CZ20001502A3 - Způsob stanovení přítomnosti abnormálně proliferujících buněk - Google Patents

Abstract

Vynález se týká stanovení abnormalit buněčné proliferace, zejména nádorových abnormalit, pomocí detekce cílových polypeptidů neboje kódující mRNA, kde uvedené cílové polypeptidy jsou členy preiniciačního komplexu replikace DNA, ve tkáni, buňkách nebo tekutinách. Cílové polypeptidy zahrnují Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7. Testovaným vzorkem může být tkáň čípku děložního (jak biopsie, tak stěr), prsu, tlustého střeva, plic, močového měchýře, kůže, hrtanu, jícnu, bronchu, lymfatické uzliny a močového traktu (jak bioptický vzorek, tak cytologický nátěr), pak jsou stanovovány nádorové nebo pre-nádorové abnormality buněčného růstu, nebo mohou být vzorkem buňky získané z moči, krve a séra, a poté jsou stanovovány hematologické malignity a přítomnost metastázujícího sarkomu nebo karcinomu.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká hodnocení buněk ve vzorku tkáně, v buněčném vzorku nebo v kapalině z hlediska abnormalit buněčného růstu, zejména hodnocení potenciálně (nebo aktuálně) nádorových buněk. Aspekty předkládaného vynálezu jsou jsou zejména použitelné pro skríningové vzorky, jako jsou stery z čípku děložního od žen, pro stanovení toho, které cervikální buňky jsou abnormální. Vynález je také možno použít pro hodnocení buněk ve vzorcích jiných tkání, včetně prsu, jak je zde uvedeno na pokusech. Vzorky určené jako abnormální mohou být vyšetřovány podrobněji a stav buněk ve tkáni může být dále zkoumán. Po identifikaci maligních nebo pre-maligních stavů mohou být provedena důkladnější diagnostická vyšetření a potom může následovat vhodná léčba.

Dosavadní stav techniky

Předkládaný vynález je založen na překvapivém zjištění, že specifické vazebné molekuly s vazbou na určité proteiny preiniciačního komplexu DNA replikace mohou být použity pro detekci abnormálních buněk. Zejména výhodné jsou v předkládaném vynálezu vazebné molekuly namířené proti Cdc6. Také výhodné jsou v předkládaném vynálezu vazebné molekuly namířené proti MCM proteinům, zejména proti MCM5. Provedené pokusy dokazují, že specifické vazebné molekuly namířené proti Cdc6 a také molekuly namířené proti MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 nebo proti MCM7 jsou mnohem účinnější ve stanovení abnormality ve vzorku tkáně než protilátky proti PCNA a Ki67. A priory by bylo možno očekávat, že Cdc6 a McM budou dávat stejné výsledky jako Ki67 a PCNA, protože všechny tyto proteiny mohou být považovány za ·· • 444

4 markéry prolíferace. Výsledky pokusů na cervikálních vzorcích zpracovaných pro získání antigenu (tlakově zpravovaných a nebo autoklavovaných) uvedené dále skutečně ukazují, že získané výsledky jsou podobné pro všechny tyto proliferační markéry, ale že existuje jasný rozdíl pro stěry z Čípku děložního a pro zmrazené vzorky. Takové vzorky, primárně odebírané za účelem skrínigu, nejsou dostatečně velké pro zpracování tlakovou sterilizací. Zejména zajímavé z hlediska skríningu jsou velmi silné a velmi jasné výsledky získané při vyšetřování vzorků z čípku děložního za použití anti-Cdc6 nebo anti-MCM vazebných molekul, které vykazují vysokou úroveň barvení abnormálních buněk a barvení v celé tloušťce vzorku v LSIL vzorcích. Tyto skutečnosti ukazují na použitelnost těchto molekul v hodnocení stěrů z epitelového povrchu čípku děložního - a tato použitelnost je zde dále experimetnálně potvrzena. Barvení celé tloušťky vzorku je také pozorováno pro HSIL vzorky.

Experimentální hodnocení abnormalit ve tkáních prsu, v moči, v krvi nebo v séru potvrzují obecnou použitelnost aspektů předkládaného vynálezu. Dalším důkazem je použití stejných protilátek v detekci přítomnosti dysplastických nebo neoplastických buněk v tělesných kapalinách za použití biochemických metod, které mohou být automatizované. Zde uvedené příklady zahrnují detekci karcinomu močového měchýře pomocí analýzy moči a detekci leukémií a lymfomů pomocí analýzy krve. Vhodnou metodou pro takovouto analýzu je Dissociation Enhanced Lanthanid Fluorescence Immunoassay DELFIA. Předkládaný vynález také obsahuje demonstraci detekce sarkomu a karcinomu pomocí DELFIA z krve.

Epitel čípku děložníh se skládá v podstatě ze dvou odlišných typů buněk: ze dlaždicobuněčného epítelu a ze žlázového epitelu, kde každý z těchto typů je umístěn v anatomicky φ φφ φ β φφφ φφφφ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ » · · φφ φφ odlišném regionu tkáně. Dlaždicobuněčný epitel je umístěn na vnější straně (na ektocervixu) cervikálního ústí (otvoru), zatímco žlázový epitel se nachází v endocervikálním kanálu (v endocervixu). Tyto dva odlišné typy epitelových buněk se stýkají poblíž cervikálního ústí, v místě adeno-skvamosního přechodu. Adenoskvamosní přechod má klinický význam jako místo, ve kterém začíná růst většiny malignit. Pro diagnostickou validitu musí stěry z čípku děložního obsahovat buňky z této oblasti. Pro potvrzení toho, že byly odebrány buňky z této oblasti, musí stěry obsahovat žlázové, stejně jako dlaždicobuněčné epitelové buňky.

Většina nádorů Čípku děložního vyrůstá z adeno-skvamosního přechodu ze spinocelulárního epitelu, který je mnohovrstevným dynamických systémem obsahujícím kmenové buňky, který se konstantně obnovuje. Kompartment kmenových buněk samotných je umístěn poblíž bazální mebrány ve vrstvě bazálních buněk. Při dělení buněk vznikají parabazální, intermediátní a superfíciální buněčné vrstvy. Tyto buňky jsou běžně definovány jak podle jejich charakteristické morfologie, tak podle lokalizace v dlaždicobuněčném epitelu. Přeměna z bazálních buněk umístěných v nejhlubší vrstvě dlaždicobuněčného epitelu na superfíciální buňky na povrchu dlaždicobuněčného epitelu je spojen s progresivní diferenciací a se ztrátou proliferace, až do terminální diferenciace superficiálních skvamosních epitelových buněk na povrchu čípku děložního.

U dysplasií dochází ke zvýšené buněčné proliferaci se snížením diferenciace buněk při jejich postupu v dlaždicobuněčném epitelu. Obvykle, pro první vyšetření, obsahuje skríningové vyšetření čípku děložního hodnocení stěrů odebraných z povrchu epitelu, cytopatologické vyšetření zaměřené na abnormality povrchového epitelu, které jsou • ♦« • · · · • ·· ·«·* ···· ··· «· *· ·« «· .« charakteristické pro sníženou diferenciaci, které je důsledkem dysplasie.

V pozdním fetálním období, během adolescence a v těhotenství je žlázový epitel nahrazen v místě přechodu spínocelulárním epitelem v důsledku metaplasie. Metaplastické spinocelulární buňky, které nahrazují žlázový epitel, jsou zejména náchylné ke *

karcinogenesi. Normální metaplasie nemusí být považována za abnormální dysplasii spinocelulárního epitelu a z hlediska skríningu je významné rozlišení mezi metaplastickými a dysplastickými buňkami.

I přes intenzivní a nákladný národní skríningový program je karcinom čípků děložního osmou nejčastější malignitou u žen v i

UK a nej častější malignitou u žen mladších než 35 let (Cancer Research Campaign, Cancer of the Cervíx uteri, 1994, CRC,

London). V rozvojových zemích je nejčastější malignitou a nejčastější příčinou smrti u žen ve věku od 35 do 45 let a každým rokem je zjištěno 437000 nových případů (Cancer Research Campaign, Cancer - world perspectives, 1995, CRC, London).

Ve většině případů se jedná o spinocelulární karcinom (SCC) a tentto typ karcinomu je silně asociován s infekcí vysoce rizikovými typy papillomavirů, jako jsou typy 16, 18 a 31 (Park , et al., Cancer, 1995, 76 (10 Suppl.): 1902-13). Karcinom čípku děložního je vhodný pro prevenci populačním skríningem, protože » se vyvíjí přes dobře definované neinvazivní intraepitelové léze (Wright et al., Precancerouslesions of the cervíx, v Blaustein's Pathology of female genital tract. R.J. Kurman, editor, 1994, Springer-Verlag: New York, str. 22978).Spinocelulární intraepitelové abnormality mohou být klasifikovány za použití 3-stupňových (CIN) nebo 2-stupňových (Bethesda) systémů. Různé histologické abnormality obecně • 99

9·99 · * · ·· • * korelují s typem infekce HPV a s DNA ploidií, klonalitou a vývojem léze. Podle Bethesda systému představují spinocelulární intraepitelové léze s nízkým stupněm malignity (LSIL), které odpovídají CIN1 a HPV infekci čípku děložního (HPVI), obecně produktivní infekce HPV, s relativně nízkým rizikem progrese do invazivního onemocnění (Wright and Kurman. A critical review of the morphological classification systems of preinvasive lesions of the cervix: the scientific basis for shifting the paradigm, v Papilloma reviews: current research on papillomaviruses, C. Lacey, Editor, 1996, Leeds University Press, Leeds).

Spinocelulární intraepitelové léze s vysokým stupněm malignity (HSIL), které odpovídají CIN2 a CIN3, mají vyšší riziko progrese než CIN1 (LSIL) a obě jsou považovány za potenciální prekursory maligního onemocnění. Ačkoliv je možné stanovit přibližně riziko vzniku malignity pro každou kategorii intraepitelových lézí, není v současnosti možné stanovit přibližnou pravděpodobnost progrese pro jednotlivé případy.

V roce 1943 zavedli Papanicolau a Trout Pap stěrový test pro detekci prekursorových lézí karcinomu čípku děložního u žen. Tento tes je cytologickým skríningovým testem a pravděpodobně se osvědčil jako nejúspěšnější skríningový test pro rprevenci zhoubných nádorů. Masové skríningové programy, ve kterých je u žen prováděn stěr z čípku děložního alespoň jednou za tři až pět let, se ukázaly jako vysoce účinné v některých zemích ve snížení mortality a morbidity na karcinom čípku děložního. Například, v Britské Kolumbii a ve Finsku snížil organizovaný skríning mortalitu na karcinom čípku děložního o 70%. Při včasné diagnose je léčba karcinomu čípku děložního snadná.

Ve světle těchto výsledků je reálná situace ve světě deprimující. Ze stovek tisíc žen, u kterých se ročně diagnostikuje karcinom čípku děložního, zemře na toto • · · • ·· « * β · »999 99

9»9 9 9 9

9 9

9 9 9

99 onemocnění více než 50%. 75% těchto žen žije v rozvojových zemích, ve kterých nejsou masové skrínígové programy využívající dostupných metod dosažitelné, zejména z finančních důvodů. Kromě toho, v mnoha rozvojových zemích bylo snížení počtu onemocnění v poslední dekádě statisticky nevýznamné a účinnost cytologického skríningu byla mnohem menší, než se předpokládalo. Dále, odborníci pozorují významnou podíl případů invazivního karcinomu čípku děložního u pacientek, které byly pravidelně vyšetřovány, zejména u mladých žen.

Hlavní důvody pro občasné selhání cytologického skríningu v detekci karcinomu čípku děložního jsou dlouhé intervaly mezi testy a také vysoký počet falešně negativních výsledků (10-30%) (Pap Cytology screening: Most of benefits reaped?, WHO and EUROGIN release a report on cervical cancer control. Press Release WHO/25, březen 1997).

Vysoký počet falešně negativní výsledků odráží skutečnost, že interpretace Pap steru je jedním z nejobtížnějších morfologických vyšetření. Výsledky Pap stěrů se interpretují obtížněji než vzorky z aspirace tenkou jehlou, než cytologické vzorky z tělesných kapalin nebo než bioptické vzorky, z důvodů komplexity a variability smíšené populace buněk přítomné ve steru a z důvodů široké škály zánětlivých a reparačních procesů, které probíhají v Čípku děložním. Také existují cyklické změny v buněčné populaci, alterace indukované těhotenstvím a alterace, ke kterým dochází v postmenopausálním období. Vzhledem k tomu, že gynekologická cytologie je takto obtížná, musí být praxe cytopatologa dlouhá; je nutné vyškolení a vysoký stupeň odborných znalostí. I po dokončení příslušného vyškolení musí mít cytopatolog několik let praxe pro to, aby mohl odpovědně určit, zda je výsledek Pap steru normální nebo abnormální. Podobně, ačkoliv mohou být patologové vyškolení pro • ·♦· • · · e »

► · · · « ·· Ι· i interpretaci histologických řezů, musí absolvovat speciální další školení v cytopatologii, aby se staly odborníky pro vedení cytologické laboratoře a aby byly schpni stanovit správnou diagnosu stěrů.

Dvěma hlavními problémy spojenými s Pap skríningovými programy jsou neuspokojivě vysoký stupeň falešné negativity (10—30%) a relativně vysoká cena skríningu. Proto jsou nyní hledány alternativní přístupy pro skríning karcinomu čípku děložního. Dva nejčastěji diskutované přístupy jsou použití testování a typizace HPV DNA jako primární skríningové vyšetření nebo jako doplnění Pap stěrů a použití přístrojů, které mohou automaticky vyšetřovat běžně odebrané Pap stery, což vyloučí nutnost relativně vysokých nákladů na cytologickou techniku a na cytopatology (Richart, Cancer Supplement, 1995, 76(10): 1919-1927; Birdsong, Human Pathology, 1996, 27(5): 468481) .

Předchozí techniky zůstávají problematickými. Existují problémy související se sensitivitou a pozitivní prediktivní hodnotou in sítu metod pro HPV. Použití PCR pro detekci HPV-DNA zjistilo tak vysoký stupeň infekce HPV v celkové populaci, že použití testování na HPV pro skríning se považuje za problematické.

Druhý přístup obsahuje automatizování. Mnoho společností v současnosti vyvíjí a prodává automatické skríningové přístroje. Obecně takové přístroje využívají video-skener s vysokou rozlišovací schopností pro získání zobrazení, které je potom digitalizováno a analyzováno sérií algoritmů a data jsou potom zpracována počítačem, který je nastaven pro rozlišení mezi normální a abnormální buněčnou složkou. Předpokládá se, že s dalším vývojem softwaru a hardwaru se automatizovaný skríning • · v • ·*· ««·· ·· ·· stane primárním skríningem, ačkoliv v současnosti neexistuje žádný přístroj pro pre-skríning nebo nezávislý skríning Pap stěrů, který by byl schválen US FDA. To, že společnosti jsou připraveny investovat do tak nákladné a komplexní techniky, která by překonala problémy s běžným testováním Pap stěrů, ilustruje závažnost problémů a nutnost jejich řešení.

Hodnocení markérů buněčné proliferace v minulosti nepřineslo žádné řešení a odborníci v oboru jsou skeptiční v tom, že by mohly markéry proliferace přinést užitečné klinické informace (Halí and Coates, Histopathology, 1995, 26: 105-112) . Existuje předpoklad, že měření parametrů buněčné proliferace umožní získání objektivních informaci o nádorech, ale i přes provedení značného počtu studií existuje málo přímých důkazů o tom, že použití markérů buněčné proliferace, jako je PCNA, KI67 atd., znamená skutečně zlepšení vůči optimálně provedeným histologickým vyšetřením. Několik studií se zabývalo vztahem relativních hodnot proliferačních markérů ve srovnání se standardním histopatologickým gradingem a stagingem.

Pokusy o použití imunocytochemického a imunofluorescenčního barvení při automatickém skríninku na karcinom čípku děložního byly limitovány nespecifickým barvením normálních buněk. Například, bylo zjištěno, že epitelový membránový antigen (EMA) barví neoplastické buňky z čípků děložních s CIN, ale že barví také některé metaplastické buňky z normálních čípků děložních. Proto, ačkoliv je technologie pro měření imunohistochemických barvení dostupná, není v současnosti používán žádný přístroj pro automatizovaný skríning využívající imunohistochemického barvení.

