SK5592000A3 - Determination of cellular growth abnormality - Google Patents

Description

Spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke jedinca a kit

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka stanovenia buniek vo vzorke tkaniva, buniek alebo tekutiny s ohľadom na detekciu abnormality bunkového rastu, najmä potenciálnych (alebo skutočných) nádorových buniek. Uskutočnenia predloženého vynálezu sú užitočné najmä na skríning vzoriek ako napríklad sterov krčka maternice od žien, aby sa detegovali tie bunky krčku maternice, ktoré sú abnormálne. Vynález je použiteľný aj na zhodnotenie buniek iných tkanivových vzoriek, ako napríklad vzoriek prsníka, ako je experimentálne demonštrované nižšie. Vzorky, o ktorých sa zistí, že sú abnormálne, môžu byť podrobnejšie preskúmané a ďalej sa môžu skúmať stav buniek v tkanive. Po identifikácii malígneho alebo pred-malígneho stavu môže nasledovať vhodná liečba a následné rozsiahlejšie diagnostické postupy.

Doterajší stav techniky

Predložený vynález je založený na prekvapujúcom zistení, že na detekciu abnormálnych buniek môžu byť použité špecifické väzobné molekuly nasmerované proti konkrétnym proteínom pred-iniciačného komplexu DNA replikácie. Výnimočne užitočné sú v predloženom vynáleze väzobné molekuly nasmerované proti Cdc6. Výnimočne užitočné sú aj väzobné molekuly nasmerované proti MCM proteínom, najmä MCM5. Tu zahrnuté experimentálne dôkazy ukazujú, že špecifické väzobné molekuly nasmerované proti Cdc6, a aj molekuly nasmerované proti MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 alebo MCM7 sú oveľa účinnejšie pri označovaní abnormalít bunkového rastu v tkanivových vzorkách ako protilátky proti PCNA a Ki67. A priori by sa dalo očakávať, že Cdc6 a MCM's poskytnú podobné výsledky ako Ki67 a PCNA, keďže všetky tieto proteíny môžu byť považované za „proliferačné markery“. Na vzorkách z krčku maternice, ktoré sa podrobili antigénovému prehľadávaniu (sterilizácia alebo autoklávovanie), nižšie uvedené výsledky experimentov ukázali,

-2že pre všetky tieto proteíny sú získané výsledky podobné, ale existuje jasný rozdiel medzi stermi z krčku maternice a zamrazenými vzorkami. Takéto vzorky, ktoré sú primárne zaujímavé z hľadiska skríningových účelov, nie sú dostatočne veľké, aby sa sterilizovali. Vo vzťahu ku skríningu sú zaujímavé najmä veľmi silné a jasné výsledky získané zhodnotením vzoriek krčka maternice použitím anti-Cdc6 alebo anti-MCM väzobných molekúl, vysoká úroveň farbenia abnormálnych buniek a farbenie v celej hrúbke v LSIL vzorkách. Z toho vyplýva užitočnosť zhodnocovania sterových vzoriek odobratých z epiteliálneho povrchu krčka maternice - a naozaj sú tu nižšie overené experimentálne. Farbenie v celej hrúbke je viditeľné aj v HSIL vzorkách.

Experimentálne stanovenie abnormality v tkanive prsníka, v moči, v krvi a v sére potvrdilo všeobecnosť uskutočnení podľa vynálezu. Ďaiší dôkaz je poskytnutý použitím rovnakých protilátok na detekciu prítomnosti dysplastických alebo neoplastických buniek v telesných tekutinách biochemickými metódami, ktoré môžu byť automatizované. Tu uvedené príklady zahŕňajú detekciu rakoviny mechúra analýzou moču a detekciu leukémie a lymfómu analýzou krvi. Vhodnou metódou na takúto analýzu je disociáciu zosilňujúci lantanidový fluorescenčný imunotest, DELFIA (Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorescence Immunoassay). Zahrnuté je aj demonštrovanie detekcie prípadov sarkómu a karcinómu prostredníctvom DELFIA v krvi.

Epitel krčka maternice je v podstate zložený z dvoch odlišných typov buniek: so šupinového epitelu a so stĺpcového epitelu, pričom každý z týchto epitelov sa nachádza v anatomicky odlišnej oblasti tkaniva. Šupinový epitel sa nachádza na vonkajšej strane (ectocervix) otvoru krčku maternice (os), zatiaľ čo stĺpcový epitel vybieha do vnútorného kanála krčku maternice (endocervix). Tieto dva odlišné typy epiteliálnych buniek sa spájajú v blízkosti otvoru krčku maternice, v mieste nazývanom šupinovo-stĺpcové spojenie. Šupinovo-stĺpcové spojenie je klinicky veľmi dôležité, keďže to je oblasť, kde vzniká väčšina malignit. Aby bola diagnostika platná, mali by stery krčka maternice obsahovať bunky z tejto oblasti. Ster by mal obsahovať stĺpcové, ako aj šupinové epitolové bunky, aby bolo isté, že ster je z tejto oblasti.

-3Väčšina rakoviny krčku maternice vzniká v šupinovo-stĺpcovom spojení zo šupinového epitelu, ktorý je viacvrstvovým dynamickým systémom kmeňových buniek, ktoré sa konštantné obnovujú. Samotný kompartment kmeňových buniek sa nachádza vedľa základnej membrány vo vnútri vrstvy základných buniek. Delením kmeňových buniek vznikajú parabazálne, stredné a povrchové bunkové deriváty. Tieto sú bežne definované tak vo vzťahu ku ich charakteristickej morfológii, ako aj vo vzťahu ku ich umiestneniu vo vnútri šupinového epitelu. Prechod z bazálnych buniek, umiestnených v najhlbšej vrstve šupinového epitelu, do povrchových buniek na jeho povrchu je spojený s progresívnou diferenciáciou a s progresívnym ubúdaním proliferácie až pokiaľ nie sú povrchové šupinové epiteliálne bunky na povrchu krčku maternice terminálne diferencované.

Pri dysplázii sa zvyšuje bunková proliferácia a zároveň sa znižuje diferenciácia buniek, keď postupujú cez šupinový epitel. Typicky zahŕňa najprv skríning krčku maternice zhodnotenie sterov odobratých z povrchu epitelu, pričom cytopatológ hľadá abnormability vzorky povrchu, kde je znížená diferenciácia ako výsledok dysplázie.

V neskorom fetálnom štádiu, počas dospievania a v tehotenstve sú stĺpcové bunky v spojení nahradené šupinovým epitelom procesom metaplázie. Metaplastické šupinové bunky, ktoré nahrádzajú stĺpcové bunky sú veľmi citlivé voči karcinogénom. Normálna metaplázia by sa nemala zamieňať s abnormálnou dyspláziou vo vnútri šupinového epitelu a v súvislosti s kontextom skríningu môže byť dôležitá schopnosť rozlišovať medzi metaplastickými a dysplastickými bunkami.

Napriek intenzívnemu a nákladnému národnému skríningovému programu je rakovina krčku maternice ôsmou najbežnejšou malignitou u žien v UK a najbežnejšou malignitou u žien mladších ako 35 rokov (Kampaň výskumu rakoviny, Cancer of the cervix uteri. 1994, CRC: London). V rozvinutom svete je to najbežnejšia malignita a hlavná príčina smrti žien medzi 35 a 45 rokom, s odhadom 437 000 nových prípadov za rok (Kampaň výskumu rakoviny, Cancer - world perspectives,. 1995, CRC: London).

Väčšina prípadov predstavuje karcinóm šupinových buniek (SCC) a je silne asociovaná s infekciou vysoko rizikovými typmi ľudských papillomavírusov, ako 16,18 a 31 (Park, a iný, Cancer, 1995, 76 (10 dod.): str. 1902-1913) Rakovina krčka

-4maternice je vhodná na prevenciu skríningom populácie, keďže zahŕňa dobre definované neinvazívne intraepiteliálne štádiá (Wright a iný, Precancerous lesions of the cervix, in Blaustein's pathology of the female genital tract. R.J. Kurman, Vydáv. 1994, Springer-Verlag: New York. str. 229-278). Šupinové intraepiteliálne abnormality môžu byť klasifikované použitím 3 radových (CIN) alebo 2 radových (Bethesda) systémov. Rôzne histologické abnormality značne korelujú s typom infikujúceho HPV a s DNA ploiditou, klonalitou a s prirodzenou históriou lézie. Podľa klasifikácie Bethesda systémom nízky stupeň šupinových intraepiteliáinych lézií (LSIL), zodpovedajúci CIN1 a HPV infekcia krčku maternice (HPVI) vo všeobecnosti predstavujú produktívne HPV infekcie s relatívne nízkym rizikom progresie do invazívnej choroby (Wright a Kurman. A critical review of the morphological classification Systems of preinvasive lesions of the cervix: the scientific basis for shifting the paradigm, in Papillomavirus reviews: current research on papillomaviruses, C. Lacey, Vydáv. 1996, Leeds University Press: Leeds). Vysoký stupeň šupinových intraepiteliáinych lézií (HSIL), zodpovedajúci CIN2 a CIN3, znamená vyššie riziko progresie ako CIN1 (LSIL), na oba sa pozerá ako na potenciálne prekurzory malignity. Hoci je možné odhadnúť približné riziko malignity pre každú kategóriu epiteliálnej lézie, v súčasnosti nie je možné stanoviť približnú pravdepodobnosť progresie pre individuálny prípad.

V roku 1943 Papanicolau a Trout zaviedli Pap sterový test na detekciu rakoviny krčku maternice u žien. Je to cytologický skríningový test a pravdepodobne je dokázané, že je to najúspešnejší verejný prostriedok na stanovenie zdravotného stavu zavedený na prevenciu rakoviny. V niektorých krajinách sa potvrdilo sa, že masové skríningové programy, v ktorých sú ženám robené testy sterov krčku maternice najmenej raz za každé tri až päť rokov, ako veľmi účinné pri znižovaní hodnôt úmrtnosti a chorobnosti v prípadoch rakoviny krčka maternice. Napríklad v Britskej Kolumbii a vo Fínsku znížil organizovaný skríning úmrtnosť na rakovinu krčku maternice o 70 %. Ak sa rakovina krčka maternice deteguje skoro, je ju možné jednoducho liečiť.

