JP2003240786A - 細胞の増殖異常 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 標的ポリペプチド又はコーディングmRNAの検
出による、細胞の増殖異常性、特に癌性異常の決定方法
の提供。 【解決手段】 上記標的ポリペプチドは、組織、細胞又
は流体における DNA複製のプレイニシェーション複合体
のメンバーである。標的ポリペプチドには、CDC6, MCM
2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6及びMCM7がある。テストサ
ンプルには、癌性及び前癌性の細胞の増殖異常の決定に
おける、頸部（バイオプシー及びスミアサンプルの両
方）、前胸部、直腸、肺、膀胱、皮膚、喉頭、食道、気
管支、リンパ節及び尿路（バイオプシー及び細胞学的ス
ミアサンプルの両方）、並びに血液学的悪性腫瘍の決定
並びに転移性肉腫及び癌腫の証拠における尿、血液及び
血清から遠心分離された細胞を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、細胞の増殖異常、特に潜在的に
（又は実際に）癌性の細胞を検出する点で、組織、細胞
又は流体のサンプル中の細胞の評価に関する。本発明の
態様は、頸部細胞が異常である女性を検出するためのそ
れら女性からの頸管スミアのようなサンプルをスクリー
ニングするのに特に役立つ。本発明は、本明細書で実験
的に示されるような、胸を含む他の組織サンプル中の細
胞の評価にも適用できる。異常であることが見い出され
たサンプルは、より詳細に検査することができ、その組
織中の細胞の条件を更に研究することができる。より広
範な診断手順の後に、悪性又は前悪性条件の同定の後
に、適切な処置を行うことができる。

【０００２】本発明は、 DNA複製のプレイニシェーショ
ン複合体の特定のタンパク質に対する特定の結合分子が
異常な細胞を検出するのに用いることができるという驚
くべき発見に基づく。本発明において特に有用なのは、
Cdc6に対する結合分子である。また、 MCMタンパク質、
特にMCM5に対する結合分子も特に役立つ。本明細書に含
まれる実験的証拠は、Cdc6に対する特定の結合分子、及
びMCM2, MCM3, MCM4,MCM5, MCM6又はMCM7に対するもの
は、PCNA及びKi67に対する抗体より、組織サンプル中の
細胞の増殖異常を選定することにおいて極めて有効であ
る。従来は、Cdc6及び MCMのものはKi67及びPCNAと同様
の結合となるであろうと予想したであろう。なぜならこ
れら全てのタンパク質は、“増殖マーカー”と考えるこ
とができるからである。抗原回復（加圧クッキング又は
オートクレーブ）にかけた頸部サンプルに基づいて、以
下の実験結果は実際に得られた結果はこれら全てについ
て同様であるが、頸管スミア及び凍結サンプルにおいて
明らかな差があることを示す。スクリーニング目的のた
めに一次的な関心があるこのようなサンプルは加圧クッ
キングにかけるのに十分に強固でない。スクリーニング
の点で特に関心があるのは、異常細胞の高レベルの染
色、及びLSILサンプルにおける十分に濃厚な染色を示
す、抗Cdc6又は抗 MCM結合分子を用いる頸部サンプルの
評価で得られた明らかな結果である。これは、頸部の上
皮表面からとったスミアサンプルの評価における有用性
を示しそして実際、これは本明細書において実験で確認
される。十分に濃厚な染色もHSILサンプルについて見ら
れる。

【０００３】胸組織、尿、血液及び血清の実験的評価
は、本発明の態様の一般性を確認する。更なる証拠は、
自動化することができる生化学的方法により、体液中の
形成異常又は新生物細胞の存在の検出における同じ抗体
の使用により供される、本明細書に示される例は、尿の
分析による膀胱癌の検出並びに血液の分析による白血病
及びリンパ腫の検出を含む。このような分析のための適
切な方法は、Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor
escence Immunoassay, "DELFIA" である。血液でDELFIA
による肉腫及び癌腫の場合の検出の証明も含まれる。

【０００４】頸部の上皮は、２つの明確な細胞型：各々
が解剖学的に組織のはっきりと識別される領域に位置し
た扁平上皮及び円柱上皮から本質的に構成される。扁平
上皮は頸部開口部（OS）の外部面（子宮頸外部（ectoce
rvix）に位置するが、円柱上皮は子宮頸外管（子宮頸内
部（endocervix）に広がる。これら２つの明確な上皮細
胞型は、扁平−円柱連結部において頸部のOSの近隣で接
触する。扁平−円柱連結部は、それが悪性腫瘍の大部分
が生じる領域であるので、臨床的に重要である。診断の
妥当性のために、頸管スミアサンプルは、この領域から
の細胞を含むべきである。これが達成されることを確実
にするために、スミアは、扁平及び円柱上皮細胞を含む
べきである。

【０００５】ほとんどの頸部腫瘍は、一定の再生下の多
層化動力学的幹細胞システムである扁平上皮から扁平−
円柱連結部において生ずる。その幹細胞の区画自体は、
基底細胞層内の基底膜に隣接して位置する。幹細胞分割
は、旁基底、中間、及び表面の細胞誘導を生じさせる。
これらは、扁平上皮内の特徴的な形態及び位置の点で、
慣用的に定義される。扁平上皮の最も深い層に位置した
基底細胞からの、その表面の表面細胞への移行は、頸部
表面における表面扁平上皮細胞が最終的に分化するま
で、進行的な分化及び増殖の喪失と関連する。形成異常
においては、細胞が扁平上皮に進行するので、細胞の分
化の減少に伴い、細胞の増殖の増加がある。典型的には
慣用的な最初の例としては、頸部のスクリーニングは、
上皮の表面からとったスミアの評価に関し、ここで細胞
病理学者は、形成異常の結果として、分化の減少の代表
である表面にある異常性を捜す。

【０００６】後期胎児期において、思春期において、及
び妊娠中において、円柱上皮は、化生の過程により、連
結部で扁平上皮に置き換わる。円柱上皮におきかわる化
生扁平上皮は特に発癌性物質に弱い。正常な化生は、扁
平上皮内で異常な異形成と混同すべきでなく、化生及び
形成異常細胞の間を区別することができることはスクリ
ーニングの情況において重要であり得る。

【０００７】徹底的かつ高価な国家的スクリーニングプ
ログラムにもかかわらず、頸部の癌は、UKにおいて女性
の８番目に最も一般的な悪性腫瘍であり、35歳未満の女
性では最も一般的な悪性腫瘍である（Cancer Research
Campaign, Cancer of the Cervix Uteri, 1994, CRC: L
ondon)。発展中の世界において、それは、35〜45歳の年
齢の女性における最も一般的な悪性腫瘍及び死を引きお
こす原因であり、毎年、 437,000の新しいケースがある
と見積もられている（Cancer Research Campaign, Canc
er-world perspectives, 1995, CRC: London) 。

【０００８】大部分の場合は扁平細胞癌(SCC) であり、
16, 18及び31のようなヒトパピローマウイルスの‘危険
性の高い’型での感染と強く関連している（Parkら、Ca
ncer, 1995, 76 (10 Suppl.): p.1902〜13）。頸部癌
は、それが十分に規定された非侵入的‘上皮内’段階を
通して発達するので、集団スクリーニングによる予防に
敏感である（Wrightら、Precancerous lesions of the
cervix, in Blaustein'sphathology of the female gen
ital tract . R.J.Kurman, Editor. 1994, Springer-Ve
rlag: New York. p.229〜78) 。扁平上皮内異常は、３
層(CIN) 又は２層（Bethesda）システムを用いて分類す
ることができる。異なる組織学的異常性は、感染性 HPV
の型と、及びその障害の DNA倍数性、クローン数及び自
然の変遷と広範囲で相関する。Bethesdaシステムにより
分類されるように、CIN1及び頸部 HPV感染（HPVI）に対
応する低グレード扁平上皮内障害（LSIL）は、侵入性の
病気への進行の比較的低い危険性の生産性の HPV感染を
一般に示す（Wright及びKurman. A critical review of
the morphological classification systems of prein
vasive lesions of the cervix: the scientific basis
for shifting the paradigm, in Papillomavirus revi
ews: current research on papillomaviruses,C.Lacey,
Editor. 1996, Leeds University Press: Leeds)。CIN
2及びCIN3に対応する高グレード扁平上皮内障害（HSI
L）は、CIN1（LSIL）より進行の危険が高いことを示
し、両方とも悪性腫瘍の潜在的な前験体であるとみられ
ている。上皮内障害の各々のカテゴリーについて悪性腫
瘍の適当な危険性を評価することが可能であるが、個々
のケースについての進行の適切な可能性を決定すること
は現在、可能でない。

【０００９】1943年に、 Papanicolau及び Troutは、女
性において頸部癌の前駆体を検出するために Papスミア
−テストを導入した。これは、細胞学的スクリーニング
テストであり、おそらく、癌の予防のために導入された
最も成功した公衆の健康の測定であると判明した。女性
が３〜５年毎に少くとも１回、頸部スミア−テストを行
う大規模スクリーニングプログラムは、頸部癌死亡率及
び罹患率を減少させることにおいていくつかの国におい
て極めて有効であると判明している。例えば、ブリティ
ッシュコロンビア及びフィンランドにおいて、組織化し
たスクリーニングは、頸部癌による死亡率を70％だけ減
少させた。早期に検出されれば、頸部癌は容易に治療さ
れる。

【００１０】これらの功績にかかわらず、全世界の状況
の現実は低調である。例年、頸部癌を発達させた何千人
の女性のうちの何百人のうち、50％超がその病気で死ぬ
であろう。このような女性の全ての75％は、開発途上国
の人であろう。ここでは、財政的制約のため、利用でき
る方法を用いる大規模スクリーニングプログラムが実行
できない。多くの先進国においてでさえ、過去10年、そ
の病気の減少は微細なものであり、細胞学的スクリーニ
ングのインパクトは予想よりかなり少なかった。更に、
専門家は、定期的にスクリーニングされる患者、特に若
い女性における侵入的頸部癌のケースの実質的な割合を
観察している。

【００１１】細胞学的スクリーニングが頸部癌を検出す
るのに時々失敗する主な理由は、テスト間の間隔の大き
さ及び多数の誤ったネガティブな結果（10〜30％）であ
る（Pap Cytology screening: Most of the benefits r
eaped ? WHO 及び EUROGINが頸部癌抑制についての報告
を公開する。 Press Release WHO／25, 1997年３月）。

【００１２】多数の誤ったネガティブな結果は、 Papス
ミアの解釈は、形態学的運動の最も困難なものの１つで
ある。 Papスミアの結果は、スミア上の混合した細胞集
団の複雑さ及び多様性並びに頸部でおこる広範囲の炎症
及び修復過程のため、細針吸引、体液細胞学テスト又は
バイオプシーより解釈するのが難しい。細胞集団内での
周期的変化、妊娠誘導性変化及び閉経後期間におこる変
化もある。婦人科学的細胞学は極めて難しいので、細胞
技術者のためのトレーニング期間は長く；それらは訓練
された研究生及び高程度の訓練並びにパターン認識技術
を要求する。適切なトレーニングプログラムを完了した
後でさえ、細胞技術者は、 Papスミアの結果が正常であ
るか異常であるかのような矛盾のない正確な判断をする
ことができる前に数年間の実際の経験を必要とする。同
様に、病理学者は組織学的断片と解釈するために訓練さ
れ得るが、彼らは、細胞学研究室を組織化し、管理する
ため及び異常なスミアに関する適切な診断を行うために
適切な技術を有するために細胞病理学的における特別の
更なるトレーニングを必要とする。

【００１３】Papスクリーニングプログラムに関連する
２つの主な問題は、見掛け上避けることができない誤っ
たネガティブな比率（10〜30％）及び比較的高いコスト
のスクリーニングである。それゆえ、頸部スクリーニン
グに対してかわりのアプローチが現在考えられている。
２つの最も一般的に議論される提案は、一次スクリーニ
ングモダリティーとして又は Papスミアへの補給として
HPV DNAテスト及び検査を用いること、並びに慣用的に
採取した Papスミアを自動的にスクリーニングすること
ができる装置を用い、これにより比較的高給の細胞技術
者及び細胞病理学者の必要性を減少させることである
（Richart, Cancer Supplement, 1995, 76(10): 1919〜
1927; Birdsong, Human Pathology, 1996, 27 (5): 468
〜481)。

【００１４】前者の方法には問題がある。 HPVのための
イン・シトウ法を用いる感度及びポジティブな予想値の
問題である。 HPV DNA検出のための PCRの使用は一般的
集団において HPV感染の高い割合を示し、 HPV DNAテス
トは臨床的スクリーニングのために問題となり得る使用
のものと思われる。

【００１５】第２のアプローチは自動化に関する。いく
つかの会社が現在、スクリーニング装置を開発し、市販
している。一般に、このような装置は、像を捕獲するた
めに高分解能ビデオスキャナーを用い、次にそれはデジ
タル化され、一連のアルゴリズムで分析され、次にその
データはその機械が正常及び異常細胞構成物の間を区別
するよう仕込まれているインターフェアレンスネットワ
ークにかけられる。更なるソフトウェア及びハードウェ
アの開発、自動化されたスクリーニングが一次的スクリ
ーニングのために考えられることが希望されており、現
在、US FDAにより Papスミアのプレスクリーニング又は
独立したスクリーニングのために認可されている装置は
ない。これらの会社は、慣用的な PAPスミアテストがこ
れらの問題の難しさ及び解決のための心からの必要性を
示す問題を克服するための試みにおいてこのような高価
かつ複雑なアプローチにおいて極めてきびしく投資する
覚悟をする。

【００１６】細胞増殖マーカーの評価は、以前はこのよ
うな解決法のいずれかを供し、当該分野の専門家は、増
殖マーカーが有用な臨床的情報を供するであろうことに
懐疑的である（Hall及び Coates, Histopathology, 199
5, 26: 105〜112)。細胞増殖の測定パラメータは腫瘍に
ついての客観的情報を供するであろうと信じられるが、
多数の研究にかかわらず、PCNA, Ki67等のような細胞増
殖マーカーの使用は実際に、最適に用いられる組織学的
評価に対する改良があることの直接的証拠はほとんどな
い、標準化された組織病理学的等級付け及び段階化と比
較した増殖マーカーの相対値の重要な問題に着目した研
究はほとんどない。

【００１７】自動化スクリーニングと共に免疫細胞化学
的又は免疫蛍光染色を用いる試みは、正常な細胞の非特
異的染色により限定されている。例えば、上皮膜抗原(E
MA)は、 CINで頸部からの新生物細胞を染色することが
示されているが、正常な頸部からのいくつかの化生細胞
の染色も報告された。それゆえ、免疫組織学的染色を測
定するための技術は利用できるが、現在、免疫組織化学
を用いる市販の又は進歩のある自動化スクリーニングの
装置はない。

