MXPA00003892A

MXPA00003892A - Determinacion de anormalidad en el crecimiento celular

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Publication number: MXPA00003892A
Application number: MXPA/A/2000/003892A
Authority: MX
Inventors: Ronald Alfred Laskey; Gareth Haydn Williams; Nicholas Coleman
Original assignee: Cancer Research Campaign Technology Limited; Nicholas Coleman; Ronald Alfred Laskey; Gareth Haydn Williams
Priority date: 1997-10-21
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2001-12-13

Abstract

La determinación de anormalidad en el crecimiento celular, particularmente anormalidad cancerosa, mediante detección de polipéptidos objetivo o codificación de mRNA, en donde los polipéptidos objetivo son miembros del complejo de pre-inicio de la replicación de ADN en tejidos, células o fluidos. Los polipéptidos objetivo incluyen Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, y MCM7. Las muestras de prueba incluyen tejido de la cerviz (tanto biopsia como muestras de frotis), pecho, colon, pulmón, vejiga, piel, laringe, esófago, bronquio, nódulos linfáticos y tracto urinario (muestras de biopsia y de frotis citológico), en la determinación de anormalidad en el crecimiento celular pre-canceroso y canceroso, y células extraídas de orina, sangre y suero, en la determinación de malignidades hematológicas y evidencia de sarcoma y carcinoma metastáticos.

Description

DETERMINACIÓN DE ANORMALIDAD EN EL CRECIMIENTO CELULAR DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la evaluación de células en una muestra de tejido, células o fluidos con vista a detectar anormalidad en el crecimiento celular, particularmente potencialmente (o realmente) células cancerosas. Los aspectos de la presente invención son particularmente útiles en la práctica de detección de muestras tales como frotis cervical de las mujeres para detectar aquellas cuyas células cervicales son anormales. La invención también es aplicable a la evaluación de células en otras muestras de tejido, incluyendo del pecho, como se demuestra experimentalmente en la presente. Las muestras que se evalúan como anormales pueden ser examinadas en más detalle y la condición de las células en el tejido puede ser investigadas en mayor detalle. La identificación de una condición maligna o pre-maligna puede ser seguida por el tratamiento apropiado seguida de procedimientos diagnósticos más extensivos. La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento que moléculas de unión específicas dirigidas contra proteínas particulares del complejo de pre-inicio de la replicación de ADN puede REF.: 119544 usarse para detectar células anormales. En la presente invención son especialmente útiles las moléculas de unión dirigidas contra Cdc6. También son especialmente útiles las moléculas de unión dirigidas contra las proteínas MCM, particularmente MCM5. La evidencia experimental incluida en la presente muestra que las moléculas de unión específicas dirigidas contra Cdc6, y también aquellas dirigidas contra MCM2 , MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 o MCM7 son mucho más efectivas en marcar la anormalidad en el crecimiento celular en muestras de tejido que los anticuerpos contra PCNA y KÍ67. A prori uno hubiera esperado que Cdc6 y los MCMs den resultados similares que Ki67 y PCNA, ya que todas esas proteínas pueden ser consideradas "marcadores de proliferación". En las muestras cervicales sometidas a una recuperación de antígenos (cocción a presión o autoclave), los resultados experimentales que siguen muestran que de hecho los resultados obtenidos son similares para todos ellos, pero hay una clara diferencia en el frotis cervical y las muestras congeladas. Tales muestras, de interés principal para los propósitos de la práctica de exámenes de detección, no son lo suficientemente robustas para ser sometidas a la cocción a presión. De particular interés en el contexto de la práctica de exámenes de detección son los resultados claros y fuertes obtenidos con la evaluación de las muestras cervicales usando moléculas de unión anti-Cdc6 o anti-MCM, mostrando un manchado de alto nivel de las células anormales y un manchado de grosor completo en las muestras LSIL. Esto indica la utilidad en la evaluación de muestras de frotis tomadas de la superficie epitelial cervical - y de hecho esto se verifica experimentalmente en la presente. El manchado de grosor completo también se ve en las muestras HSIL. La evaluación experimental de anormalidad en tejidos del pecho, orina, sangre y suero confirman la generalidad de los aspectos de la presente invención. Más evidencia es provista mediante el uso de los mismos anticuerpos en la detección de la presencia de células neoplásicas o displásicas en los fluidos del cuerpo mediante métodos bioquímicos que pueden ser automatizados. Los ejemplos demostrados en la presente incluyen la detección de cáncer de vejiga mediante el análisis de la orina y la detección de leucemia tanto como linfoma mediante el análisis de sangre. Un método adecuado para tal análisis es el Inmunoensayo de Disociación de Fluorescencia de Lantanida Mejorado, Di ssocia ti on Enhanced Lan thani de Fl uorescence Immunoassay- "DELFIA" . También se encuentra incluida una demostración de detección de casos de sarcoma y carcinoma mediante DELFIA en sangre. El epitelio cervical está esencialmente compuesto por dos tipos de células distintivas: el epitelio escamoso y el epitelio columnar, cada uno de los cuales se encuentra ubicado en una región del tejido anatómicamente distintivos. El epitelio escamoso se encuentra ubicado en el aspecto exterior (exocervix) de la abertura cervical (os), mientras que el epitelio columnar se extiende dentro del canal endocervical (endocervix) . Estos dos tipo de células epiteliales distintivas entran en contacto en la vecindad del os cervical, en la unión escamo-columnar . La unión escamo-columnar es de importancia clínica como es la región en donde la mayoría de las malignidades surgen. Para una valides en el diagnóstico, una muestra de frotis cervical debería incluir células de esta región. Para asegurarse que esto se ha logrado, un frotis debería contener células epiteliales escamosas así como también columnar. La mayoría de los tumores cervicales surgen en la unión escamo-columnar del epitelio escamoso, que es un sistema de célula raíz dinámica en multicapas bajo constante renovación. El compartimento de célula raíz en sí mismo se encuentra ubicado adyacente a la membrana de base dentro de la capa de célula basal. La división de célula raíz da origen a derivado de células superficial, intermedia y parabasal. Estas son definidas convencionalmente en términos tanto de su morfología y ubicación características dentro del epitelio escamoso. La transición desde las células básales ubicadas en la capa más profunda del epitelio escamoso, a las células superficiales en su superficie es asociada con la diferenciación progresiva y una perdida de la proliferación hasta las células epiteliales escamosas superficiales en la superficie cervical se diferencian terminantemente. En la displasia, existe una proliferación celular aumentada con una reducción en la diferenciación de las células a medida que progresan a través del epitelio escamoso. Normalmente, por conveniencia en la primera instancia, en la práctica de exámenes de detección cervical involucra la evaluación de frotis tomadas de la superficie del epitelio, el citopatologista que busca las anormalidades en la superficie representativa de diferenciación reducida como resultado de la displasia. En el estado fetal tardío, durante la adolescencia y en el embarazo, el epitelio columnar es reemplazado en la unión por el epitelio escamoso por un proceso de metaplasia. Las células escamosas metaplásicas que reemplazan las células columnares son particularmente vulnerables a los carcinógenos. La metaplasia normal no debería confundirse con la displasia normal dentro del epitelio escamoso, y puede ser importante en los contextos de la práctica de exámenes de detección, el poder distinguir entre células metaplásicas y displásicas. A pesar de un programa nacional de práctica de exámenes de detección costoso e intensivo, el carcinoma de cerviz es la octava malignidad más frecuente en las mujeres del Reino Unido y la malignidad más común en la mujeres del Reino Unido menores de 35 años (Campaña de Investigación del Cáncer, Cáncer del cervi z u teri . 1994, CRC: Londres) . En el mundo en desarrollo es la malignidad más común y la causa principal de muerte en las mujeres entre los 35-45 años, con un estimado de 437,000 casos nuevos cada año (Campaña de Investigación del Cáncer, Cáncer - perspectivas mundiales 1995, CRC: Londres ) . La mayoría de los casos representan el carcinoma de las células escamosas (SCC) y se asocian fuertemente con la infección con tipos de ?alto riesgo' de papilomavirus humano, tal como 16, 18 y 31 (Park y colaboradores, Cáncer, 1995, 76 (10 Supl . ) : páginas 1902-13) . El carcinoma cervical esta dispuesto a la prevención mediante la práctica de exámenes de detección en la población, a medida que evolucione a través de etapas 'intraepiteliales' no invasivas bien definidas (Wright y colaboradores, Lesiones pre-cancerosas de la cerviz, en la patología de Blaustein del tracto genital femenino. R. J. Kurman, Editor. 1994, Springer-Verlag: Nueva York, páginas 29-78). Las anormalidades escamosas intraepiteliales pueden ser clasificadas usando sistemas de 3 tier (CIN) o 2 tier (Bethesda) . Las anormalidades histológicas diferentes se correlacionan ampliamente con el tipo de HPV infeccioso y con la ploidía de ADN, clonalidad e historia natural de la lesión. Como se ha clasificado de acuerdo con el sistema Bethesda, las lesiones escamosas intraepiteliales de grado bajo (LSIL) , correspondientes CIN1 e infección cervical HPV (HPVI) generalmente representan infecciones HPV productivas, con un riesgo relativamente bajo de progresión a enfermedad invasiva (Wright y Kurman. Un informe crítico de la clasificación morfológica de sistemas de lesiones pre-invasivas de la cerviz: la base científica para cambiar el paradigma en informes de papilomavinus : investigación actual acerca del papilomavirus, C. Lacey, Editor. 1996, Leeds University Press: Leeds) . Las lesiones intra-epiteliales escamosas de alto grado (HSIL) , correspondientes a CIN2 y CIN3, muestran un mayor riesgo de progresión que CNI1 (LSIL) a pesar que ambas son vistas como representantes de un potencial precursor de la malignidad. Aunque es posible estimar el riesgo aproximado de malignidad para cada categoría de lesión intraepitelial, actualmente no es posible determinar la probabilidad aproximada de progresión para un caso individual. En 1943, Papanicolau y Trout introdujeron la evaluación de frotis Pap para detectar precursores de cáncer cervical en las mujeres. Este es una evaluación de práctica de examen de detección citológico y probablemente ha probado ser la medida de salud pública más exitosa que se ha introducido para la prevención del cáncer. Los programas de práctica de exámenes de detección masivos, en los cuales las mujeres efectúan evaluaciones de frotis cervical al menos una vez cada tres o cinco años, han probado ser altamente efectivos en algunos países en la reducción de los porcentajes de mortalidad y morbilidad de cáncer cervical. Por ejemplo, en la Columbia británica y en Finlandia, la práctica de exámenes de detección organizada ha reducido los porcentajes de mortalidad por cáncer cervical en 70%. Si se detecta tempranamente el cáncer cervical es fácilmente tratado.

