KR20040030984A

KR20040030984A - 순환성 종양 세포, 단편 및 잔해의 분석

Info

Publication number: KR20040030984A
Application number: KR10-2004-7002572A
Authority: KR
Inventors: 라오갤라찬드라; 라손크리스토퍼; 레폴렛메이들린; 루트너허만; 터스테이픈레온; 오하라션마크; 그로스스티븐
Original assignee: 이뮤니베스트 코포레이션
Priority date: 2001-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2004-04-09
Also published as: EP1425294B1; BR0212125A; WO2003019141A3; CA2457891A1; EP1425383A2; CA2457894C; JP2009109514A; JP2005501236A; WO2003018757A2; AU2009200013A1; ATE401574T1; JP2005502863A; IL160210A0; CN1571634A; AU2008288601A1; IL160209A0; BR0212124A; AU2009200013B2; DE60227678D1; CA2457891C

Abstract

본 발명에 기술된 방법 및 시약은 순환성 종양 세포, 클러스터, 단편 및 잔해를 분석하는데 사용된다. 분석법은 유동성 세포계수기 및 CellSpotter(등록상표명) 형광 현미경 이미지화 시스템을 포함하는 다수의 플랫폼으로 수행된다. 생체내 손상은 세포자살, 괴사 또는 면역 반응에 의하여 발생한다. 시험관내 손상은 샘플 채취, 취급, 운반, 처리 또는 분석시 발생한다. 따라서, 시험관내 손상이 분석법을 방해하지 않도록 막기 위해서 시험관내 손상을 제한, 감소, 제거 또는 최소한 정성화하는 것이 바람직하다. 본원에 개시된 방법은, CTC, 클러스터, 단편 및 잔해에 의해 확인되는 악성종양을 비롯한 순환성 희귀 세포를 바탕으로 하여 질병을 진단, 모니터 및 스크린하는 것이다. 본 발명은 이러한 방법을 사용하여 생물 표본을 분석하는 케트도 제공한다.

Description

순환성 종양 세포, 단편 및 잔해의 분석{ANALYSIS OF CIRCULATING TUMOR CELLS, FRAGMENTS, AND DEBRIS}

초창기에 많은 임상의들은 암이 기관에 한정되어 발생하는 질환이라고 믿고 있었다. 그러나, 이러한 생각은 틀린 것으로서, 현재 실시되고 있는 방법을 사용하여 검출되고 나서야 비로소 암이 전신 질환임이 밝혀졌다. 1차 암(primary cancer)은 이상증식 세포를 질병의 초기 단계에 혈류에 유출시킴으로써 개시되고, 그후 임상적 징후를 나타낸다는 증거가 있다. 종양의 맥관 형성시, 혈류로 유출된 종양 세포는 체내 원거리 부위에 부착된후 콜로니를 형성하여 전이체를 생성시킨다. 이러한 순환성 종양 세포(circulating tumor cell ; CTC)는 일반적으로 건강한 개체의 세포에서는 발견되지 않는 마커를 함유하므로, 특정 암종의 진단 및 치료에 대한기초를 제공한다. 그러므로, 혈류중 종양 세포의 존재는 다른 테스트 예컨대, 유방암의 유선조영술, 또는 전립성암의 전립선 특이적 항원(PSA)의 측정 대신에, 또는 이와 병행하여 암의 스크리닝에 이용될 수 있다. 표적 세포상에 존재하거나 또는 표적 세포와 결합한 마커에 대하여 생성된 적당한 모노클로날 항체를 사용함으로써, 또는 세포 단백질 발현에 관한 기타 분석법을 사용함으로써, 또는 세포 mRNA의 분석에 의하여, 이러한 세포의 기원 기관 예를 들어, 유방, 전립선, 결장, 폐, 난소 또는 기타 비-조혈세포의 암을 용이하게 측정할 수 있다.

그러므로, 근본적으로 종양에 대한 임상적 징후는 없으면서도 암 세포가 검출될 수 있을 경우, 이러한 징후의 존재 및 기원 기관을 확인할 수 있을 것이다. 수술후 CTC가 검출되면, 그 CTC가 병의 재발에 대한 징후일 경우 보조 치료를 개시할 수 있을 것이다. 환자가 이러한 치료를 필요로 하는지 여부, 또는 이의 효능, 이러한 치료에 드는 비용을 예측하는 것은 중요하고 유익한 임상 정보이다. 또한 CTC의 수가 변화하면, 질환이 진행중인지(CTC 증가) 또는 치료에 반응하고 있는지(CTC 감소) 여부를 예측할 수 있다.

악성종양은 인접 조직에 침투할 수 있는 것을 특징으로 한다. 일반적으로, 지름 1㎜인 종양은 맥관 형성되며, 동물 연구에 따르면, 종양에 존재하는 세포의 4% 정도는 24 시간 이내에 혈류로 유출될 수 있다고 한다[Butler, TP & Gullino PM, 1975 Cancer Research 35:512-516]. 종양의 유출 능력은 대부분 종양의 공격성에 의존적인 것으로 파악된다. 비록 종양 세포가 연속적 방식으로 혈류중에 유출된다고 하더라도, 소량의 종양 세포만이 원거리 변이를 발생시키거나, 또는 종양 세포는 이러한 원거리 변이를 거의 발생시키지 않을 것으로 생각된다[Butler, & Gullino, 상동]. 종양 질량은 단일 세포로서, 또는 부착성이 증가된(즉, 침투 가능성이 더욱 커진) 세포 클러스터로서 CTC 생성 빈도가 증가함에 따라서 증가할 것으로 예측된다. 만일 이럴 경우, 감도 수준이 높은 방법은 원거리 변이가 발생한 환자 및 국소화된 질환을 앓고 있는 환자에 있어서 종양 부하(tumor load)의 평가를 촉진시킬 것이다. 국소화된 질환을 앓고 있는 환자의 말초 혈액중 종양 세포를 검출함으로써 초기 단계의 종양 세포를 검출하는 것 뿐만 아니라, 종양의 잠재적 침습성에 대한 지표를 제공할 수 있다.

그러나, 전혈은 특히 24 시간 이상 동안 정가 보관기 다수의 생체내 및 시험관내 생화학적 및 효소적 반응을 수행할 수 있는 다양한 세포 및 가용성 성분들의 군집을 함유하는 복합적 체액이다. 이러한 반응중 일부는 외래 종으로서 인지되는 CTC의 면역학적 파괴와 관련되어 있다. 환자의 면역 반응은 식세포작용 및 호중구 활성화를 비롯한 정상적인 방어 기작에 의해서 종양 세포를 약화시키거나 또는 파괴한다. 이와 유사하게 화학요법은 괴사를 통하여 세포 사멸을 유도함으로써 세포 기능과 증식을 모두 감소시키는 경향이 있다. 이와 같은 외부적 파괴 요인 이외에, 대립하는 환경에서 손상된 종양 세포는 프로그램화된 사멸 또는 세포자살을 수행할 수 있다. 괴사 및 세포자살을 수행하는 정상 및 비정상 세포(CTC 포함)는 막투과성을 변화시켜, DNA, RNA 및 기타 세포내 성분을 탈출시킬 수 있으며, 이로써 손상된 세포, 단편화된 세포, 세포 잔해를 생성시키고, 이로 인하여 세포를 완전히 붕괴시킨다. 이러한 종양 세포 잔해는 원상태 세포에 특징적인 에피토프 또는 결정기를보유할 수 있으며, 이로써 검출된 순환성 암 세포의 수를 의사적으로 증가시킬 수 있다. 건강한 개체로부터 얻은 전혈 표본은, 24 시간 이상의 기간 동안 장기 보관시 혈액 질 저하로서 분류되는 불안정한 혈액 세포 성분을 파괴하는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 적혈구는 파열되어 헤모글로빈을 방출시켜 세포 고스트(cell ghost)를 생성시킬 수 있다. 백혈구 특히, 과립구는 불안정하여 저장시 그 수가 감소된다고 공지되어 있다. 이러한 변화는 희귀 표적 세포(rare target cell) 예컨대, CTC의 분리 및 검출을 방해할 수 있는 세포 잔해의 양을 증가시킨다. 이러한 파괴 과정의 조합적인 효과(이를 총칭하여 채혈후(post-draw) 또는 시험관내 손상이라 칭함)는 실질적으로 세포 잔해를 증가시키고, 이 세포 잔해는 예를 들어, 유동 세포계수법 및 현미경 예컨대, CellSpotter(등록상표명) 또는 CellTracks(상표명) 분석에서 용이하게 검출 가능하다.

유사하게, 현미경 이미지화에 의한 순환성 종양 세포의 검출법은 분류 가능한 종양 세포의 의사적 감소 및 이에 따른 방해성 염색 잔해의 증가에 의하여 악영항을 받을 것이다. 그러므로, 채혈과 표본 처리 사이에 24 시간 정도의 시간적 지연이 있을 수 있으므로, 혈액 표본의 일체성 또는 질을 유지하는 것이 가장 중요하다. 이 분석법에 있어서 혈액 처리에 사용되는 기법 및 장치는 실험실에 따라서는 용이하게 입수할 수 없기 때문에, 이러한 지연은 예측가능하다. 샘플 처리를 위하여 샘플이 실험실에 도착하는데 필요한 시간은 상당히 가변적일 수 있다. 따라서, 샘플이 처리될 수 있는 시간의 범위를 확보하는 것이 중요하다. 통상적인 혈액학적 분석법에서, 혈액 샘플은 24 시간 이내에 분석될 수 있다. 그러나, 희귀한 혈액 세포의 분석이 더 중요하므로, 혈액 샘플이 분석될 수 있는 시간의 범위는 더 짧다. 그 예로서는, 일반적으로 24 시간 이내에 수행되어야 하는 혈액 세포의 면역 표현형 분석이 있다. 암 세포 분석법에서는, 더욱 많은 부피의 혈액이 처리되어야 하고, 혈액 샘플의 시험관내 분해는 CTC 및 조혈세포 둘다로부터 유래된 붕괴 세포에 의하여 방출되는 물질이 백그라운드를 증가시킬 수 있음에 따라서 종양 세포의 검출 능력은 더욱 감소되므로, 이로 인하여 더욱 문제가 많을 수 있다.

관찰된 작은 잔해과 큰 덩어리 형태의 응집체의 기원 및 성질에 관하여는 완전히 이해되지는 않았지만, 표적 세포, 비표적 세포 및 혈장 성분으로부터 유래된 세포 성분 또는 요소를 포함하는 것으로 생각된다. CTC는 면역학적으로 외래종인 것으로 간주되므로, 채혈하기 전이라도 생체내에서는 숙주의 정상적 세포 면역 반응이 발생할 것이다. 또한, 다수의 CTC는 종양 부위로부터 연속적으로 유출될 수 있으며, CTC 파괴 속도와 유출 속도가 동일하여, 종양 부하량에 따라 달라지는 정상 상태 수준이 유지된다[JG Moreno 등, "Changes in Circulating Carcinoma Cells in Patients with Metastatic Prostate Cancer Correlates with Disease State." Urology 58. 2001 참조].

혈액으로부터 종양 세포를 회수하는 다양한 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,190,870호(AmCell 및 Miltenyi)에서는 면역자기 분리법 수행후 유동 세포계수법에 의해 계수하는 방법에 관하여 교시하고 있다. 그러나, 면역자기 분리 이전에, 혈액 샘플은 밀도 구배를 이용하여 예비 처리된다. 뿐만 아니라, 원상태 세포(intact cell) 이외에 임의의 것을 분리 또는 계수하는 것에 관하여는 논의되어 있지 않다. 또한, 샘플의 가시적 형태 분석에 관하여도 논의되어 있지 않다.

미국 특허 제6,197,523호(Rimm 등)에는, 100㎕ 혈액 샘플중 암 세포를 계수하는 방법에 관하여 개시되어 있다. 이 방법은 모세관식 현미경을 사용하여 발견된 세포의 실체를 확인하는 방법이다. 이 방법은, 소부피의 샘플에 다수 존재하는 것이 확실한 원상태 세포에 특이적이다. 그러나, 그 외의 것 즉, 단편 또는 잔해를 분리 또는 계수하는 것에 관하여는 논의되어 있지 않다.

미국 특허 제6,365,362호(Immunivest)는 혈액중 종양 세포 샘플을 면역자기적으로 증폭시키고 분석하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 특히 원상태 세포의 분석에 관한 것으로서, 세포의 수는 질병의 상태와 상관되어 있다. 분리된 세포를 핵산 및 부가 마커의 존재에 관하여 표지화함으로써, 분석중 비표적 샘플 성분을 배제시킬 수 있다.

WO 02/20825(Chen)에는 종양 세포를 계수하기 위한 부착 매트릭스의 용도에 관하여 가술되어 있다. 요약하면, 이 매트릭스를 소정의 전이 잠재성을 보유하는 살아있는 암 세포에 결합하게 될 특이적 부착 분자로 코팅시키는 것이다. 이후 이 매트릭스를 포획된 세포(captured cell)의 존재 및 유형에 대하여 분석할 수 있다. 또한 스크리닝 처리에 매트릭스를 사용하는 방법에 관하여도 기술되어 있다. 원상태 세포 및 세포자살 세포 또는 괴사 세포간 구별하는 단계를 수행하긴 하지만, 세포자살 세포 또는 괴사 세포는 분석법으로부터 특이적으로 배제된다.

WO 00/47998(Cell Works)에는 CTC, 종결 및 증식에 관한 2가지 경로에 관하여 기술되어 있다. 상기 두 경로는 형태학상 차이에 의하여 결정되는 "중간체" 세포 즉, 종결 경로 또는 증식 경로로 진행되는 세포에 의해 개시된다. 종결 경로의 세포는 결과적으로 파괴되며, 증식 경로의 세포는 전이 종양으로서 새로운 전이 콜로니를 형성한다. 이러한 증식 경로(세포 또는 클러스터)는 잠재적 진단법의 중심을 차지하지만, 세포 단편 또는 잔해의 유의성을 최소화시킨다. 이들 두개의 경로는 환자의 샘플에서 관찰되는 형태학적 차이점을 설명해 주도록 디자인되었다.

일반적으로, 저항성 및 증식성이 보다 강한 세포는 생존하여 2차 또는 전이 부위를 확보한다. 말초 혈류에서, CTC는 추가로 활성화된 호중구 및 대식세포에 의해 생체내 공격(그리고 시험관내 공격)을 당하여, 막 천공, 전해질 누설, 더욱 작은 분자의 생성을 유발시키고, 또한 궁극적으로는 세포 생존에 필수인 세포 요소 예컨대, DNA, 크로마틴 등과 같은 중요한 세포 요소가 소멸된다. 세포 사멸의 임계 시점에서, 세포 파괴는 세포자살에 의하여 더욱 촉진된다. 세포자살은 일련의 단계별 세포내 서행 현상을 특징으로 하는데, 이는 세포외래종 예컨대, 세포독성 항종양 약물에 의하여 촉진 또는 매개되는 괴사 또는 급속 세포 사멸(rapid cell death)과는 구별된다. 이와 같은 파괴 과정의 전부 또는 일부를 통하여, 붕괴성 CTC 및 약물 치료중 정상적인 조혈세포의 우연적 파괴로부터 생성된, 염색성 DNA, DNA 절편 및 "DNA 래더(DNA ladder)" 구조를 포함하는 잔해 및/또는 응집체를 형성시킬 수 있는데, 그 이유는 대부분의 세포 독성 약물이 독성을 나타내는 투여량애 가까운 양으로 투여되기 때문이다.