Napriek týmto úspechom je skutočná celosvetová situácia deprimujúca. Zo stoviek tisíc žien, u ktorých sa každoročne vyvinie rakovina krčku maternice, viac ako 50 % zomrie na túto chorobu. Sedemdesiat päť percent zo všetkých týchto žien

-5bude v rozvojovom svete, kde kvôli finančným prekážkam nie sú aplikovateľné masové skríningové programy s použitím dostupných metodológií. Aj v mnohých rozvinutých krajinách bol pokles ochorenia v poslednej dekáde nevýznamný, pričom vplyv cytologického skríningu bol oveľa menší ako sa očakávalo. Navyše experti pozorovali podstatný podiel prípadov invazívnej rakoviny krčku maternice u pacientiek, ktoré boli pravidelne skrínované, najmä u mladých žien.

Hlavnými dôvodmi, prečo cytologický skríning niekedy zlyhá pri detekcii rakoviny krčku maternice, sú veľké intervaly medzi testami a aj vysoký počet falošne negatívnych výsledkov (10 až 30 %) (Pap Cytology screening: Most of the benefits reaped? WHO a EUROGIN vydáva správu o kontrole rakoviny krčku maternice. Press Release WHO/25, marec 1997).

Vysoký počet falošne negatívnych výsledkov odráža skutočnosť, že interpretácia Pap sterov je jedným z najťažších morfologických úkonov. Výsledky Pap steru sú ťažšie interpretovateľné ako výsledky odsatia s tenkou ihlou, cytologického testovania telesných tekutín alebo biopsií, kvôli zložitosti a variabilite populácie zmiešaných buniek, ktorá sa nachádza v stere a kvôli širokému rozsahu zápalových a opravných procesov, ktoré nastávajú v krčku maternice. V bunkovej populácii sa vyskytujú aj cyklické zmeny, zmeny indukované tehotenstvom a zmeny, ktoré nastávajú v období po menopauze. Pretože gynekologická cytológia je taká zložitá, je obdobie školenia cytotechnológov veľmi dlhé; vyžaduje si vzdelaného študenta a vysoký stupeň disciplíny a zručnosť v rozoznávaní vzorov. Aj po ukončení zodpovedajúceho školiaceho programu potrebujú cytotechnológovia niekoľko rokov praktických skúseností predtým, ako môžu presne posúdiť či je výsledok Pap steru normálny alebo abnormálny. Podobne, hoci patológovia môžu byť školení na interpretáciu histologických rezov, potrebujú ďalšie špecializované školenie v cytopatológii, aby získali adekvátne schopnosti na organizáciu a vedenie cytologického laboratória a na uskutočňovanie príslušných diagnóz, ktoré sa týkajú abnormálnych sterov.

Dvomi hlavnými problémami spojenými s Pap skríningovými programami sú zjavne nevylúčiteľné falošne negatívne výsledky (10 až 30 %) a relatívne vysoké náklady na skríning. Preto sa teraz zvažujú alternatívne prístupy na skríning krčku maternice. Najbežnejšie diskutovanými návrhmi sú použitie HPV DNA testovania a

-6typovania ako primárnej skríningovej modality alebo ako dodatku ku Pap sterom a použitie nástrojov, ktoré môžu automaticky skrínovať bežne odoberané Pap stery, čím sa zníži potreba relatívne vysoko platených cytotechnológov a cytopatológov (Richart, Cancer Supplement, 1995, 76(10): 1919-1927; Birdsong, Human Pathology, 1996, 27(5): 468-481).

Predchádzajúca metóda ostáva problematická. Pri použití in situ metód pre HPV sú problémy s citlivosťou a s predpokladanou pozitívnou hodnotou. Použitie PCR na HPV DNA detekciu deteguje tak vysoký podiel HPV infekcie vo všeobecnej populácii, že použitie HPV DNA testovania na klinický skríning sa považuje za otázne.

Druhý prístup zahŕňa automatizáciu. Množstvo spoločností v súčasnosti vyvíja a predáva automatizované skríningové zariadenia. Vo všeobecnosti takéto zariadenia využívajú video skener s vysokou rozlišovacou schopnosťou na zachytenie obrazov, ktoré sa potom digitalizujú a analyzujú sériou algoritmov a údaje potom prechádzajú cez interferenčnú sieť, prostredníctvom ktorej bolo zariadenie trénované na rozoznávanie medzi normálnymi a abnormálnymi bunkovými zložkami. Dúfa sa, že s ďalším rozvojom softwaru a hardwaru bude môcť byť automatický skríning braný do úvahy na primárny skríning, hoci v tomto čase US FDA neschválil používanie žiadneho zariadenia na predbežný alebo nezávislý skríning Pap sterov. To, že spoločnosti sú pripravené značne investovať do takéhoto nákladného a zložitého prístupu v snahe prekonať problémy bežného testovania Pap sterov ilustruje vážnosť týchto problémov a úprimnú potrebu riešenia.

Stanovenie bunkových proliferačných markerov v minulosti neposkytlo žiadne takéto riešenia a odborníci v oblasti boli skeptickí v tom, že proliferačné markery poskytnú užitočné klinické informácie (Halí a Coates, Histopathology, 1995, 26:105112). Verí sa, že meracie parametre bunkovej proliferácie poskytnú objektívne informácie o nádoroch, ale napriek množstvu štúdií je len málo priamych dôkazov, že použitie bunkových proliferačných markerov, ako PCNA, Ki67 atď. predstavuje skutočné zlepšenie bežného, optimálne použitého, histologického stanovenia. Niekoľko štúdií sa zaoberalo aj kritickým problémom relatívnej hodnoty

-7proliferačných markerov v porovnaní so štandardným histopatologickým stupňovaním a určovaním štádií.

Pokusy použiť imunocytochemické alebo imunofluorescenčné farbenie s automatizovaným skríningom krčku maternice boli limitované nešpecifickým farbením normálnych buniek. Napríklad sa ukázalo, že epiteliálny membránový antigén (EMA) farbí neoplastické bunky z krčku maternice s CIN, ale bolo publikované aj farbenie niektorých metaplastických buniek z normálneho krčku maternice. Preto, hoci je dostupná technológia na meranie imunohistologického farbenia, v tomto čase žiadny zo strojov na automatický skríníng, ktoré sú na trhu alebo v pokročilom štádiu vývoja, nepoužíva imunohistochémiu.

Najširšie študovanými markermi proliferácie sú Ki67, protein s neznámou funkciou, a PCNA (jadrový antigén proliferujúcich buniek) (Yu a Filipe, Histochemical Journal, 1993, 25: 843-853). PCNA sa podieľa na predlžovaní pri DNA replikácii a na mechanizme DNA opravy. Preto je prítomný počas prebiehajúcej DNA syntézy replikáciou alebo počas opravy.

Pôvodcovia predloženého vynálezu študovali proteíny, ktoré sa zúčastňujú na skoršom iniciačnom štádiu DNA replikácie. Týmito sú Cdc6 a proteíny MCM2-7 rodiny (MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7). Willliams a iný (1997) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:142-147) publikovali, že ľudské HeLa bunky v kultúre exprimujú Cdc6 počas proliferačných bunkových cyklov, ale že WI38 ľudské diploidné fibroblasty zastavia expresiu Cdc6, keď sa stlmia vyhladovaním cez sérum. Tu je ukázané, že tieto pozorovania sú rozšírené na iné bunkové línie a iné druhy. MCMs sa nachádzajú v G1 fáze jadra (pred DNA syntézou) a progresívne sa premiestňujú z chromatínu do rozpustnej nukleoplazmy počas syntézy DNA. Je tu ukázané, že chýbajú v chromatíne aj v pokojovom štádiu. Demonštruje sa tu tiež, že MCM5 nie je prítomný v diferencovaných bunkách krčku maternice a prsníkov.

Na základe týchto skutočností známych z doterajšieho stavu techniky by sa očakávalo, že MCMs alebo Cdc6 antiséra napodobňujú distribúcie PCNA alebo Ki67. Ďalší dôkaz pre takéto očakávanie pochádza od Hiraiwa a iných (Int. J. Cancer, 1997, 74: 180-184), ktorí zistili podobné imunofarbiace charakteristiky pre PCNA a MCM7 (hCD47) v niekoľkých ľudských tkanivách a v troch typoch ľudských nádorov.

-8Pôvodcovia predloženého vynálezu však prekvapujúco zistili dramatické odlišnosti v potenciálnych diagnostických hodnotách MCMs a Cdc6 v porovnaní s PCNA a Ki67.

Pôvodcovia testovali antiséra proti ľudskému MCM proteínu a ľudskému Cdc6 na cytológiu krčku maternice. Študovali rezy normálnych a chorých ľudských krčkov maternice a stery krčku maternice. Porovnali výsledky s výsledkami získanými použitím PCNA a Ki67. Cdc6 protilátky alebo MCM (napr. MCM5) protilátky detegovali LSIL (HPVI/CIN 1) lézie v krčku účinnejšie ako protilátky proti PCNA alebo Ki67. Navyše, v podstate všetky bunky LSIL (HPVI/CIN 1) alebo HSIL (HPVI/CIN 2/3) lézií boli farbené. To je v rozpore s farbením inými proliferačnými markermi, ako napríklad PCNA. Z toho vyplýva, že špecifické väzobné molekuly nasmerované na proteíny pred-iniciačného komplexu DNA replikácie, najmä Cdc6 alebo MCM proteíny (ako MCM5, ale tu ilustrované aj MCM2, MCM3, MCM4, MCM6 a MCM7) majú výnimočnú diagnostickú hodnotu na skorú detekciu atypických alebo neoplastických buniek. Na vzorkách krčku maternice, ktoré sa podrobili vyhľadávaniu antigénu (sterilizácia alebo autoklávovanie), a ktoré sa fixovali formalínom a zabalili sa parafínom, dávali anti-Cdc6 a anti-MCM protilátky podobné vzory farbenia ako vzory získané s PCNA, ale zrejmé boli oveľa lepšie výsledky na steroch, čerstvých a mrazených vzorkách.

Takže predložený vynález sa vo všeobecnosti týka rôznych uskutočnení spôsobov a prostriedkov na detekciu konkrétneho cieľového polypeptidu alebo mRNA kódujúcej cieľový proteín, v tkanivách, tekutinách alebo bunkách jedinca, zvyčajne vo vzorke odobratej z tela.

