ES2948803T3 - Método de lisis parcial y ensayo - Google Patents

Abstract

La presente divulgación describe un método para tratar una muestra que comprende células con un proceso de lisis parcial. Las células se exponen a un proceso como el batido de perlas que lisa algunas células de la mezcla. El proceso genera una mezcla de muestras resultante que es adecuada tanto para la detección de morfología celular como para la detección genética. Se puede montar una primera porción de la muestra parcialmente lisada en un portaobjetos y observarla en busca de células atípicas y anomalías citológicas. Una segunda porción de la muestra parcialmente lisada se puede analizar en busca de marcadores genéticos que se sabe que se correlacionan con el riesgo de cáncer de cuello uterino. Sorprendentemente, la presencia de perlas en la mezcla procedentes del proceso de lisis parcial no interfiere con el procesamiento del portaobjetos o el análisis celular. El método es particularmente útil para la detección cervical, donde una combinación de citología y cribado genético presenta una imagen más completa de la salud cervical. El método divulgado agiliza el proceso de diagnóstico para protocolos que requieren ambos tipos de ensayos, sin comprometer la precisión de la detección. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de lisis parcial y ensayo

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos para tratar una muestra tanto para el cribado de la morfología celular como para el cribado de componentes moleculares.

Antecedentes de la invención

La prueba de Papanicolaou (Pap) es un método ampliamente usado de cribado de cuello uterino que detecta anomalías en las células del cuello uterino y del endometrio, incluidas las lesiones precancerosas y cancerosas. La prueba de Papanicolaou se usa ampliamente porque es simple, mínimamente invasiva y económica. La prueba generalmente implica tomar una muestra de células del cuello uterino mediante el uso de un dispositivo de recolección y analizar las células para determinar ciertas características diagnósticas que son indicativas de la presencia de virus del papiloma humano (HPV). La detección temprana de anomalías del cuello uterino es esencial para un tratamiento efectivo, y el cribado de Papanicolaou periódico han reducido la cantidad de muertes anuales en los Estados Unidos en más del 60 % desde su introducción en 1955 (Instituto Nacional del Cáncer).

Para obtener una muestra de cuello uterino, los médicos generalmente usan un cepillo o una espátula para recolectar células del cuello uterino y el canal endocervical. Después, el espécimen se unta directamente en un portaobjetos de vidrio (es decir, "prueba de Papanicolaou" convencional) o se recolecta en un medio de citología de base líquida (LBC). Con el LBC, el dispositivo de recolección se sumerge en un medio conservante tal como la solución de ThinPrep® PreservCyt® disponible de Hologic, Inc. (Bedford, MA) y agitada para liberar las células en el medio. La exposición al medio LBC fija las células, lo que les permite evaluar la morfología celular. Pueden encontrarse más detalles de medios LBC útiles en la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 6,531,317.

El estándar de atención actual es fijar una porción de las células recolectadas en un portaobjetos para la evaluación de la morfología celular. Los portaobjetos pueden prepararse a mano ("prueba de Papanicolaou"), sin embargo, pueden obtenerse resultados superiores con sistemas automatizados, tales como las pruebas de Papanicolaou de Hologic's ThinPrep® combinada con el sistema de obtención de imágenes de ThinPrep®. Esta metodología es superior a la prueba de Papanicolaou convencional debido a una mayor precisión y una mayor detección de enfermedad (citación - Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) Program. SEER Database: Incidence -SEER 9 Regs Public-Use, Nov. 2004 Sub (1973-2002), National Cancer Institute, DCCPS, Surveillance Research Program, Cancer Statistics Branch, publicado en abril de 2005, basado en la presentación de noviembre de 2004). Una vez que se fijan las células, la muestra puede seleccionarse en busca de células escamosas atípicas, lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado, lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado, carcinomas de células escamosas, células glandulares atípicas, adenocarcinomas y otras anomalías citológicas. Véase, por ejemplo, el Sistema Bethesda para informar sobre citología de cuello uterino.

Los avances recientes en las tecnologías de selección genética han hecho posible seleccionar los cambios genéticos indicativos de cáncer o infección. Por ejemplo, las muestras de cuello uterino pueden recolectarse y seleccionarse para diagnósticos moleculares mediante el uso de un ensayo genético, tal como un ensayo híbrido, PCR multiplex o secuenciación directa. La muestra puede seleccionarse contra una base de datos de marcadores genéticos para identificar el riesgo de cáncer de cuello uterino de una mujer, mediante la tipificación de HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-68, HPV-73 o HPV-82. La selección puede basarse en ADN, ARN o alguna de sus combinaciones. Los sistemas comerciales para el cribado diagnóstico del HPV están disponibles en Hologic, Inc., por ejemplo, ensayos de Cervista® HPV o APTIMA® HPV.

Si bien el estándar de atención para el cribado de cuello uterino en los Estados Unidos aún es la prueba de Papanicolaou, la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. recientemente abrió el camino para que las pruebas genéticas solo se usen para cribar el cáncer de cuello uterino en las mujeres. Sin embargo, grupos tal como la Asociación Americana de Mujeres Médicas han expresado su preocupación de que las pruebas genéticas por sí solas sin un cribado morfológico simultáneo darán como resultado que demasiadas mujeres reciban tratamiento cuando esas mujeres son simplemente portadoras del HPV y no tienen ningún riesgo inmediato de desarrollar cáncer de cuello uterino. Véase "FDA approves Roche Genetic Test as an Alternative to Pap Smear for Cervical Cancer Screening." Associated Press 24 de abril de 2014.

Resumen

La presente invención se refiere a un método para tratar una muestra con un proceso de lisis parcial, que genera una mezcla de muestra resultante que es adecuada tanto para el cribado de la morfología celular como para el cribado de componentes moleculares, tales como ácidos nucleicos, patógenos, proteínas y otros marcadores de la enfermedad.

El método de la presente invención se define en la reivindicación 1.

En algunos casos, los ácidos nucleicos pueden secuenciarse y compararse con marcadores genéticos para la enfermedad. En una modalidad preferida el método comprende cizallamiento mecánico de células en la muestra mediante batido de perlas, es decir, al agitar la muestra junto con una multitud de perlas. El rápido movimiento de las perlas tritura las células. El método implica controlar el grado de lisis, al retener de esta manera un número suficiente de células completas en la muestra para observar la morfología celular. Después del proceso de lisis parcial, el usuario observa las estructuras celulares de la muestra, ya sea solo o junto con un sistema automatizado tal como la prueba de Papanicolaou de Thin Prep® combinada con el sistema de obtención de imágenes de ThinPrep®, y la muestra también se selecciona en busca de marcadores genéticos, tales como los tipos de HPV de alto riesgo. Sorprendentemente, la presencia de perlas en la mezcla no interfiere con las mediciones de citología, por ejemplo, la función del procesador o sistema de obtención de imágenes de ThinPrep®, ni interfiere con la presentación celular o el análisis visual de los portaobjetos.

El método es generalmente aplicable a combinaciones de citología y diagnósticos moleculares. En particular, el método es útil para el cribado de cuello uterino, donde una combinación de citología y selección genética presenta una imagen más completa de la salud del cuello uterino. Por ejemplo, una primera porción de la muestra parcialmente lisada puede montarse en un portaobjetos y observarse en busca de células atípicas y anomalías citológicas. Una segunda porción de la muestra parcialmente lisada puede seleccionarse en busca de marcadores genéticos conocidos que se correlacionan con un riesgo de cáncer de cuello uterino, por ejemplo, la presencia de HPV.