A pesar de estos logros, la realidad de la situación mundial es deprimente. De los cientos de miles de mujeres que desarrollan cáncer cervical anualmente, más del 50% morirán de la enfermedad. El setenta y cinco por ciento de todas esas mujeres se encontrarán en los países en desarrollo, en donde, debido a problemas financieros, los programas masivos de práctica de exámenes de detección usando metodologías disponibles no son viables. Aún en muchos países desarrollados, la disminución de la enfermedad en la década pasada ha sido insignificante, mientras que el impacto de la práctica de exámenes de detección citológica ha sido mucho menor del esperado. Además, los expertos observan una proporción sustancial de casos de cáncer cervical invasivo en pacientes que son examinados con regularidad, particularmente mujeres j óvenes . Las razones principales por las cuales la práctica de exámenes de detección citológicos algunas veces falla en detectar el cáncer cervical son los largos intervalos entre las evaluaciones y también el alto número de resultados negativos falsos (10-30%) (Práctica de exámenes de detección de citología Pap: la mayoría de los beneficios cosechados? WHO y EUROGIN publican un informe acerca del control del cáncer cervical. Press Reléase WHO/25, Marzo de 1997). El gran número de resultados negativos falsos refleja el hecho que la interpretación de frotis Pap es uno de los ejercicios morfológicos más difíciles. Los resultados de un frotis Pap son más difíciles de interpretar que aquellos de aspiración con aguja fina, evaluación de fluido citológico o biopsias debido a la complejidad y variabilidad de la población de células mixtas ubicadas en el frotis y el amplio espectro de procesos infamatorios y reparadores que ocurren en la cerviz. También existen cambios cíclicos en la población celular, alteraciones inducidas por los embarazos y alteraciones que ocurren en el periodo post menopáusico. Debido que la citología ginecológica es tan difícil, los periodos de entrenamiento para los citotécnicos es largo; requieren un estudiante educado y un alto grado de disciplina y destrezas de reconocimiento de patrones. Aún después de haber completado un programa de entrenamiento adecuado, los citologistas requieren de varios anos de experiencia práctica antes de que puedan efectuar juicios de exactitud consistente acerca de que, si el resultado de frotis Pap es normal o anormal. En forma similar, aunque los patologistas pueden ser entrenados para interpretar secciones histológicas, requieren entrenamiento adicional especializado en citopatología para poseer destrezas adecuadas para organizar y supervisar el laboratorio de citología y efectuar los diagnósticos apropiados en lo que concierne frotis anormales . Los dos problemas principales asociados con los programas de práctica de exámenes de detección Pap son el porcentaje (10-30%) de negativos falsos aparentemente inevitable y el costo relativamente alto de la práctica de exámenes de detección. Por lo tanto, los enfoques alternativos están siendo considerados para la práctica de exámenes de detección cervical. Las dos propuestas más comúrmente debatidas son usar la evaluación y tipificación de ADN HPV como una modalidad de práctica de exámenes de detección primaria o como suplemento de los frotis Pap y usar instrumentos que pueden efectuar de manera automática la práctica de exámenes de detección de frotis Pap tomados en forma convencional, reduciendo así la necesidad de citotécnicos y citopatólogos altamente pagos (Richart, Cáncer Supplement, 1995, 76 (10) : 1919-1927; Birdsong, Patología Humana, 1996, 27 (5) : 468-481) . El método anterior permanece problemático. Existen problemas de sensibilidad y valor de predicción positivo usando métodos para HPV in situ. El uso de PCR para la detección de HPV DANA produjo tales porcentajes altos de infección HPV en la población general que la evaluación HPV ADN es considerada ser de uso cuestionable para la práctica de exámenes de detección clínicos . El segundo enfoque involucra la automatización. Un número de compañías al presente se encuentran desarrollando y comercializando instrumentos de práctica de exámenes de detección automatizados. En general, tales instrumentos usan un explorado de video de alta resolución para capturar imágenes, que son entonces digitalizadas y analizadas con una serie de algoritmos, y los datos son entonces pasados a través de una red de interferencia a través de la cual la máquina ha sido entrenada para distinguir entre componentes celulares normales o anormales. Se espera que con el desarrollo de software y hardware adicional, la práctica de exámenes de detección automatizados puedan ser considerados para la práctica de exámenes de detección primarios, aunque hasta el momento la FDA de EE.UU. no ha aprobado dispositivos para la práctica previa o independiente de exámenes de detección de frotis Pap, Aquellas compañías están preparadas para efectuar grandes inversiones en tal enfoque complejo y costoso para intentar superar los problemas de la evaluación de frotis Pap convencional ilustra la severidad de los problemas y la gran necesidad de una solución. La evaluación de ios marcadores de proliferación de células no ha provisto previamente ninguna tal solución y los expertos en el campo han sido escépticos que los marcadores de proliferación proporcionarán información clínica útil (Hall y Coates, Histopatología, 1995, 26: 105-112. Existe una creencia que midiendo los parámetros de la proliferación de las células proporcionará información objetiva acerca de los tumores, pero a pesar de los numerosos estudios existe poca evidencia directa de que el uso de marcadores de proliferación de células tales como PCNA, Ki67 etc. son realmente una mejora sobre la evaluación históloga convencional óptimamente empleados. Algunos estudios han nombrado el hecho crítico del valor relativo de los marcadores de proliferación comparados con el estadio y grado del estándar histopatológico . Los intentos de usar el manchado inmunocitoquímico o inmunofluorescente con la práctica de exámenes de detección cervical automatizada han sido limitados por el manchado no específico de células normales. Por ejemplo, el antígeno de membrana epitelial (EMA) ha demostrado manchar las células neoplásicas de las cerviz con CIN, pero el manchado de algunas células metaplásicas de cerviz normales también han sido informadas. Por lo tanto, aunque la tecnología para medir el manchado inmunohistológico se encuentra disponible, ninguna de las máquinas para la práctica de exámenes de detección automatizadas que se encuentran en el mercado o en desarrollo avanzado usan la inmunohistoquímica al momento. Los marcadores de proliferación más ampliamente estudiados son Ki67, una proteína de función desconocida y PCNA (antigen nuclear de célula prolifera) (Yu y Felipe, Jornal Histoquímico, 1993, 25: 843-853) . El PCNA se encuentra involucrado en la elongación de la replicación de ADN y en el mecanismo de reparación de ADN. Por lo tanto se encuentra presente durante la síntesis real de ADN mediante replicación o reparación. Los presentes inventores han estudiado proteínas involucradas en la etapa de iniciación temprana de la replicación de ADN. Estas son Cdc6 y proteínas de la familia MCM2-7 (MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 y MCM7) . Williams y colaboradores (1997) Proc. Nati. Acad Sci. USA, 1997, 94: 142-147) informó que las células HeLa humanas en cultivo expresan Cdc6 a través de ciclos de células de proliferación, pero que fibroplastos diploides humanos WI38 dejan de expresar Cdc6 cuando se hacen quiescentes mediante inanición de suero. En la presente se muestra que estas observaciones se extienden a otras líneas de células y a otras especies. Los MCM se encuentran presentes en núcleos en fase Gl (antes de la síntesis de ADN) y son desplazados progresivamente de cromatina en el núcleoplasma soluble durante la síntesis de ADN. En la presente se muestra que también se encuentran ausentes de cromatina durante el estado de reposo. También se demuestra en la presente que el MCM5 se encuentra ausente de las células diferenciadas de la cerviz uterina y los pechos. A partir de estos hechos antecedentes, se espera que los antisueros MCM o Cdc6 se parezcan a las distribuciones de PCNA o Ki67. Otra evidencia de esta expectativa proviene de Hiraiwa y colaboradores (Int. J. Cáncer, 1997, 74: 180-184) que encontró patrones de inmuno-manchado similares para PCNA y MCM7 (hCDC47) en varios tejidos humanos y en tres tipos de tumor humano. Sin embargo, sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado diferencias dramáticas en el valor de diagnóstico potencial de MCM y Cdc6 en comparación con PCNA y Ki67. Los inventores han evaluado antisueros surgidos contra la proteína MCM humana y Cdc6 humano para citología cervical. Han estudiado secciones de frotis cervicales y cerviz uterino humano enfermos y normales. Han comparado los resultados con aquellos obtenidos usando PCNA y KÍ67. Los anticuerpos Cdc6 o anticuerpos MCM (por ejemplo MCM5) detectan lesiones LSIL (HPVI/CIN 1) en la cerviz más efectivamente que los anticuerpos contra PCNA o Ki67. Además, esencialmente todas las células de lesiones LSIL (HPVI/CIN 1) o HSIL (CIN 2/3) se encuentran manchadas. Esto es en contraste al manchado mediante otros marcadores de proliferación tales como PCNA. Indica que las moléculas de unión específicas dirigidas a las proteínas del complejo de pre-inicio de la replicación de ADN, particularmente proteínas Cdc6 o MCM (tal como MCM5 pero también ejemplificadas en la presente para MCM2, MCM3, MCM4, MCM6 y MCM7 ) tienen valor de diagnóstico excepcional para la detección temprana de células neoplásicas o atípicas. En las muestras cervicales sujetas a la recuperación de antígeno (cocción a presión o autoclave), cuyas muestras tienen formalina fijada y parafina incrustada, los anticuerpos anti Cdc6 y anti-MCM dan patrones similares de manchado que aquellas obtenidas con PCNA, pero los resultados superiores sobre muestras frescas y congeladas de frotis son claros.

Así la presente invención general mente se relaciona en varios aspectos con métodos y medios para detectar un polipéptido objetivo particular, o codificación mRNA de un polipéptido objetivo, en tejido, fluido o células de un individuo, usualmente en una muestra retirada del cuerpo. Los polipéptidos objetivo de la presente invención tales como Cdc6 y proteínas MCM, tal como MCM5, pueden distinguirse de otros marcadores de proliferación celular que no son útiles en la presente invención siendo incluidos dentro del complejo de pre-inicio de la replicación de ADN. Pueden distinguirse siendo desplazados de la cromatina durante el reposo y la diferenciación. Por ejemplo, ORC2 (Gavin y colaboradores, 1995, Ciencia 270, 1667-1671, que no es objetivo de uso en la presente invención, puede distinguirse de proteínas tales como Cdc6 y MCM permaneciendo unido a la cromatina en células en reposo. Orc2 no está regulada en disminución en células en reposo, aunque otros complementos del complejo ORC, y como Orel, puede comportarse en forma diferente. El Cdc6 es regulado en disminución durante el reposo y la diferenciación. Las células cultivadas paradas en GO pro solo 48 horas no contienen ninguna proteína Cdc6 detectable. La Cdcd no es detectable en células paradas in vitro por mayor en periodos de tiempo o en células diferenciadas ex vivo. Las células paradas in vitro mediante inanición de suero o inhibición de contacto pierden MCMs unidos en cromatina (después de unos días), aunque el nivel total de los MCMs en las células no disminuye en forma apreciable, al menos dentro de los 14 días. Las células HL-60 que se someten a la diferenciación in vitro (por ejemplo, las células inducidas a diferenciarse con DMSO o TPA) disminuyen la regulación de MCM3 pero no de 0rc2 (Musahl, Reunión Aussois en Replicación de ADN, Aussois, Francia, Junio 1997) . Las células diferenciadas de tejidos ex vivo no expresan proteínas MCM tales como MCM2 y MCM5. Las seis proteínas MCM, MCM2-MCM7 forman un complejo de multiproteína, que se divide en dos subcomplej os : MCM3 y MCM5 dímero; MCM2-4-6-7 tetrámero. MCM3 y MCM5 pueden ser desplazados de la cromatina durante la fase S más lentamente que MCM2-4-6-7 (Kubota y colaboradores, 1997, EMBO J. 16, 3320-3331). Los MCMs se encuentran unidos en cromatina en Gl desplazados durante la fase S y la nuclear, pero no unidos a la cromatina en G2. La Cdc6 se comporta similar en hongos, aunque además de ser desplazada de la cromatina también es degradada, los niveles de proteína disminuyendo dramáticamente en la transición Gl/S. Otros componentes del complejo de pre-inicio de la replicación de ADN pueden incluirse de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos incluyen homólogos humanos de componentes de hongos, tal como proteína quinasa Cdc7 (Chapman y Johnston, Exp. Cel, Res., 1989, 180 419-428 (hongos), Sao y colaboradores, 1997, EMBBBO J., 16, 4340-4351 (humano regulado en disminución en reposo)), Dbf4, la subunidad reguladora de la proteína quinasa Cdc7 (Jackson y colaboradores, 1993, Mol. Cell. Biol. 13 2899-2908 (hongo), Masai y colaboradores, Reunión de Cold Spring Harbor en la replicación de ADN eucariótica, 3-7 de septiembre de 1997 (humano)), proteína fosfatasa Cdcl4 (Hogan y Koshland PNAS USA, 1992, 89, 3098-3102 (hongo)), Cdc5, que se asocia con y tiene un fenotipo similar a los MCMs (Zou y colaboradores, Mol. Cell. Biol, 1997, 17, 553-563 (hongo) , Takisawa y colaboradores, Reunión de Cold Spnng Harbor en la replicación de ADN eucariótica, 3-7 de septiembre de 1997 (Xenopus)), MCM10, que se asocia con y tiene un fenotipo similar a los MCMs (Merchant y colaboradores, 1997, Mol. Cell. Biol. 17 3261-3271). Los polipéptidos objetivo de la presente invención pueden decirse, variadamente, que son cualquiera de los componentes del complejo pre-replicativo de ADN, componentes de replicación de cromatina competente, involucrados en restringir la replicación de ADN a una vez por ciclo, componentes de la licencia de replicación, involucrados en la licencia de cromatina para una sola vuelta de replicación de ADN, y unida en los orígenes de la replicación antes de la iniciación de la replicación de ADN. La secuencia de aminoácido Cdc6 se revela en Williams y colaboradores, 1997, PNAS USA 94: 142-147, GenBank Cuenta No. U77949. La secuencia MCM2 humana se describe en Todorov y colaboradores., 1994, J. Ceil. Sci . , 107, 253-265, GenBank Cuenta No. X67334. La secuencia MCM3 humana se describe en Thom es y colaboradores., 1992 Nucí . Aci d Res . , 20, 1069-1074, GenBank Cta. No. P25205. La secuencia MCM4 humana se describe en Ishimi y colaboradores., 1996, J. Bi ol . Chem . , 271, 24115-24122, GenBank Cuenta No. X74794. La secuencia MCM5 humana se describe en Hu y colaboradores., 1993, Nucl ei c Aci d Res . , 21, 5289-5293, GenBank Cuenta No. X74795. La secuencia MCM6 humana se describe en Holthoff y colaboradores., 1996, Genomi cs, 37, 131-134, GenBank Cuenta No. X67334. La secuencia MCM7 humana se describe en Hu y colaboradores., 1993, Nucl ei c Aci d Res . , 21, 5289-5293.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se encuentra proporcionado un método para determinar la presencia o ausencia de células de proliferación anormal o anormalidad en el crecimiento celular en una muestra de un individuo, el método incluye contactar una muestra con un miembro de unión específico dirigido contra un polipéptido objetivo, como se mencionó anteriormente, y determinando la unión del miembro de unión específico a la muestra. Otro aspecto de la presente invención proporcionado para un método para categorizar un tejido como (i) normal o (ii) potencialmente o realmente canceroso o precanceroso, displásico o neoplásico, el método incluyendo determinar la unión a la muestra de tejido de un miembro de unión específico dirigido contra un polipéptido objetivo, como ya se expuso. El patrón o grado de unión pueden compararse con aquel de una muestra normal conocida y/o una muestra anormal conocida . El Cdc6 humano ha sido clonado independientemente por los presentes inventores, como se describe en la presente, pero la primer publicación de su clonado fue hecha por Williams y colaboradores, cuyo informe (PNAS USA 94: 142-147, 1997) proporciona la secuencia de aminoácido completa. Como se ha demostrado experimentalmente en la presente, las moléculas de unión anti-Cdc6 son muy efectivas en marcar anormalidad en varios tejidos, especialmente muestras cervicales, preferiblemente frotis. Esto se compara con una no-unión de tejido cervical normal es una muestra de frotis . La secuencia de aminoácido para MCM5 humana se revela en Hu y colaboradores, 1993, Nucleic Acids Res., 21, 5289-5293, GenBank No. X74795. La evidencia experimental incluida en la presente muestra que las moléculas de unión dirigidas contra la misma, como Cdc6 son muy efectivas en marcar la anormalidad en varios tejidos, especialmente muestras cervicales, preferiblemente frotis. Obtener anticuerpos de alta afinidad contra MCM5 parece más fácil que para Cdc6, que puede reflejar una antigenicidad mayor. Más evidencia experimental incluida en la presente muestra que las moléculas de unión dirigidas contra MCM2, contra MCM3, contra MCM4, contra MCM5, contra MCM6 y contra MCM7 también son efectivas en marcar anormalidad en muestras de tejido tal como frotis cervical. Los anticuerpos anti-MCM5 han sido descubiertos como dadores de un patrón de machado más fuerte que los anticuerpos anti-MCM2 y anti-MCM7, tanto en todas como en un número de células. Los anticuerpos anti-CDC6 han sido descubiertos como dadores de un patrón de manchado similar a anti-MCM5. Así, la unión de (por ejemplo) un miembro de unión específico anti-MCM o anti-Cdcd a una muestra proporciona la categorización del tejido desde la cual la muestra es derivada como anormal, potencialmente o realmente pre-cancerosa o cancerosa, displásica o neoplásica. De acuerdo con la presente práctica ante la obtención de un resultado positivo usando una evaluación Pap, un individuo con resultado positivo puede ser investigado en mayor profundidad, por ejemplo por medio de una evaluación de biopsia y/o repetición de una práctica de exámenes de detección. Es muy común para un potencial pre-canceroso para no resultar en un estado canceroso real. La práctica de exámenes de detección durante seis meses es normalmente usado para seguir una progresión o regresión de displasia para permitir una intervención terapéutica a tiempo y apropiada si se lo requiere . Si un tejido es categorizado como potencialmente o realmente pre-canceroso o canceroso, sobre la base de anormalidad detectada en una muestra de tejido de acuerdo con la presente invención, será necesario un diagnóstico apropiado y/o seguimiento clínico.

