经发现，在许多情况下，不典型增生和癌细胞能够表达和释放足够量的抗炎性细胞因子抑制或终止对其的免疫攻击，并局部迫使先天免疫系统进入静止状态的。施加这种局部的免疫抑制状态被认为对于允许不典型增生或癌症的进展是必要的且充分的。

发明内容

本文公开增强生物学样品癌症检测的评估的方法。除了传统上在样本的以形态为基础的细胞学筛查中所考虑的的细胞类型，本文公开的方法添加某些细胞类型和细胞因子的评估，他们传统上在筛选过程中轻视或忽略。

靶细胞是被评分为“正常”、“不典型增生”或“癌”的细胞。例如，上皮细胞通常是宫颈癌筛查的靶细胞。

在单层样品制备中被剔除或数量明显减少的细胞类型有淋巴细胞(T细胞和B细胞)、嗜中性粒细胞、树突细胞和巨噬细胞。虽然这些细胞类型，如果大量存在在涂片样本中，偶尔被认为感染指标，如阴道炎，但就宫颈癌筛查而言历史上他们是被忽略的。正是这些历史上和有意被忽略的细胞，以及与它们相关的某些细胞因子，是本文所要求保护的公开的材料和方法的基础。

公开监控先天免疫系统在该生物样品收集区域的状态的方法和组合物，以确定免疫系统是否被局部地抑制，以及如果是这样，这种抑制是否被不典型增生或癌细胞强加或增强。一些可能的通常结果，每一种承载不同的进展风险，可以设想为：

1.正常状态指标为没有不典型增生/癌细胞和没有表达抗炎性细胞因子的细胞

2.如果存在不典型增生或癌性细胞，但免疫和靶细胞都不表达抗炎性细胞因子，表明正常的免疫应答。这可能表示轻度升高的风险。

3.如存在免疫细胞表达抗炎性细胞因子，指示抑制免疫应答。如果存在的靶细胞形态正常，并且不表达抗炎性细胞因子，则可以推测，异常引发的免疫应答已被成功地解决。然而，如果存在异常的靶细胞，都不表达抗炎性细胞因子，可以解释为由于应答过长，免疫系统进入静止状态，这些结果可以指示中等增加的进展风险。

4.表达抗炎性细胞因子的靶细胞和免疫细胞都存在说明免疫系统被强制抑制。此状态表示进展到癌症的高风险。

虽然临床上有用的信息可以从这些测试中简单地通过注意样本中的任何细胞是否表达抗炎性细胞因子取得，如果存在的细胞被分类为在至少区分靶细胞和免疫细胞的水平上的类型会更有用，而更加有用的是，如果不典型增生和癌细胞在形态学上检测以及，任选地，分类。

以风险评估为目的获得细胞学样本，而不是为了临床诊断。在组织学的程序中使用的样本是组织切片，其中相当大的依赖于在包含在细胞和组织的细胞间质之间的三维空间关系的信息。在另一方面，细胞学样本由分散细胞的二维排列组成，其中组织学样本里存在的基质和其它细胞间质已被除去，并且剩余的细胞间的空间关系被有意破坏。由于缺乏细胞间质和空间关系，这两者都被认为在不典型增生和癌症的分类和分期中是重要的，细胞学样本通常被认为不适用于细胞进展到癌症的风险的评估。增加本文所公开的方法以提高细胞学样本的价值。

一种用于细胞学评估不典型增生进展为癌症的风险的方法，包括：

(a)将生物学样品制备为细胞学样本；

(b)检测和分类所述样本中任何不典型增生的细胞；

(d)检测所述样本中发现的任何细胞(正常或不典型增生的)中抗炎性细胞因子的存在；

(e)评估(估计)存在于从其获得所述样品的受试者中的任何不典型增生进展到癌症的风险，所述评估基于在可能在样本中的不典型增生或其他细胞中是否存在抗炎性细胞因子。用于风险评估的合适的抗炎性细胞因子是IL-10。

不典型增生细胞用一种或多种发荧光染料染色和在细胞形态基础上的检测和分类。

对T细胞、B细胞、巨噬细胞和/或先天免疫系统的其他细胞进行额外地检测和分类。

公开了一种免疫测定细胞学样本中的分析物的空间分布的方法，其中检测试剂包括分别带有第一和第二标记的抗体。在本文中所用的“分析物”是分析下的任何化学物或分子。使用这种方法以，例如，增强细胞因子的信号

(a)第一和第二标记的抗体可以特异性结合到一抗(未标记)；

(b)第一和第二标记显示出结合到样本上的不同的非特异模式；

(c)第一和第二标记在空间分辨模式下，可单个检测到；

并且该方法还包括

(d)任选地，用未标记的一抗处理所述样本；

(e)用第一和第二标记抗体处理所述样本，标记的抗体同时施加到样本上；

(f)确定第一标记的抗体结合样本的位置；

(g)确定第二标记的抗体结合样本的位置；以及

(h)在空间上关联结合的第一和第二标记的抗体在样本上存在的位置；其中分析物被认为存在在那些第一和第二标记的抗体以高度关联存在的位置，并且分析物被认为是不存在于那些没有标记的抗体存在，或者仅一个标记的抗体存在，或两个标记抗体以低相关性存在的位置。