Cieľové polypeptidy podľa predloženého vynálezu ako Cdc6 a MCM proteíny, ako MCM5, sa môžu odlíšiť od iných bunkových proliferačných markerov, ktoré nie sú užitočné v predloženom vynáleze, tým, že sú zahrnuté v pred-iniciačnom komplexe DNA replikácie. Môžu byť odlíšené tým, že odchádzajú z chromatínu počas pokojového štádia a diferenciácie. Napríklad ORC2 (Gavin a iný, 1995, Science 270, 1667-1671), ktorý nie je cieľom na použitie v predloženom vynáleze, sa môže od proteínov ako Cdc6 a MCM5 odlíšiť tým, že ostáva naviazaný na chromatín v pokojových bunkách. Orc2 nie je tlmený v pokojových bunkách, hoci iné zložky ORC komplexu, ako Orc1, sa môžu správať odlišne. Cdc6 je v pokojovom

-9štádiu a počas diferenciácie rýchlo tlmený. Kultivované bunky zastavené v GO len na 48 hodín neobsahujú žiadny detegovateľný Cdc6 proteín. Cdc6 nie je detegovateľný v bunkách zastavených in vitro na dlhšie časové obdobie alebo v ex vivo diferencovaných bunkách. Bunky zastavené in vitro sérovým hladovaním alebo kontaktnou inhibíciou strácajú na chromatín naviazané MCMs (po niekoľkých dňoch), hoci celková hladina MCMs v bunkách významne neklesá najmenej 14 dní. Bunky, ktoré sa diferencujú in vitro (napr. HL-60 bunky indukované k diferenciácii s DMSO alebo TPA), tlmia MCM3, ale netlmia Orc2 (Musahl, Aussois Meeting on DNA Replication, Aussois, France June 1997). Diferencované bunky z tkanív ex vivo neexprimujú MCM proteíny ako MCM2 a MCM5. Šesť MCM proteínov MCM2MCM-7 vytvára multiproteínový komplex, ktorý sa rozdeľuje na dva subkomplexy: MCM3 a MCM5 dimér; MCM2-4-6-7 tetramér. MCM3 a MCM5 môžu odchádzať z chromatínu počas S fázy oveľa pomalšie ako MCM2-4-6-7 (Kubota et al., 1997, EMBO J. 16, 3320-3331). MCMs sú na chromatín naviazané v G1, odchádzajú počas S fázy a sú v jadre, ale nie sú naviazané na chromatín v G2. Cdc6 sa správa podobne v kvasinkách, hoci okrem odchodu z chromatínu je aj degradovaný, hladiny proteínu sa dramaticky znižujú pri G1/S prechode. Podľa predloženého vynálezu môžu byť zahrnuté ďalšie zložky pred-iniciačného komplexu DNA replikácie. Príklady zahŕňajú ľudské homológy kvasinkových zložiek, ako Cdc7 proteín kináza (Chapman a Johnston, Exp. Celí Res., 1989,180 419-428 (kvasinky), Sao a iný, 1997, EMBO J., 16, 4340-4351 (ľudský - tlmený v pokojovom štádiu), Dbf4, regulačná podjednotka Cdc7 proteín kinázy (Jackson et al., 1993, Mol. Celí Biol. 13 2899-2908 (kvasinky), Masai et al., Cold Spring Harbor Meeting on Eukaryotic DNA Replication, 3-7. september 1997 (ľudský)), Cdc14 proteín fosfatáza (Hogan a Koshland PNAS USA, 1992, 89, 3098-3102 (kvasinky)), Cdc45, ktorý je spojený s MCMs a má rovnaký fenotyp (Zou a iný, Mol. Celí. Biol., 1997,17, 553-563 (kvasinky), Takisawa a iný, Cold Spring Harbor Meeting On Eukaryotic DNA Replication, 3-7 september 1997 (Xenopus)), MCM10, ktorý sa spája s MCMs a má podobný fenotyp (Merchant a iný, 1997, Mol. Celí Biol. 17 3261-3271). Cieľovými polypeptidmi podľa predloženého vynálezu môžu byť akékoľvek zložky DNA pred-replikačného komplexu, zložky replikačne kompetentného chromatínu, zložky podieľajúce sa na obmedzení DNA replikácie na jeden krát za bunkový

-10cyklus, zložky replikačnej licencie podieľajúce sa na povolení chromatínu pre jedno kolo DNA replikácie a zložky zostavené v počiatkoch replikácie pred iniciáciou DNA replikácie.

Aminokyselinová sekvencia ľudského Cdc6 je opísaná vo Williams a iný, 1997, PNAS USA 94: 142-147, GenBank Katalógové č. U77949.

Sekvencia ľudského MCM2 je opísaná v Todorov a iný, 1994, J. Celí Sci., 107, 253-265, GenBank Katalógové č. X67334.

Sekvencia ľudského MCM3 je opísaná v Thommes a iný, 1992, Nucl. Acid Res., 20, 1069-1074, GenBank Katalógové č. P25205.

Sekvencia ľudského MCM4 je opísaná v Ishimi a iný, 1996, J. Biol. Chem., 271, 24115-24122, GenBank Katalógové č. X74794.

Sekvencia ľudského MCM5 je opísaná v Hu a iný, 1993, Nucleic Acids Res., 21, 5289-5293, GenBank Katalógové č. X74795.

Sekvencia ľudského MCM6 je opísaná v Holthoff a iný, 1996, Genomics, 37, 131-134, GenBank Katalógové č. U46838.

Sekvencia ľudského MCM7 je opísaná v Hu a iný, 1993, Nucleic Acids Res., 21, 5289-5293.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke z jedinca, ktorý zahŕňa detegovanie cieľového polypeptidu vo vzorke, pričom cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie; s podmienkou, že ak je cieľovým polypeptidom MCM7, vzorka nie je podrobená vyhľadávaniu antigénu alebo sterilizácii/autoklávovaniu.

Iné uskutočnenie vynálezu zahrnuje spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke krčku maternice od jedinca, ktorý zahŕňa uvedenie vzorky do kontaktu so špecifickým väzobným členom alebo špecifickými väzobnými členmi nasmerovanými proti cieľovému polypeptidu a stanovenie viazania sa špecifického väzobného

-11 člena alebo väzobných členov na vzorku, pričom cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie.

Iné uskutočnenie predloženého vynálezu poskytuje spôsob kategorizácie tkaniva ako (i) normálne alebo (ii) potenciálne alebo skutočne pre-nádorové alebo nádorové, dysplastické alebo neoplastické, pričom spôsob zahŕňa stanovenie viazania špecifického väzobného člena nasmerovaného proti cieľovému polypeptidu, ako bolo diskutované vyššie, vo vzorke tkaniva. Vzor alebo stupeň viazania sa môže byť porovnávaný so vzorom alebo stupňom známym z normálnej vzorky a/alebo známym z abnormálnej vzorky.

Pôvodcami predloženého vynálezu bol nezávisle klonovaný ľudský Cdc6, ako je tu opísané, ale prvé zverejnenie jeho klonovania urobili Williams a iný, ktorých článok (PNAS USA 94:142-147, 1997) poskytuje úplnú aminokyselinovú sekvenciu. Ako je tu experimentálne demonštrované, anti-Cdc6 väzobné molekuly sú veľmi účinné na označovanie abnormalít v rôznych tkanivách najmä vo vzorkách krčku maternice, výhodne v steroch. V porovnaní s týmto, žiadna väzba nenastáva v normálnom tkanive krčku maternice v sterovej vzorke.

Aminokyselinové sekvencia ľudského MCM5 je opísaná v Hu a iný, 1993, Nucleic Acids Res., 21, 5289-5293, GenBank katalóg, č. X74795. Tu uvedený experimentálny dôkaz ukazuje, že väzobné molekuly nasmerované proti nemu, ako Cdc6, sú veľmi účinné na označovanie abnormalít v rôznych tkanivách, najmä vzorkách krčku maternice, výhodne v steroch. Získanie protilátok proti MCM5 s vysokou afinitou sa zdá byť jednoduchšie ako pre Cdc6, čo môže odrážať vyššiu antigénnosť.

Ďalší, tu zahrnutý experimentálny dôkaz ukazuje, že väzobné molekuly nasmerované proti MCM2, proti MCM3, proti MCM4, proti MCM6 alebo proti MCM7 sú tiež účinné na označovanie abnormalít vo vzorkách tkaniva, ako napríklad sterov krčku maternice. Zistilo sa, že anti-MCM5 protilátky poskytujú silnejší farebný vzor ako anti-MCM2 a anti-MCM7 protilátky, tak celkovo, ako aj v množstve buniek. Zistilo sa, že anti-Cdc6 protilátky poskytujú podobný vzor farbenia ako anti-MCM5.

Takže viazanie sa (napr.) anti-Cdc6 alebo anti-MCM špecifického väzobného člena na vzorku umožňuje kategorizáciu tkaniva, podľa ktorej je vzorka stanovená ako abnormálna, potenciálne alebo skutočne pred-nádorová alebo nádorová,

- 12dysplastická alebo neoplastická. Podľa súčasnej praxe, pri získaní pozitívneho výsledku použitím Pap testu, je možné pozitívne testovaných jedincov ďalej skúmať, napríklad prostredníctvom bioptického testovania a/alebo opakovaným skríningom. Je celkom bežné, že výsledkom pred-nádorového potenciálu nie je skutočné nádorové štádium. Typicky sa používa šesťmesačný skríning na sledovanie progresie alebo regresie dyspiázie, aby sa umožnila príslušná a vhodne načasovaná terapeutická intervencia, ak je to potrebné.

Ak sa tkanivo kategorizuje ako potenciálne alebo skutočne pred-nádorové alebo nádorové na základe detekcie abnormality vo vzorke tkaniva podľa predloženého vynálezu, budú vyžiadané príslušné diagnostické a/alebo klinické postupnosti. Treba poznamenať, že vynález nie je obmedzený na detekciu abnormality bunkového rastu, ktorá je nevyhnutne pred-nádorová alebo nádorová. Môžu byť detegované iné poruchy bunkovej proliferácie ako je demonštrované príkladmi uvedenými nižšie, vrátane psoriázy (pozri príklad 24 nižšie) a zápalovej choroby vnútorností, ako napríklad vredovej kolitídy a Crohnovej choroby (príklady 33 a 34). Okrem toho, že zápalové choroby vnútorností sú poruchami bunkovej proliferácie, môžu byť prekurzormi rakovinového stavu, hoci nie u všetkých pacientoch, takže ich detekcia prostredníctvom predloženého vynálezu môže byť použitá na poskytnutie hodnotných výsledkov na bližšie štúdium následnosti. Pri zápalovom ochorení vnútorností môže nastať odlupovanie buniek čreva a vnútorností, čo umožňuje, aby sa uskutočnila analýza vzoriek fekálií, a prípravu buniek z týchto vzoriek. Nižšie uvedený príklad 32 opisuje farbenie fekálnych sterov pripravených izolovaním buniek z fekálií.

