KR20070026475A - 자궁경부 질환의 검사 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 생체 샘플에서 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 한가지 이상의 바이오마커(biomarker)를 검출하는 단계를 포함한다. 특히, 생체 샘플은 자궁경부 스미어 또는 자궁경부 세포의 단일층이다. 본 발명의 바이오마커는 세포 주기, 신호 전달 및 DNA 복제와 전사에 관여하는 유전자 및 단백질을 포함한다. 특히, 바이오마커는 S-단계 유전자이다. 본 발명의 일부 측면에서, 목적한 바이오마커의 과다 발현은 바이오마커 특이적 항체를 이용하여 단백질 수준으로, 또는 핵산 혼성화 기법을 이용하여 핵산의 수준으로 검출한다. 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 또한 제공한다.
높은 등급의 자궁경부 질환, 바이오마커
Description
본 발명은 높은 등급의 자궁경부 질환 검사 방법 및 조성물에 관한 것이다.
자궁경부암은 여성에서 2번째로 가장 흔히 발생되는 종양으로, 전체 여성 암환자의 약 12%를 차지하고 있으며 매해 약 250,000명이 사망하고 있다. Baldwin et al. (2003) Nature Reviews Cancer 3:1-10를 참조한다. 집단 검사 프로그램을 이용할 수 없는 많은 개발도상국들에서 임상적인 문제가 더욱 심각하다. 이들 국가에서의 여성의 사망원인 1위는 자궁경부암이다.
선암(adenocarcinoma)이 관찰되기도 하지만, 대부분의 자궁경부암은 편평표피 세포암을 나타낸다. 자궁경부막은 충분히 규명된 비침입성의 표피내 단계를 지나 발전하므로, 형태적으로 식별할 수 있는 집단 스크리닝으로 예방할 수 있다. Williams et al.(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14932-14937. 정상 세포가 변이되는 방법에 대해선 파악되지 않았지만, 정상적인 중층상피(stratified epithelium)에서 자궁경부 상피내 종양(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)을 통한 침투성 암으로의 연속적인 병리조직학적 변화 스펙트럼 개념은 수년간 광범위하게 인정되고 있다. 자궁경부암의 전구형태는 CIN 또는 편평 상피내 병 변(squamous intraepithelial lesions (SIL))으로도 당업계에 알려있는 이형성(dysplasia)이다. 편평 상피내 이상은 3단계(CIN) 또는 2단계(Bethesda) 시스템을 이용함으로써 분류할 수 있다. 베데스다 시스템에서, CINI 및 HPV 감염에 해당되는 낮은 등급의 편평 표피내 병변(LSIL)은 일반적으로 생산적인 HPV 감염을 나타내며 침투성 질환으로의 진행 위험성이 낮다. CINII 및 CINIII에 해당되는 높은 등급의 편평 상피내 병변(HSIL)은 LSIL 보다는 자궁경부암으로의 진행 위험성이 더 높지만, LSIL과 HSIL 모두 잠재적인 악성 전구형태로 보고 있다. 또한, 환자의 샘플을 이러한 시스템하에서 ASCUS(atypical squamous cells of unknown significance) 또는 AGUS(atypical glandular cells of unknown significance)로 분류할 수 있다.
자궁경부암과 타입 16, 18 및 31과 같은 위험 등급이 높은 인간 파필로마 바이러스(HIPV) 타입간의 강력한 관련성이 확인되고 있다. 실제, 많은 역학 및 분자 생물학적 증거들로 자궁경부암의 병인으로서 HPV 감염이 확정되었다. 또한, 높은 등급의 자궁경부 질환들의 85% 이상에서 HPV가 관찰되었다. 그러나, HPV 감염은 30살 이상 여성의 5-15%에서 발생될 수 있는 매우 흔한 현상으로, 소수의 HPV 양성 여성들에서만 높은 등급의 자궁경부 질환 또는 암으로 발병된다. HPV가 존재한다는 것은 감염만을 나타내는 것일 뿐 높은 등급의 자궁경부 질환을 의미하는 것이 아니므로, 따라서 HPV 테스트에서 많이 위양성으로 판단된다. 예로, Wright et al. (2004) Obstet. Gynecol . 103:304-309를 참조한다.
현재 문헌들은 HPV가 자궁경부의 하부 조직(underlying tissue)내 기저 줄기 세포에 감염하는 것으로 제안하고 있다. 줄기세포의 성숙형 각질형성세포로의 분화와 그로 인한 세포의 중층 경부 표피로의 이동은 HPV 바이러스의 복제와 세포의 재감염과 관련 있다. 바이러스 복제 과정중에, 세포 주기의 탈규제, 활발한 증식, DNA 복제, 전사 활성화 및 게놈 불안정성을 포함한, 수많은 세포 변화가 이루어진다(Crum(2000) Modern Pathology 13:243-251; Middleton et al. (2003) J. Virol . 77:10186-10201; Pett et al. (2004) Cancer Res . 64:1359-1368).
대부분의 HPV 감염은 자연상태에서 일시적이며, 바이러스 감염 12개월이내에 자체적으로 해결된다. 1종 이상의 HPV 발암성 서브타입으로 감염된 영구적인 감염상태인 개체는, HPV 감염되지 않는 환자들에 비해 종양 발생 위험성이 존재한다. 자궁경부암 발생에 있어서의 HPV의 중요성으로 인해, HPV의 임상 검사는 자궁경부암 발생 위험이 있는 환자를 확인하는 중요한 진단 수단이 되고 있다. HPV를 기초로한 자궁경부 질환 스크리닝의 임상적 이용성은 그의 음성 예측치내이다. 팝 스미어(Pap smear) 병력을 가지며 HPV에 음성인 결과는, 질병이 없는 상태이며 향후 1-3년간 자궁경부암 발병 위험성이 낮음을 나타내는 우수한 지표이다. 그러나, HPV 양성 결과는 자궁경부 질환을 진단한다기 보다는 감염이 있음을 나타내는 것이다. 대부분 HPV 감염은 일시적으로 12개월 이내에 자연적으로 없어지지만, 위험성이 높은 HPV 바이러스 서브타입의 지속적인 감염은 자궁경부암 발병 위험성이 높음을 의미한다. HPV 테스트를 보완하기 위해, 자궁경부암 관련 분자 마커의 동정으로 자궁경부 질환 진단의 임상적 특이도를 개선시킬 수 있을 것으로 추측된다.
파파니콜로-염색성(Papanicolaou-stained) 자궁경부 스미어 세포 검사(Pap smears)는 현재 자궁경부암을 검사하기 위한 선택 방법이다. Pap 테스트는 60년간 실질적인 변화없이 유지되고 있는 주관적인 방법이다. 그러나, 그 실행에 있어서는 여러가지가 문제가 있다. 단일 PaP 테스트의 민감도(테스트-양성이 질병 양성일 비율)가 낮고, 편차가 넓다(30-87%). 단일 Pap 테스트의 특이도(테스트-음성이 질병 음성일 비율)는 집단 스크리닝에서 86%로 낮으며, 잠복성 높은 등급 질병 검사에 대한 ASCUS PLUS 집단에서는 상당히 낮다. 상기 Baldwin 등의 문헌을 참조한다. LSIL 또는 CINI로 판단된 Pap 스미어의 상당 비율은 실제 높은 등급 병변에 대해 양성을 나타낸다. 또한, Pap 스미어의 최대 10%는 ASCUS(atypical squamous cells of undetermined significance)로 분류되며, 즉 정상, 중간 또는 심각한 병변이나 암으로 명확하게 분류하기 어렵다. 그러나, 이러한 ASCUS 집단의 최대 10%는 높은 등급 병변을 가지는데 결과적으로 간과된다. 예로, Manos et al(1999) JAMA 281:1605-1610를 참조한다.
따라서, 기존의 Pap 스미어 및 위험성이 높은 HPV 감염의 분자적 검사를 각각 또는 조합한, 높은 등급의 자궁경부 질환 진단 방법이 요구된다. 이러한 방법은 실제 높은 등급 병변 양성인 Pap 염색에 의해 LSIL 또는 CINI로 분류되는 사례(즉, "위음성")를 포함한, 모든 환자 집단에 존재하는 높은 등급의 경부 질환을 특이적으로 확인할 수 있어야 한다. 그러므로, 높은 등급의 자궁경부 질환을 검사할 수 있으며 HPV 감염 초기 단계 및 경증의 이형성(mild dysplasia)과 같은 임상 질환으로 간주되지 않는 증상과 높은 등급 질병을 구별할 수 있는 특이적이고도 신뢰성 있는 진단 방법이 당업계에 필요한 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 한가지 이상의 생체 샘플내 바이오마커(biomarker), 특히 핵의 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 이러한 바이오마커의 과다 발현 검출로 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 샘플을 특이적으로 파악한다. 본 발명의 방법은 양성 증식, HPV 초기 감염 단계 또는 경증의 이형성을 나타내는 샘플로부터 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 샘플을 구별한다. 따라서, 본 발명의 방법은 정상 세포 또는 임상 질병이 아닌 세포에서 과다 발현되진 않지만 높은 등급의 자궁경부 질환에서는 선택적으로 과다 발현되는 바이오마커 검출을 토대로 한다.
본 발명의 바이오마커는 HPV 유발성 세포 주기 이상 및 S 단계 유도에 관여하는 특정 유전자의 활성화를 초래하는 것을 포함한, 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 단백질 및/또는 유전자이다. 바이오마커는 특히 발현으로 인해 HPV 유발성 세포 주기 이상과 전사 인자 SP-1 및 E2F의 이차적인 활성화를 초래하는 S 단계 유전자를 포함한다. 본 발명의 바이오마커 유전자나 단백질의 과다 발현 검출로, 경증 내지 중증의 이형성 및 자궁경부암종과 같은 높은 등급 질환을 나타내는 샘플을, 정상 세포 또는 임상 질환을 나타내지 않는(예, HPV 초기 감염 단계 및 경증의 이형성) 세포로부터 식별할 수 있다.
바이오마커 과다 발현은 단백질 또는 핵산 수준으로 평가할 수 있다. 일부 예에서, 면역세포화학적 기법은 자궁경부 세포 샘플에서 바이오마커 단백질의 과다 발현을 검사하기 위한 항체를 활용하는 방법을 제공한다. 이러한 측면에서, 본 발명은 특정 바이오마커를 검출하기 위한 한가지 이상의 항체를 사용한다. 또한, 과다 발현은 핵산을 이용한 기술, 예컨대, 혼성화 및 RT-PCR 방법으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 방법은 형태적 특징이나 HPV 감염 상태를 분석하는 전통적인 산부인과 진단 기법을 병용 사용할 수 있다. 따라서, 예컨대, 기존의 면역조직 화학 방법을 Pap 테스트와 병용하여, 기존 방법으로 수득한 형태 정보를 유지할 수 있다. 이러한 방법에서, 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 바이오마커의 검출로 Pap 테스트의 높은 위음성율을 낮출 수 있으며, 집단 자동 스크리닝을 용이하게 할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 높은 등급의 자궁경부 질환을 동정 및 진단하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 높은 등급의 자궁경부 질환(예, 중간 내지 중한 이형성 및 자궁경부암)에서 선택적으로 과다 발현되는 특이 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함한다. 즉, 본 발명의 바이오마커는 HPV 감염 세포와 전-악성, 악성 또는 명백히 암인 HPV 감염 세포를 구별할 수 있다. 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법은 환자의 조직이나 체액 샘플에서 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 한가지 이상이 바이오마커의 과다 발현 검출을 포함한다. 특정 예에서, 항체 및 면역세포화학 기법을 목적한 바이오마커의 발현 검출에 사용한다. 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 또한 제공한다.
"높은 등급의 자궁경부 질환 진단"은, 예컨대 자궁경부 질환의 존재 진단 또는 검출, 질병 진행 모니터링, 및 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 세포 또는 샘플의 동정 또는 검출을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 높은 등급의 자궁경부 질환의 진단, 검출 및 동정은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. "높은 등급의 자궁경부 질환"은 질경 검사로 분류한 전악성 병리, 악성 병리, 중간 내지 중증의 이형성 및 자궁경부암과 같은 증상을 의미한다. 잠재적인 높은 등급의 자궁경부 질환은 CINTII, CINIII, HSIL, 암종 in situ , 선암종(adenocarcinoma) 및 암(FIGO stages I-TV)의 조직학적 동정을 포함한다.
전술한 바와 같이, 정상, CINI 또는 ASCUS로 분류된 Pap 스미어로 검사한 환자의 상당 퍼센트는 실제 높은 등급의 자궁경부 질환의 특징적인 병변을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 "위음성" 환자를 포함한 자궁경부 질환을 동정하며, 환자 샘플내 드문 비정상적인 세포 검출을 용이하게 한다. 또한, 본 발명의 방법은 기존의 진단 기법, 예컨대 Pap 테스트, 위험성이 높은 HPV 타입의 분자적 검사 등과 병용하여 사용할 수 있지만, 진단은 세포 형태 및 HPV 감염 단계로 독립적으로 수행할 수 있다.
HPV 타입은 자궁경부암 및 전암성 병변과의 관련성을 토대로, 위험성 높음 및 위험성 낮음으로 분류된다. 위험성이 낮은 HPV 타입은 타입 6, 11, 42, 43, 44를 포함하며, 자궁경부암의 위험성 증가와 관련이 없다. 반대로, 위험성이 높은 HPV 타입은 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68을 포함하는 것으로, 자궁경부암과 편평 경피성 병변과 강하게 관련되어 있다. 예로, Wright et al. (2004) Obstet . Gynecol . 103:304-309를 참조한다. 실제, 자궁경부암의 99% 이상이 위험성이 높은 HPV 감염과 관련 있다. 위험성이 높은 HPV 타입의 지속적인 감염은 HPV 유전자 E2, E6 및 E7를 통해 자궁경부 세포에서의 세포 주기 및 유사분열 체크포인트 파괴를 유도한다. 특히, HPV E7은 사이클린 E 증가와 이후의 레티노블라스토마(Rb)에서의 전사 인자 E2f의 방출을 야기한다. 방출된 E2f 전사 인자는 이후 토포이소머라제 II 알파(Topo2A), MCM 단백질, 사이클린 E1 및 E2, 및 p14asf를 포함한 여러가지 S 단계 유전자의 전사를 촉발시키며, 그 결과 세포 주기 조절이 소실된다. 또한, HPV E2는 추가적으로 Sp-1 전사 인자를 활성화시켜, p21waf - 1와 같은 S 단계 유전자의 과다 발현을 자극한다. 지속적인 HPV 감염으로 인한 세포 주기 파괴는 중간 또는 중증의 이형성으로 진행될 수 있는 경증의 자궁경부 이형성을 유발할 수 있으며, 결국 일부 경우에서는 자궁경부암으로 진행될 수 있다. "자궁경부암"은 자궁경부 조직 또는 자궁경부 세포와 관련된 모든 암 또는 암성 병변을 포함한다.
자궁경부의 각질형성세포의 HPV 감염으로 인해, 세포 주기에서 활성을 파괴하는 다수의 변이가 발생된다. 위험성이 높은 HPV 서브타입의 E6 및 E7 발암단백질은 증식 증가 및 감염된 각질형성세포의 종양성 변이와 관련된 수많은 세포 기작에 관여한다. E6 단백질은 두가지 주된 기작에 관여한다. 첫번째는 유비퀴틴 매개의 단백질 분해를 통한 p53 종양 억제 단백질의 분해이다. 기능성 p53의 제거는 DNA 복제 및 유사분열로 진행되기 전에 DNA 회복에 필요한 중요한 세포 주기 체크포인트를 없앤다(Duensing and Munger (2003) Prog Cell Cycle Res . 5:383-391). 또한, E6은 c-myc 단백질과 상호 작용하는 것으로 확인되었으며, 이후의 텔로머라제 발현을 수반하는 hTERT 유전자의 직접적인 전사 활성화에 책임지고 있다(McMurray and McCance (2003) J Virol . 77:9852-9861; Veldman et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100: 8211-8216). 텔로머라제의 활성화는 염색체 복제에서 텔로미어의 길이를 유지하는데 필요한 암 생물학에서 중요한 단계로, 이 효소는 세포의 불멸화 중에 무손상 염색체를 기능적으로 확보한다.
HPV 발암단백질 E7은 두 가지 독립적인 메카니즘을 통해 세포 증식에 작용하는 것으로 알려져 있다. 그 첫째는, E7과 Smad 단백질(Smad 2, 3 및 4)의 직접적인 상호작용을 통한 G1 단계로의 세포 주기 정지에 관여하는 TGF-베타 종양 억제 경로의 불활성화로, 그로인해 이들의 DNA 결합력이 저해된다(Lee et al. (2002) J Biol Chem. 277: 38557-38564). 이와 같이, E7도 Rb 종양 억제 단백질과 특이적으로 상호작용하는 것으로 알려져 있다. G1 세포 주기에서, Rb는 E2F 전사 인자와 복합체를 형성하여 E2F의 유전자 전사 활성화를 방지한다. G1/S 경계에서, Rb 단백질은 인산화되어 E2F 전사 인자를 방출하고, 따라서 E2F 유전자 전사가 개시되어 세포 주기의 S 단계로 진입하게 된다. HPV E7 발암단백질은 Rb와 직접 결합하여 복합체로부터의 E2F를 대체함으로써 이러한 조절 메카니즘을 파괴한다. 그 결과, 정상 세포 주기 조절과는 독립적인 E2F 유발성 유전자 전사가 발생된다(Duensing and Munger (2003) Prog Cell Cycle Res. 5:383-391; Duensing and Munger (2004) Int J Cancer 109:157-162; Clarke and Chetty (2001) Gynecol Oncol . 82:238-246). 이렇게 방출된 E2F는 세포 주기 조절에서 유전자 전사와 커플을 이루지 못하고, 결과적으로 DNA 합성 및 세포 증식에 필요한 S 단계 유전자의 지속적이고 비정상적인 전사를 초래하게 된다. 또한, E6와 E7의 조합적인 작용은 센트로좀의 이상에 기여하여, 자궁 종양에서 게놈의 불안정성을 초래하는 것으로 알려져 있다(Duensing and Munger (2004) Int J cancer 109:157-162).
특정 메카니즘으로 제한될 의도 없이, 일부 예에서, HPV의 발암 균주의 감염의 결과로서, 높은 등급의 자궁경부 질환의 분자 양태는 세포 주기의 S 단계에서만 정상적으로 발현되는 개별적인 유전자의 과다 발현으로 특정화할 수 있다. 후속적인 유전자 전사의 무통제성 활성화 및 비정상적인 S 단계 유도는 E2F-1 전사 인자 경로를 통해 매개된다. 이러한 양상은 높은 등급의 자궁경부 질환의 지표로 나타나며, 발암성 HPV 감염과 자궁경부 종양의 분자적 양상 간의 연관성을 제공한다. 이러한 자궁경부 종양의 이들 분자 바이오마커를 분자적 진단 분석에 사용하여, 자궁경부 질환 검출 방법을 향상시킬 수 있으며, 기존 방법에 비해 민감도 및 특이도가 향상된다. 도 1-4 및 Malinowski (2005) BioTechniques 38:1-8(in press)를 참조하며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 따라서, 특정 예에서, 높은 등급의 자궁경부 질환 진단 방법은 비정상적인 S-단계 유도를 나타내는 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함한다. 또다른 예로, 상기 방법은 HPV E6 및 HPV E7 유전자의 과다 발현 또는 전사 활성을 나타내는 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
이형성은 세포 및 핵 크기, 모양 및 염색 특성상의 변이가 수반된, 상피 세포의 정상적인 위상 소실로, 형태적인 측면으로 일반적으로 정의된다. 이형성은 세포 이상 정도(즉, 경증, 중간, 중증)에 따라 등급을 매기며, CIN과 같은 전-암성 이형성 상태의 동정에 의해 입증된 바와 같이 정상 조직에서 종양으로의 진행에 있어 중간 단계인 것으로 널리 인지되고 있다. 본 발명의 방법은 중간 내지 중증의 이형성 및 자궁경부암(즉, CINII 상태 및 상기한 바)을 포함하는 높은 등급의 자궁경부 질환을 높은 등급 자궁경부 질환에 특이적인 바이오마커의 과다 발현을 토대로 동정가능하다.
본 발명의 방법은 Pap 스미어 및/또는 HPV 감염 테스트 방법에 비해 월등한, 높은 등급의 자궁경부 질환 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 민감도 및 특이도는 기존의 Pap 스미어의 민감도 및 특이도와 동일하거나 또는 이보다 월등하다. 본원에서, "특이도"는 본 발명의 방법이 질경검사에서 NIL로 확인된 샘플을 정확하게 동정할 수 있는 수준(즉, 진음성)을 의미한다. 즉, 테스트-음성이 질병 음성인 비율이다. 임상 실험에서, 특이도는 진음성과 위양성의 합으로 진음성 값을 나누어 계산한다. "민감도"는 본 발명의 방법이 높은 등급의 자궁경부 질환에서 양성으로 질경검사에서 판단된 샘플을 정확하게 동정할 수 있는 수준(즉, 진음성)을 의미한다. 따라서, 민감도는 테스트-양성이 질병 양성인 비율이다. 민감도는 진양성 및 위음성의 합으로 진양성을 나누어 임상 실험에서 계산한다. 실시에 1-3을 참조한다. 일부 예들에서, 높은 등급의 자궁경부 질환 검출 방법의 민감도는 적어도 약 70% 이상이 바람직하며, 더 바람직하기로는 약 80% 이상이며, 가장 바람직하기로는 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 % 이상이다. 또한, 본 발명의 특이도는 바람직하기로는 약 70% 이상이며, 보다 바람직하기로는 약 80%이며, 가장 바람직하기로는 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상이다.
용어 "양성 예측치" 또는 "PPV"는 본 발명의 방법을 이용하여 양성으로 분류된 환자에 한해 환자가 높은 등급의 자궁경부 질환을 가질 가능성이다. PPV는 임상 연구에서는 진양성 및 위양성의 합으로 진양성을 나누어 계산한다. 일부 예에서, 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출하기 위한 본 발명에 따른 방법은 약 90% 이상의 민감도, 보다 바람직하기로는 약 95%의 민감도를 유지한 상태에서, PPV는 약 40% 이상이다. "음성 예측치" 또는 "NPV"는 음성으로 테스트된 모든 환자에 한해 환자가 질병이 없을 가능성을 나타낸다. NPV는 임상 연구에서 진양성과 위음성의 합으로 진음성을 나누어 계산한다.
본 발명의 바이오마커는 유전자 및 단백질, 그리고 이들의 변형체 및 단편을 포함한다. 이러한 바이오마커는 바이오마커를 코딩하는 핵산 서열의 전체 또는 일부 서열을 포함하는 DNA 또는 상기 서열의 상보체를 포함한다. 또한, 바이오마커 핵산은 목적한 모든 핵산 서열의 전체 또는 일부 서열을 포함하는 RNA를 포함한다. 바이오마커 단백질은 본 발명의 DNA 바이오마커에 의해 코팅되는 또는 해당하는 단백질이다. 바이오마커 단백질은 모든 바이오마커 단백질 또는 폴리펩티드의 전체 또는 일부 아미노산 서열을 포함한다.
"바이오마커"는 조직이나 세포에서의 발현 수준이, 정상이거나 건강한 세포나 조직의 것에 비해 달라진 모든 유전자 또는 단백질이다. 본 발명의 바이오마커는 잠재적인 높은 등급의 자궁경부 질환에 선택적이다. "높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 발현된"은 목적한 바이오마커가 LSIL, CINI, 어떠한 이형성이 없는 HPV-감염 샘플, 미성숙 화생성 세포(immature metaplastic cell) 및 임상 질환으로 간주되지 않는 그외 상태로 분류된 상태에서는 발현되지 않으나, 높은 등급의 자궁경부 질환에서 과다 발현되는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 바이오마커 검출은 양성 증식, HPV 감염 초기 단계 또는 경증의 이형성을 나타내는 샘플로부터 잠재적인 높은 등급의 자궁경부 질환을 보이는 샘플을 식별할 수 있게 한다. "HPV 감염 초기 단계"는 자궁경부 이형성으로 진행되지 않은 HPV 감염 상태를 의미한다. 본원에서 "경증의 이형성"은 높은 등급의 병변이 없는 LSIL 및 CINI를 의미한다. 또한, 본 발명은 정상 세포, 미성숙 화생성 세포 및 그외 임상 질환을 나타내지 않는 세포에서 높은 등급 질환의 세포를 구별한다. 이러한 방법에서, 본 발명의 방법은 정상, CINI, LSIL 또는 ASCUS로 기존의 Pap 테스트로 잘못 분류된 경우에서도(즉, 위음성), 높은 등급의 자궁경부 질환을 정확하게 동정할 수 있다. 일부 예에서, 높은 등급의 자궁경부 질환 진단 방법은 이상 또는 비전형 Pap 스미어에 대한 반사작용으로서 수행된다. 즉, 본 발명의 방법은 이상 또는 비전형 PAp 스미어 결과를 나타내는 환자에 대해 실행될 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 상기 방법은 기존의 Pap 테스트가 현재 실행되는 것처럼, 일반적인 여성 집단에서 높은 등급의 자궁경부 질환의 일차 스크리닝 테스트로서 수행된다.
본 발명의 바이오마커는 전술한 바와 같은 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 모든 유전자 또는 단백질을 포함한다. 이러한 바이오마커는 전-악성, 악성 또는 명백하게 암인 조직 세포 현탁물내 세포를 동정할 수 있다. 본 발명의 바이오마커는 CINII 상태 및 상기에 기재한 세포를 검출하지만, CINI 및 잠재적인 높은 등급의 질환이 없는 HPV 감염 세포를 검출하지 않는다. 특히 목적한 바이오마커는 세포 주기 조절, 세포 주기의 HPV 파괴, DNA 복제 및 전사, 및 신호 전이에 관여하는 유전자 및 단백질이다. 일 예에서, 바이오마커는 그 발현이 E2f 전사 인자 또는 Sp-1 전사 인자에 의해 자극되는 유전자를 포함한, S-단계 유전자이다. 핵의 바이오마커는 본 발명의 특정 측면을 실행하는데 사용할 수 있다. "핵의 바이오마커"는 세포의 핵내에서 우세적으로 발현되는 바이오마커이다. 핵의 바이오마커는 세포의 다른 부분에서는 낮은 수준으로 발현된다. 높은 등급의 자궁경부 질환을 표시하는 모든 바이오마커는 본 발명에서 사용할 수 있지만, 특정 예에서는, 바이오마커 특히 핵의 바이오마커는 MCM2, MCM6, MCM7, p2lwaf1, 토포이소머라제 IIα(Topo2A), p14asf, 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 구체적으로는, 바이오마커는 MCM 단백질을 포함할 수도 있다.
미니염색체 유지(MCM, Minichromosome maintenance) 단백질은 진핵의 DNA 복제에 필수적인 역할을 수행한다. 미니염색체 유지 단백질은 DNA상에 전-복제 복합체를 재(loading)하여 헬리카제로 기능함으로써,DNA 복제의 초기 단계에서 복제 DNA 가닥의 신규 합성시 이중 DNA의 꼬임을 풀어주는 작용을 보조한다. MCM 단백질 각각은 매우 보존적인 중추 도메인에 DNA 의존적 ATPase 모티프를 가지고 있다. MCM 단백질 수준은 일반적으로 세포주기 G0에서 G1/S로 정상 세포가 진행되면서, 여러가지 방법에 의해 증가된다. G0 단계에서, MCM2와 MCM5 단백질은 MCM7 및 MCM3 단백질에 비해 매우 소량 존재한다. MCM6은 MCM2, MCM4 및 MCM7과 복합체를 형성하여 히스톤 H3에 결합한다. 또한, MCM4, MCM6 및 MCM7의 하위복합체는 헬리카제 활성을 가지고 있으며, MCM6의 ATP 결합 활성 및 MCM4의 DNA 결합 활성에 의해 매개된다. 예로, Freeman et al. (1999) Clin . Cancer Res . 5:2121-2132; Lei et al. (2001) J. Cell Sci. 114: 1447-1454; Ishimi et al. (2003) Eur . J. Biochern . 270:1089-1101을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다.
초기 문헌들은 MCM 단백질, 특히 MCM-5가 자궁경부 질환(Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:14932-14937) 뿐만 아니라 그외 암(Freeman et al. (1999) Clin Cancer Res . 5:2121-2132) 검출에 유용하다는 것을 입증하였다. 공개된 문헌에서는 MCM-5에 대한 항체가 자궁경부 종양 세포를 검출할 수 있다고 개시되어 있다. 높은 등급의 자궁경부 질환의 검출 특이도는 MCM-5에 대해선 입증되지 않았다(Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:14932-14937). MCM-5 발현 검출은 높은 등급의 자궁경부 질환에만 한정되지 않으며, 규명된 저등급의 이형성 및 위험성이 높은 HPV 감염 이후에 세포 주기로 재진입되는 증식성 세포를 검출한다. MCM-5 항체를 이용한 자궁경부 종양 검출은 도 4에 나타낸다. MCM-5 이외에도, 그외 MCM 계열의 일원들, 예컨대 MCM-2 및 MCM-7이 조직 샘플에서 자궁경부 종양 검출에 잠재적으로 유용한 마커인 것으로 확인되었다(Freeman et al. (1999) Clin Gancer Res . 5:2121-2132; Brake et al . (2003) Cancer Res . 63:8173-8180). 최근 결과는 MCM-7이 면역화학적 방법을 이용한 높은 등급의 자궁경부 질환 검출용 특이 마커임을 보이고 있다(Brake et al (2003) Cancer Res . 63:8173-8180; Malinowski et al. (2004) Acta Cytol . 43:696).
토포이소머라제 II 알파(Topo2a)는 DNA 복제에 관여하는 필수적인 핵 효소이며, 암 치료에 사용되는 수많은 항암제의 표적물질이다. Topo2a 발현 감소는 여러가지 화학치료제에 대한 우세적인 내성 메카니즘이다. 상기 단백질의 발현 범위상의 유의적인 편차는 다수의 여러가지 종양에서 엄급되고 있다. Topo2a는 증식성 세포에서 우세적이며, 상염색체의 응축(chromosome condensation) 및 분열(segregation)에 중요한 특정 부위의 인산화에 의해 M 단계에서 변형된다.
p21은 염색체 6p상의 WAFl/Cipl 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 이 유전자는 수종의 사이클린/사이클린 의존적 키나제 복합체의 활성화를 저해하고, 세포 주기 진행을 차단하는 것으로 확인되었다. p21waf1의 발현은 p53의 세포 주기 정지 작용을 매개한다. p21은 p53의 여러가지 증식 조절 작용을 매개하는 것으로 보이므로, 이의 발현은 p53 축적보다는 더 정확하게는 p53의 기능적 상태를 반영할 수 있다. 나아가, p21waf1은 세포 핵 항원의 증식(PCNA) 작용을 차단함으로써 DNA 복제를 저해할 수 있다.
사이클린 E는 cdk-2 조절 서브유닛이며, 포유류의 세포 주기에서 G1/S 전이를 조절한다. 사이클린 E의 다중 아이소형태는 단지 종양에서 발현될 뿐 정상 조직에서는 발현되지 않으며, 이로는 사이클린 E의 전사후 조절을 시사한다. 시험관내 분석으로, 사이클린 E의 절단된 다양한 아이소형태가 히스톤 H1을 인산화시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 사이클린 E 단백질 변이는 여러가지 암에서 불충분한 예측 지표로서 관련되어 있다.