Nejprostudovanějšími markéry proliferace jsou Ki67, protein neznámé funkce, a PCNA (jaderný antigen proliferujících buněk).

• · • ftftft • · * · • ft • ftft · ft ftft ft • ft ftft (Yu and Filipe, Histochemical Journal, 1993, 25: 843-853). PCNA se účastní elongace DNA replikace a mechanismu oprav DNA. Proto je přítomen během syntézy DNA, ke které dochází při replikaci nebo při opravách.

Předkladatelé vynálezu studovali proteiny účastnící se časnějšího iniciačního stadia replikace DNA. Těmito proteiny jsou Cdc6 a proteiny MCM2-7 rodiny (MCM2, MCM3, MCM4, MCM5,

MCM6 a MCM7). Williams et al., (1997) (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 142-147) popisuje, že lidské HeLa buňky v kultuře exprimuji Cdcfiběhem proliferačního buněčného cyklu, ale že WI38 lidské diploidní fibroblasty přestávají exprimovat Cdc6, když se dostanou do klidového stadia při vyčerpání séra.

V předkládaném vynálezu je dokázáno, že tato pozorování platí I pro jiné buněčné linie a pro jiné druhy. MCM jsou přítomny v jádrech buněk v G1 fázi (před syntézou DNA) a jsou progresivně odstraňovány z chromatinu do solubilní nukleoplasmy během syntézy DNA. Zde je také prokázáno, že jsou také nepřítomné v chromatinu v klidové fázi. Je zde také prokázáno, že MCM5 není přítomen v diferencovaných buňkách čípku deložního a prsu.

Z těchto základních skutečností lze předpokládat, že MCM a Cdc6 budou napodobovat distribuci PCNA a nebo Ki67. Další skutečnosti podporující tento předpoklad pocházejí z práce Hiraiwa et al. (Int. J. Cancer, 1997, 74: 180-184), který zjistil podobný charakter imunobarvení pro PCNA a MCM7 (hCDC47) v několika lidských tkáních a ve třech typech lidských nádorů.

Předkladatelé vynálezu však překvapivě zjistili výrazné odlišnosti potenciální diagnostické hodnoty MCM a Cdc6 ve srovnání s PCNA a Ki67.

• · · • ·· • tt « « · ···« ·· » · * * V v •tttt· tt · ·< · · ·· · * * * · · · · ·· ·* ·· ··

Vynálezci testovali antiséra namířená proti lidskému MCM proteinu a lidskému Cdc6 při vyšetření cytologie z čípku děložního. Vynálezci studovali řezy získané z normálních a nemocných lidských čípků děložních a stery z čípků děložních. Srovnávali získané výsledky s výsledky získanými při použití PCNA a Ki67. Protilátky proti Cdc6 nebo protilátky proti MCM (například MCM5) detekovaly LSIL (HPVl/CINl) léze v čípku děložním s vyšší účinností než protilátky namířené proti PCNA nebo KI67. Kromě toho, v podstatě všechny buňky LSIL (HPVl/CINl) nebo HSIL (CIN 2/3) lézí se barvily. Toto je v protikladu s barvením na jiné proliferační markéry, jako je například PCNA. Toto ukazuje, že specifické vazebné molekuly namířené proti proteinům preiniciačního komplexu DNA replikace, zejména proti Cdc6 nebo MCM proteinům (jako je MCM5, ale také zde uvedené MCM2, MCM3, MCM4, MCM6 a MCM7), mají výjimečnou diagnostickou hodnotu pro časnou detekci atypických nebo neoplastických buněk. Na vzorkách čípku děložního zpracovaných pro presentaci antigenů (tlakovou sterilizací nebo autoklavováním), které jsou fixované formalinem a ponořené do parafinu, vykazují anti-Cdc6 a anti-MCM protilátky stejný charakter barvení jako PCNA, ale vykazují jasně lepší výsledky při použití na stery, čerstvé nebo zmrazené vzorky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se proto obecně týká různých aspektů způsobů a prostředků pro detekci určitého cílového polypeptidů nebo mRNA kódující cílový polypeptid, ve tkáni, kapalině nebo v buňkách jedince, obvykle ve vzorku odebraného z těla jedince.

Cílové polypeptidy podle předkládaného vynálezu, jako jsou Cdc6 a MCM proteiny, jako je například MCM5, mohou být odlišeny od jiných markérů buněčné proliferace, které nejsou použitelné ii ·* ·**··: * ’**. * * * * • ·· ·«. ··.· ••to· toto toto toto toto ·· v předkládaném vynálezu proto, že nejsou součástí preiniciačního komplexu replikace DNA. Tyto markéry mohou být odlišeny tím, že jsou odstraněny z chromatinu během klidového stadia a během diferenciace. Například, ORC2 (Gavin et al.,

1995, Science 270: 1667-1671), který není cílovým proteinem podle předkládaného vynálezu, může být odlišen od proteinů jako je Cdc6 a MCM5 tím, že zůstává navázaný na chromatin v klidových buňkách. Exprese ORC2 není snížena v klidových buňkách, ačkoliv jiné složky ORC komplexu, jako je Orc 1, se mohou chovat odlišně. Exprese Cdc6 je během klidového stadia a během diferenciace rychle snížena. Kultivované buňky zastavené v G0 fázi po dobu nejméně 48 hodin neobsahují žádný detekovatelný Cdc6 protein. Cdc6 není detekovatelný v buňkách zastavených po delší dobu in vitro neno v diferencovaných buňkách ex vivo. Buňky zastavené v růstu in vitro pomocí vyčerpání séra nebo kontaktní inhibice ztrácí MCM navázané na chromatin (po několika dnech), ačkoliv celkové hladiny MCM se v buňkách významným způsobem nesnižují, alepoň po dobu 14 dnů.

Buňky, u kterých probíhá diferenciace in vitro (například HL-60 buňky, jejichž diferenciace byla indukována DMSO nebo TPA), snižují expresi MCM3, ale nikoliv expresi 0rc2 (Musahl, Aussois Meeting on DNA Replication, Aussois, France, June 1997). Diferencované buňky ze tkání ex viv neexprimují MCM proteiny, jako je například MCM2 nebo MCM5. Šest MCM proteinů MCM2-MCM7 tvoří multiproteinový komplex, který se dělí na dva subkomplexy: MCM3 a MCM5 dimer; MCM2-4-6-7 tetramer. MCM3 a MCM5 mohou být odstraňovány z chromatinu během S fáze pomaleji než MCM2-4-6-7 (Kubota et al., 1997, EMBO J., 16: 3320-3331).

MCM jsou navázané na chromatin v G1 fázi, jsou odstraňovány z chromatinu během S-fáze a jsou přítomné v jádru, ale nikoliv navázané na chromatin, během G2-fáze. Cdc6 se chová podobně v kvasinkách, ačkoliv je kromě toho, Že je odstraňován z chromatinu také degradován, a koncentrace proteinu se • · « i • · * · ·« ·· · « · · · · · · · · « · **·· ·· 99 »· 99 99 dramaticky snižují během Gl/S přechodu. Další složky preiniciačního komplexu replikace DNA mohou být použity ve způsobech podle předkládaného vynálezu. Příklady zahrnují lidské homology kvasinkových složek, jako je Cdc7 proteinkinasa (Chapman and Johnston, Exp. Cell Res., 1989, 180: 419428 (kvasinková), Sao et al., 1997, EMBO J., 16: 4340-4351 (lidská - exprese snížena v klidovém stadiu), Dbf4, regulační podjednotka Cdc7 protein-kinasy (Jackson et al·., 1993, Mol.

Cell Biol. 13: 2899-2908 (kvasinková), Masaí et al., Cold Spring Harbor Meeting on Eukaryotic DNA Replication, 3-7 September 1997 (lidská), Cdcl4 protein-fosfatasa (Hogan and Koshland, PNAS USA, 1992, 89: 3098-3102 (kvasinková)), Cdc45, která se asociuje s MCM a která má stejný fenotyp jako MCM (Zou et al., Mol. Cell. Biol., 1997, 17; 553-563 (kvasinková), Takisawa et al., Cold Spring Harbor Meeting on Eukaryotic DNA Replication, 3-7 September 1997 (Xenopus), MCM10, která se asociuje s MCM a která má stejný fenotyp jako MCM (Merchant et al., 1997, Mol. Cell. Biol. 17: 3261-3271). Cílovými polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být variabilně označeny jako jakékoliv složky preiniciačního komplexu DNA replikace, složky chromatinu odpovědné za replikaci, složky účastnící se restrikce replikace DNA na jednu replikaci na cyklus, složky replikační licence účastnící se omezení chromattinu na jedno kolo replikace DNA, a prvky rozpoznávající počátek replikace před iniciací replikace DNA.

Aminokyselinová sekvence lidské Cdc6 je popsána ve Williams et al., 1997, PNAS USA 94: 142-147, GenBank přírůstkové č. U77949.

Sekvence lidského MCM2 je popsána v Todorov et al., 1994, J. Cell Sci., 107: 253-265, GenBank přírůstkové č. X67334.

· ·

4 4 4 4

4 4 4 4 · 4 «

4· • ·· · • · * · « • * · · <·*· ·*

4 4

4 4

4 4

4 4 ·

Sekvence lidského MCM3 je popsána v Thommes et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20: 1069-1074, GenBank přírůstkové č. P25205.

Sekvence lidského MCM4 je popsána v Ishimi et al., 1996, J. Biol. Chem., 271: 24115-24122, GenBank přírůstkové č. X74794.

Sekvence lidského MCM5 je popsána v Hu et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21: 5289-5293, GenBank přírůstkové č. X74795.

Sekvence lidského MCM6 je popsána v Holthoff et al., 1996, Genomics, 37: 131-134, GenBank přírůstkové č. U46838.

Sekvence lidského MCM7 je popsána v Hu et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21: 5289-5293.

V jednom aspektu předkládaný vynález obsahuje způsob pro stanovení přítomnosti či nepřítomnosti abnormálně proliferujících buněk nebo abnormalit buněčného růstu ve vzorku od jedince, kde uvedený způsob obsahuje kontaktování vzorku se specifickým vazebným činidlem namířeným proti cílovému polypeptidů, jak byl popsán výše, a stanovení vazby specifického vazebného činidla na vzorek.

V jiném aspektu předkládaný vynález obsahuje způsob pro kategorizování tkání jako (I) normálních, nebo (ii) potenciálně nebo skutečně prekancerosních nebo nádorových, dysplastických nebo neoplastických, kde uvedený způsob obsahuje stanovení vazby specifického vazebného činidla namířeného proti cílovému polypeptidů, jak byl popsán výše, na vzorek. Charakter nebo stupeň vazby může být srovnáván s vazbou pro známý normální vzorek a/nebo s vazbou pro známý abnormální vzorek.

ft · • · ··· · • ftft ··» · * I • ft · ft · ft » 1 ft· ·· ftft ft* nezávisle, je uveden • ftft • · ft « • · * • •ft· ··

Lidská Cdc6 byla předkladateli vynálezu klonována jak je zde popsáno, ale první popis jejího klonování v Williams et al., jehož práce (PNAS USA 94: 142-147, 1997) poskytuje úplnou aminokyselinovou sekvenci. Jak je zde prokázáno experimentálně, anti-Cdc6 vazebné molekuly jsou velmi účinné v označení abnormalit různých tkání, zejména abnormalit ve vzorcích z čípku děložního, výhodně ve stěrech. Tato vazba není naopak přítomná v normální tkáni čípku děložního ve stěrech.

Aminokyselinová sekvence lidského MCM5 je popsána v Hu et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21: 5289-5293, GenBank přírůstkové č. X74795. Zde uvedené experimentální důkazy ukazují, že vazebné molekuly namířené proti tomuto proteinu, podobně jako proti Cdc6, jsou velmi účinné v označení abnormalit různých tkání, zejména abnormalit ve vzorcích z čípku děložního, výhodně ve stěrech. Získání vysoce afinitních protilátek proti MCM5 se zdá být snazší než pro Cdc6, což může odrážet vyšší antigenicitu.

Další zde uvedené experimentální důkazy ukazují, že vazebné molekuly namířené proti MCM2, MCM3, MCM4, MCM6 nebo proti MCM7, jsou také účinné v označení abnormalit různých tkání, zejména abnormalit ve vzorcích z čípku děložního, výhodně ve stěrech. Bylo zjištěno, že anti-MCM5 protilátky způsobují silnější barvení než anti-MCM2 a antí-MCM7 protilátky, jak celkově, tak v počtu buněk. Bylo zjištěno, že anti-Cdc6 protilátky dávají stejný charakter barvení jako anti-MCM5 protilátky.

Proto je vazba činidel specifických pro Cdc6 a MCM na vzorek prostředkem pro určení toho, která tkáň ve vzorku je abnormální, potenciálně nebo skutečně prekancerosní nebo nádorová, dysplastická nebo neoplastická. Stejně jsko v • v • ··· • · · · φ » ·

• · φ φ φ φ φ « φ φ φ * ♦ · ♦· současné praxi při získání pozitivních výsledků v Pap testu může být jedinec s pozitivním testem dále vyšetřován, například může být provedena biopsie a/nebo může být opakováno skríningové vyšetření. Je dosti běžné, že prekancerosní léze nevede ke vzniku skutečného nádoru. 6-měsíční skrining je obvykle prováděn pro sledování progrese nebo regrese dysplasie a tento skríning umožňuje správnou a správně načasovanou terapeutickou intervenci.

Pokud je tkáň kategorizována jako potenciálně nebo aktuálně prekancerosní nebo nádorová, podle abnormality ve tkáňovém vzorku detekované způsobem podle předkládaného vynálezu, tak může být provedeno vhodné diagnostické a/nebo klinické vyšetřování.

Je třeba si uvědomit, že předkládaný vynález není omezen na detekci abnormalit buněčného růstu, které by nutně musely být prekancerosní nebo nádorové. Mohou být detekovány jiné choroby s proliferací buněk, jak je uvedeno v příkladech popsaných dále, včetně psoriasy (viz příklad 24) a zánětlivých střevních onemocnění, jako je Colitis ulcerosa a Crohnova nemoc (příklady 33 a 34). Kromě toho, že jsou poruchami buněčné proliferace, mohou zánětlivá střevní onemocnění také předcházet nádorovým onemocněním, ačkoliv ne u všech pacientů, takže detekce způsobem podle předkládaného vynálezu může být použita jako účinný prostředek pro dokonalejší sledování takových pacientů. Při zánětlivých onemocnění střeva může docházet k odlučování buněk střeva, což umožňuje provedení analýzy na vzorcích stolice a buněčných preparátech získaných z takových vzorků. Příklad 32 uvedený dále popisuje barvení nátěrů ze stolice připravených z buněk získaných ze stolice.

• · ··· • · · ·

9 · «

99 • 9 » « • · · · • 9 9 « • · 9 9

99 vyšetření být použit • · · · • ·· • · · · • · * ♦··· ··

Předkládaný vynález může být použit pro předběžné vzorků před další analýzou. Předkládaný vynález může pro skríning nebo pro analýzu vzorků dříve testovaných za použití dostupných technik, jako je Pap ster nebo ThinPrep 2000 test. Pokusy uvedené dále také ukazují, že analýza Pap barvením a analýza způsobem podle předkládaného vynálezu využívající vhodných protilátek, mohou být provedeny na stejných preparátech. Tak může být ster z čípku děložního testován jak za použití běžného Pap stěru, zak za použití testu podle předkládaného vynálezu.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob pro označení abnormálních buněk ve vzorku tkáně, kde uvedený způsob obsahuje kontaktování buněk se specifickým vazebným činidlem namířeným proti cílovému polypeptidu, jako je například Cdc6, MCM5 nebo jiný MCM protein, za podmínek umožňujících vazbu specifického vazebného činidla na abnormálně proliferující buňky a nikoliv na normální buňky. Potom se stanoví přítomnost či nepřítomnost vazby specifického vazebného činidla na vzorek, což určí přítomnost abnormálně proliferujících buněk ve vzorku.

V ještě dalším aspektu vynález obsahuje použití specifického vazebného činidla namířeného proti cílovému polypeptidu, jak byl popsán výše, pro stanovení, hodnocení nebo diagnostiku přítomnosti nebo nepřítomnosti abnormální buněčné proliferace, abnormalit buněčného růstu, dysplasie, neoplasie nebo potenciálně nebo aktuálně prekancerosního nebo nádorového stavu ve tkáni nebo ve vzorku tkáně.