WO 00/47998, 미국 특허 제6,190,870호 및 기타 공보에 나타낸 바에 의하면,CTC는 생존 세포 및 사멸 세포 모두의 형태로서 순환할 수 있다고 하며, 여기서 "사멸"이라는 용어는 손상된 세포 및 단편화된 세포 뿐만 아니라 CTC-유래 잔해의 모두를 포함하는 것이다. 종양 부하는 클러스터를 포함하는 원상태 CTC와, 세포의 형태학적 특징(덩어리 및/또는 응집체와 구별되는 특징)을 보유하는 손상된 CTC에 의하여 가장 잘 나타내어질 것이다. 그러나, 일부 손상된 세포는 액상 및 입상 세포질 함유물을 누설시킬 수 있는 커다란 공극을 보유할 수 있으므로, 부유 밀도를 약 1.06∼1.08에서 1.12 이상으로, 또는 RBC의 밀도보다 훨씬 크게 변화시킬 수 있다[Pharmacia 프로토콜에 따르면 생존 및 사멸 세포는 구배 경계 d = 1.12 및 1.16에서 분리될 수 있다]. WO 00/47998에 사용된 종래의 밀도 구배는 폐기된 RBC 층(밀도 범위 : 약 1.08∼1.11)에서 이러한 손상된 CTC를 소실시킬 것이다. 시토케라틴에 대하여 양으로 염색된 CTC 잔해는 또한 RBC 정도의 밀도를 갖거나 또는 그 이상의 범위의 밀도를 가질 수도 있는데, 그 이유는 대부분의 세포내 성분(혈장-연층 계면에 근접하여 위치할 수 있는 친지성 막 단편을 제외)의 밀도가 1.15∼1.3의 범위에 있기 때문이다. 그러므로, 손상된 CTC 및 CTC 잔해의 실제 부분은 연층 외부에 위치할 수 있으며, 이는 밀도 구배 방법 예컨대, WO 00/47998의 방법에 의해서는 확인되지 않는다. 손상되거나 또는 단편화된 CTC의 일부 이미지가 확인되기는 하지만, 시토스핀(cytospin) 또는 그후의 처리중에 손상이 발생할 수 있으므로, 이는 인위적인 것이라 할 수 있다. 대부분의 원상태 종양 세포의 밀도는 WBC 영역에 속할 수 있지만, 환자 샘플중 손상된 CTC는 밀도가 더욱 높아서 RBC 층(구배 기법의 허용 범위 이외)에 속할 수 있을 것으로 보인다.

미국 특허 출원 제2001-0024802호는 단편 및 잔해를 비드에 결합시키는 방법에 관하여 기술하고 있다. 상기 공표된 출원은 목적 단편 및 잔해의 밀도에 대한 다수의 가능성을 기술하고 있다. 원심분리시, 단편 및/또는 잔해과 커플링된 비드의 소정의 비중력(밀도)으로 인하여 비드는 RBC의 위층에 위치할 것이다. 그러나, 이 시스템은 비드에 단편 및 잔해가 올바르게 결합하는지에 의존성이다. 임의의 기타 샘플 성분이 비드에 결합하면, 이 비드는 목적 위치에 나타날 수 없을 것이며, 따라서 분석 결과도 나오지 않을 것이다.

상피 기원 세포 조직은 확립된 성장 및 발생 "규칙"에 순응한다. 이러한 규칙은 군집 조절(population control)을 포함한다. 이는 세포의 수와 크기가 정상적인 환경하에서는 일정하게 유지되며, 유기체의 정상적인 성장 및 발생에 필요할 때에만 변하는 것을 의미한다. 상피의 성질 및 위치에 의존하는 것이 무엇이든지간에, 상피가 그 기능을 수행하는데 필요할 때 상피의 기저 세포 또는 무한증식 세포만이 분열할 것이다. 비정상적이되 양성인 일부 환경하에서, 세포는 증식할 것이며, 기저층은 보통 이상으로 분열하여 이상증식을 일으킬 것이다. 기타 비정상적이되 양성인 일부 환경하에서, 세포의 크기는 특정 조직의 정상적인 크기 이상으로 증가하게 되어, 엽산 결핍증에서와 같은 세포 거대화를 유발시킬 것이다.

상피 조직은 예비 악성종양 또는 악성 병변으로 인해서도 세포의 크기 또는 수를 증가시킬 수 있다. 이러한 경우, 전술한 바와 유사한 변화는 하등 상피내 병변에 있어서 온화한 상태로부터 악성종양에 있어서 심각한 상태까지의 범위의, 핵 이상증을 수반한다. 증상의 심각성이 증가하면 상피가 더욱 두꺼워지므로, 이들 세포에 있어서의 변화는 상피의 두께를 나타내는 부분에 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각된다. 이들 세포는 접촉 억제로 인한 제한에 순응하지 않으며, 조직을 조절하지 않고 계속해서 성장하게 된다. 상피의 전체 두께가 악성의 변화에 의하여 영향을 받을때, 증상은 동일계 암종(carcinoma in situ ; CIS)인 것으로 인지된다.

결과적으로 악성종양 세포는 기저막을 통과하여 악성종양 잠재성이 증가함에 따라서 기관의 스트로마에 침투할 수 있다. 스트로마를 침투한후, 이 세포들은 혈관에 도달할 가능성을 갖게 된다고 생각된다. 일단 이 세포가 혈관에 침습하면, 세포는 이 자신들이 유래된 환경과는 완전히 상이한 환경에 있음을 인식한다.

세포는 단일 세포 또는 2 이상의 세포의 클러스터로서 혈관에 침습할 수 있다. 순환계를 통하여 순환되는 상피 기원의 단일 세포는 다음과 같은 2개의 결과중 어느 하나(즉, 사멸 또는 생존)를 나타낼 것이다.

단일 세포 :

1. 세포는 내부 변화로 인한 세포자살 또는 세포 자체에서의 메시지에 의하여 사멸될 수 있다. 상기 메시지는 침투 이전에 세포에 존재할 수 있거나 또는 혈액중에 있을때 수용될 수 있거나, 또는 숙주의 면역계에 유입됨으로써 사멸할 수 있으며, 세포를 이러한 환경에 대해서 "외래"로서 인식할 수 있다. 세포 사멸의 결과는 CellSpotter(등록상표명)에서 제핵 세포, 세점 세포 또는 무정형 세포로서 확인할 수 있다. 이 세포는 세포 분열할 가능성 또는 콜로니나 전이체를 형성할 가능성이 없다.

- 제핵 세포는 핵 붕괴 및 제거(핵붕괴 및 핵분해)의 결과이다. 이 제핵 세포는 시토케라틴에 대하여 양성이고, 핵산에 대하여는 음성이다.

- 세점 세포(speckled cell)는 시토케라틴 및 DAPI에 대하여 양성으로서, 세포 퇴화 및 세포질 붕괴의 증거를 나타낸다. 이러한 세포들은 세포골격 단백질이 수축함에 따라서, 치료법 또는 숙주의 면역계에 대한 반응을 나타낼 수 있다.

- CellSpotter(등록상표명)를 사용하여 확인가능한 다른 사멸 종양 세포는 무정형 세포이다. 이 세포는 제조 과정중에 손상될 수 있으며, 보다 약하고 보다 예민하되, 세포자살 또는 면역 공격을 받을 수도 있다.

2. 생존 악성종양 상피 세포는 혈류중에서 생존하여 원거리 기관에 콜로니를 형성할 잠재성을 보유할 수 있다. 이와 같은 "생존 세포"는 CellSpotter(등록상표명)에서 핵내 물질/세포질 물질의 비율이 높은 원상태 세포로 나타난다. 이들 세포는 미분화된 세포로서 혈액중에서 잠재적으로 분열하여 원거리 모세혈관(세포가 새로운 콜로니를 형성할 수 있는 곳)으로까지 퍼질 수 있는 작은 클러스터를 형성할 수 있거나, 또는 (콜로니를 새로이 형성하기 시작하는) 새로운 조직에서 그 자체가 분열하여 퍼질 때까지, 단일 세포로서 유지될 수 있을 것이다.

클러스터 :1차 종양은 문헌[B.Brand 등, ("Isolation of prostate-derived single cells and cell clusters fron human peripheral blood", Cancer Research 56, p4556-4561, 1996]에 기술된 바와 같이 혈류에 도입되는 클러스터를 유출시킬수 있다. 이들 클러스터는 클러스터로서 남아서 원거리 조직에 침투할 수 있거나, 또는 혈압차나 면역계 개재에 의하여 혈류내에서 해리될 수 있다. 이들 세포가 단일 세포들로 해리되면, 이 세포는 전술한 단일 세포에 관한 두가지 경로(상기 1 및 2 참조)중 어느 하나의 경로로 진행할 수 있다. 클러스터 형성은 외부 세포를 내부 세포를 면역계로부터 보호하는 보호막으로 사용함으로써 생존할 수 있다.

일단 새로운 콜로니가 새로운 기관에 형성되면, 일부 악성종양 세포는 계속해서 복제하여 새로운 종양을 형성할 것이다. 이 세포가 새로운 모세혈관에 도착하면, 전이 과정은 또 다시 반복되어 2차 전이가 발생한다.

공지의 암종 환자 치료의 모니터 :종양 세포 수의 감소 및/또는 반응 지수의 증가는 환자의 치료법에 대한 반응을 나타낼 수 있다.

- 총 종양 세포 = 사멸 세포 + 생존 세포(TTC = DC + SC)

- 반응 지수 = 사멸 세포/총 종양 세포(RI = DC/TTC)

반응 지수가 높을수록 치료에 대한 반응이 양호한 것이다. 반응 지수가 낮으면 환자가 치료에 반응을 하지 않는다는 의미이거나, 또는 환자의 면역계가 종양 부하를 다룰수 없음을 나타낼 수 있다.

예비 치료 과정(RI = 0/50 = 0)에서 모두 생존한 세포인 총 종양 세포가 50이고 이후(치료후) 과정에서의 TTC가 50인 환자는 RI에 따라서 상이한 결과를 나타낼 수 있다. 모든 TTC가 SC(즉, DC = 0)이면, 치료에 대한 반응이 없는 것이다. 50개의 세포가 존재하되, 반응 지수가 40/50 = 0.8이면, 면역계 또는 치료중 어느 하나는 종양 부하에 부정적인 영향을 주는 것으로서, 환자는 양성 반응을 나타낸다.

공지의 예비 악성종양 환자에 대한 후속 결정 :pap 도말 표본이 샘플 채취시 발생할 수 있는 오류로서 간과되었던, 비정형 또는 하등 상피내 병변을 갖는 세포인 것으로 진단될 때에는, 언제나 이 환자가 보다 심각한 이상 증상을 나타낼 가능성이 있는 것이다. 이 환자는 질경 및 생검될 수 있거나, 또는 반복적인 pap 도말시 3개월 경과후 다시 문진을 받을 수 있다. 비정형 세포가 샘플링되지 않은 악성종양 세포의 작은 병소 영역을 수반하면, 환자는 임의의 후속 처리를 받기전 3개월 동안 대기하게 될 것이다. 이는 일부 예비 악성종양 환자들이 왜 다른 환자들(샘플링 오류로 인한 오진에 의해 통계에서 임위적 결과를 나타낸 환자)보다 병의 진행 속도가 더욱 빠른지를 설명해줄 수 있다. 이는 보통 더욱 "공격적인(agressive)" 예비 악성종양(pre-malignancy)으로서 설명된다. CellSpotter(등록상표명)를 사용하여 이들 환자의 트리(tree)를 결정하는 것을 보조할 수 있다. 비정상적 pap 환자들 모두(미국내 pap 도말 표본의 5∼10%)는 순환성 상피 세포에 대하여 즉시 테스트될 수 있다. 테스트 결과가 양성인 환자들은 즉시 전국적으로 후속 조치를 수행하여야 한다. 테스트 결과가 음성인 환자들은 반복 pap 도말 이후 3개월 동안 대기하여야 한다. 이는 내과의 및 건강 전문가가 진행하는 결정 방법을 단순화시켜 환자들이 이 전문가들이 진행하고자 하는 후속 과정에 대하여 신뢰할 수 있도록 도와준다.

스크리닝 :CellSpotter(등록상표명) 이미지 분석법은, 특정의 조직 특이적 항체가 모든 비정상 샘플에 대한 제2의 테스트에 사용될 수 있는 조건으로 전체 군집의 스크리닝에 사용될 수 있다. 환자에 있어서 CTC를 확인함으로써 전이 과정을 개시하였거나 또는 이를 개시하는 1차적 악성종양이 존재함을 알 수 있다. 이 세포가 새로운 마커를 보유하는 기원 조직으로서 확인되면, CT 유도 미세 바늘 흡출법(FNA)과 같은 기관 특이적 테스트를 적용하여 이러한 악성종양이 존재하는지 여부를 확인할 수 있다. 1차 악성종양이 확인될 수 없는 환자는 개인에 대한 기준선을 확립한후 반복적인 테스트를 수행할 수 있다.

요약하면, 상기 언급된 요인들 모두 또는 일부는, 본 발명에 개시된 바와 같이 전혈로부터 직접 증폭시키는 과정에 의하여 CTC 검출 결과를 혼동시키는 잔해 및/또는 응집체의 형성에 기여하는 것으로 파악될 수 있었다. 원상태의 CTC, 손상되거나 의심되는 CTC의 수와, CTC에 대한 손상의 정도는 종양 부하, 종양 세포의 증식 가능성 및/또는 치료 효능에 관하여 진단학적으로 중요한 지표가 될 수도 있다. 이와는 반대로, 선행 기술의 방법 및 프로토콜은 피할 수 없는 CTC의 생체내 손상과, 피할 수 있는 시험관내 보관 및 처리시 손상을 조합하여, 암 환자의 CTC 및 종양 부하에 관한 오류성 정보를 구할 수 있다. 최종적으로 본 발명에 기술된 비교적 단순한 (감도 및 특이성이 높은) 혈액 테스트는 "전신 생검(whole body biopsy)"인 것으로 생각된다.

우선권 정보

본 출원은 35 USC §119(e)하에서 미국 가명세서 출원 제60/314,151호(2001년 8월 23일 출원) 및 동 제60/369,628호(2002년 4월 3일 출원)의 우선권을 주장하고 있다. 상기 출원은 모두 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다.

기술분야

본 발명은 순환성 종양 세포, 단편 및 잔해의 분석에 관한 것이다.

도 1은 종양 유출 및 전이의 모델을 나타내는 것이다. 도 1a는 세포, 클러스터 및 단편의 가능한 단계를 보여주는 것이다. 도 1b는 샘플로부터 얻어진 실제 이미지를 갖는 동일한 모델을 나타내는 것이다.

도 2는 7.5 ㎖의 혈액으로부터 얻은, 면역자기적으로 증폭된 종양 세포의 유동 세포계수 분석 결과를 나타내는 것이다.

도 3은 종양 세포에 대하여 면역자기적으로 증폭된, 전이성 전립선암 환자의 혈액 샘플 7.5 ㎖의 CellSpotter(등록상표명) 분석 결과를 나타내는 것이다. 작은 점들로 이루어진 선들은 염색 과정중 사용된 상이한 염료에 해당하는 것으로서, 시토케라틴 PE(녹색) 및 DAPI(마그네타)로 염색된 종양 후보 세포를 나타내는 것이다.

도 4는 시토케라틴 PE(녹색) 및 DAPI(마그네타)로 염색된 전이성 전립성 암 환자의 단일 전혈 샘플로부터 분리된 종양 세포의 CellSpotter(등록상표명) 분류 결과를 나타내는 것이다.

A - 원상태 세포

B - 손상된 종양 세포

C - 종양 세포 단편

도 5는 20개의 임상 샘플중 오비어스(obvious) CTC의 수 : 서스펙트(suspect) CTC의 수의 비교 결과를 나타내는 것이다.

도 6은 전혈에 스파이킹되어 분리된후 시토케라틴 PE(녹색) 및 DAPI(마그네타)로 염색된 파클리탁셀 처리 LnCaP 세포의 분류 결과를 나타내는 것이다.