La presente invención pueden ser usadas para pre-evaluar muestras entes de un mayor análisis. La presente invención puede usarse para la práctica de exámenes de detección o análisis de muestras previamente evaluadas usando una técnica disponible, tal como una evaluación de frotis Pap o evaluación Thinrep 2000. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para marcar células anormales entro de una muestra de tejido, el método incluyendo que la muestra haga contacto con un miembro de unión dirigido contra el polipéptido objetivo, tal como Cdc6, MCM5 u otro MCM como se mencionó, bajo condiciones en donde el miembro de unión específica se une a células de proliferación anormales y células no normales. Si el miembro de unión específica se une o no a la muestra puede determinarse para aseverar la presencia de células de proliferación anormal dentro de la muestra. En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un miembro de unión específica dirigido contra un polipéptido objetivo, como se mencionó, para determinar, evaluar o diagnosticar la presencia o ausencia de proliferación celular anormal, anormalidad de crecimiento celular, displasia, neoplasia o un estado potencialmente o realmente canceroso en un tejido o en una muestra del mismo.

Una molécula de unión específica puede proporcionarse en un botiquín, que puede incluir instrucciones de uso de acuerdo con la presente invención. Tales botiquines son provistos como otro aspecto de la presente invención. Uno o más reactivos pueden ser incluidos, tal como moléculas de etiquetamiento, y así sucesivamente (ver abajo) . Los reactivos pueden proporcionarse dentro de contenedores que los protejan del ambiente externo, tal como un frasco sellado. Un botiquín puede incluir uno o más artículos proporcionando la muestra de evaluación en si misma dependiendo del tejido de interés, por ejemplo, un tapón para retirar células de la cavidad bucal, una jeringa para retirar una muestra de sangre, una espátula para tomar frotis cervical, una pistola de biopsia y así sucesivamente (tales componentes siendo generalmente estériles). Un botiquín puede incluir cualquier combinación de o un agente bloqueante completo para disminuir el manchado no específico, un separador de almacenamiento para preservar la actividad de la molécula de unión durante el almacenamiento, separador de manchado y/o separador de lavado a ser usado durante el manchado de anticuerpo, un control positivo, un control negativo y así sucesivamente. Los controles negativo o positivo pueden usarse para validar la actividad y corregir el uso de reactivos empleados de acuerdo con la invención y que pueden proporcionarse en un botiquín. Los controles pueden incluir muestras, tales como secciones de tejido, células fijadas en estuches cubiertos y así sucesivamente, conocidos por ser positivos o negativos para la presencia del objetivo tale como Cdc6 o MCM5. El diseño y el uso de controles es estándar y entran bien en las capacidades de rutina de aquellos diestros en el arte. Se pueden retirar muestras del cuerpo usando medios y técnicas convenientes. Para la práctica de exámenes de detección cervical, las muestras de frotis estándar pueden ser empleadas. Alternativamente, la tecnología ThinRep 2000 (Cytec Corp., Boxborough, Mass., EE.UU.) pueden usarse. Esto ha sido aclarado por la FDA de EE . UU. Como un reemplazo para la preparación de frotis del método Pap convencional. Una muestra es recolectada en un medio líquido en vez de colocar las células en frotis en una placa de vidrio. Un procesador automatizado (la máquina ThinRep 2000) después es usada para recolectar las células del líquido y los depositan en una fina capa en una placa de vidrio para su análisis. Una espátula o esponjina pueden usarse para retirar las células de endotelio, por ejemplo de la cerviz o de la cavidad bucal. Las muestras de sangre y otros fluidos pueden retirarse usando una jeringa o aguja. Otras muestras de tejido pueden ser retiradas mediante biopsia o sección de tejido. En las realizaciones preferidas la muestra no se encuentra sujeta a la recuperación de antígeno o cocción a presión/autoclave. La recuperación de antígeno ha sido estándar por mucho tiempo en el arte y es bien conocida para aquellos de una destreza ordinaria. Hiraiwa y colaboradores se refieren a Shun y colaboradores (1991) Lab. Invest. 64, 693-702, que proporciona un enfoque ejemplar. Las muestras pueden ser frescas o estar congeladas pero generalmente no tienen parafina incrustada ni formalina fijada. Como ya se expuso, en una realización particularmente preferida la muestra es un frotis cervical. Los frotis cervicales no son lo suficientemente robustos para ser sometidos a cocción de presión. Además, el tratamiento de recuperación de antígeno generalmente no conduce a una práctica de examen de detección en donde se desea un alto rendimiento. La ej emplificación experimental de aspectos de la presente invención incluida en la presente demuestra la aplicabilidad a la cerviz, incluyendo la evaluación de los frotis cervicales, el pecho, malignidades del tracto urinario (evaluados tanto en muestras de tejidos de biopsia y en frotis de citología de orina) , colon, pulmón, vejiga, piel, laringe, esófago, bronquios, nodulos linfáticos y malignidades hematológicas, también sangre y suero para pruebas de sarcoma y carcinoma metastáticos . La presente invención puede emplearse además en la evaluación de anormalidades pre-malignas de células epiteliales glandulares cervicales (neoplasia glandular intra-epitelial, GIN) o anormalidades pre-malignas en otros tejidos. Puede ser particularmente apropiado para el empleo en la evaluación bioquímica y citológica de otros especímenes clínicos en donde la detección de células neoplásicas, o su distinción de células muestren cambios reactivos, puede ser muy difícil. Tales especímenes incluyen esputo, especímenes de lavaje bronqui-alveolar , orina y cepillado del tracto alimentario (incluyendo esófago, estómago y páncreas, tanto el conducto biliar y el conducto pancreático) . La presente invención puede aplicarse en evaluaciones biológicas o histológicas de tejido en donde la evaluación de proliferación puede permitir una predicción más exacta de resultado clínico, y/o una selección más racional de terapia. Los especímenes pueden incluir malignidades de células glandulares (por ejemplo, pulmón, pecho, colon, próstata, estómago), células escamosas (por ejemplo, pulmón, piel, esófago) u otros tipos de células epiteliales (por ejemplo, vejiga, uréter, riñon, ovario) . El alto grado de especificidad observado en los experimentos que se describen en adelante con anticuerpos anti-Cdc6 y anticuerpos anti-MCM, incluyendo varios anticuerpos anti-MCM2, anti-MCM3, anti-MCM4, anti-MCM5, anti-MCM6 y anti-MCM7, evaluados en un intervalo de cáncer de pecho proporciona enfoques inmunocitológicos y bioquímicos para el diagnóstico de cáncer de pecho. Tales pueden ser aplicados a biopsias de pecho o especímenes de aspiración de aguja fina (FNA) o muéstreos de fluidos de los conductos mamarios, permitiendo el uso en programas de práctica de exámenes de detección. Las muestras a ser sometidas a contacto con un miembro de unión de acuerdo con varios aspectos de la presente invención pueden prepararse usando cualquier técnica disponible que permita la unión de una molécula de unión específica al polipéptido objetivo, tal como Cdc6, MCM5 u otro MCM como se expuso, la determinación de los niveles de ácido nucleico, actividad enzimática y así sucesivamente, de acuerdo con distintas realizaciones de la presente invención. Varias técnicas son estándar en el arte, por ejemplo (para moléculas tales como el polipéptido objetivo de unión de anticuerpos) como se usa en las células de fijación en la evaluación Pap. Las reactividades del miembro de unión tal como un anticuerpo en muestras de evaluación y normales pueden determinarse mediante cualquier medio apropiado. El marcado con moléculas de informe individuales es una posibilidad. Las moléculas de informe pueden generar directa o indirectamente, y preferiblemente medir señales. La unión de moléculas de informe puede ser en forma directa o indirecta, covalentemente, por ejemplo, vía una unión péptida o no covalentemente. La unión vía una unión péptida puede ser como resultado de la expresión de recombinación de una molécula de unión de codificación de fusión de gen (por ejemplo, anticuerpo) y molécula de información. Un modo favorecido es mediante unión covalente de cada miembro de unión con un fluorocromo, fosfor o tinte láser individual con características de emisión o absorción aisladas espectralmente . Los fluorocromos adecuados incluyen fluoreceina, rodamina, ficoerritrina y Texas Red. Los tintes cromogénicos adecuados incluyen diaminobencidina . Otros informes incluyen partículas coloidales macromoleculares o material particulado tal como cuentas de látex coloreadas, magnéticas o paramagnéticas, y agentes biológica o químicamente activos que pueden causar directa o indirectamente señales detectables a ser observadas visualmente, electrónicamente detectadas o registradas de otra forma. Esta moléculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones que desarrollan o cambian colores o causan cambios en propiedades eléctricas, por ejemplo. Pueden ser excitables en forma molecular, tal que las transiciones electrónicas entre los estados de energía resultan en absorciones o emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas usadas en conjunción con biosensores. Se pueden emplear sistemas de detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina. Otros ejemplos son peroxidasa de rábano picante y quimoluminescencia . El modo de determinar la unión no es un aspecto de la presente invención y aquellos diestros en el arte pueden elegir un modo adecuado de acuerdo a su preferencia y conocimiento general. En los experimentos ya descritos, la peroxidasa de rábano picante ha sido empleada. Otros experimentos han sido llevados a cabo usando fosfatasa alcalina, con resultados similares siendo obtenidos (por ejemplo con frotis cervicales) . La fosfatasa alcalina puede ser un sistema de detección más sensible que la peroxidasa de rábano picante, pero el color desarrollado es menor compatible con el manchado de Pap. Un protocolo para el manchado de anticuerpo de frotis cervicales, que ha sido empleado en realizaciones de la presente invención es como sigue 1. Fijar frotis fresco por 5 minutos en 50:50 acetona :metanol . (Nótese que un punto de inicio alternativo en donde un frotis ha sido previamente fijado con "Cytohx" - un tratamiento de cera y alcohólico que es de uso estándar en el Reino Unido para tratar muestras de frotis cuando son tomadas para permitir un transporte seguro a un centro de práctica de exámenes de detección- es retirar el Cytofix empapado en licores metilados por 10 minutos. Si el frotis ha sido cubierto con cualquier capa protectora, cualquier tratamiento puede emplearse para exponer una muestra al manchado de anticuerpos.) 2. Lavar en salina Tri-reguladora (TBS) por 5 minutos. 3. Lavar para permeabilizar en 4mM deoxicolato de sodio en TBS por 15 minutos. 4. Lavar en TBS más 0.3% de Tritón X100 por 5 minutos.

. Repetir el paso 4. 6. Lavar en TBS más 0.025% de Tritón X100 por 5 minutos. 7. Escurrir el exceso de líquido sin permitir que se seque el tejido. 8. Transferir las placas en una cámara humidificada y ubicar a cada lado de las placas 200 microlitros de 10% de reactivo de suero de cabra en TBS por un mínimo de 2 horas (o durante toda la noche) . 9. Escurrir el exceso de líquido sin permitir que se seque el tejido. 10. Ubicar 200 microlitros de anticuerpo primario diluido en TBS conteniendo 0.1%. 11. El Tritón y 1% BSA en cada placa y se dejan durante la noche a 4% en un agitador orbital. 12. Transferir las placas en rejillas y lavar en TBS más 0.3% de Tritón X100 por 5 minutos. 13. Lavar en TBS más 0.025% de Tritón X100 por 5 minutos . 14. Repetir el paso 12. 15. Escurrir el exceso de líquido sin permitir que se seque el tejido. 16. Transferir las placas en una cámara humidificada y ubicar en cada placa 200 microlitros de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra biotinilado (Dako) a 1:500 en TBS conteniendo 1% de BSA por 1 hora. 17. Mientras las placas se encuentra en anticuerpo secundario, hacer una solución SABC . 18. Transferir las placas a las rejillas y lavar en TBS por 5 minutos. 19. Ubicar las placas en un agente bloqueante de peroxidasa endógena con 0.6% de peróxido de hidrógeno por 10 minutos. 20. Lavar en TBS por 5 minutos. 21. Repetir el paso 19 dos veces. 22. Transferir las placas en una cámara humidificada y ubicar en cada placa 200 microlitros de solución de SABC por 30 minutos. 23. Transferir las placas a las rejillas y lavar en TBS por 5 minutos . 24. Repetir el paso 22. 25. Revelar en una solución DAB por 10 minutos. 26. Lavar en agua corriente por 5 minutos. 27. Ubicar las placas en una solución de hematoxilina harris por 6 segundos. 28. Lavar en agua corriente por 1 minuto. 29. Diferenciar en 0.5% de ácido hidroclórico por 1-2 segundos. 30. Lavar en agua corriente por 5 minutos. 31. Enjuagar en 50% de metanol por 5 minutos. 32. Enjuagar en 70% de metanol por 2 minutos. 33. Enjuagar en 90% de metanol por 2 minutos. 34. Enjuagar en 100% de metanol por 2 minutos.

. Colocar en una solución de trabajo Orange G por 2 minutos . 36. Enjuagar en 100% de metanol por 7 segundos y agitar suavemente . 37. Repetir el paso 35. 38. Colocar en una solución BA50 por 2 minutos. 39. Enjuagar en 100% de metanol por 7 segundos y agitar suavemente . 40. Repetir el paso 38. 41. Colocar las placas en xileno para aclararse por 5 minutos . 42. Repetir el paso 40 dos veces. 43. Aplicar placas de cobertura usando un montante DEPEX. Los frotis para la inmunofluorescencia pueden prepararse en forma similar (y ha sido asá) . Después del anticuerpo secundario, son incubados en strepavidina FITC-anticuerpo conjugado por 1 hora y contra machado para ADN con yoduro de propidio/RNA se A (ambos Sigma a 50 ng/ml), lavados y montados en glicerol/PBS/ fenil enodiamina . Las moléculas de unión preferidas para usar en los aspectos de la presente invención incluyen anticuerpos, unificadores naturales para el objetivo, pequeñas moléculas cuyo objetivo es uno o más epitopes en el objetivo y dominios de unión del Receptor de células T. Los anticuerpos que son específicos para un objetivo de interés, tal como Cdc6, MCM5 u otro MCM, puede obtenerse usando técnicas que son estándar en el arte. Los métodos para producir anticuerpos incluyen inmunizar un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja, mono o ave tal como pollos) con la proteína o un fragmento de la misma o una célula o virus que expresa la proteína o fragmento. La inmunización con ADN codificando el polipéptido objetivo también es posible. Los anticuerpos pueden obtenerse de animales inmunizados usando cualquiera de las variedades de técnicas conocidas en el arte, y efectuando la práctica de exámenes de detección, preferiblemente usando la unión de anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, las técnicas de secado por presión Western o inmunoprecipitación pueden usarse (Armitage y colaboradores, 1992, Nature 357: 80-82) . La producción de anticuerpos monoclonales está bien establecida en el arte. Los anticuerpos monoclonales pueden estar sujetos a las técnicas de tecnología de recombinación de ADN para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden involucrar introducir ADN codificando la región variable de inmunoglobulina, o las regiones determinando complementariedad (CDRs), de un anticuerpo a las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de esqueleto, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, EP184187A, GB 2188638A o EP-A-0239400. Un hibridoma produciendo un anticuerpo monoclonal puede ser sometido a mutación genética u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos. Como una alternativa o suplemento para inmunizar un mamífero con un péptido, un anticuerpo específico para un objetivo puede obtenerse de una librería producida recombinantemente de dominios de variables de inmunoglobulina expresada, por ejemplo, usando bactenofago lambda o bacteriófago filamentoso que exponen dominios de unión de inmunoglobulina funcional en sus superficies, por ejemplo ver W092/01047. La librería puede ser natural, que es construida de secuencias obtenidas de un organismo que no ha sido inmunizado con el objetivo o puede ser uno construido usando secuencias obtenidas de un organismo que ha sido expuesto al antígeno de interés (o un fragmento del mismo) .