所述第一和第二标记可是荧光的。

所述样本可进一步用荧光或发荧光的形态染料处理。

附图说明：

图1显示在与抗体和结合的IL-10阴性的HSIL样品(D1H)上的IL-10的免疫染色的结果；(A)正常和不典型增生的细胞，散点图(箭头指向染红色的细胞)；(B)用(绿色)NSB染色的细胞，R-G相关系数＝0.088；(C)用(红色)NSB染色的细胞，R-G相关系数＝0.67。

图2是显示与抗体和结合的IL-10阳性HSIL样品(D6H)上的IL-10的免疫染色结果的散点图；正常和不典型增生细胞(箭头指向染红色的细胞)。

图3表明细胞的假色图像：(A)、(B)其中非特异性结合用相同细胞的分色图像阐明，所述图像显示(A)(绿色)和(B)(红色)标记的二抗位置的空间相关性差(<0.08)。蓝色表示细胞核用DAPI染色；(C)、(D)、(E)显示(C)IL-10阳性HSIL块、(D)HSILc块-594染色、(E)HSIL块-647染色的特异性结合；(F)、(G)、(H)显示(F)IL-10淋巴细胞、(G)IL-10淋巴细胞-594染色、(H)IL-10淋巴细胞-647染色的特异性结合。

发明详述：

1.临床原理

公开了用生物学样本来预测患者是否处于增加的发展癌症的风险的方法。

没有引起修复反应的癌症，感染或细胞损伤，细胞学样本中的细胞将有正常范围内的形态，免疫反应指标如存在T细胞的存在，B细胞和巨噬细胞会很罕见。类似地，细胞经历无关癌症或感染的损伤的正常修复将显示修复过程的形态变化特征和可能存在一些巨噬细胞，但T细胞和B细胞不存在。然而，如果癌症、显著的癌前状态或感染存在，细胞将呈现出独特的形态变化以及活性免疫应答(形式有效应T细胞，Th1型辅助T细胞，M1巨噬细胞和可能的其他先天免疫系统的效应细胞)的迹象。另一方面，中止的免疫反应的特征是与Treg和(可能)Breg细胞、Th2辅助T细胞和M2巨噬细胞以及抗炎性细胞因子的产生相结合的不典型增生。因此，由这些细胞产生抗炎性细胞因子，如IL-10，是中止的免疫应答的指标，表明局部环境处于免疫抑制状态允许不利情况的进展。

从临床角度看，细胞学样本中的的癌细胞的检测被认为是使立即确证性跟进和积极干预显得必要，而对这些样本中的不典型增生(癌前)细胞的反应更有可能基于临床医生对所述不典型增生进展成癌症的风险的评估。世界范围内的护理标准大部分使人相信，高度不典型增生(HSIL)代表进展的高风险，因此使立即进行干预显得必要，而较低程度的不典型增生代表低风险，并进行相应应对。然而，这个风险评估会被已知小部分的ASCUS和LSIL会进展，以及相当部分的HSIL(有人估计60-90％)会自发退行这样的事实复杂化。因此，在细胞学样本中更准确地评估从其获得所述样本的受试者中进展的风险的方法是可取的。任何类型分泌IL-10的细胞的存在指示患者处于进展的高风险，并且不依赖于不典型增生和其他风险因素的程度，如感染HPV的高风险(致癌)毒株。

所公开的方法和组合物主要打算用于基于细胞学样本在癌症筛查环境中的评估的风险评估，但它也可以用于活检样本以及用于诊断和患者管理。触摸制备物是用于此目的的活检样本的一个特别方便的形式，但也可以使用其它形式，例如组织切片和分散的组织。宫颈细胞学样品，如常规用于宫颈癌筛查的，将在以下描述中呈现。

2.预测不典型增生将进展到癌症的风险的方法

预测不典型增生将进展到癌症风险的方法包括：

(a)检测细胞因子；

(b)鉴定不典型增生和癌细胞；

(c)将(a)和(b)的结果关联用于风险评估的分类

形态染料用于检测不典型增生和癌细胞，免疫试剂用于检测细胞因子。标准有色染料及有色标记的免疫试剂可以用于此目的，但是荧光核或形态染料与荧光标记的免疫学试剂联用对大多数用途更方便。特别是，荧光染色利于同一细胞的同时或序贯染色为多种分析物，而有色染色常常需要将每种染料应用于相同样品制备的不同样本。同一样本上完成所有染色大大简化了相关步骤，并产生大幅地更可靠的结果。

描述了使用标记的二抗标准两步免疫染色程序，但也可以其他方式，如使用标记的一抗。类似地，虽然此方法可以使用标准视觉显微技术进行，但是自动图像捕捉结合这些捕获的图像的自动分析更方便和有效，特别是必须评估大量的样本的时候，如在筛选程序中遇到的。

定义

如本文所定义的，筛选是以检测异常的存在为目标的样品检查。意思是检测不典型增生的细胞。该定义的关键词是“检测”。与确定不典型增生的特定类型或产生原因或其所预示的无关。很多围绕这一术语的混淆源于也报道不典型增生程度(无，低，中，高)作为部分筛选结果的习惯作法。

另一方面，本文所定义的诊断与检测无关，而是着重于根据，例如，特定的类型、程度和其他特征详细的分类和鉴定已经检测到的异常的根本原因。作为例子，乳腺癌筛查结果可能被报告为不典型增生(相当于一些其它组织的高度不典型增生)，因而相应的诊断可能是阶段3浸润性导管上皮癌进一步表征为阴性或阳性的多种细胞表面标记物，如ER、PR和Her2Neu(全部这三种都没有表示诊断的癌症是臭名昭著的“三阴性”类型)。