【００１８】最も広く研究されている増殖のマーカー
は、未知の機能のタンパク質であるKi67及びPCNA（増殖
性細胞核抗原）である（Yu及びFilipe, Histochemical
Journal, 1993, 25: 843〜853)。PCNAは、 DNA複製の延
長及び DNA修復のメカニズムに関連する。それゆえ、そ
れは複製又は修復による実際の DNA合成の間に存在す
る。本発明者らは、 DNA複製の初期の開始段階に関連す
るタンパク質を研究した。これらは、Cdc6及びMCM2〜７
のファミリーのタンパク質（MCM2, MCM3, MCM4, MCM5,
MCM6及びMCM7）である。Williamsら (1997)(Proc.Natl.
Acad.Sci. USA, 1997, 94: 142〜147)は、培養中のヒト
HeLa細胞が、増殖中の細胞サイクルを通してCdc6を発現
するが、WI38ヒト二倍体繊維芽細胞は血清飢餓により静
止させた時にCdc6の発現を停止することを報告した。こ
れらの観察結果は他の細胞系及び他の種に広げられるこ
とがここで示される。 MCMはＧ１期の核(DNA合成の前）
に存在し、進行的に、 DNA合成の間、クロマチンから可
溶性核質におきかえられる。それらも静止の間、クロマ
チンから欠如していることがここで示される。MCM5が、
子宮頸及び胸の分化した細胞から欠如していることもこ
こで示されている。

【００１９】これらの背景技術から、 MCM又はCdc6抗血
清は、PCNA又はKi67の分布に似ていると予想されよう。
この予想についての更なる証拠は、いくつかのヒト組織
及び３つの型のヒト腫瘍においてPCNA及びMCM7（hCDC4
7）についての類似した免疫染色パターンを見い出した
Hiraiwaら（Int. J.Cancer, 1997, 74: 180〜184)から
もある。しかしながら、驚くことに、本発明者らは、PC
NA及びKi67と比較して MCM及びCDc6の潜在的な診断値に
おいて劇的な差があることを見い出した。

【００２０】本発明者は、頸部細胞学についてヒト MCM
タンパク質及びヒトCdc6に対して生じた抗血清をテスト
した。彼らは、正常な及び病気のヒト子宮頸及び頸管ス
ミアの断片を研究した。彼らは、PCNA及びKi67を用いて
得られたものでの結果を比較した。Cdc6抗体又はMCM(例
えばMCM5）抗体は、PCNA又はKi67に対する抗体より有効
に頸部においてLSIL（HPVI／CIN1）障害を検出する。更
に、本質的に全てのLSIL（HPVI／CIN1）又はHSIL (CIN2
13) 障害の細胞が染色される。これは、PCNAのような他
の増殖マーカーによる染色と対照的である。それは、 D
NA複製のプレイニシェーション複合体のタンパク質、特
にCdc6又は MCMタンパク質（例えば、MCM5、しかし、本
明細書において、MCM2, MCM3, MCM4, MCM6及びMCM7につ
いても例示される）に対する特異的結合分子は異型性又
は新生物の細胞の早期検出のための例外的な診断価値を
有することを示す。抗原回復（加圧クッキング又はオー
トクレーブ）にかけた頸部サンプルに基づいて、これら
のサンプルはホルマリンで固定され、パラフィンに浸さ
れ、抗Cdc6及び抗 MCM抗体はPCNAで得られたものと同様
の染色のパターンを供するが、スミア、新しい及び凍結
したサンプルでの優れた結果は明らかである。

【００２１】これにより、本発明は、広くは、個体の組
織、流体又は細胞中の、通常は体から除去したサンプル
中の、特定の標的ポリペプチド、又は標的ポリペプチド
をコードするmRNAを検出するための方法及び手段の種々
の態様に関する。

【００２２】本発明の標的ポリペプチド、例えばCdc6及
び MCMタンパク質、例えばMCM5は、DNA複製のプレイニ
シェーション複合体内に含まれることにより本発明に有
用でない他の細胞増幅マーカーから区別され得る。それ
らは、静止及び分化の間にクロマチンにより置換される
ことにより区別され得る。例えば、本発明に用いるため
の標的でないORC2(Gavinら、 1995, Science 270, 1667
〜1671）は、静止細胞中のクロマチンに結合し続けるこ
とにより、Cdc6及びMCM5のようなタンパク質から区別さ
れ得る。 ORC複合体の他の成分、例えばOrc1は異なる挙
動をするが、Orc2は静止細胞中で下降制御されない。Cd
c6は静止及び分化の間、迅速に下降制御される。48時間
程度Ｇ０に止まった培養細胞はいずれの検出可能なCdc6
タンパク質も含まない。Cdc6は、より長期間、試験管内
で束縛された細胞中で、又は生体外で分化した細胞中で
検出できない。

【００２３】血清飢餓又は接触阻害により試験管内に束
縛された細胞は、細胞中の MCMの全レベルは少くとも14
日間、はっきりと減少しないが、（数日後に）クロマチ
ンに結合した MCMを失った。試験管内で分化を行う細胞
（例えばDMSO又は TPAで分化するよう誘導された HL-60
細胞）は、MCM3を下降制御するが、Orc2はしない（Musa
hl, Aussois Meeting on DNA Replication, Aussois, F
rance, June 1997) 。生体外組織からの分化した細胞
は、MCM2及びMCM5のような MCMタンパク質を発現しな
い。多重タンパク質からの６つの MCMタンパク質MCM2〜
MCM7は、２つのサブグループ：MCM3及びMCM5ダイマー；
MCM2-4-6-7テトラマーに分けられる。MCM3及びMCM5は、
MCM2-4-6-7よりＳ期においてゆっくりとクロマチンから
はなれ得る（Kubotaら、1997, EMBO J. 16, 3320〜333
1)。 MCMはＧ１期にクロマチンに結合しており、Ｓ期及
び核の間に置換されるが、Ｇ２期においてクロマチンに
結合しない。Cdc6は、クロマチンからの置換に加えて、
分解もされてタンパク質レベルがＧ１／Ｓ遷移において
劇的に下降するが、イーストにおいて同様な挙動をす
る。 DNA複製のプレイニシェーション複合体の更なる構
成物が本発明により含まれ得る。例えば、イースト構成
物のヒト相同体、例えばCdc7プロテインキナーゼ(Chapm
an及びJohnston, Exp.Cell Res., 1989, 180 419-428(y
east), Saoら., 1997, EMBO J., 16, 4340-4351(human-
down-regulated in quiescence)), Dbf4, Cdc7プロテイ
ンキナーゼの調節サブユニット(Jacksonら., 1993, Mo
l.Cell Biol.13 2899-2908(yeast), Masaiら., Cold Sp
ring Harbor Meeting on EukaryoticDNA Replication,
3-7 September 1997 (human))、 Cdc14プロテインホス
ファターゼ(Hogan及びKoshland PNAS USA, 1992, 89, 3
098-3102 (yeast)) 、 MCMに似た表現型と関連し、それ
を有するCdc45 (Zouら., Mol.Cell.Biol., 1997, 17, 5
53-563 (yeast), Takisawaら., Cold Spring Harbor Me
eting On Eukaryotic DNA Replication, 3-7 September
1997(Xenopus)) 、 MCMと似た表現型と関連し、それを
有するMCM10(Merchantら., 1997, Mol.Cell Biol. 17 3
261-3271) である。本発明の標的ポリペプチドは、 DNA
プレ複製複合体の構成物、細胞サイクル当りに１回、 D
NA複製を制限することに関連する複製コンピテントクロ
マチンの構成物、クロマチンの１回の DNA複製を許可す
ることに関連し、 DNA複製の開始前に、複製源において
アセンブルする複製ライセンスの構成物と多方向に呼ば
れる。

【００２４】ヒトCdc6アミノ酸配列は、Williamsら.,
(1997, PNAS USA 94: 142-147, GenBank Acc. No.U7794
9) に開示される。ヒトMCM2配列は、 Todorovら., (199
4, J.Cell Sci., 107, 253-265, GenBankAcc. No.X6733
4)に開示される。ヒトMCM3配列は、 Thommesら(1992, N
ucl.Acid Res., 20, 1069-1074, GenBank Acc. No.P252
05) に開示される。ヒトMCM4配列は、Ishimiら., (199
6, J.Biol.Chem., 271, 24115-24122, GenBank Acc. N
o.X74794) に開示される。ヒトMCM5配列は、Huら(1993,
Nucleic Acids Res., 21, 5289-5293, GenBankAcc. N
o.X74795) に開示される。ヒトMCM6配列は、Holthoffら
(1996, Genomics, 37, 131-134, GenBank Acc. No.U468
38) に開示される。ヒトMCM7配列は、Huら(1993, Nucle
ic Acids Res., 21, 5289-5293) に開示される。

【００２５】本発明の一態様によれば、個体からのサン
プル中の異常に増殖する細胞又は細胞増殖異常性の存在
又は欠如を決定する方法であって、議論されるように、
サンプルを、標的ポリペプチドに対する特異的結合メン
バーに接触させ、そして該サンプルに対する前記特異的
結合メンバーの結合を決定することを含む方法を供す
る。

【００２６】本発明の他の態様は、（ｉ）正常であるか
又は（ii）潜在的にもしくは実際に前癌性もしくは癌性
の、異形成もしくは新形成であるとして組織を類別する
方法であって、議論されるように、標的ポリペプチドに
対する特異的結合メンバーの組織のサンプルへの結合を
決定することを含む方法を供する。結合のパターン又は
程度は、周知の正常のサンプル及び／又は周知の異常な
サンプルについてのものと比較することができる。

【００２７】ヒトCdc6は、本明細書に記載されるよう
に、本発明者らにより独立してクローン化されたが、そ
のクローニングの最初の発表は、 Williamらによるもの
であった。その論文（PNAS USA 94: 142〜147, 1997)は
全体のアミノ酸配列を供する。本明細書に実験的に証明
されるように、抗Cdc6結合分子は種々の組織、特に頸部
サンプル、好ましくはスミアにおいて異常性をマークす
ることにおいて極めて有効である。

【００２８】ヒトMCM5についてのアミノ酸配列は、Huら
(1993, Nucleic Acids Res., 21,5289〜5293, GenBank
Acc. No.X74795) に開示される。ここに含まれる実験
的証拠は、Cdc6のようなそれに対する結合分子が、種々
の組織、特に頸部サンプル、好ましくはスミアにおいて
異常性をマークすることにおいて極めて有効であること
を示す。MCM5に対する高アフィニティー抗体を得ること
は、より高い抗原性を反映し得るCdc6についてより容易
であるようである。

【００２９】ここに含まれる更なる実験的証拠は、MCM2
に対する、MCM3に対する、MCM4に対する、MCM6に対する
又はMCM7に対する結合分子も、頸管スミアのような組織
サンプルにおいて異常性をマークするのに有効であるこ
とを示す。抗MCM5抗体は、全体及び細胞の数の両方にお
いて抗MCM2及び抗MCM7より強力な染色パターンを供する
ことが見い出されている。抗CDC6抗体は、抗MCM5と似た
染色パターンを供することが見い出されている。

【００３０】これにより、（例えば）抗Cdc6又は抗 MCM
特異的結合メンバーの、サンプルへの結合は、異常な、
潜在的にもしくは実際に前癌性もしくは癌性の、異形成
もしくは新形成であるとしてそれからサンプルが得られ
る組織を類別することを供する。 Papテストを用いて陽
性の結果を得ることに基づく本実施に従って、陽性でテ
ストされた個体は、例えばバイオプシーテスト及び／又
はくり返しのスクリーニングにより更に研究することが
できる。前癌潜在性は実際に癌性の状態を生じないこと
は極めて一般的である。必要に応じて適切な及び時を得
た治療による介入を許容するために、形成異常の進行又
は退縮を追跡するために６ケ月に１回のスクリーニング
が典型的に用いられる。

【００３１】組織が、本発明により、組織中の検出され
た異常性に基づいて、潜在的に又は実際に前癌性又は癌
性であるとして類別されるなら、適切な診断及び／又は
臨床的追跡調査が要求されよう。本発明は、必要な前癌
又は癌である細胞増殖異常の検出に限られないことに注
目することができる。他の細胞の増殖の疾患は、以下の
実験例により示されるように、検出することができる。
これらには、乾癬（例えば以下の実施例24を参照のこ
と）及び炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎及びクロー
ン病（実施例33及び34）である。独立して細胞増殖異常
であることに加えて、炎症性腸疾患は、全の患者ではな
いが、癌状態への前駆体であり得、従って、本発明によ
るそれらの検出は、より密接なフォローアップのための
価値ある結果を供するのに用いることができる。炎症性
腸疾患において、便のサンプル及びこのようなサンプル
からの細胞の調製物で分析が行われるのを許容する結腸
及び腸の細胞の脱落がある。以下の実施例32は、便から
細胞を回収することにより調製された便スミアの染色を
記述する。

【００３２】本発明は、更なる分析の前にサンプルをプ
レスクリーニングするのに用いることができる。本発明
は、 Papスミアテスト又はThin Prep 2000テストのよう
な利用できる技術を用いて以前にテストされたサンプル
のスクリーニング又は分析のために本発明を用いること
ができる。以下の実験は、 Pap染色分析及び適切な抗体
を用いる本発明による分析を同じ調製物で行うことがで
きることも示す。これにより、頸管スミアは、例えば、
慣用的な Papスミアテスト及び本発明によるテストの両
方を用いてテストすることができる。

【００３３】本発明の更なる態様は、組織サンプル内の
異常細胞をマークする方法であって、サンプルを、議論
されるような、Cdc6, MCM5又は他の MCMのような標的ポ
リペプチドに対する特異的結合メンバーに、該特異的結
合メンバーが異常に増殖する細胞に結合し、正常な細胞
に結合しない条件下で接触させることを含む方法を供す
る。特異的結合メンバーがサンプルに結合するか否か
は、サンプル内で異常に増殖する細胞の存在を確認する
ために決定することができる。更なる態様において、本
発明は、組織又はそのサンプル中の、異常細胞増殖、細
胞増殖異常、形成異常、新形成、又は潜在的にもしくは
実際に前癌性もしくは癌性の状態の存在又は異常を決
定、評価又は診断するための、議論されるような、標的
ポリペプチドに対する特異的結合メンバーの使用を供す
る。