전술한 바이오마커는 구체적으로 논의되었지만, 높은 등급의 자궁경부 질환 상태에서 과다 발현되는 모든 바이오마커(예, CINTI, CINIII 및 자궁경부 암종)는 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 그외 목적한 바이오마커로는 G1/S 단계 경계 또는 S단계에 특이적인 세포 주기 조절 유전자를 포함한다. 이러한 유전자로는, 헬리카제(DDX11), 우라실 DNA 글리콜라제(UNG), E2F5, 사이클린 El(CCNBI), 사이클린 E2(CCNE2), CDC25A, CDC45L, CDC6, p21 WAF-l(CDKN1A), CDKN3, E2F1, MCM2, MCM6, NPAT, PCNA, 스템 루프(stem loop) BP(SLBP), BRCA1, BRCA2, CCNG2, CDKN2C, 디하이드로폴레이트 리억타제(DHFR), 히스톤 H1, 히스톤 H2A, 히스톤 H2B, 히스톤 H3, 히스톤 H4, MSH2, NASP, 리보뉴클레오티드 리덕타제 Ml(RRM1), 리보뉴클레오티드 리덕타제 M2(RRM2), 티미딘 신테타제(TYMS), 복제 인자 C4(RFC4), RAD51, 염색사 인자 lA(CHAF1A), 염색사 인자 lB (CHAF1B), 토포이소머라제 III(TOP3A), ORC1, 프리마제(primase) 2A(PRIM2A), CDC27, 프리마제 1(PRIM 1), 플랩 구조 엔도뉴클레아제(flap structure endonuclease)(FEN1), 판코니 아네미아 콤프. grpA(fanconi anemia comp. grp A)(FNACA), PKMYT1 및 복제 단백질 A2 (RPA2)을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 예로, Whitfield et al. (2002) Mo !. Biol . Cell 13:1977-2000을 참조하며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 그외 목적한 S 단계 유전자로는 사이클린 의존적 키나제 2(CDK2), MCM3, MCM4, MCM5, DNA 중합효소 I 알파(DNA POLl), DNA 리가제 1, B-Myb, DNA 메틸 트랜스퍼라제(DNA MET), 페리센트린(pericentrin)(PER), KIF4, DP-1, ID-3, RAN 결합 단백질(RANBP1), 갭 정션 알파 6 (GJA6), 아미노 레불리네이트 디하이드라타제(amino levulinate dehydratase)(ALDH), 히스톤 2A Z(H2A.Z), 스페르민 신타제(spermine synthase)(SpmS), 프로리페린(proliferin) 2, T-림프구 활성 단백질, 포스포리파제 A2(PLA2), 및 L6 항원(L6)이 있다. 예컨대, Nevins et al. (2001) Mol . Cell . Biol . 21:4689-4699을 참조하며, 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일부 측면에서, 바이오마커는 E2f 전사 인자에 의해 유도되는 유전자를 포함한다. 이러한 유전자로는 티미딜레이트 신타제, 티미딘 키나제1, 리보뉴클레오티드 리덕타제 M1, 리보뉴클레오티드 리덕타제 M2, CDK2, 사이클린 E, MCM3, MCM7, PCNA, DNA 프리마제 소형 서브유닛, 토포이소머라제 II A(Topo2A), DNA 리가제 1, 플랩 엔도뉴클레아제 1, RAD5I, CDC2, 사이클린 A2, 사이클린 Bl, 사이클린 B2, KI-67, K1FC1, FIN16, BUB1, 임포르틴 알파-2, HMG2, 제스트의 인핸서(enhancer of zeste), STK-l, 히스톤 스템-루프 BP, Rb, P18-INK4C, 아넥신 VIII, c-Myb, CDC25A, 사이클린 D3, 사이클린 El, 데옥시사이토신 키나제, DP-l, 엔도텔린 변환 효소, 에놀라제 2, P18 INK4C, 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 유라실 DNA 글리콜라제 2가 있으나, 이로 한정되는 것을 아니다. 예로, 상기 Nevins et al.; Muller et al. (2000) Genes and Dev . 15:267-285를 참조한다. 특정 예로, 목적한 바이오마커는 세포 주기 조절 및 DNA 복제에 관여하는 E2f 전사 인자에 의해 유발된 유전자이며, 예컨대,사이클린 E2, Ki-67, p57K]P2, RAINBPM, 및 복제 단백질 Al이 있다. 일부 E2f-유발성 목적 유전자는 세포자살에 관여하며, APAF1, Bcl-2, 카스파제 3, MAP3 키나제 5 및 TNF 리셉터 조합 인자를 포함한다. 그외 E2f-유발성 유전자는 전사 조절에 관여하며, 예컨대, asb2 계, 폴리호메오틱(polyhomeotic) 2, 배아 외배엽 단백질(embryonic ectoderm protein), 제스트의 인핸서, 스플리트의 헤리/인핸서(hairy/enhancer of split), 호메오박스 AlO, 호메오박스A7, 호메오박스 A9, 호메오도메인 TF1, 프리-B-세포 백혈병 FT3, YY1 TF, POU 도메인 TF, TAFII13O, TBP-인자 172, 베이직 TF3, 보로모도메인/아연 핑거, SWI/SNF, ID4, TEA-4, NFATC1, NFATC3, BT, CNC-l, MAF, MAFF, MAFG, 코어 결합 단백질, E74-유사 인자 4, c-FOS, JUNB, 아연 핑거 DNA BP 및 Cbp/p300 전사 활성자를 포함한다. 신호 전달에 관여하는 E2f-유발성 유전자는, 또한 잠재적인 목적한 바이오마커이며, TGF 베타, 폴리스타틴(follistatin), 뼈 형태형성 단백질 2, BMP 리셉터 타입 1A, 프리즐드 호몰로그(frizzled homolog) 1, WNT1OB, 스핑고신 키나제1, 듀얼 특이도 포스파타제(dual specificity phosphatase) 7, 듀얼 특이도(Y) 포스파타제, FGF 리셉터 3, 단백질 티로신 포스파타제, 듀얼 특이도(Y) 포스프타제 D6655, 인슐린 리셉터, 성숙 T-세포 증식 1, FGF 리셉터 2, TGF 알파, CDC42 작용자 단백질(effector protein) 3, Met, CD58, CD83, TACC1 및 TEAD4가 있다.
본 발명의 방법에는 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출하기 위해 환자 샘플에서 한가지 이상의 바이오마커 검출이 요구되지만, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 바이오마커를 사용하여 본 발명의 방법을 실시할 수도 있다. 생체 샘플에서 2가지 이상의 바이오마커의 검출은 높은 등급의 자궁경부 질환의 경우를 동정하는데 사용할 수 있을 것으로 이해되다. 따라서, 일부 예에서는, 2종 이상의 바이오마커를 사용하며, 보다 바람직하기로는 2종 이상의 상보적인 바이오마커를 사용한다. "상보적인"은 생체 샘플내 바이오마커 조합 검출로, 단지 한가지 바이오마커만을 사용한 경우 동정되는 것에 비해, 수배 높은 퍼센트로 높은 등급의 자궁경부 질환을 성공적으로 동정하는 것을 의미한다. 따라서, 일부 예에서는, 보다 정확한 높은 등급의 자궁경부 질환 검사를 적어도 2종 이상의 바이오마커를 이용하여 수행할 수 있다. 따라서, 한가지 이상의 바이오마커를 사용하는 경우에는, 개별적인 바이오마커에 대한 적어도 2가지 이상의 항체를 사용하여, 본원에 기재된 면역세포화학적 방법을 수행할 것이다. 항체는 생체 샘플과 일시에(simultaneously) 또는 동시에(concurrently) 접촉될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, MCM2과 Topo2A의 과다 발현은 3가지 항체를 이용하여 검출하며, 이때 2가지 항체는 MCM2에 특이적이며, 나머지 항체는 Topo2A에 특이적이다.
특정 예에서, 본 발명의 진단 방법은 환자의 자궁경부 샘플을 수집하는 단계, 상기 샘플을 목적한 바이오마커에 특이적인 1종 이상의 항체와 접촉시키는 단계 및 항체 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 항체 결합 검출에 따라 본 발명의 바이오마커의 과다 발현을 나타내는 샘플은 높은 등급의 자궁경부 질환에 양성인 것으로 둔다. 특정 예에서, 생체 샘플은 자궁경부 세포의 단일층이다. 일부 측면에서, 자궁경부 세포의 단일층은 글라스 슬라이드상에 제공된다.
"생체 샘플"은 바이오마커의 발현을 검출할 수 있는 모든 세포, 조직 또는 체액 샘플링을 의미한다. 이러한 생체 샘플의 예로는, 혈액, 림프, 뇨, 부인과 체액(gynecological fluid), 생검 및 스미어(smear)를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 생체 샘플은 예컨대, 부위 스크랩핑 또는 스위빙(swabbing) 또는 바늘을 이용한 생체 체액 흡입에 의한 것을 포함한, 다양한 방법으로 환자로부터 채취할 수 있다. 다양한 생체 샘플 채취 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 특정 예로, 생체 샘플은 자궁경부 세포를 경부 조직 샘플로서 또는 현탁 상태, 특히 액체-기제의 조제물의 자궁경부 세포로서 포함한다. 일 예로, 자궁경부 샘플은 예컨대 SurePath®(TriPath Imaging, Inc.)또는 ThinPrep®preparation (CYTYC, Inc.)와 같은 액체 기재의 조직 샘플 준비 지침에 따라 채취한다. 생체 샘플은 현미경하에서 관찰하기 위해 글라스 슬라이드로 이동시킬 수 있다. 고정 및 염색 용액을 글라스 슬라이드 상의 세포에 적용하여, 검체을 보존시키고 검경을 용이하게 할 수 있다. 일 예로, 자궁경부 샘플은 미국 특허 제 5,346,831호에 기재된 바와 같이 채취하고 처리하여 단일층 샘플로 제공하며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
단일층 방법은 양으로 하전된 기질상에 세포 물질의 단일층을 형성시키는 방법과 관련있다. 상기 방법은 밀도 구배로 원심분리하는 단계, 압축된 세포 물질의 펠렛을 제조하는 단계, 상기 세포 물질의 펠렛을 혼합하는 단계, 혼합한 펠렛에서 미리 결정한 부피의 분주물을 취하는 단계, 상기 분주물과 미리 결정된 부피의 물을 하전된 기질에 이동가능하도록 확보된 침강 바셀로 옮기는 단계, 중력하에 상기 세포 물질을 기질상에서 침강시키는 단계 및 세포 물질의 침강 이후에 침강 바셀에서 물을 제거하는 단계에 의해 세포 물질을 분리하는 단계를 포함한다. 자동 분석시, 침강 바셀은 기질에서 탈착시킬 수 있다. 분리(Disaggregation)는 시린징(syringing), 트립신 처리(trypsinizing), 초음파 처리, 교반, 혼합(vortexing), 또는 미국 특허 제 5,316,814에 기재된 기기를 이용하는 것과 같은 당업계에 공지된 모든 방법에 의한 것일 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 일부 예들에서, 자궁경부 세포의 단일층을 포함하는 슬라이드는 PrepStainTM 슬라이드 프로세서(TriPath Imaging, Inc.)를 이용하여 SurePathTM(TriPath Imaging, Inc.) 샘플로부터 준비한다.
바이오마커의 동정 또는 검출에 유용한 당업계의 모든 방법이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 바이오마커 과다 발현은 핵산 또는 단백질의 수준으로 검출할 수 있다. 과다 발현을 검출하기 위해, 검사되는 생체 샘플을 건강한 사람에서 유래한 해당 생체 샘플과 비교할 수 있다. 즉, "정상" 발현 수준은 높은 등급의 자궁경부 질환이 없는 인간이나 환자의 자궁경부 세포에서의 바이오마커 발현 수준이다. 이러한 샘플은 표준화된 형태로 존재될 수 있다. 일부 예들에서, 특히 생체 샘플이 자궁경부 세포의 단일층을 포함하는 경우, 바이오마커의 과다 발현 측정은 생체 샘플과 건강한 사람에서 유래된 해당 생체 샘플간을 비교할 필요가 없다. 이러한 상황에서, 한명의 환자에서 유래된 자궁경부 세포의 단일층은 50,000개의 정상 세포당 1-2개의 비정상적인 세포 수준으로 소량 함유할 수 있다. 본 발명의 바이오마커의 과다 발현에 의해 동정된 이러한 비정상적인 세포 검출은, 건강한 사람에서 유래한 해당 생체 샘플과의 비교 필요성을 배제한다.
본 발명의 바이오마커 검출 방법은 핵산 또는 단백질 수준 어느 쪽으로 바이오마커의 존재 또는 양을 결정하는 모든 방법을 포함한다. 이러한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 서든 블롯, ELISA, 면역침강, 면형형광, 유세포 측정, 면역세포화학, 핵산 혼성화 기법, 핵산 역전사 방법 및 핵산 증폭 방법이 있다. 특정 예에서, 바이오마커의 과다 발현은 예컨대 특정 바이오마커 단백질에 대한 항체를 이용하여 단백질 수준으로 검출된다. 이러한 항체는 웨스턴 블롯, ELISA, 면역침강 또는 면역세포화학 기법과 같은 다양한 방법으로 사용할 수 있다. 이와 같이, 자궁경부 스미어의 면역 염색은 기존의 Pap 염색 방법과 병용하여, 형태학적 정보와 면역세포화학적 정보를 수득할 수 있다. 이러한 방법으로, 바이오마커의 검출은 Pap 스미어 테스트의 높은 위음성율을 낮출 수 있으며, 집단 자동 스크리닝을 용이하게 할 수 있다.
일 예에서, 바이오마커 단백질에 특이적인 항체는 생체 샘플내 바이오마커 단백질의 과다 발현을 검출하기 위해 이용한다. 상기 방법으로 환자에서 생체 샘플을 수득하는 단계, 상기 생체 샘플을 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 바이오마커에 대한 1종 이상의 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 바이오마커가 환자 샘플에서 과다 발현되는지는 결정하기 위해 항체 결합성을 검사하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면은 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하기 위한 면역세포화학적 기술을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 높은 등급의 자궁경부 질환에 특이적인, 환자 샘플내 바이오마커의 항체 염색을 포함한다. 당업자라면 하기 면역세포화학적 방법을 수동으로 또는 예컨대 Autostainer Universal Staining System (Dako) 또는 Biocare Nemesis Autostainer (Biocare)를 이용한 자동화 양상으로 실시할 수 있음을 인식할 것이다. 자궁경부 샘플의 항체 염색(즉, 면역세포화학)의 한가지 방법은 실시예 1에 기재되어 있다.
바람직한 면역세포화학적 방법에서, 환자의 자궁경부 샘플은 액체 매질중에, 예컨대, SurePathTM 채취 바이얼(TriPath Imaging, Inc.)내로 채집한다. PrepStainTM system(TriPath Imaging, Inc.)과 같은 자동 프로세서를 사용하여, 액체 매질에서 세포를 수집하여, 이후 분석을 위한 글라스 슬라이드상의 얇은 층으로 이들을 배치한다. 슬라이드 검체는 고정 또는 고정하지 않을 수 있으며, 준비 이후에 즉시 분석하거나, 또는 나중 분석을 위해 보관헤 둘 수 있다. 일부 예들에서, 준비한 슬라이드는 최소 24시간동안 95% 에탄올내에서 보관한다. 또는, 다른 예로, 슬라이드는 하기와 같이 전처리 완충액내에서 보관한다.
샘플은 항체 결합 가능한 바이오마커 항원을 준비하기 위해 변형될 수도 있다. 면역세포화학 방법의 일 측면에서, 슬라이드를 전처리 완충액, 예컨대 SureSlideTM Preparation Buffer(TriPath Imaging, Inc.)으로 이동시키고, 선택적으로 항원 접근성을 증가시키기 위해 가온한다. 전처리 완충액중에서 샘플의 가온 처리는 세포의 이중 지질층을 신속하게 파괴하여, 항원(즉, 바이오마커 단백질)이 보다 더 항체 결합에 접근가능하도록 한다. 전처리 완충액은 폴리머, 세제 또는 비이온성 또는 양이온성 계면활성제, 예컨대 에틸옥실화된 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 알카노에이트 또는 알콕실레이트 또는 이들 계면활성제의 혼합 또는 담즙염의 사용을 포함한다. 특정 예에서, 전처리 완충액은 비이온성 또는 음이온성 세제, 예컨대 분자량 약 183 kD과 소듐 알카노에이트와 분자량 약 370 kD의 알콜실레이트의 혼합(이하, RAM)을 포함한다. 특정 예로, 전처리 완충액은 1% RAM을 포함한다. 일부 예에서, 또한, 전처리 완충액은 슬라이드 보관 완충액으로, 전술한 바와 같이 사용할 수 있다. 다른 예로, 0.1 내지 1%의 데옥시콜산 용액, 소듐 염, 모노하이드레이트를 전처리 완충액 뿐만 아니라 보관 완충액으로도 사용하였다. 다른 예로, 소듐 라우레트-13-카르복실레이트(예, Sandopan LS) 용액 또는 및 에톡실화된 음이온성 착화물, 또도는 알킬아릴 에톡실레이트 카르복실산을 보관 및 전처리 완충액으로 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 슬라이드 전처리 완충액은 0.05 내지 5%의 소듐 라우레트-13-카르복실레이트, 특히 0.1 내지 1 %의 소듐 라우레트-13-카르복실레이트, 보다 구체적으로는 0.5%의 소듐 라우레트-13-카르복실레이트를 포함한다. 일 예로, 슬라이드는 전처리 및 염색 공정 이전에 최대 72시간동안 완충액에서 보관할 수 있다. 본 발명의 전처리 완충액은 예컨대 면역세포화학 방법이나 면역조직화학과 같은 면역분석에서의 항체 결합에 항원 접근성을 좋게 하기 위한 방법에 사용할 수 있다. 실시예 14를 참조한다. 용어 "전처리 완충액" 및 "제조 완충액"은 본 발명에서 상호호환적으로 사용되며, 특히 항체 결합을 위한 항원 접근성을 증가시킴으로써 면역 염색용 세포 또는 조직 샘플을 제조하기 위해 사용되는 완충액을 의미한다.
항원을 항체 결합에 보다 접근가능하도록 만들기 위한 모든 방법을 본 발명의 실시에 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 항원 부활 방법(antigen retrieval method)이 있다. 예로, Bibbo et al. (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bibbo et al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8- 11를 참조하며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 일부 예들에서, 항원 부활은 24시간 이상동안 95% 에탄올중에 슬라이드를 보관하는 단계, 상기 슬라이드를 95℃로 미리 열처리한 IX Target Retrieval Solution pH 6.0 (DAKO S1699)/dH2O 수조에 침지하는 단계 및 25분간 슬라이드를 스티머(steamer)안에 두는 단계를 포함한다. 하기 실시예 2를 참조한다.
항원 접근성을 증가시키기 위한 전처리 또는 항원 부활 이후에, 샘플은 적합한 차단제, 예컨대 하이드로겐 페록사이드와 같은 페록시다제 차단제를 이용하여 차단시킨다. 일부 예들에서, 샘플은 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 단백질 차단제를 이용하여 차단한다. 상기 단백질 차단제는, 예컨대 정제된 카세인을 포함할 수 있다. 이후 목적한 바이오마커에 대한 항체, 특히 단일 클론 항체를 샘플과 함께 반응시킨다. 전술한 바와 같이, 당업자라면 환자 샘플내 2가지 이상의 바이오마커를 검출함으로써 일부 경우들에서 높은 등급의 자궁경부 질환을 보다 정확하게 진단할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 특정 예에서, 2가지의 개별 바이오마커에 대한 2가지 이상의 항체를 사용하여 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출한다. 2가지 이상의 항체를 사용하는 경우, 이들 항체는 각각의 항체 시약으로 순차적으로 또는 항체 칵테일로서 동시에 단일 샘플에 첨가할 수 있다. 하기 실시예 3을 참조한다. 대안적으로, 각각의 개별 항체를 동일한 환자의 각각의 샘플에 첨가할 수 있으며, 이후 결과를 종합한다. 특정 예에서, 항체 칵테일은 적어도 3가지 이상의 항체를 포함하며, 이때 2가지 항체는 MCM2에 특이적으로, 나머지 항체는 Topo2A에 특이적으로 결합한다.
항체 결합 검출 기법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 목적한 바이오마커에 대한 항체 결합은 항체 결합 수준, 및 따라서 바이오마커 단백질의 발현 수준에 상응하는 검출가능한 신호를 생성하는 화학 시약의 사용을 통해 검출할 수 있다. 면역세포화학적 방법의 한가지로, 항체 결합은 표지된 폴리머가 접합된 이차 항체를 사용하여 검출한다. 표지된 폴리머의 예로는, 폴리머-효소 접합체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 복합체에서 효소는 전형적으로 항원-항체 결합부위에 발색체의 증착(deposition)을 촉매화하기 위해 사용되며, 그로 인해 목적한 바이오마커의 발현 수준에 상응하는 세포 염색이 이루어진다. 특정한 목적 효소는 서양고추냉이 페록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 및 알카리 포스파타제(AP)가 있다. 상업적인 항체 검출 시스템 예컨대, Dako Envision+ system 및 Biocare Medical's Mach 3 system을 사용하여 본 발명의 실시할 수 있다.
본 발명의 면역세포화학적 방법의 일예로, 바이오마커에 결합하는 항체는 이차 항체에 접합된 HRP-표지 폴리머를 사용하여 검출한다. 또한, 항체 결합은 마우스 단일 클론 항체에 결합하는 마우스 프로브 시약, 및 마우스 프로브 시약에 결합하는 HRP에 접합된 폴리머를 사용하여 검출할 수 있다. 슬라이드는 발색체 3,3-디아미노벤지딘(DAB)를 이용하여 항체 결합을 염색하고, 이후 헤마톡실린과 선택적으로 암모늄 하이드록사이드 또는 TBS/트윈-20과 같은 청색화제(bluing agent)를 이용하여 대비염색한다. 본 발명의 일부 측면에서, 슬라이드는 세포기술자 및/또는 병리학자에 의해 현미경으로 관찰하여, 세포 염색(즉, 바이오마커의 과다 발현)을 분석하고, 높은 등급의 자궁경부 질환의 존재 여부를 결정한다. 대안적으로 샘플은 자동 현미경이나 또는 양성 염색 세포의 동정을 용이하게 하는 컴퓨터 소프트웨어의 보조 구성에 의해 관찰할 수 있다.
용어 "항체" 및 "항체들"은 광의적으로 천연적인 항체 형태 및 단쇄 항체, 키메라 및 인간화 항체와 같은 재조합 항체, 다중-특이적 항체 뿐만 아니라 이들의 단편 및 유도체를 포함하며, 단편 및 유도체는 적어도 한가지 이상의 항원 결합부를 가진다. 항체 유도체는 단백질 또는 항체에 접합된 화학 모이어티를 포함할 수 있다.
"항체들" 및 "면역글로불린(Ig)"은 동일한 구조 특징을 가지는 당단백질이다. 항체는 항원에 대해 특이적인 결합성을 나타내지만, 면역글로불린은 항체와 항원 특이성이 결핍된 그외 항체 유사 분자 모두를 포함한다. 후자 유형의 폴리펩티드는, 예컨대 림프계에 의해 낮은 수준으로, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
용어 "항체"는 광의적인 의미로 사용되며, 충분히 조합된 항체, 항원에 결합하는 항체 단편(예, Fab', F'(ab)2, Fv, 당쇄 항체, diabody) 및 전술한 것을 포함하는 재조합 펩티드를 포괄한다.
용어 "단일 항체"는 본원에서 실질적으로 동종의 항체 집단, 즉 소량 존재할 수 있는 자연적인 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단을 포함하는 개별 항체로 구성된 집단으로부터 수득된 항체를 의미한다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하기로는 항원-결합부 또는 무손상 항체의 다변부를 포함한다. 항체 단편의 예는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; DB(diabody); 선형 항체(Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적인 항체들이 있다. 항체를 파파인으로 분해하면, 각각이 단일 항원-결합부를 가지고 있는 두개의 동일한 항원-결합 단편, "Fab" 단편과, 그 이름에서 35 결정화 능력을 반영하는 "Fc"가 형성된다. 펩신 처리시 두개의 항원-조합 부위를 가지며 항원 교차 연결 가능한 F(ab')2 단편이 형성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인지부 및 결합부를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 2쇄의 Fv 종에서, 이들 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 다변 도메인의 비공유성 조합에 의해 견고하게 이루어진 이량체로 구성되어 있다. 단쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경좨 다변성 도메인은 유연한 펩티드 링커에 의해 공유결합으로 연결되어, 경쇄 및 중쇄가 2쇄 Fv 종과 유사한 "이량성" 구조로 조합될 수 있다. 각 다변성 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여, VH-VL 이량체의 표면에 항원-결합부를 규정한다. 종합적으로, 6개의 CDR은 항체의 항원-결합 특이도를 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위에 대해 친화성은 낮지만, 하나의 다변성 도메인(또는 항쳉 특이적인 단지 3개의 CDR로 구성된 Fv 절반)도 항원을 인지 및 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다.
또한, Fab 단편은 중쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유하고 있다. Fab 단편은 항체 힌지 부위 유래의 한가지 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기 부가에 의해 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 티올 기를 가지는 Fab'를 나타낸다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이의 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 쌍으로 생성된다.
다중 항체는 바이오마커 단백질 면역원으로 적합한 개체(예, 토끼, 염소, 마우스 또는 그외 포유류)를 면역화시켜 제조할 수 있다. 면역화된 개체의 항체 역가는 고정화된 바이오마커 단백질을 이용한 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)와 같은 표준 기법으로 경시적으로 모니터링할 수 있다. 면역화후 적정 시점에, 예컨대 항체 역가가 최고일 때, 항체 생산 세포를 개체에서 수득하여, Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497에 의해 최초 개시된 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), EBV-하이브리도마 기법(Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld and Sell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), pp. 77-96) 또는 트리오마 기법과 같은 표준 기법에 의해 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 하이브리도마 제조 기법은 잘 알려져 있다(Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY); Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Kenneth (1980) inMonoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY); and Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402).
단일 클론 항체-분비성 하이브리도마 제조 방법의 다른 방법으로, 단일 클론 항체는 바이오마커 단백질을 이용하여 재조한 조합 면역글로불린 라이브러리(예, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 검색한 다음, 바이오마커 단백질에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 일원을 분리함으로써, 동정 및 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝 키트를 상업적으로 구입가능하다(예, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; and the Stratagene SurβAPS Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 또한, 항체 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝에 특히 사용가능한 방법 및 시약의 예들은, 예컨대 미국 특허 5,223,409; PCT Publication Nos. WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; and 90/02809; Fuchs et al.(1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734에서 확인할 수 있다.
항체 결합 검출은 항체에 검출가능한 물질을 커플링시킴으로써 용이하게 할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는, 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사능 물질이 있다. 적합한 효소의 예로는 서양고추냉이 페록시다제, 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며, 적합한 보결기의 예로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오티이 있으며; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있으며; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며; 생발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린이 있으며; 적합한 방사능 물질의 에로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 있다.
생체 샘플내 다수의 분자종(예, 바이오마커 단백질)의 양을 정량 측정하기 위한 비디오-현미경 및 소프트웨어 방법에서, 본 발명의 면역세포화학적 방법에 따른 항체 염색 검출은 특정 색상을 가지는 대표적인 염료 마커에 의해 나타낸다. 또한 이러한 방법은 색 분석 방법으로서 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법에서, 목적한 특정 바이오마커의 존재를 가시화하기 위해 염색한 후, 생체 샘플의 이미지를 제공하기 위해, 비디오-현미경을 사용한다. 이러한 방법의 일부는, Marcelpoil 등의 U.S. 특허 출원 09/957,446과 Marcelpoil 등의 미국 특허 출원 10/057,729에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함되며, 상기 문헌에서는 색 염료 마커의 최적 강도 또는 투과값으로 표시된 대표적인 색 염료 마커의 존재성을 토대로 한 각 존재 분자 종의 상대적인 양을 측정하기 위한, 영상화 시스템과 관련 소프트웨어를 개시하고 있다. 이러한 기법들은 그것의 색 구성 파트로 "해체"된 하나의 비디오 영상을 이용하여 염색된 생체 샘플내 각 분자 종의 상대적인 정량 측정을 제공한다.
본 발명의 실시에 사용된 항체는 목적한 바이오마커 단백질에 특이성이 높도록 선택된다. 항체 제조법 및 적정 항체 선별 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예로, Celis, ed. (in press) Cell Biology & Laboratory Handbook, 3rd edition (Academic Press, New York)를 참조하며, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다. 일부 예들에서, 특정 바이오마커 단백질에 대한 상업적인 항체를 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다. 본 발명의 항체는 조직보다는 세포의 적정 염색을 기초로 선택할 수 있다. 즉, 특정 예로, 항체는 최종 샘플 타입(즉, 세포 준비)에 유념하여, 그리고 결합 특이도에 따라 선택한다.
본 발명의 일부 측면에서, 목적한 특정 바이오마커에 대한 항체를 선택하고, 다단계 스크리닝 과정을 통해 정제한다. 특정 예에서, 폴리도마를 스트리닝하여 원하는 특이도 및 민감도를 가진 바이오마커-특이 항체를 동정한다. 본 발명에서, "폴리도마"는 다수개의 하이브리도마를 의미한다. 본 발명의 폴리도마는 전형적으로 멀티웰 조직 배양 플레이트내에 제공된다. 항체 스크리닝의 첫 단계로, 다수개의 정상(즉, CIN 아님), CINIII, 편평 세포 암종 및 선암종 샘플을 포함하는 종양 조직 마이크로어레이를 준비한다. Chemicon® Advanced Tissue Arrayer과 같은 단일 슬라이드상의 멀티 조직 어레이 형성 방법 및 장비는 당업계에 공지되어 있다. 예로, 미국 특허 4,820,504를 참조한다. 폴리도마를 함유하고 있는 각 웰로부터 희석하지 않은 상층액을 취하여, 표준 면역조직화학적 기법을 이용한 양성 염색으로 분석한다. 스크리닝 첫 단계에서, 백그라운드, 비특이적 결합을 필히 무시된다. 양성 결과를 보이는 폴리도마를 선별하고, 항체 스크리닝 2번째 단계에서 사용한다.
제2 스크리닝 단계에서, 양성 결과를 보인 폴리도마로 한정 희석 공정을 수행한다. 표준 면역조직화학적 기법을 이용하여 CINIII 또는 자궁경부암종 샘플의 양성 염색을 위해, 수득한 미스크리닝 항체를 분석하였다. 이 단계에서, 백그라운드 염색이 관련되며, 단지 비정상 세포(즉, CINIII 및 암 세포)에 대해서만 양성으로 염색되는 폴리도마 후보를 이후 분석을 위해 선택하였다.
정상과 CINI 샘플을 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 샘플(즉, CINIII 및 상기)로부터 구별할 수 있는 항체를 동정하기 위해, 질병 패널 조직 마이크로어레이를 제조한다. 이 조직 마이크로어레이는 전형적으로 다중의 CIN가 아닌, CINI, CINII, CINIII, 편평 세포 암종 및 선암종 샘플을 포함한다. 표준 면역조직화학적 기법을 사용하여 단지 높은 등급의 자궁경부 질환인 샘플(즉, CINIII 및 상기한 바)의 특이적인 양성 염색에 대해 폴리도마 후보들을 분석한다. 양성 결과 및 백그라운드 최소 염색을 보이는 폴리도마는 이후 분석을 위해 선별한다.
양성 염색 배양물은 각각의 단클론 항체 후보를 선별하기 위해 각각의 클론으로 준비한다. 각각의 클론을 분리하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 정제되지 않은 항체를 포함하는 각 클론의 상층액은, 전술한 종양 및 질병 패널 조직 마이크로어레이를 이용하여 CINII, CINIII, 편평 세포 암종 및 선암종 샘플의 특이적인 염색으로 분석한다. 높은 등급의 자궁경부 질환 샘플(즉, CINIII 및 상기한 바)에 대한 양성 염색, 그외 세포 타입(즉, 정상 및 CINI 샘플들)에 대해선 최소한의 염색을 보이며 백그라운드가 거의 없는 항체 후보를 선택하여, 정제 및 분석한다. 친화성 흡착 크로마토그래피를 통한 항체 정제 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
경구 세포 샘플에서 높은 등급의 자궁경부 질환 샘플의 최대 특이적인 염색 및 최소 백그라운드, 즉 최소 비특이적 염색을 보이는 항체를 동정하기 위해, 전술한 면역조직화학을 이용한 스크리닝 방법으로 분리 및 정제한 항체 후보를, 본 발명의 면역세포화학적 기법으로 분석한다. 면역세포화학을 수행하기 위한 프로토콜의 예는 실시예 1 및 2에 기재되어 있다.
명확하게는, 목적한 정제된 항체를 사용하여 NIL(즉, 비침투성 병변), ASCUS, LSIL, HSIL 또는 암성 경부 세포 환자 샘플의 통계학적으로 유의한 수치를 분석하였다. 샘플은 본원에 기재된 바에 따라 면역세포화학으로 분석하고, 특정 바이오마커에 대한 양성인 항체 염색을 토대로, 높은 등급의 자궁경부 질환에 대한 양성, 음성 또는 불확정으로 분류한다. 민감도, 특이도, 양성 예측치 및 음성 예측치를 각 항체에 대해 계산한다. 자궁경부 세포 샘플에서 높은 등급의 자궁경부 질환에 대한 최대 특이적 염색을 보이고, 백그라운드가 최소인(즉, 신호 대 노이즈 비율이 최대) 항체를 본 발명에서 선택한다.
적정 항체 동정은 신호대 노이즈 비율을 증가시키고, 분석의 임상의 유용성을 증가시킨다. 사용되는 분석 형식 및 샘플 타입은 적정 항체 선별에 중요한 인자이다. 바이오마커에 대한 많은 항체들은 세포 준비물을 이용한 면역세포화학적 포맷이나 포르말린-고정화된 파라핀 포매 샘플을 이용한 면역조직화학적 포맷에서 적정한 신호대 노이즈 비를 형성한다. 또한, 면역조직화학적 포맷에서 신호대 노이즈 비를 최대로 형성하는 바이오마커 항체는, 면역세포화학적 분석에서는 잘 작동하지 않을 수 있다. 예컨대, 면역세포화학적 포맷에서 적정 염색 수준을 형성하는 항체는, 면역조직화학적 분석에서 적정 염색 수준을 형성시키지 않을 수 있다(데이타 미첨부). 이처럼, 면역조직화학적 분석에서 허용가능한 수준의 신호 대 노이즈 비를 형성하는 항체는, 면역세포화학적 샘플의 과다 염색을 발생시킬 수 있다(데이타 미첨부). 따라서, 항체 선택시에는 사용되는 최종 샘플 타입과 분석 포맷을 우선 고려하여야 한다.
조직 구조가 면역세포화학적 포맷에서 염색을 판단하는데 보조 인자로 이용가능하지 않는 한, 세포를 근간으로 하는 분석(즉, 면역세포화학)은 조직을 근간으로 하는 분석(즉, 면역조직화학)과 다르다. 예컨대, 경증의 이형성 또는 편평 세포 암종을 가진 환자의 샘플에 대해 클라우딘(Claudin) 1 항체를 이용하여 수행한 면역조직화학적 분석에서, 클라우딘 1은 경증의 이형성 샘플의 병변에서는 발현되지만(즉, 연갈색 염색), 암 병변에서는 현저하게 과다 발현되는 것으로(즉, 짙은 갈색빛 염색) 확인된다(도 12). 동일한 클로우딘 1 항체를 이용하여 수득한 면역세포화학 분석 포맷 결과는 모호하였다(도 13). 비정상 세포는 클라우딘 1 항체를 이용하여 면역조직화학적 분석에서 쉽게 검출가능하였지만, 면역세포화학적 분석에서의 클라우딘 1 염색 결과는 해석하기 보다 어려웠다. 따라서, 면역조직화학적 포맷에 적합한 바이오마커는 면역세포화학적 분석에서는 적합하지 않을 수 있으며, 이로 인해 본 발명의 바람직한 예로는 포함되지 않는다.