El método de lisis parcial puede comprender cizallamiento mecánico, lisis con detergente, lisis osmótica u otros métodos conocidos en la técnica, y la técnica elegida se adapta para evitar la lisis sustancialmente de todas las células en la muestra. Mientras que las técnicas de citología de última generación enseñan una cuidadosa atención para mantener la integridad estructural de una muestra, la presente descripción menciona un método en el que la misma muestra, es decir, una muestra parcialmente lisada, es adecuada tanto para citología como para diagnósticos moleculares. Este método agiliza el proceso diagnóstico para protocolos que requieren ambos tipos de pruebas de selección, tales como el cribado de cuello uterino. El proceso se agiliza porque no hay necesidad de doble recolección. Tener un solo punto de recolección reduce la prevalencia de contaminación cruzada en entornos de prueba sensibles. Además, en contraste con otros protocolos de diagnóstico molecular, la presente descripción proporciona un método de manera que la muestra molecular no se destruye en el proceso de diagnóstico. El método también permite el ensayo simultáneo de morfología celular y los marcadores genéticos de la misma muestra celular.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un flujo de trabajo para seleccionar una muestra mediante el uso de un método de lisis parcial.

La Figura 2 muestra un flujo de trabajo para seleccionar una muestra mediante el uso de un método de lisis parcial.

La Figura 3 muestra un diagrama de flujo de un diseño experimental para comparar el recuento y la visualización de células antes y después del método de lisis parcial.

La Figura 4 muestra una variedad de agujas adecuadas para usar con un método de cizallamiento mecánico. La Figura 5 muestra una tabla de muestra que describe una prueba para refinar un protocolo de batido de perlas para la lisis parcial.

La Figura 6 muestra una tabla de concentración celular después de varias duraciones de batido de perlas.

La Figura 7 muestra los resultados de absorbancia de varias pruebas del método de batido de perlas.

La Figura 8 muestra una vista de 40X de células expuestas a varios tiempos de mezcla con perlas de granate.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un método para tratar una muestra con un proceso de lisis parcial, que genera una mezcla de muestra resultante que es adecuada tanto para el cribado de la morfología celular como para diagnósticos moleculares. Mientras que las técnicas de citología de la técnica enseñan una cuidadosa atención para mantener la integridad estructural de una muestra, la presente descripción menciona un método en el que la misma muestra se lisa parcialmente para que sea adecuada tanto para citología como para diagnósticos moleculares. Este método agiliza el proceso diagnóstico para protocolos que requieren citología y selección genética para un examen completo, tales como en el cribado de cuello uterino. A diferencia de otros métodos que enseñan a dividir una muestra antes de lisar (véase, por ejemplo, Iftner y otros, "Study comparing human papillomavirus (HPV) real-time multiplex PCR and Hybrid Capture II INNO-LiPA v2 HPV genotyping PCR assays," J. Clin. Microbiol. 47(7):2106-13, julio de 2009), el método descrito produce resultados satisfactorios tanto para el análisis citológico como para diagnósticos moleculares, mientras que requiere el uso de una sola muestra.

La invención proporciona un método útil para el cribado de cuello uterino, por ejemplo, porque una primera porción de la muestra parcialmente lisada puede montarse en un portaobjetos y observarse en busca de células atípicas y anomalías citológicas, y una segunda porción de la muestra parcialmente lisada puede seleccionarse para detectar componentes moleculares, por ejemplo, marcadores genéticos conocidos que se correlacionan con un riesgo de enfermedad, por ejemplo, cáncer de cuello uterino. Los componentes moleculares pueden ser cualquier componente acelular que pueda encontrarse en una muestra biológica, tal como ADN libre de células, proteínas degradadas, virus, hongos u otro marcador químico. Los componentes moleculares también pueden incluir porciones de células o subestructuras celulares, tales como cromosomas, proteínas o enzimas. En modalidades preferidas, los componentes moleculares son ácidos nucleicos, tal como ADN o ARN, tal como ARNm o ARNr.

La Figura 1 muestra un flujo de trabajo 100 para seleccionar una muestra mediante el uso de un método de lisis parcial. Una primera etapa 110 comprende obtener una muestra. La muestra puede ser cualquier muestra biológica, incluida una muestra celular o de fluido corporal que comprenda células. La muestra puede ser una muestra de cuello uterino, una muestra bucal, una muestra nasal, una muestra de sangre, una muestra de fluido amniótico u otros materiales biológicos. La muestra puede recolectarse con un cepillo, una espátula, un hisopo, una jeringa u otros aparatos conocidos en la técnica. En la etapa 120, la muestra se pone en contacto con un conservante de muestras biológicas tal como la solución PreservCyt® para crear una muestra biológica conservada. El conservante de muestras biológicas puede comprender un alcohol, tal como metanol, etanol o isopropanol; un tampón tal como Tris o PBS; una solución que comprende formaldehído; o un detergente tal como Tween-20 o Tritón X-100. El conservante de muestras biológicas puede servir para fijar células en la muestra biológica conservada o prepararlas de cualquier otra manera para análisis basado en células.

La muestra biológica conservada se somete a un proceso de lisis parcial en la etapa 130. La lisis parcial rinde una mezcla que comprende al menos un 10 % de células intactas. En algunas modalidades, la mezcla comprende al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de células intactas. La lisis parcial puede comprender cizallamiento mecánico, lisis con detergente, lisis osmótica, desnaturalización química, centrifugación, sonicación, congelación-descongelación u otras técnicas de lisis conocidas en la técnica. El cizallamiento mecánico incluye el cizallamiento con jeringa, batido de perlas, otras técnicas conocidas en la técnica o cualquiera de sus combinaciones. Cualquiera que sea la técnica de lisis que se elija se adapta para evitar lisar sustancialmente todas las células en la muestra biológica conservada. Los métodos de la invención implican controlar el grado de lisis a un nivel predeterminado, al retener de esta manera un número suficiente de células completas en la mezcla para observar la morfología celular.

En una modalidad preferida, el método comprende el cizallamiento mecánico de células en la muestra biológica conservada mediante el batido de perlas, es decir, al agitar la muestra biológica conservada junto con una multitud de perlas, tales como las perlas vendidas por MO-BIO Laboratories, Inc. (Carlsbad, CA). Se sabe que la lisis de las células se produce al agitar las células y las perlas juntas en un medio líquido. Las perlas pueden estar hechas de vidrio, cerámica, metal, granate u otros materiales conocidos en la técnica. El diámetro de la perla puede ser menor o igual a 0,1 mm, 0,15 mm, 0,25 mm, 0,5 mm, 0,7 mm, 1,4 mm, 2,38 mm, 2,8 mm o mayor. La agitación puede comprender agitación manual, mediante el uso de un agitador orbital, mediante el uso de un mezclador de vórtice o cualquier otra técnica conocida en la técnica. La duración de la agitación puede ser inferior a 1 segundo, 2 segundos, 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos o más.

En otra modalidad, el método comprende lisar parcialmente las células en la muestra biológica conservada mediante cizallamiento con jeringa. Las células en solución se bombean a través de una aguja de jeringa, tales como las agujas de acero inoxidable reutilizables que se muestran en la Figura 4 de McMaster-Carr (Robbinsville, NJ). La longitud de la aguja puede ser inferior a 10 mm, inferior a 20 mm, inferior a 30 mm, inferior a 50 mm, inferior a 80 mm, inferior a 100 mm, inferior a 200 mm o superior. El tamaño del orificio de la aguja puede ser de 152 μm, 203 μm, 254 μm, 406 μm, 610 μm, 686 μm o superior. Las células en solución pueden bombearse a través de la aguja manualmente o con el uso de un motor de bomba accionado por un suministro de energía externa. La jeringa puede bombearse con un solo golpe unidireccional o con múltiples golpes de ida y vuelta.

Después del proceso de lisis parcial, una porción de la mezcla se usa para el análisis basado en células en la etapa 140, y otra porción de la mezcla se analiza en busca de componentes moleculares en la etapa 150. El análisis basado en células (etapa 140) puede ser realizado por un médico al montar las células en un portaobjetos y observarlas bajo un microscopio. Cuando se realiza el cribado para el cáncer de cuello uterino, las células se seleccionan para detectar anomalías de células escamosas o anomalías de células glandulares. En su lugar, la mezcla puede pasar por una máquina de formación de imágenes automatizada, tal como la prueba de Papanicolaou de ThinPrep® combinada con el sistema de obtención de imágenes de ThinPrep® para detectar anomalías. En las modalidades en las que se usa el batido de perlas para lisar parcialmente las células, no es necesario eliminar las perlas antes de la formación de imágenes. Sorprendentemente, la presencia de perlas en la mezcla no interfiere con la función del procesador o formador de imágenes de ThinPrep®, ni interfiere con el análisis visual de los portaobjetos. Los portaobjetos preparados a partir del batido de perlas de ciertas duraciones y el cizallamiento con jeringa muestran poco o ningún resto o degradación celular y son adecuados para el análisis basado en células.