示例

该方法包括以下步骤。某些步骤可以被省略、组合或不依所列次序完成，取决于这一方法任何特定的使用要求。

在某些情况下，可能希望补充本发明，通过加入样本被染色并评估未包括在本发明范围内的标记物存在的步骤：

1.获得细胞样品

众多细胞收集装置和方法已经被设计，其用于收集来自组织、人体分泌物及其它解剖学来源的细胞样品在本领域中是众所周知的。由于可用的设备和方法的多样性，以及因为每个设备或方法常用于收集一些特定的解剖部位的细胞，这些设备和方法的详细讨论已超出了本说明书的范围。

能够收集足够数量的靶细胞的任何这样的设备或方法可以用于本发明的实践。1000-5000个细胞一般是足够的，但是优选更多数目，特别是预期靶细胞为收集的总细胞的一小部分的情况下和/或当从样品制备样本期间，预期细胞会大量损失。

也可以用标准的统计方法来估计达到测试结果中统计置信的特定水平所需的细胞数，所述结果给出所测试的人群中感兴趣的疾病状态的发病率的近似值。除了提供足够数量的靶细胞，优选地，收集装置和方法对收集的细胞几乎不导致任何损害，最大限度地减少潜在干扰物质如粘液和红细胞，并满足使用便利、一致性、无创性、成本和类似因素相关的各种操作标准。适用于本发明的实践的靶细胞是上皮来源的。由于可用的采集装置和方法通常对收集的细胞类型不具有高度选择性，所收集的样品中也存在非靶细胞，其可以是上皮或非上皮来源的类型。这类非靶细胞与本发明的实践中有关的是淋巴细胞，包括T细胞、B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、髓源抑制细胞和免疫系统的其他细胞。

在一个优选的实施方案中，宫颈上皮细胞可以使用宫颈刮勺或扫帚刮或擦宫颈表面收集。在另一个优选的实施方案中，采用真空装置使乳腺组织中的乳导管产生液体(乳头抽吸液)，其含有导管上皮细胞，所述细胞通过吸附在吸附材料上，通过膜过滤器过滤，或沉积过滤进行收集。类似，在其他优选的，但非限制性的实施方案中，膀胱细胞可以从尿或膀胱洗液通过过滤或沉淀收集；肺细胞可以从痰收集；皮肤细胞可以使用任何各种刮或粘结装置收集，以及来自外部不能直接到达的组织的细胞通过细针抽吸(FNA)收集。在一些情况下，可以利用在外科手术过程得到的附带的组织样品。在这种情况下，可以通过在液体介质中的组织分散从组织中回收细胞，或优选地，通过接触制备方法获得，所述方法中组织表面瞬时接触预先被涂覆细胞优先附着的材料，如聚-L-赖氨酸，的显微镜载玻片的表面。由这些和其他类似的方法采集的样品包含靶和非靶细胞的混合物。

因为收集的细胞通常是不稳定的，而在细胞收集和他们被制备为供评估的样本之间有明显的时间延迟，优选的是新鲜收集的细胞收集后立即被保存或固定。众多防腐剂和固定剂配置物和同样众多它们的使用方法是本领域众所周知的。为了本发明的目的，优选的防腐剂或固定剂是醇基的，或者可替代是有机溶剂如丙酮或乙醚。合适的醇包括甲醇、乙醇和异丙醇，无论是在纯的醇或更常见的缓冲的水性溶液，其中醇浓度在15-80％之间。合适的醇基防腐剂可另外含有粘液溶解剂和其它修饰剂，而醇基固定剂往往还含有聚合物，例如聚乙二醇或聚乙二醇。在一些情况下，交联固定剂如包括甲醛、福尔马林或戊二醛的那些，也可以使用在本发明的实践中，但这样的固定剂不是优选的，因为这些固定剂中出现的交联反应可以阻断，模糊或损坏在本发明的免疫染色步骤中待检测的表位。

2.从细胞样品中制备细胞学样本

细胞学样本的制备需要所收集的细胞被转移到显微镜载玻片，然后以突出细胞特征和感兴趣的组分的方式染色。

用于将细胞沉积在显微镜载玻片的众多装置和方法是本领域所熟知的，并且可以在本发明的实践中使用。优选的方法是，最大限度地减少细胞团块在玻片上的数目，玻片上相邻细胞之间的重叠度，和转移过程中细胞的损失和对细胞的损害。一种优选的方法是细胞离心，其中包含在细胞悬浮液中的细胞在离心(重力)场的影响下沉积到显微镜载玻片上。这种方法的一个限制是，可能存在于细胞样品中的污染物如粘液和红血球可以沉积在玻片上使靶和非靶细胞模糊不清。在这种情况下，使用细胞防腐剂(见上文)，其中包含合适的溶解粘液剂和/或其它的选择性裂解剂是适当的。可替代地，通过各种过滤或梯度离心的方法除去不要的样品成分被广泛应用在本领域中。这种分离是几个广泛使用的方法的主要部分，膜过滤器被用于转移细胞到玻片上。利用或结合细胞分离方法可用于本发明的实践，只要该分离方法不导致靶或非靶细胞的不可接受程度的损失。