Los anticuerpos pueden ser modificados en un número de formas. Es más, salvo que el contexto lo evite de otra forma, el término anticuerpo deberá entenderse como abarcando cualquier sustancia de unión específica teniendo un dominio de unión de antigen anticuerpo. Así esto cubre fragmentos de anticuerpos, derivados y equivalentes funcionales, incluyendo cualquier polipéptido comprendiendo un dominio de unión de inmunoglobulina, tanto natural como sintético. Las moléculas quiméricas comprenden un dominio de unión de inmunoglobulina, o un equivalente, fundido en otro polipéptido y por lo tanto incluido. El clonado y la expresión de anticuerpos quiméricos son descritos en EP-A-0120694 y EP-A-0125023. Se ha mostrado que la función de los antígenos de unión puede ser llevada a cabo mediante fragmentos de un anticuerpo completo. Ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab consistiendo de los dominios VL, VH, CL, y CH1; (ii) el fragmento Fd consistente de los dominios VH y CH1 ; (iii) el fragmento Fv consistiendo los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward E.S. y colaboradores, Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste de un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente comprendiendo dos fragmentos Fab unidos (wii) moléculas Fv de cadena única (scFv) , en donde un dominio VH y un dominio VL son unidos por un unificador péptido que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión de antígeno (Bird y colaboradores, Science, 242, 423-426, 1988; Huston y colaboradores, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dímeros Fv de cadena única biespecífica (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecí fieos construidos por fusión de genes (W094/13804; P. Holliger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993) . La expresión recombinante de polipéptidos, incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, es bien conocida en el arte. Los sistemas de clonado y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células huésped son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, hongos, y sistemas de bacilovirus. Las líneas de células de mamíferos disponibles en el arte para la expresión de in polipéptido heterologo incluyen células de ovario de hámsters chinos, células HeLa, células de riñon de hámster de corta edad y muchos otros. Un huésped bacteriano preferido, común es E. Coli. Los huéspedes preferidos para la expresión de bacilovirus son células de insecto como la línea de células SF9. Los vectores adecuados pueden ser elegidos o construidos, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias de promotor, fragmentos terminantes, secuencias de poliadenilación, secuencias mejoradoras, genes marcadores y otras secuencias así de apropiadas. Para más detalles ver, por ejemplo, Clonado molecular: un manual de laboratorio: 2da. Edición, Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los procedimientos de transformación dependen del huésped usado, pero son bien conocidos. Siguiendo la producción por expresión de la codificación de ácido nucleico un anticuerpo u otra molécula de unión específica dirigida contra un objetivo útil en la presente invención, tal como Cdc6, puede ser recuperada y puede ser aislada, si es necesario conjugada a un informe o etiqueta apropiada, y provista para su uso en la determinación de la presencia o ausencia de anormalidad de crecimiento celular en una muestra de tejido tal como frotis cervical, de acuerdo con la presente invención como se ha revelado. Los niveles de expresión de Cdc6 y MCM en tumores son mucho mayores que en los tejidos normales y estos antígenos pueden ser liberados en el flujo sanguíneo (por ejemplo, debido a la necrosis de células de tumores) u otros fluidos del cuerpo, por ejemplo orina o materia fecal. Una molécula de unión específica puede ser usada para detectar el objetivo en un cuerpo fluido, por ejemplo suero, empleando cualquier técnica disponible para aquellos diestros en el arte, tales como DELFIA, ELISA, RÍA, secado por presión Western. La progresión y regresión de tumores puede ser controlada, por ejemplo en respuesta al tratamiento o en recidiva. Así una muestra de sangre o de otro fluido corporal, por ejemplo, orina, fluido prostático, fluido de los pezones, efusiones serosas y asciticas, fluido cerebro espinal, también materia fecal, pueden ser evaluados de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, una muestra de sangre puede ser sometida a un ensayo para la presencia de un polipéptido objetivo tal como MCM5 y CDC6 usando DELFIA, ELISA RÍA, por ejemplo como se describe en Williams y colaboradores, Clin. Chem. Acta, 1986, 155, 329-344. La determinación de unión al objetivo in vivo puede usarse para identificar la localización de células anormales en el cuerpo. Las moléculas de unión etiquetadas contra un objetivo de acuerdo con la presente invención puede ser administrada a un individuo y unir dentro del cuerpo determinado. Cuando un radionucleótido tal como lodine-125, Indium-111, Thallium-201 o Technetium-99m es adosado a un anticuerpo, si ese anticuerpo localiza preferiblemente es un tumor más que en tejidos normales, la presencia de radio etiqueta en tejidos tumorales puede ser detectada y cuantificada usando una cámara gamma o cintigrafía. La calidad de la imagen del tumor obtenida está directamente correlacionada a la proporción señal:ruido. El radio etiquetado con technetium-99m se describe en Pak y colaboradores (1992), Nucí. Med. Biol. 19; 699-677. Un informe de imágenes de cáncer con anticuerpos anti-CEA esta provisto por Goldenberg D.M., Int. J. de Bio. Markers 1992, 7; 183-188. Cualquier método practicado en cuerpos humanos y animales puede ser un método de diagnóstico real de una enfermedad, la presente invención por supuesto se extiende a los miembros de unión específicos dirigidos contra los polipéptidos objetivo como se ha revelado, para su uso en cualquier tal método. Se ha informado actividad enzimática ATPase para proteínas Cdc6 y MCM. (Zwerschke y colaboradores, 1994, J. Biol. Chem. 269, 23351-23356; Ishimo y colaboradores. Reunión de Cold Spring Harbor acerca de la replicación de ADN Eucariotico, 3-7 de septiembre de 1997). Estas proteínas pueden tener otras actividades enzimáticas, por ejemplo, la actividad helicasa informada por Ishimi y colaboradores, (Ibid.). El nivel de una proteína objetivo de acuerdo con la presente invención puede ser evaluado por medio de determinación de su actividad enzimática en una muestra. Por ejemplo, se han desarrollado sustratos cro ogénicos específicos para la actividad enzimática de enzimas tales como peroxidasa de rábano picante ( diaminobezidina) y beta-galactosidasa (X-GAL) . Se puede evaluar Cdc6, MCM5 u otra proteína objetivo en el nivel de ácido nucleico, por ejemplo, determinando los niveles de mRNA. Williams y colaboradores (Reunión de Cold Spring Harbor acerca de la replicación de ADN Eucariótico, 3-7 de septiembre de 1997) han informado la expresión de Cdc6mRNA en la base de las criptas intestinales en la base de las entrañas de un ratón. Los métodos para la detección de RNA son bien conocidos en el campo, e incluyen secado por presión Northern, secado por presión de punto, hibridación in situ, RT-PCR cuantitativa. El ácido nucleico aislado y/o purificado de una o más células o una librería de ácido nucleico derivado del ácido nucleico aislado y/o purificado de las células (por ejemplo, una librería cDNA derivada de mRNA aislado de las células), pueden ser sondeadas bajo condiciones para la hibridación selectiva y/o sometidas a una reacción de amplificación de ácido nucleico específico tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . La unión de un sondado al ácido nucleico objetivo puede medirse usando cualquiera de la variedad de técnicas a disposición de aquellos diestros en el arte. Por ejemplo, las investigaciones pueden ser etiquetadas en forma radioactiva, fluorescente o enzimática. Otros métodos que no emplean la etiquetación de sondeo incluyen el examen de restricción de polimorfismos de longitud de fragmento, amplificación usando PCR, sondeo de oligonucleótido específico alelo y desdoblamiento de Rnasa. ' Con propósitos prácticos, o al menos con propósitos comerciales teniendo en cuenta costos y tiempo, la evaluación de la expresión de proteína objetivo es generalmente preferida sobre la evaluación en el nivel de ácido nucleico. Ahora se ilustraran aspectos de la presente invención con referencia a la ej emplificación experimental. Otros aspectos y realizaciones de la presente invención serán aparentes para aquellos diestros en el arte.

EJEMPLO 1 - Preparación de anticuerpos Los anticuerpos para Cdc6 fueron preparados usando el siguiente protocolo. Los fragmentos de codificación de etiquetas de secuencia expresada de proteína tipo-Cdc6 humana (GenBank números de acceso: T90351, H59204, N69246, M045217, AA099980) fueron identificados sobre la base de su homología de secuencia débil a Orel humano y hongo Cdc6/Cdcl8. Los clones de librería correspondientes fueron obtenidos de IMAGE Consortium (Research Genetics inc., USA) y secuenciados en ambos filamentos usando un secuenciador ABI PRISM 377 (Applied Biosystems). Un consenso de secuencia de todos los cinco clones contenía un esqueleto de lectura abierta de 536 aminoácidos. La alineación con la secuencia de Cdc6 humano subsecuentemente publicada (Williams y colaboradores, 1997) reveló el 99.7% de homología en el nivel de proteína. Dos fragmentos separados de Cdc6 humano correspondiente a los aminoácidos 145-360 y 364-547 fueron clonados como fragmentos Xbal-BamHI en un vector de expresión pET23a (Novagen) y expresado en una cepa de E. Coli CL41. Los fragmentos de proteína recombinante fueron purificados mediante una cromatografía de afinidad de agarosa Ni+2 (Qiagen) y usadas para inmunización. Los anticuerpos fueron elevados y la afinidad purificada como se describió previamente (Romanowski y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93:10189-10194). Tres anticuerpos reconocieron una banda predominante de 62kD en extractos de células totales HeLa y extractos nucleares. Anticuerpos para MCM5 fueron preparados como sigue : Cargas iniciadoras PCR fueron diseñadas sobre la base de la secuencia publicada de MCM5 humano (Hu y colaboradores, 1993, Nucí. Acid Res. 21 1069-1974). Un fragmento de la secuencia de codificación MCM5 correspondiente a los aminoácidos 367-582 fue ampliado del ADN HeLa transcrito en reversa y clonado como un fragmento Sphl-BglII en un vector de expresión pQE70 (Qiagen) . La proteína fue expresada en células BL21 E.

Coli y purificada usando cromatografía de afinidad agarosa Ni~t (Quiagen) . Los anticuerpos fueron elevados como se describe en Romanowski y colaboradores, Proc.

Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 10189-10194.

EJEMPLO 2- Relaciones de Cdc6 y MCM5 con la proliferación de células Previamente se ha mostrado mediante secado a presión Western que la línea de célula humana inmortal HeLa expresa Cdc6 y MCM5 todo a lo largo del ciclo de la célula (Williams y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 1997, 94: 142-147; Schulte y colaboradores, Eur. J. Biochem., 1996, 235, 144-151). Recientemente la disminución en la regulación de Cdc6 en fibroblastos humanos Wi38 en reposo fue informada por Williams y colaboradores, 1997. Los presentes inventores también han demostrado mediante secado a presión Western que la expresión Cdc6 tiene una disminución en la regulación cuando los fibroblastos 3T3 de ratón se hacen reposar mediante inhibición de contacto (Figura ÍA) . La línea de células NIH 3T3 fue interrumpida mediante crecimiento a confluencia. Los cultivos se mantuvieron en reposo por 7 días. Las células fueron liberadas de la interrupción GO mediante la separación de tripsina y revestido. Extractos solubles (sobrenadantes) y de proteina nuclear (granulo) fueron preparados en intervalos de tres horas y ambos extractos fueron inmuno-secados por presión con anticuerpos contra MCM5, Orc2 y Cdc6 humanos. Orc2 (ver Gavin y colaboradores para clonado -Ciencia (1995) 270 1667-1671) permanece unido en cromatina en células en reposo (GO) y no aumenta apreciablemente a medida que las células entran al ciclo de la célula. En contraste MCM5 no pudo detectarse en la fracción unida en cromatina (granulo) de las células en reposo aún cuando la fracción soluble contenía cantidades significativas de MCM5. En contraste a MCM5, Cdc6 se encontró completamente ausente de las células en reposo pero la expresión de esta proteína fue rápidamente inducida a medida que las células volvían a entrar al ciclo de la célula. También se obtuvieron resultados similares con la línea de células humanas EJ13 (derivadas de un carcinoma de vejiga) . Estos resultados proporcionan la indicación de que la ausencia de Cdc6 en células en reposo es un fenómeno general . Estos estudios se extendieron mediante inmunofluorescencia y aplicación de anticuerpos anti-Cdcd y anti-MCM5 a células enteras. La expresión de Cdcd y de MCM5 también demostró estar regulada en disminución cuando los fibroblastos humanos recién nacidos (NHF) se hacen quiescentes mediante inhibición de contacto. Los NFH fueron desarrollados para confluir y fueron mantenidos quiescentes por tres días. Se liberaron las células de la interrupción GO mediante separación de tripsina y revestimiento. Entonces las células enteras fueron cosechadas en puntos de tiempo múltiples después de la separación hasta la entrada en la fase S. El manchado con yoduro de propidio fue usado para revelar el ADN y se compararon los resultados con el manchado de las muestras con anticuerpos anti-Cdc6 y ant-MCM5. Las células quiescentes (GO) no mostraron inmunoreactividad Cdc6, y mostró una señal muy débil con anticuerpo anti-MCM5. Sin embargo durante la entrada en el ciclo de la célula y la fase S, se observó una fuerte inmunoreactividad nuclear para Cdc6 y MCM5. Estos estudios pueden sugerir que los anticuerpos anti-Cdc6 podrían proporcionar un marcador para las células en proliferación similar a PCNAo Ki67.