더욱이, 세포내 바이오마커의 위치 역시 면역세포화학적 분석에서 중요하게 고려된다. 핵, 세포질 또는 막 염색 패턴을 나타내는 바이오마커는 형태적으로 확인할 수 있으며, 면역조직화학적 방법에 적합하다. 세포질 및 막 염색은 그러나 면역세포화학적 분석으로 자궁경부 질환의 중요한 형태학적 특징들(예, 핵대 세포질 비율)을 파악하기 어렵게 한다. 도 15를 참조한다. 대조적으로, 핵에서 발현되며 핵 염색 패턴을 보이는 바이오마커는 항체 염색 검출을 용이하게 하며, 또한 형태 분석을 가능하게 한다. 도 15를 참조한다. 따라서, 일부 바람직한 예들에서, 핵에서 선택적으로 발현되는 바이오마커만을 본 발명의 면역세포화학적 분석에 사용한다.
당업자는 항체 역가 최적화 및 검출 화학적 방법이 특정 항체의 신호 대 노이즈 비율을 최대화하기 위해 필요하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 바이오마커에 대한 특이적인 결합성을 최대화시키고, 비특이 결합성(또는 "백그라운드")를 최소화하는 항체 농도를 결정할 것이다. 특정 예로, 자궁경부 세포 준비물에 사용하기 위한 적정 항체 역가는, 우선 포르말린에 고정시킨 파라핀 포매 정상 및 높은 등급의 자궁경부 질환의 조직 샘플에 다양한 항체 희석물들을 테스트함으로써 결정한다. 항체의 최적 농도 및 검출 화학 조건은, 먼저 포르말린에 고정시킨 파라핀 포매 자궁경부 조직 샘플에 대해 결정한다. 항체 역가 및 검출 조건을 최적화하기 위한 분석 설계는, 당업자의 일반적인 능력 범위내에서 표준적이며 자명하다. 고정시킨 조직 샘플에 대한 최적 조건을 결정한 후, 각 항체를 동일한 조건하에서 자궁경부 조직 준비물에 사용한다. 일부 항체는 백그라운드 염색을 감소시키고 및/또는 세포 샘플에서 염색 특이도 및 민감도를 향상시키기 위한 추가적인 최적화를 필요로 한다.
또한, 당업자라면 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용된 특정 항체의 농도를 결합 시간, 바이오마커 단백질에 대한 항체 특이성 정도 및 생체 샘플 준비 방법과 같은 인자에 의존적으로 변경된다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 다수의 항체를 사용하는 경우, 필수 농도는 샘플에 항체를 적용하는 순서, 즉 칵테일로 동시에 또는 개별 항체 시약으로서 순차적으로 사용하는 것에 따라 영향을 받는다. 또한, 목적한 바이오마커에 결합하는 항체를 가시화하기 위해 사용한 검출 화학 방법, 역시 원하는 신호대 노이즈 비율을 형성하도록 최적화되어야 한다.
다른 예로, 목적한 바이오마커의 발현은 핵산 수준으로 검출한다. 발현을 평가하기 위한 핵산을 기본으로한 기법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예컨대 생체 샘플내 바이오마커 mRNA의 수준을 결정하는 방법을 포함한다. 다수의 발현 검출 방법은 분리된 RNA를 이용한다. mRNA의 분리시 채택되지 않은 임의의 RNA 분리 기법은 자궁경부 세포로부터 RNA의 정제를 위해 활용할 수 있다(예, Ausubel et al, ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York)). 또한, 조직 샘플 다량을 Chomczynski(1989, 미국 특허 4,843,155)의 일단계 RNA 분리 공정과 같은 당업계에 공지된 기법으로 쉽게 처리할 수 있다.
용어 "프로브"는 특이적으로 의도된 표적 바이오분자, 예컨대 핵산 전사체 또는 바이오마커에 의해 또는 해당되는 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 프로브는 당업자가 합성하거나 또는 적절한 생물학적 조제물로부터 유래될 수 있다. 프로브는 표지되도록 특이적으로 설계될 수 있다. 프로브로서 활용될 수 있는 분자의 예로는, RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
분리된 mRNA는 비제한적으로 서든 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응 분석 및 프로브 어레이를 포함한 혼성화 또는 증폭 분석법에 이용할 수 있다. mRNA 수준 검출의 한가지 방법은, 검출중인 유전자에 의해 코딩된 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자(프로브)와 분리한 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함한다. 예컨대, 핵산 프로브는 전장 cDNA 또는 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개 이상의 뉴클레오티드 길이를 가지는 올리고뉴클레오티드와 같은 그의 일부분일 수 있으며, 엄격 조건하에서 mRNA 또는 본 발명의 바이오마커를 코딩하는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 것일 수 있다. 프로브와 mRNA의 혼성화는 문제의 바이오마커가 발현되고 있음을 의미한다.
일 예에서, mRNA를 고체 표면에 고정하고, 예컨대 분리된 mRNA를 아가로스젤상에서 전개시킨 후 이를 젤에서 니트로셀룰로스와 같은 멤브레인으로 이동시킴으로써, 프로브와 접촉시킨다. 대안적인 예로, 프로브(들)을 고체 표면에 고정시키고, mRNA를, 예컨대 Affymetric 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)과 접촉시킨다. 당업자는 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩된 mRNA 수준을 검출하는데 유용한 mRNA 검출 방법을 쉽게 적용시킬 수 있다.
샘플내 바이오마커 mRNA의 수준을 결정하기 위한 다른 방법에는 핵산 증폭 공정, 예컨대 RT-PCR(the experimental embodiment set forth in Mullis, 1987, 미국 특허 4,683,202), 리가제 연쇄 반응(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. ScI USA 88:189-193), 자기 지속성 서열 복제(self sustained sequence replication)(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. ScI USA 87:1874- 1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86:1173-1177), Q-베타 리플리카제(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제(Lizardi et al., 미국 특허 5,854,033), 및 그외 다른 핵산 증폭 방법과, 이후 당업자에게 공지된 기법을 이용한 증폭된 분자 검출이 관여한다. 이러한 검출 방법은 이러한 분자가 매우 소수로 존재하는 경우에 핵산 분자를 검출하는데 매우 유용하다. 본 발명의 특정 예에서, 바이오마커 발현은 정량적 플루오로제닉 RT-PCR(즉, TaqMan® 시스템)으로 평가한다. 이러한 방법들은 전형적으로 목적한 바이오마커에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 이용한다. 공지된 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 제작 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
바이오마커의 RNA 발현 수준은 멤브레인 블롯(예컨대 노던, 서든, 돗(dot) 같은 혼성화 분석에서 사용되는 바와 같이), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 젤, 비드 또는 파이버(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 이용하여 모니터링할 수 있다. 미국 특허 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 및 5,445,934를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 또한, 바이오마커 발현 검출은 용액준에서 핵산 프로브를 이용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일예에서, 마이크로어레이를 바이오마커 발현 검출에 사용한다. 마이크로어레이는 여러가지 실험들간의 재현성으로 인해 본 목적에 특히 매우 적합하다. DNA 마이크로어레이는 다수 유전자의 발현 수준의 동시 측정 방법을 제공한다. 각 어레이는 고체 지지체에 접촉된 포획 프로브의 재현가능한 패턴으로 구성된다. 표지된 RNA 또는 DNA를 어레이상에서 상보적인 프로브와 혼성화시키고, 이후 레이저 스캐닝에 의해 검출한다. 어레이상의 각 프로브에 대한 혼성화 세기를 측정하고, 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 정량적인 수치로 바꾼다. 미국 특허 6,040,138, 5,800,992 6,020,135, 6,033,860, 및 6,344,316를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 고밀도의 올리고뉴클레오티드 어레이가 특히 샘플내 다수의 RNA에 대한 유전자 발현 프로파일을 측정하는데 유용하다.
기계적 합성 방법을 이용한 이러한 어레이 합성 기법은 예컨대, 미국 특허 5,384,261에 개시되어 있으며, 그 모든 목적으로 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 평면 어레이 표면이 바람직하지만, 어레이는 실제 모든 형태의 표면이나 또는 다중적인 표면상에 제조할 수 있다. 어레이는 비드, 젤, 폴리머성 표면, 파이버, 예컨대 광섬유, 유리 섬유 또는 그외 접합한 기질상의 펩티드 또는 핵산일 수 있다. 미국 특허 5,770,358, 5,789,162, 5,708,153, 6,040,193 및 5,800,992를 참조하며, 이들은 그 모든 목적으로 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 어레이는 모든 포함 장치의 진단 또는 그외 조작을 허용하도록 그러한 방식으로 패키지될 수 있다. 예로, 미국 특허 5,856,174 및 5,922,591를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
한가지 접근 방법으로, 샘플에서 분리한 총 mRNA를 표지된 cRNA로 변환한 다음 올리고뉴클레오티드 어레이에 혼성화시킨다. 각 샘플은 분리된 어레이에 혼성화된다. 상대적인 전사 수준을 어레이 및 샘플에 존재하는 적정 대조군을 참조하여 계산할 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 추가적으로 제공한다. "키트"는 본 발명의 바이오마커를 특이적으로 검출하기 위한 한가지 이상의 시약, 예컨대 항체, 핵산 프로브 등을 포함하는 임의의 제조물(예, 패키지 또는 용기)로 의도된다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유니트(unit)로서 조성하거나, 분배하거나 또는 판매할 수 있다. 부가적으로, 키트는 키트와 그의 사용 방법이 설명된 패키지 삽입물을 포함할 수 있다.
특정 예로, 본 발명의 면역세포화학적 방법을 수행하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 키트는 실시예 1에 개시된 바와 같이, 수동 및 자동 면역세포화학적 기법(예, 세포 염색)과 혼화가능하다. 이러한 키트는 목적한 바이오마커에 대한 한가지 이상의 항체, 바이오마커에 대한 항체 결합성을 검출하기 위한 화합물, 대조염색제 및 선택적으로 양성 염색 세포의 동정을 용이하게 하기 위한 청색화제(bluing agent)를 포함한다. 항원-항체 결합성을 검출하는 모든 화합물을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 일부 예들에서, 검출 화합물은 이차 항체에 접합된 표지된 폴리머를 포함한다. 예컨대, 항원-항체 결합부에 발색체 증착(deposition)을 촉매화하는 효소에 접합된 이차 항체를 제공할 수 있다. 이러한 효소 및 항체 결합 검출에서의 이들의 사용 기법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일 예로, 키트는 HRP 표지 폴리머에 접합된 이차 항체를 포함한다. 접합된 효소와 양립가능한 발색체(예, HRP 표지 이차 항체의 경우 DAB) 및 하이드로겐 페록사이드와 같은 비특이적 염색 차단용 용액을 추가적으로 제공할 수 있다. 다른 예로, 바이오마커 단백질에 대한 항체 결합은 마우스 단일클론 항체에 결합하는 마우스 프로브 시약을 이용한 다음, 마우스 프로브 시약에 결합하는 HRP가 접합된 덱스트란 폴리머를 첨가하여, 검출한다. 이러한 검출 시약은 예컨대 Biocare Medical로부터 상업적으로 구입가능하다.
본 발명의 키트는 페록시다제 차단제(예, 과산화수소), 단백질 차단제(예, 정제한 카세인) 및 대조염색제(예, 헤마톡실린)을 더 포함할 수 있다. 청색화제(예, 암모늄 하이드록사이드 또는 트윈-20 및 소듐 아지드가 첨가된 TBS, pH 7.4)를 키트에 더 제공하여 양성 염색 세포의 검출을 용이하게 할 수 있다.
다른 예로, 본 발명의 면역세포화학 키트는 적어도 2가지 이상의 개별 바이오마커의 발현을 특이적으로 검출하기 위한 2가지 이상의 시약, 예컨대 항체를 추가적으로 포함한다. 각 항체는 개별 시약으로써 또는 목적한 상이한 바이오마커에 대한 모든 항체를 포함한 항체 칵테일로서 키트에 제공될 수 있다. 또한, 키트의 모든 또는 임의 시약은 외부 환경으로부터 이를 보호하기 위한 용기내로, 예컨대 밀봉된 용기 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트의 예는 하기 실시에 8에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 채택된 시약의 정확한 사용과 활성을 검증하기 위해, 키트내에 양성 및/또는 음성 대조군이 함유될 수 있다. 대조군은 목적한 바이오마커가 있거나 없는 것으로 알려진 조직 단편, 글라스 슬라이드에 고정된 세포 등과 같은 샘플을 포함할 수 있다. 특정 예로, 양성 대조군은 SiHa 세포를 포함한다. 이는 다형배수체(hypertriploid)이고 HPV 16 감염에 양성인 인간 자궁경부 편평 암 세포주이므로, 따라서, 높은 등급의 자궁경부 질환 상태에서의 바이오마커 과다 발현의 양성 대조군으로 제공된다. SiHa 대조군 세포는 본 발명의 키트내에 제조된 슬라이드 또는 슬라이드 조제물과 혼용가능한 세포 현탁액으로서 제공될 수 있다. 대조군의 제작 및 사용은 당업자의 일반적인 능력내에서 표준적이며 자명하다.
다른 예로, 핵산 수준으로 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 것을 포함하는 높은 등급의 자궁경부 질환 동정용 키트를 추가적으로 제공한다. 상기 키트는, 예컨대, 바이오마커 핵산 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 핵산 프로브를 포함한다. 특정 예로, 키트는 개별 바이오마커 핵산과 혼성화하는 2종 이상의 핵산 프로브를 포함한다.
일부 예로, 본 발명의 방법은 형태적인 특징을 분석하는 기존의 세포 기법을 함께 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 면역세포화학적 기법은 기존 방법으로 수득한 모든 형태학적 정보를 유지하기 위해 기존 Pap 염색법과 조합할 수 있다. 이러한 방식으로 바이오마커를 검출하여 Pap 스미어의 높은 위음성율을 낮출 수 있으며, 집단 자동 스크리닝을 용이하게 할 수 있다. 특정 예로, 본 발명에 기재된 면역세포화학적 방법은 하기 실시예 6-7에 기재된 바와 같이 단일 방법으로 기존 Pap 염색과 조합된다. 면역세포화학 및 Pap 염색의 조합 방법은 단일 샘플(예, 자궁경부 세포 단일층을 포함하는 현미경 슬라이드)내 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현된 바이오마커와 세포 형태를 가시화한다. 면역세포화학 및 Pap 염색의 조합 방법은 기존의 Pap 테스트 방법에 의해 정상, LSIL 또는 ASCUS로 잘못 분류된 경우에 대해 특히 높은 등급의 자궁경부 질환을 보다 더 정확하게 동정 및 진단한다. 단일 방법으로 바이오마커 과다 발현 및 세포 형태를 분석하는 방법은 자궁경부 질환의 초기 스크리닝 방법으로서 Pap 스미어 방법을 대체할 수 있다.
당업자는 이러한 조합 방법에서의 염색 파라미터(예, 배양 시간, 세정 조건, 발색체/염색 농도 등)은 면역세포화학적 결과(예, 발색체 염색) 및 Pap 염색간의 충분한 대조가 수득되도록 최적화할 필요가 있음을 인식할 것이다. 염색 파라미터를 최적화하기 위한 분석 설계는 당업자의 일반적인 능력내에서는 표준적이며, 자명한 바이다. 면역세포화학 및 Pap 염색의 조합 방법을 수행하기 위한 키트는 또한 본 발명에 포함된다. 키트는 전술한 바와 같이, 면역세포화학에 필요한 시약과 기존의 Pap 염색용 시약, 특히 EA50 및 오렌지 G를 포함한다.
당업자는 또한 본 발명의 방법에서 임의의 또는 모든 단계들은 개별적으로 실시되거나 또는 대안적으로는 자동화 양상으로 수행될 수 있다. 따라서, 생체 샘플 준비, 샘플 염색 및 바이오마커 발현 검출 단계를 자동화할 수 있다.
도 1은 자궁경부 이형성에서의 증식 및 세포 주기 탈규제를 종합적으로 도시한 것이다. 자궁경부 이형성에서의 세포 주기 변이 및 증식 조절 결함. HPV 감염과 E6 및 E7 발암단백질의 과다 발현은 세포 주기 및 증식 조절에 일련의 변이를 초래한다. HPV E6 발암 단백질은 Gl/S 와 G2/M의 경계에서 세포 주기 체크 포인트를 파괴하고, 이후 DNA 복제에 염색체 돌연변이를 동반시킨다. E7은 S 단계로의 진행을 가속화하며, DNA 복제에 필요한 S 단계 유전자의 발현을 연장시킨다(비정상적인 S 단계 유발). 이처럼, E6도 증식 및 세포 불멸화 과정중에 연속된 염색체 텔로미어 보전을 부여하는 텔로머라제 발현을 촉진시킨다. 마지막으로, E7은 TGF-베타 시그널링 경로를 파괴하여, G1 정지 조절 메카니즘과 증식 조절을 파기한다.
도 2는 자궁경부 이형성에서 비정상적인 S 단계 유발을 나타내는 도식도이다. 세포 주기 조절과 증식에서의 HPV 단백질의 작용은 p53과 Rb 종양 억제 경로의 비활성화, E2F-1 전사 활성화, S 단계 유전자 MCM-2, MCM-6, MCM-7, TOP2A 및 사이클린 El 등의 유발을 포함한다. 또한, E2는 Sp-1 전사 인자와 상호작용하여 p2l-waf-1의 유전자 발현을 활성화한다.
도 3은 세포 주기의 비정상적인 S 단계에서 세포 증식의 피드백 루프를 나타낸 것이다. S 단계에서 사이클린 E와 CDK2 과다 발현은 독립적인 메카니즘을 발생시켜, S 단계 유전자의 유도를 허용한다.
도 4는 비정상적인 S 단계 유발에서 c-myc 의 작용을 나타낸 것이다. c-myc는 세포 증식에 중요한 전사 활성자이다. c-myc를 코딩하는 유전자는 염색체상에 위치한다. HPV 18이 삽입되는 것으로 보고된 부위와 이 유전자의 해당 증복 부위는 동일한 부위이다. c-myc 유전자의 증폭은 코딩된 단백질의 과다 발현을 발생시키며, c-myc의 증가는 독립적으로 S 단계 유전자의 전사에 작용할 것이며, 이후 세포 증식을 가속화할 것이다.
도 5는 MCM7 전사체 변이형에 대한 TaqMan® 프라이머를 나타낸다.
도 6은 경증의 이형성 환자 및 편평세포 암종 환자에 대한 IHC 분석에서 클라우딘 1에 대한 항체의 상이한 염색 패턴을 나타낸다.
도 7은 IHC 및 ICC 포맷에서 클라우딘 1에 대한 항체의 상이한 염색 패턴을 나타낸다. 정상 세포와 CINIII 및 HSIL의 세포를 나타낸다.
도 8은 핵의 바이오마커(즉, MCM2)를 이용한 핵 염색 패턴과 세포 바이오마커(p16)을 이용한 세포의 염색 패턴을 나타낸다. 높은 등급의 자궁경부 질환 환자의 샘플에 대한 면역조직 화학 분석 결과이다.
도 9는 높은 등급의 자궁경부 질환 환자의 자궁경부 조직에 대한 두가지 MCM6 항체를 이용한 면역세포화학 분석시 바람직한 및 바람직하지 않은 항체 염색을 나타낸 것이다.
다음 실시예는 예시의 목적으로 제공된 것일 뿐 한정의 목적은 아니다.
실시예
1: 면역세포화학을 이용한
바이오마커
과다 발현 검출
슬라이드 준비 및 전처리
환자 자궁경부 샘플을 채취하여 SurePath™ 콜렉션 바이얼(TriPath Imaging, Inc.)에 두었다. 자궁경부 세포를 액체 배지에서 수득하여 PrepStain™ 슬라이드 프로세서 시스템(TriPath Imaging, Inc.)을 이용하여 글라스 슬라이드상에 박막으로 두었다. 제조한 슬라이드를 즉시 전처리 완충액(1% RAM)으로 옮겨 95 ℃에서 35분간 열처리하였다. 이 슬라이드를 실온으로 감온시킨 다음 TBS(tris buffered saline)로 3회(1회당 2분) 세정하였다.
수동 면역세포화학
비특이적 백그라운드 염색을 방지하기 위해, 슬라이드는 염색 과정중에 건조되지 않게 하였다. 또한, 비특이적 염색을 차단하기 위해, 과산화수소를 5분간 슬라이드에 가한 후, TBS로 세정하였다. MCM6 항체를 실온에서 1시간동안 슬라이드에 적용하였다. MCM6 항체로 배양한 다음, 슬라이드는 매회 2분간 TBS로 3번 세정하였다. 이 슬라이드에 Dako Envision + HRP 표지된 폴리머 이차 항체를 실온에서 30분간 적용한 다음 THS로 세정하였다. 슬라이드에 HRP 기질 발색체 DAB를 10분간 적용한 다음, 물로 5분간 세정하였다. 각 슬라이드는 헤마톡실린으로 대조염색한 다음, 선명해질때까지 물로 세정하였다. 대조 염색후, 슬라이드는 10초간 암모늄 하이드록사이드에 담근 다음 1분간 물로 세정하였다.
샘플을 1분간 95% 에탄올에 침지시킨 다음 수분간 무수 에탄올에 침지하여, 탈수하였다. 슬라이드를 회당 1분씩 크실렌으로 3회 세정하여 선명하게 하였다. 이후, 슬라이드를 불변의 고정 매질(permanent mounting media)을 이용하여 커버슬립하고 35 ℃에 두어 건조시켰다. 양성 염색 세포는 명시 현미경을 이용하여 가시화하였다.
자동 면역세포화학
Dako 자동염색기 유니버셜 염색 시스템을 제조사의 설명서에 따라 프로그래밍하고, 수동 면역세포화학용 전술한 필수 염색 및 대조 염색 시약을 상기 기계에 적재하였다. 준비되고 전처리한 슬라이드를 자동염색기에 적재하고, 프로그램을 운영하였다. 프로그램 종료 시점에 슬라이드를 제거하고 5분간 물로 세정하였다. 슬라이드는 전술한 바와 같이, 탈수하고, 선명화하고, 커버슬립하고 및 분석하였다.
실시예
2: 임상 샘플에서
바이오마커
검출
다양하게 진단된 약 180개의 환자 자궁경부 세포 샘플을 수집하였다. 이들 환자에서 높은 등급 질환을 나타내는 암종 세포 또는 병변의 존재 또는 부재를 질경 검사로 미리 확인하였다. 하기 표는 본 실험에서 분석한 각 진단 그룹의 샘플 수와 질경 검사 결과(예, 높은 등급 병변의 존재 또는 부재)를 나타낸다.
표 1: 분석한 검체
| 진단 | 수 | 결과 |
| NIL | 72 | HPV 음성 |
| ASC-US | 26 | 병변 없음: 26 병변 또는 위험성이 높은 HPV 있음: 0 |
| LSIL | 48 | 높은 등급의 병변 없음: 42 높은 등급의 병변 있음 :6 |
| HSIL | 25 | |
| 암 | 10 | 편평세포 암종 및 선암종 |
샘플은 면역세포화학적 방법으로 분석하여 높은 등급의 자궁경부 질환을 동정하였다. 항체를 사용하여 6가지의 목적한 바이오마커의 과다 발현을 검출하였다: MCM2, MCM6, MCM 7, ρ21wafl, 사이클린 E 및 Topo2A. MCM2, MCM6, MCM 7, ρ21wafl, 사이클린 E, Topo2A 및 마우스 음성을 포함한 분석 대조군은 SiHa 세포주상에 전개한다. 또한, 샘플은 기존의 Pap 염색 기법으로 분석하였다.
슬라이드 준비
각 샘플을 보관상태에서 꺼내어 실온으로 조절하였다. 6 ml의 TriPath CytoRich® 보존제를 각 바이얼에 첨가하고, 바이얼을 볼텍스하였다. 샘플을 TriPath PrepMate® 자동 프로세서상에서 처리하고, 바이얼내 잔류 유액 모두를 원심분리관으로 옮겼다. 샘플은 200 xg에서 2분간 원심분리하였고, 상층액을 흡입하였다. 이후 샘플을 800 xg로 10분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 샘플 튜브를 TriPath PrepStain® 시스템에 장착하고, 시스템 소프트웨어(version 1.1; Transfer Only)를 작동시켰다. 각 환자 샘플에 대해 8개의 슬라이드를 준비하고, Pap 염색 및 면역세포화학적 방법에 이용하기 적어도 2주 전에 24시간 이상 95% 에탄올중에 보관하였다.
Pap 염색 방법
준비한 슬라이드를 30초간 95% 에탄올에 둔 다음 30초간 물로 헹구었다. 헤마톡실린을 상기 슬라이드에 6분간 적용하였다. 슬라이드는 1분간 물로 헹구고, 2초간 산성수로, 그리고 30초간 물로 헹구었다. 청색화제(암모늄 하이드록사이드)를 30초간 적용하고, 슬라이드는 먼저 물로 헹군 다음 30초간 95% 에탄올로 헹구었다. 6분간 EA 50과 오렌지 G(Autocyte®)를 적용하였다. 슬라이드는 95% 에탄올로 2회, 100% 에탄올로 3회 및 크실렌으로 3회로 1회당 30초간 헹구었다.
이후 슬라이드는 아크리톨 고정 매질(Acrytol mounting media)을 이용하여 커버슬립하고 35 ℃에 두어 건조시켰다. 병리학자가 명시 현미경으로 샘플을 검경하였다.
면역세포화학적 방법
준비한 슬라이드를 95% 에탄올에서 꺼내어 약 1분간 탈이온수로 헹구었다. 슬라이드는 95 ℃로 전처리한 IX 표적 부활 용액(Target Retrieval Solution) pH 6.0 (DAKO S1699)/dH2O 수조내에 넣어 25분간 스티머내에 두었다. 샘플을 실온에서 20분간 감온시킨다음, 탈이온수로 잘 헹구고, TBS중에 위치시켰다. 전처리한 슬라이드를 상기 실시예 1, "자동 면역조직화학"에 개시한 바와 같이, 필수적으로 바이오마커 발현에 대해 염색하였다. 상업적인 MCM2 항체(1:200), MCM7 항체(1:25), p21wafl 항체(1:100) 및 사이클린 E 항체(1:100)를 희석하여 바이오마커 발현 검출에 사용하였다. 하기 실시예 4에 개시한 바와 같이 폴리도마 스크리닝에 의해 동정한 정제된 MCM6 항체를 1:6000 희석으로 사용하였다.
슬라이드 분석
각 슬라이드를 세포기술자 및 병리학자들에 의해 스크리닝 및 검출하였다. 샘플은 하기 파라미터에 따라 높은 등급의 자궁경부 질환에 대해 양성, 음성 또는 불확정으로 분류하였다:
- 비세포성 인공물 및 염증 세포의 갈색 염색(DAB)는 무시하였다.
- 성숙한 정상으로 보이는 편평 세포 및 정상으로 보이는 선세포는 DAB로 염색시 양성으로 계산하지 않았다
- 비정상 세포와 편평 화생성 세포(metaplastic cell)는 양성으로 간주하였 다
- 1.5 미만의 염색 강도는 음성으로 간주하였다
- 모순되는 결과는 슬라이드 공동 검토로 해결하였다.
면역세포화학적 결과는 질경검사로 미리 수득한 결과와 비교하였다. 이후 각 슬라이드는 최종 진양성(TP), 진음성(TN), 위양성(FP), 위음성(FN) 또는 불확정으로 최종 결과를 매겼다. 각 바이오마커에 대한 민감도, 특이도, 양성 예측치 및 음성 예측치를 계산하였다.
결과
각 바이오마커에 대한 결과는 하기로 종합한다.
표 2:
MCM2
| NIL ASC-US(병변 없음) ASC-US(병변) LSIL(HSIL 없음) LSIL(HSIL) HSIL 암 | TP FP FN TN 불확정 총 | |||||
| 0 | 0 | 0 | 71 | 1 | 72 26 0 42 6 25 10 | |
| 0 | 0 | 0 | 25 | 1 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 0 | 7 | 0 | 3 | 4 | ||
| 3 | 0 | 3 | 0 | |||
| 24 | 0 | 1 | 0 | 0 | ||
| 7 | 0 | 1 | 0 | 0 | ||
| 34 7 5 127 8 181 | ||||||
민감도 0.8718
특이도 0.9478
PPV 0.8293
NPV 0.9621
표 3:
MCM6
| NIL ASC-US(병변 없음) ASC-US(병변) LSIL(HSIL 없음) LSIL(HSIL) HSIL 암 | TP FP FN TN 불확정 총 | |||||
| 0 | 0 | 0 | 68 | 4 | 72 26 0 42 6 25 10 | |
| 0 | 3 | 0 | 22 | 1 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 0 | 14 | 0 | 24 | 4 | ||
| 3 | 0 | 2 | 0 | 1 | ||
| 22 | 0 | 0 | 0 | 3 | ||
| 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 35 17 2 114 13 181 | ||||||
민감도 0.9459
특이도 0.8702
PPV 0.6731
NPV 0.9828
표 4:
MCM7
| NIL ASC-US(병변 없음) ASC-US(병변) LSIL(HSIL 없음) LSIL(HSIL) HSIL 암 | TP FP FN TN 불확정 총 | |||||
| 0 | 0 | 0 | 67 | 5 | 72 26 0 42 6 25 10 | |
| 0 | 2 | 0 | 21 | 33 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 0 | 12 | 0 | 28 | 2 | ||
| 4 | 0 | 2 | 0 | 0 | ||
| 24 | 0 | 1 | 0 | 0 | ||
| 9 | 0 | 0 | 0 | 1 | ||
| 37 14 3 116 11 181 | ||||||
민감도 0.9250
특이도 0.8923
PPV 0.7255
NPV 0.9748
표 5:
사이클린
E
| NIL ASC-US(병변 없음) ASC-US(병변) LSIL(HSIL 없음) LSIL(HSIL) HSIL 암 | TP FP FN TN 불확정 총 | |||||
| 0 | 0 | 0 | 72 | 0 | 72 26 0 42 6 25 10 | |
| 0 | 0 | 0 | 26 | 0 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 0 | 3 | 0 | 35 | 4 | ||
| 2 | 0 | 4 | 0 | 0 | ||
| 15 | 0 | 4 | 0 | 6 | ||
| 7 | 0 | 2 | 0 | 1 | ||
| 24 3 10 133 11 181 | ||||||
민감도 0.7059
특이도 0.9779
PPV 0.8889
NPV 0.9301
표 6:
p21
wqf1
| NIL ASC-US(병변 없음) ASC-US(병변) LSIL(HSIL 없음) LSIL(HSIL) HSIL 암 | TP FP FN TN 불확정 총 | |||||
| 0 | 2 | 0 | 61 | 9 | 72 26 0 42 6 25 10 | |
| 0 | 1 | 0 | 22 | 3 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 0 | 12 | 0 | 23 | 7 | ||
| 3 | 0 | 3 | 0 | 0 | ||
| 21 | 0 | 1 | 0 | 3 | ||
| 7 | 0 | 2 | 0 | 1 | ||
| 31 15 6 106 23 181 | ||||||
민감도 0.8378
특이도 0.8760
PPV 0.6739
NPV 0.9464
표 7:
TOPO2A
| NIL ASC-US(병변 없음) ASC-US(병변) LSIL(HSIL 없음) LSIL(HSIL) HSIL 암 | TP FP FN TN 불확정 총 | |||||
| 0 | 0 | 0 | 68 | 4 | 72 26 0 42 6 25 10 | |
| 0 | 1 | 0 | 24 | 1 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 0 | 4 | 0 | 27 | 11 | ||
| 3 | 0 | 3 | 0 | 0 | ||
| 21 | 0 | 1 | 0 | 3 | ||
| 9 | 0 | 0 | 0 | 1 | ||
| 33 5 4 119 20 181 | ||||||
민감도 0.8919
특이도 0.9597
PPV 0.8684
NPV 0.9675
본 발명의 면역세포화학적 방법을 이용하여 높은 등급의 자궁경부 질환 존재를 약 180 사례에 대해 분석하였다. 이들 중에서, MCM 바이오마커는 4% 내지 7%의 불확정 비율을 형성하였다. 또한 MCM2는 특이도 95% 및 민감도 87%를 보였다. MCM6 및 MCM7 바이오마커는 각각 95% 및 93%에 필적하는 민감도를 나타내었다. 이들 2가지 바이오마커의 특이도는 87% 내지 89%였다.
사이클린 E는 98%의 최대 특이도를 나타내었다. 불확정 비율은 6%였지만, 민감도는 단지 71%였다. p21waf1에 대한 불확정 비율이 13%로 테스트한 모든 마커들에서 가장 높았다. p21waf1의 민감도는 84%였고, 특이도는 88%였다. Topo2A 바이오마커의 특이도는 96%로 관찰되었다. Tpop2a의 불확정 비율은 11%였고, 민감도는 89%였다.
실시예
3: 항체 칵테일을 이용한 임상 샘플에서의
바이오마커
검출
약 180개의 질경검사로 검증한 자궁경부 세포 샘플을 면역세포화학적 방법으로 분석하여, 높은 등급의 자궁경부 질환을 동정하였다. 각 샘플을 목적한 다수개의 바이오마커 발현에 대해 분석하였다. 구체적으로, MCM2, MCM6, MCM7, p21wafl, 사이클린 E 및 Topo2A에 대한 항체들의 다양한 조합으로 높은 등급의 자궁경부 질환 검출 능력을 분석하였다. 이들 샘플은 면역세포화학적 방법과 실시예 2의 슬라이드 분석 설명을 이용하여 목적한 다수개의 바이오마커의 발현을 평가하였다.
면역세포화학적 결과는 질경검사로 수득한 기존의 결과와 비교하였다. 이후, 각 슬라이드의 진양성(TP), 진음성(TN), 위양성(FP), 위음성(FN) 또는 불확정으로 최종 결과를 나타내었다. 민감도, 특이도, 양성 예측치 및 음성 예측치를 각 바이오마커에 대해 계산하였다.
결과
각 바이오마커의 결과는 하기에 종합한다.