3.用一种或多种形态染料处理细胞学样本

因为细胞视觉上是透明的，有必要以建立在细胞结构和别的目的成分与周围的环境之间的可检测的对比度的方式处理细胞。这种对比是通过用各种试剂染色细胞而产生。在细胞学样本的评估中最常用的染料是有色的染料如苏木精，它染色DNA，和曙红，它染色细胞质的各种成分。虽然这些染料可以单独使用，它们最常联用，常被称为H&E染色。在某些情况下，硫素替代苏木精和/或其它染料与H&E相结合，用于特定目的。这些常规的形态染料可用于本发明的实践，如果在下文描述的免疫化学染色程序，以及诸如记录相关的形态鉴定的目标和非目标细胞的位置和相同性的方法之后进行此形态染色，以便允许这些形态学结果与来自下文所述的免疫化学染色过程中获得的结果关联的话。

如果如上所述的有色形态染料如H&E被置换为荧光或发荧光的形态染料如DAPI、POPRO等，将大大促进所公开和要求保护的方法实践。荧光染料比有色染料的优势，尤其是要求定量此染料时，已是本领域众所周知的。其中两个有点特别适用于本发明，细胞中的组分浓度范围很广，在荧光中更易于适应，以及荧光和发荧光的形态染料比大多数有色染料更易于与荧光免疫染色方法兼容。鉴于最后一点内容，应注意有色染料曙红有荧光发射，可覆盖免疫染色过程常用的大多数荧光团的发射。由于这些原因，使用荧光或发荧光的形态染料在本发明的实践中强烈优选。这些荧光染料和使用它们的方法是本领域众所周知的。

在某些情况下，可能方便或期望使用细胞类型的选择性免疫学或其它类型的一或多种染料，以特异性地检测靶细胞或感兴趣的非靶细胞。这种选择性染色的实例包括使用包含抗细胞角蛋白19的一抗的免疫染料检测包含乳头吸取液的样品中的导管上皮细胞，或者用抗-CD4或抗-CD8抗体检测和鉴定T细胞的特定类别。这种选择性染色的方法和步骤是本领域众所周知的。

4.在形态的基础上检测、鉴定和分类可能存在于细胞学样本里的细胞和其 他目标，并检测靶细胞的存在，其具有细胞形态的基础上的异常增生、癌 症、感染或其它疾病状态的指示性特征。

用于来自各种组织的细胞的形态学鉴定和分类的方法和标准，是本领域众所周知的和得到确认的。靶上皮细胞和免疫系统的非靶细胞，如T细胞、B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和髓源抑制细胞的鉴定和分类在本发明的实践中执行。其它类型的细胞通常可以忽略不计。细胞鉴定和分类传统上是由细胞形态的视觉评估来完成，但有利地，它也可通过细胞的电子捕获图像的自动分析完成。

5.用一种或多种免疫染料处理细胞样本和检测一种或多种抗炎性细胞因子 的存在。

众多细胞样本免疫染色的方法被开发，为了检测和任选地定量特定细胞组分，自从这种技术在20世纪50年代首次推出。其中，“标记的二抗”和ELISA形式是当前细胞实验室采用的主要方法。“标记的二抗”形式是在本发明的实践中优选的免疫染色方法。这种形式利用特异性结合目的细胞组分的未标记的一抗，联用特异性结合一抗的Fc部分的荧光标记的二抗。利用荧光标记的一抗的形式也可以有效使用，但会导致较低水平的信号，以及需要定制的抗体标记。

在本发明中优选单独或组合使用强且特异结合抗炎性细胞因子TNF-β-I/II、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-13和IL-19的单克隆一抗。在这些中，IL-10已被证明是最普遍适用于检测各种组织中不典型增生的可能进展，而其他的抗炎性细胞因子如IL-19似乎是更加具有组织特异性。因此，靶细胞因子或细胞因子的组合最好在获得所测试的细胞样品的组织的基础上确定。所有由特定克隆产生的单克隆抗体分子是一致的，但是在本领域已知，这些抗体的特异性和亲合性在克隆间变化很大。因此，即使使用市售的单克隆抗体，本发明的性能将取决于所选的特定的抗体和对应的克隆。由于用于本发明的样品中抗炎性细胞因子的相对低浓度，和标记二抗相对低的信号放大，优选的单克隆一抗即使低至纳摩尔，或优选低至从低到中皮摩尔的范围内应具有亲和力，并且具有针对特定靶细胞因子的适度高特异性。

标记的二抗是来自不同于一抗的物种的物种的抗体，其特异性结合所选择的一抗的Fc部分，并且其附着一些荧光团分子。合适的荧光标记的二抗可自许多来源商购，或者可以通过本领域中已知的方法来制备。荧光团标记的二抗的一个缺点是，它们呈现出一定量的非特异性的结合，这使得稀有事件检测有问题。在本发明中，这通过使用以不同结构类型的荧光团标记的二抗，从而有不同的非特异性结合性质来克服。这样的染料的实例是Alexa和Alexa

样本的免疫染色以本领域众所周知的方式实施，通过用所选择的单克隆一抗或特异于靶抗炎性细胞因子的抗体处理样本；经洗涤除去未结合的一抗；用大致相等的第一和第二荧光基团标记二抗的混合物处理样本；经洗涤除去未结合的二抗；应用盖玻片保护染色的载玻片。