【００３４】特異的結合分子は、本発明による使用のた
めの説明書を含み得るキットにおいて供され得る。この
ようなキットは、本発明の更なる態様として供される。
１又は複数の他の試薬、例えば標識化分子等（以下参
照）を含めることができる。試薬は、外部環境からそれ
らを保護する容器、例えば密閉バイアル内に供され得
る。キットは、関心の組織によりテストサンプル自体を
供するための１又は複数の部品、例えば口腔から細胞を
除去するための綿棒、血液サンプルを除去するためのシ
リンジ、頸管スミアをとるためのスパチュラ、バイオプ
シーガン等（これらの部品は一般に滅菌される）を含み
得る。キットは、非特異的染色を減少させるためのブロ
ッキング剤、貯蔵の間、結合する分子の活性を保護する
ための保存緩衝液、抗体染色の間に用いるべき染色液及
び／又は洗浄液、陽性対照、陰性対照等のいずれかの組
合せ又は全てを含み得る。陽性及び陰性対照は、本発明
により用いられ、キットにおいて供され得る試薬の活性
及び正確な利用性を確認するのに用いることができる。
対照には、標的、例えばCdc6又はMCM5の存在について陽
性であるか陰性であるか知られている、組織断片、カバ
ースリップ上に固定された細胞のようなサンプルを含み
得る。対照のデザイン及び使用は標準的であり、当業者
の慣用的な能力内で十分である。

【００３５】サンプルは、いずれかの慣用的な手段及び
技術を用いて体から除去することができる。頸部スクリ
ーニングのために、標準スミアサンプルを用いることが
できる。あるいは、Thin Prep 2000技術（Cytec Corp,
Boxborough, Mass., USA) を用いることができる。これ
は、 Papスミア調製物の慣用的な方法の代わりとしてUS
FPAにより明らかにされている。サンプルは、細胞をガ
ラススライドに塗るかわりに液体媒体中に収集される。
自動化プロセッサー（Thin Prep 2000装置）が、後に、
その液体から細胞を収集するのに用いられ、そしてそれ
らを、分析のためにガラススライド上の薄層内におく。
スパチュラ又は綿棒を、内皮細胞、例えば頸部又は口腔
からのものを除去するのに用いることができる。血液及
び他の流体サンプルは、シリンジ及び針を用いて除去す
ることができる。他の組織サンプルは、バイオプシー又
は組織断片により除去することができる。

【００３６】好ましい実施形態において、サンプルは、
抗原回復又は加圧クッキング／オートクレーブにかけら
れない。抗原回復は当該技術において標準的であり、当
業者に公知である。 Hiraiwaらは、典型的なアプローチ
を供するShinら(1991)(Lab.Invest. 64, 693〜702)に言
及する。サンプルは新鮮であっても凍結したものでもよ
いが、一般には、ホルマリンで固定され又はパラフィン
に浸されない。議論されるように、特に好ましい実施形
態において、サンプルは頸管スミアである。頸管スミア
は加圧クッキングにかけるのに十分に強くない。更に、
抗原回復処理は、一般に、高スループットが要求される
スクリーニングの助けとならない。

【００３７】本明細書に含まれる本発明の態様の実験例
は、頸管スミアを含む頸部、胸、尿路悪性腫瘍（バイオ
プシー組織サンプル及び尿細胞学スミアの両方でテスト
したもの）、結腸、肺、膀胱、皮膚、喉頭、食道、気管
支、リンパ節、及び血液学的悪性腫瘍、また、転移性肉
腫及び癌腫の証拠のための血液及び血清への適用可能性
を証明する。本発明は、頸部腺性上皮細胞の前悪性異常
（腺性上皮内新形成、GIN)又は他の組織における前悪性
異常の評価に更に用いることができる。それは、新生物
細胞の検出又は反応性の変化を示す細胞からのそれらの
区別が極めて難しい他の臨床試料の細胞学的又は生化学
的評価に用いるために特に適切であり得る。このような
試料は、唾液、気管支−歯槽洗浄試料、尿及び消化管
（食道、胃及び膵臓、胆管及び膵臓管を含む）からのふ
きとり物を含む。本発明は、増殖の評価がより正確な臨
床結果の予測、及び／又はより合理的な治療の選択を可
能にし得る組織の組織学的又は生物学的評価に適用する
ことができる。試料は、腺細胞（例えば、肺、胸、結
腸、前立腺、胃）、扁平上皮細胞（例えば肺、皮膚、食
道）又は他の上皮細胞型（例えば膀胱、尿管、腎臓、卵
巣）の悪性腫瘍を含み得る。

【００３８】所定範囲の乳癌でテストした、抗Cdc6抗体
並びに種々の抗MCM2、抗MCM3、抗MCM4、抗MCM5、抗MCM6
及び抗MCM7抗体を含む抗 MCM抗体で、以下に記載される
実験において観察された高い程度の特異性は、乳癌の診
断のための免疫細胞学的及び生化学的アプローチを供す
る。これらは、胸バイオプシーもしくは細い針での吸引
(FNA) 試料又は乳管からの流体のサンプリングに適用す
ることができ、これらは、スクリーニングプログラムに
おける使用を許容する。

【００３９】本発明の種々の態様に従って結合メンバー
に接触させられるサンプルは、本発明の異なる実施形態
に従って、特異的結合分子の標的ポリペプチド、例えば
議論されるようなCdc5, MCM5又は他の MCMへの結合、核
酸レベルの決定、酵素活性等を許容するいずれかの利用
できる技術を用いて調製することができる。種々の技
術、例えば Papテストのために細胞を固定するのに用い
られるような（標的ポリペプチドに結合する抗体のよう
な分子のためのもの）は当該技術分野において標準的で
ある。

【００４０】抗体のような結合メンバーの、正常な及び
テストサンプルの反応性は、いずれかの適切な手段によ
り決定することができる。個々のリポーター分子での標
識化は１つの可能性である。そのリポーター分子は、直
接的に又は間接的に、検出可能な、好ましくは測定可能
なシグナルを作り出すことができる。リポーター分子の
連結は、直接又は間接的に、共有結合、例えばペプチド
結合又は非共有結合であり得る。ペプチド結合による連
結は、結合分子（例えば抗体）及びリポーター分子をコ
ードする遺伝子様式の組換え発現の結果としてであり得
る。

【００４１】１つの好ましい態様は、分光的に単離され
た吸光又は発光特性を有する個々の発蛍光団、リン光体
又はレーザー染料との、各々の結合メンバーの共有結合
による。適切な発蛍光団は、フルオレセイン、ロダミ
ン、フィコエリトリン及びテキサスレッドを含む。適切
な色原染料は、ジアミノベンジジンを含む。

【００４２】他のリポーターは、高分子コロイド状粒子
又は粒子状材料、例えば色のついた、磁性もしくは常磁
性のラテックスビーズ、検出可能なシグナルを直接的又
は間接的に視覚的に観察できる、電気的に検出でき、そ
の他記録できる生物学的もしくは化学的に活性な剤を含
む。これらの分子は、例えば、色を展開しもしくは変化
させ又は電気特性を変化させる反応を触媒する酵素であ
り得る。それらは、エネルギー状態間の電気転移が特徴
的なスペクトル吸光又は発光を生ずるように、分子的に
励起可能であり得る。それらは、バイオセンサーと共に
用いられる化学的なものを含み得る。ビオチン／アビジ
ン又はビオチン／ストレプトアビジン及びアルカリホス
ファターゼ検出システムを用いることができる。更なる
例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及び化学ルミネ
センスである。

【００４３】結合を決定する態様は本発明の特徴ではな
く、当業者は、彼らの好み及び一般的な知識に従って、
適切な態様を選択することができる。

【００４４】以下の実験において、セイヨウワサビペル
オキシダーゼを用いた。アルカリホスファターゼを用い
て更なる実験を行い、同様の結果を得た（例えば頸管ス
ミア）。アルカリホスファターゼは、セイヨウワサビペ
ルオキシダーゼより感度の高い検出システムであるが、
その展開された色は PAP染色との適合性が低い。

【００４５】本発明の実施形態に用いた頸管スミアの抗
体染色のためのプロトコルは以下の通りである。

【００４６】１．６つの新鮮なスミアを、50：50アセト
ン・メタノール中に５分、浸す。（スミアを以前に"Cyt
ofix" で固定する代わりの出発点−スクリーニング中心
への安全な輸送を許容するよう取った時にスミアサンプ
ルを処理するためにUKにおいて標準的に用いられるアル
コール及びワックス処理は、10分間、メチル化有機溶剤
に浸漬することにより Cytofixを除去することである。
スミアをいずれかの他の保護層で覆うなら、サンプルを
抗体染色にさらすためにいずれかの適切な処理を用いる
ことができる。）

【００４７】２．５分間、トリス緩衝塩類溶液(TBS) で
洗う。 ３．15分間、 TBS中４mMデオキシコール酸ナトリウム中
に浸透させるように洗う。 ４．５分間、 TBS＋ 0.3％ Triton X100で洗う。 ５．ステップ４をくり返す。 ６．５分間、 TBS＋ 0.025％ Triton X100で洗う。

【００４８】７．組織を乾燥させることなく、過剰な液
体を排出する。 ８．加湿チャンバー内にスライドを移し、各々のスライ
ド上に、最少で２時間（又は一晩）、 TBS中10％ヤギ血
清試薬 200マイクロリッターをおく。 ９．組織を乾燥させることなく、過剰な液体を排出す
る。

【００４９】10． 0.1％ Triton 及び１％ BSAを含む T
BS中に希釈した一次抗体 200ミリリッターを各々のスラ
イド上におき、オービタルシェーカー上で４℃で一晩、
放置する。 11．スライドをラックに移し、５分、 TBS＋ 0.3％ Tri
ton X100中で洗う。 12． TBS＋ 0.025％ Triton X100中で５分、洗う。 13．ステップ12をくり返す。 14．組織を乾燥させることなく、過剰な液体を排出す
る。

【００５０】15．スライドを、加湿チャンバーに移し、
各々のスライド上に、１％ BSAを含む TBS中１：500 で
ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体（Dako)200マイクロリ
ッターを２時間、おく。 16．スライドを二次抗体内に入れ、SABC溶液を作る。 17．スライドをラックに移し、 TBS中で５分、洗う。 18．スライドを、 0.6％過酸化水素と共に、内因性ペル
オキシダーゼブロッキング剤に10分、入れる。 19． TBSで５分、洗う。

【００５１】20．ステップ19を２回、くり返す。 21．スライドを加湿チャンバーに移し、各々のスライド
上に、 200マイクロリッターのSABC溶液を、30分、お
く。 22．スライドをラックに移し、 TBS中で５分、洗う。 23．ステップ22をくり返す。 24．10分、 DAB溶液中に展開する。

【００５２】25．５分、水道水で洗う。 26．６秒、Harrisヘマトキシリン溶液にスライドを入れ
る。 27．１分、水道水で洗う。 28．１〜２秒、 0.5％塩酸中で区別化する。 29．５分、水道水で洗う。

【００５３】30．２分、50％メタノールをそそぐ。 31．２分、70％メタノールをそそぐ。 32．２分、90％メタノールをそそぐ。 33．２分、 100％メタノールをそそぐ。 34．２分、Orange G作業液に入れる。

【００５４】35．７秒、 100％メタノールをそそぎ、静
かに撹拌する。 36．ステップ35をくり返す。 37．２分、EA50溶液に入れる。 38．７秒、 100％メタノールをそそぎ、静かに撹拌す
る。 39．ステップ38をくり返す。

【００５５】40．５分、キシレンにスライドを入れて透
明にする。 41．ステップ40を２回、くり返す。 42． DEPEXマウンタントを用いてカバーガラスを適用す
る。

【００５６】免疫蛍光のためのスミアは、同様に調製す
ることができる（そしてできている）。二次抗体の後、
それらを、１時間、ストレプトアビジンFITC接合抗体中
でインキュベートし、ヨウ化プロピジウム／RNAseA（両
方とも Sigma、50ng／ml）で、 DNAについて対比染色
し、次にグリセロール／PBS ／フェニレンジアミン中に
マウントした。

【００５７】本発明の態様に用いるための好ましい結合
分子には、抗体、標的のための天然のリガンド、標的上
の１又は複数のエピトープを標的にする小分子及びＴ細
胞レセプター結合ドメインがある。

【００５８】関心の標的に特異的である抗体、例えばCd
c6, MCM5又は他の MCMは、当該技術で標準的である技術
を用いて得ることができる。抗体を生産する方法は、哺
乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、サル又はトリ、例えばニワトリ）を、タンパク
質もしくはそのフラグメント又はタンパク質もしくはフ
ラグメントを発現する細胞もしくはウイルスで免疫化す
ることを含む標的ポリペプチドをコードする DNAでの免
疫化も可能である。抗体は、当該技術で周知の種々の技
術のいずれかを用いて、免疫化された動物から得ること
ができ、そして、好ましくは関心の抗原への抗体の結合
を用いて、スクリーニングすることができる。例えば、
ウエスタン・ブロッティング技術は免疫沈降法を用いる
ことができる（Armitageら、1992, Nature 357: 80〜8
2) 。

【００５９】モノクローナル抗体の生産は当該技術で十
分に確立されている。モノクローナル抗体は、組換え D
NA技術にかけて、もとの抗体の特異性を保持する他の抗
体又はキメラ分子を作ることができる。このような技術
は、抗体のイムノグロブリン可変領域又は相補性決定領
域(CDR) をコードする DNAを、異なるイムノグロブリン
の定常領域又は定常領域＋骨格領域に導入することに関
連し得る。例えば、 EP 184187A, GB 2188638A又はEP-A
-0239400を参照のこと。モノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマは、生産される抗体の結合特異性を変え
ても変えなくてもよい遺伝子変異又は他の変化にかける
ことができる。

【００６０】ペプチドで哺乳動物を免疫化するためのか
わりとして又はその補助として、標的に特異的な抗体
を、例えばそれらの表面上に機能的イムノグロブリン結
合ドメインを提示するラムダバクテリオファージ又は繊
維状バクテリオファージを用いて、発現されたイムノグ
ロブリン可変ドメインの組み換え生産されたライブラリ
ーから得ることができる；例えば WO 92／01047 を参照
のこと。そのライブラリーは、標的で免疫化されていな
い生物から得られた配列から作製されたネイティブであ
っても、又は関心の抗原（又はそのフラグメント）に露
出された生物から得られた配列を用いて作製されたもの
であってもよい。

【００６１】抗体は、いくつかの方法で修飾することが
できる。実際、他に文脈で排除しなければ、用語“抗
体”は、抗体−抗原結合ドメインを有するいずれの特異
的な結合物質も包含するものとして解釈されるはずであ
る。これにより、これは、天然であっても合成であって
もイムノグロブリン結合ドメインを含むいずれかのポリ
ペプチドを含む、抗体フラグメント、誘導体、及び機能
的等価物を包含する。それゆえ、他のポリペプチドに融
合された、イムノグロブリン結合ドメイン又は等価物を
含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング
及び発現はEP-A-0120694及びEP-A-0125023に開示され
る。