표 8:
MCM2
및
MCM7
표 9:
MCM6
및
MCM7
표 10:
MCM7
및
Topo2A
표 11:
MCM7
및
사이클린
E
표 12:
MCM7
및
p21waf1
표 13:
MCM2
및
MCM6
표 14:
MCM2
및
Topo2A
표 15:
MCM2
및
사이클린
E
표 16:
MCM2
및
p21waf1
표 17:
Topo2A
및
사이클린
E
표 18:
Topo2A
및
p21waf1
표 19:
p21waf1
및
사이클린
E
표 20:
MCM2
,
MCM6
및
MCM7
표 21:
MCM2
,
MCM7
및
Topo2A
표 22:
MCM6
,
MCM7
및
Topo2A
표 23:
MCM6
,
MCM7
및
사이클린
E
표 24:
MCM2
,
MCM7
및
사이클린
E
표 25:
MCM2
,
MCM7
및
p21waf1
표 26:
MCM2
,
Topo2A
및
사이클린
E
표 27:
MCM2
,
사이클린
E 및
p21waf1
표 28:
MCM2
,
Topo2A
및
p21waf1
표 29:
MCM7
,
Topo2A
및
사이클린
E
표 30:
MCM7
,
p21waf1
및
사이클린
E
표 31:
MCM7
,
p21waf1
및
Topo2A
표 32:
MCM2
,
MCM7
,
사이클린
E 및
p21waf1
표 33:
MCM2
,
MCM7
,
사이클린
E 및
Topo2A
표 34:
MCM2
,
MCM7
,
사이클린
E,
p21waf1
및
Topo2A
표 35:
MCM2
,
MCM6
,
MCM7
,
Topo2A
,
사이클린
E 및
p21waf1
데이타는 전술한 바와 같이 28가지 항체 칵테일에 대해 수득하였다. 바이오마커 발현은 2, 3, 4, 5 또는 6개의 목적한 바이오마커에 대한 항체를 포함하는 칵테일로 분석하였다. 28가지 항체 칵테일중 21가지의 민감도는 92%보다 높았다. 28가지 칵테일의 4종의 민감도는 90% 보다 높았으며, 가장 낮은 수치는 78%였다. MCM2, TOPOIIA 및 사이클린 E의 조합에서 가장 수치가 높았다. 이 칵테일의 민감도는 93%였고, 특이도는 92%였다. 3개 이상의 바이오마커 조합은 90% 보다 높은 민감도를 나타내는 것으로 보였다. 분석 조정으로 본 분석의 민감도 및 특이도를 더욱 증가시킬 수 있을 것으로 인지되었다.
실시예
4: 항체 칵테일을 이용한
바이오마커
발현 검출
항체 칵테일을 사이클린 E, MCM2, MCM6, MCM7, p21wafl 및 Topo2A 항체들의 여러가지 조합으로 제조하였다. 각 칵테일의 조성은 하기 표에 나타낸다.
표 36: 항체 칵테일의 조성
| 칵테일 번호 | 바이오마커 |
| 칵테일 1 | 사이클린 E, MCM2, MCM7 |
| 칵테일 2 | 사이클린 E, MCM6, MCM7 |
| 칵테일 3 | 사이클린 E, MCM7, p21wafl |
| 칵테일 4 | 사이클린 E, MCM7, TOPO2a |
| 칵테일 5 | MCM2, MCM7, p21wafl |
| 칵테일 6 | MCM6, MCM7, p21wafl |
| 칵테일 7 | MCM7, p21wafl, TOPO2a |
| 칵테일 8 | MCM2, MCM7, TOPO2a |
| 칵테일 9 | MCM6, MCM7, TOPO2a |
| 칵테일 10 | MCM2, MCM6, MCM7 |
| 칵테일 11 | 사이클린 E, MCM2, MCM6, MCM7, p21wafl, TOPO2a |
| 칵테일 12 | 사이클린 E, MCM2, MCM7, p21wafl |
| 칵테일 13 | MCM2, MCM 7 |
| 칵테일 14 | MCM7, p21wafl |
| 칵테일 15 | MCM7, 사이클린 E |
| 칵테일 16 | MCM2, p21wafl |
| 칵테일 17 | 사이클린 E, p21wafl |
| 칵테일 18 | MCM2, 사이클린 E |
| 칵테일 19 | MCM7, TOPO2a |
| 칵테일 20 | MCM2, TOPO2a |
| 칵테일 21 | 사이클린 E, TOPO2a |
| 칵테일 22 | p21wafl, TOPO2a |
2세트의 자궁경부 세포 검체를 HSIL 사례(HSIL 풀) 및 NIL 사례(NIL 풀)로 수집하여 준비하였다. 각 항체 칵테일을 HSIL 풀과 NIL 풀에 대해 테스트하였다. 또한, 바이오마커 항체를 대조군으로 각각 테스트하였다. 슬라이드 조제물 및 자동 면역세포화학 방법을 실시예 2에 개시된 바와 같이 수행하였다.
슬라이드를 스크리닝하고, 세포기술자 및 병리학자가 검토하였다. 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 세포에 특이적인 염색, 선세포 염색, 세균 교차 반응성 및 세포 염색 위치는 스크리닝 과정중에 기록된 것으로 모두 다양하였다.
면역세포화학 결과는 단일 바이오마커의 검출로 수득한 결과에 비해, 바이오마커 항체 칵테일을 이용하여 HSIL 풀에서 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 세포의 염색 증가를 나타내었다. 또한, 칵테일의 항체 수를 2에서 3, 4 또는 6으로 증가시켰을때 백그라운드의 유의적인 증가는 없었다. 더욱이, 다양한 항체 칵테일은 NIL 풀에서 테스트하였을때 백그라운 염색 증가를 나타내지 않았다.
실시예
5: 면역세포화학을 이용한 자궁경부
샘플내
바이오마커의
과다 발현 검출
슬라이드 제조 및 전처리
환자의 자궁경부 샘플을 실시예 1과 같이 수집하였다. 단일층의 자궁경부 세포를 포함하는 슬라이드를 "단지 제조(prep only)" 모드로 AutoPrep® 시스템으로 제조하였다. 제조된 슬라이드는 즉시 1X SureSlide® 전처리 완충액(탈이온수내 0.5% 소듐 라우레트-13-카르복실레이트(Sandopan LS))중에 최소 한시간, 최대 72시간 두었다. 전처리한 슬라이드는 전열처리 없이 45분간 95 ℃에서 스티머내에 두었다. 슬라이드를 스티머에서 꺼내, 20분간 실온으로 냉각시킨 다음, 탈이온수로 잘 헹구었다. 슬라이드는 1회당 2분간 2회 TBST(TBS/Tween-20)로 헹구었다. 슬라이드를 두드려 과잉의 완충액을 제거하고, 습도 챔버(humid chamber)에 두었다. 슬라이드는 하기와 같이 수동으로 또는 자동 면역세포화학으로 분석하였다.
수동 면역세포화학
200 ㎕ 페록시다제 차단제(0.03% 과산화수소)를 각 슬라이드에 적용하여, 5분간 세포 침전 영역을 덮었다. 이후, 슬라이드를 1회당 2분간 TBST로 3회 헹구었다. 과잉의 완충액을 제거하고, 슬라이드를 습도 챔버에 두었다. 단백질 차단제 200 ㎕(정제 카세인 및 계면활성제)를 각 슬라이드에 적용하여, 5분간 배양하였다. 과잉의 단백질 차단제를 제거한 후, 슬라이드를 습도 챔버에 두었다.
MCM2에 대한 두가지 마우스 항-인간 항체(클론 27C5.6, 0.39 mg/ml, 1:800 희석; 클론 26H6.19, 0.918 mg/ml, 1:10,000 희석) 및 Topo2A에 특이적인 제3 마우스 항-인간 항체(클론 SWT3D1, 100 μg/ml, 1:10,000 희석)를 포함하는 일차 단일클론 항체 칵테일 200 ㎕을 각 슬라이드에 적용하여, 세포 침전 영역을 완전하게 덮었다. 슬라이드를 30분간 배양한 다음, 1회단 2분씩 TBST로 3회 헹구었다. 과잉의 완충액을 제거하고, 슬라이드는 습도 챔버에 다시 넣었다. 마우스 단일 클론 항체게 결합하는 마우스 프로브 시약 200 ㎕을 20분간 적용하였다. 슬라이드는 회당 2분씩 TBST로 3회 헹구었다. 과잉의 완충액을 제거하고, 다시 슬라이드를 습도 챔버에 넣었다.
HRP이 접합된 덱스트란 폴리머 및 마우스 프로브 시약에 결합하는 이차 염소 항-마우스 항체를 포함하는 폴리머 시약 200 ㎕을 20분간 가하고, 슬라이드를 1회당 2분간 TBST로 2회 헹구었다. 과잉의 완충액 제거한 다음, 슬라이드를 다시 습도 챔버에 넣었다. DAB 기질-발색체 용액 200 ㎕를 5분간 적용하였다. 슬라이드는 5분간 탈이온수로 헹군 다음, 2분간 TBST로 헹구고, 완충액을 1회 교체하였다. 과잉의 완충액을 제거하고, 슬라이드는 전과 같이 습도 챔버에 두었다. 헤마톡실린 200 ㎕을 1분간 첨가한 다음, 1회당 2분간 탈이온수로 3회 헹구었다. 과잉의 탈이온수를 제거하고, 슬라이드를 습도 챔버에 넣었다. 청색화제(즉, 트윈20 및 소듐아지드가 첨가된 TBS, pH 7.4) 200 ㎕을 각 슬라이드에 1분간 적용하였다. 이 후, 슬라이드는 TBST로 1회, 탈이온수로 1회로 각각 2분씩 헹구었다. 이후, 슬라이드를 건조, 선명화하고, 커버슬립을 덮은 다음 실시예 1 및 2에 개시한 바와 같이 분석하였다.
자동 면역세포화학
자동염색기를 하기 단계로 제조사의 설명서에 따라 프로그래밍하였다:
a. 2회 완충액 헹굼(TBST)
b. 5 분간 페록시다제 차단
c. 2회 완충액 헹굼(TBST)
d. 5분간 단백질 차단, 하기
e. 30분간 일차 항체 칵테일 반응
f. 3회 완충액 헹굼(TBST)
g. 20분간 마우스 프로브 시약
h. 3회 완충액 헹굼(TBST)
i. 20분간 폴리머-HRP
j. 3회 완충액 헹굼(TBST)
k. 5분간 DAB(발색체를 1 ml의 완충액에 1회 점적)
l. 3회 H2O 헹굼
m. 2회 완충액 헹굼(TBST)
n. 1분간 Mayer 헤마톡실린
o. 3회 H2O 헹굼
p. 1분간 청색화제
q. 1회 완충액 헹굼(TBST)
r. 1회 H2O 헹굼
필수 염색 및 대조염색 시약을 기계에 주입하였다. 제조 및 전처리한 슬라이드를 자동염색기상에 두고, 상기 프로그램을 실행하였다. 실행 종료시, 슬라이드를 꺼내어 수돗물로 간단하게 헹구었다. 슬라이드를 건조, 선명화하고, 커버슬립을 덮은 다음 실시예 1 및 2에 개시한 바와 같이 분석하였다.
결과
표 37:
NIL
사례(n=45)
| Pap 결과 | ||
| NIL | 기타 | 불만족 |
| 44 | 1(ASC-US) | 0 |
| ICC 결과 | ||
| 양성 | 음성 | 불만족 |
| 0 | 44 | 1 |
표 38:
HSIL
사례(n=45)
| Pap 결과 | ||
| NIL | 기타 | 불만족 |
| 45 | 0 | 0 |
| ICC 결과 | ||
| 양성 | 음성 | 불만족 |
| 45 | 0 | 0 |
테스트한 45건의 NIL 사례들중, Pap 염색된 슬라이드의 관찰시 하나의 ASC- US 사례가 확인되었다. NIL 샘플에 대한 면역세포화학(ICC) 결과는 음성이었고, 한 사례는 평가에 불만족이었다. HSIL 사례에서, 45건의 각 사례는 Pap 염색한 슬라이드의 관찰을 토대로 높은 등급의 자궁경부 질환인 것으로 확인되었다. 추가적으로, 45건의 HSIL 사례 각각 역시 ICC 분석에서 양성이었다. 음성 대조군, 즉, SiHa 세포주 대조군에 적용한 유니버셜 마우스 IgG 대조군은 ICC 분석의 음성 결과를 형성하였다. 양성 대조군, 즉, SiHa 세포주 대조군에 적용한 일차 항체 칵테일은 ICC 분석에 양성 결과를 형성하였다.
실시예
6: 조합 면역세포화학 및
Pap
염색 공정
환자의 자궁경부 샘플을 상기 실시예 1과 같이 수집하였다. 단일층의 자궁경부 세포를 포함하는 슬라이드를 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조 및 전처리하였다. 각 전처리한 슬라이드를 자동 면역세포화학 및 Pap 염색을 수행하여, 단일 슬라이드상에서의 바이오마커 과다 발현 및 세포 형태를 가시화하였다.
자동 면역세포화학
자동 면역세포화학을 실시예 5에서와 같이 각 슬라이드에 대해 수행하였다. 염색 프로그램 종료 시 슬라이드를 자동염색기에서 꺼내어 3-5분간 수돗물로 세정하였다. 이후, 각 슬라이드는 하기와 같이 기존의 Pap 염색 방법에 따라 염색하였다.
Pap
염색법
자동 면역세포화학 이후에, 각 슬라이드는 Pap 염색으로 더 염색하였다. 슬라이드는 95% 에탄올로 30초간 일차 세정하였다. EA50 및 오렌지 G를 3분간 슬라 이드 절반에 적용하고, 나머지 슬라이드는 6분간 적용하였다. 슬라이드 모두 95% 에탄올로 2회, 100% 에탄올로 3회, 및 크실렌으로 3회, 회당 30초간 세정하였다. 이후, 슬라이드를 불변 고정 매질(permanent mounting media)로 커버슬립하고, 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 분석하였다.
결과
5 NIL 및 5 HSIL 사례들을 각각 Pap 염색 방법으로 EA50 및 오렌지G로 3 또는 6분간 염색하였다. 그 결과 3분 및 6분 염색 프로토콜간에 극소 차이가 있었다. 3분간 Pap 염색한 슬라이드는 일부 약한 강도의 염색을 나타내었다. 또한, ICC 양성 염색의 HSIL 세포는 Pap 대조 염색으로 쉽게 관찰되었다.
실시예
7: 면역세포화학 및
Pap
염색의 조합 방법(
Pap
염색의 최적화)
면역조직화학 방법의 발색체(즉, DAB) 염색과 Pap 염색 수준간의 대비를 최대화하기 위해, 실시예 6에 나타낸 면역세포화학 및 Pap 염색의 조합 공정을 수정하여, Pap 염색 파라미터를 최적화하였다.
실시예 6에 기재한 바와 같이, 슬라이드를 제조, 전처리하고 자동 면역세포화학을 수행하였다. 이후, 슬라이드는 실시예 6에 기재된 바와 같인 기존의 Pap 염색으로 필수적으로 염색하였고, 이후 수정을 수행하였다. 헤마톡실린은 메이어스 제형과 해리스 제형을 이용하여 테스트하였다. EA/오렌지 G를 3분 또는 6분간 적용하였다. 또한, EA/오렌지 G를 첨가한 후, 95% 에탄올을 3회 교체하였다.
슬라이드는 면역세포화학 염색으로 양성, 음성 또는 불만족으로 결정하였다. 또한, 이후 Pap 진단을 이용한 비교로 슬라이드를 형태적으로 평가하였다.
결과
표 39: 면역세포화학 및 Pap 염색의 조합 방법의 결과
| Pap 진단 | ICC 결과 | 코멘트 |
| NIL, n = 7 | 음성 | 모든 사례 NIL로 확인됨 |
| LSIL, n = 6 | 음성 | 6건의 LSIL 사례중 5건은 슬라이드상에서 LSIL 세포를 가지지 않음. 이들 사례는 NIL 또는 ASC-US임 |
| HSIL, n = 6 | 양성 | 모든 사례는 HSIL로 확인됨 |
| 암, n = 4 | 양성 | 모든 사례는 편평 세포 종양임 |
ICC 및 Pap 염색의 조합 공정으로 형태 분석 및 바이오마커의 과다 발현 평가 모두가 가능하였다. 추가적인 실험이 이후의 방법을 최적화하는데 필요할 것이다.
실시예
8: 자궁경부
샘플내
바이오마커의
과다 발현 검출용 면역세포화학
키트
I. 공정의 원리
면역세포화학적 테스트 키트는 일반적으로 제조된 단일층의 자궁경부 세포의 3단계 면역세포화학적 염색 공정을 완료하기 위해 필요한 시료를 함유한다. 이후 단일클론 항체 칵테일과 배양한 후, 이 키트는 덱스트란 기법을 토대로한 레디 투 유즈 가시화를 채택한다. 이 시약은 이차 염소 항-마우스 항체 분자와 덱스트란 폴리머 백본에 연결된 서양고추냉이 페록시다제 분자로 구성된다. 이후 첨가한 발색체의 효소학적 변환으로 항원부에 가시화가능한 반응 산물이 형성된다. 이후, 검체는 헤마톡실린으로 대조 염색하고, 청색화제를 적용하고, 슬라이드의 커버 슬립하였다. 결과는 광학 현미경으로 관찰하였다. 목적한 세포가 갈색으로 염색하 였을 때 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 양성 결과가 나타난다.
자동 영상 장비로 잠재적으로 양성인 세포 무리를 형성시킬 수 있다. 이후 이 무리를 검토하여 양성 또는 음성 결과를 결정하였다.
면역세포화학 테스트 키트는 수동 및 자동 염색으로 모두 적용가능하다.
II
. 제공 시약
1회 제조단 레이두 유즈 마우스 단일클론 칵테일 200 ㎕을 이용하여 75개의 단일층을 제조하기에 충분한 하기 물질이 면역세포화학적 테스트 키트에 함유된다.
표 40: 면역세포화학
키트
구성
| 바이얼 번호 | 양 | 내용 |
| 1a | 1 x 15 ml | 페록시다체 차단제: 완충화된 과산화수소 + 안정화제 및 비공개 성분(proprietary component) |
| 1b | 1 x 15 ml | 단백질 차단제: 정제 카세인 + 보존제 및 계면활성제가 첨가된 변형 PBS중의 단백질들의 비공개 조합 |
| 2 | 1 x 15 ml | 마우스 항-인간 항체 칵테일: 트윈 20, pH7.4가 첨가된 트리스 완충화액에 적용된 레디 투 유즈 단일클론 항체 칵테일. 0.39 mg/mL의 MCM2 mAb 클론 27C5.6(1:800 희석), 0.918 mg/mL의 MCM2 mAb 클론 26H6.19(1:10,000 희석), 100 ㎍/ml의 Topo2a mAb 클론 SWT3D1(1:10,000 희석), 안정화 단백질 및 항미생물제 함유 |
| 3a | 1 x 15 ml | 마우스 프로브 시약: 마우스 단일클론 항체에 결합 |
| 3b | 1 x 15 ml | 폴리머 시약: 마우스 프로브 시약에 결합하는 서양고추냉이 페록시다제와 접합된 폴리머 |
| 4a | 1 x 18 ml | DAB 기질 완충액: DAB 박색단의 제조에 사용된 기질 완충액 |
| 4b | 1 x 1 ml | DAB 발색체: 3,3'-디아미노벤지딘 발색체 용액 |
| 5 | 1 x 18 ml | 헤마톡실린 대조염색제: 수계 메이스 헤마톡실린 |
| 6 | 1 x 18 ml | 청색화제: 트윈 20 및 0.09% NaN3이 첨가된 트리스 완충화된 염수 |
하기 물질 및 시약은 면역세포화학적 방법을 수행하기 위해 필요한 것으로, 키트에는 제공되지 않는다:
- 흡수 와이프
- SiHa 세포주(TriPath Imaging, Inc.)
- 탈이온수 또는 증류수
- 에탄올(95% 및 100%)
- 글라스 커버슬립
- 장갑
- 습도 챔버
- 광학 현미경(10x, 2Ox, 40x 배율)
- 고정 매질
- 피펫 및 피펫 팁(20 ㎕, 200 ㎕ 및 1OOO ㎕ 부피 전이 가증)
- 슈어슬라이드 제조 완충액(TriPath Imaging, Inc.)- 전처리 완충액(0.5% 소듐 라우레트-13-카르복실레이트(Sandopan LS), 탈이온수내)
- 염색 용기 또는 조
- 타이머(1-60분 측정 가능)
- 트리스 완충화된 염수(TBS)
- 트윈 20
- 유니버셜 마우스 IgG 음성 대조군
- 볼텍서
- 크실렌 또는 크실렌 대체물
- 스티머/수조
III
. 사용법
검체 제조
하기 단계로 자궁경부 샘플을 제조하였다.
- 잔여 검체로부터 슬라이드 제조를 위해 SurePath PrepStain System™용 조작 매뉴얼 참조한다.
- SurePath™ 바이얼(약 2 mL)내 잔여 샘플에 SurePath™ 보존액 8 ml을 첨가한다. 희석한 샘플을 표준 기법으로 PrepMate™에서, 그리고 GYN 버전 1.1을 이용하여 PrepStain™에서 처리한다.
슬라이드 제조
- 제조한 슬라이드는 면역염색전 최소 1시간, 최대 72시간 즉시 전처리 완충액에 둔다.
- 최적 키트 수행을 위해 에피토프 부활(retrieval)을 이용하여야 한다. 이러한 공정은 실온에서 최소 1시간동안 전처리 완충액에 제조한 슬라이드를 담근 다음, 전처리 완충액 중에 슬라이드를 95 ℃로 가온한다. 슬라이드를 15분간 95 ℃에 두고, 20분간 실온에서 냉각시킨다. 필수 온도를 유지할 수 있는 규격의 수조( calibrated waterbath) 또는 찜망(vegetable steamer)의 사용을 추천한다. 고도의 실험으로 필수 온도를 유지하는 최상의 방법을 결정하여야 한다. 염색 공정은 즉각적으로 개시하고, 이후 에피토프 부활 및 냉각을 수행하였다. 기재된 공정의 편차는 결과에 영향을 미칠 수 있다.
시약 제조
염색전에 하기 시약을 제조하였다:
0.05% 트윈 20이 첨가된
트리스
완충화된
염수(
TBST
)
- 제조사의 설명에 따라 TBS를 제조한다.
- 트윈 20을 최종 농도 0.05%로 첨가한다.
- 일주일내에 사용가능한 경우 실온에서 보관한다.
- 미사용 용액은 3달간 2-8 ℃에서 보관할 수 있다.
- 용액은 투명하고, 무색이다. 탁해지면 희석 용액을 버린다.
기질-
발색체
용액(
DAB
)(5개 슬라이드에 충분한 용량)
- DAB 완충화된 기질 1 ml을 테스트 튜브에 넣는다.
- DAB+ 발색체를 1회 점적(20-30 ㎕)한다. 잘 혼합하여, 피펫으로 슬라이드에 적용한다.
- 기질-발색체 용액을 매일 신선하게 준비한다.
- 용액에 어떠한 침전물이 생겨도 염색 품질에 영향을 미치지 않는다.
IV
. 염색 프로토콜(실온에서 수행, 20-
25 ℃
)
자궁 경부 세포 샘플의 면역염색을 위해 하기 단계를 수행하였다:
염색 과정
- 사용자는 주의깊게 설명서를 읽어야 하며, 사용전에 모든 성분들에 친숙해져야 한다.
- 모든 시약은 면역염색전에 실온(20-25 ℃)으로 평형화한다. 모든 배양은 실온에서 수행한다.
- 염색 과정중에는 슬라이드가 건조되지 않도록 한다. 건조된 세포 준비물은 비특이적 염색 증가를 나타낼 수 있다. 커버 슬라이드는 통풍시킨다. 슬라이 드는 지속적인 배양시 습도 챔버내에 위치시켜야 한다.
에피토프
부활
- 제조한 슬라이드를 최소 1시간, 최대 72시간동안 전처리 완충액내에 둔다.
- 10분간 95 ℃에서 배양한다.
- 수조 또는 스티머에서 슬라이드가 든 코플린 용기 전체를 꺼내서, 20분간 완충액중에서 슬라이드를 냉각시킨다.
- diH2O로 슬라이드를 세정하고, TBST 수조로 이동시킨다.
페록시다제
차단
- 두들겨 과잉의 완충액을 제거한다.
- 준비한 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다(물에 젖신 종이 타월 또는 거즈로 충진됨)
- 페록시다제 차단제 200 ㎕을 가하여, 세포 침전 부분을 덮는다.
- 5분(+ 1분)간 배양한다.
- 슬라이드를 2분씩 3번 TBST로 세정한다.
단백질 차단
- 두들겨 과잉의 완충액을 제거한다.
- 준비한 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다(물에 젖신 종이 타월 또는 거즈로 충진됨)
- 단백질 차단제 200 ㎕을 가하여, 세포 침전 부분을 덮는다.
- 5분(+ 1분)간 배양한다.
- 슬라이드를 세정하지 않는다.
일차 항체 칵테일
- 두들겨 과잉의 완충액을 제거한다.
- 준비한 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다(물에 젖신 종이 타월 또는 거즈로 충진됨)
- 일차 항체 칵테일 200 ㎕을 (세포 침전 부분을 완전히 덮도록)가한다.
- 실온에서 30분간 배양한다.
- 각각의 슬라이드를 세정 병을 이용하여 TBST로 개별적으로 헹군다(세포 침전 부위에 직접 닿도록 흘리지 않는다). 슬라이드를 슬라이드 랙에 둔다.
- 슬라이드를 2분씩 3번 TBST로 세정한다.
검출 화학
- 두들겨 과잉의 완충액을 제거한다.
- 준비한 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다(물에 젖신 종이 타월 또는 거즈로 충진됨)
- 마우스 프로브 200 ㎕을 가하여, 세포 침전 부분을 완전히 덮는다.
- 20분(+ 1분)간 배양한다.
- 슬라이드를 2분씩 3번 TBST로 세정한다.
- 두들겨 과잉의 완충액을 제거한다.
- 준비한 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다(물에 젖신 종이 타월 또는 거즈로 충진됨)
- 폴리머 200 ㎕을 가하여, 세포 침전 부분을 덮는다.
- 20분(+ 1분)간 배양한다.
- 슬라이드를 2분씩 3번 TBST로 세정한다.
- 두들겨 과잉의 완충액을 제거한다.
- 준비한 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다(물에 젖신 종이 타월 또는 거즈로 충진됨)
- DAB 작용용액 200 ㎕을 가하여, 세포 침전 부분을 완전히 덮는다.
- 5분(+ 1분)간 배양한다.
- 슬라이드를 5분간 diH2O로 세정한다.
대조 염색제
- 슬라이드를 TBST로 2분간 1회 세정한다.
- 준비한 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다(물에 젖신 종이 타월 또는 거즈로 충진됨)
- 헤마톡실린 200 ㎕을 가하여, 세포 침전 부분을 완전히 덮는다.
- 1분(+ 10초)간 배양한다.
- 슬라이드를 3분간 흐르는 물로 세정한다.
- 준비한 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다(물에 젖신 종이 타월 또는 거즈로 충진됨)
- 청색화제 200 ㎕을 1분간(+ 10초) 가하여 슬라이드를 청색으로 염색한다.
-흐르는 물에 1분간 반복 세정한다.
고정(
mounting
)
- 슬라이드를 1분간 또는 25 95% 에탄올을 적시거나 담근다.
- 슬라이드를 1분씩 4회 무수 알콜에 적시거나 또는 25 담근다.
- 크실렌으로 1분씩 3회 또는 25회 침지로 세정한다.
- 비수계 불변 고정 매질로 글라스 커버슬립을 이용하여 슬라이드를 덮는다.
v. 품질 관리
실시예에 기재된 면역세포화학 키트를 이용할 때 하기 품질 관리 문제를 고려하였다.
결과 변이성은 종종 검체 취급상의 차이 및 테스트 과정에서의 변화로부터 유래된다. 추가적인 정보를 위해 면역세포화학용 NCCLS 품질 관리의 제안된 품질 관리 지침서를 참조한다.
대조군 세포주는 TriPath Imaging, Inc사로부터 구입가능하다. 각 바이얼은 임상 검체들과 유사한 방법으로 처리된 자궁경부암 세포주를 함유한다. 두개의 슬라이드는 각 염색 공정으로 염색하여야 한다. 대조군 슬라이드 세포주의 평가는 염색 수행의 타당성을 나타낸다.
VI
. 염색 분석
대조군 슬라이드:
면역세포화학적 테스트 키트로 염색된 대조군 슬라이드를 모든 시약이 적절 하게 기능하는 것을 확인하기 위해 먼저 시험하였다. 갈색(3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드, DAB)의 반응 산물이 세포 핵에 존재하는 것은 양성 반응성을 나타낸다.
환자 검체: 광학 현미경을 이용하여 세포기술자나 병리학자를 통해 슬라이드를 평가하였다. 세포는 광학 현미경으로 관찰한 수동 또는 전기적으로 저장된 이미지들로 검토하였다.
다양한 진단을 나타내는 약 1610개의 자궁경부 샘플을 수집하였다. 하기 표는 면역세포화학 키트를 이용하여 기존의 Pap 염색 또는 생검으로 결정된 각 진단 군내 분석한 샘플 수이다.
표 41: 각 진단 군의 환자 검체(
Pap
염색)
| 세포 결과 | 수 | % |
| NIL | 671 | 41.7% |
| LSlL | 395 | 24.53% |
| ASCUS | 349 | 21.68% |
| HSIL | 150 | 9.32% |
| ASC-H | 38 | 2.36% |
| AGUS | 6 | 0.37% |
| SCC | 1 | 0.06% |
| 총 | 1610 |
표 42: 각 진단 군의 환자 검체(
생검
)
| 세포 결과 | 수 | % |
| NIL | 968 | 60.20% |
| CIN1 | 369 | 22.95% |
| CIN2 | 140 | 8.71% |
| CIN3 | 131 | 8.15% |
| 분실 | 2 | |
| 총 | 1610 |
슬라이드
스코링
(scoring) 지침
하기 과정을 실시예에 기재된 면역세포화학적 방법으로 분석된 모든 슬라이드의 스코어를 매기기 위해 수행하였다.
단계 1: 검체가 적합한가?
자궁경부 세포(2판) 보고용 베데스다 시스템(Bethesda System)은, "적정한 액체계 조제물은 적어도 5000개 이상의 잘-가시화된/잘-보존된 편평 세포의 추정 최소값을 가져야 한다"고 한다. 이러한 동일 기준을 모든 슬라이드 평가에 적용하였다. 그로나, 일반적인 Pap 조제물과 같이, 양성 분자 반응을 나타내는 비정상적인 세포를 가지는 모든 검체는 당연히 평가에 만족스러웠다. 이 단계에 대한 답이 "예"인 경우, 세포기술자는 다음 단계로 진행하였고, 답이 "아니오"인 경우, 결과는 평가 불만족이었다.
단계 2: 상피 세포에서 중간 내지 강한 수준의 갈색 핵 염색이 존재하나?
본 실시예의 면역세포화학 키트에 사용된 검출 화합물(예, SureDetect Detection Chemistry Kit)은 > CIN2 관련 이형성 핵을 갈색 발색체, DAB를 이용하여 염색한다. 이 단계에서 "예"로 확인하기 위해, 샘플을 쉽게 가시화되는 갈색 염색으로 분석하였다. 엷거나 또는 흐린 갈색의 관찰은 양성으로 판단하기 불충분하였다. 갈색의 핵 염색이 관찰되지 않는 경우, 이는 음성 테스트 결과로 하였다. 적정 갈색 염색이 있는 경우 이후 단계로 분석을 진행하였다.
단계 3: 갈색의 핵 염색된
편평
(또는 선)세포가 있는지 그리고 ≥
ASC
(
AGC
)인지?
자궁 경부 세포 보고용 베데스다 시스템(2판)("TBS")에 개괄된 동일한 형태 기준을 이용하여, 갈색 핵을 가지고 있는 편평 세포가 ≥ASC(비정형 편평세포)인지를 결정하였다. 이는 ASC-US, ASC-H, LSIL, HSIL 및 암을 함유한다. 만약 세포가 외관상 선이 있다면, 세포가 ≥AGC(비정형 선세포)인지를 결정하기 위한 TBS 기준을 적용하였다. 이는 자궁경부 AGC, 자궁내막 AGC, AIS, 및 선암종을 포함한다. 만약 세포가≥ASC (또는 ≥AGC)로 간주된다면, 결과는 양성이다. 만약, 미제의 세포가 NILM(상피내 병변 또는 악성이 음성)이면, 이는 음성 결과이다.
VII
. 결과
기존의 Pap 염색 방법에 의해 본래 NIL로 분류된 27건은 면역세포화학적 테스트에서 양성으로 염색되었다. 이들 27건중에서, 7건은 HSIL로, 10건은 ASC-H, ASC-US로, 그리고 3건은 불확실로, 공인된 병리학자 검토에 의해 분류되었다. 7건의 HSIL은 높은 등급의 자궁경부 질환으로 간주되었다. 이들 27건은 면역세포화학적 분석에서 양성 면역염색에 의해 동정되었으며, 따라서, Pap 염색에 의해 NIL로 잘못 분류된 환자를 동정하는데 있어, 본원에 기재된 방법의 가치를 시사한다.
생검 결과를 NIL 검체 모두에서 수득하지 못하였다. 본 실시예에 기재된 면역세포화학적 방법의 민감도 및 양성예측치(PPV) 추정은 "골드 스탠다드" 생검 결과와의 비교를 토대로 계산되었다. 하나의 생검은 골드 스탠다드로서 한계를 가진다. ICC 분석에서 PPV는 환자를 계속적으로 모니터링하거나 또는 루프 전기외과적 절개 과정 또는 원추 생검(cone biopsy)과 같은 보다 적극적인 외과적 종결(endpoint)을 이용에 의해 향상될 것이다. 단일 생검은 31% 이상의 질병의 위음 성 결과를 가지는 것으로 알려져 있다. Elit et al. (2004) J. Lower Genital Tract Disease 8(3):181-187을 참조한다.