免疫染色的结果由在荧光显微镜下，检查染色样本来评估，配置显微镜以利用与所用第一和第二荧光基团兼容的激发和发射波长。这种评估可以在视觉上或者优选地，通过自动图像采集和分析系统的方法进行。这一评估的目的是找出那些细胞，如果有的话，所述细胞存在于样本中，其中通过标记有第一荧光基团的抗体染色在空间上与标记有第二荧光基团的抗体染色一致。此过程允许检测和补偿非标记的二抗特异性结合于细胞，如果未校正可能产生的假阳性结果。概括说来，如果只有一个或另一个二抗在特定位置上结合细胞，可以假定这种结合是非特异性的，但是，如果这两个标记的抗体结合在相同的位置中，结合可以假定为特异性的，并因此是靶抗炎性细胞因子的存在真实指标。

6.基于组成细胞学样本的细胞的一些部分中存在的一种或多种抗炎性细胞 因子，评估靶细胞的相对风险由此鉴定进展至更不利的疾病状态。

为了估计进展的风险，有必要对每个靶细胞和非靶细胞分类，其中步骤5的免疫染色程序表明，靶抗炎性细胞因子的表达，就其类型而言，以及如果适用，就其形态异常程度而言。因为免疫染色和形态学染色在相同的样本上完成，在步骤5检测到的免疫染色的细胞可基于步骤3和4得到的相同细胞的形态信息鉴定和分类。这种相关可以手动进行，但最方便的是使用自动图像分析系统进行的。在本发明的实践中，对于鉴定可能存在的任何未染色的形态异常的靶细胞和免疫系统任何未染色的细胞也是有用的，但不是必要的。

进展风险可以基于上述信息进行分阶层。这些进展风险与相应的风险相关，所述相应的风险通常是与具有呈现类似的形态特征的相同类型，但不表达的炎症细胞因子的靶细胞相关联。

通过上述程序所获得结果的例子总结于表1。各样品作为妇女常规巴氏筛查宫颈癌的存在的一部分进行收集，或在追踪具有先前异常筛查结果的妇女的过程中进行收集。通过使用宫颈刮铲，有时与宫颈刷联用，从子宫颈收集这些样品，以及保存在一个市面上可买到的甲醇的防腐剂()中。每个样品的一个部分制备为细胞学样本；染色采用巴氏染色；并由几个训练有素的细胞学家按照国际公认的标准和准则进行形态学评估。样品这部分的常规细胞学评估的结果记录在列表1的“细胞学”栏，它是根据越来越不利的细胞学诊断排列而成，并且包含这些样本的官方参照诊断。还提供HPV状态，其可利用是因为感染HPV病毒的高风险(HR致癌)毒株被广泛认为是子宫颈癌的主要原因。当可用时也注意低风险(LR，非致癌)的HPV毒株的感染或共感染。

每个样本的第二部分包含约5000个细胞，通过细胞离心制备；染色使用POPRO；免疫染色使用兔单克隆抗IL-10的一抗与标记Alexa和Alexa山羊抗兔二抗组合。形态评估、数据采集和数据分析可肉眼使用市售的荧光显微镜(OlympusBX-50)，以及使用一个定制的自动图像捕捉和分析系统来完成。IL-10的染色和形态分类之间的相关性在表1“HSIL”和“高度病变组”栏所示。在这个特定的研究中，HSIL的报告阈值被用作形态学异常的水平，常常被认为是开始积极患者追踪的阈值。HSIL及HSIL组分别报告为，在分离的细胞中HSIL组通常被认为是比HSIL更不利的结果。“风险评估栏”表示任何表达IL-10的鳞状上皮细胞形态分类和相应的预计风险水平，即该患者有可能进展到比在“细胞学”栏中所标示的更为不利的疾病状态。

表1中的样品10表明本发明检测出在一个名义上“正常”的样品中存在异常细胞的能力。在这个特定的实例中IL-10阳性分离的HSIL和IL-10阳性HSIL块都被发现。因此，尽管该样品被常规细胞学报告为正常，但该患者应该被认为是处于进展到癌症的高风险。

在表1中样品15被常规细胞学分类为ASCUS。ASCUS在美国是占主导地位来使用的类别，意味着存在显示形态异常，不属于传统类别LSIL、HSIL或癌症的鳞状细胞。据认为，报告为ASCUS样品中的至少某些部分代表样品收集错误，其中所述样品收集自病变相邻的区域，而不包括病变，如果正确采样，所述病变会回复到诊断为LSIL或更高。因为在巴氏宫颈癌筛查过程中报告异常的结果的很大一部分被分类为ASCUS，所以想要一种用于鉴定临床显著的ASCUS样品的子集。这个特定的样品被发现含有表达IL-10的细胞，其经形态评估被发现是HSIL或HSIL块，以及该患者应该因此被认为处于进展高风险。

在用于宫颈癌筛查中的细胞分类的Bethesda系统下，LSIL(表1中的样品16-42)是异质的类别，其包括表现出与低度不典型增生相关的形态变化的细胞，以及被病毒如乳头瘤病毒感染细胞相关的形态变化的细胞。本领域众所周知，相当大比例，很多估计超过90％的细胞，分类为LSIL，其会随着时间的推移自发地恢复正常，而剩余将进展到HSIL。ASCUS情况下，这些考虑表明，需要鉴定可能进展的LSIL样品子集的方法。表1中LSIL样品16-34不含有IL-10的表达的鳞状上皮细胞，因此不被认为是处于增加的进展风险，而LSIL样品35-42是IL-10的进展阳性的，复查发现含有HSIL和/或HSIL组。有兴趣的是注意到，该被形态分类为不表达IL-10的LSIL细胞。另一个值得注意的因素是，一些LSIL样品，包括判定为处于高的进展风险的样品41，检测结果为高风险HPV感染阴性。这种类型的观察暗示建议使用HPV检测作为宫颈癌筛查的主要手段。