Ni PCNA ni Ki67 han sido probados satisfactorios para la citología cervical.

EJEMPLO 3 - Moléculas de unión anti-Cdc6 y anti-MCM5 detectan células anormales (por ejemplo, tumor) mucho más efectivamente que los anticuerpos PCNAy Ki67. Los resultados perfilados en el ejemplo 2 sugieren que la expresión Cdcd puede parecerse a aquella de PCNA o Ki67, ninguna de las cuales habiendo sido probadas satisfactorias para la citología cervical. Los presentes inventores compararon anticuerpos a estas proteínas en secciones de cerviz uterino enfermo o normal .

El inmunomanchado de SILs cervicales para los marcadores de proliferación convencionales PCNA y Ki67 muestra un patrón diferente de inmunoreactividad al compararse con el manchado para Cdc6 o MCM5. En la cerviz normal, los anticuerpos contra todos los cuatro antígenos mostraron inmunomanchado positivo de las células epiteliales confinadas a las capas básales y para básales. No se observo inmunomanchado de células metaplásicas, estromáticas o inflamatorias. En ambos grados de anticuerpos SILs, alto y bajo, (LSIL y HSIL) contra Cdc6 y MCM5 mostraron un inmunomanchado positivo de la mayoría (> 95%) de las células anormales. Por el contrario, el inmunomanchado para PCNA y Ki67 fue positivo solo en una población minoritaria (< 30%) de las células anormales en ambos grados de SILs. Los Coilocitos, que son característicos de LSIL y reflejan un efecto HPV citopático, todos mostraron un inmunomanchado positivo con Cdc6 y MCM5, mientras que solo una población minoritaria (20%) mostró un manchado positivo para PCNA o Ki67. El mayor nivel de manchado en las células anormales proporciona una ventaja distintiva para usar moléculas de unión ant?-Cdc6 o anti-MCM5 sobre las moléculas anti-PCNA y anti-Ki67 en la práctica de exámenes de detección cervical en donde las muestras de tejido son mejor tomadas mediante frotis de la superficie del epitelio. Se cortaron secciones de 5 µm en placas de vidrio y fueron des-enceradas en xileno. La actividad de la peroxidasa endógena fue aplacada mediante incubación en 0.6% peróxido de hidrógeno en 100% de metanol por 3-5 minutos a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas en salina fosfato dividida por 2 x 5 minutos y entonces fueron bloqueados con aproximadamente 100 µl por sección de 10% de suero de ternero fetal (FCS) en salina fosfato dividida (PBS). Las placas fueron diluidas a 1 en 20 en PBS conteniendo 2.5% FCS, y 25-50 µl fue agregado a cada sección. La incubación fue por 45 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Entonces las placas fueron lavadas por 3x5 minutos en PBS, seguido de un bloqueado con 20% de suero de conejo para anti-Ki67 o anti-PCNA y 20% suero de burro para anti-Cdc6 o anti-MCM5 en PBS por 15 minutos. Después de escurrir el anticuerpo bloqueante y enjugar las placas, el anticuerpo secundario anti-ratón de conejo biotinilado (para anti-Ki67 o anti-PCNA) o anti-conejo de burro (para anti-Cdc6 o anti-MCM5) a 1 en 200 en PBS conteniendo 10% de suero normal humano se agregó por 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 3 x 5 minutos de lavados en PBS, se agregó un complejo de peroxidasa de rábano picante-biotina-estraptavidina a 1 en 500 en PBS por 30 minutos a temperatura ambiente. Seguido de los lavados de PBS por 3x5 minutos se agregó el sustrato de diaminobencidina a 1% en 100 mM Tris. Cl (pH 7.6) conteniendo 0.005% de peróxido de hidrógeno, y fue incubado a temperatura ambiente por 5 minutos. La reacción fue detenida enjuagando con agua corriente, y las placas fueron levemente manchadas con hematoxilina Gilí, deshidratada a través de etanoles graduados y lavada 2x6 minutos en xileno. Se aplicaron coberturas con un medio de montaje DPX . Las secciones en serie de la cerviz normal fueron manchadas para PCNA, Ki67, MCM5 y Cdcd usando los respectivos anticuerpos. Todos estos anticuerpos mostraron patrones similares de inmunoreactividad con células positivas confinadas a las capas básales y parabasales solamente. Las secciones en serie de una cerviz de SIL (CINI) en grado bajo fueron manchados para PCNA, Ki67, MCM5 y Cdcd respectivamente usando los anticuerpos. La displasia es prominente en la tercera parte inferior del epitelio escamoso y está asociada a los cambios virales del HPV (coilocitosis ) , esta última extendiéndose a la superficie. Los PCNA y KÍ67 muestran una inmunoreactividad focal irregular que está confinada al tercio inferior del epitelio y en el cual solo una pequeña proporción de células atípicas se encuentran positivamente manchadas. Por el contrario, Cdc6 y MCM5 muestra una inmunoreactividad de densidad total con un manchado positivo de todas las células atípicas incluyendo los coilocitos en las capas más superficiales del epitelio. Las secciones en serie de un SIL de alto grado fueron manchadas usando anticuerpos PCNA, Ki67 MCM5 y Cdc6 respectivamente. La displasia se encuentra presente a través de todas las capas del epitelio. Los PCNA y Ki67 muestran patrones similares de inmunoreactividad con una densidad de manchado completa pero en la cual solo una población minoritaria de células atípicas son positivas (hasta aproximadamente 30%) . Los Ccdc6 y MCM5 también muestra un manchado de densidad completa del epitelio. Sin embargo, en marcado contraste con PCNA y Ki67, Cdcd y MCM5 muestra un manchado positivo de todas las células atípicas. Estos resultados son indicativos de la utilidad particular de usar moléculas de unión específicas anti-Cdcd o anti-MCM5 en la evaluación del estado de una cerviz mediante la determinación de la unión a una muestra de frotis la frotis solo muestra una capa de la superficie superior de las células de la cerviz, de modo tal que es importante tener un alto nivel de manchado. Tal manchado de alto nivel obtenido con anti-Cdc6 y con anti-MCM5 en una etapa temprana de anormalidad (SIL de bajo grado, CINI), que no es muestra con anti-PCNA ni con anti-Ki67 es muy significativo. Es más, el manchado de densidad completa obtenido durante el uso de anticuerpos anti-Cdc6 y anti-MCM5 en muestras LSIL, pero no anticuerpos anti-PCNA ni anti-Ki67, destaca la utilidad particular de estos últimos para una premalignidad potencial en un estado temprano.

EJEMPLO 4 - Los anticuerpos Cdc6 y MCM5 detectan células anormales en frotis cervicales. El ejemplo 3 demuestra el valor de las moléculas de unión anti-Cdc6 y anti-MCM5 para detectar lesiones potencialmente pre-malignas en secciones de la cerviz uterina. Además, los resultados experimentales muestran que son igualmente efectivas en detectar células anormales en preparaciones de frotis cervical. Los frotis cervicales fueron fijadas por 10 minutos en formaldehído (4% recién preparado de paraformaldehído en salina separada de fosfato) . El material fijado fue entonces manchado con anticuerpos anti-Cdc6 (1:200) o anticuerpos anti-MCM5 (1:200) seguido de anticuerpo policlonal anti-conejo de burro conjugado a isotiocianato fluoresceino (Amersham; 1:100). Las imágenes fueron obtenidas usando microscopía confocal de explorador láser (Bio-Rad MRC 1024) . En estas imágenes el ADN total es rojo, el inmunomanchado Cdc6 o MCMS es verde y así los núcleos inmunoreactivos son amarillos. Los ejemplos de los frotis cervicales normales mostraron una tira característica de células endocervicales dispuestas en forma paralela y una población mezclada de células escamosas metaplásicas y superficiales. No hay evidencia de inmunoreactividad específica anit-Cdc6 o anti-MCM5 con cualquiera de los anticuerpos evaluados. Los frotis anormales que contienen células discarióticas (células escamosas atípicas) mostraron un manchado positivo con tres anticuerpos anti-Cdc6 diferentes y con un anticuerpos anti-MCM5. Los coilocitos también mostraron una inmunoreactividad con anticuerpos anti-Cdcd y anti-MCM5. Ninguna de las células metaplásicas/escamosas superficiales normales adyacentes muestran inmunoreactividad Cdc6 MCM5. Se obtuvieron resultados usando distintos anticuerpos anti-Cdc6, preferiblemente manchando células LSIL, incluyendo coilocitos, contra un antecedente muy bajo en frotis de cerviz normales, o en células normales en frotis de cerviz anormal. Estos resultados también fueron obtenidos usando un anticuerpo anti-MCM5. Se vieron resultados similares con anticuerpos contra MCM5.

EJEMPLO 5 - Anticuerpos Cdc6 y MCM5 preferiblemente manchan las células cancerosas en las mamas. Los anticuerpos anti-Cdc6 y anti-MCM5 fueron evaluados en otros sitio de cánceres comunes, las mamas. El manchado y fijado del tejido de las mamas es igual al descrito en los ejemplo 3 y 4 para frotis cervicales. Se evaluaron los anticuerpos anti-Cdcd y anti-MCM5 en un intervalo de cánceres de mamas. Mientras que la mama normal no mostró evidencia de inmunomanchado, se observó un manchado fuerte positivo con anticuerpos anti-Cdc6 y anti-MCM5 en una variedad de tipos histológicos de cáncer de mamas incluyendo carcinoma de conductos invasivo en alto y bajo grado. Un carcinoma mucosal de bajo grado también mostró un manchado positivo con ambos anticuerpos. Importantemente, las células estromales normales adyacentes al cáncer eran negativas.

EJEMPLO 6 - Análisis de muestras de sangre Las muestras de sangre de archivos de pacientes con enfermedad metaplásica diseminada son ensayadas para la presencia de MCM5 y Cdc6 usando un ensayo inmunosorbente unido a enzimas como se describe en Williams y colaboradores, Clin. Chem. Acta, 1986, 155, 329-344. La cantidad de MCM5 y Cdc6 soluble en suero está correlacionada con la carga tumoral.

EJEMPLO 7 - Comparación de frotis y secciones congeladas con secciones de tejido de cerviz normal incrustados en cera de parafina con recuperación de antígeno. El manchado de inmunoperoxidasa de 5 µm secciones de secciones de tejido de cerviz normal incrustados en cera de parafina fijados con formalina (siete muestras), LSIL (cinco muestras), HSIL (seis muestras) fue llevada a cabo con anticuerpos contra KÍ67, PCNA, MCM5 y Cdc6. Se cortaron secciones de 5 µm en placas de vidrio y fueron des-enceradas en xileno. La actividad de peroxidasa endógena fue aplacada mediante incubación en 0.6% peróxido de hidrógeno en 100% de metanol por 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas por 2 minutos en agua ultra-pura y entonces fue cocinada a presión por 2 minutos en un separador de citrato de sodio. Las placas fueron lavadas en salina fosfato-Tris-dividida (TBS) por 2 x 5 minutos y entonces fueron bloqueadas con aproximadamente 100 µl por sección de 10% de suero de cabra en TBS, las placas fueron escurridas y el exceso de cera enjugado. Los anticuerpos primarios fueron diluidos a 1 en 200 en TBS conteniendo 1% de BSA, y 100 µl fue agregado a cada sección. La incubación duró toda la noche en una cámara humidificada a 4°C. Entonces las placas fueron lavadas por 3x5 minutos en TBS, seguido de un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra biotinilado a 1 en 500 en TBS conteniendo 1% de BSA por 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 3 x 5 minutos de lavados en TBS, se agregó un complejo de peroxidasa de rábano picante- biotina-estraptavidina a 1 en 500 en TBS por 30 minutos a temperatura ambiente. Seguido de los lavados de TBS por 3x5 minutos se agregó el sustrato de diaminobencidina a 1% en TBS conteniendo 0.005% de peróxido de hidrógeno, y fue incubado a temperatura ambiente por 10 minutos. La reacción fue detenida enjuagando con agua corriente, y las placas fueron levemente manchadas con hematoxilina, deshidratada a través de etanoles graduados y aclarada en xileno. Se aplicaron coberturas con un medio de montaje DPX .

El manchado de inmunoperoxidasa de secciones de cerviz normal de tejido congelado (ocho muestras), HSIL (nueve muestras) y LSIL (ocho muestras) fue llevado a cabo con anticuerpos contra PCNA, Ki67,MCM5 y Cdc6. Las secciones congeladas fueron fijadas por 10 minutos en acetona. La actividad endógena de la peroxidasa fue aplacada mediante incubación en 0.6% de peróxido de hidrógeno en 100% de metanol por 30 minutos. Las secciones fueron entonces lavadas en TBS y bloqueadas durante la noche con 10% de suero de cabra en TBS. Los anticuerpos primarios fueron diluidos 1/200 en TBS conteniendo 1% de BSA e incubados durante la noche a 4°C. Seguidamente se llevó a cabo el procedimiento de anticuerpo secundario para las secciones de tejido fijo tal como ya se describió. La sensibilidad del manchado con los anticuerpos anti-MCM5 y anti-Cdcd fue mucho mayor que con los anticuerpos anti-PCNA y anti-Ki67 al ser aplicadas a las secciones congeladas. En el tejido de carcinoma de célula escamosa, normal y LSIL fijado en formalina, incrustado en parafina y expuesto a cocción a presión, anti-PCNA, anti-MCM7, anti-MCM5 y anti-Cdc6 dieron patrones similares de manchado. El Ki67 fue mucho menos sensible con solo un manchado débil focal de LSIL y carcinoma de células escamosas.