표 43:
생검
결과를
초대로한
ICC
테스트의 민감도 및 양성 예측치 추정
| ASC-H | ASCUS | LSIL | HSIL | >ASCUS | |
| 민감도 | 76.5% (52.7%, 90.4%)* | 92.6% (76.6%, 97.9%) | 97.7% (92.1%, 99.4%) | 98.5% (94.6%, 99.6%) | 96.2% (93.1%, 97.9%) |
| PPV | 59.1% (38.7%, 76.7%) | 26.0% (18.3%, 35.6%) | 31.0% (25.9%, 36.7%) | 90.1% (84.1%, 94.0%) | 46.9% (42.8%, 51.2%) |
* (95% 신뢰 구간)
또한 면역세포화학적 방법의 민감도 및 PPV를 기존의 PAp 염색 결과와 비교하였다. Pap 염색에 대한 두가지 치료 종말(endpoint)(즉, >LSIL 및 >HSIL)을 사용하였다. 다시, 모든 계산의 기준은 생검 결과이다.
표 44:
Pap
테스트와 면역세포화학적 방법의 비교
| >LSIL(Pap 테스트) | >HSIL(Pap 테스트) | >ASCUS(ICC) | |
| 민감도 | 76.5% (52.7%, 90.4%)* | 92.6% (76.6%, 97.9%) | 97.7% (92.1%, 99.4%) |
| PPV | 59.1% (38.7%, 76.7%) | 26.0% (18.3%, 35.6%) | 31.0% (25.9%, 36.7%) |
* (95% 신뢰 구간)
표 42의 결과는 면역세포화학적 방법이 높은 PPV를 유지하면서 보다 높은 등급의 자궁경부 질환 샘플을 검출함을 나타낸다.
면역세포화학적 키트를 이용한 본 실험에서 14개의 위음성이 있었다. 14개의 환자 샘플중 13개에 대해 HPV 테스트를 수행하였다. 나머지 샘플은 위음성 환자들중 하나로 이용할 수 없었다.
게놈 DNA를 NucleoSpin® 조직 DNA 키트(BD Clontech, Cat#635967)를 이용하여 자궁경부 세포 샘플로부터 분리하였다. 품질 관리 목적으로, 베타-글로빈, 하우스키핑 유전자의 PCR 분석을 수행하였다.
HPV Ll 유전자 증폭은 MY09/11 프라이머 세트를 이용한 기존의 Li PCR과 MY09/11 및 GP5+/6+ 프라이머 세트를 이용한 네스티드 PCR 둘다로 당업계에 공지된 바에 따라 수행하여, 검출 민감도가 증가되었다. L1 증폭체의 DNA 서열분석을 더욱 실시하여, 존재하는 HPV의 타입(들)을 동정하였다.
품질이 우수한 게놈 DNA를 13개의 임상 세포 샘플들중 10개에서 분리하였다. 3개의 샘플의 게놈 DNA 품질은 베타-글로빈 PCR 분석에 의해 나타낸 바와 같이, 불량하였다. 기존의 L1 PCR(MY09/11 프라이머) 및 네스티드 L1 PCR(MY09/11 및 GP+5/+6 프라이머) 둘을 이용한 13개의 샘플중들 10개는 HPV NDA가 미검출이거나 음성이었다. 이러한 결과는 HPV가 높은 등급이 자궁경부 질환에서 양성일때, 샘플링 에러가 대부분의 위음성 샘플에서 발생됨을 나타낸다(민감도 >92%).
실시예
9:
MCM6
항체 선택
폴리도마
스크리닝
멀티 웨 조직 배양 플레이트에 제공된 폴리도마를 스크리닝하여 원하는 민감도 및 특이도를 가지는 MCM6 바이오마커 특이 항체를 동정하였다. 다수의 정상(즉, CIN 아님), CINIII, 편평 세포 종양 및 선암종 샘플을 포함하는 조직 마이크로어레이를 하나의 슬라이드상에 제조하였다. 폴리도마를 함유하고 있는 각 웰로 부터 희석하지 않은 상층액을 조직 마이크로어레이의 양성 염색으로 분석하였다. 백그라운드, 즉 비특이 결합은 이 단계에서 필연적으로 무시되었다. 35개중 11개가 폴리도마스 테스트 양성이었고, 이후 분석을 위해 선별하였다.
선별한 폴리도마의 특이도를 결정하기 위해, 폴리도마 상층액으로 수득한 염색 패턴을 상업적으로 이용가능한 MCM6 항체 (BD TRANSDUCTION Laboratories)를 이용하여 수득한 결과와 비교하였다. 폴리도마 상층액의 염색 패턴은 상업적인 MCM6 항체에서 관찰된 바보다 더 특이적인 것으로 보였다(도 17).
11개의 선별한 폴리도마를 이후 한정 희석 과정(limiting dilution process)을 수행하였다. 선별한 폴리도마의 상층액으로부터 수득한 30개의 한정 희석물은 다수개의 정상(즉, CIN 아님), CINIII, 편평 세포 암종 및 선암종 샘플을 포함하는 조직 마이크로어레이의 양성 염색에 대해 분석하였다. 2개의 한정 희석 클론, 9D4.3 및 9D4.4를 비정상 및 암성 경부 조직 샘플의 양성 염색을 토대로, 최상의 상층액으로 선택하였다. 이들 클론의 여러가지 희석물들을 NIL, LSIL, HSIL 조직에 대한 그들의 반응성에 대해 테스트하였고, 액체성 세포 샘플로 모았다. 1:100 희석의 클론 9D4.3이 신호대 노이즈 비가 최상이었으며, 이후 특정화를 위해 선택하였다.
MCM6
, 클론 9
D4
.3의 특정화
클론 9D4.3을 더욱 특정화하기 위해, 아래 진단 카테고리로부터 선택한 10개의 액체 세포 샘플들의 양성 염색에 대해 클론을 분석하였다: NIL(7), LSIL(10), HSIL(18) 및 자궁경부암종(5). 40개의 샘플 각각에 대해 PrepStainTM 슬라이드 프로세서(TriPath Imaging, Inc.)로 슬라이드를 제조하였다. 샘플당 2개의 슬라이드를 각각 MCM2 항체(Dako) 및 클론 9D4.3으로 염색하였다. 나머지 슬라이드는 Pap 염색이나 음성 대조군으로 이용하였다.
슬라이드를 제조하기 위해, 각 샘플을 2분간 200 xg로 원심분리하여 펠렛을 형성시킨 다음, 상층액을 버렸다. 탈이온수 2 ml을 각 샘플에 첨가하여 볼텍스한 다음 600 xg에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버린 다음, 트리스 완충화된 물 700 ㎕을 첨가하였다. 마지막으로 샘플을 PrepStainTM 슬라이드 프로세서(Tripath Imaging, Inc.), 버전 1.1에 넣고, 이동 프로그램만 실행하였다.
슬라이드 모두는 제조 후 적어도 24시간 이상, 3일 미만으로 95% 에탄올에 두었다. MCM2에 대한 항체 부활은 1X 표적 부활 용액 pH 6.0(DAKO S1699)dH2O 조에 슬라이드를 넣고, 스티머에서 95 ℃로 25분간 가온하여, 수행하였다. MCM6의 경우, 항원 접근성은 슬라이드를 1x Tris pH 9.5 완충액(Biocare)/dH2O) 조에 넣고 스티머로 25분간 95 ℃로 가온하여 수행하였다. 스팀 후, 슬라이드 모두 20분간 실온에서 냉각시켰다.
슬라이드는 DAKO 유니버셜 자동염색기를 이용하여 실시예 1"자동 면역세포화학"에 기재된 바와 같이 면역세포화학적으로 염색하였다. 슬라이드를 스크리닝하고, 형태적 진단 분류 결정으로 숙련된 세포기술자가 평가하였다. 샘플들은 마커 염색 강도(0-3), 양성 염색 세포의 비% 및 마커 염색 위치(핵, 세포질, 막 및 조합)에 대해 평가하였다. 세포 염색 ㅇ도는 0-3으로 매겼다. 세포 수치는 >1.5이었다. 성숙형의 정상으로 보이는 편평 세포와 정상으로 보이는 선세포는 갈색 염색시 양성으로 판단되지 않았다. 그러나, 편평 화생성 세포는 비정상 세포와 함께 양성으로 판단되었다. 면역세포화학 슬라이드는 TN(진음성), FN(위음성), TP(진양성t), 또는 FP(위양성)으로 표시하였다.
표 45: 클론 9
D4
.3 (
MCM6
)
표 46:
MCM2
사용한 계산식
민감도 = TP/ (TP + FN)
특이도 = TN/ (FP + TN)
양성 예측력(PPP) = TP/ (TP + FP)
음성 예측력(NPP) = TN/ (FN + TN)
클론 9D4.3에 대한 민감도 및 특이도는 상업적으로 이용가능한 MCM2 항체의 결과와 비교하였다. NIL 한 사례는 항체 둘다에 대해 음성이었다. 10건의 LSIL 사례들중 9건은 클론 9D4.3과 상업적인 MCM2 항체에 음성이었다. 24건의 HSIL 중 23건은 클론 9D4.3과 상업적인 MCM2 항체에 양성이었다. 자궁경부암 샘플의 5건 모두 클론 9D4.3에 양성이었고, 5건중 4건은 MCM 2 항체에 양성이었다.
MCM
6, 클론 9
D4
.3의 정제
민감도, 특이도 및 핵 염색 패턴 때문에, 클론 9D4.3을 이후의 분석을 위해 정제하였다. Streamline rProteinA(Amersham Biosciences) 친화성 흡착 크로마토그래피를 이용하여, 표준 방법으로 정제한 항체를 수득하였다. 얻어지는 항체 용액은 이후 1:500 내지 1:6000의 다양한 희석비로, HSIL 액체계 자궁경부 세포 풀에 대한 반응성을 테스트하였다. 신호는 1:6000에서 확인되었다.
실시예
10: 임상 조직
샘플내
바이오마커의
실시간
PCR
검출
TaqMan® 실시간 PCR을 ABI Prism 7700 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 수행하였다. 프라이머 및 프로브를 Primer Express™ 프로그램, 버전 1.5(Applied Biosystems)를 사용하여, 본 실험에서 표적 자궁경부 바이오마커들(즉, MCM7, p21wafl, pl4ARF/pl6, 사이클린 El, 및 사이클린 E2)의 특이 증폭을 위해 제작하였다. 프라이머 및 프로브 서열 정보는 다음과 같다:
MCM7
:
프라이머 명: MCM7_T1T3-F
서열: CTCTGAGCCCGCCAAGC (서열번호 25)
프라이머 명: MCM7_T1T3-R
서열: TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA (서열번호 26)
프로브 명: MCM7_T1T3-Probe
서열: CCCTCGGCAGCGATGGCACT (서열번호 27)
프라이머 명: MCM7JT2T4-F
서열: GAGGAATCCCGAGCTGTGAA (서열번호 28)
프라이머 명: MCM7_T2T4-R
서열: CCCGCTCCCGCCAT (서열번호 29)
프로브 명: MCM7_T2T4-Probe
서열: CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA (서열번호 30)
프라이머 명: MCM7_T2-F
서열: GTCCGAAGCCCCCAGAA (서열번호 31)
프라이머 명: MCM7_T2-R
서열: CCCGACAGAGACCACTCACA (서열번호 32)
프로브 명: MCM7_T2-Probe
서열: CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA (서열번호 33)
프라이머 명: MCM7_T3T4-F
서열: CGCTACGCGAAGCTCTTTG (서열번호 34)
프라이머 명: MCM7_T3T4-R
서열: CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA (서열번호 35)
프로브 명: MCM7_T3T4-Probe
서열: TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA (서열번호 36)
p21
wafl
:
프라이머 명: p21TlT2-F
서열: CAAACGCCGGCTGATCTT (서열번호 37)
프라이머 명: p21TlT2-R
서열: CCAGGACTGCAGGCTTCCT (서열번호 38)
프로브 명: p21TlT2-Probe
서열: CAAGAGGAAGCCCTAATCCGCCCA (서열번호 39)
프라이머 명: ρ21T2-F
서열: GAGCGGCGGCAGACAA (서열번호 40)
프라이머 명: p21T2-R
서열: CCGCGAACACGCATCCT (서열번호 41)
프로브 명: p21T2-Probe
서열: CCCAGAGCCGAGCC AAGCGTG (SEQ ID NO :42)
프라이머 명: p21T3-F
서열: TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA (서열번호 43)
프라이머 명: p21T3-R
서열: TCCAGTCTGGCCAACAGAGTT (서열번호 44)
프로브 명: ρ21T3-Probe
서열: CGGCGGCAGACCAGCATGAC (서열번호 45)
pl4
ARF
/
pl6
:
프라이머 명: pl6T4-F
서열: GCC CTC GTG CTG ATG CTA CT (서열번호 46)
프라이머 명: ρl6T4-R
서열: TCA TCA TGA CCT GGT CTT CTA GGA (서열번호 47)
프로브 명: ρl6T4-Probe
서열: AGC GTC TAG GGC AGC AGC CGC (서열번호 48)
프라이머 명 : p16T 1-F
서열: TGCCCAACGCACCGA (서열번호 49)
프라이머 명: pl6Tl-R
서열: GGGCGCTGCCCATCA (서열번호 50)
프로브 명: pl6Tl-Probe
서열: TCGGAGGCCGATCCAGGTCATG (서열번호 51)
프라이머 명: pl6T2-F
서열: AAGCTTCCTTTCCGTCATGC (서열번호 52)
프라이머 명: pl6T2-R
서열: CATGACCTGCCAGAGAGAACAG (서열번호 53)
프로브 명: ρl6T2-Probe
서열: CCCCCACCCTGGCTCTGACCA (서열번호 54)
프라이머 명: pl6T3-F
서열: GGAAACCAAGGAAGAGGAATGAG (서열번호 55)
프라이머 명 : p16T3 -R
서열: TGTTCCCCCCTTCAGATCTTCT (SEQ ID NO.56)
프로브 명: pl6T3-Probe
서열: ACGCGCGT ACAGATCTCTCGAATGCT (서열번호 57)
프라이머 명: pl6Universal-F
서열: CACGCCCTAAGCGCACAT (서열번호 58)
프라이머 명: p16 Universal-R
서열: CCTAGTTCACAAAATGCTTGTCATG (서열번호 59)
프로브 명: pl? Universal-Probe
서열: TTTCTTGCGAGCCTCGCAGCCTC (서열번호 60)
사이클린
El
:
프라이머 명: CCNE1T1T2-F
서열: AAAGAAGATGATGACCGGGTTTAC (서열번호 61)
프라이머 명: CCNE1T1T2-R
서열: GAGCCTCTGGATGGTGCAA (서열번호 62)
프로브 명: CCNE1T1T2-P
서열: CAAACTCAACGTGCAAGCCTCGGA (서열번호 63)
프라이머 명: CCNElTl-F
서열: TCCGCCGCGGACAA (서열번호 64)
프라이머 명: CCNElTl-R
서열: CATGGTGTCCCGCTCCTT (서열번호 65)
프로브 명: CCNEIT1-Probe
서열: ACCCTGGCCTCAGGCCGGAG (서열번호 66)
사이클린
E2
프라이머 명: CCNE2T1T2-F
서열: GGAATTGTTGGCCACCTGTATT (서열번호 67)
프라이머 명: CCNE2T1T2-R
서열: CTGGAGAAATCACTTGTTCCTATTTCT (서열번호 68)
TaqMan 프로브 명: CCNE2T1T2-P
서열: CAGTCCTTGCATTATCATTGAAACACCTCACA (서열번호 69)
프라이머 명: CCNE2T1T3-F
서열: TCAACTCATTGGAATTACCTCATTATTC (서열번호 70)
프라이머 명: CCNE2T1T3-R
서열: ACCATCAGTGACGTAAGCAAACTC (SEQ ID N0:71)
TaqMan 프로브 명: CCNE2T1T3-P
서열: CCAAACTTGAGGAAATCTATGCTCCTAAACTCCA (서열번호 72)
프라이머 명: CCNE2T2-F
서열: TTTTGAAGTTCTGCATTCTGACTTG (서열번호 73)
프라이머 명: CCNE2T2-R
서열: ACCATCAGTGACGTAAGCAAGATAA (서열번호 74)
TaqMan 프로브 명: CCNE2T2-P
서열: AACCACAGATGAGGTCCATACTTCTAGACTGGCT (서열번호 75)
프로브는 형광 염료 FAM(6-카르복시플루오레세인)으로 5'염기에, 그리고 3'염기에는 퀀칭 염료 TAMRA(6-카르복시테트라메틸로다민)으로 표지하였다. 증폭체의 크기는 약 100 bp였다. 18S 라이보좀 RNA를 내인성 대조군으로 사용하였다. 18S rRNA 프로브는 형광 염료 VIC™으로 표지하였다. 발색전(Pre-developed) 18S rRNA 프라이머/프로브 혼합물은 Applied Biosystem에서 구입하였다. 정상(N) 또는 암(T) 자궁경부 조직으로부터 추출한 총 RNA 5 ㎍은 High-Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems)을 이용하여 랜덤 헥사머가 있는 단일 가닥 cDNA로 정량적으로 변환시켰다. 아래 반응 시약을 준비하였다:
2
OX
프라이머
/
프로브
마스터
믹스
(200 ㎕)
180 μM 정방향 프라이머 20 ㎕
180 μM 역방향 프라이머 20 ㎕
100 μM TaqMan 프로브 10 ㎕
H2O 150 ㎕
최종 반응
믹스
(25 ㎕/웰)
2OX 프라이머/프로브 마스터 믹스 1.25 ㎕
2X TaqMan 유니버셜 PCR 마스터 믹스(P/N: 4304437) 12.5 ㎕
cDNA 주형 5.0 ㎕
H2O 6.25 ㎕
2OX TaqMan 유니버셜 PCR 마스터 믹스는 Applied Biosystems에서 구입하였다. 총 부피 25 ㎕의 최종 프라이머 및 프로브 농도는 각각 0.9 μM 및 0.25 μM이었다 총 RNA 1O ng을 각 웰에 가하였다. 증폭 조건은 50 ℃에서 2분, 95 ℃에서 10분, 그리고 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 60초로 이루어진 2단계 사이클로, 총 40 사이클이다. 각 반응시 적어도 3개 이상의 주형이 없는 대조군 반응 혼합물을 포함시켰다. 모든 실험은 3배수로 수행하였다.
각 반응 종료시, 기록된 형광 강도를 하기 계산에 사용하였다: Rn+는 모든 성분을 포함한 반응의 Rn 값이다. Rn-는 미반응 샘플의 Rn 값이다(베이스라인 값 또는 NTC에서 검출된 값). ΔRn은 Rn+와 Rn- 간의 차이이고, 이는 PCR에 의해 형성된 신호 증폭의 지표이다. 양을 모르는 표준물을 사용하고, 임의의 선택한 참조 값에 대한 표적 서열(예, 18S rRNA)의 상대적인 양을 비교하는 비교 CT 방법을 본 실험에 사용하였다. TaqMan® Human Endogenous Control Plate 프로토콜을 사용하여 미가공 데이타를 실시간 PCR 데이타 분석으로 변환시켰다.
결과
각 바이오마커 및 특이 프라이머로 수득한 결과는 하기 표에 나타낸다. 정상적인 자궁경부 조직 샘플 결과(즉, NIL)은 N으로 나타내고, 자궁경부암 조직 결과는 T로 나타낸다.
표 47:
MCM7
TaqMan
®
결과
표 48:
p21
waf1
TaqMan
®
결과
표 49:
p14ARF
/
p16
TaqMan
®
결과
표 50:
사이클린
E1
TaqMan
®
결과
표 51:
사이클린
E2
TaqMan
®
결과
실시예
11: 임상 조직
샘플내
바이오마커의
실시간
PCR
검출
자궁경부암 조직 샘플(예, 선암종, 편평 세포 암종) 및 정상 자궁경부 조직 샘플을 이용하여 실시예 9에 개시된 바와 같이 TaqMan® 실시간 PCR을 수행하였다. 본 실험에서 표적 자궁경부 바이오마커(즉, MCM2, MCM6, MCM7, Topo2A)의 특이적 증폭을 위해 Primer Express™ program, version 1.5 (Applied Biosystems)로 프라이머와 프로브를 제작하였다. 프라이머 및 프로브의 서열 정보는 아래와 같다:
TaqMan
프라이머
MCM2
:
프라이머 명: MCM2-F
서열: 5'-GGAGGTGGTACTGGCCATGTA-S' (서열번호 80)
프라이머 명: MCM2-R
서열: 5'-GGGAGATGCGGACATGGAT-S' (서열번호 81)
TaqMan 프로브 명: MCM2-P
서열: 5'-CCAAGTACGACCGCATCACCAACCA-S' (서열번호 82)
MCM6
:
프라이머 명: MCM6-F
서열: 5'-CATTCCAAGACCTGCCTACCA-S' (서열번호 83)
프라이머 명: MCM6-R
서열: 5'-ATGCGAGTGAGCAAACCAATT-S' (서열번호 84)
TaqMan 프로브 명: MCM6-P
서열: 5'-ACACAAGATTCGAGAGCTCACCTCATCCA-S' (서열번호 85)
MCM7
:
프라이머 명: MCM7_T1T3-F
서열: CTCTGAGCCCGCCAAGC (서열번호 25)
프라이머 명: MCM7_T1T3-R
서열: TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA (서열번호 26)
프로브 명: MCM7_T1T3-Probe
서열: CCCTCGGCAGCGATGGCACT (서열번호 27)
프라이머 명: MCM7_T2T4-F
서열: GAGGAATCCCGAGCTGTGAA (서열번호 28)
프라이머 명: MCM7_T2T4-R
서열: CCCGCTCCCGCCAT (서열번호 29)
프로브 명: MCM7_T2T4-Probe
서열: CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA (서열번호 30)
프라이머 명: MCM7_T2-F
서열: GTCCGAAGCCCCCAGAA (서열번호 31)
프라이머 명: MCM7_T2-R
서열: CCCGACAGAGACCACTCACA (서열번호 32)
프로브 명: MCM7_T2-Probe
서열: CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA (서열번호 33)
프라이머 명: MCM7_T3T4-F
서열: CGCTACGCGAAGCTCTTTG (서열번호 34)
프라이머 명: MCM7JT3T4-R
서열: CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA (서열번호 35)
프로브 명: MCM7_T3T4-Probe
서열: TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA (서열번호 36)
TOPO2A
:
프라이머 명: TOP2A_F
서열: 5'- GGCTACATGGTGGCAAGGA -3' (서열번호 86)
프라이머 명: TOP2A_R
서열: 5'- TGGAAATAACAATCGAGCCAAAG -S' (서열번호 87)
TaqMan 프로브 명: TOP2A_P
서열: 5'- TGCTAGTCCACGATACATCTTTACAATGCTCAGC -3' (서열번호 88)
결과
각 바이오마커 결과는 하기 표로 나타낸다. 또한, 데이타는 하기에 종합한다.
표 52: 순간-동결 자궁경부암 조직 샘플
표 53: 정상 조직 샘플
결과 종합
표 54: 종양 대 정상
M: 평균; SD: 표준편차; R: 종양 대 정상의 평균 비; P: P t-테스트의 P 값
표 55:
HPV
-16 대
HPV
-18
표 56:
편평
세포
암종
대
선암종
SCC: 편평 세포 암종; AC: 선암종
실시예
12: 자궁경부 및 유방암 세포주에서의 실시간
PCR
바이오마커
검출
TaqMan® 실시간 PCR을 수행하여, 자궁경부 및 유방암 세포주에서의 MCM2, MCM6 및 MCM7의 발현 수준을 검사하였다.
실험 설계 및 프로토콜
3종의 인간 자궁경부암 세포주, SiHa, Caski 및 HeLa와, 3종의 인간 유방암 세포주 MCF-7, SK-BR3 및 CAMA를 ATCC에서 구입하여, 본 실험에 사용하였다. 세포의 총 RNA를 RNeasy® Protect Mini kit(Qiagen, Valencia, CA)으로 배양한 세포에서 신성하게 추출하고, High-Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems, P/N: 4322171)을 이용하여 랜덤 헥사머가 있는 단일 가닥 cDNA로 변환시켰다. TaqMan® 유니버셜 마스터 믹스(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)를 이용하여 ABI Prism® 7700 서열 검출 시스템상에서, 실시간 PCR을 수행하였다.
MCM2, MCM6 및 MCM7에 특이적인 증폭을 위한 프라이머 및 프로브는 ABI Primer Express™ program, vl.5로 제작하였다. MCM7은 4개의 전사 다변체를 함유한다: 전사 다변체 1(Tl, refseq NM_005916) 및 전사 다변체 2(T2, refseq NM_182776)는 NCBI Entrez 뉴클레오티드 데이타베이스에서 동정하였다. 다변체 T3 및 T4는 NCBI의 모델 마커를 통한 EST 어셈블리로 분석한 바와 같이 택일성 엑손들을 가진다. 프라이머 및 프로브는 다변체 T1 및 T3, T2 및 T4, T2, 및 T3 및 T4 각각을 검출하기 위해 특이적인 T1T3, T2T4, T2 및 T3T4로 제작하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 실시예 10 및 11에 개시되어 있다.
프로브는 5' 염기에 형광 염료 FAM(6-carboxyfluorescein)으로, 3' 염기에 퀀칭 염료 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)로 표지하였다. 내인성 대조군으 로서 18S 라이보좀 RNA를 사용하였다. 18S rRNA 프로브는 형광 염료 VIC로 표지하였다. 발색전 18S rRNA 프라이머/프로브 혼합물은 Applied Biosystems에서 구입하였다. 1O ng의 cDNA를 0.9 μM 및 0.25 μM의 프라이머 및 프로브를 각각 함유하는 총 25 ㎕의 반응 혼합물에 적용하였다. 증폭 조건은 50 ℃에서 2분, 95 ℃에서 10분, 그리고 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 60초로 이루어진 2단계 사이클로, 총 40 사이클이다. 각 반응시 적어도 3개 이상의 주형이 없는 대조군 반응 혼합물을 포함시켰다. 모든 실험은 2배수로 수행하였다. 상대적인 정량 방법을 적용하여, ABI의 사용자 매뉴얼(P/N 4303859)에 따라 CT 값을 토대로 18S 내인성 대조군에 상대적인 표적 유전자의 발현 수준을 계산하였다.
결과
각 바이오마커 결과는 하기 표에 나타낸다.
표 57: 자궁경부 및 유방암 세포주에서의
바이오마커
발현
결론
경부 HeLa 세포주는 MCM2, MCM6 및 MCM7 바이오마커를 낮은 수준으로 발현하는 것으로 확인되었다. 자궁경부 SiHa, 유방 MCM7 및 CAMA 세포주 모두 바이오마커 MCM2, MCM6 및 MCM7를 과다 발현하였다. 자궁경부 Caski 및 유방 SK-BR3 세포주는 MCM7은 과다 발현하였으나, MCM2와 MCM6는 낮은 수준으로 발현하였다.
실시예
13: 일시적
HPVl6
E6
/
E7
유전자
형질검염에
의한 293
세포내 자궁경부
바
이오마커의 발현 유도
TaqMan® 실시간 PCR 분석을 사용하여 HEK 293 세포주 시스템에서의 자궁경부 바이오마커 발현과 위험성이 높은 HPV 발암 유전자 전사간의 연관성을 조사하였다.
실험 설계 및 프로토콜
본 실험에 테트라사이클린 조절성 발현 시스템(T-Rex system, Invitrogen, Inc)을 적용하였다. HPVl6 E2, E6 또는 E7 단백질을 발현하는 T-Rex 벡터를 구축하였다. 돌연변이 E2, E6 또는 E7 유전자를 함유하는 벡터는 음성 대조군으로 활용하였다. 이후, T-Rex 293 세포에 HPV 플라스미드를 형질감염시킨 다음, 4시간, 24시간 및 72시간 동안 테트라사이클린에 의해 HPV 유전자의 발현을 활성화시켰다. 세포의 총 RNA를 RNeasy® 보호 미니 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 형질감염된 세포로부터 추출하고, 고역량의 cDNA 수득 키트(Applied Biosystems, P/N: 4322171)를 이용하여 랜덤 헥사머가 있는 단일 가닥 cDNA로 변환시켰다. TaqMan® 유니버셜 마스터 믹스(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)를 이용하여 ABI Prism® 7700 서열 검출 시스템상에서, 실시간 PCR을 수행하였다.
MCM2, MCM6, MCM7, Topo2A, 사이클린 E, p21, p14, HPV16 E2, E6 및 E7에 특이적인 증폭을 위한 프라이머 및 프로브는 ABI Primer Express™ program, vl.5로 제작하였다. MCM7은 4개의 전사 다변체를 함유한다: 전사 다변체 1(Tl, refseq NM_005916) 및 전사 다변체 2(T2, refseq NM_182776)는 NCBI Entrez 뉴클레오티드 데이타베이스에서 동정하였다. 다변체 T3 및 T4는 NCBI의 모델 메이커를 통한 EST 어셈블리로 분석한 바와 같이 5'-말단 부근에 택이적인 엑손들을 가진다. 프라이머 및 프로브는 다변체 T1 및 T3, T2 및 T4, T2, 및 T3 및 T4 각각을 검출하기 위해 특이적인 T1T3, T2T4, T2 및 T3T4로 제작하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 실시예 10 및 11에 개시되어 있다.
프로브는 5' 염기에 형광 염료 FAM(6-carboxyfluorescein)으로, 3' 염기에 퀀칭 염료 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)로 표지하였다. 내인성 대조군으로서 18S 라이보조말 RNA를 사용하였다. 18S rRNA 프로브는 형광 염료 VIC로 표지하였다. 발색전 18S rRNA 프라이머/프로브 혼합물은 Applied Biosystems에서 구입하였다. 1O ng의 cDNA를 0.9 μM 및 0.25 μM의 프라이머 및 프로브를 각각 함유하는 총 25 ㎕의 반응 혼합물에 적용하였다. 증폭 조건은 50 ℃에서 2분, 95 ℃에서 10분, 그리고 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 60초로 이루어진 2단계 사이클로, 총 40 사이클이다. 각 반응시 적어도 3개 이상의 주형이 없는 대조군 반응 혼합물을 포함시켰다. 모든 실험은 2배수로 수행하였다. 상대적인 정량 방법을 적용하여, ABI의 사용자 매뉴얼(P/N 4303859)에 따라 CT 값을 토대로 18S 내인성 대조군에 상대적인 표적 유전자의 발현 수준을 계산하였다.
결과
HPV16 E2, E6 및 E7 유전자의 T-Rex 293 세포내 발현은 형질감염 시간 경과 에 따라 증가하는 것으로 관찰되었다. T-Rex 293 세포에서의 Topo2A, MCM2, MCM6, MCM7 및 사이클린 E의 mRNA 발현은 형질감염 후 4시간에서 최대 72시간까지 HPVl6 E6 또는 E7 유전자에 의해 현저하게 유도되었다. 그러나, HPV 유전자 형질감염 후 p21과 pl4의 검출된 발현 수준은 증가되지 않았다. E6 또는 E7의 발현은 E2 유전자의 공동-형질감염에 의해 억제되는 것으로 보이지 않았다. 이는, E6 또는 E7의 발현이 천연 HPV 프로모터 대신 외부 CMV 프로모터에 의해 완전히 유도되기 때문이다. 후자는 본 모델 시스템에 존재하지 않는다.
표 58:
Topo2A
표 59:
MCM2
표 60:
MCM6
표 61:
MCM7
표 62:
사이클린
E1
표 63:
p21
표 64:
p14
표 65:
HPV16
E2
표 66:
HPV16
E6
표 67:
HPV16
E7
실시예
14: 슬라이드 전처리
완충액을
이용한 면역세포화학 및 면역조직화학 방법들에서의 항원 접근성 증가
검체 선택 및 시약 설명
동일 환자에서 수득한 쌍을 이룬 세포 및 조직 검체를 바이오마커 과다 발현 을 검출하기 위해 면역분석하였다. ASCUS(3), LSIL(6) 및 HSIL(5)로 분류된 환자의 파라핀 차단 조직 샘플과 SurePath® 세포 검체를 분석하였다. 사용한 시약은 항체 칵테일(세포용), 변형된 항체 칵테일(조직용), 검출 시약, 대조염색제 및 SureSlide® 제조 완충액 1OX(전처리 완충액)이다.
세포 슬라이드 제조 및 자동 면역세포화학
면역세포화학을 위해, 슬라이드 제조 및 전처리를 실시예 5와 같이 수행하였다. 이후, 한가지를 제외하고는 실시예 5에 기재된 바와 같이, 각 세포 검체에 대한 자동 면역세포화학을 수행하였다. 일차 항체 칵테일(MCM2 클론 26H6.19 1:10,000, MCM2 클론 27C5.6 1:800, TOPOIIA 클론 SWT3D1 1:1000) 배양은 본 실험에서 30분으로 줄였다.
조직 슬라이드 제조 및 자동 면역조직화학
각 사례에서, 4 마이크론의 단편을 잘라 70 ℃의 공기 오븐내에서 20분간 건조하거나, 하룻밤 건조시켰다. 단편들은 각각 5분간 크실렌을 3회 교체하여 파라핀을 제고하였다. 이후, 슬라이드는 각각 5분간 무수 알코올내에서 선명하게 하였다. 슬라이드를 물에 넣어 잘 헹구었다. 슬라이드를 미리 열처리한 1X SureSlide 제조 완충액으로 이동시킨 다음, 25분간 스티머내에서 배양하였다. 슬라이드는 완충액이 완저히 교체될때까지 물속에서 서서히 헹구었다. 이후 각 2분간 TBST로 2회 헹구었다.