Predložený vynález môže byť použitý na predbežný skríning vzoriek pred ďalšou analýzou. Predložený vynález môže byť použitý na skríning alebo analýzu vzoriek predtým testovaných použitím dostupnej techniky, ako Pap sterovým testom alebo ThinPrep 2000 testom. Nižšie uvedené experimenty tiež ukazujú, že Pap kmeňová analýza a analýza podľa predloženého vynálezu, s použitím príslušnej protilátky, sa môžu uskutočňovať na rovnakých prípravkoch. Takže stery krčka maternice môžu byť napríklad testované použitím tak bežného Pap sterového testu, ako aj testu podľa predloženého vynálezu.

- 13Ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu poskytuje spôsob označovania abnormálnych buniek vo vnútri tkanivovej vzorky, ktorý zahŕňa uvedenie vzorky do kontaktu so špecifickým väzobným členom nasmerovaným proti cieľovému polypeptidu, ako Cdc6, MCM5 alebo inému MCM, ako bolo diskutované, v podmienkach, pri ktorých sa špecifický väzobný člen viaže na abnormálne proliferujúce bunky a nie na normálne bunky. To či sa špecifický väzobný člen viaže alebo nie na vzorku, sa môže stanoviť na určenie prítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek vo vzorke.

V ďalšom uskutočnení predložený vynález poskytuje použitie špecifického väzobného člena nasmerovaného proti cieľovému polypeptidu, ako bolo diskutované, na determináciu, stanovenie alebo diagnostiku prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálnej bunkovej proliferácie, abnormalít bunkového rastu, dysplázie, neoplázie alebo potenciálne alebo skutočne pred-nádorového alebo nádorového štádia v tkanive alebo vo vzorke tkaniva.

Špecifické väzobné molekuly môžu byť poskytnuté v kite, ktorý môže obsahovať inštrukcie na použitie podľa predloženého vynálezu. Takéto kity sú poskytnuté ako ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu. Môže byť zahrnuté jedno alebo viac iných reakčných činidiel, ako napríklad značkovacie molekuly atď. (pozri nižšie). Reakčné činidlá môžu byť umiestnené vo vnútri nádob, ktoré ich chránia pred vonkajším prostredím, ako napríklad utesnené liekovky. Kit môže obsahovať jeden alebo viacero materiálov na odobratie samotnej testovacej vzorky v závislosti na sledovanom tkanive napr. vata na špajli na odobratie buniek z bukálnej dutiny, striekačku na odobratie vzorky krvi, špachtla na odobratie steru krčka maternice, nástroj na biopsiu atď. (takéto komponenty sú vo všeobecnosti sterilné). Kit môže obsahovať ktorýkoľvek, ktorúkoľvek kombináciu alebo všetky z nasledujúcich: blokovacie činidlá na zníženie nešpecifického farbenia, uskladňovací tlmivý roztok na zachovanie aktivity väzobných molekúl počas skladovania, farbiaci tlmivý roztok a/alebo premývací tlmivý roztok na použitie počas protilátkového farbenia, pozitívnu kontrolu, negatívnu kontrolu atď. Pozitívna a negatívna kontrola môžu byť použité na zhodnotenie aktivity a správneho využitia použitých reakčných činidiel, môžu byť poskytnuté v kite, v súlade s predloženým vynálezom. Kontroly môžu obsahovať vzorky, ako napríklad rezy tkaniva, bunky fixované na krycích

- 14sklíčkach atď., o ktorých je známe, že sú buď pozitívne, alebo negatívne na prítomnosť cieľa, ako Cdc6 alebo MCM5. Návrh a použitie kontrol je štandardný a spadá do rutinných schopností priemerných odborníkov v oblasti.

Vzorky môžu byť odobraté z tela použitím akýchkoľvek bežných prostriedkov alebo techník. Na skríning krčku maternice môžu byť použité štandardné sterové vzorky. Alternatívne môže byť použitá ThinPrep 2000 technológia (Cytec Corp, Boxboorugh, Mass., USA). Toto bolo potvrdené US FDA ako zámena bežnej metódy prípravy Pap steru. Vzorka sa odoberá do kvapalného média namiesto stierania buniek na sklenené sklíčko. Automatizovaný procesor (ThinPrep 2000 zariadenie) je potom použitý na zozbieranie buniek z kvapaliny a ich uloženie do tenkej vrstvy na sklenené sklíčko na analýzu. Na odohranie endoteliálnych buniek napr. z krčku maternice alebo z bukálnej dutiny môže byť použitá špachtla alebo vata na špachtli. Vzorky krvi alebo tekutiny môžu byť odobraté použitím striekačky alebo ihly. Vzorky iných tkanív môžu byť odobraté biopsiou alebo tkanivovým rezom.

Vo výhodných uskutočneniach sa vzorky nepodrobia vyhľadávaniu antigénu alebo sterilizácii/autoklávovaniu. Antigénové vyhľadávanie bolo pre priemerných odborníkov v oblasti dlho štandardným. Hiraiwa a iný sa odvolávajú na Shin a iných (1991) Lab. Invest. 64, 693-702, ktorý poskytujú príkladný prístup. Vzorky môžu byť čerstvé alebo zmrazené ale vo všeobecnosti nie sú fixované formalínom alebo obalené parafínom. Ako bolo diskutované, v najvýhodnejšom uskutočnení je vzorkou ster krčku maternice. Stery krčku maternice nie sú dostatočne robustné na to, aby sa sterilizovali. Navyše ošetrenie vyhľadávaním antigénu nie je vo všeobecnosti dostatočne vodivé na skríning, kde sa vyžaduje vysoká výkonnosť.

Tu uvedené experimentálne príklady uskutočnení podľa predloženého vynálezu demonštrujú aplikovateľnosť na kŕčok maternice, vrátane testovaných sterov krčka maternice, na prsníkové, malignity a malignity močového traktu (testované tak na bioptických tkanivových vzorkách, ako aj na cytologických steroch moču), na malignity hrubého čreva, pľúc, močového mechúra, pokožky, hrtana, ezofágu, priedušnice, lymfatických uzlín a hematologických malignít, ako aj na krv a sérum na dokázanie metastatického sarkómu a karcinómu. Predložený vynález môže byf ďalej použitý na stanovenie pred-malígnych abnormalít sekrečných

-15epiteliálnych buniek krčku maternice (žľazová intra-epiteliálna neoplázia, GIN) alebo pred-malígnych abnormalít v iných tkanivách. Výnimočne vhodné môže byť použitie na cytologické alebo biochemické zhodnotenie iných klinických vzoriek, v ktorých môže byť detekcia neoplastických buniek alebo ich odlišností od buniek, vykazujúcich reaktívne zmeny, veľmi ťažká. Takéto vzorky zahŕňajú sputum, vzorky bronchio-alveolárneho výplachu, moč a stery tráviaceho traktu (zahŕňajúc ezofágus, žalúdok a pankreas, tak žlčovod, ako aj pankreatický kanál). Predložený vynález môže byť použitý na histologické alebo biologické zhodnotenie tkaniva, kde stanovenie proliferácie môže umožniť presnejšiu predpoveď klinického výstupu, a/alebo racionálnejší výber terapie. Vzorky môžu obsahovať malignity žľazových buniek (napr. pľúc, prsníka, hrubého čreva, prostaty, žalúdka), šupinatých buniek (napr. pľúc, pokožky, ezofágu) alebo iných epiteliálnych bunkových typov (napr. močového mechúra, močovodu, obličky, vaječníka).

Vysoký stupeň špecificity pozorovaný v nižšie opísaných experimentoch s anti-Cdc6 protilátkami a anti-MCM protilátkami, vrátane anti-MCM2, anti-MCM3, anti-MCM4, anti-MCM5, anti-MCM6 a anti-MCM7 protilátok, ktoré boli testované na rade rakovín prsníka, poskytuje imunocytologické a biochemické prístupy na diagnostiku rakoviny prsníka. To môže byť použité na vzorky biopsie prsníka alebo na vzorky odsané tenkou ihlou (FNA) alebo na vzorky tekutiny z mliečnych žliaz, čo umožňuje použitie na skríningové programy.

Vzorky, ktoré sa majú uviesť do kontaktu s väzobným členom, v súlade s rôznymi uskutočneniami predloženého vynálezu, môžu byť pripravené použitím akejkoľvek dostupnej techniky, ktorá umožňuje naviazanie špecifickej väzobnej molekuly na cieľový polypeptid, ako napríklad Cdc6, MCM5 alebo iné MCM ako bolo diskutované, stanovenie hladín nukleovej kyseliny, enzymatickej aktivity atď., podľa rôznych uskutočnení predloženého vynálezu. Rôzne techniky sú štandardné v oblasti, napr. (pre molekuly ako protilátky viažuci cieľový polypeptid) ako sú techniky používané na fixovanie buniek na Pap test.

Reaktivita väzobného člena, ako napríklad protilátky, môže byť v normálnej alebo testovanej vzorke stanovená akýmkoľvek vhodným prostriedkom. Pripevnenie príveskov s jednotlivými reportérovými molekulami je jednou možnosťou.

Reporterové molekuly môžu priamo alebo nepriamo generovať detekovateľné a

-16výhodne merateľné signály. Pripojenie reportérových molekúl môže byť priame alebo nepriame, kovalentné, napr. cez peptidovú väzbu alebo nekovalentné. Spojenie prostredníctvom peptidovej väzby môže byť výsledkom rekombinantnej expresie génovej fúzie kódujúcej väzobnú molekulu (napr. protilátku) a reporterovú molekulu.

Jedným uprednostňovaným spôsobom je kovalentné spojenie každého väzobného člena s jednotlivým fluorochrómom, fosforom alebo laserovou farbičkou so spektrálne izolovanou absorpciou alebo s emisnými vlastnosťami. Vhodné fluorochrómy zahŕňajú fluoresceín, rodamín, fýkoerytrín a Texaskú červeň. Vhodné chromogenické farbičky zahŕňajú diaminobenzidín.

Iné reporterové molekuly zahŕňajú makromolekulové koloidálne častice alebo časticový materiál, ako latexové guličky, ktoré sú kolorované, magnetické alebo paramagnetické, a biologicky alebo chemicky účinné činidlá, ktoré môžu priamo alebo nepriamo zapríčiniť detegovatefné signály, ktoré sa dajú vizuálne pozorovať, elektronicky detegovať alebo inak zaznamenať. Tieto molekuly môžu byť enzýmy, ktoré katalyzujú reakcie, ktoré vyvíjajú alebo menia farby alebo napríklad spôsobujú zmeny elektrických vlastností. Môžu byť molekulárne excitabilé, takže výsledkom elektronickej tranzície medzi dvoma energetickýmistavmi sú charakteristické spektrálne absorpcie alebo emisie. Môžu zahŕňať chemické entity používané na konjunkciu s biosenzormi. Môžu byť použité biotín/avidínový alebo biotín/streptavidinový a alkalický fosfatázový detekčný systém. Ďalšími príkladmi sú chrenová peroxidáza a chemiluminiscencia.