【００６２】結合抗原の機能は、全体の抗体のフラグメ
ントによって行うことができることが示されている。典
型的な結合フラグメントは、（ｉ）VL, VH, CL及びCH１
ドメインからなる Fabフラグメント；（ii）VH及びCH１
ドメインからなるFdフラグメント；（iii ）単一抗体の
VL及びVHドメインからなるFvフラグメント；（iv）VHド
メインからなる dAbフラグメント（Ward, E.S.ら、Natu
re 341, 544-546 (1989)) ；（ｖ）単離された CDR領
域；（vi）２つの連結した Fabフラグメントを含む二価
フラグメントであるF(ab′)2フラグメント；（vii ）一
本鎖Fv分子（scFV)(ここで、VHドメイン及びVLドメイン
が、これら２つのドメインが抗原結合部位を形成するよ
うに会合するのを許容するペプチドにより連結されてい
る)(Birdら、 Science, 242, 423〜426, 1985; Huston
ら、PNAS USA, 85, 5879〜5883, 1988)；（viii）二種
特異的一本鎖Fvダイマー(PCT／US92／09965)及び（ix）
遺伝子融合により作製された多価又は多種特異的フラグ
メントである“ジアボディー(diabodies)"(WO 94／1380
4; P.Holliger ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90, 6444
〜6448, 1993) である。

【００６３】抗体及び抗体フラグメントを含むポリペプ
チドの組換え発現は当該技術で公知である。

【００６４】種々の異なる宿主細胞内でのポリペプチド
のクローニング及び発現のためのシステムは公知であ
る。適切な宿主細胞には、バクテリア、哺乳動物細胞、
イースト及びバキュロウイルスシステムがある。異種ポ
リペプチドの発現のために当該技術で利用できる哺乳動
物細胞系には、チャイニーズハムスター卵母細胞、HeLa
細胞、ベイビーハムスター腎細胞及び多くの他のものが
ある。一般的な好ましいバクテリア宿主は大腸菌であ
る。バキュロウイルス発現のための好ましい宿主はSF９
細胞系のような昆虫細胞である。

【００６５】適切なベクターは、適切なら、プロモータ
ー配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化
配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列
を含む適切な調節配列を含むように選択され、作製され
得る。更なる詳細については、例えば、Molecular Clon
ing: a Laboratory Manual: 2nd edition(Sambrookら、
1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照の
こと。形質転換手順は用いる宿主に依存するが、公知で
ある。

【００６６】コーディング核酸からの発現による生産の
後、Cdc6のような本発明に役立つ標的に対する抗体又は
他の特異的結合分子は、回収し、そして単離することが
でき、必要に応じて適切な標識又はリポーターにコンジ
ュゲートされ、そして開示される本発明に従って、組織
サンプル、例えば頸管スミア中の細胞の増殖異常の存在
又は欠如の決定に用いるために供される。

【００６７】腫瘍中のCdc6及び MCM発現のレベルは正常
な組織中よりかなり高く、これらの抗原は（例えば腫瘍
細胞の壊死により）血流又は他の体液、例えば尿、又は
便に遊離され得る。特異的結合分子は、当業者に利用で
きるいずれかの技術、例えばDELFIA, ELISA, RIA、 Wes
ternブロッティングを用いて、体液、例えば血清中で標
的を検出するのに用いることができる。腫瘍の進行及び
退縮は、例えば処理に対する応答において又は再発にお
いてモニターすることができる。これにより、血液又は
他の体液サンプル、例えば尿、前立腺液、乳頭液、漿液
及び腹水流出物、脳脊髄液、及び便も、本発明に従って
評価することができる。例えば、血液サンプルは、例え
ばWilliamsら（Clin.Chem.Acta, 1986, 155, 329〜344)
に記載されるように、DELFIA, ELISA, RIAを用いて、MC
M5及びCDC6のような標的ポリペプチドの存在についてア
ッセイすることができる。

【００６８】生体内標的への結合の測定は、体内の異常
細胞の局在化を同定するのに用いることができる。本発
明に従う標的に対する標識された結合分子は、個体に投
与することができ、その体内での結合が測定される。ラ
ジオヌクレオチド、例えばヨウ素−125 、インジウム−
111 、タリウム−201 又はテクネチウム−99ｍを抗体に
結合させた場合、その抗体が正常組織より腫瘍において
優先的に局在化するなら、腫瘍組織中の放射性標識の存
在を、ガンマカメラ又はシンチグラフィーを用いて定量
することができる。得られた腫瘍の像の質はシグナル：
ノイズ比に直接、相関する。テクネチウム−99ｍで放射
能標識することは Pakら (1992)(Nucl.Med.Biol. 19; 6
99〜677)に記載される。抗 CEA抗体での癌像形成の報告
は、Goldenberg D.M.(Int.J. of Biol.Markers 1992,
7; 183〜188)により供される。ヒト又は動物の体で行わ
れるいずれかの方法が病気の実際の診断の方法であるな
ら、本発明は、もちろん、いずれかのこのような方法に
用いるための、開示されるような標的ポリペプチドに対
する特異的結合メンバーに広げられる。

【００６９】ATPase酵素活性がCdc6及び MCMタンパク質
について報告されている(Zwerschkeら、 1994, J.Biol.
Chem. 269, 23351〜23356; Ishimi ら、 Cold Spring H
arbor Meeting on Eukaryotic DNA Replication, 3-7,
1997年９月）。これらのタンパク質は、他の酵素活性、
例えばIshimiら（前掲）により報告されるヘリカーゼ活
性を有し得る。本発明による標的タンパク質のレベル
は、そのサンプル中の酵素活性の測定により評価するこ
とができる。例えば、特定の色原物質は、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ（ジアミノベンジジン）及びβ−ガ
ラクトシダーゼ(X-GAL) のような酵素の酵素活性のため
に開発されている。

【００７０】Cdc6, MCM5又は他の標的タンパク質発現
は、例えばmRNAレベルを決定することにより、核酸レベ
ルにおいて評価することができる。 Williamら(Cold Sp
ring Harbor Meeting On Eukaryotic DNA Replication,
3-7, 1997年９月）は、マウスの腸の腸陰窩の基部にお
ける Cdc6 mRNAの発現を報告している。 RNA検出のため
の方法はその分野で公知であり、ノーザンブロッティン
グ、ドットブロッティング、イン・シトウハイブリダイ
ゼーション、定量的RT-PCRがある。１又は複数の細胞又
は細胞から単離及び／又は精製された核酸由来の核酸ラ
イブラリー（例えば細胞から単離されたmRNA由来のcDNA
ライブラリー）から単離及び／又は精製された核酸は、
選択的ハイブリダイゼーションのための条件下でプロー
ビングされ、及び／又は特異的核酸増幅反応、例えばポ
リメラーゼ鎖反応(PCR) にかけることができる。プロー
ブの標的核酸への結合は、当業者の自由に種々の技術の
いずれかを用いて測定することができる。例えば、プロ
ーブは、放射能で、蛍光で、又は酵素により標識するこ
とができる。プローブの標識化を用いない他の方法に
は、制限フラグメント長多形性の検査、 PCRを用いる増
幅、 RNase開裂及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチ
ドプロービングがある。

【００７１】実施する目的のため、又はコストと時間を
考慮した少くとも商業目的のために、タンパク質レベル
における標的タンパク質発現の評価が、核酸レベルにお
ける評価より一般に好ましい。

【００７２】本発明の態様は、実験例を引用して詳述さ
れよう。本発明の更なる態様及び実施形態は当業者に明
らかであろう。

【００７３】実施例１−抗体の調製 Cdc6のための抗体を以下のプロトコルを用いて調製し
た。ヒトCdc6様タンパク質のフラグメントをコードする
発現された配列タグ(GenBankアクセス番号：T90351, H5
9204, N69246, AA045217, AA099980) を、ヒトOrc1及び
イーストCdc6／Cdc18 に対するそれらの弱い配列相同性
に基づいて同定した。対応するライブラリークローン
を、IMAGE Consortium (Research Genetics Inc., USA)
から得て、 ABI PRISM 377シーケンサー（Applied Bios
ystems) を用いて両方の鎖に基づいて配列決定した。全
ての５つのクローンの共通配列が 536アミノ酸のオープ
ン読み枠を含んでいた。後に公開されたヒトCdc6の配列
とのアライメント（Williamsら、1997）は、タンパク質
レベルでの99.7％の相同性を示した。アミノ酸 145〜36
0 及び 364〜547 に相当するヒトCdc6の２つの別個のフ
ラグメントを、 XbaＩ−BamHＩフラグメントとしてpET2
3a発現ベクター(Novagen)にクローン化し、大腸菌CL41
株中で発現させた。組換えタンパク質フラグメントを、
Ni+2アガロースアフィニティークロマトグラフィー（Qi
agen）により精製し、免疫化のために用いた。抗体を生
じさせ、以前に記載されるように（Romanowskiら、Pro
c.Natl.Acad.Sci. USA, 1996, 93: 10189〜10194)アフ
ィニティー精製した。３つの抗体は、HeLa全細胞抽出物
及び核抽出物中で62kDの主要なバンドを認識した。

【００７４】MCM5に対する抗体を次の通りに調製した：

【００７５】PCRプライマーを、ヒトMCM5の公開された
配列に基づいてデザインした（Huら、1993、Nucl.Acid
Res. 21 5289〜5293) 。アミノ酸 367〜582 に対応する
MCM5コーディング配列のフラグメントを、逆転写した H
eLa cDNAから増幅し、 SphＩ− BglIIフラグメントとし
て pQE70発現ベクター（Qiagen）にクローン化した。そ
のタンパク質をBL21大腸菌細胞中で発現させ、Ni²⁺アガ
ロースアフィニティークロマトグラフィー（Qiagen）を
用いて精製した。抗体は、Romanowskiら（Proc.Natl.Ac
ad.Sci. USA, 1996, 93: 10189〜10194)に記載されるよ
うに生じさせた。

【００７６】実施例２−Cdc6及びMCM5の細胞増殖との関
係 不死のヒト細胞系HeLaが細胞サイクル全体を通してCdc6
及びMCM5を発現することが以前にウエタスタンブロット
により示されている（Williamsら、Proc.Natl.Acad.Sc
i. USA, 1997, 94: 142-147; Schulte ら、Eur.J.Bioch
em., 1996, 235,144-151) 。現在、静止Wi38ヒト繊維芽
細胞中でのCdc6の下降制御がWilliamsら、1997により報
告されている。

【００７７】本発明者らは、マウス 3T3繊維芽細胞を接
触阻害により静止させた時に、Cdc6発現が下降制御され
ることもウエスタン・ブロットにより示した（図１
Ａ）。

【００７８】NIH 3T3細胞系を、群集になるまで増殖さ
せることにより拘束した。培養物を７日間、静止状態に
維持した。細胞を、トリプシン分離及びリプレーティン
グによりＧ０拘束から解放した。可溶性（上清）及び核
タンパク質（ペレット）抽出物を、３時間の間隔で調製
し、両抽出物をヒトMCM5, Orc2及びCdc6に対する抗体で
免疫化した。

【００７９】Orc2（クローニングについて、 GavinらCS
cience(1995) 270, 1667〜1671) は、静止細胞内で結合
したクロマチンを保持しており（Ｇ０）、細胞が細胞サ
イクルに入る時にはっきりと増加しない。対照的に、MC
M5は、可溶性画分が大量のMCM5を含んでいたにもかかわ
らず、静止細胞のクロマチン結合画分（ペレット）内で
検出することができなかった。MCM5と対照的に、Cdc6は
静止細胞から完全に欠如していたが、このタンパク質の
発現は、細胞が細胞サイクルに再び入る時に迅速に誘導
された。ヒトEJ13細胞系（膀胱癌由来）でも同様の結果
を得た。

【００８０】これらの結果は、静止細胞中のCdc6の欠如
が一般的な現象であることを示す。

【００８１】これらの研究を、免疫蛍光並びに抗Cdc6及
び抗MCM5抗体の完全な細胞への適用により拡張した。Cd
c6及びMCM5の発現は、新生のヒト繊維芽細胞(NHF) が接
触阻害により静止状態になる時にも下降制御されること
が見い出された。

【００８２】NHFを群集になるまで増殖させ、３日間、
静止状態に維持した。細胞を、トリプシン分離及びリプ
レーティングによりＧ０拘束から解放した。次に完全な
細胞を、Ｓ期に入るまで、解放後の複数の時点で収集し
た。ヨウ化プロピジウムでの染色を DNAを示すために用
い、結果を、抗Cdc6及び抗MCM5抗体でのサンプルの染色
と比較した。静止（Ｇ０）細胞は、Cdc6免疫反応性を示
さず、抗MCM5抗体で極めて弱いシグナルを示した。しか
しながら、細胞サイクルに入る時及びＳ期の間に、Cdc6
及びMCM5についての強力な核免疫反応性が観察された。

【００８３】これらの研究は、抗Cdc6抗体が、PCNA又は
Ki67と同様の細胞を増殖するためのマーカーを供し得る
であろうことを示唆し得る。PCNAもKi67も頸部細胞学の
ために満足するものでないことが判明した。

【００８４】実施例３−抗Cdc6及び抗MCM5結合分子はPC
NA又はKi67抗体よりかなり有効に異常な（例えば腫瘍）
細胞を検出する。 実施例２に概説される結果は、Cdc6発現が、頸部細胞学
のためにいずれも満足いくものでないPCNA又はKi67のそ
れに類似し得ることを示唆する。本発明者らは、正常な
又は病気の子宮頸の断片に基づいてこれらのタンパク質
に対する抗体を比較した。

【００８５】慣用的な増殖マーカーPCNA及びKi67につい
ての頸部 SILの免疫染色は、Cdc6又はMCM5についての染
色と比較した時に異なるパターンの免疫反応性を示す。
正常な頸部において、全ての４つの抗原に対する抗体
は、基底及び旁基底層に制限された上皮細胞の陽性の免
疫染色を示した。化生の、ストローマの、又は炎症性の
細胞の免疫染色は観察されなかった。低及び高グレード
SIL(LSIL及びHSIL）の両方において、Cdc6及びMcm5に対
する抗体は、異常細胞の大部分（95％超）の陽性の免疫
染色を示した。対照的に、PCNA及びKi67についての免疫
染色は、両グレードの SILにおいて異常細胞の少数集団
（30％未満）のみである。LSILの特徴であり、 HPVの細
胞病理学的効果を反映するコイロサイト(koilocyte)
は、全て、Cdc6及びMCM5で陽性の免疫染色を示したが、
少数集団（20％）のみがPCNA又はKi67について陽性染色
を示した。

【００８６】異常細胞の染色のかなり大きなレベルは、
組織サンプルが上皮の表面からスミアによりほとんど直
ちにとられる頸部スクリーニングにおいて、抗PCNA及び
抗Ki67分子に優る、抗Cdc6又は抗MCM5結合分子を用いる
ことについての明白な利点を供する。