자동 면역조직화학을 두가지를 제외하고는 실시예 5의 면역세포화학과 같이 수행하였다. 일차 항체 칵테일 배양을 본 실험에서는 30분으로 줄였다. 또한, 일차 항체 칵테일은 다음과 같이 변형하였다(MCM2 클론 26H6.19 1:4,000, MCM2 클론 27C5.6 1:200, TOPOIIA 클론 SWT3D1 1:400).
결과
RUO 시약의 사용으로 조직 및 세포 검체 모두에서 사용한 염색 패턴이 관찰되었다. 구체적으로, SureSlide® 제조 완충액, 검출 시약 및 대조 시약을 이용한 조직 및 세포 검체 모두에 대한 면역염색 능력이 성공적으로 입증되었다.
표 68:
바이오마커
뉴클레오티드 및 아미노산 서열 정보
상기 설명 및 실시예로, 당업자는 본 발명의 방법이 기존의 실무에 비해 높은 등급의 질환을 나이와 상관없이 탁월하게 검출가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 방법은 하기와 같이 특정한 용도를 가질 수 있다:
- 30세 이상의 여성에서, 테스트는 HPV 양성이나 ASCUS+ 세포 결과를 반영할 수 있다
- 30세 이하의 여성에서, 테스트는 높은 등급의 자궁경부 질환 검출을 위해 세포학을 조합하여 사용할 수 있다.
- 30세 이상의 여성에서, 테스트는 높은 등급의 자궁경부 질환 검출을 위해 세포학을 조합하여 사용할 수도 있다.
- 30세 이하의 여성에서, 테스트는 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출하기 위한 일차 스크리닝으로서 사용할 수 있다.
- 30세 이상의 여성에서, 테스트는 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출하기 위한 일차 스크리닝으로서 사용할 수 있다.
- 테스트는 30세 이하의 여성에서 Pap 스미어 방법의 대안책이 될 수 있다.
- 궁극적으로, 테스트는 나이와는 무관하게, Pap 스미어 방법의 대안책이 될 수 있다.
본 발명의 실시로 인한, 그외 잠재적인 이점은 다음과 같다:
- 30세 이상의 NIL/HPV 양성인 여성을 대상으로 조직학적으로 높은 등급의 비정상을 검출한다.
- DNA+Pap 테스트에 양성인 30세 이상의 여성에게서 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출하는데 있어 특이도가 탁월하다.
- 나이와는 무관하게, ASC-US, ASC-H 및 LSIL에 속하는 여성에게서 높은 등급 자궁경부 질환을 검출하는데 탁월하다.
- HSIL에 속하는 높은 등급의 자궁경부 질환 검출시 특이도가 탁월하다.
- 30세 이하의 여성을 대상으로 세포를 기초로한 진단과 함께 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출한다.
- 나이와 무관하게 세포를 기초로한 진단과 함께 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출한다.
- 30세 이하의 여성을 대상으로 일차 스크리닝으로서 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출하는데 있어 향상된 특이도를 가진다.
- 나이와 무관하게 일차 스크리닝으로서 높은 등급의 자궁경부 질환을 검출하는데 있어 향상된 특이도를 가진다.
- 자궁경부 질환의 동정, 및 HPV 감염과 높은 등급 자궁경부 질환을 구별한다.
- 허용가능한 분석 수행을 수동 분석 또는 자동 현미경을 통한 보조 분석으로 확립할 수 있다.
명세서에 기재된 모든 공개물 및 특허 출원들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자 수준을 나타낸다. 모든 공개물 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물 또는 특허 출원이 구체적이고도 개별적으로 원용에 의해 통합되는 것으로 기재된 바와 같이 동일한 범위로 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
전술한 발명은 이해를 명확하게 하기 위해 예와 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명하지만, 임의 변형 및 수정이 첨부된 예의 범위내에서 실시될 수 있음은 자명한 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Fischer, Timothy J.
Malinowski, Douglas P.
Taylor, Adriann J.
Parker, Margaret R.
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE
DETECTION OF CERVICAL DISEASE
<130> 46143/290269
<150> 60/556,495
<151> 2004-03-24
<160> 90
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 1958
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
agcagccggc gcggccgcca gcgcggtgta gggggcaggc gcggatcccg ccaccgccgc 60
gcgctcggcc cgccgactcc cggcgccgcc gccgccactg ccgtcgccgc cgccgcctgc 120
cgggactgga gcgcgccgtc cgccgcggac aagaccctgg cctcaggccg gagcagcccc 180
atcatgccga gggagcgcag ggagcgggat gcgaaggagc gggacaccat gaaggaggac 240
ggcggcgcgg agttctcggc tcgctccagg aagaggaagg caaacgtgac cgtttttttg 300
caggatccag atgaagaaat ggccaaaatc gacaggacgg cgagggacca gtgtgggagc 360
cagccttggg acaataatgc agtctgtgca gacccctgct ccctgatccc cacacctgac 420
aaagaagatg atgaccgggt ttacccaaac tcaacgtgca agcctcggat tattgcacca 480
tccagaggct ccccgctgcc tgtactgagc tgggcaaata gagaggaagt ctggaaaatc 540
atgttaaaca aggaaaagac atacttaagg gatcagcact ttcttgagca acaccctctt 600
ctgcagccaa aaatgcgagc aattcttctg gattggttaa tggaggtgtg tgaagtctat 660
aaacttcaca gggagacctt ttacttggca caagatttct ttgaccggta tatggcgaca 720
caagaaaatg ttgtaaaaac tcttttacag cttattggga tttcatcttt atttattgca 780
gccaaacttg aggaaatcta tcctccaaag ttgcaccagt ttgcgtatgt gacagatgga 840
gcttgttcag gagatgaaat tctcaccatg gaattaatga ttatgaaggc ccttaagtgg 900
cgtttaagtc ccctgactat tgtgtcctgg ctgaatgtat acatgcaggt tgcatatcta 960
aatgacttac atgaagtgct actgccgcag tatccccagc aaatctttat acagattgca 1020
gagctgttgg atctctgtgt cctggatgtt gactgccttg aatttcctta tggtatactt 1080
gctgcttcgg ccttgtatca tttctcgtca tctgaattga tgcaaaaggt ttcagggtat 1140
cagtggtgcg acatagagaa ctgtgtcaag tggatggttc catttgccat ggttataagg 1200
gagacgggga gctcaaaact gaagcacttc aggggcgtcg ctgatgaaga tgcacacaac 1260
atacagaccc acagagacag cttggatttg ctggacaaag cccgagcaaa gaaagccatg 1320
ttgtctgaac aaaatagggc ttctcctctc cccagtgggc tcctcacccc gccacagagc 1380
ggtaagaagc agagcagcgg gccggaaatg gcgtgaccac cccatccttc tccaccaaag 1440
acagttgcgc gcctgctcca cgttctcttc tgtctgttgc agcggaggcg tgcgtttgct 1500
tttacagata tctgaatgga agagtgtttc ttccacaaca gaagtatttc tgtggatggc 1560
atcaaacagg gcaaagtgtt ttttattgaa tgcttatagg ttttttttaa ataagtgggt 1620
caagtacacc agccacctcc agacaccagt gcgtgctccc gatgctgcta tggaaggtgc 1680
tacttgacct aagggactcc cacaacaaca aaagcttgaa gctgtggagg gccacggtgg 1740
cgtggctctc ctcgcaggtg ttctgggctc cgttgtacca agtggagcag gtggttgcgg 1800
gcaagcgttg tgcagagccc atagccagct gggcaggggg ctgccctctc cacattatca 1860
gttgacagtg tacaatgcct ttgatgaact gttttgtaag tgctgctata tctatccatt 1920
ttttaataaa gataatactg tttttgagac aaaaaaaa 1958
<210> 2
<211> 410
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Pro Arg Glu Arg Arg Glu Arg Asp Ala Lys Glu Arg Asp Thr Met
1 5 10 15
Lys Glu Asp Gly Gly Ala Glu Phe Ser Ala Arg Ser Arg Lys Arg Lys
20 25 30
Ala Asn Val Thr Val Phe Leu Gln Asp Pro Asp Glu Glu Met Ala Lys
35 40 45
Ile Asp Arg Thr Ala Arg Asp Gln Cys Gly Ser Gln Pro Trp Asp Asn
50 55 60
Asn Ala Val Cys Ala Asp Pro Cys Ser Leu Ile Pro Thr Pro Asp Lys
65 70 75 80
Glu Asp Asp Asp Arg Val Tyr Pro Asn Ser Thr Cys Lys Pro Arg Ile
85 90 95
Ile Ala Pro Ser Arg Gly Ser Pro Leu Pro Val Leu Ser Trp Ala Asn
100 105 110
Arg Glu Glu Val Trp Lys Ile Met Leu Asn Lys Glu Lys Thr Tyr Leu
115 120 125
Arg Asp Gln His Phe Leu Glu Gln His Pro Leu Leu Gln Pro Lys Met
130 135 140
Arg Ala Ile Leu Leu Asp Trp Leu Met Glu Val Cys Glu Val Tyr Lys
145 150 155 160
Leu His Arg Glu Thr Phe Tyr Leu Ala Gln Asp Phe Phe Asp Arg Tyr
165 170 175
Met Ala Thr Gln Glu Asn Val Val Lys Thr Leu Leu Gln Leu Ile Gly
180 185 190
Ile Ser Ser Leu Phe Ile Ala Ala Lys Leu Glu Glu Ile Tyr Pro Pro
195 200 205
Lys Leu His Gln Phe Ala Tyr Val Thr Asp Gly Ala Cys Ser Gly Asp
210 215 220
Glu Ile Leu Thr Met Glu Leu Met Ile Met Lys Ala Leu Lys Trp Arg
225 230 235 240
Leu Ser Pro Leu Thr Ile Val Ser Trp Leu Asn Val Tyr Met Gln Val
245 250 255
Ala Tyr Leu Asn Asp Leu His Glu Val Leu Leu Pro Gln Tyr Pro Gln
260 265 270
Gln Ile Phe Ile Gln Ile Ala Glu Leu Leu Asp Leu Cys Val Leu Asp
275 280 285
Val Asp Cys Leu Glu Phe Pro Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Ser Ala Leu
290 295 300
Tyr His Phe Ser Ser Ser Glu Leu Met Gln Lys Val Ser Gly Tyr Gln
305 310 315 320
Trp Cys Asp Ile Glu Asn Cys Val Lys Trp Met Val Pro Phe Ala Met
325 330 335
Val Ile Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Leu Lys His Phe Arg Gly Val
340 345 350
Ala Asp Glu Asp Ala His Asn Ile Gln Thr His Arg Asp Ser Leu Asp
355 360 365
Leu Leu Asp Lys Ala Arg Ala Lys Lys Ala Met Leu Ser Glu Gln Asn
370 375 380
Arg Ala Ser Pro Leu Pro Ser Gly Leu Leu Thr Pro Pro Gln Ser Gly
385 390 395 400
Lys Lys Gln Ser Ser Gly Pro Glu Met Ala
405 410
<210> 3
<211> 1787
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gtgctcaccc ggcccggtgc cacccgggtc cacagggatg cgaaggagcg ggacaccatg 60
aaggaggacg gcggcgcgga gttctcggct cgctccagga agaggaaggc aaacgtgacc 120
gtttttttgc aggatccaga tgaagaaatg gccaaaatcg acaggacggc gagggaccag 180
tgtgggagcc agccttggga caataatgca gtctgtgcag acccctgctc cctgatcccc 240
acacctgaca aagaagatga tgaccgggtt tacccaaact caacgtgcaa gcctcggatt 300
attgcaccat ccagaggctc cccgctgcct gtactgagct gggcaaatag agaggaagtc 360
tggaaaatca tgttaaacaa ggaaaagaca tacttaaggg atcagcactt tcttgagcaa 420
caccctcttc tgcagccaaa aatgcgagca attcttctgg attggttaat ggaggtgtgt 480
gaagtctata aacttcacag ggagaccttt tacttggcac aagatttctt tgaccggtat 540
atggcgacac aagaaaatgt tgtaaaaact cttttacagc ttattgggat ttcatcttta 600
tttattgcag ccaaacttga ggaaatctat cctccaaagt tgcaccagtt tgcgtatgtg 660
acagatggag cttgttcagg agatgaaatt ctcaccatgg aattaatgat tatgaaggcc 720
cttaagtggc gtttaagtcc cctgactatt gtgtcctggc tgaatgtata catgcaggtt 780
gcatatctaa atgacttaca tgaagtgcta ctgccgcagt atccccagca aatctttata 840
cagattgcag agctgttgga tctctgtgtc ctggatgttg actgccttga atttccttat 900
ggtatacttg ctgcttcggc cttgtatcat ttctcgtcat ctgaattgat gcaaaaggtt 960
tcagggtatc agtggtgcga catagagaac tgtgtcaagt ggatggttcc atttgccatg 1020
gttataaggg agacggggag ctcaaaactg aagcacttca ggggcgtcgc tgatgaagat 1080
gcacacaaca tacagaccca cagagacagc ttggatttgc tggacaaagc ccgagcaaag 1140
aaagccatgt tgtctgaaca aaatagggct tctcctctcc ccagtgggct cctcaccccg 1200
ccacagagcg gtaagaagca gagcagcggg ccggaaatgg cgtgaccacc ccatccttct 1260
ccaccaaaga cagttgcgcg cctgctccac gttctcttct gtctgttgca gcggaggcgt 1320
gcgtttgctt ttacagatat ctgaatggaa gagtgtttct tccacaacag aagtatttct 1380
gtggatggca tcaaacaggg caaagtgttt tttattgaat gcttataggt tttttttaaa 1440
taagtgggtc aagtacacca gccacctcca gacaccagtg cgtgctcccg atgctgctat 1500
ggaaggtgct acttgaccta agggactccc acaacaacaa aagcttgaag ctgtggaggg 1560
ccacggtggc gtggctctcc tcgcaggtgt tctgggctcc gttgtaccaa gtggagcagg 1620
tggttgcggg caagcgttgt gcagagccca tagccagctg ggcagggggc tgccctctcc 1680
acattatcag ttgacagtgt acaatgcctt tgatgaactg ttttgtaagt gctgctatat 1740
ctatccattt tttaataaag ataatactgt ttttgagaca aaaaaaa 1787
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<211> 395
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Lys Glu Asp Gly Gly Ala Glu Phe Ser Ala Arg Ser Arg Lys Arg
1 5 10 15
Lys Ala Asn Val Thr Val Phe Leu Gln Asp Pro Asp Glu Glu Met Ala
20 25 30
Lys Ile Asp Arg Thr Ala Arg Asp Gln Cys Gly Ser Gln Pro Trp Asp
35 40 45
Asn Asn Ala Val Cys Ala Asp Pro Cys Ser Leu Ile Pro Thr Pro Asp
50 55 60
Lys Glu Asp Asp Asp Arg Val Tyr Pro Asn Ser Thr Cys Lys Pro Arg
65 70 75 80
Ile Ile Ala Pro Ser Arg Gly Ser Pro Leu Pro Val Leu Ser Trp Ala
85 90 95
Asn Arg Glu Glu Val Trp Lys Ile Met Leu Asn Lys Glu Lys Thr Tyr
100 105 110
Leu Arg Asp Gln His Phe Leu Glu Gln His Pro Leu Leu Gln Pro Lys
115 120 125
Met Arg Ala Ile Leu Leu Asp Trp Leu Met Glu Val Cys Glu Val Tyr
130 135 140
Lys Leu His Arg Glu Thr Phe Tyr Leu Ala Gln Asp Phe Phe Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Met Ala Thr Gln Glu Asn Val Val Lys Thr Leu Leu Gln Leu Ile
165 170 175
Gly Ile Ser Ser Leu Phe Ile Ala Ala Lys Leu Glu Glu Ile Tyr Pro
180 185 190
Pro Lys Leu His Gln Phe Ala Tyr Val Thr Asp Gly Ala Cys Ser Gly
195 200 205
Asp Glu Ile Leu Thr Met Glu Leu Met Ile Met Lys Ala Leu Lys Trp
210 215 220
Arg Leu Ser Pro Leu Thr Ile Val Ser Trp Leu Asn Val Tyr Met Gln
225 230 235 240
Val Ala Tyr Leu Asn Asp Leu His Glu Val Leu Leu Pro Gln Tyr Pro
245 250 255
Gln Gln Ile Phe Ile Gln Ile Ala Glu Leu Leu Asp Leu Cys Val Leu
260 265 270
Asp Val Asp Cys Leu Glu Phe Pro Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Ser Ala
275 280 285
Leu Tyr His Phe Ser Ser Ser Glu Leu Met Gln Lys Val Ser Gly Tyr
290 295 300
Gln Trp Cys Asp Ile Glu Asn Cys Val Lys Trp Met Val Pro Phe Ala
305 310 315 320
Met Val Ile Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Leu Lys His Phe Arg Gly
325 330 335
Val Ala Asp Glu Asp Ala His Asn Ile Gln Thr His Arg Asp Ser Leu
340 345 350
Asp Leu Leu Asp Lys Ala Arg Ala Lys Lys Ala Met Leu Ser Glu Gln
355 360 365
Asn Arg Ala Ser Pro Leu Pro Ser Gly Leu Leu Thr Pro Pro Gln Ser
370 375 380
Gly Lys Lys Gln Ser Ser Gly Pro Glu Met Ala
385 390 395
<210> 5
<211> 2748
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
agcgggtgcg gggcgggacc ggcccggcct atatattggg ttggcgccgg cgccagctga 60
gccgagcggt agctggtctg gcgaggtttt atacacctga aagaagagaa tgtcaagacg 120
aagtagccgt ttacaagcta agcagcagcc ccagcccagc cagacggaat ccccccaaga 180
agcccagata atccaggcca agaagaggaa aactacccag gatgtcaaaa aaagaagaga 240
ggaggtcacc aagaaacatc agtatgaaat taggaattgt tggccacctg tattatctgg 300
ggggatcagt ccttgcatta tcattgaaac acctcacaaa gaaataggaa caagtgattt 360
ctccagattt acaaattaca gatttaaaaa tctttttatt aatccttcac ctttgcctga 420
tttaagctgg ggatgttcaa aagaagtctg gctaaacatg ttaaaaaagg agagcagata 480
tgttcatgac aaacattttg aagttctgca ttctgacttg gaaccacaga tgaggtccat 540
acttctagac tggcttttag aggtatgtga agtatacaca cttcataggg aaacatttta 600
tcttgcacaa gacttttttg atagatttat gttgacacaa aaggatataa ataaaaatat 660
gcttcaactc attggaatta cctcattatt cattgcttcc aaacttgagg aaatctatgc 720
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ctcctggcta aatctctttc tccaagttga tgctcttaaa gatgctccta aagttcttct 900
acctcagtat tctcaggaaa cattcattca aatagctcag cttttagatc tgtgtattct 960
agccattgat tcattagagt tccagtacag aatactgact gctgctgcct tgtgccattt 1020
tacctccatt gaagtggtta agaaagcctc aggtttggag tgggacagta tttcagaatg 1080
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gacttttaag aagattccta tggaagacag acataatatc cagacacata caaactattt 1200
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agtgtgcaat ggaggcatta tgacaccacc gaagagcact gaaaaaccac caggaaaaca 1320
ctaaagaaga taactaagca aacaagttgg aattcaccaa gattgggtag aactggtatc 1380
actgaactac taaagtttta cagaaagtag tgctgtgatt gattgcccta gccaattcac 1440
aagttacact gccattctga ttttaaaact tacaattggc actaaagaat acatttaatt 1500
atttcctatg ttagctgtta aagaaacagc aggacttgtt tacaaagatg tcttcattcc 1560
caaggttact ggatagaagc caaccacagt ctataccata gcaatgtttt tcctttaatc 1620
cagtgttact gtgtttatct tgataaacta ggaattttgt cactggagtt ttggactgga 1680
taagtgctac cttaaagggt atactaagtg atacagtact ttgaatctag ttgttagatt 1740
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gtgctctaaa cagtgggagt accaaagaaa ttataaacaa gataaatgct gtggctcctt 2040
cctaactggg gctttcttga catgtaggtt gcttggtaat aacctttttg tatatcacaa 2100
tttgggtgaa aaacttaagt accctttcaa actatttata tgaggaagtc actttactac 2160
tctaagatat ccctaaggaa tttttttttt taatttagtg tgactaaggc tttatttatg 2220
tttgtgaaac tgttaaggtc ctttctaaat tcctccattg tgagataagg acagtgtcaa 2280
agtgataaag cttaacactt gacctaaact tctattttct taaggaagaa gagtattaaa 2340
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gtattatata aacttaacct tttaatactg tttattttta gcccattgtt taaaaaataa 2700
aagttaaaaa aatttaactg cttaaaagta aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2748
<210> 6
<211> 404
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
Val Trp Leu Asn Met Leu Lys Lys Glu Ser Arg Tyr Val His Asp Lys
115 120 125
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180 185 190
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275 280 285
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<212> DNA
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Leu Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala
100 105 110
Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu
115 120 125
Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu
130 135 140
Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp
145 150 155 160
Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp
165 170 175
Leu Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp Val Ser Met Ala Gly Pro Arg
180 185 190
Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn Phe Leu Arg Thr His Val Asp
195 200 205
Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys
210 215 220
Glu Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg
225 230 235 240
Glu His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu
245 250 255
Gln Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu Val Val Leu Ala Met Tyr Pro
260 265 270
Lys Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile His Val Arg Ile Ser His Leu
275 280 285
Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Gln Leu His Leu Asn Gln
290 295 300
Leu Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro
305 310 315 320
Gln Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu
325 330 335
Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys
340 345 350
Pro Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Val Asn Met Glu Glu Thr
355 360 365
Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
Val Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala
385 390 395 400
Asp Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly
405 410 415
Ile Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe
420 425 430
Pro Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala Asn His Val Ala Lys Lys Asp
435 440 445
Asn Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr Asp Glu Asp Val Lys Met Ile
450 455 460
Thr Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser
465 470 475 480
Ile Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala
485 490 495
Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys Asn Pro Gly Gly Lys His Lys
500 505 510
Val Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala
515 520 525
Lys Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile
530 535 540
Phe Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val
545 550 555 560
Gln Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu
565 570 575
Val Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met
580 585 590
Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser
595 600 605
Ile Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys
610 615 620
Thr Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser
625 630 635 640
Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg
645 650 655
Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp Thr Val Asp Pro Val Gln Asp
660 665 670
Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly Ser His Val Arg His His Pro
675 680 685
Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro
690 695 700
Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu
705 710 715 720
Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu Arg Val His Pro Lys Leu Asn
725 730 735
Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys
740 745 750
Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro Ile Thr Val Arg His Ile Glu
755 760 765
Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His Ala Arg Ile His Leu Arg Asp
770 775 780
Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met Ala Ile Arg Val Met Leu Glu
785 790 795 800
Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser Val Met Arg Ser Met Arg Lys
805 810 815
Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu
820 825 830
Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg
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Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp
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Leu Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn Ile His Asn Leu Ser Ala Phe
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Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn Lys Phe Ser His Asp Leu Lys
885 890 895
Arg Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe
900
<210> 13
<211> 2821
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
cgccccttcc cagccccaag ggtctaggat acagtctttg tagatgagcg ggtccccctt 60
ggaggacaga atgaagaatt gggaaatcat ggccgttctg gagagtagac aagaagacgg 120
cgaaagtcgg gcctgccccg ccctgcggcc ccggaacaaa agaacgcgtg tgcgctggcc 180
ctttaagagc gattctcctc cgcccgcgcc agctcggacc gcgggaaacc cggcgcctgc 240
actaccccgc ccggagattc ccttccgacg cccgcaccgc ctccccgtca ctcattctag 300
gcccgcacgg tgattggctt gcggctagcg ggaggtgaag aaggccgcct tgtccgattg 360
gcccgcacgc agtggcgccg gtcacgtggg gggcgacgtt tcgcgccaat ttcggttggc 420
cggccacagt ccaccgcgcg gagattctca gcttccccag gagcaagacc tctgagcccg 480
ccaagcgcgg ccgcacggcc ctcggcagcg atggcactga aggactacgc gctagagaag 540
gaaaaggtta agaagttctt acaagagttc taccaggatg atgaactcgg gaagaagcag 600
ttcaagtatg ggaaccagtt ggttcggctg gctcatcggg aacaggtggc tctgtatgtg 660
gacctggacg acgtagccga ggatgacccc gagttggtgg actcaatttg tgagaatgcc 720
aggcgctacg cgaagctctt tgctgatgcc gtacaagagc tgctgcctca gtacaaggag 780
agggaagtgg taaataaaga tgtcctggac gtttacattg agcatcggct aatgatggag 840
cagcggagtc gggaccctgg gatggtccga agcccccaga accagtaccc tgctgaactc 900
atgcgcagat ttgagctgta ttttcaaggc cctagcagca acaagcctcg tgtgatccgg 960
gaagtgcggg ctgactctgt ggggaagttg gtaactgtgc gtggaatcgt cactcgtgtc 1020
tctgaagtca aacccaagat ggtggtggcc acttacactt gtgaccagtg tggggcagag 1080
acctaccagc cgatccagtc tcccactttc atgcctctga tcatgtgccc aagccaggag 1140
tgccaaacca accgctcagg agggcggctg tatctgcaga cacggggctc cagattcatc 1200
aaattccagg agatgaagat gcaagaacat agtgatcagg tgcctgtggg aaatatccct 1260
cgtagtatca cggtgctggt agaaggagag aacacaagga ttgcccagcc tggagaccac 1320
gtcagcgtca ctggtatttt cttgccaatc ctgcgcactg ggttccgaca ggtggtacag 1380
ggtttactct cagaaaccta cctggaagcc catcggattg tgaagatgaa caagagtgag 1440
gatgatgagt ctggggctgg agagctcacc agggaggagc tgaggcaaat tgcagaggag 1500
gatttctacg aaaagctggc agcttcaatc gccccagaaa tatacgggca tgaagatgtg 1560
aagaaggcac tgctgctcct gctagtcggg ggtgtggacc agtctcctcg aggcatgaaa 1620
atccggggca acatcaacat ctgtctgatg ggggatcctg gtgtggccaa gtctcagctc 1680
ctgtcataca ttgatcgact ggcgcctcgc agccagtaca caacaggccg gggctcctca 1740
ggagtggggc ttacggcagc tgtgctgaga gactccgtga gtggagaact gaccttagag 1800
ggtggggccc tggtgctggc tgaccagggt gtgtgctgca ttgatgagtt cgacaagatg 1860
gctgaggccg accgcacagc catccacgag gtcatggagc agcagaccat ctccattgcc 1920
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gcctacgggc gctacaaccc tcgccgcagc ctggagcaga acatacagct acctgctgca 2040
ctgctctccc ggtttgacct cctctggctg attcaggacc ggcccgaccg agacaatgac 2100
ctacggttgg cccagcacat cacctatgtg caccagcaca gccggcagcc cccctcccag 2160
tttgaacctc tggacatgaa gctcatgagg cgttacatag ccatgtgccg cgagaagcag 2220
cccatggtgc cagagtctct ggctgactac atcacagcag catacgtgga gatgaggcga 2280
gaggcttggg ctagtaagga tgccacctat acttctgccc ggaccctgct ggctatcctg 2340
cgcctttcca ctgctctggc acgtctgaga atggtggatg tggtggagaa agaagatgtg 2400
aatgaagcca tcaggctaat ggagatgtca aaggactctc ttctaggaga caaggggcag 2460
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c 2821
<210> 14
<211> 719
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Ala Leu Lys Asp Tyr Ala Leu Glu Lys Glu Lys Val Lys Lys Phe
1 5 10 15
Leu Gln Glu Phe Tyr Gln Asp Asp Glu Leu Gly Lys Lys Gln Phe Lys
20 25 30
Tyr Gly Asn Gln Leu Val Arg Leu Ala His Arg Glu Gln Val Ala Leu
35 40 45
Tyr Val Asp Leu Asp Asp Val Ala Glu Asp Asp Pro Glu Leu Val Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Glu Asn Ala Arg Arg Tyr Ala Lys Leu Phe Ala Asp Ala
65 70 75 80
Val Gln Glu Leu Leu Pro Gln Tyr Lys Glu Arg Glu Val Val Asn Lys
85 90 95
Asp Val Leu Asp Val Tyr Ile Glu His Arg Leu Met Met Glu Gln Arg
100 105 110
Ser Arg Asp Pro Gly Met Val Arg Ser Pro Gln Asn Gln Tyr Pro Ala
115 120 125
Glu Leu Met Arg Arg Phe Glu Leu Tyr Phe Gln Gly Pro Ser Ser Asn
130 135 140
Lys Pro Arg Val Ile Arg Glu Val Arg Ala Asp Ser Val Gly Lys Leu
145 150 155 160
Val Thr Val Arg Gly Ile Val Thr Arg Val Ser Glu Val Lys Pro Lys
165 170 175
Met Val Val Ala Thr Tyr Thr Cys Asp Gln Cys Gly Ala Glu Thr Tyr
180 185 190
Gln Pro Ile Gln Ser Pro Thr Phe Met Pro Leu Ile Met Cys Pro Ser
195 200 205
Gln Glu Cys Gln Thr Asn Arg Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Leu Gln Thr
210 215 220
Arg Gly Ser Arg Phe Ile Lys Phe Gln Glu Met Lys Met Gln Glu His
225 230 235 240
Ser Asp Gln Val Pro Val Gly Asn Ile Pro Arg Ser Ile Thr Val Leu
245 250 255
Val Glu Gly Glu Asn Thr Arg Ile Ala Gln Pro Gly Asp His Val Ser
260 265 270
Val Thr Gly Ile Phe Leu Pro Ile Leu Arg Thr Gly Phe Arg Gln Val
275 280 285
Val Gln Gly Leu Leu Ser Glu Thr Tyr Leu Glu Ala His Arg Ile Val
290 295 300
Lys Met Asn Lys Ser Glu Asp Asp Glu Ser Gly Ala Gly Glu Leu Thr
305 310 315 320
Arg Glu Glu Leu Arg Gln Ile Ala Glu Glu Asp Phe Tyr Glu Lys Leu
325 330 335
Ala Ala Ser Ile Ala Pro Glu Ile Tyr Gly His Glu Asp Val Lys Lys
340 345 350
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Gly Gly Val Asp Gln Ser Pro Arg Gly
355 360 365
Met Lys Ile Arg Gly Asn Ile Asn Ile Cys Leu Met Gly Asp Pro Gly
370 375 380
Val Ala Lys Ser Gln Leu Leu Ser Tyr Ile Asp Arg Leu Ala Pro Arg
385 390 395 400
Ser Gln Tyr Thr Thr Gly Arg Gly Ser Ser Gly Val Gly Leu Thr Ala
405 410 415
Ala Val Leu Arg Asp Ser Val Ser Gly Glu Leu Thr Leu Glu Gly Gly
420 425 430
Ala Leu Val Leu Ala Asp Gln Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp
435 440 445
Lys Met Ala Glu Ala Asp Arg Thr Ala Ile His Glu Val Met Glu Gln
450 455 460
Gln Thr Ile Ser Ile Ala Lys Ala Gly Ile Leu Thr Thr Leu Asn Ala
465 470 475 480
Arg Cys Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Tyr Gly Arg Tyr Asn
485 490 495
Pro Arg Arg Ser Leu Glu Gln Asn Ile Gln Leu Pro Ala Ala Leu Leu
500 505 510
Ser Arg Phe Asp Leu Leu Trp Leu Ile Gln Asp Arg Pro Asp Arg Asp
515 520 525
Asn Asp Leu Arg Leu Ala Gln His Ile Thr Tyr Val His Gln His Ser
530 535 540
Arg Gln Pro Pro Ser Gln Phe Glu Pro Leu Asp Met Lys Leu Met Arg
545 550 555 560
Arg Tyr Ile Ala Met Cys Arg Glu Lys Gln Pro Met Val Pro Glu Ser
565 570 575
Leu Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Ala Tyr Val Glu Met Arg Arg Glu Ala
580 585 590
Trp Ala Ser Lys Asp Ala Thr Tyr Thr Ser Ala Arg Thr Leu Leu Ala
595 600 605
Ile Leu Arg Leu Ser Thr Ala Leu Ala Arg Leu Arg Met Val Asp Val
610 615 620
Val Glu Lys Glu Asp Val Asn Glu Ala Ile Arg Leu Met Glu Met Ser
625 630 635 640
Lys Asp Ser Leu Leu Gly Asp Lys Gly Gln Thr Ala Arg Thr Gln Arg
645 650 655
Pro Ala Asp Val Ile Phe Ala Thr Val Arg Glu Leu Val Ser Gly Gly
660 665 670
Arg Ser Val Arg Phe Ser Glu Ala Glu Gln Arg Cys Val Ser Arg Gly
675 680 685
Phe Thr Pro Ala Gln Phe Gln Ala Ala Leu Asp Glu Tyr Glu Glu Leu
690 695 700
Asn Val Trp Gln Val Asn Ala Ser Arg Thr Arg Ile Thr Phe Val
705 710 715
<210> 15
<211> 2900
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
agtgtcgtgt aaacagtgtc cttccgcgcg gcggccgcgg agagagctgc ggcccggggg 60
ggcgtgcctg ggatccggag cttcgctcgg gcccgggaaa ggcggcagtg ggctgggatc 120
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cccgagctgt gaagcggctg gaatccgggc ccatgtgctt ctttgtttac taagagcgga 240
agcgatggcg ggagcggggg tggggtgcgg tggcggggtg cggtggcgga ggtcccggtg 300
aaatcagggg ctaaggggac ccaaagaagg cgggggatca taggggtgga aagaaagctg 360
agaaccttga gaccggagtg tgaggggcca acggggaagg gcgctagaat tttaaactaa 420
agtagggacc ggaattcccc tggggagatg ttggatggcc ctgtgcactg ccacgggctc 480
tttattcttc gctggttaga aacagacttg tgaaaaagag ttatgcccac tttggggaga 540
cttcgaaaag gttaagaagt tcttacaaga gttctaccag gatgatgaac tcgggaagaa 600
gcagttcaag tatgggaacc agttggttcg gctggctcat cgggaacagg tggctctgta 660
tgtggacctg gacgacgtag ccgaggatga ccccgagttg gtggactcaa tttgtgagaa 720
tgccaggcgc tacgcgaagc tctttgctga tgccgtacaa gagctgctgc ctcagtacaa 780
ggagagggaa gtggtaaata aagatgtcct ggacgtttac attgagcatc ggctaatgat 840
ggagcagcgg agtcgggacc ctgggatggt ccgaagcccc cagaaccagt accctgctga 900