Para usar el sistema de ThinPrep®, un usuario coloca un vial que contiene células con solución de PreservCyt® en el procesador de ThinPrep®, junto con un portaobjeto de ThinPrep® y un filtro de TransCyt®. El formador de imágenes homogeneiza la mezcla al girar y el filtro recolecta las células con la ayuda de una aspiración suave. Después, el filtro entra en contacto con el portaobjetos para transferir una fina capa de células al portaobjetos. Después, el portaobjetos se pone en contacto con un agente fijador, después de lo cual puede teñirse y cubrirse con un cubreobjetos.

Para el análisis basado en células, el formador de imágenes de ThinPrep® escanea cada célula y conglomerado de células en el portaobjetos para medir el contenido de ADN. El formador de imágenes identifica los núcleos más grandes y oscuros en el portaobjeto y los resalta para que los revise un citotecnólogo, lo que ayuda a enfocar su análisis. Se ha demostrado que este proceso de selección de "revisión dual" realizado por el formador de imágenes y un citotecnólogo aumenta la detección de la enfermedad en comparación con la revisión manual sola y reduce los falsos negativos en un 39 % (véase, How Dual Screening Works, http://www.thinprep.com/hcp/imaging_system/dual review screening.html). Los portaobjetos preparados a partir de batido de perlas de ciertas duraciones y cizallamiento con jeringa muestran poco o ningún resto o degradación celular y son adecuados para observar estructuras celulares.

El análisis de componentes moleculares (etapa 150) puede comprender centrifugar toda o una porción de la mezcla. El centrifugado puede realizarse con fuerzas radiales de 10 g, 50 g, 100 g, 200 g, 300 g, 600 g, 1000 g, 2000 g o superior. La duración de la centrifugación puede ser de 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos o más. La etapa 150 puede comprender además extraer una alícuota del sobrenadante que se va a cribar. La etapa 150 puede comprender además detectar ácidos nucleicos, cuantificar ácidos nucleicos, identificar ácidos nucleicos, secuenciar o similares.

La selección genética puede realizarse mediante sistemas comerciales tales como Cervista® HPV o APTIMA® HPV de Hologic. El Cervista® HPV detecta cambios de pares de bases individuales asociados con cepas de HPV de alto riesgo mediante el uso de amplificación de señal y detección de fluorescencia. El Cervista® HPV usa el producto químico patentado de Invader™, que consiste de una reacción primaria y una reacción secundaria. En la reacción primaria, una sonda de Invader™ se une con el área diana del ADN viral y genera una estructura solapada. El colgajo de esta estructura después se escinde con una enzima patentada de Cleavase®. A través de este proceso se crean múltiples colgajos, que se unirán a una estructura de horquilla universal marcada con fluorescencia en la reacción secundaria. En la reacción secundaria, los colgajos escindidos creados en la reacción primaria funcionan como una sonda, al unirse con secuencias complementarias de la estructura de horquilla, también conocida como casete de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). La reacción secundaria utiliza la combinación de colgajos escindidos y casetes de FRET para crear una amplificación de señal basada en fluorescencia. Después, la señal fluorescente se mide con un fluorómetro para confirmar la presencia (o ausencia) de una cepa de HPV de alto riesgo. Simultáneamente en una reacción paralela, el control interno único de la prueba de HR de Cervista® HPV genera una señal fluorescente roja cuando el ADN adecuado está presente en la muestra para la prueba. Una señal fluorescente verde indica la presencia de tipos de HPV de alto riesgo. El sistema APTIMA® HPV de Hologic se dirige al ARNm para identificar 14 tipos de HPV de alto riesgo. El sistema APTIMA incluye la captura de dianas de ARNm, amplificación de objetivos y detección de productos de amplificación. También puede usarse una prueba APTIMA similar para identificar el ^a Rⁿ ribosómico (ARNr) de Chlamydia trachomatis o Neisseria gonorrhoeae para ayudar en el diagnóstico de infecciones urogenitales por clamidia o gonococo. Se describe información adicional sobre los ensayos APTIMA en las patentes de Estados Unidos núms. 5,750,365, 6,150,517, 7,094,541 y 7,172,863.

En una modalidad en la que el método se usa para el cribado de cuello uterino u otra selección genética, la etapa 150 comprende adicionalmente comparar un ácido nucleico identificado con una base de datos de marcadores conocidos para determinar si el sujeto porta un marcador conocido. La base de datos de marcadores conocidos puede comprender marcadores usados para identificar el riesgo de cáncer de cuello uterino de una mujer, incluidos HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, o HPV-68 (American Cancer Society, Human Papilloma Virus (HPV), Cancer, HPV Testing, and HPV Vaccines: Frequently Asked Questions (22 de octubre de 2013). Pueden usarse otros biomarcadores de ácido nucleico, incluidos los que se describen más abajo. Los métodos de amplificación, detección y secuenciación de ácidos nucleicos descritos más abajo también pueden usarse en la modalidad del método representado en la Figura 1.

La Figura 2 muestra un flujo de trabajo 200 para seleccionar una muestra mediante el uso de un método de lisis parcial. Una primera etapa 110 comprende recolectar una muestra. La muestra puede ser cualquier muestra biológica, incluida una muestra celular o de fluido corporal que comprenda células. La muestra puede ser una muestra de cuello uterino, una muestra bucal, una muestra nasal, una muestra de sangre, una muestra de fluido amniótico u otros materiales biológicos. La muestra puede recolectarse con un cepillo, una espátula, un hisopo, una jeringa u otros aparatos conocidos en la técnica. En la etapa 120, la muestra se pone en contacto con un conservante de muestras biológicas tal como la solución PreservCyt® para crear una muestra biológica conservada. El conservante de muestras biológicas puede comprender un alcohol, tal como metanol, etanol o isopropanol; un tampón como Tris o PBS; o un detergente tal como Tween-20 o Tritón X-100. El conservante de muestras biológicas puede servir para fijar células en la muestra biológica conservada o prepararlas de cualquier otra manera para análisis basado en células.

La muestra biológica conservada se somete a un proceso de lisis parcial en la etapa 130. La lisis parcial rinde una mezcla que comprende al menos un 10 % de células intactas. En algunas modalidades, la mezcla comprende al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de células intactas. La lisis parcial puede comprender cizallamiento mecánico, lisis con detergente, lisis osmótica, desnaturalización química, centrifugación, sonicación, congelación-descongelación u otras técnicas de lisis conocidas en la técnica. El cizallamiento mecánico incluye el cizallamiento con jeringa, batido de perlas, otras técnicas conocidas en la técnica o cualquiera de sus combinaciones. Cualquiera que sea la técnica de lisis que se elija se adapta para evitar lisar sustancialmente todas las células en la muestra biológica conservada. El método de esta descripción implica controlar el grado de lisis, al retener de esta manera un número suficiente de células completas en la mezcla para observar la morfología celular.

En una modalidad preferida, el método comprende el cizallamiento mecánico de células en la muestra biológica conservada mediante el batido de perlas, es decir, al agitar la muestra biológica conservada junto con una multitud de perlas, tales como las perlas vendidas por MO-BIO Laboratories, Inc. (Carlsbad, CA). Se sabe que la lisis de las células se produce al agitar las células y las perlas juntas en un medio líquido. Las perlas pueden estar hechas de vidrio, cerámica, metal, granate u otros materiales conocidos en la técnica. El diámetro de la perla puede ser menor o igual a 0,1 mm, 0,15 mm, 0,25 mm, 0,5 mm, 0,7 mm, 1,4 mm, 2,38 mm, 2,8 mm o mayor. La agitación puede comprender agitación manual, mediante el uso de un agitador orbital, mediante el uso de un mezclador de vórtice o cualquier otra técnica conocida en la técnica. La duración de la agitación puede ser inferior a 1 segundo, 2 segundos, 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos o más.