【００８７】５μｍセクションをガラススライド上に切
り取り、キシレン中でワックスを除いた。内因性ペルオ
キシダーゼ活性を、室温中で、３〜５分、 100％メタノ
ール中 0.6％過酸化水素中でのインキュベーションによ
り止めた。そのスライドを２×５分、リン酸緩衝塩類溶
液中で洗い、次にリン酸緩衝塩類溶液(PBS) 中10％の胎
児ウシ血清(FCS) のセクション当り約 100μｌでブロッ
クした。そのスライドをとり、過剰な血清をふき取っ
た。一次抗体を 2.5％ FCSを含む PBS中20に対して１に
希釈し、25〜50μｌを各々のセクションに加えた。イン
キュベーションを、加湿チャンバー内で室温で45分、行
った。次にそのスライドを PBS中で３×５分、洗い、次
に15分、 PBS中で、抗Ki67又は抗PCNAのために20％ウサ
ギ血清で、及び抗Cdc6又は抗MCM5のために20％ロバ血清
で、ブロッキングした。ブロッキング抗体を排出してス
ライドをふき取った後、10％の正常なヒト血清を含む P
BS中200に対して１の（抗Ki67又は抗PCNAのための）ビ
オチニル化ウサギ抗マウス二次抗体又は（抗Cdc6又は抗
MCM5のための）ロバ抗ウサギ抗体を室温で30分、加え
た。 PBS中で３×５分、洗った後、ストレプトアビジン
−ビオチン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体
を、室温で30分、 PBS中で 500に対して１で加えた。３
×５分の PBS洗浄の後、基質ジアミノベンジジンを、
0.005％過酸化水素を含む100mM Tris-Cl (pH 7.6)中１
％で加え、室温で５分、インキュベートした。その反応
を、水道水をそそぐことにより停止させ、スライドをGi
ll'sヘモトキシリンで軽く染色し、特級エタノールによ
り脱水し、キシレン中で２×６分、洗った。カバースリ
ップを DPXマウント媒体で適用した。

【００８８】正常な頸部の連続断片を、各々の抗体を用
いて、PCNA, Ki67, MCM5及びCdc6について染色した。こ
れら全ての抗体は、基底及び旁基底層のみに制限された
陽性細胞と同様の免疫反応性のパターンを示した。

【００８９】低グレードSIL(CINI) 頸部の連続セクショ
ンを、各々抗体を用いてPCNA, Ki67, MCM5及びCdc6につ
いて染色した。形成異常は扁平上皮の下３分の１におい
て支配的であり、 HPV関連のウイルスの変化（コイロサ
イト−シス）に関連しており、ここで後者は表面まで広
がっていた。PCNA及びKi67は、上皮の下３分の１に制限
された。パッチ様の焦点にある免疫反応性であって、不
定型の細胞の小さな集団のみが陽性染色されているもの
を示した。対照的に、Cdc6及びMCM5は、上皮のより表面
の層においてコイロサイトを含む全ての不定型の細胞の
陽性染色と共に、十分に濃厚な免疫反応性を示す。

【００９０】高グレード SILの連続断片を、各々PCNA,
Ki67, MCM5及びCdc6抗体を用いて染色した。上皮の全て
の層全体に形成異常が存在する。PCNA及びKi67は、十分
に濃厚な染色での同様のパターンの免疫反応性を示した
が、不定型細胞の小数集団のみが陽性である（約30％ま
で）ことを示した。Cdc6及びMCM5も、上皮の十分に濃厚
な染色を示す。しかしながら、PCNA及びKi67と著しく対
照的に、Cdc6及びMCM5は全て不定型の細胞の陽性染色を
示す。

【００９１】これらの結果は、スミアサンプルへの結合
を決定することにより頸部の状態を評価することにおい
て抗Cdc6又は抗MCM5特異的結合分子を用いることの特定
の有用性の指標である。スミアサンプルのただ頸部から
の頂上の表面層のみが、高レベルの染色を有することが
重要である。抗PCNAでも抗Ki67でも示されない早期段階
異常性（低グレードSIL, CINI)での抗Cdc6で及び抗MCM5
で得られた高レベル染色は極めて重要である。更に、LS
ILサンプルで抗Cdc6及び抗MCM5抗体を用いて得られるが
抗PCNAでも抗Ki67抗体でも得られない十分に濃厚な染色
は、早期の段階の潜在的な前悪性腫瘍についてスミアサ
ンプルを評価するために前者の特定の有用性を強調す
る。

【００９２】実施例４−Cdc6及びMCM5抗体は頸管スミア
において異常細胞を検出する。 実施例３は、子宮頸のセクションにおいて潜在的に前癌
性の障害を検出するための抗Cdc6及び抗MCM5結合分子の
価値を証明する。更なる実験結果は、それらが頸管スミ
ア調製物中で異常細胞を検出するのに同じく有効である
ことを示す。

【００９３】頸管スミアは、（リン酸緩衝塩類溶液中の
パラホルムアルデヒドから新しく調製した４％の）ホル
ムアルデヒド中で10分、固定化した。次にその固定化し
た材料を、抗Cdc6抗体（１：200)又は抗MCM5抗体（１：
200)で、次にフルオレセインイソチオシアネートに接合
させたロバ抗ウサギポリクローナル抗体（Amersham；
１：100)で染色した。全 DNAをヨウ化プロピジウムによ
り標識した。走査性レーザー共焦顕微鏡（Bio-Rad MRC
1024）を用いて像を得た。これらの像において、全ての
DNAは赤色であり、Cdc5又はMCM5免疫染色は緑色であ
り、免疫反応性の核は黄色に見えた。

【００９４】正常な頸管スミアの例は、平行に配列され
た頸部内部細胞の特徴的なストリップ並びに表面上及び
化生扁平上皮細胞の混ぜ合わさった集団を示した。テス
トした抗体のいずれとの特定の抗Cdc6又は抗MCM5免疫反
応性の証拠もなかった。

【００９５】異常核の細胞（不定型の扁平上皮細胞）を
含む異常スミアは、３つの異なる抗Cdc6抗体で、及び抗
MCM5抗体で陽性染色されることを示した。コイロサイト
（Koilocytes）も、抗Cdc6及び抗MCM5抗体との強力な免
疫反応性を示した。隣接した正常な表面の扁平上皮／化
生細胞でCdc6又はMCM5免疫反応性を示したものはない。

【００９６】正常な頸部のスミアにおける極めて低いバ
ックグラウンドに対して、又は異常な頸部からのスミア
中の正常な細胞において、異なる抗Cdc6抗体を用いて、
好ましくは、コイロサイトを含む、LSIL細胞を染色し
て、結果を得た。これらの結果を、抗MCM5抗体を用いて
も得た。MCM5に対する抗体で同様の結果が見られた。

【００９７】実施例５−Cdc5及びMCM5抗体は胸において
有利に癌細胞を染色する。 抗Cdc6及び抗MCM5抗体を、一般的な癌の他の部位、胸で
テストした。胸組織固定化及び染色は頸管スミアについ
て実施例３及び４に記載されるように行った。

【００９８】抗Cdc6及び抗MCM5抗体を、所定範囲の乳癌
でテストした。正常な胸は、免疫染色の証拠を示さなか
ったが、低及び高グレードの侵入性導管癌を含む乳癌の
種々の組織学的な型において抗Cdc6及び抗MCM5の両方で
観察された。低グレード粘膜癌も両方の抗体で強力に陽
性染色することを示した。重要なのは、癌に隣接した正
常なストローマ細胞が陰性であったことであった。

【００９９】実施例６−血液サンプルの分析 散在性の化生の疾患を患う患者からの保管した血液サン
プルを、Williamsら（Clin.Chem.Acta, 1986, 155, 329
〜344)に記載されるように、酵素連結イムノソルベント
アッセイを用いてMCM5及びCDC6の存在についてアッセイ
する。血清中の可溶性MCM5及びCDC6の量は腫瘍負荷と相
関する。

【０１００】実施例７−抗原回復と共にパラフィンろう
に浸した組織断片とのスミア及び凍結断片の比較 正常な頸部（７つのサンプル）、LSIL（５つのサンプ
ル）、HSIL（６つのサンプル）及び扁平上皮細胞癌（６
つのサンプル）のホルマリン固定したパラフィンろうに
浸した組織断片の５μｍ断片のイムノペルオキシダーゼ
染色を、Ki67, PCNA, MCM5及びCdc6に対する抗体で行っ
た。

【０１０１】５μｍ断片をガラススライド上に切断し、
キシレン中でろうを除いた。内因性のペルオキシダーゼ
活性を、室温で30分、 100％メタノール中 0.6％過酸化
水素中でのインキュベーションにより止めた。そのスラ
イドを超高純度の水で２分、洗い、次にクエン酸ナトリ
ウム緩衝液中で２分、加圧クッキングした。そのスライ
ドを、２×５分、Tris緩衝塩類溶液(TBS) で洗い、次に
TBS中10％ヤギ血清の、断片当り約 100μｌでブロック
した。そのスライドをとり、過剰な血清をふきとった。
一次抗体を、１％ BSAを含む TBS中 200に対して１に希
釈し、 100μｌを各々の断片に加えた。加湿チャンバー
内で、４℃で一晩、インキュベーションを行った。次に
そのスライドを TBS中で３×５分、洗い、次に室温で30
分、１％BSAを含む TBS中で 500に対して１でビオチニ
ル化ヤギ抗ウサギ二次抗体で洗った。 TBSでの３×５分
の洗浄の後、ストレプトアビジン−ビオチン−セイヨウ
ワサビペルオキシダーゼ複合体を室温で30分、 TBS中で
500に対して１で加えた。３×５分の TBS洗浄の後、基
質ジアミノベンジジンを、 0.005％過酸化水素を含む T
BS中で１％で加え、室温で10分、インキュベートした。
その反応を、水道水をそそぐことにより停止させ、スラ
イドをヘマトキシリンで軽く染色し、特級エタノールに
より脱水し、キシレン中で透明にした。カバースリップ
を、 DPXマウンティング媒体と共に適用した。

【０１０２】正常な頸部（８つのサンプル）、HSIL（９
つのサンプル）及びLSIL（８つのサンプル）の凍結組織
断片のイムノペルオキシダーゼ染色を、PCNA, Ki67, MC
M5及びCdc6に対する抗体で行った。

【０１０３】凍結断片をアセトン中で10分、固定化し
た。内因性のペルオキシダーゼ活性を、30分、 100％メ
タノール中 0.6％過酸化水素中でのインキュベーション
により止めた。次に断片を TBSで洗い、 TBS中10％ヤキ
血清で一晩、ブロックした。一次抗体を１％ BSAを含む
TBSで１／200 に希釈し、４℃で一晩、インキュベート
した。次に固定化組織断片について上述されるように二
次抗体手順を行った。

【０１０４】抗MCM5及び抗Cdc6抗体での染色の感度は、
凍結断片に適用した時に抗PCNA及び抗Ki67抗体でのもの
よりかなり高かった。ホルマリンで固定し、パラフィン
に浸し、そして加圧クッキングにかけた正常な、LSIL及
び扁平上皮細胞癌腫組織に基づいて、抗PCNA、抗MCM7、
抗MCM5及び抗Cdc6は同様の染色のパターンを供した。比
較においてKi67は、LSIL及び扁平上皮細胞癌腫の唯一の
焦点にある弱い染色で、かなり弱い感度であった。

【０１０５】実施例８−凍結断片へ及び抗原回復にかけ
た組織への抗MCM7抗体での染色 HSILとして分類された頸部の４つの凍結断片を抗MCM7抗
体で染色した。抗Cdc6及び抗MCM5抗体での染色と同じパ
ターンの染色が観察された。

【０１０６】この結果は、抗原回復プロトコルにかけた
いくつかのヒト組織及び３つの型のヒト腫瘍においてPC
NA及びMCM7（hCDC47）について同様の免疫染色パターン
を見い出した Hiraiwaら（Int.J.Cancer, 1997, 74: 18
0 〜184 ）のものと異なる。

【０１０７】しかしながら、正常な頸部、LSIL及び抗原
回復にかけた扁平上皮細胞癌腫のパラフィンろうに浸し
た組織断片について得られた染色パターンが抗PCNA抗体
について得られたものと同様であることが見い出された
点で Hiraiwaらと一致した。実施例７に示す通り、この
ように調製した断片での抗MCM5及び抗Cdc6抗体について
の染色パターンは、抗PCNA抗体についてのものとも似て
いた。

【０１０８】実施例９−抗MCM2抗体での染色 ウサギポリクローナル抗ヒトMCM2を、正常な頸部の２つ
の凍結断片及びHSILの４つの凍結断片（各々が正常な頸
部上皮を含む）を染色するのに用いた。正常な頸部外部
は、表面の分化した細胞において発現はなく、基底層に
おいてのみ核の染色を示した。対照的に、異常な上皮の
厚みの全てにおいてHSIL細胞の核染色があった。頸部内
部の細胞は陰性であった。

【０１０９】実施例10−抗MCM3抗体での染色 ウサギポリクローナル抗ヒトMCM3を正常な頸部の凍結断
片及びHSILの２つの凍結断片（各々が正常な頸部上皮を
含む）を染色するのに用いた。

【０１１０】正常な頸部外部は、表面の分化した細胞に
おいて核の発現がなく、基底層のみで核のむしろ粒状の
染色を示した。角化細胞の細胞質の特定のバックグラウ
ンド染色が見られた。対照的に、異常な上皮の厚みの全
てにHSIL細胞の核の染色があった。頸部内部細胞の核は
陰性であったが、頸部粘液のいくらかの染色があった。

【０１１１】ポリクローナル抗ヒトMCM3を、HSILの４つ
のスミア及びLSILの２つのスミア（これら各々は正常な
頸部細胞を含む）を染色するのにも用いた。各々の場
合、 SIL細胞の核の染色があった。更に、用いた一次抗
体の希釈において、角化細胞のバックグラウンドの細胞
質染色及び頸部細胞核のいくらかの染色があった。

【０１１２】ポリクローナル抗アフリカツメガエルMCM3
をHSILの凍結断片を染色するのに用いた。抗アフリカツ
メガエルMCM3抗体のヒトMCM3との交差反応性をウエスタ
ン・ブロッティング及び組織断片上での局在化により確
認した。異常な上皮の厚み全体にHSIL細胞の核の染色が
あった。

【０１１３】実施例11−抗MCM4抗体での染色 ウサギポリクローナル抗ヒトMCM4を、正常な頸部の凍結
断片及びHSILの２つの凍結断片（各々が正常な頸部上皮
を含む）を染色するのに用いた。

【０１１４】正常な頸部外部は、表面の分化した細胞に
おいて核の発現はなく、基底層においてのみ核のむしろ
粒状の染色を示した。角化細胞細胞質のいくらかのバッ
クグラウンド染色が見られた。対照的に、表面の核の強
力な染色と共に、異常な上皮の厚み全体にHSIL細胞の核
の染色があった。用いた一次抗体の希釈において頸部内
部細胞の弱い染色があった。

【０１１５】ポリクローナル抗ヒトMCM4を、HSILの２つ
のスミア（各々が正常な頸部細胞を含む）を染色するの
にも用いた。各々の場合にHSIL細胞の核の染色があっ
た。更に、用いた一次抗体の希釈において、角質細胞の
バックグラウンド細胞質染色及び頸部内部の細胞核のい
くらかの染色があった。