Spôsob stanovenia väzby nie je znakom predloženého vynálezu a odborníci v oblasti sú schopní vybrať vhodný spôsob podľa ich preferencií a všeobecných znalostí.

V nižšie opísaných experimentoch bola použitá chrenová peroxidáza. Ďalšie experimenty sa uskutočnili použitím alkalickej fosfatázy, pričom sa dosiahli podobné výsledky (napríklad so stermi krčku maternice). Alkalická fosfatáza môže byť citlivejším detekčným systémom ako chrenová peroxidáza, ale vyvinutá farba je menej kompatibilná s PAP farbením.

Nižšie je uvedený jeden protokol na protilátkové farbenie sterov krčku maternice, ktorý bol použitý v uskutočneniach podľa vynálezu.

-171. Fixovať čerstvý ster 5 minút v zmesi acetón:metanol v pomere 50:50. (Alternatívnym východiskovým bodom, ak je ster predtým fixovaný s Cytofixom alkoholovým a voskovým ošetrením, ktoré je štandardne používané v UK na ošetrenie vzoriek sterov pri odobratí, na umožnenie bezpečného transportu do skríningového centra - je odstrániť Cytofix lúhovaním v metylovaných alkoholoch počas 10 minút. Ak bol ster pokrytý akoukoľvek inou ochrannou vrstvou, môže byť použitý akýkoľvek vhodný postup na vystavenie vzorky farbeniu protilátkou).

2. Premývať v Tris tlmenom fýziologickom roztoku (TBS) 5 minút.

3. Premývať za účelom permeabilizácie v 4mM deoxycholáte sodnom v TBS 15 minút.

4. Premývať v TBS s 0,3% Tritónom X100 5 minút.

5. Opakovať krok 4.

6. Premývať v TBS s 0,025% Tritónom X100 5 minút.

7. Odsať prebytočnú kvapalinu bez toho, aby sa mohlo tkanivo vysušiť.

8. Preniesť podložné sklíčka do vlhkej komory a umiestniť na každé sklíčko 200 μΙ 10% kozieho sérového reakčného činidla v TBS na minimálne 2 hodiny (alebo cez noc).

9. Odsať prebytočnú kvapalinu bez toho, aby sa mohlo tkanivo vysušiť.

10. Umiestniť 200 μΙ primárnej protilátky nariedenej v TBS s obsahom 0,1% Tritónu a 1% BSA na každé podložné sklíčko a nechať cez noc pri 4 °C na orbitálnej miešačke.

11. Preniesť podložné sklíčka na stojany a premývať v TBS s 0,3% Tritónom X100 5 minút.

12. Premývať v TBS s 0,025% Tritónom X100 5 minút.

13. Opakovať krok 12.

14. Odsať prebytočnú kvapalinu bez toho, aby sa mohlo tkanivo vysušiť.

15. Preniesť podložné sklíčka do vlhkej komory a umiestniť na každé sklíčko 200 μΙ biotinylovanej kozej anti-králičej sekundárnej protilátky (Dáko) v pomere 1:500 v TBS s obsahom 1% BSA počas 1 hodiny.

16. Pokiaľ sú podložné sklíčka v sekundárnej protilátky vyrobiť SABC roztok.

17. Preniesť podložné sklíčka na stojany a premývať v TBS 5 minút.

-1818. Umiestniť podložné sklíčka do endogénneho peroxidázového blokovacieho činidla s 0,6% hydrogénperoxidázou na 10 minút.

19. Premývať v TBS 5 minút.

20. Dvakrát opakovať krok 19.

21. Preniesť podložné sklíčka do vlhkej komory a na každé sklíčko umiestniť 200 μΙ SABC roztoku na 30 minút.

22. Preniesť podložné sklíčka na stojany a premývať s TBS 5 minút.

23. Dvakrát opakovať krok 22.

24. Vyvíjať 10 minút v DAB roztoku.

25. Premývať v tečúcej vode z vodovodu 5 minút.

26. Na 6 sekúnd umiestniť podložné sklíčka do Harrisovho hematoxylínového roztoku.

27. Premývať v tečúcej vode z vodovodu 1 minútu.

28. Diferencovať v 0,5% kyseline chlorovodíkovej 1 až 2 sekundy.

29. Premývať v tečúcej vode z vodovodu 5 minút.

30. Preplachovať v 50% metanole 2 minúty.

31. Preplachovať v 70% metanole 2 minúty.

32. Preplachovať v 90% metanole 2 minúty.

33. Preplachovať v 100% metanole 2 minúty.

34. Na 2 minúty umiestniť do Orange G pracovného roztoku.

35. Preplachovať v 100% metanole 7 sekúnd a jemne premiešavať.

36. Opakovať krok 35.

37. Na 2 minúty umiestniť do EA50 roztoku.

38. Preplachovať v 100% metanole 7 sekúnd a jemne premiešavať.

39. Opakovať krok 38.

40. Umiestniť podložné sklíčka na 5 minút do xylénu kvôli vyčisteniu.

41. Dvakrát opakovať krok 40.

42. Aplikovať krycie sklíčka s použitím DEPEX rámika.

Stery na imunofluorescenciu môžu byť pripravené podobným spôsobom (a aj boli). Po sekundárnej protilátke sa inkubujú v streptavidín FITC-konjugovanej protilátke 1 hodinu a farbia sa kontrastnou farbou na vyfarbenie DNA s propidium

-19jodid/RNAáza A (obe od Sigma v množstve 50 ng/ml), potom sa premývajú a upevnia v glycerol/PBS/fenyléndiamíne.

Výhodné väzobné molekuly na použitie v uskutočneniach predloženého vynálezu zahŕňajú protilátky, prirodzené ligandy pre cieľ, malé molekuly, ktorých cieľom je jeden alebo viacero epitopov na cieli a väzobné domény T-bunkových receptorov.

Protilátky, ktoré sú špecifické pre predmetný cieľ, ako napríklad Cdc6, MCM5 alebo iné MCM, sa môžu získať štandardnými technikami v oblasti. Spôsoby výroby protilátok zahŕňajú imunizáciu cicavca (napr. myši, potkana, králika, koňa, kozy, ovce, opice alebo vtáka, ako napríklad kurčaťa) proteínom alebo jeho fragmentom alebo bunkou alebo vírusom, ktorý exprimuje cieľový proteín alebo jeho fragment. Možná je aj imunizácia s DNA, ktorá kóduje cieľový polypeptid. Protilátky sa môžu z imunizovaných zvierat získať použitím rôznych techník známych v oblasti a skrínovať výhodne použitím viazania sa protilátky na predmetný antigén. Použité môžu byť napríklad Western blotingové techniky alebo imunoprecipitácia (Armitage et el, 1992, Náture 257: 80-82).

Výroba monoklonálnych protilátok je v oblasti dobre zavedená. Monoklonálne protilátky sa môžu podrobiť technikám rekombinantnej DNA technológie na výrobu iných protilátok alebo chimérnych molekúl, ktoré si zachovávajú špecificitu pôvodnej protilátky. Takéto techniky môžu zahŕňať zavedenie DNA kódujúcej imunoglobulínovú variabilnú oblasť, alebo oblasti determinujúce komplementaritu (CDRs) protilátky do konštantných oblastí, alebo konštantných oblastí s hraničnými oblasťami, rôznych imunoglobínov. Pozri napríklad EP 184187A, GB 2188638A alebo EP-A-0239400. Hybridom produkujúci monoklonálnu protilátku sa môže podrobiť genetickej mutácii alebo iným zmenám, ktoré môžu alebo nemusia meniť väzobnú špecificitu produkovaných protilátok.

Ako alternatíva alebo doplnok ku imunizácii cicavca peptidom, sa môže protilátka špecifická pre cieľ získať z rekombinatne vyrobenej knižnice exprimovaných imunoglobínových variabilných domén, napr. použitím lambda bakteriofágu alebo vláknitého bakteriofágu, ktoré nesú na svojom povrchu funkčné imunoglobínové väzobné domény, pozri napríklad W092/01047. Knižnica môže byť naivná, ktorá je konštruovaná zo sekvencií získaných z organizmu, ktorý nebol

-20imunizovaný cieľom, alebo môže byť konštruovaná použitím sekvencii získaných z organizmu, ktorý bol vystavený predmetnému antigénu (alebo jeho fragmentu).

Protilátky sa môžu modifikovať mnohými spôsobmi. V skutočnosti, ak z kontextu nevyplýva niečo iné, má byť výraz protilátka považovaný za taký, ktorý pokrýva akúkoľvek špecifickú väzobnú látku, ktorá má protilátkovú antigénovú väzbovú doménu. Takže to pokrýva protilátkové fragmenty, deriváty a funkčné ekvivalenty, vrátane akéhokoľvek polypeptidu, ktorý obsahuje imunoglobínovú väzobnú doménu, či už prirodzeného alebo syntetického. Zahrnuté sú aj chimérne molekuly, ktoré obsahujú imunoglobínovú väzobnú doménu alebo ekvivalent, fúzovaný s iným polypeptidom. Klonovanie a expresia chimérnych protilátok sú opísané v EP-A-0120694 a EP-A-0125023.

Ukázalo sa, že funkcia viazania antigénov sa môže uskutočňovať fragmentmi celej protilátky. Príkladom väzobných fragmentov sú (i) Fab fragment pozostávajúci z VL, VH, CL a CH1 domén; (ii) Fd fragment pozostávajúci z VH a CH1 domén; (iii) Fv fragment pozostávajúci z VL a VH domén jednej protilátky; (iv) dAb fragment (Ward, E.S. et al., Náture 341, 544-546 (1989)), ktorý pozostáva z VH domény; (v) izolované CDR oblasti; (vi) F(ab')2 fragmenty, bivalentný fragment obsahujúci dva spojené Fab fragmenty (vii) jednoreťazcové Fv molekuly (scFv), v ktorých sú VH doména a VL doména spojené peptidovým spojovníkom, ktorý umožňuje spojenie dvoch domén tak, že vytvárajú antigén viažuce miesto (Bird a iný, Science, 242, 423-426, 1988; Huston a iný, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) bišpecifické jednoreťazcové Fv diméry (PCT/US92/09965) a (ix) diabody, multivalentné alebo multišpecifické fragmenty konštruované génovou fúziou (WO94/13804; P. Holliger a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448,1993).

Rekombinantná expresia polypeptidov, vrátane protilátok a fragmentov protilátok, je v oblasti dobre známa.