En otra modalidad, el método comprende lisar parcialmente las células en la muestra biológica conservada mediante cizallamiento con jeringa. Las células en solución se bombean a través de una aguja de jeringa, tales como las agujas de acero inoxidable reutilizables que se muestran en la Figura 4 de McMaster-Carr (Robbinsville, NJ). La longitud de la aguja puede ser inferior a 10 mm, inferior a 20 mm, inferior a 30 mm, inferior a 50 mm, inferior a 80 mm, inferior a 100 mm, inferior a 200 mm o superior. El tamaño del orificio de la aguja puede ser de 152 μm, 203 μm, 254 μm, 406 μm, 610 μm, 686 μm o superior. Las células en solución pueden bombearse a través de la aguja manualmente o con el uso de un motor de bomba accionado por un suministro de energía externa. La jeringa puede bombearse con un solo golpe unidireccional o con múltiples golpes de ida y vuelta.

Después del proceso de lisis parcial, la mezcla se usa para el análisis basado en células en la etapa 140. El análisis basado en células (etapa 140) puede ser realizado por un médico al montar las células en un portaobjetos y observarlas bajo un microscopio. Cuando se realiza el cribado para el cáncer de cuello uterino, las células se seleccionan para detectar anomalías de células escamosas o anomalías de células glandulares. En su lugar, la mezcla puede pasar por una máquina de formación de imágenes automatizada, tal como el sistema de obtención de imágenes de ThinPrep® para detectar anomalías. En las modalidades en las que se usa el batido de perlas para lisar parcialmente las células, no es necesario eliminar las perlas antes de la formación de imágenes. Sorprendentemente, la presencia de perlas en la mezcla no interfiere con la función de procesador de ThinPrep® o formador de imágenes de ThinPrep®, ni interfiere con el análisis visual del portaobjetos. Los detalles del sistema de ThinPrep® se describen anteriormente. Los portaobjetos preparados a partir del batido de perlas de ciertas duraciones y el cizallamiento con jeringa muestran poco o ningún resto o degradación celular y son adecuados para el análisis basado en células.

Las células se ensayan en busca de componentes celulares en la etapa 150. El análisis de componentes celulares 150 puede comprender centrifugar la mezcla. El centrifugado puede realizarse con fuerzas radiales de 10 g, 50 g, 100 g, 200 g, 300 g, 600 g, 1000 g, 2000 g o superior. La duración de la centrifugación puede ser de 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos o más. La etapa 150 puede comprender además extraer una alícuota del sobrenadante que se va a cribar. La etapa 150 puede comprender además detectar ácidos nucleicos, cuantificar ácidos nucleicos, identificar ácidos nucleicos, secuenciar o similares. La selección genética puede realizarse con dispositivos comerciales tales como Cervista® HPV o APTIVA® HPV de Hologic, cuyos detalles se describen anteriormente.

En una modalidad en la que el método se usa para el cribado de cuello uterino u otra selección genética, la etapa 150 comprende adicionalmente comparar un ácido nucleico identificado con una base de datos de marcadores conocidos para determinar si el sujeto porta un marcador conocido. La base de datos de marcadores conocidos puede comprender marcadores correlacionados con un riesgo elevado de cáncer, tales como los marcadores usados para identificar el riesgo de cáncer de cuello uterino de una mujer, incluidos HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, o HPV-68 (American Cancer Society, Human Papilloma Virus (HPV), Cancer, HPV Testing, and HPV Vaccines: Frequently Asked Questions (22 de octubre de 2013). Pueden usarse otros biomarcadores de ácido nucleico, incluidos los que se describen más abajo. Los métodos de amplificación, detección y secuenciación de ácidos nucleicos descritos más abajo también pueden usarse en la modalidad del método representado en la Figura 2.

La Figura 3 muestra un diagrama de flujo de un diseño experimental 300 para comparar el recuento y la visualización de células antes y después del método de lisis parcial. El diseño experimental 300 comienza con una muestra de células bucales en un medio líquido 310. El medio líquido puede ser PBS, solución de PreservCyt® o cualquier otro medio descrito anteriormente. Se extrae una porción de la muestra y se cuenta o visualiza 320. Las técnicas de recuento de células que pueden usarse con el método descrito incluyen espectrofotometría, hemocitometría, citometría de flujo o similares. Las células pueden visualizarse al montar y observar bajo un microscopio o con un sistema de obtención de imágenes tal como el sistema de ThinPrep®. El remanente de la muestra se lisa parcialmente 330 para generar una mezcla parcialmente lisada. La mezcla contiene células lisadas. Las células lisadas comprenden componentes celulares y sus fragmentos. La mezcla también contiene componentes moleculares de la célula, que incluyen ácidos nucleicos, proteínas, orgánulos y otras estructuras subcelulares. Los componentes moleculares también incluyen componentes de patógenos presentes en la muestra biológica. Dichos patógenos incluyen bacterias, virus, levaduras y similares. Específicamente, los patógenos pueden estar asociados con enfermedades que incluyen clamidia, gonorrea, tricomoniasis y candidiasis. La etapa de lisis parcial 330 puede comprender cualquiera de las técnicas de lisis parcial descritas anteriormente. Se extraen alícuotas de la mezcla parcialmente lisada para el recuento y la visualización de células 340, por un lado, y purificación y análisis molecular 350, por otro lado. Los resultados de la etapa del recuento y la visualización de células 320 pueden compararse con los resultados de la etapa del recuento y la visualización de células 340 para determinar el efecto de la etapa de lisis parcial 330. En la medida en que las células en la etapa 340 estén demasiado degradadas para el recuento y visualización adecuados, o en la medida en que la muestra no se haya lisado lo suficiente para realizar el análisis molecular en la etapa 350, la etapa de lisis parcial 330 puede ajustarse en consecuencia. En las modalidades en donde la etapa de lisis parcial 330 comprende el batido de perlas, los posibles ajustes incluyen alterar el número de perlas, el tamaño de las perlas, el material de las perlas, la duración de la mezcla o el vórtex, u otras alteraciones cuantitativas o cualitativas del procedimiento de lisis, como se describió anteriormente. En modalidades en donde la etapa de lisis parcial 330 comprende el cizallamiento con jeringa, los posibles ajustes incluyen alterar la longitud o el diámetro de la jeringa o cambiar la presión aplicada para expulsar las células a través de la jeringa. En modalidades donde la etapa de lisis parcial 330 comprende lisis con detergente, lisis osmótica o desnaturalización química, los posibles ajustes incluyen alterar las concentraciones de los reactivos o sustituir los reactivos.

La Figura 4 muestra una variedad de agujas de acero inoxidable reutilizables de McMaster-Carr (Robbinsville, NJ) adecuadas para usar con un método de cizallamiento mecánico que comprende el cizallamiento con jeringa. Las agujas varían en longitud y tamaño de orificio. La longitud de la aguja puede ser inferior a 10 mm, inferior a 20 mm, inferior a 30 mm, inferior a 50 mm, inferior a 80 mm, inferior a 100 mm, inferior a 200 mm o superior. El tamaño del orificio de la aguja puede ser de 152 μm, 203 μm, 254 μm, 406 μm, 610 μm, 686 μm o superior. Para implementar la técnica de cizallamiento con jeringa, las células en solución pueden bombearse manualmente a través de una aguja o con el uso de un motor de bomba accionado por un suministro de energía externa. La jeringa puede bombearse con un solo golpe unidireccional o con múltiples golpes de ida y vuelta.