actcatgcgc agattgtgag tggtctctgt cgggaaagat gtagggattg gttctccagg 960
atcttgtttg tgactgtttt ctccccttag tgagctgtat tttcaaggcc ctagcagcaa 1020
caagcctcgt gtgatccggg aagtgcgggc tgactctgtg gggaagttgg taactgtgcg 1080
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gcctgtggga aatatccctc gtagtatcac ggtgctggta gaaggagaga acacaaggat 1380
tgcccagcct ggagaccacg tcagcgtcac tggtattttc ttgccaatcc tgcgcactgg 1440
gttccgacag gtggtacagg gtttactctc agaaacctac ctggaagccc atcggattgt 1500
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atacgggcat gaagatgtga agaaggcact gctgctcctg ctagtcgggg gtgtggacca 1680
gtctcctcga ggcatgaaaa tccggggcaa catcaacatc tgtctgatgg gggatcctgg 1740
tgtggccaag tctcagctcc tgtcatacat tgatcgactg gcgcctcgca gccagtacac 1800
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gcagaccatc tccattgcca aggccggcat tctcaccaca ctcaatgccc gctgctccat 2040
cctggctgcc gccaaccctg cctacgggcg ctacaaccct cgccgcagcc tggagcagaa 2100
catacagcta cctgctgcac tgctctcccg gtttgacctc ctctggctga ttcaggaccg 2160
gcccgaccga gacaatgacc tacggttggc ccagcacatc acctatgtgc accagcacag 2220
ccggcagccc ccctcccagt ttgaacctct ggacatgaag ctcatgaggc gttacatagc 2280
catgtgccgc gagaagcagc ccatggtgcc agagtctctg gctgactaca tcacagcagc 2340
atacgtggag atgaggcgag aggcttgggc tagtaaggat gccacctata cttctgcccg 2400
gaccctgctg gctatcctgc gcctttccac tgctctggca cgtctgagaa tggtggatgt 2460
ggtggagaaa gaagatgtga atgaagccat caggctaatg gagatgtcaa aggactctct 2520
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cgtccgtgaa ctggtctcag ggggccgaag tgtccggttc tctgaggcag agcagcgctg 2640
tgtatctcgt ggcttcacac ccgcccagtt ccaggcggct ctggatgaat atgaggagct 2700
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<210> 16
<211> 543
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Val Val Ala Thr Tyr Thr Cys Asp Gln Cys Gly Ala Glu Thr Tyr
1 5 10 15
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Gln Glu Cys Gln Thr Asn Arg Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Leu Gln Thr
35 40 45
Arg Gly Ser Arg Phe Ile Lys Phe Gln Glu Met Lys Met Gln Glu His
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Gly Gly Val Asp Gln Ser Pro Arg Gly
180 185 190
Met Lys Ile Arg Gly Asn Ile Asn Ile Cys Leu Met Gly Asp Pro Gly
195 200 205
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210 215 220
Ser Gln Tyr Thr Thr Gly Arg Gly Ser Ser Gly Val Gly Leu Thr Ala
225 230 235 240
Ala Val Leu Arg Asp Ser Val Ser Gly Glu Leu Thr Leu Glu Gly Gly
245 250 255
Ala Leu Val Leu Ala Asp Gln Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp
260 265 270
Lys Met Ala Glu Ala Asp Arg Thr Ala Ile His Glu Val Met Glu Gln
275 280 285
Gln Thr Ile Ser Ile Ala Lys Ala Gly Ile Leu Thr Thr Leu Asn Ala
290 295 300
Arg Cys Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Tyr Gly Arg Tyr Asn
305 310 315 320
Pro Arg Arg Ser Leu Glu Gln Asn Ile Gln Leu Pro Ala Ala Leu Leu
325 330 335
Ser Arg Phe Asp Leu Leu Trp Leu Ile Gln Asp Arg Pro Asp Arg Asp
340 345 350
Asn Asp Leu Arg Leu Ala Gln His Ile Thr Tyr Val His Gln His Ser
355 360 365
Arg Gln Pro Pro Ser Gln Phe Glu Pro Leu Asp Met Lys Leu Met Arg
370 375 380
Arg Tyr Ile Ala Met Cys Arg Glu Lys Gln Pro Met Val Pro Glu Ser
385 390 395 400
Leu Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Ala Tyr Val Glu Met Arg Arg Glu Ala
405 410 415
Trp Ala Ser Lys Asp Ala Thr Tyr Thr Ser Ala Arg Thr Leu Leu Ala
420 425 430
Ile Leu Arg Leu Ser Thr Ala Leu Ala Arg Leu Arg Met Val Asp Val
435 440 445
Val Glu Lys Glu Asp Val Asn Glu Ala Ile Arg Leu Met Glu Met Ser
450 455 460
Lys Asp Ser Leu Leu Gly Asp Lys Gly Gln Thr Ala Arg Thr Gln Arg
465 470 475 480
Pro Ala Asp Val Ile Phe Ala Thr Val Arg Glu Leu Val Ser Gly Gly
485 490 495
Arg Ser Val Arg Phe Ser Glu Ala Glu Gln Arg Cys Val Ser Arg Gly
500 505 510
Phe Thr Pro Ala Gln Phe Gln Ala Ala Leu Asp Glu Tyr Glu Glu Leu
515 520 525
Asn Val Trp Gln Val Asn Ala Ser Arg Thr Arg Ile Thr Phe Val
530 535 540
<210> 17
<211> 2140
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
agctgaggtg tgagcagctg ccgaagtcag ttccttgtgg agccggagct gggcgcggat 60
tcgccgaggc accgaggcac tcagaggagg cgccatgtca gaaccggctg gggatgtccg 120
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gtccccaggt ggacctggag actctcaggg tcgaaaacgg cggcagacca gcatgacaga 540
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gtctcagttt gtgtgtctta attattattt gtgttttaat ttaaacacct cctcatgtac 720
ataccctggc cgccccctgc cccccagcct ctggcattag aattatttaa acaaaaacta 780
ggcggttgaa tgagaggttc ctaagagtgc tgggcatttt tattttatga aatactattt 840
aaagcctcct catcccgtgt tctccttttc ctctctcccg gaggttgggt gggccggctt 900
catgccagct acttcctcct ccccacttgt ccgctgggtg gtaccctctg gaggggtgtg 960
gctccttccc atcgctgtca caggcggtta tgaaattcac cccctttcct ggacactcag 1020
acctgaattc tttttcattt gagaagtaaa cagatggcac tttgaagggg cctcaccgag 1080
tgggggcatc atcaaaaact ttggagtccc ctcacctcct ctaaggttgg gcagggtgac 1140
cctgaagtga gcacagccta gggctgagct ggggacctgg taccctcctg gctcttgata 1200
cccccctctg tcttgtgaag gcagggggaa ggtggggtac tggagcagac caccccgcct 1260
gccctcatgg cccctctgac ctgcactggg gagcccgtct cagtgttgag ccttttccct 1320
ctttggctcc cctgtacctt ttgaggagcc ccagcttacc cttcttctcc agctgggctc 1380
tgcaattccc ctctgctgct gtccctcccc cttgtctttc ccttcagtac cctctcatgc 1440
tccaggtggc tctgaggtgc ctgtcccacc cccaccccca gctcaatgga ctggaagggg 1500
aagggacaca caagaagaag ggcaccctag ttctacctca ggcagctcaa gcagcgaccg 1560
ccccctcctc tagctgtggg ggtgagggtc ccatgtggtg gcacaggccc ccttgagtgg 1620
ggttatctct gtgttagggg tatatgatgg gggagtagat ctttctagga gggagacact 1680
ggcccctcaa atcgtccagc gaccttcctc atccacccca tccctcccca gttcattgca 1740
ctttgattag cagcggaaca aggagtcaga cattttaaga tggtggcagt agaggctatg 1800
gacagggcat gccacgtggg ctcatatggg gctgggagta gttgtctttc ctggcactaa 1860
cgttgagccc ctggaggcac tgaagtgctt agtgtacttg gagtattggg gtctgacccc 1920
aaacaccttc cagctcctgt aacatactgg cctggactgt tttctctcgg ctccccatgt 1980
gtcctggttc ccgtttctcc acctagactg taaacctctc gagggcaggg accacaccct 2040
gtactgttct gtgtctttca cagctcctcc cacaatgctg aatatacagc aggtgctcaa 2100
taaatgattc ttagtgactt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2140
<210> 18
<211> 164
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys Gly Ser Lys
1 5 10 15
Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln Leu Ser Arg
20 25 30
Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala Arg Glu Arg
35 40 45
Trp Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala
50 55 60
Trp Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr
65 70 75 80
Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Val Asp
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu Gln Ala Glu
115 120 125
Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys Arg Arg Gln
130 135 140
Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser
145 150 155 160
Lys Arg Lys Pro
<210> 19
<211> 2281
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
agctgaggtg tgagcagctg ccgaagtcag ttccttgtgg agccggagct gggcgcggat 60
tcgccgaggc accgaggcac tcagaggagg tgagagagcg gcggcagaca acaggggacc 120
ccgggccggc ggcccagagc cgagccaagc gtgcccgcgt gtgtccctgc gtgtccgcga 180
ggatgcgtgt tcgcgggtgt gtgctgcgtt cacaggtgtt tctgcggcag gcgccatgtc 240
agaaccggct ggggatgtcc gtcagaaccc atgcggcagc aaggcctgcc gccgcctctt 300
cggcccagtg gacagcgagc agctgagccg cgactgtgat gcgctaatgg cgggctgcat 360
ccaggaggcc cgtgagcgat ggaacttcga ctttgtcacc gagacaccac tggagggtga 420
cttcgcctgg gagcgtgtgc ggggccttgg cctgcccaag ctctaccttc ccacggggcc 480
ccggcgaggc cgggatgagt tgggaggagg caggcggcct ggcacctcac ctgctctgct 540
gcaggggaca gcagaggaag accatgtgga cctgtcactg tcttgtaccc ttgtgcctcg 600
ctcaggggag caggctgaag ggtccccagg tggacctgga gactctcagg gtcgaaaacg 660
gcggcagacc agcatgacag atttctacca ctccaaacgc cggctgatct tctccaagag 720
gaagccctaa tccgcccaca ggaagcctgc agtcctggaa gcgcgagggc ctcaaaggcc 780
cgctctacat cttctgcctt agtctcagtt tgtgtgtctt aattattatt tgtgttttaa 840
tttaaacacc tcctcatgta cataccctgg ccgccccctg ccccccagcc tctggcatta 900
gaattattta aacaaaaact aggcggttga atgagaggtt cctaagagtg ctgggcattt 960
ttattttatg aaatactatt taaagcctcc tcatcccgtg ttctcctttt cctctctccc 1020
ggaggttggg tgggccggct tcatgccagc tacttcctcc tccccacttg tccgctgggt 1080
ggtaccctct ggaggggtgt ggctccttcc catcgctgtc acaggcggtt atgaaattca 1140
ccccctttcc tggacactca gacctgaatt ctttttcatt tgagaagtaa acagatggca 1200
ctttgaaggg gcctcaccga gtgggggcat catcaaaaac tttggagtcc cctcacctcc 1260
tctaaggttg ggcagggtga ccctgaagtg agcacagcct agggctgagc tggggacctg 1320
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ctggagcaga ccaccccgcc tgccctcatg gcccctctga cctgcactgg ggagcccgtc 1440
tcagtgttga gccttttccc tctttggctc ccctgtacct tttgaggagc cccagctacc 1500
cttcttctcc agctgggctc tgcaattccc ctctgctgct gtccctcccc cttgtccttt 1560
cccttcagta ccctctcagc tccaggtggc tctgaggtgc ctgtcccacc cccaccccca 1620
gctcaatgga ctggaagggg aagggacaca caagaagaag ggcaccctag ttctacctca 1680
ggcagctcaa gcagcgaccg ccccctcctc tagctgtggg ggtgagggtc ccatgtggtg 1740
gcacaggccc ccttgagtgg ggttatctct gtgttagggg tatatgatgg gggagtagat 1800
ctttctagga gggagacact ggcccctcaa atcgtccagc gaccttcctc atccacccca 1860
tccctcccca gttcattgca ctttgattag cagcggaaca aggagtcaga cattttaaga 1920
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gttgtctttc ctggcactaa cgttgagccc ctggaggcac tgaagtgctt agtgtacttg 2040
gagtattggg gtctgacccc aaacaccttc cagctcctgt aacatactgg cctggactgt 2100
tttctctcgg ctccccatgt gtcctggttc ccgtttctcc acctagactg taaacctctc 2160
gagggcaggg accacaccct gtactgttct gtgtctttca cagctcctcc cacaatgctg 2220
aatatacagc aggtgctcaa taaatgattc ttagtgactt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280
a 2281
<210> 20
<211> 164
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys Gly Ser Lys
1 5 10 15
Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln Leu Ser Arg
20 25 30
Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala Arg Glu Arg
35 40 45
Trp Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala
50 55 60
Trp Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr
65 70 75 80
Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Val Asp
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu Gln Ala Glu
115 120 125
Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys Arg Arg Gln
130 135 140
Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser
145 150 155 160
Lys Arg Lys Pro
<210> 21
<211> 1275
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
cctccctacg ggcgcctccg gcagcccttc ccgcgtgcgc agggctcaga gccgttccga 60
gatcttggag gtccgggtgg gagtgggggt ggggtggggg tgggggtgaa ggtggggggc 120
gggcgcgctc agggaaggcg ggtgcgcgcc tgcggggcgg agatgggcag ggggcggtgc 180
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ccgtctgccc gtggacctgg ctgaggagct gggccatcgc gatgtcgcac ggtacctgcg 720
cgcggctgcg gggggcacca gaggcagtaa ccatgcccgc atagatgccg cggaaggtcc 780
ctcagacatc cccgattgaa agaaccagag aggctctgag aaacctcggg aaacttagat 840
catcagtcac cgaaggtcct acagggccac aactgccccc gccacaaccc accccgcttt 900
cgtagttttc atttagaaaa tagagctttt aaaaatgtcc tgccttttaa cgtagatata 960
tgccttcccc cactaccgta aatgtccatt tatatcattt tttatatatt cttataaaaa 1020
tgtaaaaaag aaaaacaccg cttctgcctt ttcactgtgt tggagttttc tggagtgagc 1080
actcacgccc taagcgcaca ttcatgtggg catttcttgc gagcctcgca gcctccggaa 1140
gctgtcgact tcatgacaag cattttgtga actagggaag ctcagggggg ttactggctt 1200
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ttcattcatt cactc 1275
<210> 22
<211> 173
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met Gly Arg Gly Arg Cys Val Gly Pro Ser Leu Gln Leu Arg Gly Gln
1 5 10 15
Glu Trp Arg Cys Ser Pro Leu Val Pro Lys Gly Gly Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Glu Leu Gly Pro Gly Gly Gly Glu Asn Met Val Arg Arg Phe Leu Val
35 40 45
Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly Pro Pro Arg Val Arg Val Phe
50 55 60
Val Val His Ile Pro Arg Leu Thr Gly Glu Trp Ala Ala Pro Gly Ala
65 70 75 80
Pro Ala Ala Val Ala Leu Val Leu Met Leu Leu Arg Ser Gln Arg Leu
85 90 95
Gly Gln Gln Pro Leu Pro Arg Arg Pro Gly His Asp Asp Gly Gln Arg
100 105 110
Pro Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Pro Arg Arg Gly Ala Gln Leu Arg
115 120 125
Arg Pro Arg His Ser His Pro Thr Arg Ala Arg Arg Cys Pro Gly Gly
130 135 140
Leu Pro Gly His Ala Gly Gly Ala Ala Pro Gly Arg Gly Ala Ala Gly
145 150 155 160
Arg Ala Arg Cys Leu Gly Pro Ser Ala Arg Gly Pro Gly
165 170
<210> 23
<211> 5698
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
aggttcaagt ggagctctcc taaccgacgc gcgtctgtgg agaagcggct tggtcggggg 60
tggtctcgtg gggtcctgcc tgtttagtcg ctttcagggt tcttgagccc cttcacgacc 120
gtcaccatgg aagtgtcacc attgcagcct gtaaatgaaa atatgcaagt caacaaaata 180
aagaaaaatg aagatgctaa gaaaagactg tctgttgaaa gaatctatca aaagaaaaca 240
caattggaac atattttgct ccgcccagac acctacattg gttctgtgga attagtgacc 300
cagcaaatgt gggtttacga tgaagatgtt ggcattaact atagggaagt cacttttgtt 360
cctggtttgt acaaaatctt tgatgagatt ctagttaatg ctgcggacaa caaacaaagg 420
gacccaaaaa tgtcttgtat tagagtcaca attgatccgg aaaacaattt aattagtata 480
tggaataatg gaaaaggtat tcctgttgtt gaacacaaag ttgaaaagat gtatgtccca 540
gctctcatat ttggacagct cctaacttct agtaactatg atgatgatga aaagaaagtg 600
acaggtggtc gaaatggcta tggagccaaa ttgtgtaaca tattcagtac caaatttact 660
gtggaaacag ccagtagaga atacaagaaa atgttcaaac agacatggat ggataatatg 720
ggaagagctg gtgagatgga actcaagccc ttcaatggag aagattatac atgtatcacc 780
tttcagcctg atttgtctaa gtttaaaatg caaagcctgg acaaagatat tgttgcacta 840
atggtcagaa gagcatatga tattgctgga tccaccaaag atgtcaaagt ctttcttaat 900
ggaaataaac tgccagtaaa aggatttcgt agttatgtgg acatgtattt gaaggacaag 960
ttggatgaaa ctggtaactc cttgaaagta atacatgaac aagtaaacca caggtgggaa 1020
gtgtgtttaa ctatgagtga aaaaggcttt cagcaaatta gctttgtcaa cagcattgct 1080
acatccaagg gtggcagaca tgttgattat gtagctgatc agattgtgac taaacttgtt 1140
gatgttgtga agaagaagaa caagggtggt gttgcagtaa aagcacatca ggtgaaaaat 1200
cacatgtgga tttttgtaaa tgccttaatt gaaaacccaa cctttgactc tcagacaaaa 1260
gaaaacatga ctttacaacc caagagcttt ggatcaacat gccaattgag tgaaaaattt 1320
atcaaagctg ccattggctg tggtattgta gaaagcatac taaactgggt gaagtttaag 1380
gcccaagtcc agttaaacaa gaagtgttca gctgtaaaac ataatagaat caagggaatt 1440
cccaaactcg atgatgccaa tgatgcaggg ggccgaaact ccactgagtg tacgcttatc 1500
ctgactgagg gagattcagc caaaactttg gctgtttcag gccttggtgt ggttgggaga 1560
gacaaatatg gggttttccc tcttagagga aaaatactca atgttcgaga agcttctcat 1620
aagcagatca tggaaaatgc tgagattaac aatatcatca agattgtggg tcttcagtac 1680
aagaaaaact atgaagatga agattcattg aagacgcttc gttatgggaa gataatgatt 1740
atgacagatc aggaccaaga tggttcccac atcaaaggct tgctgattaa ttttatccat 1800
cacaactggc cctctcttct gcgacatcgt tttctggagg aatttatcac tcccattgta 1860
aaggtatcta aaaacaagca agaaatggca ttttacagcc ttcctgaatt tgaagagtgg 1920
aagagttcta ctccaaatca taaaaaatgg aaagtcaaat attacaaagg tttgggcacc 1980
agcacatcaa aggaagctaa agaatacttt gcagatatga aaagacatcg tatccagttc 2040
aaatattctg gtcctgaaga tgatgctgct atcagcctgg cctttagcaa aaaacagata 2100
gatgatcgaa aggaatggtt aactaatttc atggaggata gaagacaacg aaagttactt 2160
gggcttcctg aggattactt gtatggacaa actaccacat atctgacata taatgacttc 2220
atcaacaagg aacttatctt gttctcaaat tctgataacg agagatctat cccttctatg 2280
gtggatggtt tgaaaccagg tcagagaaag gttttgttta cttgcttcaa acggaatgac 2340
aagcgagaag taaaggttgc ccaattagct ggatcagtgg ctgaaatgtc ttcttatcat 2400
catggtgaga tgtcactaat gatgaccatt atcaatttgg ctcagaattt tgtgggtagc 2460
aataatctaa acctcttgca gcccattggt cagtttggta ccaggctaca tggtggcaag 2520
gattctgcta gtccacgata catctttaca atgctcagct ctttggctcg attgttattt 2580
ccaccaaaag atgatcacac gttgaagttt ttatatgatg acaaccagcg tgttgagcct 2640
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ttgatggatg gagaagaacc tttgccaatg cttccaagtt acaagaactt caagggtact 2820
attgaagaac tggctccaaa tcaatatgtg attagtggtg aagtagctat tcttaattct 2880
acaaccattg aaatctcaga gcttcccgtc agaacatgga cccagacata caaagaacaa 2940
gttctagaac ccatgttgaa tggcaccgag aagacacctc ctctcataac agactatagg 3000
gaataccata cagataccac tgtgaaattt gttgtgaaga tgactgaaga aaaactggca 3060
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tctatggtgc tttttgacca cgtaggctgt ttaaagaaat atgacacggt gttggatatt 3180
ctaagagact tttttgaact cagacttaaa tattatggat taagaaaaga atggctccta 3240
ggaatgcttg gtgctgaatc tgctaaactg aataatcagg ctcgctttat cttagagaaa 3300
atagatggca aaataatcat tgaaaataag cctaagaaag aattaattaa agttctgatt 3360
cagaggggat atgattcgga tcctgtgaag gcctggaaag aagcccagca aaaggttcca 3420
gatgaagaag aaaatgaaga gagtgacaac gaaaaggaaa ctgaaaagag tgactccgta 3480
acagattctg gaccaacctt caactatctt cttgatatgc ccctttggta tttaaccaag 3540
gaaaagaaag atgaactctg caggctaaga aatgaaaaag aacaagagct ggacacatta 3600
aaaagaaaga gtccatcaga tttgtggaaa gaagacttgg ctacatttat tgaagaattg 3660
gaggctgttg aagccaagga aaaacaagat gaacaagtcg gacttcctgg gaaagggggg 3720
aaggccaagg ggaaaaaaac acaaatggct gaagttttgc cttctccgcg tggtcaaaga 3780
gtcattccac gaataaccat agaaatgaaa gcagaggcag aaaagaaaaa taaaaagaaa 3840
attaagaatg aaaatactga aggaagccct caagaagatg gtgtggaact agaaggccta 3900
aaacaaagat tagaaaagaa acagaaaaga gaaccaggta caaagacaaa gaaacaaact 3960
acattggcat ttaagccaat caaaaaagga aagaagagaa atccctggtc tgattcagaa 4020
tcagatagga gcagtgacga aagtaatttt gatgtccctc cacgagaaac agagccacgg 4080
agagcagcaa caaaaacaaa attcacaatg gatttggatt cagatgaaga tttctcagat 4140
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agcccaagtg ttctttagct ttttataata ctgtctaaat agtgaccatc tcatgggcat 4920
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tttttaagtt cttctgaact gtagaaatag ctatctgatc acttcagcgt aaagcagtgt 5040
gtttattaac catccactaa gctaaaacta gagcagtttg atttaaaagt gtcactcttc 5100
ctccttttct actttcagta gatatgagat agagcataat tatctgtttt atcttagttt 5160
tatacataat ttaccatcag atagaacttt atggttctag tacagatact ctactacact 5220
cagcctctta tgtgccaagt ttttctttaa gcaatgagaa attgctcatg ttcttcatct 5280
tctcaaatca tcagaggcca aagaaaaaca ctttggctgt gtctataact tgacacagtc 5340
aatagaatga agaaaattag agtagttatg tgattatttc agctcttgac ctgtcccctc 5400
tggctgcctc tgagtctgaa tctcccaaag agagaaacca atttctaaga ggactggatt 5460
gcagaagact cggggacaac atttgatcca agatcttaaa tgttatattg ataaccatgc 5520
tcagcaatga gctattagat tcattttggg aaatctccat aatttcaatt tgtaaacttt 5580
gttaagacct gtctacattg ttatatgtgt gtgacttgag taatgttatc aacgtttttg 5640
taaatattta ctatgttttt ctattagcta aattccaaca attttgtact ttaataaa 5698
<210> 24
<211> 1531
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Glu Val Ser Pro Leu Gln Pro Val Asn Glu Asn Met Gln Val Asn
1 5 10 15
Lys Ile Lys Lys Asn Glu Asp Ala Lys Lys Arg Leu Ser Val Glu Arg
20 25 30
Ile Tyr Gln Lys Lys Thr Gln Leu Glu His Ile Leu Leu Arg Pro Asp
35 40 45
Thr Tyr Ile Gly Ser Val Glu Leu Val Thr Gln Gln Met Trp Val Tyr
50 55 60
Asp Glu Asp Val Gly Ile Asn Tyr Arg Glu Val Thr Phe Val Pro Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Lys Ile Phe Asp Glu Ile Leu Val Asn Ala Ala Asp Asn Lys
85 90 95
Gln Arg Asp Pro Lys Met Ser Cys Ile Arg Val Thr Ile Asp Pro Glu
100 105 110
Asn Asn Leu Ile Ser Ile Trp Asn Asn Gly Lys Gly Ile Pro Val Val
115 120 125
Glu His Lys Val Glu Lys Met Tyr Val Pro Ala Leu Ile Phe Gly Gln
130 135 140
Leu Leu Thr Ser Ser Asn Tyr Asp Asp Asp Glu Lys Lys Val Thr Gly
145 150 155 160
Gly Arg Asn Gly Tyr Gly Ala Lys Leu Cys Asn Ile Phe Ser Thr Lys
165 170 175
Phe Thr Val Glu Thr Ala Ser Arg Glu Tyr Lys Lys Met Phe Lys Gln
180 185 190
Thr Trp Met Asp Asn Met Gly Arg Ala Gly Glu Met Glu Leu Lys Pro
195 200 205
Phe Asn Gly Glu Asp Tyr Thr Cys Ile Thr Phe Gln Pro Asp Leu Ser
210 215 220
Lys Phe Lys Met Gln Ser Leu Asp Lys Asp Ile Val Ala Leu Met Val
225 230 235 240
Arg Arg Ala Tyr Asp Ile Ala Gly Ser Thr Lys Asp Val Lys Val Phe
245 250 255
Leu Asn Gly Asn Lys Leu Pro Val Lys Gly Phe Arg Ser Tyr Val Asp
260 265 270
Met Tyr Leu Lys Asp Lys Leu Asp Glu Thr Gly Asn Ser Leu Lys Val
275 280 285
Ile His Glu Gln Val Asn His Arg Trp Glu Val Cys Leu Thr Met Ser
290 295 300
Glu Lys Gly Phe Gln Gln Ile Ser Phe Val Asn Ser Ile Ala Thr Ser
305 310 315 320
Lys Gly Gly Arg His Val Asp Tyr Val Ala Asp Gln Ile Val Thr Lys
325 330 335
Leu Val Asp Val Val Lys Lys Lys Asn Lys Gly Gly Val Ala Val Lys
340 345 350
Ala His Gln Val Lys Asn His Met Trp Ile Phe Val Asn Ala Leu Ile
355 360 365
Glu Asn Pro Thr Phe Asp Ser Gln Thr Lys Glu Asn Met Thr Leu Gln
370 375 380
Pro Lys Ser Phe Gly Ser Thr Cys Gln Leu Ser Glu Lys Phe Ile Lys
385 390 395 400
Ala Ala Ile Gly Cys Gly Ile Val Glu Ser Ile Leu Asn Trp Val Lys
405 410 415
Phe Lys Ala Gln Val Gln Leu Asn Lys Lys Cys Ser Ala Val Lys His
420 425 430
Asn Arg Ile Lys Gly Ile Pro Lys Leu Asp Asp Ala Asn Asp Ala Gly
435 440 445
Gly Arg Asn Ser Thr Glu Cys Thr Leu Ile Leu Thr Glu Gly Asp Ser
450 455 460
Ala Lys Thr Leu Ala Val Ser Gly Leu Gly Val Val Gly Arg Asp Lys
465 470 475 480
Tyr Gly Val Phe Pro Leu Arg Gly Lys Ile Leu Asn Val Arg Glu Ala
485 490 495
Ser His Lys Gln Ile Met Glu Asn Ala Glu Ile Asn Asn Ile Ile Lys
500 505 510
Ile Val Gly Leu Gln Tyr Lys Lys Asn Tyr Glu Asp Glu Asp Ser Leu
515 520 525
Lys Thr Leu Arg Tyr Gly Lys Ile Met Ile Met Thr Asp Gln Asp Gln
530 535 540
Asp Gly Ser His Ile Lys Gly Leu Leu Ile Asn Phe Ile His His Asn
545 550 555 560
Trp Pro Ser Leu Leu Arg His Arg Phe Leu Glu Glu Phe Ile Thr Pro
565 570 575
Ile Val Lys Val Ser Lys Asn Lys Gln Glu Met Ala Phe Tyr Ser Leu
580 585 590
Pro Glu Phe Glu Glu Trp Lys Ser Ser Thr Pro Asn His Lys Lys Trp
595 600 605
Lys Val Lys Tyr Tyr Lys Gly Leu Gly Thr Ser Thr Ser Lys Glu Ala
610 615 620
Lys Glu Tyr Phe Ala Asp Met Lys Arg His Arg Ile Gln Phe Lys Tyr
625 630 635 640
Ser Gly Pro Glu Asp Asp Ala Ala Ile Ser Leu Ala Phe Ser Lys Lys
645 650 655
Gln Ile Asp Asp Arg Lys Glu Trp Leu Thr Asn Phe Met Glu Asp Arg
660 665 670
Arg Gln Arg Lys Leu Leu Gly Leu Pro Glu Asp Tyr Leu Tyr Gly Gln
675 680 685
Thr Thr Thr Tyr Leu Thr Tyr Asn Asp Phe Ile Asn Lys Glu Leu Ile
690 695 700
Leu Phe Ser Asn Ser Asp Asn Glu Arg Ser Ile Pro Ser Met Val Asp
705 710 715 720
Gly Leu Lys Pro Gly Gln Arg Lys Val Leu Phe Thr Cys Phe Lys Arg
725 730 735
Asn Asp Lys Arg Glu Val Lys Val Ala Gln Leu Ala Gly Ser Val Ala
740 745 750
Glu Met Ser Ser Tyr His His Gly Glu Met Ser Leu Met Met Thr Ile
755 760 765
Ile Asn Leu Ala Gln Asn Phe Val Gly Ser Asn Asn Leu Asn Leu Leu
770 775 780
Gln Pro Ile Gly Gln Phe Gly Thr Arg Leu His Gly Gly Lys Asp Ser
785 790 795 800
Ala Ser Pro Arg Tyr Ile Phe Thr Met Leu Ser Ser Leu Ala Arg Leu
805 810 815
Leu Phe Pro Pro Lys Asp Asp His Thr Leu Lys Phe Leu Tyr Asp Asp
820 825 830
Asn Gln Arg Val Glu Pro Glu Trp Tyr Ile Pro Ile Ile Pro Met Val
835 840 845
Leu Ile Asn Gly Ala Glu Gly Ile Gly Thr Gly Trp Ser Cys Lys Ile
850 855 860
Pro Asn Phe Asp Val Arg Glu Ile Val Asn Asn Ile Arg Arg Leu Met
865 870 875 880
Asp Gly Glu Glu Pro Leu Pro Met Leu Pro Ser Tyr Lys Asn Phe Lys
885 890 895
Gly Thr Ile Glu Glu Leu Ala Pro Asn Gln Tyr Val Ile Ser Gly Glu
900 905 910
Val Ala Ile Leu Asn Ser Thr Thr Ile Glu Ile Ser Glu Leu Pro Val
915 920 925
Arg Thr Trp Thr Gln Thr Tyr Lys Glu Gln Val Leu Glu Pro Met Leu
930 935 940
Asn Gly Thr Glu Lys Thr Pro Pro Leu Ile Thr Asp Tyr Arg Glu Tyr
945 950 955 960
His Thr Asp Thr Thr Val Lys Phe Val Val Lys Met Thr Glu Glu Lys
965 970 975
Leu Ala Glu Ala Glu Arg Val Gly Leu His Lys Val Phe Lys Leu Gln
980 985 990
Thr Ser Leu Thr Cys Asn Ser Met Val Leu Phe Asp His Val Gly Cys
995 1000 1005
Leu Lys Lys Tyr Asp Thr Val Leu Asp Ile Leu Arg Asp Phe Phe Glu
1010 1015 1020
Leu Arg Leu Lys Tyr Tyr Gly Leu Arg Lys Glu Trp Leu Leu Gly Met
1025 1030 1035 1040
Leu Gly Ala Glu Ser Ala Lys Leu Asn Asn Gln Ala Arg Phe Ile Leu
1045 1050 1055
Glu Lys Ile Asp Gly Lys Ile Ile Ile Glu Asn Lys Pro Lys Lys Glu
1060 1065 1070
Leu Ile Lys Val Leu Ile Gln Arg Gly Tyr Asp Ser Asp Pro Val Lys
1075 1080 1085
Ala Trp Lys Glu Ala Gln Gln Lys Val Pro Asp Glu Glu Glu Asn Glu
1090 1095 1100
Glu Ser Asp Asn Glu Lys Glu Thr Glu Lys Ser Asp Ser Val Thr Asp
1105 1110 1115 1120
Ser Gly Pro Thr Phe Asn Tyr Leu Leu Asp Met Pro Leu Trp Tyr Leu
1125 1130 1135
Thr Lys Glu Lys Lys Asp Glu Leu Cys Arg Leu Arg Asn Glu Lys Glu
1140 1145 1150
Gln Glu Leu Asp Thr Leu Lys Arg Lys Ser Pro Ser Asp Leu Trp Lys
1155 1160 1165
Glu Asp Leu Ala Thr Phe Ile Glu Glu Leu Glu Ala Val Glu Ala Lys
1170 1175 1180
Glu Lys Gln Asp Glu Gln Val Gly Leu Pro Gly Lys Gly Gly Lys Ala
1185 1190 1195 1200
Lys Gly Lys Lys Thr Gln Met Ala Glu Val Leu Pro Ser Pro Arg Gly
1205 1210 1215
Gln Arg Val Ile Pro Arg Ile Thr Ile Glu Met Lys Ala Glu Ala Glu
1220 1225 1230
Lys Lys Asn Lys Lys Lys Ile Lys Asn Glu Asn Thr Glu Gly Ser Pro
1235 1240 1245
Gln Glu Asp Gly Val Glu Leu Glu Gly Leu Lys Gln Arg Leu Glu Lys
1250 1255 1260
Lys Gln Lys Arg Glu Pro Gly Thr Lys Thr Lys Lys Gln Thr Thr Leu
1265 1270 1275 1280
Ala Phe Lys Pro Ile Lys Lys Gly Lys Lys Arg Asn Pro Trp Ser Asp
1285 1290 1295
Ser Glu Ser Asp Arg Ser Ser Asp Glu Ser Asn Phe Asp Val Pro Pro
1300 1305 1310
Arg Glu Thr Glu Pro Arg Arg Ala Ala Thr Lys Thr Lys Phe Thr Met
1315 1320 1325
Asp Leu Asp Ser Asp Glu Asp Phe Ser Asp Phe Asp Glu Lys Thr Asp
1330 1335 1340
Asp Glu Asp Phe Val Pro Ser Asp Ala Ser Pro Pro Lys Thr Lys Thr
1345 1350 1355 1360
Ser Pro Lys Leu Ser Asn Lys Glu Leu Lys Pro Gln Lys Ser Val Val
1365 1370 1375
Ser Asp Leu Glu Ala Asp Asp Val Lys Gly Ser Val Pro Leu Ser Ser
1380 1385 1390
Ser Pro Pro Ala Thr His Phe Pro Asp Glu Thr Glu Ile Thr Asn Pro
1395 1400 1405
Val Pro Lys Lys Asn Val Thr Val Lys Lys Thr Ala Ala Lys Ser Gln
1410 1415 1420
Ser Ser Thr Ser Thr Thr Gly Ala Lys Lys Arg Ala Ala Pro Lys Gly
1425 1430 1435 1440
Thr Lys Arg Asp Pro Ala Leu Asn Ser Gly Val Ser Gln Lys Pro Asp
1445 1450 1455
Pro Ala Lys Thr Lys Asn Arg Arg Lys Arg Lys Pro Ser Thr Ser Asp
1460 1465 1470
Asp Ser Asp Ser Asn Phe Glu Lys Ile Val Ser Lys Ala Val Thr Ser
1475 1480 1485
Lys Lys Ser Lys Gly Glu Ser Asp Asp Phe His Met Asp Phe Asp Ser
1490 1495 1500
Ala Val Ala Pro Arg Ala Lys Ser Val Arg Ala Lys Lys Pro Ile Lys
1505 1510 1515 1520
Tyr Leu Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp Leu Phe
1525 1530
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 25
ctctgagccc gccaagc 17
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 26
tgtaagaact tcttaacctt ttccttctct a 31
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 27
ccctcggcag cgatggcact 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 28
gaggaatccc gagctgtgaa 20
<210> 29
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 29
cccgctcccg ccat 14
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 30
cccatgtgct tctttgttta ctaagagcgg aa 32
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 31