A - 원상태 세포

B - 사멸되는 종양 세포

C - 종양 세포 단편

발명의 개요

본 발명에 기술된 방법 및 시약은 순환성 종양 세포, 클러스터, 단편 및 잔해를 분석하는데 사용된다. 본 분석법은 유동 세포계수법 및 CellSpotter(등록상표명) 형광 현미경 이미지화 시스템을 포함하는 다수의 플랫폼으로 수행된다. 실시예에서는 오비어스(Obvious) 또는 원상태(Intact) CTC를 분석하는 것 뿐만 아니라, 서스펙트(Suspect) CTC 또는 손상된 단편, CTC 클러스터 및 잔해를 분석하는 것도중요하다는 것을 보여준다. 단편 및 잔해를 형성시키는 손상을 모의할 수 있다. 또한, 안정화제를 사용함으로써 샘플 처리 및 채혈간에 추가로 발생되는 CTC의 손상을 억제할 수도 있다.

본원에서는 표본 입수, 운반, 보관, 처리 또는 분석에 의하여 유발되는 시험관내 손상과, 세포자살, 괴사 또는 환자의 면역계에 의하여 유발되는 생체내 손상을 구별하는 능력을 나타낸다. 실제로, 시험관내 손상을 제한, 감소, 제거 또는 최소한 완화시켜 분석법을 방해하지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본원에는 CTC, 클러스터, 단편 및 잔해에 의하여 측정되는 악성종양을 비롯한 순환성 희귀 세포에 기초하여 질병을 진단, 모니터 및 스크리닝하는 방법이 기술되어 있다. 또한 이러한 방법을 사용하여 생물 표본을 분석하는 키트도 제공한다.

본 발명의 상세한 설명

본원에서는 당업자에 의하여 잘 이해되는 용어들을 사용하였다. 이러한 용어가 의도하는 의미는 일반적으로 받아들여지는 의미와 별도의 것은 아니다.

암종 환자에 있어서 최소로 잔류하는 질병이 임상적으로 유의성을 갖는다는 증거는 점점 증가하고 있다. 최소한으로 잔류하는 질환을 효과적으로 모니터하기 위하여, 분석적 및 정량적 평가 방법이 필요하다. 혈액 또는 골수중에는 암종 세포의 출현 빈도가 낮으므로, 분석용 샘플의 제조와 관련된 실험실 규모의 수동식 샘플 제조 방법은 종종 결과에 오류를 가져다 준다. 이러한 한계점을 극복하기 위하여, 공동 소유의 계류중인 미국 특허 출원 제10/081,996호(2002년 2월 20일 출원 ;본원에 참고문헌으로서 인용됨)에 기술된 바와 같은, 반자동 샘플 제조 시스템이 개발되어 변이성을 최소화시켰으며 이로써 더욱 일치되는 결과를 제공하였다.

표적 물질이 특이적으로 결합하는 목적 물질 및 기타 물질 사이의 복합체 형성을 기초로 하여 전술한 표적 물질을 분석 또는 분리하기 위해서 다양한 방법을 수행할 수 있다. 미결합 물질로부터의 복합체의 분리는 표적 물질과 커플링된 세분화 입자 또는 비드를 중력에 의하여 예를 들어, 침강 또는 원심분리시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 입자 또는 비드는 자성 물질로 제조되어 연계된/독립된 분리 단계를 촉진시킬 수 있다. 자성 입자는 면역 반응 및 기타 생물 특이적 친화성 반응에 사용되는 것으로서 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 자성 또는 중력에 의한 분리를 촉진하는 임의의 물질이 본 목적에 사용될 수 있다. 그러나, 자기적 분리 수단은 임의의 방법임이 분명하다.

자성 입자들은 크기에 따라서 다음과 같이 분류될 수 있으며, 이 입자들을 나노입자라고 칭하기도 한다 ; 대(약 1.5∼50 ㎛), 소(0.7∼1.5 ㎛) 또는 콜로이드(< 200 ㎚). 나노입자(페로플루이드(ferrofluid) 또는 페로플루이드 유사 물질이라고도 칭함)는 전통적인 페로플루이드의 특성을 다수 보유하고 있으며, 본원에서는 때때로 콜로이드, 초상자성 입자라고 칭하여지기도 한다.

전술한 유형의 작은 자성 입자들은 생물 특이적 친화성 반응을 바탕으로 한 분석에 꽤 유용한데, 그 이유는 이 입자들이 생물작용성 중합체(예컨대, 단백질)로 편리하게 코팅되어, 표면적을 상당히 증가시켜 합당한 반응 동력학을 부여하기 때문이다. 크기 0.7∼1.5 ㎛ 범위의 자성 입자는 예를 들어, 미국 특허 제3,970,518호 ; 동 제4,018,886호 ; 동 제4,230,685호 ; 동 제4,267,234호 ; 동 제4,452,773호 ; 동 제4,554,088호 ; 및 동 제4,659,678호를 포함하는 특허 문헌에 기술되어 있다. 이 입자중 어떠한 것은 면역학적 시약에 대한 유용한 고체 지지체인 것으로 개시되어 있다.

자기적 분리법이 수행될 수 있는 효율 및 자기적으로 표지화된 세포의 회수율과 순도는 다수의 요인들에 따라서 달라질 것이다. 이 요인들로서는 다음의 것들을 포함한다 :

- 분리된 세포의 수 ;

- 이러한 세포의 수용체 또는 에피토프 밀도 ;

- 세포당 자기장하 ;

- 자성 물질의 비특이적 결합(NSB) ;

- 포집된 비표적 세포의 이동(carry-over) ;

- 사용된 기법 ;

- 용기의 특성 ;

- 용기 표면의 특성 ;

- 배지의 점도 ; 및

- 사용된 자성 분리 장치.

보통의 경우와 마찬가지로, 시스템의 비특이적 결합 수준이 실질적으로 일정하면, 표적 군집이 감소함에 따라서 순도도 감소할 것이다.

표적화 세포의 군집이 작을수록, 자기적으로 표지화하여 회수되기에는 더욱어려워질 것이라는 사실은 그다지 확실치는 않다. 더욱이, 표지화 및 회수는 사용된 자성 입자의 특성에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 세포가 큰 자성 입자 예컨대, Dynal 비드와 함께 항온처리될 때, 세포는 시스템을 혼합할때 발생되는 충돌(비드가 너무 커서 효과적으로 확산될 수 없음으로 인함)로 인하여 표지화된다. 그러므로, 매우 초기의 암의 종양 세포의 경우와 마찬가지로, 세포가 혈액 1㎖당 1 세포의 빈도수(또는 그 이하)로 군집에 존재하면, 표적 세포가 표지화될 확률은 시스템에 첨가된 자성 입자의 수와 혼합 시간의 길이와 관련될 것이다. 오랜 기간 동안 이러한 입자와 세포를 혼합하는 것은 유해하기 때문에, 입자의 농도를 가능한한 많이 증가시킬 필요가 있다. 그러나, 분리시 다량의 자성 입자와 혼합된 희귀 세포가 기타의 혈액 세포와 혼합된 희귀 세포로 치환될 수 있으므로, 첨가될 수 있는 자성 입자의 양에는 제한이 있다. 다량의 자성 입자와 혼합된 희귀 세포는 목적 세포를 계수하는 능력 또는 이를 관찰하는 능력을 눈에 띄게 개선시키지는 않는다.

본 발명을 수행하는데 사용되는 바람직한 자성 입자는 콜로이드처럼 행동하는 입자이다. 이러한 입자는 마이크론 이하의 입자 크기(일반적으로 약 200 ㎚ 미만), 및 장기간에 걸친 용액으로부터의 중력 분리에 대한 이 입자의 안정성을 특징으로 한다. 다수의 기타 이점에 더하여, 이러한 크기 범위는 근본적으로 각각의 입자들을 세포 분석에 통상적으로 사용되는 분석 기법에서 눈으로 확인할 수 없 도록 만든다. 크기가 90∼150 ㎚의 범위내에 있으며 자기 질량이 70∼90%인 입자가 본 발명에 사용되는 것으로 생각된다. 적당한 자성 입자들은 예를 들어, 자성 코어에 물리적으로 흡착되어 있거나 또는 공유 결합되어, 콜로이드 특성을 안정화시키는분자에 의하여 둘러싸여 있는 초상자성 물질의 결정질 코어로 이루어져 있다. 코팅 물질은 샘플에서 발견되는 생물학적 거대분자와 자성 코어간의 비특이적 상호작용을 방지하는데 효과적인 양으로 도포되는 것이 바람직하다. 이러한 생물학적 거대분자는 탄수화물 예컨대, 비표적 세포, 렉틴, 당단백질 및 기타 막성분의 표면상에 시알산 잔기를 포함할 수 있다. 더욱이, 이 물질은 나노입자당 자기 질량을 가능한한 많이 함유하여야 한다. 코어를 포함하는 자성 결정의 크기는 이 결정이 완전한 자성 도메인을 함유하지 않을 정도로 충분히 작다. 상기 나노입자의 크기는 이 입자의 브라운 에너지가 이 입자들의 자기 모멘트를 초과할 정도로 충분히 작다. 결과적으로, 상기 콜로이드 자성 입자의 북극 및 남극의 배치 및 이에 따른 상호간 인력/척력은 이 입자들의 용액 안정성으로 인하여, 약간 강한 자기장에서 조차도 발생하지 않을 것으로 보인다.

마지막으로, 자성 입자는 고자기 구배 외부 장 분리기에서 분리될 수 있어야 한다. 이러한 특성은 샘플 취급을 용이하게 하여, 강자성 비드 또는 강철 울로 로딩된 보다 복잡한 내부 구배 컬럼에 비하여 경제적으로 유리하다. 전술한 특성을 보유하는 자성 입자들은 미국 특허 제4,795,698호, 동 제5,597,531호 및 동 제5,698,27호(상기 문헌들은 모두 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음)에 기술된 기저 물질을 변형시킴으로써 제조될 수 있다.

입자를 제조하는 개선된 방법에 관하여는 미국 특허 제5,698,271호에 기술되어 있다. 이 문헌에 기술된 내용은 상기 미국 특허 제5,597,531호에 기술된 내용에 비하여, 코팅의 수준을 눈에 띄게 증가시키는 고온 코팅 단계를 포함한다는 점에서개선된 것이다. 이 방법을 사용하는 소 혈청 알부민(BSA) 코팅으로 제조된 나노입자들은 예를 들어, 상기 미국 특허 제5,597,531호의 DC-BSA 물질에 비하여 세포에 대한 비특이적 결합 특성이 3∼5배 더 낮다. 비특이적 결합에 있어서의 이와같은 감소는 직접적으로 BSA 코팅 물질의 수준이 증가함으로 인한 것으로 보인다. BSA 코팅을 제거하기 위하여 이러한 나노입자가 처리될 때, 비특이적 결합은 높은 수준으로 복구된다. 그러므로, 철 산화물 결정 표면상에 코팅된 BSA의 양과 세포의 비특이적 결합 사이에 직접적인 관계가 있음을 알 수 있다. 통상적으로 전혈로부터 유래된 세포와 이 입자들의 비특이적 결합율은 0.3%로서, 이는 상기 미국 특허 제5,597,531호에서 제조된 입자의 그것에 비하여 상당히 높다. 따라서, 전혈 10 ㎖에는 증폭을 위해 표적화된 세포와 함께 분리될, 약 200,000개의 비표적 세포가 있을 것이다.

작은 나노입자(30∼70 ㎚)는 보다 용이하게 확산될 것이므로, 이 나노입자들은 이들의 보다 큰 상대물보다 세포를 더 잘 표지화할 것이다. 매우 높은 구배가 적용되는 경우, 예컨대, 내부 구배 컬럼의 경우 이 물질들의 성능은 크기와는 상관없이, 차이가 그리 크게 나지는 않는다. 다시 말해서, 외부 구배, 또는 마이크로비드 또는 강철 울 컬럼상에서 형성될 수 있는 구배보다 작은 구배를 적용할 때, 작은 나노 입자는 세포상에 매우 효율적으로 점유하게 된다. 이는 결과적으로 DC 나노입자를 분획화하여 회수에 대한 효과를 연구함으로써 파악되는 것이었다. 이러한 연구 결과와 기타 최적화 실험에 기초하여, 나노입자를 자기적으로 분획화하는 수단 또는 컬럼상에서 분획화하는 수단은, 지나치게 작거나 또는 큰 나노입자들이 존재하지 않는 자성 입자로 코팅된 기판이 제조될 수 있을때 확립되었다. 예를 들어, 평균 지름 100 ㎚인(80 ㎚보다 작거나 또는 130 ㎚보다 큰 물질이 극소량 존재하는) 입자로 코팅된 기판이 제조될 수 있다. 이와 유사하게, 평균 지름 약 120 ㎚인 물질은 지름이 90∼95 ㎚보다 작은 물질 및 160 ㎚ 이상인 물질을 거의 보유하지 않는다. 이러한 물질은 최적으로 회수되어, 지름이 60∼70 ㎚의 나노 입자를 봉입함으로써 준최적 크기로 제조될 수 있다. 본 발명을 수행하는데 바람직한 입자 크기 범위는 자성 입자 코팅된 기판 예컨대, BSA-코팅된 자철석에 대하여는 90∼150 ㎚이다.

전술한 바를 기초로 하여, 고도로 자성을 띠고, 비특이적 결합율이 낮으며, 콜로이드성인 자성 입자를 이용한 외부장 장치를 사용하는 고 구배 자성 분리법은, (특히, 목적 세포의 하위세트가 전체 군집중 작은 비율을 차지하는 경우) 진핵 세포의 혼합된 군집으로부터 목적 세포의 하위 세트를 분리하기 위한 임의의 방법이다. 이러한 물질은 그 확산 특성으로 인하여, 희귀 현상 예컨대, 혈액내 종양 세포를 용이하게 발견하여 이를 자기적으로 표지화한다. 종양 세포 분석을 위한 자기적 분리 방법이 성공적으로 수행되기 위해서, 자성 입자는 조혈 세포상에 존재하지 않는 에피토프에 특이적이어야 한다.

매우 다양한 분석 방법과 기준이 종양 세포를 확인하는데 사용되며, 그 첫번째 시도는 면역화학법에 의하여 종양 세포를 구성하는 것이 무엇인지를 한정하는 기준을 표준화하도록 행하여졌다. 이 연구법에서는, 전립선 암 환자로부터 얻은 혈액 샘플을 EpCAM을 발현하는 세포에 대해서 면역자기적으로 증폭시켰다. 다색 형광분석법을 이용하여, 세포골격 단백질인 시토케라틴의 발현(CK+), 통상의 백혈구 항원인 CD45의 부재(CD45-) 및 핵산의 존재(NA+)를 통해서 종양 세포를 확인하였다. 희귀 현상(rare event) 또는 희귀 세포는 유동 세포계수법 및 형광 현미경에 의하여 면역표현형별화될 수 있다. 유동 혈구계측 분석법은 형광도가 낮은 수준으로 존재하는 경우에서 조차도 모사적으로 정량할 수 있지만, 형태적 특징이 면역표현형별화에 의하여 확인된 대상의 분류에 도움이 될 수 있으므로 현미경 분석법의 특이성은 더욱 양호하다. 유동 세포계수법과 현미경 분석법에 의하여 전립선암 환자의 혈액중에서 검출된 CTC의 수들 사이에는 상관성이 존재하지만, CK+, CD45-, NA+ 대상의 현미경적 관찰을 통하여 대상중 소수의 것들만이 원상태 세포로 보인다는 사실을 알 수 있다. 이러한 관찰은 순환성 종양 세포의 상당 부분이포자살을 나타낸다는 다른 보고와 일치한다.