La Figura 5 muestra una tabla de muestra que describe una prueba para refinar un protocolo de batido de perlas para la lisis parcial. Los especímenes de ThinPrep® basados en líneas celulares se crearon mediante el uso de células CaSki de cultivo a una concentración de 100000 células/ml. Se añadieron perlas de granate (MO-BIO PIN 13123-05) a cada muestra de 20 ml y las muestras se sometieron a tiempos de mezcla variables en un agitador vorticial. También se prepararon controles en los que no se añadieron perlas a las muestras de CaSki. Esta tabla ayuda al usuario a determinar el tiempo de mezcla óptimo para un protocolo de batido de perlas. Pueden hacerse otras tablas con variaciones a otras condiciones en el protocolo para refinar el método de lisis parcial. Por ejemplo, un investigador podría cambiar el material de la perla, el tamaño de la perla, la concentración de la perla o el volumen de la perla. Pueden construirse tablas similares para otros protocolos de lisis parcial, incluido un protocolo de cizallamiento con jeringa. Para una tabla para probar un protocolo de cizallamiento con jeringa, las variables pueden incluir la longitud de la aguja, el tamaño del orificio, la presión de la bomba y el tiempo.

La Figura 6 muestra una tabla de concentración celular después de varias duraciones de batido de perlas del método experimental de la Figura 5. Se extrajo una alícuota de 100 μl de cada muestra antes y después de la lisis y se cuantificaron las concentraciones celulares. Los recuentos de células antes de la lisis fueron en promedio de 84000 células/ml. Los recuentos de células después de la lisis se muestran en la Figura 6. Para los tiempos de lisis aumentados, no se pudieron contar las células debido a los niveles aumentados de restos celulares. Esto sugiere que, en algunas condiciones, mezclar durante más de 5 minutos puede no lograr un resultado que se puede usar.

La Figura 7 muestra los resultados de absorbancia después de varias duraciones de batido de perlas del método experimental de la Figura 5. Las células posteriores a la lisis se centrifugaron a 600 g durante 5 minutos y se extrajeron 0,1 ml del sobrenadante para las lecturas de absorbancia. La absorbancia aumenta con los tiempos de mezcla. Esto indica que, en algunas condiciones, la lisis excesiva puede disminuir la visibilidad de las estructuras en la muestra.

Los ácidos nucleicos pueden obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica. Generalmente, los ácidos nucleicos pueden extraerse de la muestra parcialmente lisada mediante una variedad de técnicas, tales como las descritas por Maniatis, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., págs. 280-281, (1982).

En una modalidad en la que el método se usa para el cribado de cuello uterino u otra selección genética, la etapa 150 comprende adicionalmente comparar un ácido nucleico identificado con una base de datos de marcadores conocidos para determinar si el sujeto porta un marcador conocido. La base de datos de marcadores conocidos puede comprender marcadores correlacionados con un riesgo elevado de cáncer, tales como marcadores asociados con el riesgo de una mujer de desarrollar cáncer de cuello uterino, incluidos HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52 o HPV-68 (American Cancer Society, Human Papilloma Virus (HPV), Cancer, HPV Testing, and HPV Vaccines: Frequently Asked Questions (22 de octubre de 2013)). Los biomarcadores asociados con el desarrollo de cáncer de cuello uterino también se muestran en Patel (US 7,300,765), Pardee y otros (US 7,153,700), Kim (US 6,905,844), Roberts y otros (US 6,316,208), Schlegel (US 2008/0113340), Kwok y otros (US 2008/0044828), Fisher y otros (US 2005/0260566), Sastry y otros (US 2005/0048467), Lai (US 2008/0311570) and Van Der Zee y otros (US 2009/0023137). Los biomarcadores ilustrativos que se han asociado con el cáncer de cuello uterino incluyen: SC6; SIX1; protooncogén 2 del cáncer de cuello uterino humano (HCCR-2); p27; oncogén de virus E6; oncogén de virus E7; p16INK4A; proteínas Mem (tal como Mcm5); proteínas Cdc; topoisomerasa 2 alfa; PCNA; Ki-67; ciclina E; p-53; PAIl; DAP-quinasa; ESR1; APC; TIMP-3; RAR-P; CALCA; TSLC1; TIMP-2; DcR1; CUDR; DcR2; BRCA1; p15; MSH₂; RassflA; MLH1; MGMT; SOX1; PAX1; LMX1A; NKX6-1; WT1; ONECUT1; SPAG9; y proteínas Rb (retinoblastoma).

Los biomarcadores asociados con el desarrollo de cáncer de vagina se muestran en Giordano (US 5,840,506), Kruk (US 2008/0009005), Hellman y otros (Br J Cancer. 100(8):1303-1314, 2009). Los biomarcadores ilustrativos que se han asociado con el cáncer de vagina incluyen: pRb2/p130 y Bcl-2.

La invención no se limita al cribado del cáncer. Puede usarse para detectar biomarcadores de una variedad de características. Los biomarcadores de ácidos nucleicos a menudo se asocian con mutaciones de ácidos nucleicos, que incluyen adiciones, eliminaciones, inserciones, reordenamientos, inversiones, transiciones, transversiones, mutaciones de cambio de marco, mutaciones sin sentido, mutaciones sin sentido, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y sustituciones de dos o más nucleótidos dentro de una secuencia, pero no en la medida de grandes cambios en la secuencia cromosómica. Los SNP son un tipo de cambio de secuencia genómica sutil que ocurre cuando un solo nucleótido reemplaza a otro dentro de la secuencia. Las alteraciones en el número de cromosomas incluyen adiciones, eliminaciones, inversiones, translocaciones, variaciones en el número de copias y sustituciones de cromosomas dentro de una secuencia. Estas mutaciones de ácido nucleico en biomarcadores también pueden ser indicativas de cáncer.

Los biomarcadores de ácido nucleico pueden ensayarse o detectarse mediante cualquier método conocido en la técnica para usar en un único ensayo de cribado de múltiples analitos. Los métodos de la invención se proporcionan para realizar al menos un ensayo de detección en la pluralidad de biomarcadores para buscar una cualquiera de las características indicativas de cáncer descritas anteriormente. Puede analizarse cualquier combinación de biomarcadores o características mediante el uso de la misma plataforma de secuenciación o diferentes plataformas de secuenciación. En consecuencia, pueden realizarse más de una técnica de detección en la pluralidad de biomarcadores para buscar cualquier variedad de características para el ensayo de cribado de múltiples analitos individuales. Por ejemplo, puede elegirse una técnica de detección porque es particularmente adecuada para la detección de un biomarcador particular y puede elegirse otra técnica de detección porque es particularmente adecuada para detectar una característica particular.

Las sondas adecuadas para usar en la presente invención incluyen aquellas formadas a partir de ácidos nucleicos, tales como ARN y/o ADN, análogos de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos modificados y sondas quiméricas de una clase mixta que incluye un ácido nucleico con otro componente orgánico tal como los ácidos peptidonucleicos. Las sondas pueden ser monocatenarias o bicatenarias. Los análogos de nucleótidos ilustrativos incluyen ésteres de fosfato de desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina, desoxitimidina, adenosina, citidina, guanosina y uridina. Otros ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen una xantina o hipoxantina; 5-bromouracilo, 2-aminopurina, desoxiinosina o citosina metilada, tal como 5-metilcitosina y N4-metoxidesoxicitosina. También se incluyen bases de miméticos de polinucleótidos, tales como ácidos nucleicos metilados, por ejemplo, 2'-O-metARN, ácidos peptidonucleicos, ácidos peptidonucleicos modificados y cualquier otro resto estructural que pueda actuar sustancialmente como un nucleótido o una base, por ejemplo, al exhibir complementariedad de bases con una o más bases que se encuentran en el ADN o el ARN.

La longitud de la sonda de nucleótidos no es crítica, siempre que las sondas sean capaces de hibridarse con el ácido nucleico diana y el ligando de ácido nucleico. De hecho, las sondas pueden tener cualquier longitud. Por ejemplo, las sondas pueden tener tan solo 5 nucleótidos o tanto como 5000 nucleótidos. Las sondas ilustrativas son 5-mers, 10-mers, 15-mers, 20-mers, 25-mers, 50-mers, 100-mers, 200-mers, 500-mers, 1000-mers, 3000-mers o 5000-mers. Los métodos para determinar una longitud de sonda óptima son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Shuber, patente de Estados Unidos núm. 5,888,778.