Systémy klonovania a expresie polypeptidu v rozličných odlišných hostiteľských bunkách sú dobre známe. Vhodné hostiteľské bunky zahŕňajú baktérie, cicavčie bunky, kvasinky a bakulovírusové systémy. Cicavčie bunkové línie dostupné v oblasti na expresiu heteroiógneho polypeptidu zahŕňajú vaječníkové bunky čínskeho škrečka, HeLa bunky, obličkové bunky mladých škrečkov a mnohé

-21 iné. Bežným, výhodným bakteriálnym hostiteľom je E. coli. Výhodnými hostiteľmi na bakulovírusovú expresiu sú hmyzie bunky, ako napríklad SF9 bunková línia.

Vybrané alebo skonštruované môžu byť vhodné vektory, ktoré obsahujú príslušné regulačné sekvencie, vrátane promótorových sekvencii, terminátorových fragmentov, polyadenylačných sekvencii, sekvencii zosilňovačov, markerových génov a iných sekvencii, ak je to vhodné. Podrobnosti pozri napríklad v Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2. vydanie, Sambrook a iný, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Transformačné postupy závisia na použitom hostiteľovi, ale sú dobre známe.

Po produkcii prostredníctvom expresie kódujúcej nukleovej kyseliny protilátky alebo iných špecifických väzobných molekúl nasmerovaných proti cieľu užitočnému v predloženom vynáleze, ako Cdc6, sa môže táto získať a môže byť izolovaná, ak je to nevyhnutné, konjugované s príslušnou značkou alebo reportérovým činidlom, a môže byť poskytnutá na použitie na stanovenie prítomnosti alebo neprítomnosti abnormalít bunkového rastu vo vzorke tkaniva, ako napríklad v stere krčku maternice, v súlade s predloženým vynálezom, ako je opísané.

Hladiny Cdc6 a MCM expresie v nádoroch sú oveľa vyššie ako hladiny v normálnych tkanivách a tieto antigény sa môžu uvoľňovať do krvného riečišťa (napr. nekróziou nádorových buniek) alebo do iných telesných tekutín, napr. moču alebo výkalov. Na detekciu cieľa v telesnej tekutine, napr. sére, môže byť použitá špecifická väzobná molekula, použitím akejkoľvek techniky dostupnej odborníkovi v oblasti, ako DELFIA, ELISA, RIA, Western blot. Progresia a regresia nádoru môže byť monitorovaná napríklad v reakcii na liečbu alebo pri recidíve. Takže krv alebo iné vzorky telesných tekutín, napr. moču, prostatickej tekutiny, tekutiny z prsnej bradavky, seróznych a ascitických výtokov, cerebrospinálnej tekutiny a aj výkalov, môžu byť zhodnotené podľa predloženého vynálezu. Napríklad je možné testovať vzorku krvi na prítomnosť cieľového polypeptidu, ako napríklad MCM5 a Cdc6 použitím DELFIA, ELISA, RIA, napr. ako je opísané vo Williams a iný, Clin. Chem. Acta, 1986, 155, 329-344.

Stanovenie viazania sa na cieľ in vivo môže byť použité na identifikáciu lokalizácie abnormálnych buniek v tele. Jedincovi môžu byť podávané značené väzobné molekuly proti cieľu podľa predloženého vynálezu a viazanie sa môže

-22stanoviť vo vnútri tela. Keď je na protilátku pripojený rádionukleotid ako jód-125, indium-111, táiium-201 alebo technícium-99m, ak je táto protilátka lokalizovaná výhodne v nádore a nie v normálnych tkanivách, prítomnosť rádioznačky v nádorovom tkanive sa môže detegovať a kvantifikovať použitím gama fotoaparátu alebo scintigrafie. Kvalita získaného obrazu nádora priamo koreluje s pomerom signál.prerušenie. Rádioznačenie s techníciom-99m je opísané v Pak a iný (1992), Nucl. Med. Biol. 19; 699-677. Zhrnutie zobrazovania rakoviny anti-CEA protilátkami je poskytnuté Goldenbergom D.M, Int. J. of Biol. Markers 1992, 7; 183-188. Predložený vynález sa samozrejme vzťahuje na špecifické väzobné členy nasmerované proti cieľovým polypeptidom, ako boli opísané, na použite v akomkoľvek spôsobe na diagnostiku choroby ľudí alebo zvierat.

Pre Cdc6 a MCM proteíny bola publikovaná ATPázová enzymatická aktivita (Zwerschke a iný, 1994, J. Biol. Chem. 269, 23351-23356; Ishimi a iný, Cold Spring Harbor Meeting on Eukaryotic DNA Replication, 3.-7. september 1997). Tieto proteíny môžu mať iné enzymatické aktivity, napríklad helikázovú aktivitu ako je publikované Ishimim a inými, (Ibid.). Hladina cieľového proteínu podľa predloženého vynálezu môže byť stanovená prostredníctvom determinácie jeho enzymatickej aktivity vo vzorke. Napríklad boli vyvinuté špecifické chromogénne substráty pre enzymatickú aktivitu enzýmov, ako chrenová peroxidáza (diaminobenzidín) a βgalaktozidáza (X-GAL).

Expresia Cdc6, MCM5 a iných cieľových proteínov môže byť stanovená na úrovni nukleovej kyseliny, napríklad stanovením hladín mRNA. Williams a iný, (Cold Spring Harbor Meeting On Eukaryotic DNA Replication, 3.-7. september 1997) publikovali expresiu Cdc6 mRNA v základni krýpt tenkého čreva myších vnútorností. Spôsoby detekcie RNA sú v oblasti dobre známe a zahŕňajú Northern blot, kvapkový blot, in situ hybridizáciu, kvantitatívnu RT-PCR. Nukleová kyselina izolovaná a/alebo purifikovaná z jednej alebo viacerých buniek alebo knižnica nukleových kyselín odvodená od nukleovej kyseliny izolovanej a/alebo purifikovanej z buniek (napr. cDNA knižnica odvodená od mRNA izolovanej z buniek), môže byť sondovaná v podmienkach selektívnej hybridizácie a/alebo môže byť podrobená špecifickej reakcii na amplifikáciu nukleovej kyseliny, ako napríklad polymerázovej reťazovej reakcii (PCR). Viazanie sa sondy na cieľovú nukleovú kyselinu sa môže

-23merať použitím akejkoľvek z rôznych techník, ktoré má k dispozícii odborník v oblasti. Napríklad, sondy môžu byť rádioaktívne, fluorescenčné alebo enzymaticky značené. Iné spôsoby, ktoré nepoužívajú značenú sondu, zahŕňajú skúmanie polymorfizmov dĺžky reštrikčných fragmentov, amplifikáciu použitím PCR, štiepenie RNázou a sondovanie s alelovo špecifickými oligonukleotidmi.

Z praktických dôvodov, alebo aspoň z komerčných dôvodov, berúc do úvahy náklady a čas, je stanovenie expresie cieľového proteínu na úrovni proteínu vo všeobecnosti výhodnejšie ako stanovenie na úrovni nukleovej kyseliny.

Uskutočnenia predloženého vynálezu budú teraz ilustrované s odvolaním sa na experimentálne príklady. Ďalšie aspekty a uskutočnenia predloženého vynálezu budú pre odborníka v oblasti zrejmé.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava protilátok

Protilátky pre Cdc6 boli pripravené použitím nasledujúceho protokolu.

Identifikovali sa exprimované sekvenčné prívesky kódujúce fragmenty ľudského Cdc6-podobného proteínu (GenBank prístupové čísla: T90351, H59204, N69246m AA045217, AA099980) na základe ich slabej sekvenčnej homológie s ľudským Orc1 a kvasinkovým Cdc6/Cdc18. Korešpondujúce knižničné klony sa získali od IMAGE Consortium (Research Genetics Inc., USA) a sekvenovali sa oba reťazce použitím ABI PRISM 377 sekvenčného prístroja (Applied Biosystems). Konsenzus sekvencie všetkých piatich klonov obsahovali otvorený čítací rámec s 563 aminokyselinami. Porovnanie s následne publikovanou sekvenciou ľudského Cdc6 (Williams a iný, 1997) odhalilo 99,7% homológiu na proteínovej úrovni. Dva oddelené fragmenty ľudského Cdc6 zodpovedajúce aminokyselinám 145 až 360 a 364 až 547 boli klonované ako Xbal-BamHI fragmenty do pET23a expresného vektora (Novagen) a exprimovali sa v E. coli CL41 kmeni. Rekombinantné proteínové fragmenty sa purifikovali Ni+2 agarózovou afínitnou chromatografiou (Qiagen) a použili sa na imunizáciu. Protilátky sa vyvolali a afinitne purifikovali ako

-24už bolo predtým opísané (Romanowski a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10189-10194). Tri protilátky rozoznávali predominantný pás s veľkosťou 62 kD v celkových extraktoch HeLa buniek a v jadrových extraktoch.

Protilátky proti MCM5 boli pripravené nasledovne:

PCR primery boli navrhnuté na základe publikovanej sekvencie ľudského MCM5 (Hu a iný, 1993, Nucl. Acid Res. 21, 5289-5293). Fragment MCM5 kódujúcej sekvencie zodpovedajúci aminokyselinám 367 až 582 sa amplifikoval z reverzne transkribovanej HeLa cDNA a klonoval sa ako Sphl-Bglll fragment do pQE70 expresného vektora (Qiagen). Proteín sa exprimoval v BL21 E. coli bunkách a purifikoval sa použitím Ni²⁺ agarózovej afinitnej chromatografie (Qiagen). Protilátky sa vyvolali ako už bolo predtým opísané (Romanowski a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10189-10194).

Príklad 2

Vzťah Cdc6 a MCM5 ku bunkovej proliferácii

Predtým sa Western blotom ukázalo, že nesmrteľná ľudská bunková línia HeLa exprimuje Cdc6 a MCM5 počas bunkového cyklu (Williams a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:142-147; Schulte a iný, Eur. J. Biochem., 1996, 235, 144151). V súčasnosti bolo publikované tlmenie Cdc6 v pokojových Wi38 ľudských fibroblastoch Wílliamsom a inými, 1997. Pôvodcovia predloženého vynálezu tiež ukázali prostredníctvom Western blotu, že Cdc6 expresia je tlmená, keď sa myšie 3T3 fibroblasty dostanú do pokojového štádia kontaktnou inhibíciou (obrázok 1 A).

NIH 3T3 bunková línia sa zastavila rastom po súvislú vrstvu. Kultúry sa držali v pokojovom štádiu 7 dní. Bunky opustili G0 zastávku rozdelením trypsínom a premiestnením na nové platne. Rozpustné (supernatant) a jadrové (pelet) proteínové extrakty sa pripravovali v trojhodinových intervaloch a oba extrakty sa podrobili imunoblotingu s protilátkami proti ľudskému MCM5, Orc2 a Cdc6.