Specifické vazebné činidlo může být obsaženo v kitu, který může obsahovat návod pro použití podle předkládaného vynálezu. Takové kity jsou obsaženy jako další aspekt předkládaného vynálezu. Kit může obsahovat jedno nebo více dalších činidel, • · ··· · · · · • · ·« ··· · · ···· ···» ·· ·· ·· *«

Činidla * tt· tttttt tttttt tttttttt tttt jako jsou značkovací molekuly a podobně (viz dále).

mohou být obsažena v zásobnících, které je chrání před okolním prostředím, například v uzavřených lékovkách. Kit může také obsahovat jeden nebo více nástrojů pro získání testovaného vzorku, podle typu tkáně, například štěteček pro získání buněk z dutiny ústní, injekční stříkačku pro odběr vzorku krve, spatulu pro ster z čípku děložního, bioptický nástroj a podobně (takové složky jsou obvykle sterilní). Kit může obsahovat jakoukoliv kombinaci nebo všechna blokovací činidla pro snížení nespecifického barvení, skladovací pufr pro konzervaci vazebné aktivity molekuly během skladování, barvící pufr a/nebo promývací pufr, které jsou používány během barvení protilátkou, pozitivní kontrolu, negativní kontrolu atd. Pozitivní a negativní kontroly mohou být použity pro ověření aktivity a správného použití činidel použitých podle předkládaného vynálezu a mohou být obsaženy v kitu. Kontroly mohou být tvořeny vzorky, například tkáňovými řezy, buňkami fixovanými na krycích sklíčkách a podobně, o kterých je známo, že jsou buď pozitivní nebo negativní z hlediska přítomnosti cílové molekuly, jako je Cdc6 nebo MCM5. Charakter a použití kontrol je standardní a v oboru dobře známé.

Vzorky mohou být získány z těla za použití jakýchkoliv běžných prostředků a technik. Pro skríning karcinomu čípku děložního mohou být použity standardní stěry. Alternativně může být použita ThinPrep 2000 technologie (Cytex Corp., Boxborough, Mas., USA).Tato technologie byla povolena US FDA jako alternativa k běžné technice Pap stěrů. Vzorek je odebírán do kapalného media místo nátěru buněk na skleněné sklíčko. Automatické zpracovávací zařízení (ThinPrep 200 přístroj) je potom použito pro získání buněk z kapaliny a pro jejich nanesení v tenké vrstvě na sklíčko pro analýzu. Spatula nebo štětička může být použita pro odstranění endotelových buněk, • · · • · ··· * · · · ·

9 4 4 ·· ·* ···· • αν « i · · « • · · «

9 4 9 • 4 94 například z čípku děložního nebo z dutiny ústní. Vzorky krve a jiných tělních tekutin mohou být odebrány za použití injekční stříkačky nebo jehly. Jiné vzorky tkáně mohou být získány bioptícky nebo ze tkáňových řezů.

Ve výhodných provedeních není vzorek zpracován pro presentaci antigenu nebo tlakovou sterilizací/autoklavováním. Presentace antigenu byla dlouho standardním postupem v oboru a je odborníků dobře známá. Hiraiwa et al. odkazuje na Shin et al. (1991) Lab. Invest. 64: 693-702, kteří uvádějí příkladný postup. Vzorky mohou být čerstvé nebo zmrazené, ale obvykle nejsou fixovány formalinem ani ponořené do parafinu. Jak bylo uvedeno výše, ve výhodném provedení je vzorkem ster z čípku děložního. Stěry z čípku děložního nejsou dostatečně mohutné pro zpracování tlakovou sterilizací. Kromě toho, zpracování pro obnovování antigenu není vhodné pro skríning, při kterém je žádoucí vysoká výkonnost.

Příklady aspektů předkládaného vynálezu, které jsou zde uvedeny, demonstrují použitelnost předkládaného vynálezu pro malignity čípku děložního, včetně testování stěrů z čípku děložního, prsu, malignity močového traktu (testované buď na tkáňových bíopsiích nebo na cytologických nátěrech z moči), tlustého střeva, plic, močového měchýře, kůže, hrtanu, jícnu, bronchu, lymfatických uzlin a pro hematologické malignity, a také pro testování krve a séra na přítomnost metastas karcinomů a sarkomů. Předkládaný vynález může být dále použit pro hodnocení pre-maligních abnormalit epitelových buněk žláz čípku děložního (glandulární íntraepítelové neoplasie, GIN) nebo premaligních abnormalit v jiných tkáních. Předkládaný vynález je zejména vhodný pro použití při cytologickém nebo biochemickém hodnocení jiných klinických vzorků, ve kterých může být detekce neoplastických buněk nebo jejich odlišení od buněk vykazujících • ·« • 9 999 • · · t 9 · 9 9 9 9 9

9999 99 ftft ftft ftft ·· reaktivní změny velmi obtížné. Mezi takové vzorky patří sputum, vzorky z bronchioalveolární laváža, moč a kartáčkové stery z alimentárního traktu (včetně jícnu, žaludku a slinivky břišní, vývodu žlučových cest a slinivky břišní). Předkládaný vynález může být použit pro histologické nebo biologické hodnocení tkáně tehdy, když může umožnit hodnocení proliferace přesnější predikci klinického vývoje, a/nebo tehdy, může-li umožnit přesnější výběr terapie. Vzorky mohou zahrnovat malignity glandulárních buněk (například malignity plic, prsu, tlustého střeva, prostaty, žaludku), spinocelulárních buněk (například plic, kůže jícnu) nebo jiných typů epitelových buněk (například malignity močového měchýře, ureteru, ledvin, vaječníků).

Vysoký stupeň specifícity pozorovaný v pokusech popsaných dále využívajících anti-Ccd6 protilátky a anti-MCM protilátky, včetně různých anti-MCM2, anti-MCM3, anti-MCM4, anti-MCM5, anti-MCM6 a anti-MCM7 protilátek, které byly provedeny na různých karcinomech prsu, poskytuje imunocytologícké a biochemické způsoby pro diagnostiku karcinomu prsu. Tyto způsoby mohou být použity na biopsiích z prsu nebo na vzorcích získaných aspirací tenkou jehlou (FNA) nebo na vzorcích kapaliny z vůvodů mléčné žlázy a mohou být použity pro skríningové programy.

Vzorky, které mají být uvedeny do kontaktu s vazebným činidlem podle předkládaného vynálezu, mohou být připraveny za použití jakékoliv dostupné techniky, která umožňuje navázání specifické vazebné molekuly na cílový polypeptid, jako je například Ccd6, MCM5 nebo jiné MCM, jak byly uvedeny výše, stanovení hladiny nukleové kyseliny, enzymatické aktivity atd., podle různých provedení předkládaného vynálezu. Různé techniky jsou standardní v oboru, například techniky používané pro fixaci buněk pro Pap test (pro molekuly, jako jsou protilátky vážící se na cílový polypeptid).

Reaktivita vazebného činidla, jako je protilátka, s normálními a testovanými vzorky může být určena jakýmikoliv vhodnými prostředky. Označení navázáním jednotlivých reportérových molekul- je jednou možností. Reportérové molekuly •t mohou přímo nebo nepřímo vyvolávat detekovatelné, a lépe I měřitelné, signály. Vazba reportérové molekuly může být přímá *

nebo nepřímá, kovalentní (například prostřednictvím peptidové vazby) nebo nekovalentní. Vazby peptidovou vazbou může být také výsledkem rekombinantní exprese fúsního genu kódujícího vazebnou molekulu (například protilátku) a reportérovou molekulu.

Jedním výhodným způsobem je kovcalentní vazba každého vazebného činidla s určitým fluorchromem, fosforem nebo laserovým barvivém se spektrálně izolovanou absorpcí nebo emisními charakteristikami. Mezi vhodné fluorchromy patří fluorescein, rhodamin, phycoerythrin a Texas-červeň. Mezi vhodná chromogenní barviva patří diaminobenzidin.

Mezi jiné reportérové molekuly patří makromolekulám! koloidní částice nebo částicový materiál, jako jsou latexové . korálky, které jsou nabarvené, magnetické nebo paramagnetické, a biologicky aktivní činidla, která přímo nebo nepřímo * vyvolávají detekovatelné signály, které mohou být detekovány vizuálně, elektronicky nebo jinak. Těmito molekulami mohou být enzymy, které katalyzují reakce, při kterých vzniká zabarvení nebo dochází ke změně zabarvení, nebo mohou způsobovat změny elektrických vlastnosttí, například. Tyto molekuly mohou být molekulárně excitovatelné, takže přechod elektronů mezi jednotlivými energetickými stavy vede k charakteristickým • ·· · *φφφ • · · · · « * · • · · · ·« · ··♦· »· ·# «« φ φ * · • φ · « « φ < · φ« ·φ spektrálním absorpcím nebo emisím. Mezi tyto molekuly patří chemické skupiny použité spolu s biosensory. Mohou být použity detekční systémy biotin/avidín nebo biotin/streptavidin a systémy založené na použití alkalické fosfatasy. Dalšími příklady jsou křenová peroxidasa a chemiluminiscence.

Způsob stanovení vazby není aspektem předkládaného vynálezu a odborníci v oboru jsou schopni vybrat vhodný způsob podle své volby a obecných pravidel.

v pokusech popsaných dále bylo použito křenové peroxidasy. Další pokusy byly provedeny za použití alkalické fosfatasy a byly dosaženy podobné výsledky (například na stěrech z čípku děložního). Alkalická fosfatasa může být citlivějším detekčním systémem než křenová peroxidasa, ale vývoj barvy je méně kompatibilní s PAP barvením.

Jeden protokol pro protilátkové barvení stěrů z čípku děložního, který byl použit v provedeních předkládaného vynálezu, je následující:

1. Fixace čerstvých stěrů po dobu 5 minut v acetonu;methanolu (50:50). (Alternativou je - pokud byl stěr předem fixován pomocí Cytofix, což je zpracováni alkoholem a voskem, které je standardní v UK pro zpracování vzorků stěrů z čípku . děložního a které umožňuje bezpečný transport do skríningového centra - odstranění Cytofixu ponořením do methylovaného » alkoholu na dobu 10 minut. Pokud byl stěr pokryt jakoukoliv jinou ochrannou vrstvou, tak může být použito jakékoliv vhodné zpracování pro expozici vzorku protilátce).

2. Promytí v Tris-pufrovaném salinickém roztoku (TBS) po dobu 5 minut.

3. Promytí ve 4 mM deoxycholatu sodném v TBS po dobu 15 minut pro permeabilizaci.

• ·· • · » * • 4 · ···· ··

4. Promytí v TBS + 0,3% Triton X100 po dobu 5 minut.

5. Opakování kroku 4.

6. Promytí v TBS + 0,025% Triton X100 po dobu 5 minut.

7. Odstranění nadbytku kapaliny bez toho, že by se vzorek nechal vyschnout.

8. Přesun sklíček do zvlhčované komůrky a dodání 200 μί kozího séra v TBS na každé sklíčko na dobu minimálně 2 hodin (nebo přes noc).

9. Odstranění nadbytku kapaliny bez toho, že by se vzorek nechal vyschnout.

10. Umístění 200 μΐ primární protilátky ředěné v TBS obsahujícím 0,1% Triton a 1% BSA na každé sklíčko a inkubace přes noc při 4 °C na orbitální třepačce.

11. Přesun sklíček do nosiče a promytí v TBS + 0,3% Triton X100 po dobu 5 minut.

12. Promytí v TBS + 0,025% Triton X100 po dobu 5 minut.

13. Opakování kroku 12.

14. Odstranění nadbytku kapaliny bez toho, že by se vzorek nechal vyschnout.

15. Přesun sklíček do zvlhčované komůrky a dodání 200 μΐ biotinylované kozí anti-králičí sekundární protilátky (Dako) v ředění 1:500 v TBS obsahujícím 1% BSA na dobu 1 hodiny na každé sklíčko.

16. Po dobu přítomnosti sklíček v sekundární protilátce příprava SABC roztoku.

17. Přesun sklíček do nosiče a promytí v TBS po dobu 5 minut.

18. Umístění sklíček do činidla blokujícího endogenní peroxidasu s 0,6% peroxidem vodíku na dobu 10 minut.

19. Promyt v TBS po dobu 5 minut.

20. Opakování kroku 19 - 2-krát.

21. Přesun sklíček do zvlhčované komůrky a dodání 200 μί SABC roztoku na dobu 30 minut na každé sklíčko.

• ···» · · * * • «· ·· · »« · ··· · · · ·* ·· ·· ··

22. Přesun sklíček do nosiče a promytí v TBS po dobu 5 minut.

23. Opakování kroku 22.

24. Vyvíjení v DAB roztoku po dobu 10 minut.

25. Promývání v tekoucí vodě z vodovodu po dobu 5 minut.

26. Umístění sklíček v roztoku Harrisova hematoxylinu na dobu 6 sekund.

27. Promývání v tekoucí vodě z vodovodu po dobu 1 minuty.

28. Diferenciace v 0,5% kyselině chlorovodíkové po dobu 1-2 sekund.

29. Promývání v tekoucí vodě z vodovodu po dobu 5 minut.

30. Promytí v 50% methanolu po dobu 2 minut.

31. Promytí v 70% methanolu po dobu 2 minut.

32. Promytí v 90% methanolu po dobu 2 minut.

33. Promytí ve 100% methanolu po dobu 2 minut.

34. Umístění v pracovním roztoku Orange G na dobu 2 minut.

35. Promytí ve 100% methanolu po dobu 7 sekund a jemné protřepání.

36. Opakování kroku 35.

37. Umístění v roztoku EA50 na dobu 2 minut.

38. Promytí ve 100% methanolu po dobu 7 sekund a jemné protřepání.

39. Opakování kroku 38.

40. Umístění sklíček v xylenu pro projasnění na dobu 5 minut.

41. Opakování kroku 40 - 2-krát.

42. Aplikace krycích sklíček za použití DEPEX prostředku.

Stery pro imunofluorescenci mohou být připraveny podobným způsobem (a byly). Po aplikaci sekundární protilátky jsou inkubovány se streptavidín FITC-konjugovanou protilátkou po dobu 1 hodiny a potom jsou kontrastně barveny na DNA za použití propidiumjodidu/RNAsy A (oboje od Sigma, v koncentraci 50 ng/ml) a potom jsou promyty a fixovány v glycerolu/PBS/fenylendiaminu.

·♦·· v ~ *· * 9 9 • · • 999 • 9 9 9 9 9 • 9 99

9 9

9«

9 9

9 9 • 9 9

9*

Výhodnými vazebnými molekulami pro použití v předkládaném vynálezu jsou protilátky, přirozené ligandy cílových molekul, malé molekuly, které se cíleně váží na jeden nebo více epitopů na cílové molekule a vazebné domény receptoru T buněk.

Protilátky, které jsou specifické pro vybrané cílové molekuly, jako je Cdc6, MCM5 nebo jiné MCM, mohou být získány za použití technik, které jsou standardní v oboru. Způsoby pro produkci protilátek zahrnují imunizaci savců (například myší, krys, králíků, koní, koz, ovcí, opic nebo ptáků, například kuřat) proteinem nebo jeho fragmentem nebo buňkou nebo virem exprimujícím protein nebo fragment. Imunizace DNA kódující cílový polypeptid je také možná. Protilátky mohou být získány od imunizovaných zvířat za použití jakékoliv z mnoha technik známých v oboru a mohou být vyšetřovány, výhodně za použití vazby protilátky na vybraný antigen. Například může být použito technik westernového přenosu nebo imunosrážení (Armitage et al., 1992, Nátuře 357: 80-82).

Produkce monoklonálních protilátek je v oboru dobře známá. Monoklonální protilátky mohou být upraveny technikami rekombinantní DNA technologie tak, aby byly připraveny jiné protilátky nebo chimérické molekuly, které si zachovávají specificitu původní protilátky. Takové techniky mohou obsahovat navázání DNA kódující variabilní region imunoglobulinu nebo komplementaritu určující regiony (CDR) protilátky na DNA kódující konstantní regiony nebo konstantní regiony plus regiony pracovního rámce jiného imunoglobulinu. Viz, například, EP184187A, GB 2188638A nebo EP-A-0239400. Hybridom produkující monoklonální protilátky může být upraven genetickou mutací nebo jinými změnami, které mohou, ale nemusí, alterovat specificitu produkovaných protilátek.