Las sondas usadas para la detección pueden incluir un marcador detectable, tal como un radiomarcador, un marcador fluorescente o un marcador enzimático. Véase por ejemplo Lancaster y otros, patente de Estados Unidos núm. 5,869,717. En ciertas modalidades, la sonda está marcada con fluorescencia. Los nucleótidos marcados con fluorescencia pueden producirse por varias técnicas, tales como las descritas en Kambara y otros, Bio/Technol., 6:816-21, (1988); Smith y otros, Nucl. Acid Res., 13:2399-2412, (1985); y Smith y otros, Nature, 321: 674-679, (1986). El colorante fluorescente puede unirse a la desoxirribosa por un brazo enlazador que se escinde fácilmente por medios químicos o enzimáticos. Existen numerosos enlazadores y métodos para unir marcadores a los nucleótidos, como se muestra en Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, (1991); Zuckerman y otros, Polynucleotides Res., 15: 5305-5321, (1987); Sharma y otros, Polynucleotides Res., 19:3019, (1991); Giusti y otros, PCR Methods and Applications, 2:223-227, (1993); Fung y otros (patente de Estados Unidos núm. 4,757,141); Stabinsky (patente de Estados Unidos núm. 4,739,044); Agrawal y otros, Tetrahedron Letters, 31:1543-1546, (1990); Sproat y otros, Polynucleotides Res., 15:4837, (1987); y Nelson y otros, Polynucleotides Res., 17:7187-7194, (1989). Existe una amplia guía en la literatura para derivatizar moléculas fluoróforas y extintoras para la unión covalente a través de grupos reactivos comunes que pueden añadirse a un nucleótido. También existen muchos restos de enlace y métodos para unir restos de fluoróforo a nucleótidos, como se describió en Oligonucleotides and Analogues, supra, Guisti y otros, supra, Agrawal y otros, supra, y Sproat y otros, supra.

El marcador detectable unido a la sonda puede ser detectable directa o indirectamente. En ciertas modalidades, el marcador exacto puede seleccionarse basado, al menos en parte, en el tipo particular de método de detección usado. Los métodos de detección ilustrativos incluyen detección radiactiva, detección de absorbancia óptica, por ejemplo, detección de absorbancia UV-visible, detección de emisión óptica, por ejemplo, fluorescencia; fosforescencia o quimioluminiscencia; dispersión de Raman. Los marcadores preferidos incluyen marcadores detectables ópticamente, tales como marcadores fluorescentes. Los ejemplos de marcadores fluorescentes incluyen, pero no se limitan a, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'disulfónico; acridina y derivados: acridina, isotiocianato de acridina; ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS); disulfonato de 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5; N-(4-anilino-1-naftil)maleimida; antranilamida; BODIPY; alexa; fluoresceína; colorantes múltiples conjugados; amarillo brillante; cumarina y derivados; cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilculuarina (cumarina 151); colorantes de cianina; cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5'5"-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico; ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico; cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, dansilcloruro); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados; eosina, isotiocianato de eosina, eritrosina y derivados; eritrosina B, eritrosina, isotiocianato; etidio; fluoresceína y derivados; 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, QFITC, (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato de verde de malaquita; 4-metilumbeliferoneorto cresolftaleína; nitro tirosina; pararosanilina; rojo fenol; B-ficoeritrina, o-ftaldialdehído, pireno y derivados: pireno, butirato de pireno, succinimidil 1-pireno; puntos cuánticos de butirato; reactivo Rojo 4 (Cibacron.TM. Rojo brillante 3B-A) rodamina y derivados: 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), lisamina rodamina B cloruro de sulfonilo rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforrodamina B, sulforrodamina 101, cloruro de sulfonilo derivado de sulforrodamina 101 (Rojo Texas); N,N,N',N'tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico; derivados de quelato de terbio; colorantes Atto, Cy3; Cy5; Cy5.5; Cy7; IRD 700; IRD 800; La Jolta Azul; ftalocianina; y naftalocianina. La invención contempla marcadores distintos de los marcadores fluorescentes, incluidos otros marcadores detectables ópticamente.

En ciertas modalidades, el ácido nucleico se detecta mediante el uso de secuenciación. La secuenciación por síntesis es una técnica común usada en los procedimientos de próxima generación y funciona bien con la presente invención. Sin embargo, pueden usarse otros métodos de secuenciación, incluida secuencia por ligadura, secuenciación por hibridación, técnicas basadas en gel y otras. En general, la secuenciación implica hibridar un cebador con un molde para formar un dúplex molde/cebador, que pone en contacto el dúplex con una polimerasa en presencia de nucleótidos marcados de forma detectable en condiciones que permitan a la polimerasa añadir nucleótidos al cebador en una manera dependiente de molde. Después, se usa la señal del marcador detectable para identificar la base incorporada y las etapas se repiten secuencialmente para determinar el orden lineal de los nucleótidos en el molde. Los marcadores detectables ilustrativos incluyen radiomarcadores, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, etc. En modalidades particulares, el marcador detectable puede ser un marcador detectable ópticamente, tal como un marcador fluorescente. Los marcadores fluorescentes ilustrativos incluyen cianina, rodamina, fluorescencia, cumarina, BODIPY, alexa o colorantes múltiples conjugados. Se conocen numerosas técnicas para detectar secuencias y algunas se ejemplifican más abajo. Sin embargo, los medios exactos para detectar y compilar datos de secuencia no afectan la función de la invención descrita en la presente descripción.

En una modalidad preferida, los ácidos nucleicos se detectan mediante el uso de la secuenciación de una sola molécula. Un ejemplo de una tecnología de secuenciación que puede usarse en los métodos de la invención proporcionada es la secuenciación de Illumina. La secuenciación de Illumina se basa en la amplificación de ADN en una superficie sólida mediante el uso de PCR de repliegue y cebadores anclados. El ADN genómico se fragmenta y se añaden adaptadores a los extremos 5' y 3' de los fragmentos. Los fragmentos de ADN que están adheridos a la superficie de los canales de celdas de flujo se extienden y se amplifican en puente. Los fragmentos se vuelven bicatenarios y las moléculas bicatenarias se desnaturalizan. Múltiples ciclos de amplificación en fase sólida seguidos de desnaturalización pueden crear varios millones de conglomerados de aproximadamente 1000 copias de moléculas de ADN monocatenarias del mismo molde en cada canal de la celda de flujo. Los cebadores, ADN polimerasa y cuatro nucleótidos de terminación reversible marcados con fluoróforo se usan para para realizar la secuenciación secuencial. Después de la incorporación de nucleótidos, se usa un láser para excitar los fluoróforos y se captura una imagen y se registra la identidad de la primera base. Se eliminan los terminadores 3' y los fluoróforos de cada base incorporada y se repiten las etapas de incorporación, detección e identificación.

Otro ejemplo de una técnica de secuenciación de una sola molécula adecuada para usar en los métodos de la invención proporcionada es la secuenciación de Ion Torrent (solicitud de patente de Estados Unidos números 2009/0026082, 2009/0127589, 2010/0035252, 2010/0137143, 2010/0188073, 2010/0197507, 2010/0282617, 2010/0300559), 2010/0300895, 2010/0301398, y 2010/0304982) En la secuenciación de Ion Torrent, el ADN se corta en fragmentos de aproximadamente 300-800 pares de bases, y los fragmentos tienen extremos romos. Después, los adaptadores de oligonucleótidos se ligan a los extremos de los fragmentos. Los adaptadores sirven como cebadores para la amplificación y secuenciación de los fragmentos. Los fragmentos pueden unirse a una superficie y se adjuntan a una resolución de manera que los fragmentos pueden resolverse individualmente. La adición de uno o más nucleótidos libera un protón (H+), cuya señal se detecta y registra en un instrumento de secuenciación. La intensidad de la señal es proporcional al número de nucleótidos incorporados. Las guías de usuario describen en detalle los protocolos de Ion Torrent que son adecuados para usar en los métodos de la invención, tales como la literatura de Life Technologies titulada "Ion Sequencing Kit for User Guide v. 2.0" para usar con su plataforma de secuenciación, Personal Genome MachineTM (PCG).