在LSIL的情况下，分类为HSIL的例子的某些部分已知会自发恢复正常，而剩余的情况下进展为癌症。这部分自发退行的细胞已被不同的估计为30-60％。报告为没有IL-10表达的样品43-47表明，这些样品很可能退行，而表达IL-10样品48-63，如果不治疗有可能进展。

除了上述的实施方案，步骤可以根据特定应用的要求而变化。例如，步骤4/5和步骤6的顺序可以颠倒，如果使用荧光或发荧光形态染料时，这些步骤可合并成单一步骤。类似地，形态染色和评估只能在免疫染色证明抗炎性细胞因子的存在的样本上进行，否则形态学染色和评估可以完全被删除，存在或不存在染色的抗炎性细胞因子可以作为是否需要额外的追踪的指标。本发明也可以通过进行染色和评估额外标记物的存在例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、P-16和Ki-67来扩展，以获得特定样本的额外信息。

7.获得合适的样品

在宫颈癌筛查的情况下，该样品传统上主要包含通过刮或刷从子宫颈得到的上皮细胞，但也包含存在于取样的组织的其它细胞类型。

8.从所述样品制备细胞学样本

用于宫颈癌筛查的细胞学样本传统上通过使用细胞收集器将收集的细胞物理地涂在显微镜载玻片上进行制备。使用以这种方式制备的样本可能要提醒的是，一些感兴趣的细胞可能嵌入团块或簇或以其他方式受遮蔽而不容易进行评估。

引入样本制备的“单层”或“液体基”的方法在很大程度上解决涂抹制备固有的遮蔽问题。在这些方法中所收集的细胞从细胞收集装置洗入液体介质，因而形成细胞悬液。包含在此悬液中的细胞，然后通过几个建立方法中的任一种沉积到载玻片上。

在膜过滤器的表面上捕获悬浮细胞，接着将有捕获细胞的过滤器放置在显微镜载玻片上，或将捕获的细胞从过滤器转移到到显微镜载玻片上，包括广泛使用的这些的方法两大类之一。以这种方式制备样本需提供一个合适的滤器。设计最常使用制备宫颈癌筛查的滤器以在滤器的表面上捕获传统评估的上皮细胞，而允许可能存在于样品中的别的细胞类型，包括T细胞、巨噬细胞和在本发明的实践中使用的其他类型的，通过滤器并进入废物容器中。除非滤器使用较小的孔，并且能够捕获T细胞、巨噬细胞和在该方法的实践中使用的其他类型的细胞，相对于原始样品中的数量，所得到的样本中细胞的数量将显著减少。

从细胞悬液制备样本的其它常用的方法依赖于在重力场存在的情况下，悬液中的细胞的沉降到显微镜载玻片上。通常采用且可以使用其中此沉降发生在1×G重力场的方法，以及其中该重力场增加到几百×G重力场(如通过离心(例如，))的方法。然而，特定版本的沉降方法已经收到注册审批，用于宫颈癌筛查的样本制备，要求样品被分离成上皮细胞部分和含有存在于样品中的其它类型的细胞部分，并且，只有上皮细胞部分沉积在载玻片供细胞学评估。在上述的过滤方法的情况下，相对原始样品中它们的数量，T细胞、巨噬细胞和由本准许的方法制备的玻片上的其他类型的细胞数量将显著减少。出于这个原因，在本发明的实践中优选省略沉积前的样品分离步骤。可替代地，将含有上皮细胞和其它类型的细胞的部分分离，分别回收和评估。

9.检测和，任选地，分类样本中存在的任何不典型增生和/或癌细胞。

基于形态的细胞学检查和分类不典型增生和癌变细胞按照国际上通行的惯例和标准执行。在这些实践中，检查前染色样本会使检测和分类更加方便。巴氏染色常用于宫颈细胞学样本的筛选，而有或没有各种复染色的H&E通常用于其它类型的样本。可用这些染料和其他染料。

传统上报导的细胞学分类应用于整个样本。可以使用样本水平的结果，但优选在样本中检测到的每个细胞单独分类。自动图象拍摄和分析系统是提供这种功能的便利方式。

这一分类结果是根据几个标准化命名系统中的任一报告的。在广泛使用的Bethesda的命名系统和相应的追踪实践中的主要报告类别有：

正常范围内(WNL，通常还包括再活化的和修复性的)

-不进行追踪或干预

低度不典型增生(LSIL)

-所有的LSIL的90-95％自发回复到WNL，因为病变由免疫系统清除。护理的当地标准一般只缩短筛查的时间间隔，不建议追踪，除非其他危险因素存在。

高度不典型增生(HSIL)

-如果HSIL由活检证实，护理标准规定治疗性干预。所有HSIL的60-90％随着进展为癌症的平衡而由免疫系统自发清除。

癌症(CA)

-如果癌症被活检证实立即进行治疗性干预。

意义不明的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS-在一些国家承认)

-绝大多数ASCUS的发现通过追踪确定为良性，但一小部分为HSIL或CA暗示性或指示性的。追踪通常具体问题具体分析。

如从前述可以看出，虽然本发明可以应用到样本中任何一类，当应用于基于形态被分类为HSIL或ASCUS的样本，以及如果其他风险因素存在应用于LSIL样本时是最有利的。