EJEMPLO 8- Manchado con anticuerpos anti-MCM7 en secciones congeladas y en tejidos sujetos a recuperación de antígeno. Cuatro secciones de cerviz clasificada como HSIL fueron manchadas con anticuerpo anti-MCM7. Se observó manchado con el mismo patrón que el manchado con anticuerpos anti-Cdc6 y anti-MCM5. Este resultado difiere del de Hirawa y colaboradores (Int. J. Cáncer, 1997, 74: 180-184) que encontró patrones de inmunomanchado similares para PCNA y MCM7 (hCDC47) en varios tejidos humanos y en tres tipos de tumor humano que habían sido sometidos a protocolos de recuperación de antígeno. Sin embargo, consistente con Hirawa y colaboradores, los patrones de manchado obtenidos para los anticuerpos anti-MCM7 en cerviz secciones de tejido incrustados en cera de parafina de carcinoma de célula escamosa, normal y LSIL sometidos a una recuperación de antigen fueron encontrados similares a aquellos obtenidos para los anticuerpos anti-PCNA. Como se indicó en el ejemplo 7, los patrones de manchado para anticuerpos anti-MCM5 y anti-Cdcd en tales secciones así preparados también fueron similares a aquellos para los anticuerpos anti-PCNA.

EJEMPLO 9 - Manchado con anticuerpos anti-MCM2 Se usó MCM2 humano policlonal de conejo para manchar dos secciones congeladas de cerviz normal y cuatro secciones congeladas de HSIL (cada una de las cuales incluían epitelio cervical normal) . El ectocerviz normal mostró un manchado de núcleos solo en la capa basal, sin expresión en células diferenciadas superficiales. Por el contrario. Hubo un manchado nuclear de células HSIL en toda la densidad completa del epitelio anormal. Las células endocervicales fueron negativas.

EJEMPLO 10 - Manchado con anticuerpos anti-MCM3 Se usó MCM3 humano policlonal de conejo para manchar una sección congelada de cerviz normal y dos secciones congeladas de HSIL (cada una de las cuales incluían epitelio cervical normal). El ectocerviz normal mostró un manchado algo granular de núcleos solo en la capa basal, sin expresión en células diferenciadas superficiales. Se observó un antecedente de manchado del citoplasma queratinocito. Por el contrario, hubo un manchado nuclear de células HSIL en toda la densidad completa del epitelio anormal.

Hubo algo de manchado en el moco endocervical , aunque el núcleo de las células endocervicales fueron negativas. También se usó MCM3 anti-humano policlonal para manchar cuatro frotis de HSIL y dos frotis de LSIL (cada una de las cuales incluía células cervicales normales) .

Hubo manchado nuclear de células SIL en cada caso.

Además, hubo un antecedente de manchado de queratinocitos y algo de manchado en los núcleos de las células endocervicales en la dilución del anticuerpo primario usado. Se usó MCM3 anti-Xenopus policlonal para manchar una sección congelada de HSIL. La reactividad entrecruzada de los anticuerpos MCM3 anti-Xenopus con MCM3 humano fue confirmada mediante secado a presión Western y localización en secciones de tejido. Hubo manchado nuclear de células HSIL en toda la densidad completa del epitelio anormal.

EJEMPLO 11 - Manchado con anticuerpos anti-MCM4 Se usó MCM4 humano policlonal de conejo para manchar una sección congelada de cerviz normal y dos secciones congeladas de HSIL (cada una de las cuales incluían epitelio cervical normal) .

El ectocerviz normal mostró un manchado algo granular de núcleos solo en la capa basal, sin expresión en células diferenciadas superficiales. Se observó un antecedente de manchado del citoplasma queratinocito. Por el contrario, hubo un manchado nuclear de células HSIL en toda la densidad completa del epitelio anormal, con un fuerte manchado de la superficie del núcleo. Hubo un débil manchado en los núcleos de las células endocervicales en la dilución del anticuerpo primario usado. También se usó MCM3 anti-humano policlonal para manchar cuatro frotis de HSIL y dos frotis de LSIL (cada una de las cuales incluía células cervicales normales) . Hubo manchado nuclear de células SIL en cada caso. Además, hubo un antecedente de manchado de queratinocitos y algo de manchado en los núcleos de las células endocervicales en la dilución del anticuerpo primario usado. Se usó MCM4 anti-humano para manchar dos frotis de HSIL (cada una de las cuales incluían células cervicales normales). Hubo manchado nuclear de células HSIL en cada caso. Además, hubo antecedente de manchado citoplasmático de queratinocitos y algo de manchado de núcleos de células endocervicales en la dilución del anticuerpo primario usado.

EJEMPLO 12- Manchado con anticuerpos anti-MCM6 Se usó MCM6 humano policlonal de conejo para manchar una sección congelada de cerviz normal y dos secciones congeladas de HSIL (cada una de las cuales incluían epitelio cervical normal) . El ectocerviz normal mostró un fuerte manchado de núcleos solo en la capa basal, sin expresión en células diferenciadas superficiales. Por el contrario, hubo un fuerte manchado nuclear de células HSIL en toda la densidad completa del epitelio anormal. Hubo algo de manchado en el moco endocervical, aunque en el núcleo de las células endocervicales fue mínimo. También se usó MCM6 anti-humano policlonal para manchar cuatro frotis de HSIL y cuatro frotis de LSIL (cada una de las cuales incluía células cervicales normales) . Hubo manchado nuclear de células SIL en cada caso. Además, hubo un antecedente de manchado citoplasmático de queratinocitos y algo de manchado en los núcleos endocervicales en la dilución del anticuerpo primario usado.

EJEMPLO 13- Más experimentos de manchado con anticuerpos anti-MCM7 Se usó MCM7 anti-humano policlonal de conejo para manchar tres secciones congeladas de cerviz normal, seis secciones congeladas de HSIL y una sección congelada de un SCC cervical (cada una de las cuales incluían epitelio cervical normal) . El ectocerviz normal mostró un manchado de núcleos solo en la capa basal, sin expresión en células diferenciadas superficiales. Se observó un antecedente de manchado del ectoplasma queratinocito. Por el contrario, hubo un fuerte manchado nuclear de la gran mayoría de las células HSIL en toda la densidad completa del epitelio anormal. Hubo algo de manchado en el moco endocervical, y un débil manchado en las células endocervicales en la dilución del anticuerpo usado. También se usó MCM7 anti-humano policlonal para manchar dos frotis de HSIL y dos frotis de LSIL (cada una de las cuales incluía células cervicales normales) . Hubo manchado nuclear de células SIL en cada caso. Además, hubo un antecedente de manchado citoplasmático de queratinocitos y algo de manchado en los núcleos de las células endocervicales en la dilución del anticuerpo primario usado. Se usó anti-Xenopus MCM7 (confirmando su reactividad entrecruzada de MCM7 humano mediante secado a presión Western y localización en secciones de tejido) para manchar una sección congelada HSIL. Hubo manchado nuclear de células HSIL en toda la densidad completa del epitelio anormal.

MÉTODOS Preparación de frotis cervical Se fijaron frotis (5 minutos en 50:50 acetona ¡metanol ) y se secaron al aire. Después de aplacar la actividad endógena de peroxidasa (como se mencionó), las células fueron permeablizadas (4mM deoxicolato de sodio por 10 minutos), fueron lavadas (TBS con 0.25% de Tritón X-100) y bloqueadas durante la noche con 10% de suero de cabra en TBS. Se diluyeron anticuerpos primarios en 1/200 en TBS conteniendo 1% de BSA y fueron incubados durante la noche a 4°C. Las placas fueron entonces lavadas 3x5 minutos en TBS, seguido de anticuerpo secundario de conejo biotinilado (Dako) a 1 en 500 en TBS conteniendo 1% de BSA por 30 minutos a temperatura ambiente. Después de los lavados de 3x5 minutos en TBS, se agregó un complejo de peroxidasa de rábano picante estreptavidina (Dako) a 1 en 500 en TBS por 30 minutos a temperatura ambiente. Seguido de los lavados de 3x5 minutos en TBS se agregó el sustrato de diaminobencidina a 1% en TBS conteniendo 0.005% de peróxido e hidrógeno, e incubado a temperatura ambiente por 10 minutos. La reacción fue detenida enjuagando con agua corriente, y las placas fueron levemente manchadas en sentido inverso con hematoxilina, deshidratada mediante etanoles graduados y aclarada en xileno. Se aplicaron revestimientos de placa con un medio de montaje DPX.

Inmunofluorescencia Se suspendió material de frotis cervical recolectado recientemente en 0.5 ml de PBS y fue fijado mediante el agregado de 0.5 ml 8% de formaldehído y centrifugado en fundas de cubrimiento de polilisina. Las fundas de cubrimiento fueron procesadas como se describe en Romanowski y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 1996, 93: 10189-10194. Seguido del bloqueado en 5% de BSA/PBS/Triton X-100 y SDS fueron incubados con anticuerpo primario, lavados, incubados con anticuerpo secundario (anticuerpo anti-conejo conjugado con FITC Amersham 1:100) y manchado en sentido inverso para ADN con yoduro de propidio/RNAsa (ambos Sigma a 50ng/ml), lavados y montados en glicerol/PBS/ fenil enodiamina . Las imágenes fluorescentes fueron recolectadas en un microscopio confocal de exploración láser MRC 10224 BioRad usando un método de dos canales (FITC & Texas Red) . Para algunas series confocales de imágenes a 1-2 µm pasos fueron recolectados y entonces fueron proyectados como un armazón único (Figuras 4a y c) . Se recolecto tejido de mamas normales y tumorales fresco de especímenes de masectomía. Se fijaron finas rebanadas (< 1 mm) en 4% de formaldehído por 30 minutos y entonces se procesó como se ha descrito pero permitiendo periodos más largos de tiempo para las incubaciones de anticuerpo y los lavados.

EJEMPLO 14 - Una comparación de control de una realización de la presente invención con un manchado Pap estándar Se llevó a cabo una prueba de control para comparar la eficiencia de detección usando anticuerpos contra MCM5 con un manchado Pap estándar llevado a cabo en frotis obtenidos de mujeres concurrentes a los consultorios externos de colposcopía en hospitales locales . La Tabla 1 muestra que de 26 casos evaluados como positivos mediante la mancha Pap de rutina, todos los 26 también fueron de resultado positivo mediante la prueba de anticuerpo de acuerdo con la presente invención. De 16 casos que resultaron negativos mediante el manchado Pap de rutina, 13 también resultaron negativos mediante el test de anticuerpo.

De los tres restantes, uno contenía células escamosas inmaduras manchadas mostrando cambios reactivos en un fondo inflamatorio. Los otros dos fueron confirmados como teniendo células anormales (LSIL) en la re-evaluación de la mancha Pap, est es, eran negativos-falsos del tipo en el cual la presente invención puede ser usada para eliminar. Estos resultados demuestran que no hay una perdida de información de la mancha Pap, solo una ganancia de información usando una evaluación de anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Esto permite que cualquier falla posible de la evaluación de anticuerpo sea asegurada usando la mancha Pap convencional .

EJEMPLO 15 - Análisis de muestras de orina de pacientes con malignidades en el tracto urinario Se estableció un Inmunoensayo de Disociación de Fluorescencia de Lantanida Mejorado, (DELFIA) para la detección de MCM5 humano usando dos antisueros anti-hMCM5 policlonal de conejo diferentes. La base del ensayo sandwich es la inmovilización de un exceso de anticuerpo específico a una superficie (aquí, receptáculo microtiter de poliestireno) - esto es, el anticuerpo "captura".

Seguido de la reacción de unión de anticuerpo primario, un segundo anticuerpo (aquí europio) etiquetado con una distinta especificidad de epitopo es agregado en exceso. Después de que la inmunoreacción ha sido completada, el exceso de materiales de lavado y, seguido del agregado de la solución resaltadora, (Wallac Oy) la fluorescencia resuelta en tiempo es medida en un fluorómetro de tiempo resuelto. La señal es proporcional a la concentración del analizado. Se ha empleado el siguiente ensayo: 1. Revestimiento con anti MCM5 Ab de conejo policlonal (1600 ng/receptáculo) durante la noche (4°C); 2. 3 x lavado con un separado de lavado DELFIA (Wallac Oy) ; 3. Bloqueado en 5% de BSAIPBS por 1 hora; 4. 3 x lavado con un separado de lavado DELFIA (Wallac Oy) ; 5. Reacción de unión de anticuerpo primario (1:3 dilución de analizado en un separador múltiple Wallac con 0.02% de TWEEN) durante la noche (4°C); 6. 4 x lavado con un separado de lavado DELFIA (Wallac Oy) ; 7. Reacción de unión de anticuerpo secundario con anti-MCM5 Ab de conejo policlonal etiquetado europio (4 ~°Eu/lgG) por 3 horas; 8. 6 x lavado con un separado de lavado DELFIA (Wallac Oy) ; 9. Agregado de solución de resaltador 10 minutos de incubación con agitación. Medición de la fluorescencia resuelta en tiempo en un fluorómetro de resolución de tiempo (Wallac Oy) Usando antisuero anti-MCM5 policlonal de conejo de dos conejos distintos y MCM5 humano recombinante en 5% de BSA/PBS como el analizado se obtuvo una curva estándar entre 13pM y 41250pM. La concentración de hMCM5 es un espécimen siendo determinada por comparación de lo contado del ensayo DELFIA de la muestra a una curva estándar hecha de hMCM5 recombinante 5% de BSA/PBS Se espera una sensibilidad aun mejor par cuando los anticuerpos monoclonales sean usados. Los especímenes de orina de los pacientes con malignidades en el tracto urinario en el Hospital Addenbrookes, Cambridge, UK, fueron centrifugadas (50-150 ml) a 3000 rpm (SIGMA 4K10, 7 min, 4°C) y fueron producidas fracciones solubles de la pella de la célula mediante dilatación' hipotónica, remojando y extrayendo sal de proteínas unidas con ADN. Las fracciones solubles fueron ensayadas usando DELFIA MCM5 y los datos bioquímicos comparados con informes de diagnóstico para servicios de patología de urología en el hospital.

De los 5 ejemplos determinados clínicamente siendo positivos de malignidad, 4 resultaron positivos usando el DELFIA de acuerdo con la invención (80%) mostrando cantidades mensurables de MCM5 (29-85 pM) . De las 6 muestras determinadas clínicamente como negativas de, malignidad, todas dieron respuesta similar al estándar cero con el DELFIA.

EJEMPLO 16 - Análisis de muestras de sangre de pacientes con leucemia/linforna crónico y agudo Se usó del DELFIA descrito en el ejemplo 15 para evaluar muestras de sangre obtenidas de pacientes con linforna/leucemia crítica y aguda en el Hospital Adenbrookes, Cambridge. La sangre fue centrifugada a 3000 rpm (SGMA 4K10, 7 min., 4°C) y las fracciones solubles de la pella de la célula fueron producidas dilatando hipotónicamente, remojando y extrayendo la sal de las proteínas unidas con ADN. Las fracciones solubles fueron subsecuentemente ensayadas usando DELFIA. De los seis casos malignos, 5 resultaron positivos usando DELFIA de acuerdo con la presente invención (83%) mostrando cantidades mensurables de MCM5 (24-1945 pM) . De las 6 muestras de control (sangre de pacientes ambulatorios diabéticos) dieron respuestas similares al estándar cero.