·«· · ··

Alternativně nebo jako doplnění k imunizaci savce peptidem může být protilátka specifická pro cílovou molekulu získána z rekombinantně produkované knihivny exprimovaných variabilních domén imunoglubulinů, například za použití lambda bakteriofágu nebo filamentosního bakteriofágu, který zobrazuje funkční imunoglobulinové vazebné domény na svém povrchu; viz, například, WO 92/01047. Knihovna může být naivní, která je konstruované ze sekvencí získaných z organismu, který nebyl imunizován cílovou molekulou, nebo může být připravena za použití sekvencí získaných z organismu, který byl vystaven požadovanému antigenů (nebo jeho fragmentu).

Protilátky mohou být modifikovány mnoha způsoby. Proto zahrnuje termín protilátka, pokud není uvedeno jinak, jakoukoliv specifickou vazebnou substanci obsahující vazebnou doménu protilátky pro antigen. Tento termín proto zahrnuje protilátkové fragmenty, deriváty a funkční ekvivalenty, včetně jakýchkoliv polypeptidů obsahujících vazebnou doménu imunoglobulinů, ať přirozenou,, nebo syntetickou. Chimérické molekuly obsahující imunoglobulinovou vazebnou doménu nebo její ekvivalent fúsovanou na jiný polypeptid jsou také zahrnuty v tomto termínu. Klonování a exprese chimérických protilátek je popsáno v EP-A-0120694 a v EP-A-0125023.

Bylo prokázáno, že funkce vazby na antigeny může být provedena fragmenty celé protilátky. Příklady vazebných fragmentů jsou: (i) Fab fragment skládající se z VL, VH, CL a CH1 domén; (ii) Fd fragment skládající se z Vh a CH1 domén;

(iii) Fv fragment skládající se z VL a VH domén jedné protilátky; (iv) dAb fragment (Ward, E.S. et al., Nátuře 341: 544-546 (1989)), který se skládá z VH domény; (v) izolované CDR regiony; (vi) F(ab')2 fragmenty, bivalentní fragmenty • tttt • tttttt •tt·* ·· tttt ·· « · ·· skládající se ze dvou navázaných Fab fragmentů; (vii) jednořetězcové Fv molekuly (scFv), ve kterých jsou VH doména a VL doména navázány peptidovou spojovací skupinou, která umožňuje asociaci těchto dvou domén za vzniku vazebného místa pro antigen (Bird et al., Science, 242: 423-426, 1988; Hustton et al., PNAS USA 85: 5879-5883, 1988); (viii) bispecifické jednořetězcové Fv dimery (PCT/US92/09965) a (ix) diprotilátky, multivalentní nebo multispecifické fragmenty konstruované genovou fúsí (WO 94/13804; P. Holliger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993) .

Rekombinantní exprese polypeptidů, včetně protilátek a fragmentů protilátek, je v oboru dobře známá.

Systémy pro klonování a expresi polypeptidu v různých bakteriálních hosittelských buňkách jsou dobře známé. Mezi vhodné hostitelské buňky patří bakterie, savčí buňky, kvasinky a baculovirové systémy. Savčí buněčné linie dostupné v oboru pro expresi heterologních polypeptidů zahrnují ovariální buňky čínského křečka, HeLa buňky, ledvině buňky křečka a mnoho dalších typů buněk. Běžným, výhodným bakteriálním hostitelem je E. coli. Výhodnými hostiteli pro bakulovirovou expresi jsou hmyzí buňky jako je SF9 buněčná linie.

Mohou být vybrány nebo konstruovány vhodné vektory, které obsahují vhodné regulační sekvence, včetně promotorových sekvencí, terminátorových fragmentů, polyadenylačních sekvencí, zesilovačů transkripce, markerových genů a jiných sekvencí, podle potřeby. Dalčí podrobnosti jsou uvedeny, například, v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Postupy transformace závisí na vybraném hostiteli, ale jsou dobře známé v oboru.

···· «· ·· ··

Po produkci pomocí exprese z kódující nukleové kyseliny může být protilátka nebo jiná specifická vazebná molekula namířená proti cílové skupině podle předkládaného vynálezu, jako je například Cdc6, získána a může být izolována, pokud je to bhodné, tak může být konjugována na vhodnou značkovací skupinu nebo reportérovou molekulu, a může být připravena pro použití ve stanovení přítomnosti nebo absence abnormalit buněčného růstu ve tkáňovém vzorku, jako je například stěr z čípku děložního, za použití způsobu podle předkládaného vynálezu.

Hladiny exprese Cdc6 a MCM v nádorech jsou mnohem vyšší než hladiny exprese v normálních tkáních a tyto antigeny mohou být uvolňovány do krve (například při nekrose nádorových buněk) nebo do jiných tělesných kapalin, například do moči nebo do stolice. Specifická vazebná molekula může být použita pro detekci cílové skupiny v tělesné kapalině, například v séru, za použití jakékoliv techniky dostupné v oboru, jako je například DELFIA, ELISA, RIA, westernový přenos. Může být sledována progrese a regrese nádoru, například v odpovědi na léčbu nebo při relapsu. Tak může být způsobem podle předkládaného vynálezu hodnocen vzorek krve nebo jiné tělesné kapaliny, například moči, prostatické tekutiny, tekutiny z prsní bradavky, serosních a ascitických výpotků, mozkomíšního moku a také stolice. Například, vzorek krve může být testován na přítomnost cílového polypeptidu, jako je MCM5 nebo Cdc6, za použití DELFIA, ELISA, RIA, například způsobem, který popsal Williams et al., Clin. Chem. Acta, 1986, 155: 329-344.

Stanovení vazby na cílovou skupinu in vivo může být použito pro identifikaci lokalizace abnormálních buněk v těle. Značené vazebné molekuly proti cílovým skupinám podle předkládaného vynálezu mohou být podány jedinci a může být stanovena vazba v • · · · · · * · · · · ···· ftft «· ·· a« ·· těle. Při navázání radionuklidu na protilátku, například jodu125, india-111, thalia-201 nebo technecia-99m, tak může být pokud se protilátka váže přednostně na nádorovou než na normální tkáň - detekována a kvantifikována přítomnost radioaktivního činidla v nádorové tkáni pomocí gamma-kamery nebo scintigrafie. Kvalita zobrazení nádoru je přímo úměrná poměru signál .-pozadí. Radioaktivní značení techneciem-99m je popsáno v Pak et al., (1992), Nucl. Med. Biol. 19: 699-677. Přehled zobrazování nádorů za použití anti-CEA protilátek je uveden v Goldenberg D.M., Int. J. of Biol. Markers, 1992, 7: 183-188. Specifické vazebné molekuly pro popsaným cílovým polypeptidů mohou být použity v jakýchkoliv metodách prováděných na lidech či na zvířatech pro diagnostitku onemocnění.

Pro Cdc6 a pro MCM proteiny byla popsána ATPasová enzymatická aktivita (Zwerschke et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 23351-23356; Ishimi et al., Cold Sprin Harbor Meeting on Eukaryotic Gene Replication, 3-7 September, 1997). Tyto proteiny mají i jiné enzymatické aktivity, například helikasovou aktivitu, jak popisuje Ishimi et al. (výše).

Hladina cílového proteinu podle předkládaného vynálezu může být stanovena pomocí stanovení jeho enzymatické aktivity ve vzorku. Například byly vyvinuty specifické chromogenní substráty pro enzymatickou aktivitu enzymů jako je křenová peroxídasa (diaminobenzidin) a β-galaktosidasa (X-GAL) .

Exprese Cdc6, MCM5 nebo jiných cílových proteinů může být hodnocena na úrovni nukleových kyselin, například pomocí stanovení hladin mRNA. Wiiliams et al. Cold Sprin Harbor Meeting on Eukaryotic Gene Replication, 3-7 September, 1997) popisuje expresi Cdc6 mRNA v bazích střevních krypt myšího střeva. Způsoby pro detekci RNA jsou dobře známé v oboru a * ·· • v ·♦ ·· ·· *· «to patří mezi ně northernův přenos, přenos na skvrnách, hybridizace in šitu, kvantitativní RT-PCR. Nukleové kyseliny izolované a/nebo přečištěné z jedné nebo více buněk nebo knihovny nukleových kyselin získané z nukleové kyseliny izolované a/nebo přečištěné z buněk (například cDNA knihivny získané z mRNA izolované z buněk) mohou být sondovány za podmínek umožňujících selektivní hybridizaci a/nebo mohou být zpracovány specifickými amplifikačnímí reakcemi pro nukleové kyseliny, jako je polymerasová řetězová reakce (PCR) . Vazba sondy na cílovou nukleovou kyselinu může být měřena pomocí jakékoliv techniky známé odborníkům v oboru. Například, sondy mohou být značeny radioaktivně, fluorescenčně nebo enzymaticky. Jiné techniky nevyužívající značení sond zahrnují vyšetření polymorfismu délky restrikčních fragmentů, amplifíkaci za použití PCR, Štěpení RNAsou a alelově specifické oligonukleotidové sondování.

Pro praktické účely, nebo alepoň pro komerční účely beroucí v úvahu náklady a časovou náročnost, je hodnocení exprese cílového proteinu na proteinové úrovni výhodnější než hodnocení exprese na úrovni nukleových kyselin.

Aspekty předkládaného vynálezu budou nyní ilustrovány v následujících příkladech. Další aspekty a provedení předkládaného vynálezu budou odborníkům v oboru zřejmé.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava protilátek

Protilátky proti Cdc6 byly připraveny za použití následujícího protokolu.

• ftftft ftft

Exprimované sekvence kódující fragmenty lidského proteinu podobného Cdc6 (GenBank přírůstková č. T90351, H59204, N69246, AA045217, AA099980) byly identifikovány podle slabé homologie jejich sekvence s lidským Orel a kvasinkovým Cdc6/Cdcl8. Příslušné klony knihovny byly získány od IMAGE Consortium (Research Genetics lne., USA) a oba řetězce byly sekvencovány za použití ABI PRISM 377 sekvenátoru (Applied Biosystems). Konvenční sekvence všech pěti klonů obsahovala otevřený čtecí rámec o 536 aminokyselinách. Srovnání s později publikovanou sekvencí lidského Cdc6 (Williams et al., 1997) ukázalo 99,7% homologii na proteinové úrovni. Dva separované fragmenty lidského Cdc6 odpovídající aminokyselinám 145-360 a 364-547 byly klonovány jako Xbal-BamHI fragmenty do pET23a expresního vektoru (Novagen) a byly exprimovány v E. coli kmene CL41. Rekombinantní proteinové fragmenty byly přečištěny Ni²⁺agarosovou afinitní chromatografií (Qiagen) a byly použity pro imunizaci. Protilátky byly indukovány a přečištěny dříve popsaným způsobem (Romanowski et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10189-10194). Tři protilátky detekovaly predominantní proužek velikosti 62 kDa v totálních extraktech a v jaderných extraktech HeLa buněk.

Protilátky proti MCM5 byly připraveny následujícím způsobem.

PCR primery byly připraveny podle publikované sekvence lidského MCM5 (Hu et al., 1993, Nucl. Acid Res. 21: 5289-5293). Fragment MCM5 kódující sekvence odpovídající aminokyselinám 367-582 byl amplifikován z reversně transkribované HeLa cDNA a byl klonován jako SphI-BglII fragment do pQE70 expresního vektoru (Qiagen). Protein byl exprimován v BL21 E. coli buňkách a byl přečištěn Ni²⁺-agarosovou afinitní chromatografií (Qiagen). Protilátky byly indukovány dříve popsaným způsobem ·· »* · (Romanowski et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93:

10189-10194).

Příklad 2: Souvislost Cdc6 a MCM5 s buněčnou proliferaci

Již dříve bylo prokázáno pomocí westernového přenosu, že imortalizovaná lidská buněčná linie HeLa exprimuje Cdc6 a MCM5 během buněčného cyklu )Williams et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 142-147; Schlte et al., Eur. J. Biochem., 1996, 235: 144-151). Nedávno bylo popsáno snížení exprese Cdc6 v klidových Wi38 lidských fibroblastech (Williams et al., 1997). Předkldatelé vynálezu také prokázali za použití westernového přenosu, že exprese Cdc6 je snížena, pokud jsou pomocí kontaktní inhibice myší fibroblasty převedeny do klidového stadia (obr. 1).

NIH 3T3 buněčná linie byla zastavena v růstu kultivací do konfluence. Kultury byly udržovány v klidovém stavu po dobu 7 dnů. Buňky byly uvolněny z G0 arestu zpracováním trypsinem a opakovaným přenesením na nové plotny. Ve tříhodinových intervalech byly připravovány solubilní (supernatantové) extrakty a extrakty jaderného proteinu (pelety) a oba extrakty byly zpracovány imunpřenosem s protilátkami proti lidskému MCM5, 0rc2 a Cdc6.

0rc2 (pro klonování viz Gavin et al., Science (1995), 270: 1667-1671) zůstává v klidových buňkách (G0) navázaný na chromatin a jeho množství se významně nezvyšuje při vstupu buněk do buněčného cyklu. Naopak, MCM5 nelze detekovat ve frakci vázané na chromatin (peletě) klidových buněk I přesto, že solubilní frakce obsahuje významné množství MCM5. Orpti MCM5 je Cdc6 zcela nepřítomný v klidových buňkách, ale exprese tohoto proteinu se rychle indukuje při vstupu buněk do <·ι* «·

9» buněčného cyklu. Podobné výsledky byly také získány při použití lidské EJ13 buněčné linie {odvozené z karcinomu močového měchýře).

Tyto výsledky ukazují, že absence Cdc6 v klidových buňkách je obecným jevem.

Tyto studie byly rozšířeny o imunofluorescenci a použití anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátek na celé buňky.

Bylo také zjištěno, že exprese Cdc6 a MCM5 je také snížena tehdy, jsou-li lidské novorozenecké fibroblasty (NHF) indiukovány do klidového stadia pomocí kontaktní inhibice. NHF byly kultivovány do konfluence a byly udržovány v klidovém stadiu po dobu 3 dnů. Buňky byly uvolněny z GO arestu zpracováním trypsinem a opakovaným přenesením na nové plotny.Celé buňky byly potom odebírány v různých časech po uvolnění do doby jejich vstupu do S-fáze. Barvení propidiumjodidem bylo použito pro zobrazení DNA a výsledky byly srovnávány s barvením vzorků anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami.

Klidové (GO) buňky nevykazují žádnou Cdc6 ímunoreaktivitu a vykazují velmi slabý signál s anti-MCM5 protilátkou. Nicméně, během vstupu do buněčného cyklu a S-fáze byla pozorována silná jaderná imunoreaktivita pro Cdc6 a MCM5.

Tyto studie naznačují, že anti-Cdc6 protilátky mohou být markérem pro proliferaci buněk, podobně jako PCNA a Ki67. Ani PCNA, ani KI67 se neosvědčily uspokojivým způsobem pro cytologické vyšetření čípku děložního.

Příklad 3: Anti-Cdc6 a anti-MCM5 vazebné molekuly detekují • ** *·· «φ «V ·» φφ ·· abnormální (například nádorové) buňky mnohem účiněji než protilátky proti PCNA nebo KI67

Výsledky uvedené v příkladu 2 naznačují, že exprese Cdc6 je podobná expresi PCNA nebo Ki67, z nichž se ani jeden neosvědčil pro cytologické vyšetření čípku děložního. Předkladatelé vynálezu srovnávali protilátky proti těmto proteinům na řezech z normálních a chorobně změněných čípků děložních.

Imunobarvení cervikálních SIL na konvenční proliferační markéry PCNA a Ki67 ukazuje odlišný charakter imunoreaktivity ve srovnání s barvením na Cdc6 nebo MCM5. V normálním čípku deložním vykazují protilátky proti všech čtyřem antigenům pozitivní imunobarvení epitelových buněk omezených a bazální a parabazální vrstvy. Nebylo pozorováno žádné imunobarvení metaplastických, stromálních nebo zánětlivých buněk. V SIL s vysokým I nízkým stupněm malignity (LSIL a HSIL) vykazovaly protilátky proti Cdc6 a MCM5 pozitivní imunobarvení většiny (>95%) abnormálních buněk. Naopak, imunobarvení na PCNA a Ki67 bylo pozitivní pouze pro menšinu populace (<30%)abnormálních buněk obou stupňů malignity v SIL. Koilocyty, které jsou charakteristické pro LSIL a které odráží cytopatický efekt HPV, vykazovaly všechny pozitivní imunobarvení proti Cdc6 a MCM5, zatímco pouze menšina těchto buněk (20%) byla pozitivně barvena na PCNA nebo Ki67.