Otro ejemplo de una técnica de secuenciación de ADN que puede usarse en los métodos de la invención proporcionada es la secuenciación 454 (Roche) (Margulies, M y otros 2005, Nature, 437, 376-380). La secuenciación 454 implica dos etapas. En la primera etapa, el ADN se corta en fragmentos de aproximadamente 300-800 pares de bases y los fragmentos son extremos romos. Después, los adaptadores de oligonucleótidos se ligan a los extremos de los fragmentos. Los adaptadores sirven como cebadores para la amplificación y secuenciación de los fragmentos. Los fragmentos pueden unirse a perlas de captura de ADN, por ejemplo, perlas recubiertas de estreptavidina mediante el uso de, por ejemplo, el Adaptador B, que contiene la etiqueta 5'-biotina. Los fragmentos unidos a las perlas se amplifican por PCR dentro de las gotas de una emulsión de aceite y agua. El resultado son múltiples copias de fragmentos de ADN amplificados clonalmente en cada perla. En la segunda etapa, las perlas se capturan en pocillos (del tamaño de un picolitro). La pirosecuenciación se realiza en cada fragmento de ^a Dⁿ en paralelo. La adición de uno o más nucleótidos genera una señal de luz que se registra por una cámara CCD en un instrumento de secuenciación. La intensidad de la señal es proporcional al número de nucleótidos incorporados. La pirosecuenciación usa pirofosfato (PPi) que se libera tras la adición de nucleótidos. El PPi se convierte en ATP por ATP sulfurilasa en presencia de adenosina 5' fosfosulfato. La luciferasa usa ATP para convertir la luciferina en oxiluciferina, y esta reacción genera luz que se detecta y se analiza.

Otro ejemplo de una técnica de secuenciación de ADN que puede usarse en los métodos de la invención proporcionada es la tecnología SOLiD (Applied Biosystems). En la secuenciación de SOLiD, el ADN genómico se corta en fragmentos y los adaptadores se unen a los extremos 5' y 3' de los fragmentos para generar una biblioteca de fragmentos. Alternativamente, pueden introducirse adaptadores internos al ligar los adaptadores a los extremos 5' y 3' de los fragmentos, que circularizan los fragmentos, digieren el fragmento circularizado para generar un adaptador interno y unir los adaptadores a los extremos 5' y 3' de los fragmentos resultantes para generar una biblioteca emparejada. A continuación, se preparan poblaciones de perlas clonales en microrreactores que contienen perlas, cebadores, molde y componentes de PCR. Después de la PCR, los moldes se desnaturalizan y las perlas se enriquecen para separar las perlas con moldes extendidos. Los moldes de las perlas seleccionadas se someten a una modificación de 3' que permite el enlace a un portaobjetos de vidrio. La secuencia puede determinarse mediante hibridación secuencial y ligadura de oligonucleótidos parcialmente aleatorios con una base determinada central (o un par de bases) que se identifica mediante un fluoróforo específico. Después de registrar un color, el oligonucleótido ligado se escinde y elimina y luego se repite el proceso.

Otro ejemplo de una tecnología de secuenciación que puede usarse en los métodos de la invención proporcionada incluye la tecnología de molécula única en tiempo real (SMRT) de Pacific Biosciences. En SMRT, cada una de las cuatro bases de ADN se une a uno de los cuatro colorantes fluorescentes diferentes. Estos colorantes están fosfoenlazados. Una sola ADN polimerasa se inmoviliza con una sola molécula de ADN monocatenaria molde en la parte inferior de una guía de ondas de modo cero (ZMW). Una ZMW es una estructura de confinamiento que permite la observación de la incorporación de un solo nucleótido por la ADN polimerasa en el ruido de fondo de nucleótidos fluorescentes que se difunden rápidamente dentro y fuera de la ZMW (en microsegundos). Se necesitan varios milisegundos para incorporar un nucleótido en una hebra en crecimiento. Durante este tiempo, el marcador fluorescente se excita y produce una señal fluorescente y la etiqueta fluorescente se escinde. La detección de la fluorescencia correspondiente del colorante indica qué base se incorporó. El proceso se repite.

Otro ejemplo de una técnica de secuenciación que puede usarse en los métodos de la invención proporcionada es la secuenciación de nanoporos (Soni G V y Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001). Un nanoporo es un pequeño agujero, del orden de 1 nanómetro de diámetro. La inmersión de un nanoporo en un fluido conductor y la aplicación de un potencial a través de él da como resultado una ligera corriente eléctrica debido a la conducción de iones a través del nanoporo. La cantidad de corriente que fluye es sensible al tamaño del nanoporo. Cuando una molécula de ADN pasa a través de un nanoporo, cada nucleótido de la molécula de ADN obstruye el nanoporo en un grado diferente. Por lo tanto, el cambio en la corriente que pasa a través del nanoporo cuando la molécula de ADN pasa a través del nanoporo representa una lectura de la secuencia de ADN.

En un caso en el que no hay suficiente ADN para un ensayo complejo, por ejemplo, la secuenciación de próxima generación, una técnica común usada para aumentar la cantidad de ácido nucleico en una muestra es realizar PCR en la muestra antes de realizar un ensayo que detecta los ácidos nucleicos en la muestra. La PCR se refiere a métodos por K. B. Mullis (patente de Estados Unidos números 4,683,195 y 4,683,202, para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación ni purificación. El proceso para amplificar la secuencia de ácido nucleico diana y el ligando de ácido nucleico incluye introducir un exceso de cebadores de oligonucleótidos que se unen al ácido nucleico y al ligando de ácido nucleico, seguido de una secuencia precisa de ciclos térmicos en presencia de una ADN polimerasa. Los cebadores son complementarios a sus hebras respectivas del ácido nucleico diana y del ligando de ácido nucleico. El proceso de PCR amplifica el ADN en la muestra y produce una cantidad de ADN suficiente para la detección mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como transferencias de Southern o secuenciación. Otras variaciones de la PCR incluyen la reacción en cadena de la polimerasa anidada, la reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismo de conformación monocatenaria, reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de hebra y polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción.

Con PCR, es posible amplificar una sola copia de una secuencia diana específica en el ADN genómico a un nivel que puede detectarse mediante varias metodologías diferentes (por ejemplo, tinción, hibridación con una sonda marcada, incorporación de cebadores biotinilados seguida de detección de conjugados de avidina-enzima, incorporación de trifosfatos de desoxinucleótidos marcados con 32P, tales como dCTP o dATP, en el segmento amplificado). En una modalidad de la invención, el ácido nucleico diana y el ligando de ácido nucleico pueden detectarse mediante el uso de sondas marcadas detectablemente. El diseño de sondas de ácido nucleico y los métodos para sintetizar sondas de oligonucleótidos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros, DNA microarray: A Molecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., (2003) o Maniatis, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., (1982), los contenidos de cada uno de los cuales se incorporan en la presente descripción por referencia en su totalidad. Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) o F. Ausubel y otros, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing and Wile-Interscience New York (1987) Los métodos adecuados para sintetizar sondas de oligonucleótidos también se describen en Caruthers, Science, 230:281-285, (1985).

En una modalidad, las moléculas molde de ácido nucleico se unen a un sustrato (también denominado en la presente descripción como una superficie) y se someten a análisis mediante secuenciación de una sola molécula como se describe en la presente descripción. Las moléculas de molde de ácido nucleico se unen a la superficie de manera que los dúplex de molde/cebador pueden resolverse ópticamente de manera individual. Los sustratos para usar en la invención pueden ser bidimensionales o tridimensionales y pueden comprender una superficie plana (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio) o pueden tener forma. Un sustrato puede incluir vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado (CPG)), cuarzo, plástico (tal como poliestireno (poliestireno de baja y alta reticulación), policarbonato, polipropileno y poli(metilmetacrilato)), copolímero acrílico, poliamida, silicio, metal (por ejemplo, oro derivatizado con alcanoetiolato), celulosa, nailon, látex, dextrano, matriz de gel (por ejemplo, gel de sílice), poliacroleína o compuestos.