"생물학적 표본" 또는 "생물학적 샘플"은 호환적으로 사용될 수 있는 용어로서, 목적 세포를 함유하는 것으로 의심되어, 분석되어지는 인간 테스트 피검체로부터 취하여진 유체 또는 조직의 소부분을 의미하는 것이다. 생물학적 표본이란, 유체 부분, 세포 부분 및 가용성 물질을 함유하는 부분을 의미한다. 생물학적 표본 또는 생물학적 샘플로서는 체액에 한정되지 않고, 예를 들어, 말초 혈액, 조직 균질화물, 모유 흡출물, 결장 세척액, 격막 세척액, 기관지(폐포) 세척액, 늑막액, 복막액, 위심액, 뇨 및 인간 테스트 피검체로부터 얻을 수 있는 기타 세포 공급원을 포함한다. 대표적인 조직 균질화물은 유방암 환자의 전초 소절로부터 얻을 수 있다.

본원에 정의된 "희귀 세포(rare cell)"란 용어는 정상적인 생물학적 표본에는 존재하지 않지만, 비정상적 상태 예컨대, 감염성 질환, 만성 질환, 손상 또는 임신을 나타내는 지표로서 존재할 수 있는 세포를 의미하는 것이다. 희귀 세포는 또한 생물학적 표본에는 정상적으로 존재할 수 있지만, 정상적인 생물 표본에 통상적으로 존재하는 빈도 미만의 빈도수로 존재하는 세포를 의미하는 것이다.

전술한 표적 생물 실체중 임의의 것에 있어서 사용된 "결정기"란 용어는 넓은 의미로는 종종 면역 반응을 유도하는 거대분자 항원에 존재하는 화학적 모자이크를 의미한다. 결정기는 또한 에피토프와 호환적으로 사용할 수 있다. 본원에서 호환적으로 사용된 "생물 특이적 리간드" 또는 "생물 특이적 시약"은 결정기에 특이적으로 결합할 수 있다. 결정기는 특이적 결합 물질(예컨대, 리간드 또는 시약)에 선택적으로 결합하는데 관여하고, 또한 이와 같은 결합을 담당하는 표적 생물 실체의 일부를 의미하는 것으로서, 선택적 결합에 필요한 것이다. 기초적인 용어에서, 결정기는 특이적 결합쌍 반응에서 결합 친화성을 보유하는 제제, 리간드 및/또는 시약에 의하여 인식되는 표적 생물 실체상에 존재하는 분자적 접촉 영역이다.

본원에 있어서, "특이적 결합쌍"이란 용어는, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작동물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 핵산(RNA 또는 DNA) 혼성화 서열, Fc 수용체 또는 마우스 IgG-단백질 A, 아비딘-비오틴, 스트렙타비딘-비오틴 및 바이러스-수용체 상호작용을 포함한다.

본원에 있어서 "검출 가능한 표지"란 용어는 직접적으로 또는 간접적으로, 물리적 또는 화학적 수단에 의한 검출 또는 측정 결과가 테스트 샘플중 표적 생물실체의 존재를 나타내는 것인 임의의 물질을 의미하는 것이다. 유용한 검출 가능한 표지의 대표적인 예로서는 다음의 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다 : 흡광도, 형광도, 반사도, 광산란도, 인광도 또는 발광 특성을 기초로 하여 직간접적으로 검출가능한 분자 또는 이온 ; 방사능 특성에 의하여 검출 가능한 분자 또는 이온 ; 핵 자기 공명성 또는 상자성에 의하여 검출 가능한 분자 또는 이온. 흡광도 또는 형광도를 기초로 하여 간접적으로 검출 가능한 분자들의 군 중에는, 적당한 기질을 (예를 들어, 비흡광성 분자에서 흡광성 분자로, 또는 비형광성 분자에서 형광성 분자로) 전환시키는 다양한 효소가 존재한다. 분석법은, 다변수 유동성 세포계수법, 면역형광 현미경, 레이저 주사 세포계수법, 명시야계 이미지 분석법, 모세관 부피측정법, 스펙트럼 이미지화 분석법, 수동식 세포 분석법, Cell Spotter(등록상표명) 분석법, CellTracks(상표명) 분석법 및 자동화 세포 분석법을 비롯하여, 사용된 다수의 플랫폼중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다.

"실질적으로 배제될 때까지"란 표현은 생물 특이적 리간드 또는 생물 특이적 시약과 이의 해당 표적 결정기 사이의 결합 반응의 특이성을 의미하는 것이다. 표적 결정기에 대한 특이적 결합 활성을 보유하는 생물 특이적 리간드 및 시약은 또한 다른 샘플 성분에 대한 비특이적 결합성을 낮은 수준으로 나타낼 수 있다.

"초기 단계의 암"이란 표현은 본원에서 "단계 Ⅰ" 또는 "단계 Ⅱ"의 암과 호환적으로 사용되는 것으로서, 임상적으로 기관-제한적인 것으로 확인된 암을 의미한다. 또한 너무 작아서 통상의 방법 예컨대, 유방암 환자에 있어서의 유선조영술, 또는 폐암 환자에 있어서의 X-레이 검사법으로는 검출될 수 없는 종양도 포함된다.유선조영술은 약 2 ×10⁸개의 세포로 이루어진 종양을 검출할 수 있는 반면에, 본 발명의 방법은 대략 이 크기의 또는 그보다 작은 크기의 종양으로부터 유래된 순환성 암 세포를 검출할 수 있을 것이다.

본원에 있어서 "증폭(enrichment)"이라는 용어는 처리된 분석 샘플중 표적 생물 실체(예컨대, 종양 세포) : 비표적 물질의 비율을, 원래의 생물학적 샘플에서의 비율에 비해서 실질적으로 증가시키는 과정을 의미한다. 말초 혈액이 출발 물질로서 사용될 경우, 증폭 정도를 평가할때 적혈구 세포는 계수되지 않는다. 본 발명의 방법을 사용하여, 순환하는 상피 세포를 백혈구에 비하여 2,500배 이상, 더욱 바람직하게는 5,000배 및 가장 바람직하게는 10,000배 정도까지 증폭시킬 수 있다.

"항응고제" 또는 "항응고성 제제"란 용어는 호환적으로 사용될 수 있는 용어들로서, 어떠한 바람직하지 않은 특성 또는 인위적인 응고 현상을 억제할 목적으로 생물학적 표본에 첨가되는 조성물을 의미한다. 응고 현상의 예로서는 혈액 응고가 있으며, 통상의 항응고제로서는 킬레이트제 예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA), 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산(EGTA), 또는 복합화제 예컨대, 헤파린, 및 헤파린 종 예컨대, 헤파린 설페이트 및 저분자량 헤파린이 있다. 이를 총체적으로 "덩어리(clumping)" 또는 "덩어리 형성(clump formation)"이라고 정의한다. 그러나, 이러한 덩어리는 CTC "클러스터" 또는 이의 응집체로부터 분화된 것으로서, 원상태 CTC에 대한 분류 기준과 부합되면 단일 원상태 CTC로서 계수된다.

CTC 클러스터는 단일 CTC보다 증식 가능성이 큰 것으로 생각되므로, 이 클러스터의 존재는 진단학적으로 매우 중요한 의미를 갖는다. 2차 전이 종양 부위를 확보하는 경향을 증가시키는 한가지 가능성은 이 부위의 부착성을 이용하는 것이다. 가장 가능성이 높은 것은 CTC 클러스터의 실제 크기로서 ; 클러스터 크기가 더욱 크면 골 내부에 존재하는 작은 지름의 모세 혈관 또는 공극에 머무르게 될 것이다. 여기에 일단 머무르게 되면, 클러스터중 세포의 생존성은 새로운 전이 부위에서의 생존 가능성을 결정하게 될 것이다.

이상적인 "안정화제" 또는 "보존제"(본원에서는 호환적으로 사용됨)는 생물 표본중에 존재하는 목적 표적 세포를 보존할 수 있으며, 분석에 방해가 되는 즉, 어떠한 방식으로든 표적 세포의 분리, 검출 및 계수, 그리고 비표적 세포와의 구별을 방해하는 응집체와 세포 잔해가 생물 표본에 형성되는 것을 최소화시키는 조성물로서 정의된다. 다시 말해서, 항응고제와 함께 사용될때, 안정화제는 항응고제의 수행능을 방해해서는 안된다. 역으로 말하면, 항응고성 제제는 안정화제의 수행능을 방해해서는 안된다. 또한, 개시된 안정화제 역시 제3의 고정 작용을 수행하여, 침투 가능한 세포를 안정화시키며, 여기서 "침투가능한(permeabilized)" 또는 "침투화(permeabilization)" 및 "고정", "고정된" 또는 "고정화"는 세포 생물학에서 통상적으로 정의되는 바와 같이 사용된다. 본원에서 안정화제에 관한 설명에는, 농도 또는 양이 표적 세포를 손상시키지 않고 안정화시키기에 효과적일 경우, 이 제제를 세포 생물학 분야의 당업자가 용이하게 알 수 있는 적당한 농도 또는 양으로 사용하는 것이 함축되어 있다. 희귀한 세포를 보존할 목적으로 본 발명의 조성물,방법 및 장치를 사용하는 사람은 분명히 상기 희귀한 세포를 손상시키거나 파괴하는 방식으로 사용하지 않을 것이므로, 처음부터 적당한 농도 또는 양을 선택할 것이다. 예를 들어, 포름알데히드 공여체 이미다졸리디닐 우레아는 상기 표본 부피를 기준으로 일정한 농도 바람직하게는 0.1∼10%, 더욱 바람직하게는 0.5∼5% 및 가장 바람직하게는 약 1∼3%에서 효과적인 것으로 파악된다. 추가의 제제 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜은 또한 표본 부피를 기준으로 일정한 농도 바람직하게는 약 0.1∼약 5%, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼약 1%, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.1∼약 0.5%에서 효과적인 것으로 파악된다.

안정화제는 최소 수 시간 동안 샘플을 보존할 수 있어야 한다. 그러나, 셈플은 최소 72 시간 동안 안정화될 수 있는 것으로 보인다. 이러한 장기 안정성은 처리 및 분석이 행하여질 위치에서 멀리 떨어진 위치로부터 샘플을 얻는 경우 중요하다. 또한, 샘플은 운반중 기계적 손상에 대하여 안정하여야 한다.

안정화제는 생체내 종양 세포 붕괴 및 시험관내 샘플 분해로 인한 붕괴를 구별하는데 필요하다. 그러므로, 안정화제 조성물 및 이의 사용 방법 그리고 이를 사용하기 위한 장치는 공동 소유의 계류중인 출원(발명의 명칭 : "Stabilization of cells and biological specimens for analysis")에 기술되어 있다. 이와 같은 공유 출원은 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있다.

"오비어스 세포(obvious cell)" 또는 원상태의 세포(intact cell)"이란 용어는 호환적으로 사용될 수 있는 것으로서, 이미지화 분석법 수행시 발견되는 핵산 및 시토케라틴 함유 세포를 의미하는 것이다. 일반적으로 이 세포는 둥글거나 또는타원형으로 보이는데, 때로는 다각형 또는 장방형으로 보일 때도 있으며, 개개의 세포 또는 세포 클러스터로 보이기도 한다. 핵산 영역(즉, 핵산 염료에 의하여 표지화된 영역)은 세포질 영역(즉, 항-시토케라틴에 의하여 표지화된 영역)보다 작으며, 세포질 영역에 의하여 둘러싸여 있다.

"서스피셔스 세포(suspicious cell)", "서스펙트 세포(suspect cell)" 또는 "단편"이란 용어는 호환적으로 사용될 수 있는 것으로서, 이미지화 분석법 수행시 발견되며 원상태 세포와 외형상 닮아 눈으로 구분이 안되는 세포를 의미하는 것이다. 이미지화 분석법에 기초하여, 이하의 세포들을 포함하여 여러가지 유형의 의심 세포가 존재한다 :

1. 분명한 세포와 유사한 형태를 띠고 있으며, 시토케라틴에 대하여는 양성으로 염색되지만, 핵산에 대하여는 음성으로 염색되는 제핵 세포 ;

2. 핵산에 대하여는 양성으로 염색되지만, 불규칙적으로 염색되는 시토케라틴을 보유하는 세점 세포(speckled cell) 또는 점무늬 세포(punctuate cell) ; 및

3. 시토케라틴 및 핵산에 대하여는 양성으로 염색되지만, 형태가 불규칙적이거나 또는 비정상적으로 큰 무정형 세포.

이와 같은 의심스러운 세포는 CTC의 특성 및 환자의 질환에 대한 추가의 정보를 제공할 수 있으므로, 본 발명에서 주목받고 있는 세포이다. 염색 또는 이미지화 결과는 분석법 수행 동안 관찰될 수 있다. 예를 들어, 제핵 세포는 때때로 핵은 염색되되, 그 핵내 핵산은 존재하지 않는 "고스트(ghost)" 영역을 보유하는 것으로 보인다. 이는 표지화 기법 또는 이미지화 기법을 비롯한 다수의 외부 요인에 의하여 유발될 수 있다. 뿐만 아니라, 세포는 "분리된" 핵과 함께 관찰되었다. 이것이 그 핵을 방출하는 세포를 나타낼 수 있을때, 이는 이미지화 시스템 사용의 결과로 인하여 나타나는 세포일 것으로 파악된다. 그러나, 이러한 "결과"가 실제 나타날때, 이는 원상태 세포에서 무슨일이 발생될 수 있는지에 관한 유용한 정보를 제공한다. 따라서, 본 발명의 일부로서, 의심스러운 세포는 보다 면밀하게 분석될 것이다.

잔해와 세포는 반드시 유사할 필요는 없다는 점에서 세포 단편은 "잔해(debris)"와 상이하다. 본원에 사용된 잔해가라는 용어는 처리중 특이적으로 또는 비특이적으로 표지된 미분류 대상을 의미하는 것으로서, 분석법 수행시 이미지로서 확인은 되지만, 원상태 세포 및/또는 의심 세포와는 구별된다. 예를 들어, 손상된 세포는 핵내 물질을 방출할 것으로 확인되었다. 처리중 상기 핵내 물질은 비특이적으로 자기 표지화된후, 핵산 염색으로 표지화될 수 있다. 분석중, 시토케라틴이 여전히 부착되어 있을때, 자기 표지화되고 염색된 핵 물질이 관찰될 수 있다. 분석을 통하여, 잔해로서 분류되는 것으로 보이는, 유사하게 자기적으로 선택되어 염색된 기타의 대상이 존재한다.

본원에 사용된 "형태 분석"이라는 용어는, 어떤 대상에 있어서 가시적으로 관찰될 수 있는 특성 예컨대, 크기, 형태 또는 특정 성질의 존부를 의미한다. 형태적 특징을 시각화하기 위해서는, 통상적으로 대상을 비특이적으로 염색시킨다. 본원에 사용된 "에피토프 분석"이란 용어는, 특정 에피토프에 대하여 표지화된 대상을 관찰하는 것을 의미한다. 에피토프의 특징을 가시화하기 위해서는 통상, 대상을특이적으로 염색시키거나 또는 표지화하여야 한다. 형태 분석은 에피토프 분석법과 병행되어 대상에 대한 더욱 완벽한 분석 결과를 제공할 수 있다.

시각에 의한 관찰의 추가의 중요성은 단편 및 잔해가 종종 "지정되지 않은 현상(Not Assigned Events)" 또는 "미지정 현상(Unassigned event)"으로 분류될 때 부각된다. 이 용어는 시각에 의하지 않은 분석법 예컨대, 유동 세포계수법으로부터 유래된 것이다. 유동 세포계수법이 대상을 이미지화하지 않기 때문에, 특정 군집에 국한되지 않는, 표적 세포 또는 비표적 세포(WBC에 비특이적으로 수행되는 경우와 마찬가지로 음성적으로 표지화되는 세포)에 대한 기준과 부합되는 임의의 현상은 이들 군집중 어떠한 군집에도 해당하지 않을 것이다. 그러나, 본 명세서 전체를 통하여 알 수 있듯이, 이러한 미지정 현상은 중요하다.