Mnohem vyšší hladina barvení abnormálních buněk umožňuje výhodnější použití anti-Cdc6 nebo anti-MCM5 vazebných molekul než anti-PCNA a anti-Ki67 molekul ve skrínigu čípků děložních, při kterém je vzorek tkáně získán sterem z povrchu epitelu.

*· · · ·Φ

Φ Φ · «· ·* μπι řezy byly umístěny na sklíčka a byly zbaveny vosku v xylenu. Endogenní peroxidasová aktivita byla utlumena inkubací s 0,6% peroxidem vodíku ve 100% methanolu po dobu 3-5 minut při teplotě okolí. Řezy byly promývány ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku po dobu 2x5 minut a potom byly blokovány přibližně 100 μΐ na řez 10% fetálním telecím sérem (FCS) ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS). Sklíčka byla drenována a nadbytek tekutiny byl odstraněn. Primární protilátky byly ředěny 1:20 v PBS obsahujícím 2,5% FCS a 25-50 μΐ tohoto ředění bylo přidáno ke každému řezu. Inkubace byla provedena po dobu 45 minut při teplotě okolí ve zvlhčované komůrce. Sklíčka byla potom promývána po dobu 3x5 minut v PBS a potom bylo provedeno blokování 20% králičím sérem pro antiPCNA nebo anti-Ki67 a 20% oslím sérem pro anti-Cdc6 nebo antiMCM5 v PBS po dobu 15 minut. Po odstranění blokovací protilátky a po vysušení řezů byla na dobu 30 minut pří teplotě okolí přidána biotinylovaná králičí anti-myší sekundární protilátka (pro anti-Kl67 nebo anti-PCNA) nebo anti-králičí sekundární protilátka (pro anti-Cdc6 nebo anti-MCM5) v ředění 1:200 v PBS obsahujícím 10% normální lidské sérum. Po promývání po dobu 3 x 5 minut v PBS byl na dobu 30 minut při teplotě okolí přidán komplex streptavidin-biotin-křenová peroxidasa v ředění 1:500 v PBS. Po promývání po dobu 3x5 minut v PBS byl přidán diaminobenzidinový substrát v koncentraci 1% ve 100 mM Tris-Cl (pH 7,6) obsahujícím 0,005% peroxid vodíku a byla provedena inkubace při teplotě okolí po dobu 5 minut. Reakce byla ukončena promytím tekoucí vodou a řezy byly jemně barveny Gillovým haematoxylinem, byly dehydratovány v graduovaných ethanolech a byly promývány po dobu 2x6 minut v xylenu. Krycí sklíčka byla aplikována za použití DPX připevňovacího media.

*··* ··

Sériové řezy normálních čípků děložních byly barveny na PCNA, Ki67, MCM5 a Cdc6 za použití příslušných protilátek. Všechny tyto protilátky vykazovaly podobný charakter imunoreaktivíty s pozitivními buňkami, které byly omezeny pouze na bazální a parabazální vrstvy.

Sériové řezy z čípků děložních se SIL s nízkým stupněm malignity (CINI) byly barveny na PCNA, K167, MCM5 a Cdc6 za použití příslušných protilátek. Dysplasie je prominentní v dolní třetině spinocelulárního epitelu a je asociována se změnami souvisejícími s HPV (koilocytosou), která dosahuje až povrchu. PCNA a KI67 vykazují ložiskovou imunoreaktivitu, která je omezena na dolní 1/3 epitelu a pouze malá část atypických buněk je pozitivně barvena. Naopak, anti-Cdc6 a anti-MCM5 vykazují imunoreaktivitu v celé tloušťce preparátu s pozitivním barvením všech atypických buněk včetně koilocytů v povrchovějších vrstvách epitelu.

Sériové řezy z čípků děložních se SIL s vyšším stupněm malignity byly barveny na PCNA, Ki67, MCM5 a Cdc6 za použití příslušných protilátek. Dysplasie je přítomná ve všech vrstvách epitelu. PCNA a Ki67 vykazují podobný charakter imunoreaktivíty s barvením v celé tloušťce preparátu, ale pouze menšina populace atypických buněk je pozitivní (do přibližně 30%) . Cdc6 a MCM5 také barví epitel v celé tloušce. Nicméně, na rozdíl od PCNA a Ki67, vykazují Cdc6 a MCM5 pozitivní barvení všech atypických buněk.

Tyto výsledky ukazují na použitelnost anti-Cdc6 nebo antiMCM5 specifických vazebných molekul pro hodnocení stavu čípku děložního pomocí stanovení vazby na stěr. Při steru je získán vzorek pouze z povrchové vrstvy epitelu čípku děložního, takže je významné dosažení vysokého stupně barvení. Takové vysoce • · ·· · ·· účinné barveni získané při použití anti-Cdc6 a anti-MCM5 činidel pro testování Časných stadií abnormalit (SIL s nízkým stupněm malignity, CINI), kterého není dosaženo při použití anti-PCNA nebo anti-Kl67, je velmi signifikantní. Kromě toho, barvení v celé tloušťce preparátu získané za použití anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátek v LSIL vzorcích, ale nezískané při použití anti-PCNA ani anti-Ki67 protilátek, ukazuje na užitečnost použití těchto protilátek pro hodnocení stěrů z čípků děložních na časná stadia potenciálně pre-maligních lézí.

Příklad 4: Cdc6 a MCM5 protilátky detekují abnormální buňky ve sterech z čípku děložního

Příklad 3 ukazuje na význam anti-Cdc6 a anti-MCM5 vazebných moleku pro detekci potenciálně pre-maligních lézí v řezech z čípku děložního. Další experimentální výsledky ukazují, že tyto vazebné molekuly jsou stejně účinné v detekci abnormálních buněk v preparátech stěrů z čípku děložního.

Stěry z čípku děložního byly fixovány během 10 minut ve formaldehydu (4% čerstvě připraveného z paraformaldehydu ve fosfátem pufrovaném salínickém roztoku). Fixovaný materiál byl potom barven anti-Cdc6 protilátkami (1:200) nebo anti-MCM5 protilátkami (1:200) a potom oslí anti-králičí polyklonální protilátkou konjugovanou s fluorescenčním činidlem isothiokyanatanem (Amersham, 1:100). Celková DNA byla značena propidiumjodidem. Zobrazení bylo získáno za použití skenovací laserové konfokální mikroskopie (Bio-Rad MRC 1024). V těchto zobrazeních je celková DNA červená, Cdc6 nebo MCM5 imunobarvení je zelené a imunoreaktivní jádra jsou žlutá.

Vzorky normálních stěrů z čípku děložního vykazovaly charakteristický proužek paralelně uspořádaných ·* »» endocervíkálních buněk a smíšenou populaci superficiálních a metaplastických spinocelulárních buněk. Nebyla detekována specifická antí-Cdc6 ani anti-MCM5 imunoreaktivita se žádnou z testovaných protilátek.

Abnormální stery obsahující dyskaryotické buňky (atypické spinocelulární buňky) vykazovaly pozitivní barvení se třemi různými anti-Cdc6 protilátkami a s anti-MCM5 protilátkou. Koilocyty také vykazovaly silnou imunoreaktivitu s anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami. Žádná z okolních normálních superficiálních/metaplastických buněk nevykazovala Cdc6 nebo MCM5 imunoreaktivitu.

Výsledky byly získány za použití různých anti-Cdc6 protilátek, přednostně barvících LSIL buňky, včetně koilocytů, vzhledem k velmi nízkému pozadí ve sterech z normálních čípků děložních, nebo v normálních buňkách ve sterech z abnormálních Čípků děložních. Tyto výsledky byly také získány při použití anti-MCM5 protilátky.

Podobné výsledky byly pozorovány při použití anti-MCM5 protilátek.

Příklad 5: Anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátky přednostně barví nádorové buňky v prsu

Anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátky byly testovány na jiném běžném orgánu postiženém nádory, na prsu. Fixování a barvení tkáně prsu bylo stejné, jak je popsáno v příkladech 3 a 4 pro stery z čípku děložního.

Anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátky byly testovány na různých karcinomech prsu.

«· tttt • tttt • tt tttt • tt

Zatímco v normálním prsu není detekováno žádné imunobarvení, silně pozitivní barvení antí-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami bylo pozorováno v různých histologických typech karcinomu prsu, včetně málo a dobře diferencovaného invazivního duktálního karcinomu. Málo diferencovaný adenokarcinom také vykazoval silně pozitivní barvení těmito protilátkami. Důležité je, že normální stromální buňky v okolí nádoru byly negativní.

Příklad 6: Analýza vzorků krve

Archivované vzorky krve od pacientů s diseminovaným metastatickým onemocněním byly testovány na přítomnost MCM5 a Cdc6 za použití enzymového imunosorbentního testu, jak je popsán ve Williams et al., Clin. Chem. Acta, 1986, 155: 329344. Množství solubílního Cdc6 a MCM5 v séru koreluje s obsahem nádoru.

Příklad 7: Srovnání stěrů a zmrazených řezů s parafinovými tkáňovými řezy zpracovanými pro zpřístupnění antigenu

Imunoperoxidasové barvení 5 gm řezů z normálního čípku fixovaného formalinem ponořeného do parafinu (7 vzorků), LSIL (5 vzorků), HSIL (6 vzorků) a spinocelulárního karcinomu (6 vzorků) bylo provedeno s protilátkami proti Ki67, PCNA, MCM5 a Cdc6.

μη řezy byly umístěny na sklíčka a byly zbaveny vosku v xylenu. Endogenní peroxidasová aktivita byla utlumena inkubací s 0,6% peroxidem vodíku ve 100% methanolu po dobu 30 minut při teplotě okolí. Řezy byly promývány po dobu 2 minut v ultračisté *··· ·· to · to to· *· vodě a potom byly tlakově sterilizované během 2 minut v pufru tvořeném citrátem sodným. Řezy byly promývány v Tris-pufrovaném salinické roztoku (TBS) po dobu 2x5 minut a potom byly blokovány přibližně 100 μϊ na řez 10% kozím sérem v TBS.

Sklíčka byla drenována a nadbytek tekutiny byl odstraněn. Primární protilátky byly ředěny 1:20 v TBS obsahujícím 1% BSA a 25-50 μϊ tohoto ředění bylo přidáno ke každému řezu. Inkubace byla provedena přes noc při 4 °C ve zvlhčované komůrce. Sklíčka byla potom promývána po dobu 3x5 minut v TBS a potom byla přidána biotinylovaná kozí anti-králičí sekundární protilátka v ředění 1:500 v TBS obsahujícím 1% BSA na dobu 30 minut při teplotě okolí. Po promývání po dobu 3x5 minut v TBS byl na dobu 30 minut při teplotě okolí přidán komplex streptavidinbiotin-křenová peroxidasa v ředění 1:500 v TBS. Po promývání po dobu 3x5 minut v TBS byl přidán diaminobenzidinový substrát v koncentraci 1% v TBS obsahujícím 0,005% peroxid vodíku a byla provedena inkubace při teplotě okolí po dobu 10 minut. Reakce byla ukončena promytím tekoucí vodou a řezy byly jemně barveny haematoxylinem, byly dehydratovány v graduovaných ethanolech a byly projasněny v xylenu. Krycí sklíčka byla aplikována za použití DPX připevňovacího media.

Imunoperoxídasové barvení zmrazených tkáňových řezů z normálního čípku děložního (8 vzorků}, LSIL (8 vzorků) a HSIL (9 vzorků) bylo provedeno s protilátkami proti Ki67, PCNA, MCM5 a Cdc6.

Zmrazené řezy byly fixovány po dobu 10 minut v acetonu. Endogenní peroxidasové aktivita byla utlumena inkubací s 0,6% peroxidem vodíku ve 100% methanolu po dobu 30 minut při teplotě okolí. Řezy byly potom promyty v TBS a byly blokovány přes noc 10% kozím sérem v TBS. Primární prottilátky byly ředěny 1:200 v • » • ·· • ft ft·· ft · · <

ft ftft ft • · · ftftft· ···· ftftftft ft* «· ftft ftft ··

TBS obsahujícím 1% BSA a byly inkubovány přes noc při 4 °C.

Přidání sekundární protilátky bylo provedeno způsobem popsaným výše pro fixované tkáňové řezy.

Sensitivita barvení anti-MCM5 a anti-Cdc6 protilátkami byla mnohem vyšší než sensitivita barvení anti-PCNA a antí-Kl67 protilátkami, když bylo toto barvení provedeno na zmrazených řezech.

Na normální tkáni, LSIL a tkáni spinocelulárního karcinomu fixované ve formalinu, zanořené do parafinu a zpracované tlakovou sterilizací, způsobovaly anti-PCNA, anti-MCM7, antiMCM5 a anti-Cdc6 podobný charakter barvení. Protilátka proti Ki67 byla ve srovnání s těmito protilátkami mnohem méně sensitivní s pouze ložiskovým slabým barvením LSIL a spinocelulárního karcinomu.

Příklad 8: Barvení anti-MCM7 protilátkami zmrazených řezů a tkání zpracovaných pro zpřístupnění antigenu

Čtyři zmrazené řezy čípku děložního klasifikovaného jako HSIL byly barveny anti-MCM7 protilátkou.

Pozorovaný charakter barvení byl stejný jako charakter barvení získaný s anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami.

Tyto výsledky se liší od výsledků, které publikovat Hiraiwa et al. (Int. J. Cancer, 1997, 74: 180-184), který zjistil podobný charakter imunobarvení pro PCNA a MCM7 (hCDC47) v několika lidských tkáních a ve třech typech lidských nádorů, které byly zpracovány pro zpřístupnění antigenu.

♦ ΦΦΦ φφ » φ φ φφ φ*

Μ Φ

ΦΦ φφ

Nicméně, v souladu s Hiraiwa et al., byly charaktery barvení získané s anti-MCM7 protilátkami na parafinových tkáňových řezech normálního čípku děložním, LSIL a spinocelulárního karcinomu zpracovaných pro zpřístupnění antigenu podobné výsledkům získaným pro anti-PCNA protilátky. Jak je uvedeno v příkladu 7, charaktery barvení pro anti-MCM5 a anti-Cdc6 protilátky na takových řezech byly podobné výsledkům získaným pro anti-PCNA protilátky.

Příklad 9: Barvení s anti-MCM2 protilátkami

Králičí polyklonální anti-MCM2 protilátky byly použity pro barvení dvou zmrazených řezů z normálního čípku děložního a čtyř zmrazených řezů z čípku děložního s HSIL (z nichž každý obsahoval normální epitel čípku děložního).

Normální ektocervix vykazoval barvení jader pouze v bazální vrstvě, bez exprese v superficiálních diferencovaných buňkách. Naopak, bylo detekováno jaderné barvení HSIL buněk v celé tloušťce abnormálního epitelu. Endocervikální buňky byly bez exprese.

Příklad 10: Barvení s anti-MCM3 protilátkami

Králičí polyklonální anti-MCM3 protilátky byly použity pro barvení zmrazeného řezu z normálního čípku děložního a dvou zmrazených řezů z čípku děložního s HSIL {z nichž každý obsahoval normální epitel čípku děložního).

Normální ektocervix vykazoval spíše granulami barvení jader pouze v bazální vrstvě, bez jaderné exprese v superficiálních diferencovaných buňkách. Bylo detekováno určité bazální barvení cytoplasmy keratinocytů. Naopak, bylo detekováno jaderné * * tt · tt * ♦ » · » « « • 9 9 tttt#· tt··· **·· «· «# tt· tt· tttt barvení HSIL buněk v celé tloušťce abnormálního epitelu. Bylo detekováno určité barvení endocervikálního hlenu, ačkoliv jádra endocervikálních buněk byla negativní.