Orc2 (pozri Gavin a iný, kvôli klonovaniu - Science (1995) 270, 1667-1671) ostáva naviazaný na chromatín v pokojových bunkách (G0) a významne sa nezvyšuje, keď bunky vstúpia do bunkového cyklu. Na rozdiel od neho MCM5 sa

-25nedal detegovať v chromatín viažucej frakcii (pelet) pokojových buniek, aj keď rozpustná frakcia obsahovala významné množstvá MCM5. Na rozdiel od MCM5, Cdc6 úplne chýbal v pokojových bunkách, ale expresia tohto proteínu sa rýchlo indukovala, keď bunky vstúpili do bunkového cyklu. Podobné výsledky sa získali aj s ľudskou EJ 13 bunkovou líniou (odvodenou od rakoviny močového mechúra).

Z týchto výsledkov vyplýva, že neprítomnosť Cdc6 v pokojových bunkách je všeobecným fenoménom.

Tieto štúdie boli rozšírené o imunofluorescenciu a aplikáciu anti-Cdc6 a antiMCM5 protilátok na celé bunky.

Zistilo sa, že expresia Cdc6 a MCM5 je tiež tlmená, keď sa novorodenecké ľudské fibroblasty (NHF) dostanú do pokojového štádia kontaktnou inhibíciou. NHF rástli do súvislej vrstvy a udržiavali sa v pokojovom štádiu tri dni. Bunky sa dostali z GO zastávky oddelením trypsínom a prenesením na nové platne. Vo viacerých časových bodoch sa potom zozbierali celé bunky od odchodu z GO fázy po vstup do S-fázy. Farbenie propidium jodidom bolo použité na odhalenie DNA a výsledky sa porovnali s farbením vzoriek s anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami.

Pokojové (GO) bunky nevykazovali žiadnu Cdc6 imunoreaktivitu a veľmi slabý signál s anti-MCM5 protilátkou. Avšak počas vstupu do bunkového cyklu a S-fázy bola pozorovaná silná jadrová imunoreaktivita na Cdc6 a MCM5.

Tieto štúdie mohli naznačovať, že anti-Cdc6 protilátky môžu poskytnúť marker na proliferáciu buniek, podobný s PCNA alebo Ki67. Ani PCNA, ani Ki67 sa neosvedčili ako uspokojujúce na cytológiu krčku maternice.

Príklad 3

Anti-Cdc6 a anti-MCM5 väzobné molekuly detegujú abnormálne (napr. nádorové) bunky oveľa účinnejšie ako PCNA alebo Ki67 protilátky

Výsledky načrtnuté v príklade 2 naznačujú, že Cdc6 expresia mohla napodobovať expresiu PCNA alebo Ki76, z ktorých ani jeden sa neosvedčil ako uspokojivý na cytológiu krčku maternice. Pôvodcovia predloženého vynálezu porovnávali protilátky proti týmto proteínom na rezoch normálneho alebo chorého krčku maternice.

-26Imunofarbenie SILs krčku maternice na bežné proliferačné markery PCNA a Ki67 vykazuje odlišný charakter imunoreaktivity v porovnaní s farbením na Cdc6 alebo MCM5. V normálnom krčku protilátky proti všetkým štyrom antigénom ukazovali pozitívne imunofarbenie epiteliálnych buniek obmedzené na bazálne a parabazálne vrstvy. Nebolo pozorované žiadne farbenie metaplastických, stromálnych alebo zápalových buniek. Tak v nízkom, ako aj vo vysokom stupni SILs (LSIL a HSIL) vykazovali protilátky proti Cdc6 a MCM5 pozitívne imunofarbenie väčšiny (> 95 %) abnormálnych buniek. Naproti tomu imunofarbenie na PCNA a Ki67 bolo pozitívne len v menšine populácie (< 30 %) abnormálnych buniek oboch stupňov SILs. Koilocyty, ktoré sa vyznačujú LSIL a odrážajú HPV cytopatický účinok, vykazovali všetky pozitívne imunofarbenie s Cdc6 a MCM5, zatiaľ čo len menšina populácie (20 %) vykazovala pozitívne farbenie na PCNA alebo Ki67.

Oveľa vyššia úroveň farbenia abnormálnych buniek poskytuje zrejmú výhodu pri použití anti-Cdc6 alebo Anti-MCM5 väzobných molekúl voči anti-PCNA a antiKi67 molekulám ph skríningu krčku maternice, pri ktorom sa vzorky tkaniva najbežnejšie odoberajú stermi povrchu epitelu.

Na sklenené podložné sklíčka sa odrezali 5 pm rezy a zbavili sa vosku v xyléne. Endogénna peroxidázová aktivita sa potlačila inkubovaním v 0,6% hydrogénperoxide v 100% metanole počas 3 až 5 minút pri laboratórnej teplote. Sklíčka sa premývali vo fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku 2x5 minút a potom sa blokovali približne 100 μΙ na rez 10% fetálneho hovädzieho séra (FCS) vo fosfátom tlmenom fýziologickom roztoku (PBS). Sklíčka sa odvodnili a nadbytok séra sa odsal. Primárne protilátky boli nariedené na 1 v 20 v PBS s obsahom 2,5% FCS a ku každému rezu sa pridalo 25 až 50 μΙ. Inkubovalo sa 45 minút pri laboratórnej teplote vo vlhkej komore. Sklíčka sa potom premývali 3x5 minút v PBS, následne sa blokovali s 20% králičím sérom pre anti-Ki67 alebo anti-PCNA a 20% oslím sérom pre anti-Cdc6 alebo anti-MCM5 v PBS počas 15 minút. Po vysušení blokovacej protilátky a odsatí sklíčok sa pridala biotinilovaná králičia antimyšia sekundárna protilátka (pre anti-Ki67 alebo anti-PCNA) alebo oslia anti-králičia (pre anti-Cdc6 alebo anti-MCM5) v riedení 1 v 200 v PBS s obsahom 10% normálneho ľudského séra na 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5minútových premývaniach v PBS sa pridal komplex streptavidín-biotín-chrenovej

-27peroxidázy v riedení 1 v 500 v PBS na 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5minútových PBS premývaniach sa pridal substrát diaminobenzidín v koncentrácii 1 % v 100 mM Tris.CI (pH 7,6) s obsahom 0,005% hydrogénperoxidu a inkuboval sa 5 minút pri laboratórnej teplote. Reakcia sa zastavila vymytím vodou z vodovodu a sklíčka sa jemne farbili Gillovým hematoxylínom, dehydratovali sa v stupňovaných etanoloch a premývali 2x6 minút v xyléne. Aplikovali sa krycie sklíčka s DPX prichytávacím médiom.

Sériové rezy normálneho krčku maternice boli farbené na PCNA, ΚΪ67, MCM5 a Cdc6 použitím príslušných protilátok. Všetky tieto protilátky vykazujú podobné charakteristiky imunoreaktivity s pozitívnymi bunkami, ktorá je obmedzená len na bazálne a parabazálne vrstvy.

Sériové rezy s nízkym stupňom SIL (CINI) krčku maternice boli farbené na PCNA, Ki67, MCM5 a Cdc6 použitím protilátok. Dysplázia je nápadná v spodnej tretine šupinového epitelu a je spojená s vírusovými zmenami týkajúcimi sa HPV (koilocytóza), pričom tieto zmeny sú rozšírené na povrch. PCNA a Ki67 vykazujú škvrnitú fokálnu imunoreaktivitu, ktorá je obmedzená na spodnú tretinu epitelu, a v ktorej je len malá časť atypických buniek pozitívne sfarbená. Na rozdiel od nich, Cdc6 a MCM5 vykazujú imunoreaktivitu v celej hrúbke s pozitívnym farbením všetkých atypických buniek vrátane koilocytov vo vrchnejších vrstvách epitelu.

Sériové rezy s vysokým stupňom SIL boli farbené použitím PCNA, Ki67, MCM5 a Cdc6 protilátok. Dysplázia je prítomná vo všetkých vrstvách epitelu. PCNA a Ki67 vykazujú podobné charakteristiky imunoreaktivity s farbením v celej hrúbke, ale len menšinová časť populácie atypických buniek je pozitívna (do približne 30 %). Cdc6 a MCM5 tiež vykazujú farbenie v celej hrúbke epitelu. Avšak v značnom kontraste s PCNA a Ki67, Cdc6 a MCM5 vykazujú pozitívne farbenie všetkých atypických buniek.

Z týchto výsledkov vyplýva výnimočná užitočnosť použitia anti-Cdc6 alebo anti-MCM5 špecifických väzobných molekúl na stanovenie stavu krčku maternice prostredníctvom zhodnotenia viazania v sterovej vzorke. Stery sú vzorkou len vrchnej povrchovej vrstvy buniek z krčka maternice, takže je dôležité mať vysokú úroveň farbenia. Takáto vysoká úroveň farbenia získaná s anti-Cdc6 a anti-MCM5 v skorých štádiách abnormality (nízky stupeň SIL, CINI), ktorá nie je dosiahnutá s

-28anti-PCNA, ani anti-Ki67, je veľmi významná. Navyše farbenie v celej hrúbke získané použitím anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátok na LSIL vzorkách, ale nie antiPCNA, ani anti-Ki67 protilátkami, zvýrazňuje výnimočnú užitočnosť anti-Cdc6 a antiMCM5 pre zhodnotenie sterových vzoriek v skorých štádiách potenciálnej predmalignity.

Príklad 4

Cdc6 a MCM5 protilátky detegujú abnormálne bunky v steroch krčku maternice

Príklad 3 demonštruje hodnotu anti-Cdc6 a anti-MCM5 väzobných molekúl na stanovenie potenciálnych pred-malígnych lézií v rezoch krčku maternice. Ďalšie experimentálne výsledky ukazujú, že sú rovnako účinné pri detekcii abnormálnych buniek v prípravkoch steru krčku maternice.

Stery krčku maternice sa fixovali 10 minút vo formaldehyde (4%, čerstvo pripravený z paraformaldehydu vo fosfátom tlmenom fýziologickom roztoku). Fixovaný materiál sa potom farbil s anti-Cdc6 protilátkami (1:200) alebo anti-MCM5 protilátkami (1:200) a nasledovala oslia anti-králičia polyklonálna protilátka konjugovaná s fluoresceínizotiokyanátom (Amersham; 1:100). Celková DNA sa označila propidium jodidom. Obrazy sa získali použitím skenovacej laserovej konfokálnej mikroskopie (Bio-Rad MRC 1024). Na týchto obrázok je celková DNA červená, Cdc6 alebo MCM5 imunofarbenie je zelené, takže imunoreaktivita jadra sa zdá žltá.