도 1은 유출 및 전이를 비롯한 다수의 CTC 단계의 모델을 나타내는 것이다. 도 1a는 세포, 클러스터, 단편 및 잔해에 있어서의 이러한 단계들을 나타낸다. 도 1b는 이러한 단계에 있는 샘플로부터 얻은 실제 이미지이다. 세포 클러스터, 단편, 및 잔해의 이미지는 환자 샘플의 CellSpotter(등록상표명) 분석으로부터 나온 결과이다. 조직 샘플(기원 부위 및 전이 부위)의 이미지는 임의의 부위에서 얻었다[Manual of Cytology, American Society of Clinical Pathologist Press, 1983].

간단히 말해서, 1차 종양으로부터 혈액으로 유출된 단일 세포는 혈액내에서 생존하거나 또는 사멸한다. 만일 세포가 생존하면, 혈액내에서 분열되거나 또는 2차적 부위에서 콜로니를 형성할 수 있다. 만일 세포가 사멸하면, 방법에 따라서 세포는 다양한 형태의 단편 또는 잔해으로 분해된다. 다른 가능성은 1차 종양으로부터 혈액내로 유출된 세포 클러스터가 2차적 부위에서 단일 세포로 해리되거나, 또는 원상태로 유지되어 콜로니를 형성할 수 있다는 것이다. 클러스터가 해리되면, 이는 전술한 단일 세포와 유사하게 행동할 수 있다. 클러스터가 원상태로 유지되면, 전술한 이유 즉, 지름이 큰 클러스터가 지름이 작은 모세혈관에 머무르게 됨으로 인하여 2차적 콜로니를 형성하게 될 것이다. 일단, 머무르게 되면, 세포가 생존할 경우 클러스터는 새로운 종양을 형성하게 될 것이다.

극소수의 원상태 세포와 함께 단편 및 잔해가 존재하는 것은 전이의 가능성이 아주 작다는 것을 시사한다. 단편화된 세포는 분열하지 않을 것이며, 따라서 2차 종양을 형성할 수 없다. 실제로, 원상태 CTC 또는 형성 가능한 CTC 클러스터만이 2차적 부위를 콜로니화시킬 수 있을 것이다. 부착 및 침투 과정에 관여하는 항원을 확인하면 도움이 될 수 있다. 클러스터를 보유하거나 또는 보유하지 않는 환자의 전이 부위를 평가하는 후속 단계는 또한 추가의 관찰 결과를 제공할 것이다. 핵 형태학은 세포의 활동 상태 및 이상성을 측정하는데 사용된다. 크로마틴 응집, 인의 존부, 그리고 과염색증은 세포가 양성인지 또는 악성인지, 면역 반응에 반응하는지 또는 치료에 반응을 하는지 여부를 측정하는데 사용되는 기준이다. 세포질 형태학은 분화 수준(즉, 기원 조직)을 측정하는데 사용된다. 예를 들어, 세포질 형태학은 세포를 편평 세포와 선상 세포로 분류할 수 있다.

채혈 및 후속 표본 처리 과정중에, 말초 혈류중에 존재하는 생존 침투 종양 세포는 텅빈 관으로 혈액을 빨아들일때 발생하는 난류 현상 및 표본 처리 과정 예를 들어, 혈액 튜브 운반 및 분석전 혼합 과정으로 인하여 추가로 스트레스를 받아 손상될 수 있다. 이러한 기계적 손상은 진행중인 면역, 세포자살 및 괴사 과정에 부가적인 것으로서 시간 의존적 방식으로 시험관내에서 CTC의 파괴를 유발시킨다. 표본을 보관하는 시간이 길어질수록, CTC의 손실율과 분석에 방해가 되는 잔해 및/또는 응집체의 양은 더욱 증가하게 된다는 것을 파악하였다. 실제로, 본 명세서중에 제시된 데이터(도 2 및 도 3)에 따르면, 실온에서 24 시간 이상 동안 보관된 몇몇 혈액 표본중 CTC 계수가 급격히 감소함을 알 수 있는데, 이는 채혈후 CTC가 실질적으로 시험관내에서 파괴됨을 시사한다. 조혈 세포 소실이 널리 공지된 현상이고 전술한 특허(Streck Labs 등)의 주제일때, 혼합 또는 운반으로 인한 기계적 손상의 발생은 CTC 또는 희귀 세포의 소실에서 인식되지 않았던 요인인 것으로 규정하여야 한다. 세포 잔해의 형성 및 축적되는 잔해 및/또는 응집체의 CTC 또는 기타 희귀 세포 분석에 있어서의 방해 효과도 이와 유사하게 인식되지 않았던 것으로 규정되어야 한다. 비교적 부피가 큰 혈액 샘플(5∼50 ㎖)의 처리에 필요한 고감도 증폭 분석법, 및 부피 감소(1㎖ 미만) 이후의 표적 세포의 후속 현미경 검출 또는 이미지화에 있어서 가장 큰 문제로 대두된다. 이러한 잔해는 보통은 관찰되지 않는 것이거나, 또는 예를 들어, 유동 세포계수법에 의한 통상의 비증폭 분석법 또는 밀도 구배 방법에 의한 증폭법을 방해하지 않는 것이다.

환자에서 관찰되는 손상된 상피 세포 및 상피 세포 단편이 화학요법에 의하여 유발되는 종양 세포의 세포자살에 의하여 유발될 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 종양 세포 사멸을 모의하는 모델을 개발하였다. 전립선 세포주인 LnCaP 세포를 파클리탁셀을 첨가하여 또는 첨가하지 않고서 배양한 다음 이를 건강한 공여자의 혈액에 스파이킹시킨다. CellSpotter(등록상표명)에 의하여 분석된 파클리탁셀 처리 샘플의 면역자기적으로 선택된 세포는 환자의 혈액 샘플에서 관찰되는 세포와 비슷하다. 파클리탁셀 처리된 세포는 세포자살의 징후를 나타내었다. 세포의 점무늬 시토케라틴 염색 패턴은 세포골격 단백질이 붕괴되었음을 나타내는 것으로 보인다[도 4b 및 도 6b]. 파클리탁셀의 미세소관 안정화 효과로부터 기인한, 서열에서 발생되는 현상중 처음 발생하는 현상은, 세포골격의 손상을 감작하는 프로-세포자살 유전자인 Bim을 활성화시킬 수 있다. 세포자살로부터 기인한 카스파제 절단 시토케라틴에 대한 추가의 증거는 세포자살 초기에 카스파제 절단에 의해 노출되는 시토케라틴 18의 에피토프를 인지하는 M30 Cytodeath 항체(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)를 사용하여 얻어진다. 파클리탁셀로 처리된 LnCaP 세포만이 M30으로 염색되고, 대부분의 이량체 시토케라틴 세포는 M30으로 염색되는데, 이는 세포자살이 진행되고 있는 세포에서와 같다.

증폭된 샘플중 세포를 확인하고 계수하기 위하여 다수의 상이한 세포 분석 플랫폼이 사용될 수 있음에 주목해야 할 것이다. 이러한 분석용 플랫폼의 예로서는 Immunicon의 CellSpotter(등록상표명) 시스템, 실시예 Ⅱ에 기술된 바와 같이 세포의 수동식 관찰을 위한 현미경 검출법을 사용하는 자기적 세포 고정화 및 분석 시스템과, 보다 진보된 자동 광학 주사 시스템인 CellTracks(상표명) 시스템이 있다. 이러한 두개의 분석용 플랫폼에 관하여는 미국 특허 제5,876,593호, 동 제5,985,153호 및 동 제6,136,182호[각 특허는 수동식 또는 자동식 정량적 및 분석적 세포 분석법을 위한 상기 각 장치 및 방법을 개시하고 있으며, 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음]에 기술되어 있다.

기타 분석용 플랫폼으로는 레이저 주사 Cytometry(Compucyte), 명시야계 이미지 분석법(Chromavision) 및 모세관 Volumetry(Biometric Imaging)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예의 방법 및 조성물을 사용하는 혈액내 순환성 상피 세포의 계수법은 혈액으로부터 유래된 상피 세포의 면역자기적 선택법(증폭법) 수행후 샘플을 분석함으로써 이루어진다. 면역자기적 샘플 제조물은 샘플의 부피를 줄이고 표적(상피) 세포를 10⁴배 증폭시키는데 중요하다. 다변수성 유동 세포계수 분석법에 사용되는 시약은 상피 세포가 2광 산란(two light scatter) 및 3 형광 매개변수(three fluorescence parameter)를 리스트모드(listmode)로 취득함으로써 형성되는 다차원적 공간중 특정 위치에 배치되도록 최적화된다. 상기 시약으로서는 다음과 같은 것들을 포함한다 :

1. 백혈구(비종양 세포)를 확인하기 위한 pan-백혈구 항원의 CD45에 대한 항체 ;

2. 잔류하는 적혈구 세포, 혈소판 및 기타 비핵형성 현상을 배제하는 세포 유형 특이적 염료 또는 핵산 염료 ; 및

3. 생물 특이적 시약 또는 시토케라틴에 대하여 생성된 항체, 또는 면역자기적으로 세포를 선택하는데 사용되는 것과는 상이한 EpCAM 에피토프에 대한 특이성을 보유하는 항체.

증폭된 종양 세포 군집의 분석 방법은 본 발명이 의도하는 용도에 따라 달라질 것이라는 사실은 당업자에 의하여 인식될 것이다. 예를 들어, 이하에 기술된 바와 같이 암을 스크리닝할 때, 또는 질환의 재발을 모니터링할 때, 순환성 상피 세포의 수는 매우 적을 수 있다. 정맥 주사시 도입될 가능성이 높은 상피 세포가 "정상" 수준으로 존재하므로, 상피 세포를 정상 또는 종양 세포로서 확인하는 분석 방법이 바람직하다. 그러한 경우에, 현미경계 분석법은 가장 정확한 것으로 판명될 수 있다. 이러한 관찰은 또한 형태 관찰, 기지의 종양 특이 체질 관련 분자(예컨대, 암 유전자)의 확인을 포함한다.

환자

환자의 연령 범위는 47∼91세(평균 74세)로 하였으며, 일단 2∼10 년 동안 관찰한 이후에 연구를 개시하였다. 치료 단계를 위하여 임상 기록을 재검토하였다. 환자 및 건강한 지원자들은 승인된 연구에 대한동의서에 서명하였다. 혈액을 10 ㎖ EDTA Vacutainer(상표명) 튜브(Becton-Dickinson, NJ)에 채취하였다. 샘플을 실온으로 유지시키고 특별한 지시가 없으면 수집후 6 시간 이내에 처리하였다.

샘플 제조

공동 소유인 미국 특허 제6,365,362호 및 미국 특허 출원 제10/079,939호(2002년 2월 19일 출원)(상기 두 문헌은 모두 전체가 본원에 참고문헌으로 인용됨)에서 교시하는 바와 같이, 상피 세포 부착 분자(EpCAM)를 확인하는 모노클로날 항체로 표지화된 자성 나노입자를 사용하여 조혈 세포로부터 유래된 상피 세포를 표지화하고 이를 자기적 수단에 의하여 분리하였다. 부피 200㎕로 재현탁시킨 자기 포획된 세포를 형광 표지화시켜 조혈 세포와 상피 세포간 구별하였다.피코에리트린(CK-PE)에 접합된 케라틴 4, 5, 6, 8, 10, 13 및 18을 인지하는 모노클로날 항체를 사용하여 상피 세포를 인지하고, CD45를 인지하는 모노클로날 항체를 사용하여 백혈구와, 시토케라틴에 비특이적으로 결합하는 조혈세포를 확인하였다.

다색 형광 현미경(CellSpotter(등록상표명)) 분석법을 위하여, CD45를 알로피코시아닌(CD45-APC, Caltag, CA)에 접합시켰던 반면에, 유동성 세포계수 분석법을 위하여, 페리디닌 클로로필 단백질 접합된 CD45(CD45-PerCP, BIOS, San Jose, CA)를 사용하였다. 핵산 특이적 염료인 DAIP(4,6-디아미디노-2-페닐인돌)를 사용하여 CellSpotter(등록상표명) 시스템내에서 핵을 확인 및 가시화하였고, Procount 시스템(BDIS, San Jose, CA)내에서 핵산 염료를 사용하여 유동성 세포계수법으로 세포를 확인하였다. 항온처리후, 과량의 염색 시약을 흡출한 다음 포획된 세포를 재현탁시켜 12 ×75 ㎜ 튜브로 옮기거나, 또는 2개의 자석 사이에 챔버를 보유하는 자성의 요크 조립체(Captivate, Molecular Probes, OR)내에 포함되어 있는 CellSpotter(등록상표명) 분석 챔버[미국 특허 출원 제10/074,900호(2002년 2월 12일 출원, 본원에 참고문헌으로 인용됨)에 기술]에 옮겨 유동성 세포계수 분석법을 수행하였다.

실시예 1

유동성 세포계수법을 통한 샘플의 분석

488 ㎚ 아르곤 이온 레이저가 장착된 FACSCalibur 유동성 세포계수 장치로 샘플을 분석하였다(BDIS, San Jose, CA). 핵산 염료의 형광도의 한계치를 사용하여 CellQuest(BDIS, San Jose, CA)로 데이터를 수집하였다. 8000개의 비드 또는 샘플의 80%가 분석되었을때 데이터 수집을 정지하였다. 리스트모드 데이터에 대해서 다변수 데이터 분석을 수행하였다[Paint-A-Gate^Pro, BDIS, San Jose, CA]. CTC 현상에 대한 분석 기준으로서는, 전방향 광 산란에 의하여 특정되는 크기, 직교 광 산란에 의하여 특정되는 입자성, PE-표지화된 항-시토케라틴 MAb에 의한 양성적 염색성 및 PerCP-표지화된 항CD45 Mab에 의한 비염색성을 포함한다. 각각의 샘플에 있어서, 상피 세포에 통상적인 영역에 존재하는 현상의 수에 1.25를 곱하여 유동성 세포계수법에 의하여 분석되지 않은 샘플 부피를 계산하였다.

도2의 패널 A, B 및 C는 전이성 전립성 암 환자의 혈액 샘플의 유동성 세포계수 분석법을 나타내는 것이다. 패널 B에서 2개의 수직선은 백혈구(붉은 점)의 핵산(NAD) 함량의 최소 한계치와 최대 한계치를 나타내는 것이다. CTC 후보 세포는 시토케라틴을 발현하며(CK+), CD45는 보유하지 않고(CD45-), 또한 핵산을 함유(NAD+)한다. 백혈구와 동일하거나 또는 그보다 높은 NAD를 보유하는 CTC 후보세포는 흑색으로 표시되는 세포이다. NAD 함량이 백혈구의 함량 미만인 CK+, CD45- 현상은 표적 세포로 간주되지 않으며, 이는 청색으로 표시하였다. 전방향 광 산란시그널이 더욱 작음을 통하여 입증되는 바와 같이, 청색으로 표시한 현상은 흑색 으로 표시한 CTC 보다 명백히 더 작다. NAD 염색 강도에 대한 한계치는 명백히 NAD 염색 강도가 훨씬 더 작은 CK+, CD45- 현상의 대부분을 배제한다. 건강한 공여자로부터 얻은 혈액 샘플의 분석에 있어서, 이와 같은 소수의 CK+, CD45- 현상들이 관찰되는 데, 이는 이러한 현상이 암과 관련되어 있음을 시사하는 것이다. 건강한 공여자로부터 얻은 혈액의 통상적인 분석예를 도 2의 D, E 및 F에 나타내었다.