Polyklonální protilátky proti lidskému MCM3 byly také použity pro barvení čtyř stěrů HSIL a dvou stěrů LSIL (z nichž každý obsahoval normální cervikální buňky}. V každém případu bylo detekováno jaderné barvení SIL buněk. Kromě toho bylo detekováno bazální cytoplasmatické barvení keratinocytů a určité barvení jader endocervikálních buněk při použitém ředění primární protilátky.

Polyklonální anti-Xenopus MCM3 protilátky byly použity pro barvení zmrazených řezů HSIL. Zkřížená reaktivita anti-Xenopus MCM3 protilátek s lidským MCM3 byla potvrzena westernovým přenosem a lokalizací na tkáňových řezech. Bylo detekováno jaderné barvení HSIL buněk v celé tloušťce abnormálního epitelu.

Příklad 11: Barvení s anti-MCM4 protilátkami

Králičí polyklonální protilátky proti lidskému MCM4 byly použity pro barvení zmrazeného řezu z normálního čípku děložního a dvou zmrazených řezů z čípku děložního s HSIL (z nichž každý obsahoval normální epitel čípku děložního).

Normální ektocervix vykazoval spíše granulám! barvení jader pouze v bazální vrstvě, bez jaderné exprese v superficiálních diferencovaných buňkách. Bylo detekováno určité bazální barvení cytoplasmy keratinocytů. Naopak, bylo detekováno jaderné barvení HSIL buněk v celé tloušťce abnormálního epitelu, se silným barvením na povrchu jader. Bylo detekováno slabé barvení ··♦♦ ·♦ » * * φ φφ φφ φ φ φ φ· « jader endocervikálních buněk při použitém ředění primární protilátky.

Polyklonální protilátky proti lidskému MCM4 byly také použity pro barvení dvou stěrů HSIL (z nichž každý obsahoval normální cervikální buňky). V každém případu bylo detekováno jaderné barvení HSIL buněk. Kromě toho bylo detekováno bazální cytoplasmatícké barvení keratinocytů a určité barvení jader endocervikálních buněk pří použitém ředění primární protilátky.

Příklad 12: Barvení s anti-MCM6 protilátkami

Králičí polyklonální protilátky proti lidskému MCM6 byly použity pro barvení zmrazeného řezu z normálního čípku děložního a dvou zmrazených řezů z čípku děložního s HSIL (z nichž každý obsahoval normální epitel čípku děložního).

Normální ektocervix vykazoval silné barvení jader pouze v bazální vrstvě, bez jaderné exprese v superficiálních diferencovaných buňkách. Naopak, bylo detekováno silné jaderné barvení HSIL buněk v celé tloušťce abnormálního epitelu. Bylo detekováno určité barvení endocervikálního hlenu, ale minimální barvení jader endocervikálních buněk.

Polyklonální protilátky proti lidskému MCM6 byly také použity pro barvení čtyř stěrů HSIL a čtyř stěrů LSIL (z nichž každý obsahoval normální cervikální buňky). V každém případu bylo detekováno jaderné barvení SIL buněk. Kromě toho bylo detekováno bazální cytoplasmatícké barvení keratinocytů a určité barvení jader endocervikálních buněk při použitém ředění primární protilátky.

Příklad 13: Další pokusy s barvením anti-MCM7 protilátkami ···· »« ft • · ft * ftft * « ftft ftft ftft ftft

Králičí polyklonální protilátky proti lidskému MCM7 byly použity pro barvení tří zmrazených řezů z normálního čípku deložního, šesti zmrazených řezů z čípku deložního s HSIL a zmrazeného řezu z čípku deložního s SCC (z nichž každý obsahoval normální epitel čípku deložního).

Normální ektocervix vykazoval barvení jader pouze v bazální vrstvě, bez jaderné exprese v superficiálních diferencovaných buňkách. Bylo detekováno určité bazální barvení ektoplasmy keratinocytů. Naopak, bylo detekováno silné jaderné barvení většiny HSIL buněk v celé tloušťce abnormálního epitelu. Při použitém ředění primární protilátky bylo detekováno určité barvení endocervikálního hlenu, a slabé barvení jader endocervikálních buněk.

Polyklonální protilátky proti lidskému MCM7 byly také použity pro barvení dvou stěrů HSIL a dvou stěrů LSIL (z nichž každý obsahoval normální cervikální buňky). V každém případu bylo detekováno jaderné barvení SIL buněk. Kromě toho bylo detekováno bazální cytoplasmatické barvení keratinocytů a určité barvení jader endocervikálních buněk při použitém ředění primární protilátky.

Polyklonální anti-Xenopus MCM7 protilátky (jejichž zkřížená reaktivita s lidským MCM7 byla potvrzena westernovým přenosem a lokalizací na tkáňových řezech) byly použity pro barvení zmrazených řezů HSIL. Bylo detekováno jaderné barvení HSIL buněk v celé tloušťce abnormálního epitelu.

Metody

Příprava stěrů z čípku deložního ·

···· ·« ·*

Čerstvé stery byly fixovány (5 minu v 50:50 acetonu:methanolu) a byly sušeny vzduchem. Po utlumení endogenní peroxidasové aktivity (způsobem uvedeným výše) byly buňky permeabilizovány (4 mM deoxycholat sodný po dobu 10 minut), promyty (TBS s 0,25% Triton X-100) a blokovány přes noc 10% kozím sérem v TBS. Primární protilátky byly ředěny 1:200 v TBS obsahujícím 1% BSA a byla provedena inkubace přes noc při teplotě 4 °C. Řezy byly potom promývány po dobu 3x5 minut v TBS a potom byla přidána biotinylovaná králičí sekundární protilátka (Dako) v ředění 1:500 v TBS obsahujícím 1%BSA na dobu 30 minut při teplotě okolí. Po 3 x 5 minutovém promytí v TBS byl při teplotě okolí na 30 minut přidán komplex streptavidin - křenová peroxidasa (Dako) v ředění 1:500 v TBS. Po 3 x 5 minutovém promytí TBS byl přidán diaminobenzidinový substrát v koncentraci 1% v TBS obsahujícím 0,005% peroxid vodíku a byla provedena inkubace pří teplotě okolí po dobu 10 minut. Reakce byla ukončena vypláchnutím tekoucí vodou a řezy byly jemně kontrastně barveny haematoxylinem, byly dehydratovány v graduovaném ethanolu a byly projasněny xylenem. Krycí sklíčka byla aplikována za použití DPX připevňovacího media.

Imunofluorescence

Čerstvě získaný materiál ze stěrů z čípku děložního byl suspendován v 0,5 ml PBS a byl fixován přidáním 0,5 ml 8% formaldehydu a byl nanesen na polylysinová krycí sklíčka. Krycí sklíčka byla zpracována způsobem, který popisuje Romanowski et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10189-10194. Po blokování v 5% BSA/PBS/Triton X-100 a SDS byl tento materiál inkubován s promární protilátkou, byl promýt, inkubován se sekundární protilátkou (FITC konjugovanou anti-králičí

4€ • · fc ···· ·· • · · · fcfc ·· fc · · ·· ·« protilátkou, Amersham, 1:100) a kontrastně barven na DNA propidiumjodidem/RNAsou A (oboje od Sigma v koncentraci 50 ng/ml), promýt a fixován v glycerolu/PBS/fenylendiaminu.

Fluorescenční zobrazení bylo provedeno na BioRad MRC 1024 skenovacím laserovém konfokálním mikroskopu za použití dvoukanálové (FITC and Texas Red) metody. Pro některá zobrazení byla provedena konfokální serie při posunu 1-2 gm, která byla potom zobrazena jako jeden rámeček (obr. 4a a c). Normální a nádorová tkáň prsu byla čerstvě odebrána z preparátů získaných při mastektomiích. Tenké řezy (<1 mm) byly fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 30 minut a potom byly zpracovány způsobem popsaným výše s tou výjimkou, že inkubace protilátek a výplachy trvaly déle.

Příklad 14: Slepé srovnání způsobu podle předkládaného vynálezu se standardním Pap barvením

Byla provedena slepá studie srovnávající účinnost detekce za použití protilátek proti MCM5 se standardním Pap barvením provedeným na sterech získaných od žen sledovaných ambulantně kolposkopicky v místních nemocnicích.

Tabulka 1 ukazuje, že z 26 případů hodnocených jako pozitivní v běžných Pap barveních bylo všech 26 také hodnoceno jako pozitivní protilátkovým testem podle předkládaného vynálezu. Z 16 případů hodnocených jako negativní v běžné Pap barvení bylo 13 hodnoceno jako negativní v protilátkovém testu.

Ze zbývajících tří obsahoval jeden vzorek nabarvené nezralé metaplastické spinocelulární buňky vykazující reaktivní změny na zánětlivém pozadí. U další dvou bylo prokázáno, že obsahují

44·» 44 • 4 4 »« • Μ · 4 4 4 >

·♦ 44 abnormální (LSIL) buňky při opakovaném vyšetření Pap barvením, t.j. byly falešně negativní, což může být při použití způsobu podle předkládaného vynálezu eliminováno.

Tyto výsledky ukazují, že protilátkový test podle předkládaného vynálezu není méně účinný než Pap barvení, naopak, že přináší další informace. Toto umožňuje potvrzení jakéhokoliv možného selhání protilátkové testu běžným Pap barvením.

Přiklad 15: Analýza vzorků moči od pacientů s malignitami močového ústrojí

Lanthanidový Fluorescenční imunotest se zesílením disociace (DELFIA) byl použit pro detekci lidského MCM5 za použití dvou různých králičích antisér proti hMCM5.

Základem tohoto sandwichového testu je imobilizace nadbytku specifické protilátky na povrchu (zde na polystyrénových mikrotitračních jamkách) - t.j. zachycení protilátky. Po vazebné reakci primární protilátky je přidán nadbytek druhé značené (zde europiem) protilátky se specificitou pro jiný epitop. Po dokončení imunoreakce je nábytek materiálu vymyt a po přidání zesilovacího roztoku (Wallac Oy) je měřena fluorescencí s časovým rozlišením na fluormetru s časovým rozlišením. Signál je úměrný koncentraci analytu.

Byl použit následující test:

1. Potahování polyklonální králičí anti-MCM5 protilátkou (1600 ng/jamku) přes noc (4 °C) ;

2. 3 x promytí DELFIA promývacím pufrem (Wallac Oy) ;

3. Blokování v 5% BSA/PBS po dobu 1 hodiny;

4. 3 x promytí DELFIA promývacím pufrem (Wallac Oy);

• · 9 · • ·· *

9·

9999 9· • 9 9 • 9 999

9 9 9 9 • 9 9 9

99 * »

9 9 9 ·9 9

9 9 9 ·9

5. Vazebná reakce primární protilátky (ředění 1:3 analytu ve Wallac multi-pufru s 0,02% TWEEN) přes noc (4 °C);

6. 4 x promytí DELFIA promývacím pufrem (Wallac Oy);

7. Vazebná reakce sekundární protilátky s euoropiem značenou polyklonální králičí anti-MCM5 protilátkou (4 ²⁰Eu/IgG) po dobu hodin;

8. 6 x promytí DELFIA promývacím pufrem (Wallac Oy);

9. Přidání zesilovacího roztoku, 10 minutová inkubace se třepáním. Měření fluorescence s časovým rozlišením na fluormetru s časovým rozlišením (Wallac Oy).

Za použití polyklonálního králičího anti-MCM5 antiséra od dvou různých králíků a rekombínantního lidského MCM5 v 5% BSA/PBS jako analytu se získaly standardní křivky mezi 13 pM a 41250 pM. Koncentrace hMCM5 ve vzorku byla stanovena srovnáním hodnot získaných v DELFIA testu vzorku se standardní křivkou získanou při- použití rekombínantního hMCM5 v 5% BSA/PBS. Ještě lepší sensitivita se předpokládá při použití monoklonálních protilátek.

Vzorky moči od pacientů s malignitami močového ústrojí léčených v Addenbrookes Hospital, Cambridge, UK, byly centrifugovány (50-150 ml) při 300 rpm (SIGMA 4K10, 7 minut, 4 ⁵C) a solubilní frakce z buněčné pelety byly připraveny hypotonickým bobtnáním, douncing a extrakcí proteinů vázaných na DNA v solích. Solubilní frakce byly testovány za použití MCM5 DELFIA a biochemická data byla srovnávána s diagnostickými zprávami pro oddělení urologické patologie v nemocnici.

Z 5 vzorků, které byly klinicky zjištěny jako maligní, byly stanoveny jako pozitivní při použití DELFIA podle předkládaného vynálezu (80%) průkazem měřitelných množství MCM5 ♦ *♦· · + « · tt tttttt tttt « tttttttt tttttttt tttt tttt tttt tt· (29-85 pM). Ze 6 vzorků, které byly klinicky určeny jako negativní měly všechny reakce odpovídající nulovému standardu při DELFIA.

Příklad 16: Analýza vzorků krve od pacientů s akutní a chronickou leukemií/lymfomem

DELFIA test popsaný v přikladu 15 byl použit pro testování vzorků krve získaných od pacientů s akutní a chronickou leukemií/lymfomem léčených v Addenbrookes Hospital, Cambridge. Krev byla centrifugována při 300 rpm (SIGMA 4K10, 7 minut, 4 °C) a solubilní frakce z buněčné pelety byly připraveny hypotonickým bobtnáním, douncing a extrakcí proteinů vázaných na DNA v solích. Solubilní frakce byly testovány za použití DELFIA.

Z 6 maligních vzorků bylo 5 testováno jako pozitivní při použití DELFIA podle předkládaného vynálezu (83%) průkazem měřitelných množství MCM5 (24-1945 pM). Ze 6 kontrolních vzorků (krev od pacientů s diabetes mellitus) měly všechny reakce odpovídající nulovému standardu.

Příklad 17: Serologická detekce metastasujícího maligního onemocnění

Testy byly provedeny na séru od pacientů s metastatickým karcinomem prsu a ovaria léčených v Addenbrookes Hospital, Cambridge, UK, za použití DELFIA testu popsaného v příkladu 15.

Dva případy sarkomu a tři případy karcinomu (adenokarcinomu prsu a ovaria) vykazovaly měřitelné hladiny MCM5.

• toto • toto •••to toto • toto ·· ·· * to to ·· to*

Příklad 18: Příprava pan-MCM polyklonální protilátky pro použití v předkládaném vynálezu

Polyklonální protilátka schopná vazby na MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7 byla připravena následujícím způsobem.

Peptid VVCIDEFDKMSDMRTAC, odpovídající konvenční sekvenci společné proetinům MCM rodiny, byl syntetizován za použití Bocchemické syntézy. Peptid byl konjugován na PPD (přečištěný proteinový derivát - tuberkulin).

Králíci byli imunizováni injekčně v 21 denních intervalech. 10 dní po třetí imunizaci bylo odebráno séru, které bylo použito v následujících pokusech (které je v následujících příkladech označováno jako pan-MCM protilátka).

Příklad 19: Barvení tkání normálního prsu a karcinomu prsu anti-Cdc6, anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7 a pan-MCM protilátkami

Histologické vzorky normálního prsu (od pacientek s redukční operací prsu) a biopticky ověřených duktálních a lobulárních karcinomů prsu byly barveny protilátkami proti Cdc6, MCM2,

MCM5, MCM7 a pan-MCM. Anti-MCM2 protilátka byla BM28 myší monoklonální protilátka komerčně dostupná od Transduction Laboratories (viz jejich Antibody catalog, 1998). Barvení bylo provedeno jednotlivě pro každou protilátku, jak je popsáno.

Byly vyšetřovány jak formalinem fixované parafinové vzorky, které byly zpracovány tlakovou sterilizací, tak zmrazené vzorky.

**«« ·· ·· »· ·· ··

Formalinem fixované parafinové vzorky lidských tkání získané při diagnostické biopsii nebo při resekci v Addenbrooke's Hospital byly použity v souladu s etickými předpisi schválenými nemocnicí. 5 μΜ řezy byly připraveny z těchto tkání na APES (aminopropyltriethoxysilanem) potažených sklíčkách, byly zbaveny vosku v xylenu a byly zpracovány v alkoholu-vodě. Tkáň byla tlakově sterilizována v citratovém pufru pro usnadnění zpřístupnění epitopu a potom bylo provedeno propláchnutí v Tris-pufrovaném salinickém roztoku (TBS). Endogenní peroxidasová aktivita byla utlumena inkubací s 0,6% peroxidem vodíku v v TBS po dobu 30 minut.