10.在样本中的任何不典型增生的细胞调节性T细胞调节性B细胞和M2 巨噬细胞中检测抗炎性细胞因子的存在。

对于本方法白介素-10(IL-10)是优选的抗炎性细胞因子，因为IL-10在终止局部免疫反应中起着核心作用，并已显示，至少在某些癌症中，参与其他进展事件，例如抑制凋亡和减少在MHC-I复合物上肿瘤抗原的展示。其它抗炎性细胞因子如TNF-β也可使用。检测这些细胞因子的最方便的是通过免疫染色来完成。任何免疫染色的标准方法都可用。优选的免疫染色形式使用未标记的一抗与荧光标记的二抗联用。利用荧光标记的一抗形式也使用有效，但可能导致较低的信号水平，需要定制抗体标记。

11.评估从患者得到的样本的不典型增生进展到癌症的风险

据推测，通过该方法评估样本主要包括HSIL加LSIL和ASCUS的选定子集，其中患者有额外鉴定的经典风险因子，如癌症的家庭或个人史、暴露在DES下或由致癌病毒(例如高风险HPV株)持续性感染。

在样本中的任何细胞里存在的抗炎性细胞因子，如IL-10，可以作为证据表明，局部免疫反应正在发生或已经终止。如果样本的不典型增生细胞里，没有检测到抗炎性细胞因子如IL-10的表达，合理假设，这个终止是对免疫系统的长期刺激的正常反应。既然不典型增生仍然存在，有进展的中等风险。

存在表达一种抗炎性细胞因子如IL-10不典型增生的细胞，可以作为证据表明，局部免疫反应正在被积极抑制，病人因此处于进展为癌症的高风险，尤其是如果也存在调节细胞。

讨论

细胞表达抗炎性细胞因子如IL-10并非罕见，即使是在基于形态被分类为HSIL及癌症的样本里。这主要是由于使用传统的细胞收集方法，其通常收集T细胞、巨噬细胞和免疫系统的其他细胞，仅附带收集到靶细胞类型。因为如果不是必要的，往往希望采用使用这些传统的方法收集的细胞，来产生本文公开和要求保护的方法，有必要优化免疫染色试剂和方法，以使靶细胞类型的检测最大化。各种各样的优化技术是本领域公知的，并且可以使用。但是，荧光团如在本发明的实践中使用，已知倾向非特异性结合细胞成分，所述结合以不能有效地通过标准优化技术控制的方式进行。出于这个原因，本发明的另一个方面针对减轻这种非特异性结合对检测的灵敏度的影响。

免疫测定中的非特异性结合是通过使用阻断剂、洗涤剂、离液剂和其他添加剂的各种组合解决的。虽然这些方法通常有效地限制或抑制大多数类型的非特异性结合，其在减轻非特异性荧光团对细胞成分的结合效率是不足够用于本发明的实践中。因此本方法使用相关双染色，以解决这方面的不足。

先前描述的免疫染色形式包括未标记的一抗结合标记的二抗被用在本说明书中。进一步假设该标记是广泛使用系列中选出的荧光团。当用于在本发明方法的检测中，它可以很容易地观察到，系列的不同成员表现出不同模式的与细胞材料的非特异性结合。因此，观察到的染色模式包括目标分析物的特异染色和非特异性荧光团结合到细胞材料的叠加。如果使用不同的荧光团作标记，分析物特异性染色模式将保持不变，而由于荧光团的非特异性结合的模式会发生改变。这种分析物特异性染色一致性与在荧光团特定的非特异性染色的可变性结合提供了最小化分析结果上的非特异性荧光团结合影响的方法。

相关双染色利用等份的相同二抗，其中一个标记有第一荧光团，另一个标记有第二荧光团。举例来说，第一等份用标记，其具有在近红外光谱区的荧光发射，第二个用标记，其具有在红色光谱区的荧光发射。这两个标记的二抗在使用之前被合并。

如前所述，将样本首先用未标记的一抗处理，其特异性结合目的分析物。然后将样本用组合的标记的第二抗体处理，样本的图像被捕捉在红色和红外光谱区。然后这些红色和红外图像关联，以确定在其中分析物存在于样本的哪些区域。

对于给定的区域，如果在红色和红外图像中都检测到低信号，没有染色发生在样本的相应的位置，目标分析物在该位置不存在。

对于给定的区域，如果在红色和红外图像中都检测到高信号，并且信号是相关的，样本中的对应位置已被选择性染色，分析物存在于该位置。

对于给定的区域，如果是在红色或红外图像检测到高信号，但不是在两个中都有，样本中的对应位置已被非特异性染色，分析物不存在于该位置。

图1是散点图，显示了IL-10阴性的HSIL样品的IL-10的免疫染色的结果。检测试剂包括特异于IL-10的一抗和由(绿色荧光)标记的二抗和用(红色荧光)标记的相同的二抗的混合物。图1(B)：细胞表现出红色和绿色的荧光之间的低空间相关性(R-G相关系数＝0.088)从而指示二抗的非特异性结合。主要为红色的荧光表明，这些细胞的非特异性结合标记的二抗优先于用标记二抗。图1(A)：形态学正常和异常细胞呈现红色和绿色荧光之间的高空间相关性(R-G相关系数>0.9)。这表明，两种标记的二抗特异性结合。在这一区域的低的荧光强度表示很少或没有IL-10的存在于形态正常(黑色方块)或不典型增生(红色正方形)的细胞中。图1(C)：细胞表现出红色和绿色的荧光之间的低空间相关性(R-G相关系数＝0.67)从而指示二抗的非特异性结合。主要是绿色荧光表明这些细胞非特异性结合了标记的二抗优先于标记二抗。