실시예 2

CellSpotter(등록상표명)를 통한 샘플 분석

CellSpotter(등록상표명) 시스템은 수은 아치형 램프, 10X 대물렌즈, 고해상도 X, Y, Z 단 및 4개의 필터 큐브 교환기로 이루어져 있다. 4개의 큐브 각각에 있어서 여기 필터, 이색 필터 및 방사 필터는 DAPI 365nm/400nm/400nm용의 것, DiOC16 480nm/495nm/510nm용의 것, PE 546nm/560nm/580nm용의 것 그리고 APC 620nm/660nm/700nm용의 것이었다. 디지털 프레임 그래버와 연결된 디지털 카메라로 이미지를 얻었다. 챔버 표면은 80.2 ㎟이며, 560개의 이미지를 만들어내는 4개의 필터 각각당 35개 이미지로 이루어진 4개 열은 전체 표면을 커버할 수 있어야 한다. CellSpotter(등록상표명) 취득 프로그램은 이미지가 얻어지는 영역, 얻어진 이미지의 수, 각 이미지의 위치 및 각 위치에서 사용하는 현미경의 초점을 자동으로 결정한다. 샘플로부터 얻어진 모든 이미지는 특정 샘플 확인에 특유한 디렉토리로 로깅된다. 샘플로부터 얻어진 모든 이미지에 대하여 알고리즘을 적용시켜, DAPI 및 CK-PE에 대하여 염색되는 위치를 검색한다. 염색된 지역이 잠재적 종양세포(DAPI+, CK-PE+)의 지역과 일치하면, 소프트웨어는 이 지역의 위치를 데이터베이스에 저장한다. 소프트웨어는 각 박스에 작은 점으로 표시하고, 사용자는 각 열에 나타낸 이미지가 종양 세포에 해당하는지, 또는 백혈구 마커인 CD45로 염색되는지응 확인할 수 있다. 소프트웨어는 각 샘플에 대하여 체크된 박스들을 표로 나타내며, 정보는 데이터베이스에 저장된다.

도 3은 전이성 전립선 암 환자로부터 얻은 혈액 샘플의 CellSpotter(등록상표명) 분석 결과의 예를 나타내는 것이다. 잠재적으로 종양 세포를 함유하는 영역을 작은 점으로 이루어진 열로 나타내었다. 도면의 좌측 하부 코너에 있는 길이 표시는 상기 작은 점들의 크기를 나타내는 것이다. 우측에서부터 좌측으로 이 작은 점들은 막성 염료(DiOC₁₆(3)) 및 표면 CD45(CD45-APC) 염색된 핵(DAPI), 세포질 시토케라틴(CK-PE), 대조군 세포를 나타낸다. 좌측의 혼합 이미지는 보라색으로 염색된 핵(DAPI) 과 녹색으로 염색된 세포질(CK-PE)의 색상이 겹침으로써 발생하는 잘못된 색상을 나타내는 것이다. 상기 혼합 이미지 측면에 위치하는 체크 박스는 사용자가 일렬로 나열되어 나타낸 이미지가 종양 세포와 일치함을 확인할 수 있도록 해주고, CD45-APC 이미지 측면에 위치하는 체크 박스는 백혈구 또는 종양 세포가 비특이적으로 염색되었음을 확인시켜 주는 것이다. 상기 환자 샘플에서, 소프트웨어는 2761개의 작은 점들로 이루어진 열을 확인하였는데, 이 열들은 종양 세포와 염색이 일치함을 나타내는 것이다. 도면에서 2761개의 열들중 18개를 1631∼1640 및 1869∼1876으로 표시하였다. 1631번, 1636번, 1638번, 1640번 및 1873번 ∼ 1876번 열들을 체크 표시하였는데, 이는 CTC의 특징[4㎛ 이상의 크기, 세포질 시토케라틴 염색에 의하여 둘러싸인 핵의 존재 및 DiOC₁₆(3) 및 CD45 염색의 부재]을 나타내는 것이다. 종양 세포의 형태상의 차이점에 주목하라 : 1638번 열에 존재하는 세포는 크고 1640번 열에 존재하는 세포는 상당히 작다. 1634번 및 1869번 열에 해당하는 현상의 면역표현형은 종양 세포와 일치하지만, 그 형태는 원상태 세포와 일치하지 않는다. 1869번 열에 존재하는 작은 점은, 세포자살시 세포골격 단백질의 수축으로 인해 형성된 큰 핵과 세점화된 세포질을 나타낸다. 1634번 열에 나타낸 작은 점은 핵이 밀려나온 것으로 보이는 손상된 세포를 나타낸다. 1632번 열에 나타낸 작은 점은 시토케라틴 및 CD45 모두로 염색된 세포를 나타는 것으로서, CD45에 비특이적으로 결합하는 종양 세포 또는 시토케라틴으로 비특이적으로 염색된 백혈구이다. 이 경우, 세포의 형태는 백혈구의 형태와 매우 유사하다. 1633번, 1635번, 1637번, 1639번, 1870번 및 1872번 열에 나타낸 작은 점들은 4㎛ 이상이지만, 세포와는 닮지 않은 시토케라틴 염색 대상을 나타낸다. 1637번, 1639번 및 1872번 열의 작은 점에 해당하는 시토케라틴 염색 대상은 백혈구와 매우 인접하여 존재한다.

몇몇 환자 샘플의 CTC 후보 세포의 이미지 관찰 결과를 기초로 하여, CTC를 3개의 카테고리로 분류하였다 : 원상태 CTC, 손상된 CTC, 및 CD45로 모두 염색되지 않고 DiOC₁₆(3) 필터에서 확인되지 않는 CTC 단편. 도 4는 치료중인 전이성 전립선 암 환자의 혈액 튜브 하나에서 분리한 CTC의 3개의 카테고리의 예를 나타내는 것이다. 도 4의 A에 나타낸 원상태 종양 세포를, 비교적 평활한 세포질 막을 보유하는크기 4㎛ 이상의 대상, 세포질을 관통하는 세포 골격 단백질, 그리고 핵내에 포함되어 있는 원상태 핵으로서 정의한다. 도 4의 B에 나타낸 손상된 CTC는 세점화된 시토케라틴 염색되었거나, 또는 세포질 막이 울퉁불퉁하며 시토케라틴 염색과 결합된 핵을 보유하는, 크기 4㎛ 이상의 대상로 정의한다. 도 4의 C에 나타낸 종양 세포 단편을, 세포와 형태적으로 닮지 않은 핵내 물질과 결합되거나 또는 결합되지 않은, 크기 4㎛ 이상의 둥근 시토케라틴 염색 대상로 정의한다.

실시예 3

전립선 암 환자의 CTC

유동성 세포계수법 및 CellSpotter(등록상표명)에 의하여 건강한 피검체로부터 얻은 27개의 샘플과 전립선 암 환자의 18개의 혈액 샘플중 CTC를 계수하였다. CellSpotter(등록상표명)에 의하여 확인된 원상태 CTC의 수를 증가시켜 표 1에 나타낸 결과들을 분류하였다.

CellSpotter(등록상표명) 분석법에서, CTC중 가장 적은 비율을 차지함이 확실시되는 원상태 CTC의 비율은 전체 CTC의 0∼22%(평균 4%)의 범위에 해당하였다. 손상된 CTC의 비율은 1∼100%(평균 34%)의 범위에 해당하였으며, CTC중 가장 많은 비율을 차지하는 CTC 단편의 비율은 0∼93%(평균 62%)의 범위에 해당하였다. 원상태 CTC와 손상된 CTC와의 상관성(R²= 0.20), 및 원상태 CTC와 CTC 단편과의상관성(R²= 0.42), 그리고 손상된 CTC와 CTC 단편과의 상관성(R²= 0.88)이 없음으로 인해 CTC 분포는 더욱 커지는 것과 같이, 환자들간 3개의 카테고리에 대한 CTC의 분포는 상당히 넓게 퍼져 있었다. CellSpotter(등록상표명)에 의한 원상태 CTC와 유동성 세포계수법에 의하여 계수된 CTC간 비교를 통하여 유의적인 상관성(R²= 0.26)이 존재하지 않음을 알 수 있는 반면에, 유동성 세포계수법에 따른 손상된 CTC와 CTC 사이의 유의적 상관성(R²= 0.92)과, 유동성 세포계수법에 따른 CTC 단편 과 CTC 사이의 유의적 상관성(R²= 0.93)은 확인되지 않았다. 유동성 세포계수법과 CellSpotter(등록상표명)에 의하여 검출된 CTC의 비교 결과는 유동성 세포계수법에 의하여 검출된 CTC가 원상태 CTC와 손상된 CTC를 포함하며, 어느 정도까지는 CTC 단편도 포함함을 시사한다.

실시예 4

LnCaP 세포자살의 시험관내 유도에 의한 세포 손상의 모의

CTC의 유동성 세포계수 분석법 및 CellSpotter(등록상표명) 분석법에 의하여 유도된 세포자살의 효과를 관찰하기 위하여, 전립선 세포주인 LnCaP로부터 유래된 세포를 40 nM 파클리탁셀의 존재하 또는 부재하에서 72 시간 동안 배양하였다. 항온처리후, 미처리된 LnCaP 세포의 생존률은 트립판 블루 배제에 의하면 95%보다 컸으며, 파클리탁셀 처리된 세포의 생존율은 33%였다. 처리 및 미처리 LnCaP 세포를 건강한 공여자의 혈액에 스파이킹시키고, 전술한 페로플루이드 방법으로 선택하여.CellSpotter(등록상표명) 시스템으로 분석하였다. 파클리탁셀로 처리하지 않은 LnCaP 세포를 혈액에 스파이킹시키는 실험에서, 생존율이 95% 이상인 LnCaP 세포를 원상태 종양 세포로 분류하였다. 파클리탁셀 처리 LnCaP 세포의 형태는 환자 샘플에서 관찰되는 CTC의 형태와 매우 유사하였는데, 이를 도 6에 나타내었다. 파클리탁셀 처리에서 살아남은 원상태 LnCaP 세포는 도 6의 A에 나타내었고, 대부분의 세포가 세점화된 시토케라틴 염색을 나타내는 손상된 LnCaP는 도 6의 B에 나타내었으며, 종양 단편은 도 6의 C에 나타내었다.

파클리탁셀 처리된 LnCaP 세포 및 미처리된 LnCaP 세포로 스파이킹된 정상적인 혈액 샘플을 또한 유동성 세포계수 분석용으로 제조하였다. 도 2의 G, H 및 I에 501 LnCaP 세포로 스파이킹된 혈액 샘플의 유동성 세포계수 분석 결과를 나타내었다. 정상적인 인간의 백혈구보다 핵산 함량이 많고, 전방향 산란광 시그널에 의하여 나타내어지는 크기가 비교적 크며, 상당히 선명한 시토케라틴 양성 군집을 도면에서는 흑색으로 나타냈다. NAD 함량이 백혈구보다 적고, 청색으로 표시된 소수의 CK+, CD45- 현상들만이 샘플에서 검출되었다. 도 2의 J, K 및 L은 혈액중 스파이킹된 파클리탁셀 처리 LnCaP 세포의 유동성 세포계수 분석 결과를 나타내는 것이다. 생존하는 LnCaP 세포와는 대조적으로, 군집의 상당 부분에서는 시토케라틴 염색 분포가 넓게 관찰되었는데, 이는 핵산 함량의 농도가 감소되었음을 나타내는 것이다. 더욱이, 백혈구의 핵산 함량의 미만으로 핵산을 보유하는 다수의 작은 시토케라틴 양성 현상이 관찰되었다. 파클리탁셀 처리된 LnCaP 세포의 패턴과 매우 유사한 환자의 패턴은, 유동성 세포계수법에 의하여 검출된 CTC는 암 환자의 혈액중 원상태CTC와 다양한 붕괴 세포를 나타낸다는 가설을 뒷받침 해주는 것이다.

상기 제시한 데이터를 통하여 전립선 암 환자의 혈액중 유동성 세포계수법 및 CellSpotter(등록상표명)에 의하여 검출된 CTC는 원상태 세포와 붕괴의 여러 단계에 있는 세포로 이루어져 있음을 알 수 있다. 파클리탁셀에 의하여 시험관내에서 유도된 세포자살은, 환자 혈액 샘플중에서 검출된 CTC가 처치 또는 치료, 혈관계 통과, 또는 면역계에 의하여 유발된 물리적 손상을 통해서 다양한 정도로, 세포자살, 괴사 또는 생체내 손상을 진행하고 있다는 사실을 시사한다.

그러나, 시험관내에서 발생하는 세포 붕괴의 다른 원인은 채혈 이후의 샘플 제조 또는 CTC의 안정화 불이행에 의해 유발되거나, 또는 기타 혈액 성분에 의하여 유도될 수 있었다.

샘플을 손상시키는 것으로 공지된 샘플의 노화 효과를 관찰하기 위하여, 12명의 전립선 암 환자로부터 채취한 혈액 샘플을 처리하여 2시간 이내, 24 시간 경과후, 그리고 충분한 혈액이 존재하는 경우에는 6 시간 및 18 시간 경과후에 유동성 세포계수법으로 분석하였다. 12 명의 환자들중 8 명에서, CTC는 정상의 공여자에서 관찰되는 평균 수준보다 +3SD 더 높은 수준으로 검출되었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 샘플이 노화함에 따른 CTC 소실율은 모두 8개의 샘플에 대하여 관찰하였다.

혈액 처리가 지연될때 CTC의 수가 상당히 감소하는 것이 관찰되었는데, 이는 CTC가 파괴되기 쉬움을 말해주는 것이며, CTC를 정확히 계수하기 위해서는 채혈후 6개월이 경과하기 이전에 안정화되지 않은 혈액 샘플을 처리할 필요가 있다. 종양 세포 분해의 상이한 단계에 임상적으로 관련 있는 정보가 포함되어 있는지 여부를 정확히 평가하기 위하여, 채혈시 CTC를 안정화시켜 체내에서 어떠한 일이 발생하고 있는지를 정확히 반영하는데에는 혈액 보존제가 필요하다. 뿐만 아니라, CTC를 증폭시키는데 사용되는, 고감도 분석법을 수행하기 위한 샘플 제조 방법은 CTC의 모든 군들을 포획하여야 하므로, 선행 기술의 통상적인 밀도 구배 분리 방법은 사용하지 않는다.

실시예 5

중요한 지표로서의 오비어스 CTC 및 서스펙트 CTC

고감도 분석법 예컨대, 본원에 기술된 방법을 수행하기 위해서는 생체내 및시험관내 손상을 구별하는 것이 중요하다. 이는 본 분석법이 생체내 세포 손상을 유발하는 것으로 알려진 처치 또는 치료의 효능을 측정하고자 시도될 때에 특히 명백하다. 샘플 취급, 처리 또는 분석 결과 표적 세포를 손상시키고, 의심 세포, 단편 또는 잔해를 형성하면, 분석법은 의미있는 결과를 가져올 것이다.

분석법은 유동성 세포계수법에 의한 임의의 증폭 방법을 수행하지 않고 100㎕ 혈액중 CTC를 직접 검출하는데 사용되었다. 상기 100 ㎕ 분석법은 EpCAM 양성 세포만을 검출하며, 감도가 매우 낮다. 그러나, CTC 계수가 큰 암 환자는 어느 정도 단계가 진행된 것으로 예측된다. 이 분석법은 전혀 조작되지 않은, 신뢰할 수 있는 확인 차원의 측정법을 제공한다. 본 분석법을 사용하여 일부 환자 샘플로부터 데이터를 구해서 몇가지 의문점에 대한 해답을 구하였다.