EJEMPLO 17 - Detección serológica de malignidad metastática Se llevaron a cabo ensayos con suero de pacientes con cánceres de ovario y mamas metastáticos en el Hospital Addenbrookes, Cambridge, RU usando el DELFIA descrito en el ejemplo 15. Dos casos de sarcoma y tres casos de carcinoma (adenocarcinoma de ovario y mamas) mostraron cantidades mensurables de MCM5.

EJEMPLO 18 - Preparación de anticuerpo policlonal "pan-MCM" para su uso en la invención. Una preparación de anticuerpo policlonal que puede unir MCM2, MCM3, MCM , MCM5, MCM6 y MCM7 fue obtenida como sigue. El péptido WCIDEFDKMSDMRTAC, correspondiente a una secuencia de consenso común a la familia MCM de proteínas, fue sintetizado usando química t-BOC. El péptido fue conjugado a PPD (derivado de proteína purificado - tuberculina) . Se inmunizaron conejos mediante inyección en intervalos de 21 días 10 días después se cosechó el tercer suero de inmunización y se usó en experimentos subsecuentes (referidos como anticuerpo "pan-MCM" en los siguientes ejemplos experimentales).

EJEMPLO 19 - Manchado de tejidos de carcinoma de mamas y mamas normales con anticuerpos anti-Cdc6, anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7 y pan-MCM. Especímenes histológicos de mamas normales (recipientes de operaciones de reducción de senos) y carcinomas de conductos y lobulares probados mediante biopsia fueron manchados con anticuerpos contra Cdcd, MCM2, MCM5 y MCM7 y un anticuerpo pan-MCM. El anticuerpo anti-MCM2 fue el anticuerpo monoclonal de ratón BM28 disponible comercialmente de Transduction Laboratories (ver su Catálogo de Anticuerpo 1998) . El manchado fue llevado a cabo individualmente para cada anticuerpo como se describió. Ambos especímenes incrustados en parafina, fijados en formalina que fueron sometidos a cocción a presión y los especímenes congelados fueron examinados. Los tejidos humanos incrustados en parafina, fijados con formalina obtenidos para el diagnóstico de biopsia o después de su resección en el Hospital Addenbrookes fueron utilizados de acuerdo con las indicaciones éticas aprobadas por el hospital. Cinco secciones de micrón fueron cortadas de estos tejidos en rebanadas revestidas con APES (aminopropiltrietoxisilano) , des-encerado en xileno y llevado a través de alcoholes hacia el agua. El tejido fue cocinado a presión en un separador de citrato para facilitar la recuperación epitope, seguido de lavado en salina Tris-separada (TBS) , La actividad de peroxidasa endógena fue aplacada mediante incubación en 0.6% de peróxido de hidrógeno en TBS por 30 minutos. Las secciones fueron lavadas en TBS y bloqueadas con 10% de suero de cabra en TBS por hasta 2 horas. Los anticuerpos primarios fueron diluidos en TBS conteniendo 0.1% de Tritón y 1% de albúmina de suero Bovino (BSA) . Cien microlitros se agregaron a cada sección y las placas fueron incubadas a 4°C en una cámara humidificada. Las placas fueron entonces lavadas en TBS conteniendo 0.025% de Tritón, seguido de incubación en anticuerpo secundario anti-conejo de cabra biotinilada (DAKO) a 1:500 en TBS conteniendo 1% de BSA por 1 hora a temperatura ambiente. Después de los lavados en TBS, un sistema de peróxido de rábano picante estrepavidina usando el sustrato dieminobencidina fue usado para manchar las placas. La reacción fue detenida enjuagando en agua y fue levemente manchada en sentido inverso con hematoxilina Harris, deshidratada a través de etanoles graduados y aclarados en xileno. Se aplicaron fundas de revestimiento con un medio de montaje DEPEX. Se prepararon como se describió en el ejemplo 7 excepto que el bloqueo con 10% de suero de cabra fue por 30 minutos y no durante la noche. En el tejido mamario normal, solo 1-3% de células manchadas lobulares y de conductos tuvieron manchado positivo. Las células estromales fueron negativas . Un 50-80% de células anormales en una variedad de carcinomas de mamas, incluyendo lesiones de bajo y alto grado y del tipo lobular y de conducto, mostraron un manchado positivo, con células estromales alrededor y células inflamatorias no manchadas. Se obtuvieron tres resultados individualmente con cada uno de los anticuerpos. Se hizo una comparación con anticuerpos anti-PCNA y anti-Ki67. En las secciones de parafina, el manchado anti-PCNA dio resultados similares al anti-MCM5 y anti-Cdcd mientras que los anticuerpos anti-Ki67 solo dieron un manchado débil focal. En las secciones congeladas, el manchado con anticuerpos anti-MCM y anti-Cdcd dieron resultados mucho mejores que los anticuerpos anti-PCNA y anti-Ki67.

EJEMPLO 20 - Manchado de próstata normal y adenocarcinoma de la próstata usando anticuerpos contra MCM5, MCM7 y pan-MCM. Especímenes histológicos de tejido normal incrustados en parafina y endocarcino a de próstata, preparados como se describió para el tejido de mamas en el ejemplo 19, fueron manchados con anticuerpos anti-MCM5, anti-MCM7 y pan-MCM en experimentos separados. Los casos normales mostraron un manchado positivo menor que 10% con cada anticuerpo, mientras que los adenocarcinomas mostraron un 30-50°/0 de manchado de células tumorales, con las células estromales circundantes y las células inflamatorias permaneciendo sin manchado.

EJEMPLO 21 - Manchado de colon normal y carcinoma del colon usando anticuerpos contra MCM2 , MCM5, MCM7 pan-MCM y Cdcd Se marcaron por separado especímenes de resección histológica de adenocarcinoma de colon y adenoma tubulovilloso con anticuerpos contra MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM y Cdcd. También se mancharon especímenes normales con estos anticuerpos. En el tejido normal, el manchado para cada anticuerpo solo se vio en la tercera parte inferior de las criptas colónicas, con más células diferenciadas superficiales en las criptas que permanecían sin manchar . Tanto en los tejidos de adenoma tubulovilloso y adenocarcinoma, más del 50% de las células tumorales fueron positivos por el manchado con cada anticuerpo, los elementos de tejido conectivo circundante no fue manchado . Se examinaron ambas muestras, las congeladas y las incrustadas en parafina, como en el tejido de mamas del ejemplo 19, los resultados siendo similares como entre los anticuerpos anti-MCM y anti-Cdc6 por un lado y los anticuerpos anti-PCNA y anti-Ki67 por el otro.

EJEMPLO 22 - Manchado de tejido normal y carcinoma del pulmón, con anticuerpos contra MCM2, MCM5, MCM7 y pan-MCM Se mancharon por separado especímenes de histología incrustados en parafina de biopsias o resecciones de pacientes con carcinoma de células escamosas o adenocarcinoma del pulmón con anticuerpos anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7 pan-MCM. Los especímenes fueron preparados igual que para el tejido mamario en el ejemplo 19. Se comparó el manchado con aquel del tejido de pulmón parenquimal normal.

En el tejido normal, la fracción de proliferación manchada fue muy baja. En todos los carcinomas, más de 30% de las células tumorales fueron positivas, sin que se hayan manchado las células de tejido conectivo o inflamatorio circundantes .

EJEMPLO 23 - Manchado de vejiga, tanto normal como carcinoma con anticuerpos anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7 pan-MCM y anti-Cdc6 I Se mancharon especímenes histológicos de carcinomas de célula transicional tomados en citoscopía con anticuerpos anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7 y anti-Cdc6. En el tejido de vejiga normal, hubo un fuerte manchado de la capa basal del epitelio transicional permaneciendo sin manchar las células diferenciadas más superficiales . En los fragmentos conteniendo carcinoma in situ, hubo manchado de las células displásicas en toda su densidad. Los casos de carcinoma de células transicionales invasiva mostraron un manchado nuclear de células tumorales del 50-100%, con los componentes estromados e inflamatorio negativos.

Se examinaron las muestras congeladas y las incrustadas en parafina, tal como para el tejido mamario del ejemplo 19, los resultados siendo similares como entre los anticuerpos anti-MCM y anti-Cdcd por un lado y los anticuerpos anti-PCNA y anti-Ki67 por el otro.

EJEMPLO 24 - Manchado de varias muestras de piel con anticuerpos anti-MCM5 Se mancharon con anticuerpos anti-MCM5 muestras histológicas de piel normal, bajo condiciones hiperplasicas (incluyendo psoriasis), queratosis solar, enfermedad de Bowen y células escamosas invasivas con anticuerpos anti-MCM5. La piel normal mostró el manchado predominantemente en la capa basal del epitelio con células ocasiónales manchadas en el tercio inferior de la epidermis, pero las células diferenciadas más superficiales no se encontraban manchadas. En los casos de psoriasis, no hubo un manchado predominante en las 3-4 capas más inferiores en la epidermis, reflejando el ritmo de trastorno aumentado de la piel . La queratosis solar y la enfermedad de Bowen (carcinoma in situ) mostraron manchado en todas las células displásicas en la epidermis, hasta la densidad total . Los carcinomas de células escamosas invasivas mostraron un manchado mayor que el 70% de las células, con los tumores bien diferenciados mostrando pequeños focos de células negativas diferenciadas adyacentes a las perlas de queratina.

EJEMPLO 25 - Manchado de la laringe con anticuerpos anti-MCM5 Se mancharon con anticuerpos anti-MCM5 muestras histológicas de laringe normal y carcinoma, preparadas tal como los especímenes incrustados en parafina del tejido mamario descrito en el Ejemplo 19. Los casos normales mostraron el manchado solo de células epiteliales proliferantes básales (menos de %) . Los carcinomas mostraron más del 50% de las células con manchado nuclear. Las células estromadas e inflamatorias dieron negativo.

EJEMPLO 26 - Manchado del esófago con anticuerpos anti-MCM5 Se mancharon con anticuerpos anti-MCM5 muestras histológicas de esófago normal y carcinoma, preparadas tal como los especímenes incrustados en parafina del tejido mamario descrito en el ejemplo 19. Los casos normales mostraron el manchado solo de células epiteliales proliferantes básales (menos de 10%) . Los carcinomas mostraron más del 50% de las células con manchado nuclear. Las células estromales e inflamatorias dieron negativo.

EJEMPLO 27- Manchado de los bronquios con anticuerpos anti-MCM5 Se mancharon con anticuerpos anti-MCM5 muestras histológicas de bronquio normal y carcinoma, preparadas tal como los especímenes incrustados en parafina del tejido mamario descrito en el Ejemplo 19. Los casos normales mostraron el manchado solo de células epiteliales proliferantes básales (menos de 10%) . Los carcinomas mostraron más del 50% de las células con manchado nuclear. Las células estromales e inflamatorias dieron negativo.

EJEMPLO 28 - Manchado de nodulos de linfa, tanto normales como con un rango de linfomas, usando anticuerpo anti-MCM5 Se prepararon muestras histológicas incrustadas en parafina y también congeladas de nodulos de linfa reactiva y un rango de linfomas Hodgkin y que no son Hodgkin tal como se describe para los tejidos mamarios en el ejemplo 19 Los nodulos de linfa reactiva mostraron un fuerte manchado de las células en el centro germinal de los folículos linfoideos y células positivas diseminadas en las áreas parafoliculares . Los linfomas mostraron más de un 50% de manchado nuclear de las células linfoideas malignas.

EJEMPLO 29 - Análisis de frotis de citología de orina con anticuerpo anti-MCM5 Se recolectaron muestras de orina de pacientes con carcinoma de célula transicional conocido y de pacientes normales que concurren a la clínica urológica. Se centrifugaron veinte mililitros de orina a 3.000 g por 10 minutos, se retiró el sobrenadante y la pella fue resuspendida en 50 microlitros de sobrenadante. Esto se untó en una placa EPES y se fijó con alcohol. Xas placas fueron lavadas en salina Tris dividida (TBS), después fueron permeabilizadas en 4 mM de deoxicolato de sodio por 10 minutos. Fueron lavadas con TBS más 0.025% de Tritón y fueron bloqueadas con 10% de suero de cabra en TBS por 2 horas. El anticuerpo anti-MCM5 pre-absorbido fue diluido en TBS conteniendo .01% de Tritón y 1% de BSA y 200 microlitros se agregaron en cada placa. La incubación se efectuó durante la noche a 4°C en una cámara humidificada en un agitador orbital. Las placas fueron lavadas en TBS conteniendo 0.025% de Tritón seguido de una incubación en anticuerpo secundario anti-conejo de cabra biotinilada (DAKO) a 1:500 en TBS conteniendo 1% de BSA por 1 hora a temperatura ambiente. Se bloqueó la peroxidasa endógena con 0.6% de peróxido de hidrógeno en TBS por 10 minutos, seguido de un lavado en TBS. Un sistema de peroxidasa de rábano picante estreptavidina usando diaminobencidina sustrato fue usado pana manchar las placas. Se detuvo la reacción enjuagando en agua y las placas fueron levemente manchadas con hematoxilma Harris seguido del manchado con Orange G y EA50 (mancha Pap) . En seis casos de carcinoma de células transicionales, los frotis de citología de orina preparados de esta forma y manchados con anticuerpos anti-MCM5 mostraron un fuerte manchado de todas las células transicionales malignas, con un fondo no manchado de células escamosas e inflamatorias. Los Frotis similares producidos de orina de personas normales concurrentes a clínicas de urología no mostraron manchado de células transicionales normales o escamosas .

EJEMPLO 30 - DELFIA de muestras cervicales normales y muestras cervicales de pacientes con lesiones intraepiteliales escamosas Se estableció un Inmunoensayo de Disociación de Fluorescencia de Lantanida Mejorado, -Di ssoci a ti on Enhanced Lan thanide Fl uorescence inmunoassay- "DELFIA" para la detección de MCM5 humano usando dos antisueros anti-MCM5 policlonales de conejo diferentes como se describe en el ejemplo 15. Dos muestras de cerviz normales y dos muestras de cerviz HSIL fueron analizadas. Las muestras de tejido fueron solubilizadas dilatando hipotónicamente y remojando seguido de extracción de sal de partículas unidas a ADN. Las dos muestras normales dieron una respuesta similar a los estándares cero. Las dos muestras HSIL resultaron positivas, indicando que se puede detectar anormalidad en una muestra cervical usando inmunoensayo.