【０１１６】実施例12−抗MCM6抗体での染色 ウサギポリクローナル抗ヒトMCM6を、正常な頸部の凍結
断片及びHSILの２つの凍結断片（各々が正常な頸部上皮
を含む）を染色するのに用いた。

【０１１７】正常な頸部外部は、表面の分化した細胞に
おいて核の発現はなく、基底層においてのみ核のむしろ
粒状の染色を示した。対照的に、異常な上皮の厚み全体
にHSIL細胞の強力な核の染色があった。頸部内部の粘液
がいくらか染色されたが、頸部内部細胞核の染色は最小
であった。

【０１１８】ポリクローナル抗ヒトMCM6を、HSILの４つ
のスミア及びLSILの４つのスミア（各々が正常な頸部細
胞を含む）を染色するのにも用いた。各々の場合に SIL
細胞の核の染色があった。更に、用いた一次抗体の希釈
において、角質細胞のバックグラウンド細胞質染色及び
頸部内部の細胞核のいくらかの染色があった。

【０１１９】実施例13−抗MCM7抗体での更なる染色実験 ウサギポリクローナル抗ヒトMCM7を、正常な頸部の３つ
の凍結断片、HSILの６つの凍結断片及び頸部 SCCの凍結
断片（各々が正常な頸部上皮を含む）を染色するのに用
いた。正常な頸部外部は、表面の分化した細胞において
核の発現はなく、基底層において核の染色を示した。角
化細胞外質のいくらかのバックグラウンド染色が見られ
た。対照的に、異常な上皮の厚み全体にHSIL細胞の大部
分の核の染色があった。用いた一次抗体の希釈において
頸部内部粘膜のいくらかの染色、及び頸部内部細胞の弱
い染色があった。

【０１２０】ポリクローナル抗ヒトMCM7を、HSILの２つ
のスミア及びLSILの２つのスミア（各々が正常な頸部細
胞を含む）を染色するのにも用いた。各々の場合に SIL
細胞の核の染色があった。更に、用いた一次抗体の希釈
において、角質細胞のバックグラウンド細胞質染色及び
頸部内部の細胞核のいくらかの染色があった。

【０１２１】ポリクローナル抗アフリカツメガエルMCM7
（ウエスタン・ブロッティング及び組織断片での局在化
によりヒトMCM7と交差反応することを確認したもの）
を、HSILの凍結断片を染色するのに用いた。異常上皮の
厚み全体にHSIL細胞の核の染色があった。

【０１２２】方 法頸管スミアの調製 新しいスミアを固定化し（50：50 アセトン：メタノー
ル中５分）、空気乾燥させた。（上述のように）内因性
ペルオキシダーゼ活性を止めた後、細胞を浸透性にし
（４mMデオキシコール酸ナトリウム、10分）、洗浄し
（0.25％ Triton X-100 を含むTBS)、そして TBS中10％
ヤギ血清で一晩ブロックした。一次抗体を、１％ BSAを
含む TBSで１／200 に希釈し、４℃で一晩、インキュベ
ートした。次にそのスライドを TBSで３×５分、次に室
温で30分、１％ BSAを含む TBS中 500に対して１のビオ
チニル化ウサギ二次抗体（Dako）で洗浄した。 TBSでの
３×５分の洗浄の後、ストレプトアビジンセイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ複合体（Dako）を、室温で30分、 T
BS中 500に対して１で加えた。３×５分の TBS洗浄の
後、基質ジアミノベンジジンを、 0.005％過酸化水素を
含む TBS中に１％で加え、室温で10分、インキュベート
した。その反応を、水道水をそそぐことにより停止さ
せ、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、特級エタ
ノールで脱水し、キシレンで透明にした。カバースリッ
プに DPXマウンティング媒体と供に適用した。

【０１２３】免疫蛍光 新しく集めた頸管スミア材料を 0.5ml PBSに懸濁し、
0.5mlの８％ホルムアルデヒドを加えて固定化し、ポリ
スチレンカバースリップ上に広げた。カバースリップ
を、Romanowskiら（Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1996, 9
3: 10189〜10194)に記載されるように処理した。５％ B
SA／PBS ／Triton X-100及び SDSでのブロッキングの
後、それらを一次抗体と共にインキュベートし、洗浄
し、二次抗体（FITC接合抗ウサギ抗体Amersham １：10
0)と共にインキュベートし、 DNAについてヨウ化プロピ
ジウム／RNAseA（両方 Sigma、50mg／ml）で対比染色
し、洗浄し、グリセロール／PBS ／フェニレンジアミン
中にマウントした。

【０１２４】２チャンネル（FITC & Texas Red）法を用
いて、 BioRad MRC 1024走査性レーザー共焦顕微鏡で、
蛍光像を収集した。いくつかの像について、１〜２μｍ
ステップでの共焦の組を収集し、次に単一フレームとし
て投影した（図４ａ及びｃ）。正常な及び腫瘍の胸組織
を乳房切除試料から新しく収集した。薄片（１mm未満）
を30分、４％パラホルムアルデヒドに固定化し、次に両
方の抗体インキュベーション及び洗浄をより長時間行っ
た他は上述の通り処理した。

【０１２５】実施例14−本発明の実施形態の、標準 Pap
染色とのブラインド比較 検出効率を比較するために、地方の病院において膣鏡診
外来患者クリニックにかかっている女性から得たスミア
で行った標準 Pap染色と共に、MCM5に対する抗体を用い
てブラインド試験を行った。表１は、慣用的な Pap染色
により陽性として評価された26のケースのうち、26全て
が本発明による抗体テストによっても陽性であると評価
された。慣用的な Pap染色により陰性であると評価され
た16のケースのうち、13が抗体テストによっても陰性で
あると評価された。

【０１２６】残りの３つのうち、１つが、炎症性バック
グラウンドにおいて反応性の変化を示す染色された未成
熟の化生扁平上皮細胞を含んだ。他の２つは Pap染色の
再検査に基づき異常な（LSIL）細胞を含むとして確認さ
れ、即ちこれらは、本発明を用いて排除し得る種類の誤
った陰性であった。

【０１２７】これらの結果は、 Pap染色からの情報を失
うことなく、本発明による抗体テストを用いて情報が得
られることのみを証明する。これは、抗体テストのいず
れかの失敗の可能性が、慣用的な Pap染色を用いて保証
されることを許容する。

【０１２８】実施例15−尿路悪性癌瘍を有する患者の尿
サンプルの分析 解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（"DELFIA"）
を、２つの異なるウサギポリクローナル抗体 hMCM5抗血
清を用いてヒトMCM5の検出のために確立した。

【０１２９】サンドイッチアッセイの基本は、表面（こ
こでは、ポリスチレンマイクロタイターウエル）への過
剰な特定の抗体の固定化−即ち“捕獲”抗体の固定化で
ある。一次抗体結合反応の後、異なるエピトープ特異性
を有する第２の（ここではユーロピウム）標識化抗体を
過剰に加える。免疫反応を完了した後、過剰な材料を洗
い落とし、増強溶液を加えた後、(Wallac Oy) 時間分割
蛍光を時間分割蛍光計で測定する。そのシグナルは被検
体の濃度に比例する。

【０１３０】以下のアッセイを用いた： １．ポリクローナルウサギ抗MCM5Ab (1600ng／ウエル）
で一晩（４℃）でのコーティング； ２．DELFIA洗浄液(Wallac Oy) での３回の洗浄； ３．５％ BSA／PBS 中で１時間のブロッキング； ４．DELFIA洗浄液(Wallac Oy) での３回の洗浄；

【０１３１】５．一晩（４℃）の一次抗体結合反応（0.
02％ TWEENを含むWallacマルチ緩衝液中被検体の１：３
希釈）； ６．DELFIA洗浄液(Wallac Oy) での４回の洗浄； ７．ユーロピウム標識化ポリクローナルウサギ抗MCM5Ab
（４²⁰Eu／IgG)との３時間の二次抗体結合反応； ８．DELFIA洗浄液(Wallac Oy) での６回の洗浄； ９．増強溶液の添加及び振とうしながら10分のインキュ
ベーション。時間分割蛍光計(Wallac Oy) での時間分割
蛍光の測定。

【０１３２】被検体として２つの異なるウサギからのポ
リクローナルウサギ抗MCM5血清及び５％ BSA／PBS 中の
組換えヒトMCM5を用いて、13pM及び 41250pMの間の標準
曲線を作った。試料中の hMCM5の濃度を、サンプルのDE
LFIAアッセイ計数の、組換えhMCM5 ５％ BSA／PBS から
作った標準曲線との比較により決定した。モノクローナ
ル抗体を用いる時にかなり高い感度が予想されるはずで
ある。

【０１３３】Addenbrookes Hospital, Cambridge, UKに
おける尿路悪性腫瘍を有する患者からの尿試料を3000rp
m(SIGMA 4K10、７分、４℃）で遠心し（50〜150ml)、そ
の細胞ペレットからの可溶性画分を、低張膨潤させ、洗
浄し、そして DNA結合タンパク質を塩抽出することによ
り作った。可溶性画分を、病院での泌尿器病理科につい
ての診断報告と比較した MCM5 DELFIA及び生化学的デー
タを用いてアッセイした。

【０１３４】悪性腫瘍について陽性であると臨床的に判
断された５つのサンプルのうち、本発明によるDELFIAを
用いて陽性と判断された４つ（80％）はMCM5の測定可能
な量を示した（29〜85pM）。悪性腫瘍について陰性であ
ると臨床的に判断された６つのサンプルのうち、全てが
DELFIAで０標準と同様の応答を供した。

【０１３５】実施例16−急性及び慢性白血病／リンパ腫
の患者の血液サンプルの分析 実施例15に記載されるDELFIAを、Addenbrookes Hospita
l, Cambridgeにおける急性及び慢性白血病／リンパ腫の
患者から得た血液サンプルをテストするのに用いた。血
液を3000rpm(SIGMA 4K10、７分、４℃）で遠心し、その
細胞ペレットからの可溶性画分を、低張膨潤、洗浄及び
DNA結合タンパク質の塩抽出により作った。次に可溶性
画分をDELFIAを用いてアッセイした。

【０１３６】６つの悪性腫瘍のケースのうち、本発明に
よるDELFIAを用いて陽性とテストされた５つ（83％）
が、測定可能な量のMCM5（24〜1945pM）を示した。６つ
の対照サンプル（糖尿病の外来患者）のうち、全てが０
標準と同様の応答を供した。

【０１３７】実施例17−転移性悪性腫瘍の血清学的検出 Addenbrookes Hospital, Cambridge, UKにおける転移性
乳癌及び卵巣癌の患者からの血清で、実施例15に記載さ
れるDELFIAを用いてアッセイを行った。２つの肉腫のケ
ース及び３つの癌腫のケース（乳及び卵巣腺癌）は、測
定可能な量のMCM5を示した。

【０１３８】実施例18−本発明に用いるための"pan-MC
M" ポリクローナル抗体の調製 MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6及びMCM7に結合すること
ができるポリクローナル抗体を次の通り得た。MCMファ
ミリーのタンパク質に共通する共通配列に対応するペプ
チド VVCIDEFDKMSDMRTACを t-BOC化学を用いて合成し
た。そのペプチドをPPD(精製したタンパク質誘導体−ツ
ベルクリン）に連結した。ウサギを、21日間隔での注入
により免疫化した。３回目の免疫化の後10日に、血清を
収集し、後の実験に用いた（以下の実験例において"pan
-MCM" 抗体と呼ぶ）。

【０１３９】実施例19−抗CDC6、抗MCM2、抗MCM5、抗MC
M7及び pan-MCM抗体での正常な乳及び乳癌の染色 正常な胸（前胸部切除手術を受けた人）及びバイオプシ
ーで証明された導管及び小葉性癌腫の組織学的試料を、
CDC6, MCM2, MCM5及びMCM7に対する抗体並びにpan-MCM
抗体で染色した。抗MCM2抗体は、 Transduction Labora
toriesから市販されるBM28マウスモノクローナル抗体(1
998 Antibody Catalogを参照のこと）であった。記載さ
れるように、各々の抗体について個々に染色を行った。

【０１４０】加圧クッキングにかけたホルマリン固定し
パラフィンに浸漬した試料、及び凍結した試料の両方を
検査した。診断バイオプシーのために又はAddenbrooke'
s Hospitalでの切除後に得られたホルマリン固定し、パ
ラフィン浸漬したヒト組織を病院により認可された倫理
学的ガイドラインに従って利用した。これらの組織から
５ミクロン断片を、APES（アミノプロピルトリエトキシ
シラン）がコートされたスライドに切り取り、キシレン
中でろうを除き、アルコールを通して水にとった。その
組織を、エピトープ回復を容易にするためにクエン酸緩
衝液中で加圧クッキングし、次にTris緩衝塩類溶液(TB
S) 中で洗った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、30
分、 TBS中 0.6％過酸化水素中でのインキュベーション
により止めた。

【０１４１】断片を TBSで洗い、２時間まで、 TBS中10
％ヤギ血清でブロックした。一次抗体を、 0.1％ Trito
n 及び１％ウシ血清アルブミン(BSA) を含む TBSで希釈
した。各々の断片に 100マイクロリッターを加え、その
スライドを加湿チャンバー内で４℃でインキュベートし
た。

【０１４２】次にそのスライドを 0.025％ Triton を含
む TBSで洗い、室温で１時間、１％BSAを含む TBS中
１：500 で、ビオチニル化ヤギ抗ウサギ二次抗体（DAK
O）中でインキュベートした。 TBS中で洗った後、基質
ジアミノベンジジンを用いるストレプトアビジンセイヨ
ウワサビペルオキシドシステムをスライドを染色するの
に用いた。その反応を、水をそそぐことにより停止し、
Harris'ヘマトキシリンで軽く対比染色し、特級エタノ
ールで脱水し、キシレンで透明にした。カバースリップ
を、 DEPEXマウンティング媒体と共に適用した。凍結断
片を、10％ヤギ血清でのブロッキングを一晩でなく30
分、行った以外は実施例７に上述される通り調製した。

【０１４３】正常な乳組織においては、導管及び小葉性
細胞の１〜３％のみが陽性に染色された。ストローマ細
胞は陰性であった。低及び高グレードの障害並びに小葉
性及び導管性の型を含む種々の乳癌における異常細胞の
50〜80％が、陽性に染色され、周囲のストローマ細胞及
び炎症細胞は未染色のままであった。

【０１４４】これらの結果は、各々の抗体で個々に得
た。抗PCNA及び抗Ki67抗体で比較を行った。パラフィン
断片において、抗PCNA染色は抗MCM5及び抗CDC6と同様の
結果を供したが、抗Ki67抗体は弱く焦点の染色しか供さ
なかった。凍結断片において、抗 MCM及び抗CDC6での染
色は、抗PCNA又は抗Ki67抗体よりかなり優れた結果を供
した。