본 100 ㎕ 분석법은 예컨대, 크기 및 염색 강도와 같은 특성을 기초로 하여 세포들을 분류한다. 오비어스(Obvious) CTC는 핵산 염색이 선명하게 되고(백혈구와 유사), EpCAM 항원으로 염색될 뿐만 아니라, 크기는 백혈구와 유사하거나 또는 이보다 더 크다. 서스펙트 CTC는 EpCAM 항체로 염색은 되지만, 오비어스 CTC로서 특징지워지는 것은 아닌(즉, 핵산 염색이 흐릿하게 되고, 크기는 백혈구보다 작은) 임의의 대상이다. 본 분석법은 두개의 카테고리로부터 대상을 확인한다.

도 5는 100 ㎕ 분석법에 따라, 오비어스 CTC 및 서스펙트 CTC가 혈액내 존재함을 나타낸다. 100 ㎕ 분석법은 직접적인 분석법으로서 임의의 분리 단계 또는 세척 단계를 포함하지 않으므로, 샘플 처리(시험관내 손상)시 서스펙트 CTC는 형성되지 않는다. 상기 데이터에 따르면, 오비어스 CTC와 서스펙트 CTC의 갯수 사이에는관련성이 있음을 알 수 있다. 서스펙트 CTC의 갯수는 오비어스 CTC의 갯수가 증가함에 따라서 증가하는 것으로 파악된다. 서스펙트 CTC 대 오비어스 CTC의 갯수를 도표로 나타내었을 때, 기울기는 2.92 였는데, 이는 샘플내에 존재하는 서스펙트 CTC의 비율을 오비어스 CTC의 비율과 비교하였을때의 비율을 나타내는 것이다. 상관계수 r²= 0.097는 다수의 임상 샘플에 대하여 오비어스 CTC와 서스펙트 CTC 사이에 상관성이 크다는 것을 말해주는 것이다. 또한, 서스펙트 CTC는 페로플루이드-선별 분석법에서 확인되며, 직접적 분석법에 의하여 혈액중에서 검출되는 서스펙트 CTC와 유사한 특성을 갖는다. 오비어스 CTC에 더하여 서스펙트 CTC를 총 종양 세포 계수에 포함시키는 것이 중요하다.

100 ㎕ 분석법으로부터 얻어진 데이터가 어떻게 페로플루이드-선별 CTC(증폭된 CTC)와 비교되는지는 중요한 의문점이다. 페로플루이드 분석법은 CTC를 정량적으로 검출할까? 또 다른 의문점은 유동성 분석법 데이터가 맞다면 페로플루이드-선별된 분석법에서의 CTC 회수 방법은 무엇인가이다. 100 ㎕ 분석법에서 CTC의 회수율을 결정하는 3가지 주요 요인은 다음과 같다 :

- EpCAM 밀도 ;

- 시토케라틴 양성 ; 및

- 핵 양성.

서스펙트 CTC는 오비어스 CTC에 비하여 EpCAM 밀도가 더욱 낮으며, 이의 유의성에 관하여는 아직 잘 이해되지 않고 있다.

100 ㎕ 분석법으로, 오비어스 CTC와 서스펙트 CTC를 혈액 7 ㎖를 사용하는페로플루이드-선별 분석 결과에 대하여 비교하였다. 전립선 환자로부터 데이터를 얻어 유동성 세포계수법으로 분석하였다. 오비어스 CTC와 서스펙트 CTC는 모두 보관 시간이 길어지면, 페로플루이드-선별 분석법에서 검출된 CTC와 성질이 유사해져, 100 ㎕ 분석법을 유효하게 만든다. 페로플루이드-선별 분석법으로부터의 CTC 회수율은 혈액 100 ㎕중 CTC를 기준으로 하였을때 약 90%였다. 이 환자로부터 유래된 CTC의 MFI[EpCAM 밀도와 상관된 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity)]는 높았으며(MFI = 300), 모든 EpCAM 양성 세포는 시토케라틴 양성이다. 그러나, 일부 다른 임상 샘플로부터 얻은 CTC의 회수율은 20%로 낮았다. 이와 같이 회수율이 낮은 데에는 몇가지 요인이 작용할 수 있는데, 그 요인으로서는 예컨대, EpCAM 양성/시토케라틴 음성 세포, 시토케라틴이 흐릿한 세포, 및 페로플루이드가 세포에 결합하지 못하도록 만드는 세포 표면상의 뮤신이 있다.

본원에 기술된 분석법은 환자당 2회 수행되었다. 병변의 2차원 이미지화에 의하여 반응을 측정하였다. 비율(오비어스 CTC/총 CTC)은 이미 기술한 바 있는 반응 지수와 유사하며, 치료의 성공 여부를 숫자로 나타내는데 사용될 수 있다. 그 결과를 이하 표 Ⅲ에 나타내었다. 비율이 1.0에 가까운 경우는 전체 CTC가 오비어스 CTC임을 나타내는 것이며, 비율이 0.0에 가까운 경우는 서스펙트 CTC 또는 잔해가 더 많이 존재함을 나타낸다. 진행성(progressive)이란, 병변의 크기가 증가하는 경우를 나타내는 것이며, 부분 반응(partial response)이란, 비율이 비교적 낮은 경우의 치료 반응을 나타내는 것이며, 안정화 상태(stabilized)란, 병변의 크기가 변하지 않거나 또는 줄어들지 않은 상태를 나타내는 것이다. 양의 변화는 원상태CTC의 갯수가 중가하여 질병이 진행되었음을 나타내는 것이다. 음의 변화는 원상태 CTC의 갯수가 감소하였거나, 또는 서스펙트 CTC 및/또는 잔해의 갯수가 증가하여 치료에 대하여 반응할 수 있음을 나타내는 것이다.

원상태 CTC 또는 오비어스 CTC의 갯수만이 많은 정보를 제공하는 것은 아니므로, 이러한 결과들은 치료에 대한 반응을 분석할때, 서스펙트 CTC 및 잔해를 포함하는 중요성을 나타낸다. 더욱이, 이러한 지표들은 처치 및 치료의 단기간 모니터링, 또는 완화 및/또는 재발의 장기간 모니터링에 유용하다.

종양 세포 잔해의 계수는 큰 증식성 세포 클러스터의 검출에서 보다는 암 진단 및 치료에서 더욱 중요함을 알 수 있다. 약 1∼3 ㎛(혈소판 크기) 크기 범위의 잔해 입자가 원상태 세포 보다 더욱 많이 존재하기 때문에, 이들 입자는 원상태 종양 세포보다 고감도인, 별개의 독립적인 마커를 구성할 수 있다. 면역계가 원상태이고 가장 활성일때, 손상된 CTC의 존재는 특히 초기 단계의 암을 검출하는 것과 관련되어 있을 수 있다. 이와 유사하게, 치료 기간중 잔해가 급격히 증가하면 순환성 종양 세포 및 조직 종양 세포 둘다 분해되었음을(즉, 치료적 효능이 있음을) 제시할 수 있으며, 이는 종양 붕괴시 관찰되는 칼슘과 같은 세포내 성분의 다량 방출과 부합되는 것이다. 가용성 종양 마커와 유사하게, 이러한 잔해는 증폭 과정 없이, 또는 연층에서의 최소 증폭 과정에 의하여 혈액중에서 검출될 수 있으며, 대안적이고 원상태 세포 증폭/분석의 경우보다 훨씬 더 간단한 진단 수단을 구성할 수 있다. CTC 잔해는 형태를 상실하였기 때문에, 이 잔해가 적당한 결정기 예컨대, 시토케라틴에 대하여 염색되는 한 유동성 세포계수법에 의하여 검출이 수행될 수 있었다.

전술한 바와 같이, 이론적으로는 DNA를 보유하거나 또는 보유하지 않는 손상된 또는 단편화된 CTC가 형성될 것으로 기대되므로, 효과적인 치료법이 행하여지고 있는 환자로부터 얻은 표본 및 면역계가 강한 미처리 환자에서 발생하는 현상은 바람직하지 않다. 원상태 CTC : 총 검출 가능한 현상의 비율(%)은 환자의 면역계 또는 치료에 대한 반응성을 평가하는데 있어서 임상의에게 보다 유용한 매개변수임을 입증할 수 있다. 정상적인 면역 방어 특히, 활성화된 호중구는 또한 CTC가 호중구보다도 클 때 조차도 "세포외 사멸"이라 칭하여지는 과정에 의하여 CTC를 외래종으로서 인식하여 손상시키거나 또는 파괴할 수 있다. 면역계가 질병의 말기 단계에서 위력을 발휘하지 않거나 또는 치료법이 비효율적이지 않다면, 원상태 세포로서 유출된 CTC가 소량 발견되는 것은 놀라운 일이 아닌듯하다.

그러므로, 다수의 시험관내 암 검출 방법이 존재한다 : 원상태 순환성 세포/클러스터에 대한 확정적 검출법, 순환성 종양 잔해(전체 및 종양 특이적 RNA/DNA 포함) 및 통상의 가용성 종양 마커에 대한 추론적 방법. 그러나, 이 방법 자체는 감도가 충분하지 않을 수 있다. CTC 형태에 비하여 잔해 검출의 특이성이 보다 낮으면 스크리닝이 (예를 들어, 3중으로 표지화됨에 따라서) 최소화될 수 있다는 점에서 문제가 될 수 있으나, 모니터링에서는 그다지 문제가 되지는 않는다. 정상인과 비교하였을때 환자의 원상태 CTC 및 진단 단계에 상대적인 잔해 데이터에 대한 추가의 통계학적 분석 결과 및 상관성은 잔해 분석법의 감도 및 특이성을 평가하는데 있어서 가치가 있을 것으로 생각된다.

본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 검출될 수 있는 여러가지 유형의 암의 예로서는 아푸도마, 분리종, 새종, 악성 유암 증후군, 유암성 심장 질환, 암종 예컨대, 워커(Walker), 기저 세포, 염기편평세포(basosquamous), 브라운-피어스, 도관, 에를리히 종양, 동일계, 크렙스 2, 메르켈 세포, 점소양, 비-소세포 허파, 오트 세포, 유두상, 경성암양성, 세기관지, 기관지원성, 편평 세포 및 천이성 세포 세망조직증, 흑색종, 연골아세포종, 연골종, 연골육종, 섬유종, 섬유육종, 거대 세포성 종양, 조직구종, 지방종, 지방육종, 중피종, 점액종, 점액육종, 골종,골육종, 유윙 육종, 활막성종양, 선섬유종, 선림프종, 암육종, 척삭종, 간엽종, 중신종, 근육종, 에나멜아세포종, 시멘트질종, 치아종, 기형종, 트로포블라스트 종양(throphoblastic tumor), 선암종, 선종, 담관종, 콜레스테린종원주종, 낭종암, 낭선종, 과립막 세포 종양, 남녀아세포종, 간암, 한선종, 섬 세포 종양, 라이디히 세포 종양, 유두종, 세르틀리 세포 종양, 난포 세포 종양, 평활근종, 평활근육종, 근아세포종, 근종, 근육종, 횡문근종, 횡문근육종, 뇌실상의세포종, 신경절신경종, 신경교종, 수아세포종, 수막종, 신경섬유초종, 신경아세포종, 신경상피종, 신경섬유종, 신경종, 부신경정종, 비크롬친화성 부신경절종, 안티오케라토마(antiokeratoma), 경화성 맥관종, 다발성혈관종, 사구맥관종, 혈관내피종, 혈관종, 혈관외피세포종, 혈관육종, 림프관종, 림프관근종, 림프관육종, 송과체종, 임육종, 연골육종, 엽상 낭육종, 섬유육종, 혈관육종, 평활근육종, 백혈육종, 지방육종, 림프관육종, 근육종, 점액육종, 난소 암종, 횡문근육종, 육종(카포시 육종 및 대식 세포 육종), 종양(예컨대, 골, 소화계, 결장 직장, 간, 췌장, 뇌하수체, 고환, 안와, 머리 및 목, 중추 신경계, 청각, 골반, 호흡기관 및 뇨생식기), 신경섬유종증 및 경부 이형성증을 포함한다.

그러나, 본 발명은 순환성 상피 세포 및/또는 클러스터, 단편 또는 잔해의 검출에 한정되는 것은 아니다, 예를 들어, 상피 세포는 심근 경색증 환자의 혈액내에서 관찰된다. 상피 세포, 심근 세포 및 바이러스 감염된 세포 예컨대, 상피 세포는 유용한 모노클로날 항체에 의하여 인식되는 세포 유형 특이적 결정기를 보유한다. 그러므로, 본 발명의 방법 및 키트는 이러한 순환성 상피 세포를 검출하는데사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 평가될 수 있는 감염성 질환 환자의 말초 혈액중 박테리아 세포의 존재를 검출할 수 있다. 이러한 희귀 세포들이 혈류내에서 유사하게 행동할 것이라는 것과 단편 및/또는 잔해가 전술한 바와 같이 유사한 상태로 존재할 것이라는 사실은 당연할 것이다.

본원에 개시되어 있는 본 발명의 바람직한 구체예는 또한 본 발명을 당 업계 및 분야에서 암 진단법에 부가적으로 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명의 개선된 진단 방식은 전술한 바람직한 구체예에 대한 설명에 의해서 한정되는 것은 아니라는 사실은 당업자들에세 명백할 것이다. 마지막으로, 상기 제시된 임의의 구체예는 상세한 설명을 제공하지만, 이하 청구항은 상기 상세한 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다. 실제로, 이하 청구항의 범위에서 벗어나지 않은 다양한 변형예가 실시될 수 있다.

Claims

a. 원상태 희귀 세포(intact rare cell)를 함유하는 것으로 의심되는 혼합 세포 군집을 포함하고, i) 희귀 세포로부터 유래된 세포 단편 또는 ⅱ) 희귀 세포로부터 유래된 세포 잔해(cellular debris)를 추가로 포함하는 생물 표본을 테스트 피검체로부터 얻는 단계 ;

b. 상기 원상태 희귀 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해와 특이적으로 반응하는, 제1의 생물 특이적 리간드와 커플링된 자성 입자와 생물 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 혼합하여 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 ;

c. 상기 원상태 희귀 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해를 특이적으로 표지화하는, 1 이상의 추가의 생물 특이적 리간드와 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 접촉시키는 단계 ; 및

d. 상기 표지화된 희귀 세포, 및 상기 표지화된 세포 단편 또는 상기 표지화된 세포 잔해를 분석하는 단계로서, 상기 표지화된 희귀 세포, 상기 표지화된 세포 단편 및 상기 표지화된 세포 잔해의 존재는 질병이 존재하는 것을 나타내는 것인 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 테스트 피검체에서 질병을 진단하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물 표본은 혈액인 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 생물 표본을 얻은후 이 생물 표본과 이를 안정화시킬 수 있는 제제를 접촉시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 자성 입자는 콜로이드인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 이후에, 상기 샘플에 고 구배(high gradient) 자기장을 적용시켜, 이 샘플을 상기 원상태 희귀 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해에 대하여 증폭시킨, 분리된 자기 표지화 분획을 생성시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 분석법은 다변수 유동성 세포계수법, 면역형광 현미경, 레이저 주사 세포계수법, 명시야계 이미지 분석법, 모세관 부피측정법, 스펙트럼 이미지화 분석법, 수동식 세포 분석법 및 자동화 세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 분석법은 형태 분석 및 에피토프 분석으로 이루어진 군중 하나 이상을 바탕으로 하는 것인 방법.
a. 원상태 희귀 세포 및 희귀 세포 클러스터를 함유하는 것으로 의심되는 혼합 세포 군집을 포함하는 생물 표본을 테스트 피검체로부터 얻는 단계 :

b. 상기 원상태 희귀 세포 및 상기 희귀 세포 클러스터와 특이적으로 반응하는, 제1의 생물 특이적 리간드와 커플링된 자성 입자와 상기 생물 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 혼합하여 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 ;