gtccgaagcc cccagaa 17
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 32
cccgacagag accactcaca 20
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 33
cagtaccctg ctgaactcat gcgca 25
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 34
cgctacgcga agctctttg 19
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 35
cctttgtttg ccattgttct ctaa 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 36
tgccgtacaa gagctgctgc ctca 24
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 37
caaacgccgg ctgatctt 18
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 38
ccaggactgc aggcttcct 19
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 39
caagaggaag ccctaatccg ccca 24
<210> 40
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 40
gagcggcggc agacaa 16
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 41
ccgcgaacac gcatcct 17
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 42
cccagagccg agccaagcgt g 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 43
tggagactct cagggtcgaa a 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 44
tccagtctgg ccaacagagt t 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 45
cggcggcaga ccagcatgac 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 46
gccctcgtgc tgatgctact 20
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 47
tcatcatgac ctggtcttct agga 24
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 48
agcgtctagg gcagcagccg c 21
<210> 49
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 49
tgcccaacgc accga 15
<210> 50
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 50
gggcgctgcc catca 15
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 51
tcggaggccg atccaggtca tg 22
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 52
aagcttcctt tccgtcatgc 20
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 53
catgacctgc cagagagaac ag 22
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 54
cccccaccct ggctctgacc a 21
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 55
ggaaaccaag gaagaggaat gag 23
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 56
tgttcccccc ttcagatctt ct 22
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 57
acgcgcgtac agatctctcg aatgct 26
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 58
cacgccctaa gcgcacat 18
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 59
cctagttcac aaaatgcttg tcatg 25
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 60
tttcttgcga gcctcgcagc ctc 23
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 61
aaagaagatg atgaccgggt ttac 24
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 62
gagcctctgg atggtgcaa 19
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 63
caaactcaac gtgcaagcct cgga 24
<210> 64
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 64
tccgccgcgg acaa 14
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 65
catggtgtcc cgctcctt 18
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 66
accctggcct caggccggag 20
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 67
ggaattgttg gccacctgta tt 22
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 68
ctggagaaat cacttgttcc tatttct 27
<210> 69
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 69
cagtccttgc attatcattg aaacacctca ca 32
<210> 70
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 70
tcaactcatt ggaattacct cattattc 28
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 71
accatcagtg acgtaagcaa actc 24
<210> 72
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 72
ccaaacttga ggaaatctat gctcctaaac tcca 34
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 73
ttttgaagtt ctgcattctg acttg 25
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 74
accatcagtg acgtaagcaa gataa 25
<210> 75
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 75
aaccacagat gaggtccata cttctagact ggct 34
<210> 76
<211> 156
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(156)
<223> Partial amino acid sequence for p16/p14ARF isoform
1
<400> 76
Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu
20 25 30
Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro
35 40 45
Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu
50 55 60
Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg
65 70 75 80
Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val
85 90 95
Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg
100 105 110
Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg
115 120 125
Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg
130 135 140
Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp
145 150 155
<210> 77
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(105)
<223> Partial amino acid sequence for p16/p14ARF isoform
2
<400> 77
Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly
1 5 10 15
Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His
20 25 30
Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg
35 40 45
Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val
50 55 60
Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg Ile Asp Ala
85 90 95
Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp
100 105
<210> 78
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(116)
<223> Partial amino acid sequence for p16/p14ARF isoform
3
<400> 78
Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu
20 25 30
Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro
35 40 45
Ile Gln Val Gly Arg Arg Ser Ala Ala Gly Ala Gly Asp Gly Gly Arg
50 55 60
Leu Trp Arg Thr Lys Phe Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Ser Ala Ser
65 70 75 80
Ile Leu Arg Lys Lys Gly Arg Leu Pro Gly Glu Phe Ser Glu Gly Val
85 90 95
Cys Asn His Arg Pro Pro Pro Gly Asp Ala Leu Gly Ala Trp Glu Thr
100 105 110
Lys Glu Glu Glu
115
<210> 79
<211> 173
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Met Gly Arg Gly Arg Cys Val Gly Pro Ser Leu Gln Leu Arg Gly Gln
1 5 10 15
Glu Trp Arg Cys Ser Pro Leu Val Pro Lys Gly Gly Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Glu Leu Gly Pro Gly Gly Gly Glu Asn Met Val Arg Arg Phe Leu Val
35 40 45
Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly Pro Pro Arg Val Arg Val Phe
50 55 60
Val Val His Ile Pro Arg Leu Thr Gly Glu Trp Ala Ala Pro Gly Ala
65 70 75 80
Pro Ala Ala Val Ala Leu Val Leu Met Leu Leu Arg Ser Gln Arg Leu
85 90 95
Gly Gln Gln Pro Leu Pro Arg Arg Pro Gly His Asp Asp Gly Gln Arg
100 105 110
Pro Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Pro Arg Arg Gly Ala Gln Leu Arg
115 120 125
Arg Pro Arg His Ser His Pro Thr Arg Ala Arg Arg Cys Pro Gly Gly
130 135 140
Leu Pro Gly His Ala Gly Gly Ala Ala Pro Gly Arg Gly Ala Ala Gly
145 150 155 160
Arg Ala Arg Cys Leu Gly Pro Ser Ala Arg Gly Pro Gly
165 170
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 80
ggaggtggta ctggccatgt a 21
<210> 81
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 81
gggagatgcg gacatggat 19
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 82
ccaagtacga ccgcatcacc aacca 25
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 83
cattccaaga cctgcctacc a 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 84
atgcgagtga gcaaaccaat t 21
<210> 85
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 85
acacaagatt cgagagctca cctcatcca 29
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 86
ggctacatgg tggcaagga 19
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 87
tggaaataac aatcgagcca aag 23
<210> 88
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 88
tgctagtcca cgatacatct ttacaatgct cagc 34
<210> 89
<211> 3769
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 89
aaagctgcag cgtctggaaa aaagcgactt gtggcggtcg agcgtggcgc aggcgaatcc 60
tcggcactaa gcaaatatgg acctcgcggc ggcagcggag ccgggcgccg gcagccagca 120
cctggaggtc cgcgacgagg tggccgagaa gtgccagaaa ctgttcctgg acttcttgga 180
ggagtttcag agcagcgatg gagaaattaa atacttgcaa ttagcagagg aactgattcg 240
tcctgagaga aacacattgg ttgtgagttt tgtggacctg gaacaattta accagcaact 300
ttccaccacc attcaagagg agttctatag agtttaccct tacctgtgtc gggccttgaa 360
aacattcgtc aaagaccgta aagagatccc tcttgccaag gatttttatg ttgcattcca 420
agacctgcct accagacaca agattcgaga gctcacctca tccagaattg gtttgctcac 480
tcgcatcagt gggcaggtgg tgcggactca cccagttcac ccagagcttg tgagcggaac 540
ttttctgtgc ttggactgtc agacagtgat cagggatgta gaacagcagt tcaaatacac 600
acagccaaac atctgccgaa atccagtttg tgccaacagg aggagattct tactggatac 660
aaataaatca agatttgttg attttcaaaa ggttcgtatt caagagaccc aagctgagct 720
tcctcgaggg agtatccccc gcagtttaga agtaatttta agggctgaag ctgtggaatc 780
agctcaagct ggtgacaagt gtgactttac agggacactg attgttgtgc ctgacgtctc 840
caagcttagc acaccaggag cacgtgcaga aactaattcc cgtgtcagtg gtgttgatgg 900
atatgagaca gaaggcattc gaggactccg ggcccttggt gttagggacc tttcttatag 960
gctggtcttt cttgcctgct gtgttgcgcc aaccaaccca aggtttgggg ggaaagagct 1020
cagagatgag gaacagacag ctgagagcat taagaaccaa atgactgtga aagaatggga 1080
gaaagtgttt gagatgagtc aagataaaaa tctataccac aatctttgta ccagcctgtt 1140
ccctactata catggcaatg atgaagtaaa acggggtgtc ctgctgatgc tctttggtgg 1200
cgttccaaag acaacaggag aagggacctc tcttcgaggg gacataaatg tttgcattgt 1260
tggtgaccca agtacagcta agagccaatt tctcaagcac gtggaggagt tcagccccag 1320
agctgtctac accagtggta aagcgtccag tgctgctggc ttaacagcag ctgttgtgag 1380
agatgaagaa tctcatgagt ttgtcattga ggctggagct ttgatgttgg ctgataatgg 1440
tgtgtgttgt attgatgaat ttgataagat ggacgtgcgg gatcaagttg ctattcatga 1500
agctatggaa cagcagacca tatccatcac taaagcagga gtgaaggcta ctctgaacgc 1560
ccggacgtcc attttggcag cagcaaaccc aatcagtgga cactatgaca gatcaaaatc 1620
attgaaacag aatataaatt tgtcagctcc catcatgtcc cgattcgatc tcttctttat 1680
ccttgtggat gaatgtaatg aggttacaga ttatgccatt gccaggcgca tagtagattt 1740
gcattcaaga attgaggaat caattgatcg tgtctattcc ctcgatgata tcagaagata 1800
tcttctcttt gcaagacagt ttaaacccaa gatttccaaa gagtcagagg acttcattgt 1860
ggagcaatat aaacatctcc gccagagaga tggttctgga gtgaccaagt cttcatggag 1920
gattacagtg cgacagcttg agagcatgat tcgtctctct gaagctatgg ctcggatgca 1980
ctgctgtgat gaggtccaac ctaaacatgt gaaggaagct ttccggttac tgaataaatc 2040
aatcatccgt gtggaaacac ctgatgtcaa tctagatcaa gaggaagaga tccagatgga 2100
ggtagatgag ggtgctggtg gcatcaatgg tcatgctgac agccctgctc ctgtgaacgg 2160
gatcaatggc tacaatgaag acataaatca agagtctgct cccaaagcct ccttaaggct 2220
gggcttctct gagtactgcc gaatctctaa ccttattgtg cttcacctca gaaaggtgga 2280
agaagaagag gacgagtcag cattaaagag gagcgagctt gttaactggt acttgaagga 2340
aatcgaatca gagatagact ctgaagaaga acttataaat aaaaaaagaa tcatagagaa 2400
agttattcat cgactcacac actatgatca tgttctaatt gagctcaccc aggctggatt 2460
gaaaggctcc acagagggaa gtgagagcta tgaagaagat ccctacttgg tagttaaccc 2520
taactacttg ctcgaagatt gagatagtga aagtaactga ccagagctga ggaactgtgg 2580
cacagcacct cgtggcctgg agcctggctg gagctctgct agggacagaa gtgtttctgg 2640
aagtgatgct tccaggattt gttttcagaa acaagaattg agttgatggt cctatgtgtc 2700
acattcatca caggtttcat accaacacag gcttcagcac ttcctttggt gtgtttcctg 2760
tcccagtgaa gttggaacca aataatgtgt agtctctata accaatacct ttgttttcat 2820
gtgtaagaaa aggcccatta cttttaaggt atgtgctgtc ctattgagca aataactttt 2880
tttcaattgc cagctactgc ttttattcat caaaataaaa taacttgttc tgaagttgtc 2940
tattggattt ctttctactg taccctgatt attacttcca tctacttctg aatgtgagac 3000
tttccctttt tgcttaacct ggagtgaaga ggtagaactg tggtattatg gatgaggttt 3060
ctatgagaag gagtcattag agaactcata tgaaagctag aggccttaga gatgactttc 3120
caaggttaat tccagttgtt tttttttttt tttaagttta taaaagttta ttatactttt 3180
ttaaaattac tctttagtaa tttattttac ttctgtgtcc taagggtaat ttctcaggat 3240
tgttttcaaa ttgctttttt aggggaaata ggtcatttgc tatattacaa gcaatcccca 3300
aattttatgg tcttccagga aaagttatta ccgtttatga tactaacagt tcctgagact 3360
tagctatgat cagtatgttc atgaggtgga gcagttcctg tgttgcagct tttaacaaca 3420
gatggcattc attaaatcac aaagtatgtt aaaggtcaca aaagcaaaat aactgtctga 3480
ggctaaggcc cacgtgggac agtctaatac ccatgagtac tcaacttgcc ttgatgtctg 3540
agctttccag tgcaatgtga atttgagcag ccagaaatct attagtagaa agcaagacag 3600
attaatatag gttaaaacaa tgatttaaat atgtttctcc caataattat ctctttccct 3660
ggaatcaact tgtatgaaac cttgtcaaaa tgtactccac aagtatgtac aattaagtat 3720
tttaaaaata aatggcaaac attaaaaaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3769
<210> 90
<211> 821
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Met Asp Leu Ala Ala Ala Ala Glu Pro Gly Ala Gly Ser Gln His Leu
1 5 10 15
Glu Val Arg Asp Glu Val Ala Glu Lys Cys Gln Lys Leu Phe Leu Asp
20 25 30
Phe Leu Glu Glu Phe Gln Ser Ser Asp Gly Glu Ile Lys Tyr Leu Gln
35 40 45
Leu Ala Glu Glu Leu Ile Arg Pro Glu Arg Asn Thr Leu Val Val Ser
50 55 60
Phe Val Asp Leu Glu Gln Phe Asn Gln Gln Leu Ser Thr Thr Ile Gln
65 70 75 80
Glu Glu Phe Tyr Arg Val Tyr Pro Tyr Leu Cys Arg Ala Leu Lys Thr
85 90 95
Phe Val Lys Asp Arg Lys Glu Ile Pro Leu Ala Lys Asp Phe Tyr Val
100 105 110
Ala Phe Gln Asp Leu Pro Thr Arg His Lys Ile Arg Glu Leu Thr Ser
115 120 125
Ser Arg Ile Gly Leu Leu Thr Arg Ile Ser Gly Gln Val Val Arg Thr
130 135 140
His Pro Val His Pro Glu Leu Val Ser Gly Thr Phe Leu Cys Leu Asp
145 150 155 160
Cys Gln Thr Val Ile Arg Asp Val Glu Gln Gln Phe Lys Tyr Thr Gln
165 170 175
Pro Asn Ile Cys Arg Asn Pro Val Cys Ala Asn Arg Arg Arg Phe Leu
180 185 190
Leu Asp Thr Asn Lys Ser Arg Phe Val Asp Phe Gln Lys Val Arg Ile
195 200 205
Gln Glu Thr Gln Ala Glu Leu Pro Arg Gly Ser Ile Pro Arg Ser Leu
210 215 220
Glu Val Ile Leu Arg Ala Glu Ala Val Glu Ser Ala Gln Ala Gly Asp
225 230 235 240
Lys Cys Asp Phe Thr Gly Thr Leu Ile Val Val Pro Asp Val Ser Lys
245 250 255
Leu Ser Thr Pro Gly Ala Arg Ala Glu Thr Asn Ser Arg Val Ser Gly
260 265 270
Val Asp Gly Tyr Glu Thr Glu Gly Ile Arg Gly Leu Arg Ala Leu Gly
275 280 285
Val Arg Asp Leu Ser Tyr Arg Leu Val Phe Leu Ala Cys Cys Val Ala
290 295 300
Pro Thr Asn Pro Arg Phe Gly Gly Lys Glu Leu Arg Asp Glu Glu Gln
305 310 315 320
Thr Ala Glu Ser Ile Lys Asn Gln Met Thr Val Lys Glu Trp Glu Lys
325 330 335
Val Phe Glu Met Ser Gln Asp Lys Asn Leu Tyr His Asn Leu Cys Thr
340 345 350
Ser Leu Phe Pro Thr Ile His Gly Asn Asp Glu Val Lys Arg Gly Val
355 360 365
Leu Leu Met Leu Phe Gly Gly Val Pro Lys Thr Thr Gly Glu Gly Thr
370 375 380
Ser Leu Arg Gly Asp Ile Asn Val Cys Ile Val Gly Asp Pro Ser Thr
385 390 395 400
Ala Lys Ser Gln Phe Leu Lys His Val Glu Glu Phe Ser Pro Arg Ala
405 410 415
Val Tyr Thr Ser Gly Lys Ala Ser Ser Ala Ala Gly Leu Thr Ala Ala
420 425 430
Val Val Arg Asp Glu Glu Ser His Glu Phe Val Ile Glu Ala Gly Ala
435 440 445
Leu Met Leu Ala Asp Asn Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp Lys
450 455 460
Met Asp Val Arg Asp Gln Val Ala Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln
465 470 475 480
Thr Ile Ser Ile Thr Lys Ala Gly Val Lys Ala Thr Leu Asn Ala Arg
485 490 495
Thr Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ile Ser Gly His Tyr Asp Arg
500 505 510
Ser Lys Ser Leu Lys Gln Asn Ile Asn Leu Ser Ala Pro Ile Met Ser
515 520 525
Arg Phe Asp Leu Phe Phe Ile Leu Val Asp Glu Cys Asn Glu Val Thr
530 535 540
Asp Tyr Ala Ile Ala Arg Arg Ile Val Asp Leu His Ser Arg Ile Glu
545 550 555 560
Glu Ser Ile Asp Arg Val Tyr Ser Leu Asp Asp Ile Arg Arg Tyr Leu
565 570 575
Leu Phe Ala Arg Gln Phe Lys Pro Lys Ile Ser Lys Glu Ser Glu Asp
580 585 590
Phe Ile Val Glu Gln Tyr Lys His Leu Arg Gln Arg Asp Gly Ser Gly
595 600 605
Val Thr Lys Ser Ser Trp Arg Ile Thr Val Arg Gln Leu Glu Ser Met
610 615 620
Ile Arg Leu Ser Glu Ala Met Ala Arg Met His Cys Cys Asp Glu Val
625 630 635 640
Gln Pro Lys His Val Lys Glu Ala Phe Arg Leu Leu Asn Lys Ser Ile
645 650 655
Ile Arg Val Glu Thr Pro Asp Val Asn Leu Asp Gln Glu Glu Glu Ile
660 665 670
Gln Met Glu Val Asp Glu Gly Ala Gly Gly Ile Asn Gly His Ala Asp
675 680 685
Ser Pro Ala Pro Val Asn Gly Ile Asn Gly Tyr Asn Glu Asp Ile Asn
690 695 700
Gln Glu Ser Ala Pro Lys Ala Ser Leu Arg Leu Gly Phe Ser Glu Tyr
705 710 715 720
Cys Arg Ile Ser Asn Leu Ile Val Leu His Leu Arg Lys Val Glu Glu
725 730 735
Glu Glu Asp Glu Ser Ala Leu Lys Arg Ser Glu Leu Val Asn Trp Tyr
740 745 750
Leu Lys Glu Ile Glu Ser Glu Ile Asp Ser Glu Glu Glu Leu Ile Asn
755 760 765
Lys Lys Arg Ile Ile Glu Lys Val Ile His Arg Leu Thr His Tyr Asp
770 775 780
His Val Leu Ile Glu Leu Thr Gln Ala Gly Leu Lys Gly Ser Thr Glu
785 790 795 800
Gly Ser Glu Ser Tyr Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Val Val Asn Pro Asn
805 810 815
Tyr Leu Leu Glu Asp
820
Claims (88)
- 환자에게서 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법에 있어서,환자의 생체 샘플에서 하나 이상의 핵의 바이오마커(nuclear biomarker)의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 핵의 바이오마커의 과다 발현 검출 단계로 높은 등급의 자궁경부 질환(high-grade cervical disease)을 나타내는 샘플을 특이적으로 동정하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 바이오마커의 과다 발현 검출 단계는 양성 증식, HPV 감염 초기 단계 또는 경증의 이형성(mild dysplasia)을 나타내는 샘플과 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 샘플을 구별하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법은 형태적 분석 또는 HPV 감염 상태 결정과는 독립적인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 과다 발현 검출 단계는 바이오마커 단백질 발현을 검출하기 위해 하나 이상의 항체를 이용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 방법은 면역세포화학을 수행하는 단계를 포함하는 것 을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 핵의 바이오마커의 과다 발현은 핵산 수준에서 검출하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 과다 발현 검출 단계는 정량적 RT-PCR을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 액체성 조제물로 자궁경부 세포 현탁액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 자궁경부 조직 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법의 민감도는 90% 이상인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법의 양성 예측치는 40% 이상인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법의 특이도는 85% 이상인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법은 비정상적인 Pap 스미어(Pap smear) 결과를 나타내는 환자에 대해 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법은 일반 환자 집단에서 높은 등급의 자궁경부 질환의 일차 스크리닝으로서 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법은 형태학적 분석과 함께 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 환자에게서 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법에 있어서,환자의 생체 샘플에서 2가지 이상의 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커의 과다 발현 검출 단계로, 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 샘플을 특이적으로 동정하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- a) 환자에서 생체 샘플을 수득하는 단계;b) 상기 샘플을, 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 핵의 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단 계; 및c) 상기 핵의 바이오마커 단백질에 대한 상기 항체의 결합성을 검출하는 단계;를 포함하는 높은 등급의 자궁경부 질환의 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 방법은 면역세포화학을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 방법은 수동 방식으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 방법은 자동화 방식으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 샘플은 자궁경부 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 21항에 있어서, 상기 샘플은 자궁경부 세포의 단일층을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 높은 등급의 자궁경부 질환의 진단 방법의 민감도는 90% 이상인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 높은 등급의 자궁경부 질환의 진단 방법의 특이도는 85% 이상인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 방법은 비정상적인 Pap 스미어 결과를 나타내는 환자에 대해 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 방법은 일반적인 환자 집단에서 높은 등급의 자궁경부 질환의 일차 스크리닝으로서 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 핵의 바이오마커는 HPV-유발성 세포 주기 교란 및 S-단계 유도 활성화에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 27항에 있어서, 상기 핵의 바이오마커는 MCM2, MCM6, MCM7, p14ARF, p21waf1, Topo2A 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 핵의 바이오마커는 MCM 단백질인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 바이오마커는 E2f 전사 인자에 의해 유도되는 유전자인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 바이오마커는 Sp-1 전사 인자에 의해 유도된 유전자인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 바이오마커는 S-단계 유전자인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 바이오마커는 세포 주기 조절에 관여하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 바이오마커는 DNA 복제 및 전사에 관여하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 17항에 있어서, 샘플의 파파니콜로(Papanicolaou)(Pap) 염색 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- a) 환자에서 생체 샘플을 수득하는 단계;b) 상기 샘플을, 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 개별 바이오마커 단백질에 특이적으로 각각 결합하는, 둘 이상의 항체와 접촉시키는 단계; 및c) 상기 바이오마커 단백질에 대한 상기 항체의 결합성을 검출하는 단계;를 포함하는 높은 등급의 자궁경부 질환의 진단 방법.
- 제 36항에 있어서, 상기 바이오마커는 MCM2, MCM6, MCM7, p14ARF, p21waf1, Topo2A 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 37항에 있어서, 상기 바이오마커중 적어도 하나는 MCM 단백질인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 37항에 있어서, 제1 및 제2 항체는 MCM2에 특이적으로 결합하고, 제3의 항체는 Topo2A에 특이적으로 결합하는, 3종 이상의 항체를 상기 샘플과 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 36항에 있어서, 상기 항체는 개별 항체 시약으로서 순차적으로 상기 샘플과 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 37항에 있어서, 상기 항체는 항체 칵테일로서 동시에 상기 샘플과 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 36항에 있어서, 상기 항체 각각은 샘플의 일부를 포함하는 개별 현미경 슬라이드와 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- a) 환자에서 생체 샘플을 수득하는 단계;b) 상기 샘플을, 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는, 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계;c) 상기 바이오마커 단백질에 대한 상기 항체의 결합성을 검출하는 단계; 및d) 파파니콜로(Pap) 염색으로 상기 샘플을 염색하는 단계;를 포함하는 높은 등급의 자궁경부 질환의 진단 방법.
- 제 43항에 있어서, 상기 방법은 비정상적인 Pap 스미어 결과를 나타내는 환자에 대해 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 43항에 있어서, 상기 방법은 일반적인 환자 집단에서 높은 등급의 자궁경 부 질환의 일차 스크리닝으로서 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법으로서,환자의 생체 샘플에서 1종 이상의 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커의 과다 발현은 비정상적인 S-단계 유도를 표시하는 것임을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법으로서,환자의 생체 샘플에서 1종 이상의 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커의 과다 발현은 발암성 HPV E6 및 HPV E7의 활성적인 전사를 표시하는 것임을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법으로서,환자의 생체 샘플에서 1종 이상의 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커의 과다 발현은 발암성 HPV E6 및 HPV E7의 과다 발현을 표시하는 것임을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 핵의 바이오마커 단백질과 특이적으로 결합하는, 한가지 이상의 항체를 포함하는 키트.
- 제 49항에 있어서, 상기 핵의 바이오마커는 MCM2, MCM6, MCM7, p14ARF, p21waf1, Topo2A 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 50항에 있어서, 상기 핵의 바이오마커는 MCM 단백질인 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 49항에 있어서, 상기 키트는 페록시다제 차단제, 단백질 차단제, 상기 바이오마커 단백질에 대한 항체 결합을 검출하기 위한 화합물, 대조 염색제(counterstain), 청색화제 및 이용 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 52항에 있어서, 상기 항체 결합을 검출하기 위한 화합물은 발색체(chromogen) 및 표지된 폴리머가 접합된 이차 항체를 포함하며, 상기 발색체는 3',3'-디아미노벤지딘을 포함하며, 상기 표지된 폴리머는 덱스트란 폴리머가 접합된 서양고추냉이 페록시다제(horseradish peroxidase)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 52항에 있어서, 상기 대조 염색제는 헤마톡실린을 포함하는 것을 특징으 로 하는, 키트.
- 제 52항에 있어서, 상기 청색화제는 트리스 완충화된 염수(pH7.4), 트윈 20 및 소듐 아지드를 포함하는 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 52항에 있어서, 양성 대조군 샘플을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 56항에 있어서, 상기 양성 대조군 샘플은 SiHa 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 49항에 있어서, Pap 염색용 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 58항에 있어서, Pap 염색용 시약은 EA50 및 오렌지 G를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 개별적인 바이오마커 단백질에 특이적으로 각각 결합하는 2종 이상의 항체를 포함하는 키트.
- 제 60항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 개별 시약으로서 제공되는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 60항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 칵테일로서 제공되는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 60항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 MCM 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 60항에 있어서, 상기 키트는 3종 이상의 항체를 포함하며, 제1 및 제2 항체는 MCM2에 특이적으로 결합하고, 제3 항체는 Topo2A에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제 64항에 있어서, 상기 키트는 페록시다제 차단제, 단백질 차단제, 상기 바이오마커 단백질에 대한 항체 결합을 검출하기 위한 화합물, 대조 염색제, 청색화제 및 이용 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 바이오마커 단백질과 특이적으로 결합하는 한가지 이상의 항체, 및 EA50과 오렌지 G를 포함하는 Pap 염색용 시약을 포함하는, 키트.
- 제 52항의 키트를 높은 등급의 자궁경부 질환 진단에 사용하는 방법.
- 제 65항의 키트를 높은 등급의 자궁경부 질환 진단에 사용하는 방법.
- 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 핵의 바이오마커를 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 높은 등급의 자궁경부 질환의 진단 방법으로서,상기 핵의 바이오마커는 MCM2, MCM6, MCM7, p14ARF, p21waf1, Topo2A 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되며,상기 진단 방법은a) 환자에서 생체 샘플을 수득하는 단계;b) 상기 샘플에서 핵산 물질을 분리하는 단계;c) 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시키기에 적합한 조건하에서, 상기 핵의 바이오마커에 특이적인 한쌍 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 열에 안정한 DNA 중합효소를 상기 핵산 물질에 혼합하는 단계;d) PCR을 수행하는 단계; 및e) PCR 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 진단 방법.
- 제 69항에 있어서, 상기 PCR을 수행하는 단계는 RT-PCR을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 70항에 있어서, 상기 샘플은 액체성 조제물로 자궁경부 세포 현탁액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 70항에 있어서, 상기 샘플은 자궁경부 조직 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 69항에 있어서, 상기 핵의 바이오마커는 MCM 단백질인 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 69항에 있어서, 상기 방법은 비정상적인 Pap 스미어(Pap smear) 결과를 나타내는 환자에 대해 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 69항에 있어서, 상기 방법은 일반 환자 집단에서 높은 등급의 자궁경부 질환의 일차 스크리닝으로서 수행하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법에 있어서,환자의 생체 샘플에서 2종 이상의 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계 를 포함하며, 상기 바이오마커의 과다 발현 검출로 높은 등급의 자궁경부 질환을 나타내는 샘플을 특이적으로 동정하며, 상기 바이오마커의 과다 발현은 핵산 수준에서 검출하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 제 76항에 있어서, 과다 발현 검출 단계는 RT-PCR 검출을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 방법.
- 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 핵의 바이오마커에 특이적인 한쌍 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 키트.
- 각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍이 높은 등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 바이오마커에 특이적인, 2쌍 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 키트.
- 제 79항의 키트를 환자에게서 높은 등급의 자궁경부 질환을 진단하는데 사용하는 방법.
- 0.05% 내지 5%의 소듐 라우레트-13-카르복실레이트(sodium laureth-13-carboxylate)를 포함하는 슬라이드 전처리 완충액.
- 제 81항에 있어서, 0.1% 내지 1%의 소듐 라우레트-13-카르복실레이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 슬라이드 전처리 완충액.
- 제 82항에 있어서, 0.5%의 소듐 라우레트-13-카르복실레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 슬라이드 전처리 완충액.
- 0.05% 내지 5%의 소듐 라우레트-13-카르복실레이트를 포함하는 조성물을 샘플에 적용하는 단계를 포함하는, 면역세포화학적 분석에 이용하기 위한 샘플의 제조 방법.
- 제 84항에 있어서, 상기 조성물은 0.1% 내지 1%의 소듐 라우레트-13-카르복실레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플의 제조 방법.
- 제 85항에 있어서, 상기 조성물은 0.5%의 소듐 라우레트-13-카르복실레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플의 제조 방법.
- 제 84항에 있어서, 상기 조성물은 1시간 미만으로 상기 샘플에 적용되는 것을 특징으로 하는, 샘플의 제조 방법.
- 제 84항에 있어서, 상기 샘플을 열처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으 로 하는, 샘플의 제조 방법.
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