【０１４５】実施例20−MCM5, MCM7及び pan-MCMに対す
る抗体を用いる正常な前立腺及び前立腺の腺癌の染色 実施例19において胸組織について記載されるように調製
した正常な組織及び前立腺の腺癌のパラフィン浸漬組織
学的試料を、別個の実験において抗MCM5、抗MCM7及び p
an-MCM抗体で染色した。

【０１４６】正常なケースは、各々の抗体で細胞の10％
未満の陽性染色を示したが、腺癌は、腫瘍細胞の30〜50
％の染色を示し、周囲のストローマ細胞及び炎症細胞は
未染色のままであった。

【０１４７】実施例21− MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM及
びCDC6に対する抗体を用いる正常な結腸及び結腸への癌
腫の染色 結腸癌腫及び管状絨毛腺腫の組織学的切除試料を、 MCM
2, MCM5, MCM7, pan-MCM及びCDC6に対する抗体で別個に
染色した。正常な試料もこれらの抗体で染色した。正常
な組織において、各々の抗体についての染色が、結腸の
陰窩の下３分の１においてのみ見られ、その陰窩内のよ
り表面の分化した細胞は未染色のままであった。

【０１４８】管状絨毛腺腫及び腺腫組織の両方におい
て、腫瘍細胞の50％超が各々の抗体での染色について陽
性であり、周囲の結合組織の要素の染色はなかった。

【０１４９】凍結乾燥した及びパラフィン浸漬したサン
プルの両方を、胸組織について実施例19に記載されるよ
うに検査した。結果は、一方で抗 MCM及び抗CDC6抗体並
びに他方で抗PCNA及び抗Ki67抗体の間と同様であった。
即ち、凍結サンプルにおいて、抗 MCM及び抗CDC6抗体で
の染色は、抗PCNA及び抗Ki67抗体で得られたものに優っ
ていた。

【０１５０】実施例22−MCM2, MCM5, MCM7及び pan-MCM
に対する抗体での正常な組織及び肺の癌の染色 肺の扁平上皮細胞癌腫又は腺腫の患者からのバイオプシ
ー又は切除物のパラフィン浸漬した組織学的試料を抗MC
M2、抗MCM5、抗MCM7及び pan-MCM抗体で別個に染色し
た。その試料は、実施例19に胸組織について記載される
通り調製した。染色を、正常な実質肺組織での染色と比
較した。正常な組織において、染色された増殖性画分は
極めて低かった。全ての癌腫において、腫瘍細胞の30％
超が陽性であり、周囲の炎症又は結合組織細胞は染色さ
れなかった。

【０１５１】実施例23−抗MCM2、抗MCM5、抗MCM7、 pan
-MCM及び抗CDC6抗体での正常及び癌腫の両方の膀胱の染
色 膀胱鏡でとった移行細胞癌腫のバイオプシーからの組織
学的試料を抗MCM2、抗MCM5、抗MCM7、 pan MCM及び抗CD
C6抗体で染色した。正常な膀胱組織において、移行上皮
の基底層の強力な染色があり、より表面の分化した細胞
は未染色のままであった。その場に癌腫を含むフラグメ
ントにおいて、形成異常細胞の厚み全体が陽性に染色さ
れた。

【０１５２】侵入性の移行細胞癌腫のケースは、腫瘍細
胞の50〜100 ％核染色を示し、ストローマ及び炎症性成
分は陰性であった。凍結した及びパラフィン浸漬したサ
ンプルの両方を、実施例19に胸組織について記載される
ように検査した。結果は、一方で抗 MCM及び抗CDC6抗体
並びに他方で抗PCNA及び抗Ki67抗体の間と同様であっ
た。即ち、凍結サンプルにおいて、抗MCM及び抗CDC6抗
体での染色は抗PCNA及び抗Ki67抗体を用いて得られたも
のに優った。

【０１５３】実施例24−抗MCM5抗体での種々の皮膚サン
プルの染色 正常な皮膚、過形成状態（乾癬を含む）、日光性角化
症、ボーエン病及び侵入性扁平上皮細胞癌腫からの組織
学的サンプルを抗MCM5抗体で染色した。正常な皮膚は、
主に上皮の基底層の染色を示し、表皮の下３分の１の細
胞も時たま染色されたが、より表面の分化した細胞は未
染色のままであった。乾癬の場合、表皮上の下から３〜
４層においてより支配的に染色され、これは皮膚のター
ンオーバー比の増加を反映した。日光性角化症及びボー
エン病（内癌腫）は、全厚みまでの表皮内の全ての異常
形成細胞の染色を示した。侵入性扁平上皮細胞癌は、細
胞の70％超の染色を示し、十分に分化した腫瘍は、ケラ
チン真珠の近くの陰性の分化した細胞の小さな中心を示
した。

【０１５４】実施例25−抗MCM5抗体での喉頭の染色 実施例19に胸組織のパラフィン浸漬試料について記載さ
れるように調製した正常な及び癌の喉頭の組織学的サン
プルを、抗MCM5抗体で染色した。正常なケースは、基底
の増殖性上皮細胞のみの染色を示した（10％未満）。癌
腫は、核染色で50％超の細胞を示した。ストローマ及び
炎症細胞は全体を通して陰性であった。

【０１５５】実施例26−抗MCM5抗体での食道の染色 実施例19に記載される胸組織のパラフィン浸漬試料につ
いてと同様に調製した正常な及び癌腫の食道の組織学的
サンプルを、抗MCM5抗体で染色した。正常なケースは、
基底の増殖性上皮細胞のみの染色を示した（10％未
満）。癌腫は、核染色で50％超の細胞を示した。ストロ
ーマ及び炎症性細胞は全体を通して陰性であった。

【０１５６】実施例27−抗MCM5抗体での気管支の染色 実施例19に記載される胸組織のパラフィン浸漬試料と同
様に調製した正常な及び癌腫の気管支の組織学的サンプ
ルを、抗MCM5抗体で染色した。正常なケースは、基底の
増殖性上皮細胞のみの染色を示した（10％未満）。癌腫
は、核染色で50％超の細胞を示した。ストローマ及び炎
症細胞は全体を通して陰性であった。

【０１５７】実施例28−抗MCM5抗体を用いる正常なもの
及び所定範囲のリンパ腫の両方のリンパ節の染色 凍結した及びパラフィン浸漬した組織学的サンプルの両
方を、実施例19において胸組織について記載されるよう
に、反応性リンパ節、並びに所定範囲のホジキン及び非
ホジキンリンパ腫から調製した。反応性リンパ節は、リ
ンパ小節の胚中心における細胞の強力な染色及び旁ろ胞
領域における時折の分散した陽性細胞を示した。リンパ
腫は、悪性リンパ腫細胞の50％超の核染色を示した。

【０１５８】実施例29−抗MCM5抗体での尿細胞学スミア
の分析 尿サンプルを、周知の移行細胞癌腫の患者から及び泌尿
器科クリニックにかかっている正常な患者から収集し
た。尿20ミリリッターを10分、 3,000ｇで遠心して、そ
の上清を除き、ペレットを50マイクロリッターの上清に
再度懸濁した。これを、APESスライドにぬり、アルコー
ル中で固定化した。

【０１５９】そのスライドをTris緩衝塩類溶液(TBS) で
洗い、次に10分、４mMデオキシコール酸ナトリウム中で
浸透性にした。それらを TBS＋ 0.025％ Triton で洗
い、 TBS中の10％ヤギ血清で２時間、ブロックした。予
め吸着させた抗MCM5抗体を、 0.1％ Triton 及び１％ B
SAを含む TBSで希釈し、 200ミリリッターを各々のスラ
イドに加えた。オービタルシェーカー上で加湿チャンバ
ー内で４℃で一晩、インキュベーションを行った。

【０１６０】そのスライドを 0.025％ Triton を含む T
BSで洗い、次に室温で１時間、１％BSAを含む TBS中で
１：500 で、ビオチニル化ヤギ抗ウサギ二次抗体（DAK
O）中でインキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ
を10分、 TBS中 0.6％過酸化水素でブロックし、次に T
BSで洗った。基質ジアミノベンジジンを用いるストレプ
トアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼシステムを
スライドを染色するのに用いた。その反応を、水をそそ
ぐことによりその反応を停止させ、そのスライドを Har
ris'ヘマトキシリンで軽く染色し、次にOrange G及びEA
50(PAP染色) で染色した。

【０１６１】移行細胞癌腫の６つのケースにおいて、こ
の方法で調製し、抗MCM5抗体で染色した尿細胞学スミア
は、全ての悪性移行細胞の強力な染色を示し、バックグ
ラウンドにおいて炎症性及び扁平上皮細胞は染色しなか
った。泌尿器科学クリニックにかよう正常な人々の尿か
ら作った同様のスミアは、扁平上皮又は正常な移行細胞
の染色を示さなかった。

【０１６２】実施例30−正常な頸部サンプル及び扁平上
皮内障害の患者からの頸部サンプルのDELFIA 解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（DELFIA）を、
上述の実施例15に記載されるように、２つの異なるウサ
ギポリクローナル抗MCM5抗血清を用いてヒトMCM5の検出
のために確立した。正常な頸部の２つのサンプル及びHS
IL頸部の２つのサンプルを分析した。それら組織サンプ
ルを、低張膨潤して洗浄することにより可溶化し、次に
DNA結合粒子を塩抽出した。

【０１６３】２つの正常なサンプルは、０標準と同様の
応答を供した。２つのHSILサンプルは陽性であると評価
され、このことは頸部サンプル中の異常性が、イムノア
ッセイを用いて検出できることを示す。

【０１６４】実施例31−抗MCM5抗体での種々の癌腫の染
色 種々の癌腫及び白血病の骨髄の組織学的試料を抗MCM5抗
体で染色した。結果は次の通りであった：胃癌は、50％
超の腫瘍細胞の染色を示した。腎臓癌は、30〜50％の腫
瘍細胞の染色を示した。卵巣癌は、30〜50％の腫瘍細胞
の染色を示した。精巣癌は、30〜50％の腫瘍細胞の染色
を示した。急性白血病の骨髄は、90％超の腫瘍細胞の染
色を示した。

【０１６５】実施例32−結腸スミアの染色 便の材料を健康な患者から収集し、表面剥離した結腸細
胞を、 WO 97／09600に記載される方法を用いて、Dynal
AS (Oslo, Norway) により供される上皮特異的抗体が
コートされた磁気ビーズにより、便のサンプルから抽出
した。

【０１６６】その抽出された磁気ビーズ及び上皮細胞の
混合物を、 0.025％ Triton を含むTBS(Tris緩衝塩類溶
液）中で洗った。４％の緩衝パラホルムアルデヒドでの
固定化の後、細胞を TBS中で洗い、生じた細胞ペレット
からスミアを作った。次にこれらを尿サンプルからのス
ミアについてと同様に処理した。

【０１６７】PAP染色したスミアは、磁気ビーズ、いく
らかのセルロース及び細胞デブリスの混合物を示し；結
腸からの多くの円柱上皮細胞及び肛門管からのいくらか
の扁平細胞が存在した。抗MCM5抗体での染色に基づき、
膀胱又は頸部についてと同様の結果が正常及び異常細胞
について得られる。

【０１６８】実施例33−潰瘍性大腸炎の患者の腸断片の
染色 活性な潰瘍性大腸炎のケースからの腸のパラフィン浸漬
した断片をMCM5に対する抗体で染色した。テストした断
片全てにおいて、表面上皮細胞の約50％がはれ上がった
領域内にMCM5の核発現を示した。活性な潰瘍性大腸炎中
に多数のリンパ球が存在し、これらの細胞もMCM5の頻繁
な核発現を示した。鎮静した潰瘍性大腸炎の断片（即ち
活性な炎症のないもの）も分析した。これらの全てにお
いて、表面上皮細胞はMCM5について染色を示さなかっ
た。鎮静した潰瘍性大腸炎中に存在する少数のリンパ球
のうち、ごくまれな細胞がMCM5について核染色を示し
た。パラフィンに浸した断片において、活性な及び鎮静
した潰瘍性大腸炎の染色は、MCM5及びPCNAについてと同
様であることが見い出された。

【０１６９】実施例34−クローン病の患者の腸断片の染
色 パラフィンに浸漬した活性クローン病の腸の断片の染色
は、潰瘍及び炎症の領域に隣接した表面上皮細胞におけ
るMCM5の核発現を示した。はれ上がった組織中のリンパ
球も、MCM5の頻繁な核発現を示した。

【０１７０】鎮静したクローン病の腸組織もテストし、
表面上皮細胞及び存在する少数のリンパ球の両方がMCM5
について陰性であった。活性及び鎮静したクローン病気
のパラフィン浸漬したケースに基づいて抗MCM5抗体につ
いて、抗PCNA抗体と同様な発見が得られた。凍結断片及
びパラフィン浸漬した断片に基づいて行った抗MCM5及び
抗PCNA染色の間の比較は、凍結断片において、抗MCM5抗
体での染色が抗PCNA抗体での染色より優れており、より
核が染色されることを示す。

【０１７１】実施例35−抗MCM5抗体での、正常な及び癌
性の子宮内膜の染色 正常な及び癌性の子宮内膜の凍結した及びパラフィン浸
漬した断片を抗MCM5抗体で染色した。正常な組織と比べ
て癌性子宮内膜において良好な染色が示され、パラフィ
ン浸漬したものより凍結したものにおいて優れていた。

【０１７２】実施例36−頸管スミア細胞単層の染色(Thi
n Prep) APESスライド上にスミアを作った後、頸管スミアをとる
ために用いたブラシ／スパチュラを75％メタノールに入
れ、残った細胞をボルテキシングにより除去した。細胞
の懸濁液を20％スクロース上に重層し、MSE Harrier セ
ントリフュージ内で２分、1,000rpmで遠心し、一番上の
層を除去して捨てた。残りの層を3,000rpmで５分、遠心
し、その細胞ペレットを 200マイクロリッターの水に再
度懸濁した。50マイクロリッターを各々のスライド上に
おき、細胞を沈降させ、水を除去した。次にそのスライ
ドを実施例29（尿細胞学スミア）と同様に処理し、 PAP
染色した。

【０１７３】種々の実験において、単層スミアで得られ
た結果は、慣用的なスミアで得られたものと同じであっ
た。単層調製物の使用は、粘液及び炎症細胞の大部分が
除去される点で有利であり得る。