Řezy byly promývány v TBS a potom byly blokovány 10% kozím sérem v TBS po dobu 2 hodin. Primární protilátky byly ředěny v TBS obsahujícím 0,1% Triton a 1% hovězí sérový albumin (BSA).

100 μΐ tohoto ředění bylo přidáno ke každému řezu a řezy byly inkubovány při teplotě 4 °C ve zvlhčované komůrce.

Řezy byly potom promývány v TBS obshujícím 0,025% Triton a potom byla provedena inkubace s biotinylovanou kozí antikráličí sekundární protilátkou (DAKO) v ředění 1:500 v TBS obsahujícím 1% BSA po dobu 1 hodiny při teplotě okolí. Po promývání v TBS byl systém streptavidín-křenová peroxidasa využívající diaminobenzidin použit pro barvení řezů. Reakce byla ukončena promytím vodou a řezy byly jemně kontrastně barveny Harrísovým haematoxylinem, byly dehydratovány v graduovaných ethanolech a byly projasněny v xylenu. Krycí sklíčka byla aplikována za použití DEPEX připevňovacího media.

Zmrazené řezy byly připraveny způsobem popsaným výše v příkladu 7 s tou výjimkou, že blokování 10% kozím sérem bylo provedeno během 30 minut a ne přes noc.

• · ··· ·· ··· ·· · • ·· ···· ···· ···· ·· ·* ·« ·· ··

V normální tkáni prsu se pozitivně barvilo pouze 1-3% duktálních a lobulárních buněk. Stromální buňky byly negativní.

50-80% abnormálních buněk v různých karcinomech prsu, včetně lézí s vysokým a nízkým stupněm malignity a lobulárního a duktálního typu, vykazovalo pozitivní barvení, a okolí stormální buňky a zánětlivé buňky se nebarvily.

Tyto výsledky byly získány individuálně pro každou protilátku.

Bylo provedeno srovnání s anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami. Na parafinových řezech byly výsledky barvení anti-PCNA protilátkou podobné výsledkům barvení anti-MCM5 a anti-Cdc6 protilátkou, zatímco barvení anti_Kí67 protilátkou bylo pouze slabé, ložiskové. Na zmrazených řezech byly výsledky získané s anti-MCM5 a anti-Cdc6 protilátkou mnohem lepší než výsledky získané s s anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami.

Příklad 20: Barvení normální prostaty a adenokarcinomu prostaty za použití protilátek proti MCM5, MCM7 a pan-MCM

Parafinové histologické vzorky normální tkáně a adenokarcinomu prostaty, připravené způsobem použitým pro přípravu tkáně prsu, jak je popsán v příkladu 19, byly barveny anti-MCM5, anti-MCM7 a pan-MCM protilátkami v samostatných pokusech.

Normální případy vykazovaly pozitivní barvení méně než 10% buněk každou protilátkou, zatímco adenokarcinomy vykazovaly barvení 30-50% nádorových buněk, kdy okolní stromální buňky a zánětlivé buňky zůstávaly nenabarveny.

φφφφ **

Příklad 21: Barvení normální tkáně tlustého střeva a karcinomu tlustého střeva za použití protilátek proti MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM a Cdc6

Histologické resekční vzorky adenokarcinomu a tubulovillosního adenomu tlustého střeva byly separátně barveny protilátkami proti MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM a Cdc6. Vzorky normální tkáně byly také barveny za použití těchto protilátek.

V normální tkáni bylo detekováno barvení pro každou protilátku pouze v dolní třetině krypt tlustého střeva a více superficiální diferencované buňky krypt zůstávaly nenabarveny.

Jak ve vzorcích z tubulovillosních adneomů, tak ve vzorcích z karcinomů bylo více než 50% nádorových buněk pozitivních na barvení pro každou protilátku, zatímco elementy okolní pojivové tkáně se nebarvily.

Byly vyšetřovány jak zmrazené, tak parafínové vzorky, stejně jako pro tkáň prsu v příkladu 19. Výsledky byly podobné pro anti-MCM a anti-Cdc6 protilátky na jedné straně a anti-PCNA a anti-Ki67 protilátky na straně druhé, t.j. pro zmrazené vzorky bylo barvení anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami lepší než barvení anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami.

Příklad 22: Barvení normální tkáně plic a karcinomu plic za použití protilátek proti MCM2, MCM5, MCM7 a pan-MCM

Parafinové histologické vzorky biopsií nebo resekátů od pacientů se spinocelulárním karcinomem nebo adenokarcinomem plic byly separátně barveny protilátkami proti MCM2, MCM5, MCM7 • ··· • » • ·· ·· »· ·· ·· a pan-MCM. Vzorky byly připraveny způsobem popsaným pro tkáň prsu v příkladu 19. Barvení bylo srovnáváno s barvením normální parenchymové plicní tkáně. V normální tkáni byla barvená proliferativní frakce velmi nízká.

Ve všech karcinomech bylo více než 30% nádorových buněk pozitivních, s žádným barvením buněk okolní zánětlivé nebo pojivové tkáně.

Příklad 23: Barvení normální tkáně močového měchýře a karcinomu močového měchýře za použití protilátek proti MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM a Cdc6

Histologické vzorky z biopsií uroteliálního karcinomu odebraných cystoskopicky byly barveny protilátkami proti MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM a Cdc6.

V normální tkáni močového měchýře bylo detekoováno silné barvení bazální vrstvy přechodného epitelu, zatímco povrchovější diferencované buňky zůstávaly nenabarveny.

Ve fragmentech obsahujících karcinom in šitu se barvily dysplastické buňky v celé tloušťce.

Případy invazivního uroteliálního karcinomu vykazovaly 50100% jaderné barvení nádorových buněk, s hegativním barvením stromálních a zánětlivých složek.

Byly vyšetřovány jak zmrazené, tak parafinové vzorky, stejně jako pro tkáň prsu v příkladu 19. Výsledky byly podobné pro anti-MCM a anti-Cdc6 protilátky na jedné straně a anti-PCNA a anti-Ki67 protilátky na straně druhé, t.j. pro zmrazené vzorky ··«· ·· • · «· · · ·· bylo barvení anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami lepší než barvení anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami.

Příklad 24: Barvení různých vzorků kůže anti-MCM5 protilátkami

Histologické vzorky z normální kůže, hyperplastických onemocnění kůže (včetně psoriasy), solární keratosy, Bowenovi dermatosy a innvazivního spinocelulárního karcinomu byly barveny anti-MCM5 protilátkami.

Normální kůže vykazovala barvení především v bazální vrstvě epitelu, s občasným barvením buněk v dolní třetině epidermis, ale povrchovějsi diferencované buňky zůstávaly nenabarveny.

V případech psoriasy bylo detekováno predominantní barvení ve spodních 3-4 vrstvách epidermis, což odráží vyšší rychlost růstu kůže.

Solární keratosa a Bowenova dermatosa (karcinom in šitu) vykazovaly barvení všech dysplastických buněk v epidermis, v celé její tloušťce.

Invazivní spinocelulární karcinom vykazoval barvení více než 70% buněk s tím, že dobře diferencované nádory obsahovaly malá ložiska negativních diferencovaných buněk v okolí keratinových zrn.

Příklad 25: Barvení hrtanu anti-MCM5 protilátkou

Histologické vzorky normálního hrtanu a karcinomu hrtanu, připravené jako parafinové řezy tkáně prsu, jak bylo popsáno v příkladu 19, byly barveny antti-MCM5 protilátkou.

···· ·* • · barvení pouze bazálních než 10%).

«· ··

U normálních případů bylo detekováno epitelových proliferujících buněk (méně

U karcinomů bylo barvením. Stromální

Příklad 26: Barvení detekováno více než 50% buněk s jaderným a zánětlivé buňky byly negativní.

jícnu anti-MCM5 protilátkou

Histologické vzorky normálního jícnu a karcinomu jícnu, připravené jako parafinové řezy tkáně prsu, jak bylo popsáno v příkladu 19, byly barveny anti-MCM5 protilátkou.

U normálních případů bylo detekováno barvení pouze bazálních epitelových proliferujících buněk (méně než 10%).

U karcinomů bylo detekováno více než 50% buněk s jaderným barvením. Stromální a zánětlivé buňky byly negativní.

Příklad 27: Barvení bronchu anti-MCM5 protilátkami

Histologické vzorky normálního bronchu a karcinomu bronchu, připravené jako parafinové řezy tkáně prsu, jak bylo popsáno v příkladu 19, byly barveny anti-MCM5 protilátkou.

U normálních případů bylo detekováno barvení pouze bazálních epitelových proliferujících buněk (méně než 10%).

U karcinomů bylo detekováno více než 50% buněk s jaderným barvením. Stromální a zánětlivé buňky byly negativní.

Příklad 28: Barvení lymfatických uzlin, jak normálních, tak postižených různými lymfomy, za použití anti-MCM5 protilátky « · · · · · · « · · · «••· «· ·♦ ·« «· ··

Byly připraveny jak zmrazené, tak parafinové histologické řezy reaktivních lymfatických uzlin a uzlin postižených různými Hodgkinskými a non-Hodgkinskými lymfomy, za použití způsobu popsaného pro tkáň prsu v příkladu 19.

Reaktivní lymfatické uzliny vykazovaly silné barvení buněk v germinálních centrech lymfatických folikulů a občasné rozptýlené pozitivní buňky v parafolikulárních oblastech.

Lymfomy vykazovaly více než 50% jaderné barvení maligních lymfoidních buněk.

Příklad 29: Analýza cytologických nátěrů z moči za použití anti-MCM5 protilátek

Vzorky moči byly získány od pacientů s karcinomem z přechodného epitelu a od normálních pacientů sledovaných na urologické klinice. 20 ml moči bylo odstředěno při 3000 x g po dobu 10 minut, supernatant byl odebrán a peleta byla resuspendována v 50 μΐ supernatantu. Tato suspenze byla nanesena na APES sklíčka a byla fixována v alkoholu.

Sklíčka byla promyta v Tris pufrovaném salinickém roztoku (TBS), potom byla permeabilizována ve 4 mM deoxycholatu sodném po dobu 10 minut. Sklíčka byla promyta TBS plus 0,025% Triton a byla blokována 10% kozím sérem v TBS po dobu 2 hodin.

Preabsorbovaná anti-MCM5 protilátka byla ředěna v TBS obsahujícím 0,1% Triton a 1% BSA a na každé sklíčko bylo přidáno 200 μΐ. Inkubace byla provedena přes noc při 4 °C ve zvlhčované komůrce na orbitální třepačce.

•··· ·· ·* ·· • · » • · ··

Sklíčka byla promyta TBS plus 0,025% Triton a potom byla provedena inkubace s biotinylovanou kozí anti-králičí sekundární protilátkou (DAKO) v ředění 1:500 v TBS obsahujícím 1% BSA po dobu 1 hodiny při teplotě okolí. Endogenní peroxidasa byla blokována 0,6% peroxidem vodíku v TBS po dobu 10 minut a potom bylo provedeno promytí v TBS. Pro barevní sklíček byl použít systém streptavidin-křenová peroxidasa využívající jako substrát diaminobenzidin. Reakce byla ukončena vypláchnutím vodou a sklíčka byla jemně barvena Harrisovým hematoxyiinem, a potom následovalo barvení Orange G a EA50 (PAP barvení).

V 6 případech karcinomu z přechodného epitelu vykazovaly cytologické nátěry z moči připravené tímto způsobem a barvené anti-MCM5 prtoilátkou silné barvení všech maligních buněk přechodného epitelu, s nenabarvenými zánětlivými a spinocelulárními buňkami v pozadí. Podobné nátěry získané z moči normálních jedinců sledovaných na urologické klinice nevykazovaly žádné barvení spinocelulárních nebo normálních přechodných buněk.

Příklad 30: DELFIA normálních vzorků čípku děložního a vzorků čípku děložního od pacientů se spinocelulární intraepitelovou lézí

Lanthanidový Fluorescenční imunotest se zesílením disociace (DELFIA) byl použit pro detekci lidského MCM5 za použití dvou různých králičích antisér proti MCM5, jak je popsán v příkladu 15, výše.

Byly analyzovány dva vzorky z normálního čípku děložního a dva vzorky z čípku děložního s HSIL. Vzorky tkáně byly solubilizovány hypotonickým bobtnáním a ,,douncinging a potom extrakcí DNA v solích.

• ··· to ·

Dva normální vzorky dávaly podobné výsledky jako nulové standardy.

Dva HSIL vzorky byly identifikovány jako pozitivní, což ukazuje, že abnormality ve vzorku čípku děložního mohou být detekovány za použití imunotestu.

Příklad 31: Barvení různých karcinomů anti-MCM5 protilátkou

Histologické vzorky různých karcinomů a leukemické kostní dřeně byly barveny anti-MCM5 protilátkami s následujícími výsledky:

U karcinomu žaludku bylo detekováno více než 50% barvení nádorových buněk.

U karcinomu ledvin bylo detekováno 30-50% barvení nádorových buněk.

U karcinomu vaječníků bylo detekováno 30-50% barvení nádorových buněk.

U karcinomu varlat bylo detekováno 30-50% barvení nádorových buněk.

V kostní dřeni postižené akutní leukémií bylo detekováno více než 90% barvení nádorových buněk.

Příklad 32: Barvení nátěrů z tlustého střeva

Stolice byla získána od zdravých pacientů a povrchové odloučené kolonocyty byly extrahovány ze vzorků stolice za • « to * « st ·«· toto to • ·· ·*·* ···* toto· ·* ·· ·· ·· ·· použití magnetických korálků potažených protilátkami specifickými pro epitel, které byly získány od Dynal AS {Oslo, Norway), za použití postupu popsaného ve WO 97/09600.

Extrahovaná směs magnetických korálků a epitelových buněk byla promyta v TBS (Tris-pufrovaném salinickém roztoku) obsahujícím 0,025% Triton. Po fixaci ve 4% pufrovaném paraformaldehydu byly buňky promyty v TBS a ze získané buněčné pelety byly připraveny nátěry. Tyto nátěry byly potom zpracovány stejným způsobem, jako nátěry ze vzorků moči.

PAP barvené nátěry vykazovaly směs magnetických korálků, něco celulosy a buněčnou drť; bylo přítomno mnoho buněk žlázového epitelu z tlustého střeva a několik spinocelulárních buněk z análního kanálu.

Při barvení anti-MCM5 protilátkami jsou získány podobné výsledky pro normální a abnormální buňky, jako jsou výsledky získané pro močový měchýř a čípek děložni.

Příklad 33: Barvení řezů z tlustého střeva od pacientů s colitis ulcerosa

Parafinové řezy střeva od pacientů s aktivní colitis ulcerosa byly barveny protilátkami proti MCM5.

Ve všech testovaných řezech vykazovalo přibližně 50% povrchových epitelových buněk jadernou expresi MCM5 v zánětlivých oblastech. Při aktivní colitis ulcerosa je přítomno velké množství lymfocytů a tyto buňky také vykazují častou jadernou expresi MCM5.

·♦·· ··

Byly také analyzovány řezy od pacientů s colitis ulcerosa v klidovém stavu {tj. bez aktivního zánětu). V žádné z těchto povrchových epitelových buněk nebylo prokázáno barvení pro MCM5. Z malého množství lymfocytů, které jsou přítomny při colitis ulcerosa v lidovém stavu, jsou pouze ojedinělé buňky pozitivní na jaderné barvení MCM5.

V parafinových řezech bylo zjištěné barvení aktivní a klidové colitis ulcerosa podobné pro MCM5 a PCNA.

Příklad 34: Barvení řezů z tlustého střeva od pacientů s Crohnovou chorobou

Barvení parafinových řezů střeva od pacientů s aktivní Crohnovou nemocí prokázaly jaderno expresi MCM5 v povrchových epitelových buňkách v okolí regionů ulcerace a zánětu.

Lymfocyty v zánětlivé tkáni také vykazovaly častou jadernou expresi MCM5.

Tkáň střeva od pacientů s Crohnovou nemocí v klidovém stadiu byla také testována a jak povrchové epitelové buňky, tak malý počet přítomných lymfocytů, byly negativní na MCM5.

Podobné nálezy byly zjištěny pro anti-MCM5 protilátky jako pro anti-PCNA protilátky na parafinových řezech od pacientů s aktivní a klidovou Crohnovou nemocí.