Los sustratos tridimensionales adecuados incluyen, por ejemplo, esferas, micropartículas, perlas, membranas, portaobjetos, placas, chips micromecanizados, tubos (por ejemplo, tubos capilares), micropocillos, dispositivos microfluídicos, canales, filtros o cualquier otra estructura adecuada para anclar un ácido nucleico. Los sustratos pueden incluir arreglos planos o matrices capaces de tener regiones que incluyen poblaciones de ácidos nucleicos molde o cebadores. Los ejemplos incluyen CPG derivatizado de nucleósidos y portaobjetos de poliestireno; portaobjetos magnéticos derivatizados; poliestireno injertado con polietilenglicol, y similares.

Los sustratos se recubren preferentemente para permitir un procesamiento óptico y una unión de ácidos nucleicos óptimos. Los sustratos para usar en la invención también pueden tratarse para reducir el ruido de fondo. Los recubrimientos ilustrativos incluyen epóxidos y epóxidos derivatizados (por ejemplo, con una molécula de unión, tal como un oligonucleótido o estreptavidina).

Pueden usarse varios métodos para anclar o inmovilizar la molécula de ácido nucleico a la superficie del sustrato. La inmovilización puede lograrse a través de la unión directa o indirecta a la superficie. El enlace puede ser por enlace covalente. Véase, Joos y otros, Analytical Biochemistry 247:96-101, 1997; Oroskar y otros, Clin. Chem. 42:1547-1555, 1996; y Khandjian, Mol. Bio. Rep. 11:107-115, 1986. Una unión preferida es el enlace directo de amina de un nucleótido terminal del molde o el extremo 5' del cebador a un epóxido integrado en la superficie. El enlace también puede ser a través de un enlace no covalente. Por ejemplo, biotina-estreptavidina (Taylor y otros, J. Phys. D. Appl. Phys. 24:1443, 1991) y digoxigenina con anti-digoxigenina (Smith y otros, Science 253:1122, 1992) son herramientas comunes para anclar ácidos nucleicos a superficies y paralelos. Alternativamente, la unión puede lograrse mediante el anclaje de una cadena hidrófoba en una monocapa o bicapa lipídica. También pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica para unir moléculas de ácido nucleico a sustratos.

En algunas modalidades, una pluralidad de moléculas de ácido nucleico que se secuencian se unen a un soporte sólido. Para inmovilizar el ácido nucleico en un soporte sólido, puede añadirse una secuencia de captura/sitio de cebado universal en el extremo 3' y/o 5' del molde. Los ácidos nucleicos pueden unirse al soporte sólido al hibridar la secuencia de captura a una secuencia complementaria unida covalentemente al soporte sólido. La secuencia de captura (también denominada como una secuencia de captura universal) es una secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia unida a un soporte sólido que puede servir como cebador universal. En algunas modalidades, la secuencia de captura es poliNn, en donde N es U, A, T, G o C, por ejemplo, 20-70, 40-60, por ejemplo, aproximadamente 50. Por ejemplo, la secuencia de captura podría ser poliT40-50 o su complemento. Como alternativa a una secuencia de captura, un miembro de un par de acoplamiento (tal como, por ejemplo, anticuerpo/antígeno, receptor/ligando o el par avidina-biotina como se describió, por ejemplo, en la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2006/0252077) puede unirse a cada fragmento para ser capturado en una superficie recubierta con un segundo miembro respectivo de ese par de acoplamiento.

En algunas modalidades, se adjunta una secuencia de código de barras al ácido nucleico. Véase, por ejemplo, Steinman y otros (solicitud interna de PCT número PCT/US09/64001).

Ejemplo

La Figura 8 muestra una vista de 40X de células expuestas a varios tiempos de mezcla con perlas de granate. Las células fueron el producto de una prueba de modalidades del protocolo de batido de perlas. Las líneas celulares basadas en especímenes de ThinPrep® se crearon mediante el uso de células de CaSki cultivadas (una línea celular que contiene HPV-16 y secuencias relacionadas con HPV-18) a una concentración de 100 000 células/ml. Se añadieron perlas de granate (MO-BIO PIN 13123-05) a cada muestra de 20 ml y las muestras se sometieron a tiempos de mezcla variables en un agitador vorticial de plataforma.

Se prepararon portaobjetos y las células se tiñeron mediante el uso del conjunto de tinción de ThinPrep, que incluye tinción nuclear, solución de enjuague, solución de naranja G, solución de contratinción y solución de azulado. Después, los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos y se procesaron en un procesador de ThinPrep® 5000. Sorprendentemente, la presencia de perlas de granate no interfirió con el procesamiento de portaobjetos en la máquina, ni inhibió la visualización y el análisis de los portaobjetos procesados. Las muestras con y sin perlas rindieron métricas de procesamiento similares, lo que significa que las perlas no interfirieron con la función del procesador. Las muestras con y sin perlas también tenían una celularidad del portaobjetos y una presentación celular similares.

Las muestras que se sometieron a tiempos de mezcla prolongados experimentaron un mayor grado de oclusión del filtro y un menor número de aspiraciones de pulso necesarias para lograr la reducción diana en el régimen de flujo del filtro, lo que hace que el procesador deje de extraer muestras en el filtro. Este efecto también resultó en portaobjetos con celularidad disminuida. Este efecto solo fue perceptible en tiempos de mezcla de 5 minutos o más. Las imágenes de la Figura 8 son representativas solo de la presentación celular, no de la celularidad general del portaobjetos, porque el revisor seleccionó las áreas celulares de los portaobjetos para fotografiar. La presentación celular muestra que no existe un efecto significativo en la morfología celular como resultado de la presencia de perlas de granate o del tiempo de mezcla. La definición nuclear y la calidad de la tinción son similares entre todos los parámetros de control y de prueba. Solo hubo un pequeño aumento en los restos celulares en los portaobjetos como resultado del aumento de la mezcla.

Los resultados del experimento mostraron que el aumento de los tiempos de lisis resultó en recuentos de células más bajos, evidencia visual de restos celulares en la muestra, mayor turbidez de la muestra, mayor absorbancia del lisado y aumento de la oclusión del filtro de ThinPrep®. Sin embargo, el lisado no pareció afectar la transferencia celular ni la calidad de la presentación celular en los portaobjetos de ThinPrep®.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar una muestra biológica que comprende células, dicho método comprende:

obtener una muestra biológica de un sujeto;

poner en contacto la muestra biológica con un conservante de muestras biológicas para crear una muestra biológica conservada;

lisar parcialmente la muestra biológica conservada para crear una mezcla que comprenda células lisadas, células completas y componentes moleculares;

observar la morfología de células completas en una primera porción de la mezcla; y

analizar una segunda porción de la mezcla para componentes moleculares.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la lisis parcial comprende exponer la muestra biológica conservada entera a un proceso de lisis.

3. El método de la reivindicación 1, en donde se lisan menos del 50 % de las células.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la lisis parcial comprende cizallamiento mecánico, lisis con detergente, lisis osmótica, desnaturalización química, centrifugación, sonicación, congelación-descongelación o una de sus combinaciones.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el cizallamiento mecánico comprende cizallamiento con jeringa, batido de perlas o una de sus combinaciones.

6. El método de la reivindicación 1, en donde los componentes moleculares comprenden componentes de un patógeno presente en la muestra biológica.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el patógeno está asociado con una enfermedad seleccionada de un grupo que incluye clamidia, gonorrea, tricomoniasis y candidiasis.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el análisis de componentes moleculares comprende detectar ácidos nucleicos, cuantificar ácidos nucleicos, identificar ácidos nucleicos o secuenciar.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende además comparar un ácido nucleico identificado con una base de datos de marcadores conocidos para determinar si el sujeto porta un marcador conocido.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el marcador conocido se correlaciona con un riesgo de cáncer.

11. El método de la reivindicación 9, en donde el marcador conocido es HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-68, HPV-73 o HPV-82.

12. El método de la reivindicación 1, en donde observar la morfología de las células completas comprende seleccionar muestras de cuello uterino en cuanto a anomalías de células escamosas o anomalías de células glandulares.