【０１７４】議 論 本明細書に記載される結果は、Cdc6及びMCM5は、両方と
も、生体内の正常な分化した組織において下降制御さ
れ、培養において静止した哺乳動物細胞の範囲において
クロマチンから欠如することを示す。これは、これらの
タンパク質が細胞増殖マーカーとして潜在的な価値を有
し得ることを示唆する。 Hiraiwaらは、MCM7は、種々の
腫瘍型、例えば良性皮膚腫瘍並びに胃、膵臓及び結腸の
悪性腫瘍において、PCNAと同様の分布で免疫局在化し得
ることを示した。彼らは、MCM7免疫局在化は、組織断片
における細胞増殖の指標として適用し得ると結論づけ
た。しかしながら、既に上述したように、病理学の分野
の専門家は、PCNA及びKi67のようなマーカーによる腫瘍
における細胞増殖率の測定は、いずれかの臨床的に用い
られるであろうか疑いを持っている。なぜなら、このよ
うなマーカーが、最適に適用された時に段級づけ及び段
階づけのような慣用的な組織学的評価に基づく実際の改
良であるという直接的な証拠がほとんどないからであ
る。

【０１７５】本明細書に報告される観察結果は、Cdc6,
MCM5及びMCM7に対する特異的結合分子は、PCNA及びKi67
のような慣用的な増殖マーカーより、新しい及び凍結し
た頸部 SILにおける潜在的な前悪性細胞について極めて
高い特異性を示すことを示す。抗Cdc6及び抗MCM5は、LS
IL及びHSILにおける異常細胞を、頸部内部の、頸部外部
の、化生の、及びストローマの細胞を含む隣接する正常
な細胞から明らかに識別することができる。

【０１７６】この点において、記載されるように、抗Cd
c6及び抗 MCM抗体を、 SILの患者及び病気のない患者か
らとった頸管スミアに適用した。結果は、これらのタン
パク質について観察された著しい程度の特異性及びセン
シティビティーにおいて驚くべきものであった。新生物
細胞及び HPV感染したコイロサイトの両方において強力
な核及び細胞質染色が観察された。境界線上の異常性を
示す化生扁平細胞（重要性の不確かな不定型扁平細胞）
においても陽性染色が同定された。しかしながら、頸部
外部細胞、頸部内部細胞、扁平化生細胞及び炎症性細胞
（リンパ球及び好中球の両方）を含むスミア内の残りの
混合した集団は、Cdc6及び MCM免疫染色について陰性で
あった。

【０１７７】抗MCM5、抗Cdc6及び抗MCM7の感度は、頸管
スミア及び凍結断片に適用した時に抗PCNAよりかなり高
いが、ホルマリン内で固定化され、パラフィン浸漬さ
れ、及び加圧クッキングにより抗原回復にかけられた組
織に適用した時に、このような抗体により同様の染色の
パターンが供される。頸管スミア及び他の細胞学的サン
プル並びに凍結断片はホルマリン固定され、パラフィン
浸漬された組織断片より弱いので、加圧クッキングにか
けることができない。

【０１７８】頸管スミアに適用した時のCdc6及び MCM抗
体の驚くべき特異性及び感染は、生化学的／免疫細胞学
的アプローチの、大量の自動化頸部スクリーニングへの
導入を供する。更に、これらの抗体は、現在、頸部細胞
学の分野における専門家の間でさえ段級づけにおいて観
察者内及び観察者間にバリエーションがあるLSILの検出
及び分類を改善する助けとなり得る。これらの抗体の使
用は、より優れた精度及び客観性でHSILを同定する助け
ともなり、これにより包括的な頸部スクリーニングプロ
グラムに関連する主な問題である多数の誤った陰性の結
果を減らす助けともなるであろう。

【０１７９】注目すべきは、胸組織、胃、腎臓、卵巣、
精巣及び直腸、尿サンプル及び血液サンプル（白血病／
リンパ腫の患者並びに転移性肉腫及び癌腫の患者の両
方）、炎症性の腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎及びクロー
ン病、並びに便のスミアの評価の更なる実験例は、頸部
サンプル、特に頸管スミアの評価による頸部スクリーニ
ングを超える本発明の態様の一般性を示し、それは種々
の実施形態において好ましい。細胞学に加えて、生化学
的技術の適用も証明される。

【０１８０】先の実施例14に記載される、標準 PAPスミ
アを用いる頸管スミアの評価と、本発明の実施形態を比
較するブラインド試験の結果は、本発明の興奮させる利
用性を確認する。本明細書に言及される全ての文献は引
用により組み込まれる。

【０１８１】

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９８１０５６０．４ (32)優先日 平成10年５月15日(1998．5．15) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９８１７０７５．６ (32)優先日 平成10年８月５日(1998．8．5) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 ラスキー，ロナルド アルフレッド イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ４エスエックス，ホルブルック ロード 81 (72)発明者 ウィリアムズ，ガレス ヘイドン イギリス国，ケンブリッジ シービー２ ２エルダブリュ，トランピントン，ウィン チモア ロード 10 (72)発明者 コールマン，ニコラス イギリス国，ケンブリッジ シービー２ １ディーキュー，リージェンツ ストリー ト，ダウニング カレッジ

Claims (60)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 個体からのサンプル中の異常に増殖する
   細胞又は細胞の増殖異常性の存在又は欠如を決定する方
   法であって、該方法が、サンプル中で標的ポリペプチド
   を検出することを含み、ここで該標的ポリペプチドが、
   CDC6, MCM2,MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7プロ
   テインキナーゼ、Dbf4、 Cdc14プロテインホスファター
   ゼ、 Cdc45、及び MCM10からなる群から選択される DNA
   複製のプレイニシェーション複合体のメンバーであり、
   但し、前記標的ポリペプチドがMCM7である場合、前記サ
   ンプルは抗原回復又は加圧クッキング／オートクレーブ
   の対象でないことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 前記標的ポリペプチドが、CDC6, MCM2,
   MCM3, MCM4, MCM5,MCM6及びMCM7からなる群から選択さ
   れることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記標的ポリペプチドがCDC6であること
   を特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記標的ポリペプチドがMCM2であること
   を特徴とする、請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記標的ポリペプチドがMCM3であること
   を特徴とする、請求項２に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記標的ポリペプチドがMCM4であること
   を特徴とする、請求項２に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記標的ポリペプチドがMCM5であること
   を特徴とする、請求項２に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記標的ポリペプチドがMCM6であること
   を特徴とする、請求項２に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記標的ポリペプチドがMCM7であること
   を特徴とする、請求項２に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記方法が、標的ポリペプチドに対す
    る１又は複数の特異的結合メンバーにサンプルを接触さ
    せ、そして該１又は複数の特異的結合メンバーのサンプ
    ルへの結合を決定することを含むことを特徴とする、請
    求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記１又は複数の特異的結合メンバー
    が、複数の前記標的ポリペプチドに対するものであるこ
    とを特徴とする、請求項10に記載の方法。
12. 【請求項１２】 組織のサンプルがテストされることを
    特徴とする、請求項１〜11のいずれかに記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記組織のサンプルが、新鮮であるか
    又は凍結されていることを特徴とする、請求項12に記載
    の方法。
14. 【請求項１４】 前記組織のサンプルが、ホルマリンで
    固定化されず、又はパラフィンに浸漬されていないこと
    を特徴とする、請求項12に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記組織のサンプルが、抗原回復又は
    加圧クッキング／オートクレーブの対象でないことを特
    徴とする、請求項12に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記組織が、肺、前胸部、直腸、前立
    腺、胃、皮膚、食道及び膀胱から選択されることを特徴
    とする、請求項12〜15のいずれかに記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記組織が前胸部組織であることを特
    徴とする、請求項16に記載の方法。
18. 【請求項１８】 細胞のサンプルがテストされることを
    特徴とする、請求項１〜11のいずれかに記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記サンプルが、個体からとった流体
    から供されることを特徴とする、請求項１〜11のいずれ
    かに記載の方法。
20. 【請求項２０】 細胞のサンプルが、前記流体から供さ
    れることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記流体が血液であることを特徴とす
    る、請求項19又は20に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記流体が尿であることを特徴とす
    る、請求項19又は20に記載の方法。
23. 【請求項２３】 個体の集団がスクリーニングされるこ
    とを特徴とする、請求項１〜22のいずれかに記載の方
    法。
24. 【請求項２４】 個体が、（ｉ）正常なものであるか、
    又は（ii）潜在的に又は実際に前癌性もしくは癌性、形
    成異常又は新生物形成細胞を含む異常なものである組織
    を有するとして分類されることを特徴とする、請求項23
    に記載の方法。
25. 【請求項２５】 異常な組織を有するとして分類された
    個体の組織又は細胞が、更なる研究又は分析にかけられ
    ることを特徴とする、請求項24に記載の方法。
26. 【請求項２６】 個体からの頸部サンプル中の、異常に
    増殖する細胞又は細胞の増殖異常性の存在又は欠如を決
    定する方法であって、該方法が、標的ポリペプチドに対
    する１又は複数の特異的結合メンバーに、前記サンプル
    を接触させ、そして該１又は複数の特異的結合メンバー
    の前記サンプルへの結合を決定することを含み、ここ
    で、該標的ポリペプチドが、 DNA複製のプレイニシェー
    ション複合体のメンバーであることを特徴とする方法。
27. 【請求項２７】 前記サンプルが頸管スミアであること
    を特徴とする、請求項26に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記標的ポリペプチドが、CDC6, MCM
    2, MCM3, MCM4, MCM5,MCM6, MCM7, Cdc7プロテインキナ
    ーゼ、Dbf4、 Cdc14プロテインホスファターゼ、 Cdc4
    5、及び MCM10からなる群から選択されることを特徴と
    する、請求項26又は27に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記標的ポリペプチドが、CDC6, MCM
    2, MCM3, MCM4, MCM5,MCM6及びMCM7からなる群から選択
    されることを特徴とする、請求項28に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記標的ポリペプチドがCDC6であるこ
    とを特徴とする、請求項29に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記標的ポリペプチドがMCM2であるこ
    とを特徴とする、請求項29に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記標的ポリペプチドがMCM3であるこ
    とを特徴とする、請求項29に記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記標的ポリペプチドがMCM4であるこ
    とを特徴とする、請求項29に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記標的ポリペプチドがMCM5であるこ
    とを特徴とする、請求項29に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記標的ポリペプチドがMCM6であるこ
    とを特徴とする、請求項29に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記標的ポリペプチドがMCM7であるこ
    とを特徴とする、請求項29に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記１又は複数の特異的結合メンバー
    が、複数の前記標的ポリペプチドに対するものであるこ
    とを特徴とする、請求項26〜36のいずれかに記載の方
    法。
38. 【請求項３８】 個体の集団がスクリーニングされるこ
    とを特徴とする、請求項26〜37のいずれかに記載の方
    法。
39. 【請求項３９】 個体が、（ｉ）正常なものであるか、
    又は（ii）潜在的に又は実際に前癌性もしくは癌性、形
    成異常又は新生物形成細胞を含む異常なものである組織
    を有するとして分類されることを特徴とする、請求項38
    に記載の方法。
40. 【請求項４０】 異常な組織を有するとして分類された
    個体の組織又は細胞が、更なる研究又は分析にかけられ
    ることを特徴とする、請求項39に記載の方法。
41. 【請求項４１】 異常に増殖する細胞又は細胞の増殖異
    常の個体内での存在又は欠如を決定する方法であって、
    該方法が、個体の組織、流体又は細胞内の、標的ポリペ
    プチド又は標的ポリペプチドをコードするmRNAを検出す
    ることを含み、ここで該標的ポリペプチドが DNA複製の
    プレイニシェーション複合体のメンバーであり、但し、
    該方法が個体から除去されたサンプルに基づいて行われ
    前記標的ポリペプチドがMCM7である場合、該サンプルは
    抗原回復又は加圧クッキング／オートクレーブの対象で
    ないことを特徴とする方法。
42. 【請求項４２】 前記組織、流体又は細胞が個体から除
    去されたサンプル内にあることを特徴とする、請求項41
    に記載の方法。
43. 【請求項４３】 前記サンプルが組織のサンプルである
    ことを特徴とする、請求項42に記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記サンプルが、新鮮であるか又は凍
    結されていることを特徴とする、請求項43に記載の方
    法。
45. 【請求項４５】 前記サンプルが、ホルマリンで固定化
    されず、又はパラフィンに浸漬されていないことを特徴
    とする、請求項43に記載の方法。
46. 【請求項４６】 前記サンプルが、抗原回復又は加圧ク
    ッキング／オートクレーブの対象でないことを特徴とす
    る、請求項43に記載の方法。
47. 【請求項４７】 個体の集団がスクリーニングされるこ
    とを特徴とする、請求項41〜46のいずれかに記載の方
    法。
48. 【請求項４８】 個体が、（ｉ）正常なものであるか、
    又は（ii）潜在的に又は実際に前癌性もしくは癌性、形
    成異常又は新生物形成細胞を含む異常なものである組織
    を有するとして分類されることを特徴とする、請求項47
    に記載の方法。
49. 【請求項４９】 異常な組織を有するとして分類された
    個体の組織又は細胞が、更なる研究又は分析にかけられ
    ることを特徴とする、請求項48に記載の方法。
50. 【請求項５０】 DNA複製のプレイニシェーション複合
    体のメンバーである、１又は複数の標的ポリペプチドに
    対する１又は複数の特異的結合メンバーと、請求項10〜
    47のいずれかに記載の方法において前記１又は複数の特
    異的結合メンバーを用いるための説明書と、を含むキッ
    ト。
51. 【請求項５１】 前記標的ポリペプチドが、CDC6, MCM
    2, MCM3, MCM4, MCM5,MCM6, MCM7, Cdc7プロテインキナ
    ーゼ、Dbf4、 Cdc14プロテインホスファターゼ、 Cdc4
    5、及び MCM10からなる群から選択されることを特徴と
    する、請求項50に記載のキット。
52. 【請求項５２】 前記標的ポリペプチドが、CDC6, MCM
    2, MCM3, MCM4, MCM5,MCM6及びMCM7からなる群から選択
    されることを特徴とする、請求項51に記載のキット。
53. 【請求項５３】 前記標的ポリペプチドがCDC6であるこ
    とを特徴とする、請求項52に記載のキット。
54. 【請求項５４】 前記標的ポリペプチドがMCM2であるこ
    とを特徴とする、請求項52に記載のキット。
55. 【請求項５５】 前記標的ポリペプチドがMCM3であるこ
    とを特徴とする、請求項52に記載のキット。
56. 【請求項５６】 前記標的ポリペプチドがMCM4であるこ
    とを特徴とする、請求項52に記載のキット。
57. 【請求項５７】 前記標的ポリペプチドがMCM5であるこ
    とを特徴とする、請求項52に記載のキット。
58. 【請求項５８】 前記標的ポリペプチドがMCM6であるこ
    とを特徴とする、請求項52に記載のキット。
59. 【請求項５９】 前記標的ポリペプチドがMCM7であるこ
    とを特徴とする、請求項52に記載のキット。
60. 【請求項６０】 前記１又は複数の特異的結合メンバー
    が、複数の前記標的ポリペプチドに対するものであるこ
    とを特徴とする、請求項50〜59に記載のキット。