图2是散点图，显示了IL-10阳性的HSIL样品的IL-10的免疫染色的结果。这些细胞的染色和说明在图1的图例所述。呈现高的红色和绿色荧光强度的细胞表示IL-10大量产生和红色和绿色荧光之间的高空间相关性(R-G相关系数>0.9)，这表明该二抗的结合是特异的。

图3显示的同一细胞颜色区分的图像显示了(绿色)标记的和(红色)标记的二抗，两者位置的强(>0.90)空间相关性。蓝色表示细胞核用DAPI染色。共定位的红色和绿色发射出现在这个图像上为黄色。IL-10阴性细胞在该图像上显示为蓝色细胞核被绿色环绕(Alexa的594标记的二抗的非特异性结合)。

表1

Claims (16)

1.一种用于估计受试者中不典型增生进展为癌症的风险的方法，该方法包括：

(a)检测和分类来自受试者的生物样品的细胞学制备物中的不典型增生的细胞；

(b)检测不典型增生的或非不典型增生的细胞中抗炎性细胞因子的存在；和

(c)基于至少一种抗炎性细胞因子是否存在于样本中检测到的不典型增生的或其他细胞中，估计受试者中不典型增生进展为癌症的风险；其中任何细胞都没有表达表明低风险，由非不典型增生的细胞表达表明中等的风险，以及由不典型增生的细胞表达表明高风险。

2.权利要求1的方法，其中所述抗炎性细胞因子是IL-10。

3.权利要求1的方法，其中不典型增生的细胞用一种或多种发荧光染料染色和检测，并基于细胞形态进行分类。

4.权利要求1的方法，其中，任选地，检测和分类T细胞、B细胞、巨噬细胞和/或先天免疫系统的其他细胞。

5.一种用于免疫学测定分析物在细胞学或组织学样本中的空间分布的方法，其中，检测试剂包含带有第一标记的抗体，和单独带有第二标记的抗体，所述方法包括：

(a)将所述样本与分别用不同标记进行标记的抗体接触，所述不同标记可以以空间分辨的方式分别检测；

(b)用未标记的一抗处理样本；

(c)确定样本上第一标记的抗体结合的位置；

(d)确定样本上第二标记的抗体结合的位置；

(e)在空间上关联样本上结合的第一和第二标记的抗体存在的位置；其中所述分析物被认为存在于那些第一和第二标记的抗体以高相关性都存在的位置，并且所述分析物被认为不存在于那些标记的抗体都不存在，或者仅一个标记的抗体存在，或两个标记的抗体以低相关性都存在的位置。

6.一种用于评估细胞学样本的方法，该方法包括：

(a)制备细胞学样本，其来自包含靶细胞和附带收集的非靶细胞的细胞样品；

(b)将所述细胞学样本与一种或多种形态染料接触；

(c)基于形态检测、鉴定和分类存在于所述细胞学样本中的任何细胞和其他对象；

(d)用一种或多种免疫染料处理所述细胞学样本；

(e)检测一种或多种抗炎性细胞因子在所述细胞学样本中的任何细胞里的存在；

(f)基于细胞形态检测具有不典型增生、癌症、感染或其它疾病状态的指示性特征的靶细胞的存在；和

(g)基于检测组成细胞学样本的一部分细胞中的一种或多种抗炎性细胞因子的存在，评估(f)中所鉴定的靶细胞进展到更不利的疾病状态的相对风险。

7.权利要求6的方法，其中所述靶细胞是上皮起源的。

8.权利要求6的方法，其中非靶细胞包括先天免疫系统的细胞，选自树突细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞的细胞，或其组合。

9.权利要求6的方法，其中所述形态染料是荧光的或发荧光的。

10.权利要求6的方法，其中所述免疫染料包含荧光标记的一抗，其选择性结合抗炎性细胞因子。

11.权利要求6的方法，其中所述免疫染料包含未标记的一抗，其选择性结合抗炎性细胞因子，并且随后通过用荧光标记的二抗处理而原位标记，所述二抗选择性结合所述一抗。

12.权利要求6的方法，其中所述免疫染料包含未标记的一抗，其选择性结合抗炎性细胞因子，随后通过用第一二抗和第二二抗处理而原位标记，所述第一二抗选择性结合所述一抗并用第一荧光团标记，所述第二二抗选择性结合相同的一抗并且用不同于所述第一荧光团的第二荧光团标记。

13.权利要求5的方法，其中独立确定第一和第二荧光团在染色样本中的空间分布，并且使这些分布空间相关联以区分特异性染色和非特异性染色的空间位置和对象。

14.权利要求6的方法，其中所述抗炎性细胞性因子是IL-10。

15.权利要求1和6的方法，其中所述抗炎性细胞因子选自TGF-β1和2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-13和IL-19。

16.权利要求1的方法，其中风险是通过以下方式确定的：

(a)正常进展风险，由不存在显示可检出量的一种或多种抗炎性细胞因子的细胞指示；

(b)略微增加的进展风险，由存在显示可检出量的一种或多种抗炎性细胞因子的非靶细胞指示；

(c)中等增加的进展风险，由存在显示可检出量的一种或多种抗炎性细胞因子的靶细胞指示；和

(d)大大增加进展风险，由存在显示可检出量的一种或多种抗炎性细胞因子的靶细胞以及非靶细胞指示。