c. 상기 원상태 희귀 세포 및 상기 희귀 세포 클러스터를 특이적으로 표지화하는, 1 이상의 생물 특이적 리간드와 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 접촉시키는 단계 ; 및

d. 상기 표지화된 희귀 세포 및 상기 표지화된 희귀 세포 클러스터를 분석하는 단계로서, 상기 표지화된 희귀 세포 및 상기 표지화된 희귀 세포 클러스터의 존재는 질병이 존재하는 것을 나타내는 것인 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 테스트 피검체에서 질병을 진단하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 생물 표본은 혈액인 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 생물 표본을 얻은후 이 생물 표본과 이를 안정화시킬 수 있는 제제를 접촉시키는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 자성 입자는 콜로이드인 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 이후에, 상기 샘플에 고 구배 자기장을 적용시켜 이 샘플을 상기 원상태 희귀 세포 및 상기 희귀 세포의 클러스터에 대하여 증폭시킨, 분리된 자기 표지화 분획을 생성시키는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 분석법은 다변수 유동성 세포계수법, 면역형광 현미경, 레이저 주사 세포계수법, 명시야계 이미지 분석법, 모세관 부피측정법, 스펙트럼 이미지화 분석법, 수동식 세포 분석법 및 자동화 세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
a. 원상태 악성종양 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혼합 세포 군집을 포함하고, i) 악성종양 세포로부터 유래된 세포 단편 또는 ⅱ) 악성종양 세포로부터 유래된 세포 잔해를 추가로 포함하는 생물 표본을 테스트 피검체로부터 얻는 단계 ;

b. 상기 원상태 악성종양 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해와 특이적으로 반응하는, 제1의 생물 특이적 리간드와 커플링된 자성 입자와 생물 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 혼합하여 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 ;

c. 상기 원상태 악성종양 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해를 특이적으로 표지화하는, 1 이상의 추가의 생물 특이적 리간드와 상기 자기적으로표지화된 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 접촉시키는 단계 ; 및

d. 상기 표지화된 악성종양 세포, 및 상기 표지화된 세포 단편 또는 상기 표지화된 세포 잔해를 분석하는 단계로서, 상기 표지화된 악성종양 세포, 상기 표지화된 세포 단편 및 상기 표지화된 세포 잔해의 존재는 악성종양이 존재하는 것을 나타내는 것인 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 테스트 피검체에서 악성종양을 진단하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 생물 표본은 혈액인 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 생물 표본을 얻은후 이 생물 표본과 이를 안정화시킬 수 있는 제제를 접촉시키는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 자성 입자는 콜로이드인 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 이후에, 상기 샘플에 고 구배 자기장을 적용시켜 이 샘플을 상기 원상태 희귀 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해에 대하여 증폭시킨, 분리된 자기 표지화 분획을 생성시키는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 분석 단계는 다변수 유동성 세포계수법, 면역형광 현미경, 레이저 주사 세포계수법, 명시야계 이미지 분석법, 모세관 부피측정법, 스펙트럼 이미지화 분석법, 수동식 세포 분석법 및 자동화 세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 분석 단계는 세포 단편 또는 세포 잔해의 기원을 바탕으로 이 세포 단편 또는 세포 잔해가 세포자살에 의해 유발되는 것인지 또는 괴사에 의해 유발되는 것인지에 따라서 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 분석 단계는 세포 단편 또는 세포 잔해의 기원을 바탕으로 이 세포 단편 또는 세포 잔해가 기계적 손상에 의해 유발되는 것인지, 약물-유도성 손상에 의해 유발되는 것인지 또는 면역학적 손상에 의해 유발되는 것인지에 따라서 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 분류는 형태 분석 및 에피토프 분석으로 이루어진 군중 하나 이상을 바탕으로 하는 것인 방법.
a. 원상태 악성종양 세포와 이 악성종양 세포 클러스터를 함유하는 것으로 의심되는 혼합 세포 군집을 포함하는 생물 표본을 테스트 피검체로부터 얻는 단계;

b. 상기 원상태 악성종양 세포 및 상기 악성종양 세포 클러스터와 특이적으로 반응하는, 제1의 생물 특이적 리간드와 커플링된 자성 입자와 생물 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 혼합하여 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 ;

c. 상기 원상태 악성종양 세포 및 상기 악성종양 세포 클러스터를 특이적으로 표지화하는, 1 이상의 추가의 생물 특이적 리간드와 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 접촉시키는 단계 ; 및

d. 상기 표지화된 악성종양 세포, 및 상기 표지화된 악성종양 세포 클러스터를 분석하는 단계로서, 상기 표지화된 악성종양 세포 및 상기 표지화된 악성종양 세포 클러스터의 존재는 악성종양이 존재하는 것을 나타내는 것인 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 테스트 피검체에서 악성종양을 진단하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 생물 표본은 혈액인 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 생물 표본을 얻은후 이 생물 표본과 이를 안정화시킬 수 있는 제제를 접촉시키는 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 자성 입자는 콜로이드인 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 이후에, 상기 샘플에 고 구배 자기장을 적용시켜 이 샘플을 상기 원상태 악성종양 세포 및 상기 악성종양 세포 클러스터에 대하여 증폭시킨, 분리된 자기 표지화 분획을 생성시키는 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 분석법은 다변수 유동성 세포계수법, 면역형광 현미경, 레이저 주사 세포계수법, 명시야계 이미지 분석법, 모세관 부피측정법, 스펙트럼 이미지화 분석법, 수동식 세포 분석법 및 자동화 세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
a. 원상태 악성종양 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혼합 세포 군집을 포함하고, i) 악성종양 세포로부터 유래된 세포 단편 또는 ⅱ) 악성종양 세포로부터 유래된 세포 잔해를 추가로 포함하는 생물 표본을 테스트 피검체로부터 얻는 단계 ;

b. 상기 원상태 악성종양 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해와 특이적으로 반응하는, 제1의 생물 특이적 리간드와 커플링된 자성 입자와 생물 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 혼합하여 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 ;

c. 상기 원상태 악성종양 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해를특이적으로 표지화하는, 1 이상의 추가의 생물 특이적 리간드와 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 접촉시키는 단계 ; 및

d. 상기 표지화된 악성종양 세포, 및 상기 표지화된 세포 단편 또는 상기 표지화된 세포 잔해를 분석하는 단계로서, 상기 표지화된 악성종양 세포, 상기 표지화된 세포 단편 및 상기 표지화된 세포 잔해의 존재는 악성종양이 존재하는 것을 나타내는 것인 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 테스트 피검체에서 악성종양을 스크리닝하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 생물 표본은 혈액인 것인 방법.
제30항에 있어서, 상기 생물 표본을 얻은후 이 생물 표본과 이를 안정화시킬 수 있는 제제와를 접촉시키는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 자성 입자는 콜로이드인 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 이후에, 상기 샘플에 고 구배 자기장을 적용시켜 이 샘플을 상기 원상태 악성종양 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해에 대하여 증폭시킨, 분리된 자기 표지화 분획을 생성시키는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 분석법은 다변수 유동성 세포계수법, 면역형광 현미경, 레이저 주사 세포계수법, 명시야계 이미지 분석법, 모세관 부피측정법, 스펙트럼 이미지화 분석법, 수동식 세포 분석법 및 자동화 세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 분석 단계는 세포 단편 또는 세포 잔해의 기원을 바탕으로 이 세포 단편 또는 세포 잔해가 세포자살에 의해 유발되는 것인지 또는 괴사에 의해 유발되는 것인지에 따라서 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 분석 단계는 세포 단편 또는 세포 잔해의 기원을 바탕으로 이 세포 단편 또는 세포 잔해가 기계적 손상에 의해 유발되는 것인지, 약물-유도성 손상에 의해 유발되는 것인지 또는 면역학적 손상에 의해 유발되는 것인지에 따라서 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 분류는 형태 분석 및 에피토프 분석으로 이루어진 군중 하나 이상을 바탕으로 하는 것인 방법.
a. 원상태 악성종양 세포와 이 악성종양 세포 클러스터를 함유하는 것으로의심되는 혼합 세포 군집을 포함하는 생물 표본을 테스트 피검체로부터 얻는 단계 ;

b. 상기 원상태 악성종양 세포 및 상기 악성종양 세포 클러스터와 특이적으로 반응하는, 제1의 생물 특이적 리간드와 커플링된 자성 입자와 생물 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 혼합하여 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 ;

c. 상기 원상태 악성종양 세포 및 상기 악성종양 세포 클러스터를 표지화하는, 1 이상의 추가의 생물 특이적 리간드와 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 접촉시키는 단계 ; 및

d. 상기 표지화된 악성종양 세포 및 상기 표지화된 악성종양 세포를 분석하는 단계로서, 상기 표지화된 악성종양 세포 및 상기 표지화된 악성종양 세포 클러스터의 존재는 악성종양이 존재하는 것을 나타내는 것인 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 테스트 피검체에서 악성종양을 스크리닝하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 생물 표본은 혈액인 것인 방법.
제39항에 있어서, 상기 생물 표본을 얻은후 이 생물 표본과 이를 안정화시킬 수 있는 제제를 접촉시키는 것인 방법.
제38항에 있어서, 상기 자성 입자는 콜로이드인 것인 방법.
제38항에 있어서, 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 이후에, 상기 샘플에 고 구배 자기장을 적용시켜 이 샘플을 상기 원상태 악성종양 세포 및 상기 악성종양 세포의 클러스터에 대하여 증폭시킨, 분리된 자기 표지화 분획을 생성시키는 것인 방법.
제38항에 있어서, 상기 분석법은 다변수 유동성 세포계수법, 면역형광 현미경, 레이저 주사 세포계수법, 명시야계 이미지 분석법, 모세관 부피측정법, 스펙트럼 이미지화 분석법, 수동식 세포 분석법 및 자동화 세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
a. 원상태 악성종양 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혼합 세포 군집을 포함하고, i) 악성종양 세포로부터 유래된 세포 단편 또는 ⅱ) 악성종양 세포로부터 유래된 세포 잔해를 추가로 포함하는 생물 표본을 테스트 피검체로부터 얻는 단계 ;

b. 상기 원상태 악성종양 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해와 특이적으로 반응하는, 제1의 생물 특이적 리간드와 커플링된 자성 입자와 생물 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 혼합하여 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 ;

c. 상기 원상태 악성종양 세포, 및 상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해를 특이적으로 표지화하는, 1 이상의 추가의 생물 특이적 리간드와 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 접촉시키는 단계 ; 및

d. 상기 표지화된 악성종양 세포, 및 상기 표지화된 세포 단편 또는 상기 표지화된 세포 잔해를 분석하는 단계로서, 상기 표지화된 악성종양 세포, 상기 표지화된 세포 단편 및 상기 표지화된 세포 잔해의 존재는 악성종양이 존재하는 것을 나타내는 것인 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 테스트 피검체에서 악성종양을 모니터링하는 방법.
제44항에 있어서, 상기 생물 표본은 혈액인 것인 방법.
제45항에 있어서, 상기 생물 표본을 얻은후 이 생물 표본과 이를 안정화시킬 수 있는 제제를 접촉시키는 것인 방법.
제44항에 있어서, 상기 자성 입자는 콜로이드인 것인 방법.
제44항에 있어서, 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 이후에, 상기 샘플에 고 구배 자기장을 적용시켜 이 샘플을 상기 원상태 악성종양 세포, 및상기 세포 단편 또는 상기 세포 잔해에 대하여 증폭시킨, 분리된 자기 표지화 분획을 생성시키는 것인 방법.
제44항에 있어서, 상기 분석법은 다변수 유동성 세포계수법, 면역형광 현미경, 레이저 주사 세포계수법, 명시야계 이미지 분석법, 모세관 부피측정법, 스펙트럼 이미지화 분석법, 수동식 세포 분석법 및 자동화 세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제44항에 있어서, 상기 분석 단계는 세포 단편 또는 세포 잔해의 기원을 바탕으로 이 세포 단편 또는 세포 잔해가 세포자살에 의해 유발되는 것인지 또는 괴사에 의해 유발되는 것인지에 따라서 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제50항에 있어서, 상기 분석 단계는 세포 단편 또는 세포 잔해의 기원을 바탕으로 이 세포 단편 또는 세포 잔해가 기계적 손상에 의해 유발되는 것인지, 약물-유도성 손상에 의해 유발되는 것인지 또는 면역학적 손상에 의해 유발되는 것인지에 따라서 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제50항에 있어서, 상기 분류는 형태 분석 및 에피토프 분석으로 이루어진 군중 하나 이상을 바탕으로 하는 것인 방법.
a. 원상태 악성종양 세포와 이 악성종양 세포 클러스터를 함유하는 것으로 의심되는 혼합 세포 군집을 포함하는 생물 표본을 테스트 피검체로부터 얻는 단계 ;

b. 상기 원상태 악성종양 세포 및 상기 악성종양 세포 클러스터와 특이적으로 반응하는, 제1의 생물 특이적 리간드와 커플링된 자성 입자와 생물 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 혼합하여 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 ;

c. 상기 원상태 악성종양 세포 및 상기 악성종양 세포 클러스터를 특이적으로 표지화하는, 1 이상의 추가의 생물 특이적 리간드와 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 기타 표본 성분이 실질적으로 배제될 때까지 접촉시키는 단계 ; 및

d. 상기 표지화된 악성종양 세포 및 상기 표지화된 악성종양 세포 클러스터를 분석하는 단계로서, 상기 표지화된 악성종양 세포 및 상기 표지화된 악성종양 세포 클러스터의 존재는 악성종양이 존재하는 것을 나타내는 것인 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 테스트 피검체에서 악성종양을 모니터링하는 방법.
제53항에 있어서, 상기 생물 표본은 혈액인 것인 방법.
제54항에 있어서, 상기 생물 표본을 얻은후 이 생물 표본과 이를 안정화시킬 수 있는 제제를 접촉시키는 것인 방법.
제53항에 있어서, 상기 자성 입자는 콜로이드인 것인 방법.
제53항에 있어서, 상기 자기적으로 표지화된 샘플을 제조하는 단계 이후에, 상기 샘플에 고 구배 자기장을 적용시켜 이 샘플을 상기 원상태 악성종양 세포 및 상기 악성종양 세포의 클러스터에 대하여 증폭시킨, 분리된 자기 표지화 분획을 생성시키는 것인 방법.
제53항에 있어서, 상기 분석법은 다변수 유동성 세포계수법, 면역형광 현미경, 레이저 주사 세포계수법, 명시야계 이미지 분석법, 모세관 부피측정법, 스펙트럼 이미지화 분석법, 수동식 세포 분석법 및 자동화 세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
a. ⅰ) 자성 코어 물질 ;

ⅱ) 단백질계 코팅 물질 ; 및

ⅲ) 상기 악성종양 세포 및 이의 세포 단편 또는 세포 잔해의 제1의 특징적인 결정기에 특이적으로 결합하며, 상기 단백질계 코팅 물질에 커플링되는 항체

를 포함하는 코팅된 자성 나노입자 ;

b. 상기 악성종양 세포 및 이의 세포 단편 또는 세포 잔해의 제2의 특징적인 결정기에 대한 결합 특이성을 보유하는 1 이상의 항체 ; 및

c. 상기 악성종양 세포 및 이의 세포 단편 또는 세포 잔해의 추가의 흔적을 염색할 수 있는 제제

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 악성종양 세포 및 이 악성종양 세포로부터 유래된 세포 단편 또는 이 악성종양 세포로부터 유래된 세포 잔해의 존재에 대하여 생물 표본을 분석하는 키트.
제59항에 있어서, 상이한 특징을 갖는 결정기에 대하여 각각 특이적인 항체 패널을 추가로 포함하는 것인 키트.
제59항에 있어서, 비표적 실체를 표지화할 수 있는 특이적 제제를 추가로 포함하는 것인 키트.