Srovnání mezi anti-MCM5 a antiPCNA barvením provedené na zmrazených řezech a parafinových řezech ukázalo, že na zmrazených řezech je barvení anti-MCM5 protilátkami lepší než barvení anti-PCNA protilátkami v tom, že se barví více jader.

Příklad 35: Barvení normálního a karcinomového endometria anti62 » · ft ft · · ft · ft ·» ··

MCM5 protilátkami

Zmrazené a parafinové řezy normálního a karcínomového endometria byly barveny anti-MCM5 protilátkami.

Dobré barvení bylo detekováno v nádorovém endometriu ve srovnání s normální tkání a lepší barvení bylo detekováno ve zmrazených řezech ve srovnání s parafinovými řezy.

Příklad 36: Barvení monovrstvy buněk ze steru z čípku děložního (ThinPrep)

Po provedení nátěru na APES sklíčku byl kartáček/štětička použitá pro odběr steru z čípku děložního umístěn do 75% methanolu a zbývající buňky byly odstraněny důkladným protřepáním. Suspenze buněk byla navrstvena na 20% sacharosu, byla provedena centrifugace při 1000 rpm po dobu 2 minut na MSE Harrier centrifuze a horní vrstva byla odstraněna. Zbylá vrstva byla centrifugována při 3000 rpm po dobu 5 minut a buněčná peleta byla resuspendována ve 200 μΐ vody. 50 μΐ této suspenze bylo umístěno na každé sklíčko, buňky se nechaly usadit a odstranila se voda. Sklíčka se potom zpracovala jako v příkladu 29 (nátěry pro urologickou cytologii) a provedlo se PAP barvení.

V různých pokusech byly výsledky získané s monovrstevnými nátěry stejné jako výsledky získané s konvenčními nátěry. Použití monovrstevných preparátů může být výhodné v tom, že je odstraněn hlen a většina zánětlivých buněk.

Diskuse ···· ·· ·« «· «» *»

Zde popsané výsledky ukazují, že exprese jak Cdc6, tak MCM5 je snížena v normálních diferencovaných tkáních in vivo a tyto proteiny nejsou přítomny v chromatinu různých klidových savčích buněk v kultuře. Tato skutečnost naznačuje, že tyto proteiny mohou být potenciálně užitečné jako markéry buněčné proliferace. Hiraiwa et al. prokázal, že MCM7 může být lokalizován imunotechnikami v různých typech nádorů, jako jsou benigní nádory kůže a maligní nádory žaludku, slinivky břišní a tlustého střeva, s podobnou distribucí jako PCNA. Hiraiwa et al. soudí, že imunolokalizace MCM7 může být použita jako index proliferace buněk ve tkáňových řezech. Nicméně, jak již bylo uvedeno výše, odborníci v oboru patologie jsou skeptičtí v tom, že by mohlo mít měření stupně buněčné proliferace v nádorech pomocí markérů jako je PCNA a Ki67 klinicky použitelné, protože existuje málo přímých důkazů, že takové markéry jsou skutečným zlepšením běžných histologických hodnocení jako je grading a staging, pokud jsou optimálně provedeny.

Zde popsané pokusy ukazují, že specifická vazba molekul namířených proti Cdc6, MCM5 a MCM7 vykazuje mnohem vyšší stupeň specificity pro potenciální pre-maligní buňky v čerstvých a zmrazených SIL čípku děložního, než běžné markéry proliferace, jako je PCNA a Ki67. Anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátky jsou schopné jasně odlišit abnormální buňky v LSIL a HSIL od okolních normálních buněk, včetně endocervikálních, ektocervikálních, metaplastických a stromálních buněk. Z tohoto důvodu byly anti-Cdc6 a anti-MCM protilátky použity na stery z čípku děložního od pacientů se SIL a od zdravých pacientů. Výsledky byly překvapivé svou vysokou specificitou a sensitivitou pozorovanou pro tyto proteiny. Silné jaderné a cytoplasmatické barvení bylo pozorováno jak pro neoplastické buňky, tak pro HPV-infikované 'koilocyty. Pozitivní imunobarvení bylo také identifikováno v metaplastických ··»* ·· spinocelulárních buňkách vykazujících hraniční abnormality (atypických spinocelulárních buňkách nejistého významu). Nicméně, zbývající smíšená populace normálních buněk ve stěru, obsahující ektocervikální buňky, endocervikální buňky, spinocelulární metaplastické buňky a zánětlivé buňky (jak lymfocyty, tak neutrofily) byla negativní na Cdc6 a MCM imunobarvení.

Sensitivity anti-MCM5, anti-Cdc6 a anti-MCM7 protilátek jsou mnohem vyšší než sensitivity anti-PCNA, při použití na stery z čípku děložního a na zmrazené řezy, ale při použití těchto protilátek na tkáň fixovanou ve formalinu naloženou do parafinu a zpracovanou pro presentaci antigenů tlakovou sterilizací jsou výsledky barvení podobné. Stěry z čípku děložního a jiné cytologické vzorky, stejně jako zmrazené řezy, jsou méně masivní než parafinové vzorky tkáně fixované ve formalinu a proto nemohou být zpracovány tlakovou sterilizací.

Překvapivá sensitivita a specificita anti-Cdc6 a anti-MCM protilátek při použití na stěry z čípku děložního nabádá k vývoji biochemických/imunocytologických technik pro masový automatizovaný skríning onemocnění čípku děložního. Kromě toho, tyto protilátky mohou napomoci zlepšení detekce a klasifikace LSIL, pro který existují značné variace v hodnocení gradingu, I mezi největšími odborníky v oboru cytologie čípku děložního. Použití těchto protilátek také napomůže identifikaci HSIL s vyšší přesností a objektivitou, což umožní snížení vysokého počtu falešně negativních výsledků, které jsou hlavním problémem spojeným se současnými globálními skríningovými programy onemocnění čípku děložního.

Jak bylo uvedeno, další příklady hodnocení tkání prsu, žaludku, ledvin, vaječníků, varlat a tlustého střeva, vzorků

F ftft • ftft • ··· • ft · • •ftft ·· ϊ ! · ί • · ··· φφ * ·· · · · ·· ·· moči a krve (jak od pacientů s leukemiemi/lymfomy, tak od pacientů s metastasujícími sarkomy a karcinomy) a také tkání od pacientů se zánětlivými onemocněními střeva včetně colitis ulcerosa a Crohnovi nemoci, a hodnocení nátěrů stolice, ukazují, že obecné aspekty předkládaného vynálezu přesahují skríning onemocnění čípku děložního, ačkoliv hodnocení vzorků z čípku děložního, zejména stěrů z čípku děložního, je preferováno v různých provedeních. Kromě cytologie je také demonstrováno použití biochemických technik.

Výsledky slepé studie srovnávající provedení podle předkládaného vynálezu s hodnocením stěrů z čípku děložního za použití standardního PAP vyšetření, popsané v příkladu 14, potvrzují vynikající použitelnost předkládaného vynálezu.

Všechny zmíněné dokumenty jsou zde uvedeny jako odkaz.

Tabulka 1: Srovnání testu vaužívajícího anti-MCM5 protilátku s běžným PAP testem ve slepé studii provedené na pacientech pozvaných na kolposkopii

	Výsledky standardního PAP testu
	Normální	Nízký grading	Vysoký grading
Test s anti-Mcm.5 protilátkou	Přítomnost pozitivních buněk	3a	9	17
	Absence pozitivních buněk	13	0	0

viz text

Claims (53)

1. Patentové nároky

   1. Způsob stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti abnormálně proliferujících buněk nebo abnormalit buněčného růstu ve vzorku od jedince vyznačující se tím, že obsahuje detekcí cílového polypeptidu ve vzorku, kde uvedený cílový polypeptid je členem preiniciačního komplexu replikace DNA; s podmínkou, že pokud je cílovým polypeptidem MCM7, tak vzorek není zpracován pro presentaci antigenů ani tlakovou sterilizací/autoklavováním.
2. 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že cílový polypeptid je vybrán ze skupiny zahrnující Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7 protein-kinasu, Dbf4, Cdcl4 protein-fosfatasu, Cdc45 a MCM10.
3. 3. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím, že cílový polypeptid je vybrán ze skupiny zahrnující Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7.
4. 4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je Cdc6.
5. 5. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM2.
6. 6. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM3.
7. 7. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM4.

   φ φ φφ

   Φ Φ · * φφ • · φφφ φφφ φφφφ φφ φ φ φ φ φφ φφ
8. 8. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM5.
9. 9. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM6.
10. 10. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM7.
11. 11. Způsob podle jakéhokoliv z nároků nároků 1 až 10 vyznačující se tím, že obsahuje kontaktování vzorku se specifickým vazebným činidlem nebo se specifickými vazebnými činidly namířenými proti cílovému polypeptidu a stanovení vazby specifického vazebného činidla nebo činidel na vzorek.
12. 12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že uvedené specifické vazebné činidlo nebo specifická vazebná činidla jsou namířena proti většímu počtu uvedených cílových polypeptidů.
13. 13. Způsob podle jakéhokoliv z nároků nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že je testován vzorek tkáně.
14. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že vzorek tkáně je čerstvý nebo zmrazený.
15. 15. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že vzorek tkáně není fixovaný ve formalinu ani zanořený do parafinu.

    • ··
16. 16. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že vzorek tkáně není zpracován pro presentaci antigenu ani není zpracován tlakovou sterilizací/autoklavováním.
17. 17. Způsob podle jakéhokoliv z nároků nároků 13 až 16 vyznačující se tím, že tkáň je vybrána ze skupiny zahrnující plíce, mléčnou žlázu, tlusté střevo, prostatu, žaludek, kůži, jícen a močový měchýř.
18. 18. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že tkání je tkáň mléčné žlázy.
19. 19. Způsob podle jakéhokoliv z nároků nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že je testován vzorek buněk.
20. 20. Způsob podle jakéhokoliv z nároků nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že vzorek je získán z tekutiny odebrané od jedince.
21. 21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že vzorek buněk je získán z uvedené tekutiny.
22. 22. Způsob podle nároku 20 nebo 21 vyznačující se tím, že tekutinou je krev.
23. 23. Způsob podle nároku 20 nebo 21 vyznačující se tím, že tekutinou je moč.
24. 24. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 23 vyznačující se tím, že populace jedinců je skríningově vyšetřována.

    • · · ♦ · ···* ·· ·· ·· ·· ··
25. 25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že jedinci jsou kategorizováni jako jedinci mající tkáň, která je (I) normální nebo {ii} abnormální, která zahrnuje potenciálně nebo aktuálně pre-kancerosní nebo nádorové, dysplastické nebo neoplastické buňky.
26. 26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že tkáně nebo buňky jedince kategorizovaného jako jedince nesoucího abnormální tkáně jsou dále vyšetřovány nebo analyzovány.
27. 27. Způsob stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti abnormálně proliferujících buněk nebo abnormalit buněčného růstu ve vzorku z čípku děložního od jedince vyznačující se tím, že obsahuje kontaktování vzorku se specifickým vazebným činidlem nebo specifickými vazebnými činidly namířenými proti cílovému polypeptidu a stanovení vazby specifického vazebného činidla nebo činidel na vzorek, kde uvedeným cílovým polypeptidem je člen preiniciačního komplexu replikace DNA.
28. 28. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že vzorek je stěr z Čípku děložního.
29. 29. Způsob podle nároku 27 nebo 28 vyznačující se tím, že cílový polypeptid je vybrán ze skupiny zahrnující Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7 protein-kinasu, Dbf4, Cdcl4 protein-fosfatasu, Cdc45 a MCM10.
30. 30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že cílový polypeptid je vybrán ze skupiny zahrnující Cdc6,

    MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7.

    • 44 • · 4

    4444 44 • 4

    44 44

    4 4 4

    4» 44 • 44
31. 31. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je Cdc6.
32. 32. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM2.
33. 33. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM3.
34. 34. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM4.
35. 35. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM5.
36. 36. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM6.
37. 37. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že cílovým polypeptidem je MCM7.
38. 38. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 27 až 37 vyznačující se tím, že uvedené specifické vazebné činidlo nebo specifická vazebná činidla jsou namířena proti většímu počtu uvedených cílových polypeptidů.
39. 39. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 27 až 38 vyznačující se tím, že populace jedinců je skríningově vyšetřována.
40. 40. Způsob podle nároku 39 vyznačující se tím, že jedinci jsou kategorizováni jako jedinci mající tkáň, která je (I) normální nebo (ii) abnormální, která zahrnuje • to • to * · to to • ···· • to·» toto ·* ·· ·· toto potenciálně nebo aktuálně pre-kancerosní nebo nádorové, dysplastické nebo neoplastické buňky.
41. 41. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že tkáně nebo buňky jedince kategorizovaného jako jedince nesoucího abnormální tkáně jsou dále vyšetřovány nebo analyzovány.
42. 42. Způsob stanovení přítomnosti nebo nepřítomností abnormálně proliferujících buněk nebo abnormalit buněčného růstu u jedince vyznačující se tím, že obsahuje detekci cílového polypeptidu, nebo mRNA kódující cílový polypeptid, ve tkáni, tekutině nebo buňkách jedince, kde uvedený cílový polypeptid je členem preiniciačního komplexu replikace DNA;

    s podmínkou, že pokud je způsob proveden na vzorku odebraného od jedince a cílovým polypeptidem je MCM7, tak vzorek není zpracován pro presentaci antigenů ani tlakovou sterilizací/autoklavováním.
43. 43. Způsob podle nároku 42 vyznačující se tím, že uvedená tkáň, tekutina nebo buňky jsou ve vzorku odebraného od jedince.
44. 44. Způsob podle nároku 43 vyznačující se tím, že uvedeným vzorkem je tkáň.
45. 45. Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že uvedený vzorek je čerstvý nebo zmrazený.
46. 46. Způsob podle nároku 44vyznačující se tím, že vzorek není fixovaný formalinem ani zpracovaný parafinem.

    • · ftftft ftft ftftft ftft ft • ftft ftftft· ftftft· • ftft* ftft ftft ftft ftft ftft • ftft
47. 47. Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že vzorek tkáně není zpracován pro presentaci antigenu ani tlakovou sterilizací/autoklavováním.
48. 48. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 42 až 47 vyznačující se tím, že populace jedinců je skríningové vyšetřována.
49. 49. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že jedinci jsou kategorizováni jako jedinci mající tkáň, která je (I) normální nebo (ii) abnormální, která zahrnuje potenciálně nebo aktuálně pre-kancerosní nebo nádorové, dysplastické nebo neoplastické buňky.
50. 50. Způsob podle nároku 49vyznačující se tím, že tkáně nebo buňky jedince kategorizovaného jako jedince nesoucího abnormální tkáně jsou dále vyšetřovány nebo analyzovány.
51. 51. Kit obsahující následující složky:

    (i) specifické vazebné činidlo nebo specifická vazebná činidla namířená proti jednomu nebo více cílovým polypeptidům, kde uvedené cílové polypeptidy jsou členy preiniciačního komplexu replikace DNA; a (ii) návod pro použití specifického vazebného činidla nebo specifických vazebných činidel ve způsobu podle jakéhokoliv z nároků 11 až 48.
52. 52. Kit podle nároku 51, kde je cílový polypeptid vybrán ze skupiny zahrnující Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7 protein-kinasu, Dbf4, Cdcl4 protein-fosfatasu, Cdc45 a MCM10.

    *··· ·· « « « « • 4 9 « ««
53. 53. Kit podle nároku 52, kde je cílový polypeptid vybrán ze skupiny zahrnující Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7.

    54. Kit podle nároku 53, kde je cílovým polypeptidem Cdc6. 55. Kit podle nároku 53, kde je cílovým polypeptidem MCM2. 56. Kit podle nároku 53, kde je cílovým polypeptidem MCM3. 57. Kit podle nároku 53, kde je cílovým polypeptidem MCM4 . 58. Kit podle nároku 53, kde je cílovým polypeptidem MCM5. 59. Kit podle nároku 53, kde je cílovým polypeptidem MCM6. 60. Kit podle nároku 53, kde je cílovým polypeptidem MCM7.

    61. Kit podle jakéhokoliv z nároků 51 až 60, kde uvedené specifické vazebné činidlo nebo specifická vazebná činidla jsou namířena proti většímu počtu uvedených cílových polypeptidů.