EJEMPLO 31 - Manchado varios tejidos de carcinoma con anticuerpo anti-MCM5 Se mancharon especímenes histológicos de varios carcinomas y médula leucémica con anticuerpos anti-MCM5, los resultados son los siguientes: El carcinoma de estómago mostró más del 50% de manchado de células tumorales. El carcinoma de riñon mostró 30-50% de manchado de células tumorales. El carcinoma de ovario mostró 30-50% de manchado de células tumorales. El carcinoma de teste mostró 30-50% de manchado de células tumorales. La leucemia aguda de medula mostró más del 90% de manchado de células tumorales.

EJEMPLO 32 - Manchado de frotis de colon- Se recolectó materia fecal de pacientes saludables y se extrajeron colonocitos exfoliados en la superficie de las muestras fecales por medio de cuentas magnéticas revestidas de anticuerpos específicos epiteliales, suministrados por Dynal AS (Oslo Noruega) , usando el proceso descrito en W097/09600. La mezcla extraída de las cuentas magnéticas y las células epiteliales fue lavada en TBS (salina Tris-dividida) conteniendo 0.025% de Tritón. Después del fijado en 4% de paraformaldehído dividido, las células fueron lavadas en TBS y los frotis fueron hechos de la pella de célula resultante. Entonces estas fueron tratadas como para los frotis de las muestras de orina. Los frotis manchados Pap mostraron una mezcla de cuentas magnéticas, algo de celulosa y residuo de célula; muchas células epiteliales columnares del colon y unas pocas células escamosas del canal anal se encontraban presentes. Al manchar con anticuerpos anti-MCM5, se obtienen resultados similares a aquellos obtenidos con las células anormales y normales como para la vejiga y la cerviz.

DEBATE Los resultados descritos en la presente muestran que Cdcd y MCM5 ambos son regulados en disminución en tejidos diferenciados normales in vivo y ausentes de cromatina en un rango de células de mamíferos quiescentes en cultivo. Esto proporciona alguna sugerencia que estas proteínas pueden ser de valor potencial como marcadoras de células de proliferación. Hiraiwa y colaboradores demostraron que el MCM7 puede ser in unolocalizado en una variedad de tipos de tumores tales como tumores benignos de la piel y tumores malignos del estómago, páncreas y colon, con una distribución similar de PCNA. Concluyeron que la inmunolocalización de PCNA podría ser aplicada como un índice de proliferación de células en secciones de tejido. Sin embargo, como ya se ha notado, los expertos en el campo de la patología son escépticos de que ia medida de porcentajes de proliferación de células en tumores mediante marcadores tales como PCNA y Ki67 puedan ser de algún uso clínico, ya que existe poca evidencia directa de que tales marcadores sean una mejora real sobre las evaluaciones histológicas convencionales tales como gradación y estacionamiento, al ser aplicados óptimamente. Las observaciones informadas en la presente muestran que las moléculas de unión específicas dirigidas contra Cdcd, MCM5 y MCM7 muestran un grado mucho mayor de especificidad para las células potencialmente pre-malignas en Sils cervicales congelados y frescos, que los marcadores de proliferación convencionales tales como PCNA y Ki67. Los Anti-Cdcd y anti-MCMS claramente son capaces de discriminar las células anormales en LSIL y HSIL de las células adyacentes normales, incluyendo las células endocervicales, ectocervicales , metaplásicas y estromales . En vista de esto, como se ha descrito, los anticuerpos anti-Cdcd y anti-MCM fueron aplicados a frotis cervicales tomados de pacientes con SILs, y de pacientes sin enfermedad. Los resultados fueron sorprendentes en el grado llamativo de especificidad y sensibilidad observados para aquellas proteínas. Se observó un fuerte manchado citoplasmático y nuclear en las células neoplásicas y los coilocitos infectados con HPV. Se identificó un inmunomanchado positivo en células escamosas metaplásicas mostrando anormalidades limite (células escamosas atípicas de significancia incierta) . Sin embargo, la población restante de células mixtas en el frotis incluyendo las células ectocervicales, las células endocervicales, las células metaplásicas escamosas y células inflamatorias (tanto linfocitos como neutrofilos) resultaron negativos para el inmunomanchado Cdc6 y MCM. Las sensibilidades para anti-MCM5, anti-Cdcd y anti-MCM7 son mayores que anti-PCNA al aplicarse a frotis cenvicales y secciones congeladas, pero se dan patrones de manchado similar por tales anticuerpos al ser aplicados a tejido fijado en formalina, incrustados en parafina y expuestos a recuperación de antígeno mediante cocción a presión. Los frotis cervicales y otras muestras citológicas así como también las secciones congeladas son menos robustas que las secciones de tejido incrustadas en parafina, fijadas con formalina y de esa forma no pueden ser sometidas a la cocción a presión. La especificidad y sensibilidad sorprendente de los anticuerpos anti-Cdcd y anti-MCM al ser aplicados a los frotis cervicales proporciona la introducción de un enfoque bioquímico/inmunocitológico a la práctica de exámenes de detección cervical automatizada. Es más, estos anticuerpos pueden ayudar a mejorar la detección y clasificación de LSILs, para los cuales, al presente, hay una marcada variación intra-observador e intero-observador en la gradación, aun entre expertos en el campo de la citología cervical. El uso de estos anticuerpos también ayudara a identificar los HSILs con mayor exactitud y objetividad, ayudando así a reducir el alto número de resultados negativos falsos, un gran problema asociado con los programas de práctica de exámenes de detección cervical global actuales. Como se ha evidenciado, la ej emplificación experimental adicional de tejido de mamas, muestras de orina y muestras de sangre (tanto de pacientes de leucemia/linforna y de pacientes con carcinoma y sarcoma metastásicos) indica la generalidad de los aspectos de la presente invención más allá de la práctica de exámenes de detección cervical, aunque la evaluación de las muestras cervicales, especialmente frotis cervicales, es preferida en varias realizaciones. La aplicación de técnicas bioquímicas también se demuestra además de la citología. Los resultados de las pruebas de control comparando una realización de la presente invención con evaluación de frotis cervicales usando la práctica de exámenes de detección Pap estándar, descrita en el ejemplo 14, confirma la excitante utilidad de la invención. Todos los documentos mencionados en la presente están incorporados a modo de referencia.

Tabla I Comparación de evaluación de anticuerpo anti-MCM5 versus la evaluación Pap convencional en una prueba de control de pacientes hechos volver a las clínicas de colposcopía .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para determinar la presencia o ausencia de células de proliferación anormal o anormalidad en el crecimiento celular en una muestra de un individuo, el método está incluye detectar en la muestra un polipéptido objetivo, en donde el polipéptido objetivo es un miembro del complejo de pre-inicio de la replicación de ADN; con la salvedad que en donde el polipéptido objetivo es MCM7 la muestra no es materia de recuperación de antígeno o cocción a presión/autoclave.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido objetivo es seleccionado del grupo que consistente de Cdcd, MCM2, MCM3, MCM , MCM5, MCM6, MCM7, proteína quinasa Cdc7, Dbf4, proteína fosfatasa Cdcl4, Cdc45, y MCM10.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido objetivo es seleccionado del grupo consistente en Cdcd, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, y MCM7.

4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido objetivo es Cdcd.

5. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM2.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM3.

. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM .

8. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM5.

9. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM6.

10. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM7.

11. Un método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el método incluye el contacto de la muestra con un miembro de unión específico o miembros de unión específicos dirigidos contra un polipéptido objetivo y determinando la unión del miembro o miembros de unión específicos a la muestra.

12. Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque dicho miembro de unión específico o miembros de unión específicos son dirigido (s ) contra una pluralidad de dichos polipéptidos obj etivo .

13. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se evalúa una muestra de tejido.

14. Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la muestra de tejido es fresca o congelada. 5

15. Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la muestra de tejido no se encuentra fija en formalina ni incrustada en parafina. 10

16. Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la muestra de tejido no es sometida a una recuperación de antígeno ni a cocción a presión/autoclave. l:>

17. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque el tejido es seleccionado del pulmón, mamas, colon, próstata, estómago, piel, esófago y vejiga. 0

18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el tejido es tejido mamario.

19. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se evalúa una muestra de células.

20. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la muestra es provista de fluido tomado del individuo.

21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque una muestra de células se encuentra provista a partir de dicho fluido.

22. Un método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque el fluido es sangre.

23. Un método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque el fluido es orina.

24. Un método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque se practican exámenes de detección en una población de individuos .

25. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque los individuos son categorizados como que tienen tejido que es (i) normal o (ii) anormal incluyendo células neoplásicas o displásicas, potencialmente o realmente cancerosas o pre-cancerosas .

26. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque los tejidos o células de individuos que son categorizados como que tienen tejido anormal son sometidos a mayor investigación o análisis.

27. Un método para determinar la presencia o ausencia celular de proliferación anormal o anormalidad en el crecimiento celular en una muestra de un individuo, el método está caracterizado porque incluye poner en contacto una muestra con un miembro o miembros de unión específico dirigido contra un polipéptido objetivo, y determinador la unión del miembro o miembros de unión específico a la muestra en donde el polipéptido objetivo es un miembro del complejo de pre-inicio de replicación de ADN.

28. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la muestra es un frotis cervical.

29. Un método de conformidad con la reivindicación 27 ó 2°» caracterizado porque el polipéptido objetivo es seleccionado del grupo que consistente de Cdcd, MCM2, MCM3, MCM4 , MCM5, MCM6, MCM7, proteína quinasa Cdc7, Dbf4, proteína fosfatasa Cdcl4, Cdc45, y MCM10.

30. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el polipéptido objetivo es seleccionado del grupo consistente de Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, y MCM7.

31. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polipéptido objetivo es Cdc6.

32. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM2.

33. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado el polipéptido objetivo es MCM3.

34. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado el polipéptido objetivo es MCM4.

36. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado el polipéptido objetivo es MCM5.

36. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado el polipéptido objetivo es MCM6.

37. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado el polipéptido objetivo es MCM7.

38. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 38, caracterizado porque dicho miembro de unión específico o miembros de unión específicos son dirigido (s) contra una pluralidad de dichos polipéptidos objetivo.

39. Un método de conformidad con las reivindicaciones 27 a 38, caracterizado porque se practican exámenes de detección en una población de individuos .

40. Un método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque los individuos son categorizados como que tienen tejido que es (i) normal o (ii) anormal incluyendo células neoplásicas o displásicas, potencialmente o realmente cancerosas o pre-cancerosas.

41. Un método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque los tejidos o células de individuos que son categorizados como que tienen tejido anormal son sometidos a mayor investigación o análisis .

42. Un método para determinar la presencia o ausencia celular de proliferación anormal o anormalidad en el crecimiento celular en una muestra de un individuo, caracterizado porque el método incluye detectar un polipéptido objetivo, o la codificación mRNA de un polipéptido objetivo, en tejido, fluido o células de un individuo, en donde el polipéptido objetivo es un miembro del complejo de pre-inicio de replicación de ADN; con la salvedad que en donde el método sea llevado a cabo en una muestra retirada de un individuo y el polipéptido objetivo es MCM7 la muestra no es materia de recuperación de antígeno o cocción a presión/autoclave.

43. Un método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el tejido, fluido o células se encuentran en una muestra retirada de un individuo.

44. Un método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la muestra es de tej ido .

45. Un método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la muestra es fresca o congelada.

46. Un método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la muestra de tejido no se encuentra fija en formalina ni incrustada en parafina.

47. Un método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la muestra de tejido no es sometida a una recuperación de antígeno ni a cocción a presión/autoclave.

48. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 47, caracterizado porque se examina una población de individuos.

49. Un método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque los individuos son categorizados como que tienen tejido que es (i) normal o (ii) anormal incluyendo células neoplásicas o displásicas, potencialmente o realmente cancerosas o pre-cancerosas.

50. Un método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque los tejidos o células de los individuos que son categorizados como que tienen tejido anormal son sometidos a mayor investigación o análisis.

51. Un botiquín que incluye los componentes (i) e (ii) como sigue: (i) un miembro de unión específico o miembros de unión específicos dirigidos contra uno o más polipéptidos objetivo, caracterizado porque un polipéptido objetivo es un miembro del complejo de pre-inicio de replicación de ADN, y (ii) instrucciones para el uso del miembro o miembros de unión específico/s en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 48.

52. Un botiquín de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el polipéptido objetivo es seleccionado del grupo que consistente de Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, proteína quinasa Cdc7, Dbf4, proteína fosfatasa Cdcl4, Cdc45, y MCM10.

53. Un botiquín de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el polipéptido objetivo es seleccionado del grupo que consistente de Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, y MCM7.

54. Un botiquín de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polipéptido objetivo es Cdcd.

55. Un botiquín de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM2.

56. Un botiquín de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM3.

57. Un botiquín de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM4.

58. Un botiquín de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM5.

59. Un botiquín de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM6.

60. Un botiquín de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polipéptido objetivo es MCM7.

61. Un método de conformidad con las reivindicaciones 51 a 61, caracterizado porque dicho miembro de unión específico o miembro de unión específicos son dirigido (s) contra una pluralidad de dichos polipéptidos objetivo. DETERMINACIÓN DE ANORMALIDAD EN EL CRECIMIENTO CELULAR RESUMEN DE LA INVENCIÓN La determinación de anormalidad en el crecimiento celular, particularmente anormalidad cancerosa, mediante detección de polipéptidos objetivo o codificación de mRNA, en donde los polipéptidos objetivo son miembros del complejo de pre-inicio de la replicación de ADN en tejidos, células o fluidos. Los polipéptidos objetivo incluyen Cdc6, MCM2 , MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, y MCM7. Las muestras de prueba incluyen tejido de la cerviz (tanto biopsia como muestras de frotis), pecho, colon, pulmón, vejiga, piel, laringe, esófago, bronquio, nodulos linfáticos y tracto urinario (muestras de biopsia y de frotis citológico) , en la determinación de anormalidad en el crecimiento celular pre-canceroso y canceroso, y células extraídas de orina, sangre y suero, en la determinación de malignidades hematológicas y evidencia de sarcoma y carcinoma metastáticos .