Príklady normálnych sterov krčku maternice vykazujú charakteristický pás paralelne zoradených endocervikálnych buniek a zmiešanej populácie povrchových a metaplastických šupinových buniek. Nie je tam žiadny dôkaz špecifickej anti-Cdc6 alebo anti-MCM5 imunoreaktivity s ktoroukoľvek z testovaných protilátok.

Abnormálne stery obsahujúce dyskaryotické bunky (atypické šupinové bunky) vykazujú pozitívne farbenie troma rozličnými anti-Cdc6 protilátkami a anti-MCM5 protilátkou. Koilocyty tiež vykazujú silnú imunoreaktivitu s anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami. Žiadna z priľahlých povrchových šupinových/metaplastických buniek nevykazuje Cdc6 alebo MCM5 imunoreativitu.

-29Výsledky boli získané použitím rôznych anti-Cdc6 protilátok, ktoré prednostne farbia LSI L bunky, vrátane koilocytov, naproti veľmi nízkemu pozadiu v steroch normálnych krčkov maternice alebo v normálnych bunkách v steroch abnormálneho krčku. Tieto výsledky sa získali aj použitím anti-MCM5 protilátky.

Podobné výsledky sa ukázali s protilátkami proti MCM5.

Príklad 5

Cdc6 a MCM5 protilátky prednostne farbia nádorové bunky v prsníku

Anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátky boli testované na inom mieste bežných rakovín, v prsníku. Fixovanie a farbenie prsníkového tkaniva bolo rovnaké ako bolo opísané v príkladoch 3 a 4 pre stery krčku maternice.

Anti-Ced6 a anti-MCM5 protilátky boli testované na rade rakovín prsníka.

Zatiaľ čo normálny prsník nevykazuje žiadny dôkaz imunofarbenia, bolo pozorovanie silné pozitívne farbenie tak s anti-Cdc6, ako aj anti-MCM5 protilátkami v rôznych histologických typoch rakoviny prsníka vrátane nízko a vysoko invazívneho duktálneho karcinómu. Nízko stupňový slizničný karcinóm tiež vykazuje silné pozitívne farbenie oboma protilátkami. Dôležité je, že normálne stromálne bunky v blízkosti nádora boli negatívne.

Príklad 6

Analýza vzoriek krvi

Archívne vzorky krvi od pacientov s roztrúsenou metaplastickou chorobou boli testované na prítomnosť MCM5 a Cdc6 použitím enzymaticky spojeného imunosorbentného testu ako je opísané vo Williams a iný, Clin. Chem. Acta, 1986, 155, 329-344. Množstvo rozpustného MCM5 a Cdc6 v sére koreluje s dávkou nádora.

Príklad 7

Porovnanie sterov a mrazených rezov s tkanivovými rezmi obalenými v parafínovom vosku, ktoré sa podrobili vyhľadávaniu antigénu

-30Imunoperoxidázové farbenie 5 μηπ rezov zahŕňajúcich formalínom fixované tkanivové rezy obalené parafínovým voskom normálneho krčku (sedem vzoriek), LSIL (päť vzoriek), HSIL (šesť vzoriek) a šupinového bunkového karcinómu (šesť vzoriek) sa uskutočňovalo s protilátkami proti Ki67, PCNA, MCM5 a Cdc6.

Na sklenené podložné sklíčka sa odrezali 5 pm rezy a zbavili sa vosku v xyléne. Endogénna peroxidázová aktivita sa potlačila inkubovaním v 0,6% hydrogénperoxide v 100% metanole počas 30 minút pri laboratórnej teplote. Sklíčka sa premývali 2 minúty v ultračistej vode a potom sa varili tlakom 2 minúty v tlmivom roztoku citrátu sodného. Sklíčka sa premývali v Tris tlmenom fyziologickom roztoku (TBS) 2x5 minút a potom sa blokovali približne 100 μΙ na rez 10% kozieho séra v TBS. Sklíčka sa odvodnili a nadbytok séra sa odsal. Primárne protilátky boli nariedené na 1 v 200 v TBS s obsahom 1% BSA a ku každému rezu sa pridalo 100 μΙ. Inkubovalo sa cez noc, pri 4 °C vo vlhkej komore. Sklíčka sa potom premývali 3 x 5 minút v TBS, nasledovala biotinylovaná kozia anti-králičia sekundárna protilátka v riedení 1 v 500 v TBS s obsahom 1% BSA, 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5-minútových premývaniach v TBS sa pridal komplex streptavidín-biotínchrenovej peroxidázy v riedení 1 v 500 v TBS na 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5-minútových TBS premývaniach sa pridal substrát diaminobenzidín v koncentrácii 1 % v TBS s obsahom 0,005% hydrogénperoxidu a inkuboval sa 10 minút pri laboratórnej teplote. Reakcia sa zastavila vymytím vodou z vodovodu a sklíčka sa jemne farbili hematoxylínom, dehydratovali sa v stupňovaných etanoloch a vyčistili sa v xyléne. Aplikovali sa krycie sklíčka s DPX prichytávacím médiom.

Imunoperoxidázové farbenie mrazených tkanivových rezov normálneho krčku (osem vzoriek), HSIL (deväť vzoriek) a LSIL (osem vzoriek) sa uskutočňovalo s protilátkami proti PCNA, Ki67, MCM5 a Cdc6.

Mrazené rezy sa fixovali 10 minút v acetóne. Endogénna peroxidázová aktivita sa potlačila inkubovaním v 0,6% hydrogénperoxide v 100% metanole 30 minút. Rezy sa potom premývali v TBS a blokovali sa cez noc s 10% kozím sérom v TBS. Primárne protilátky sa nariedili v pomere 1/200 v TBS s obsahom 1% BSA a inkubovali sa cez noc pri 4 °C. Potom nasledoval postup so sekundárnou protilátkou ako je opísaný vyššie pre fixované tkanivové rezy.

-31 Citlivosť farbenia s anti-MCM5 a anti-Cdc6 protilátkami bola oveľa vyššia ako s anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami, keď sa aplikovali na mrazené rezy.

Na normálnych, LSIL a šupinových bunkových nádorových tkanivách fixovaných vo formalíne, obalených v parafíne a vystavených sterilizácii, poskytovali anti-PCNA, anti-MCM7, anti-MCM5 a anti-Cdc6 podobné charakteristiky farbenia. V porovnaní s nimi bol KÍ67 oveľa menej citlivý, len s fokálnym slabím farbením LSIL a šupinových karcinómových buniek.

Príklad 8

Farbenie mrazených rezov a tkanív podrobených vyhľadávaniu antigénu s antiMCM7 protilátkami

Štyri mrazené rezy krčku maternice klasifikované ako HSIL boli farbené s anti-MCM7 protilátkou.

Pozorované boli rovnaké charakteristiky farbenia ako pri farbení s anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami.

Tento výsledok sa líši od výsledkov Hiraiwa a iných (Int. J. Cancer, 1997, 74: 180-184), ktorí zistili podobné imunofarbiace charakteristiky pre PCNA a MCM7 (hCDC7) v niekoľkých ľudských tkanivách a v troch typoch ľudských nádorov, ktoré sa podrobili protokolom na vyhľadávanie antigénu.

Avšak v súlade s Hiraiwa a inými sa zistilo, že farbiace charakteristiky získané pre anti-MCM7 protilátky na normálnom krčku, LSIL a šupinových bunkových karcinómových tkanivových rezoch obalených v parafíne, ktoré sa podrobili vyhľadávaniu antigénu, sú podobné s charakteristikami získanými pre antiPCNA protilátky. Ako je uvedené v príklade 7, farbiace charakteristiky pre antiMCM5 a anti-Cdc6 protilátky na takto pripravených rezoch boli tiež podobné s charakteristikami PCNA protilátok.

Príklad 9

Farbenie s anti-MCM2 protilátkami

-32Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM2 bola použitá na farbenie dvoch mrazených rezov normálneho krčku maternice a štyroch mrazených rezov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).

Normálny ektocervix vykázal farbenie jadra len v bazálnej vrstve, bez expresie v povrchových diferencovaných bunkách. Naproti tomu nastalo jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu. Endocervikálne bunky boli negatívne.

Príklad 10

Farbenie s anti-MCM3 protilátkami

Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM3 bola použitá na farbenie mrazeného rezu normálneho krčku maternice a dvoch mrazených rezov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).

Normálny ektocervix vykazoval dosť granulárne farbenie jadra len v bazálnej vrstve, a žiadnu jadrovú expresiu v povrchových diferencovaných bunkách. Bolo vidieť určité farbenie pozadia, cytoplazmy keratinocytov. Naproti tomu, ukázalo sa jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu. Vyskytlo sa určité farbenie endocervikálnej sliznice, hoci jadrové farbenie endocervikálnych buniek bolo negatívne.

Polyklonálna anti-ľudská MCM3 bola použitá aj na farbenie štyroch sterov HSIL a dvoch sterov LSI L (z ktorých každý obsahoval normálne bunky krčku maternice). V každom prípade sa ukázalo jadrové farbenie SÍL buniek. Navyše sa objavilo určité pozadie cytoplazmatického farbenia keratinocytov a určité farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.

Polyklonálna arňi-Xenopus MCM3 bola použitá na farbenie mrazených rezov HSIL. Krížová reaktivita anti-Xenopus MCM3 protilátok s ľudskou MCM3 sa potvrdila Western blotom a lokalizáciou na tkanivových rezoch. Objavilo sa jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu.

Príklad 11

Farbenie s anti-MCM4 protilátkami

-33Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM4 bola použitá na farbenie mrazeného rezu normálneho krčku maternice a dvoch mrazených rezov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).

Normálny ektocervix vykazoval dosť granulárne farbenie jadra len v bazálnej vrstve, a žiadnu jadrovú expresiu v povrchových diferencovaných bunkách. Bolo vidieť určité farbenie pozadia, cytoplazmy keratinocytov. Naproti tomu, ukázalo sa jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu so silným farbením povrchových jadier. Vyskytlo sa slabé farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.

Polyklonálna anti-ľudská MCM4 bola použitá aj na farbenie dvoch sterov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálne bunky krčku maternice). V každom prípade sa ukázalo jadrové farbenie HSIL buniek. Navyše sa objavilo určité pozadie cytoplazmatického farbenia keratinocytov a určité farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.

Príklad 12

Farbenie s anti-MCM6 protilátkami

Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM6 bola použitá na farbenie mrazeného rezu normálneho krčku maternice a dvoch mrazených rezov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).

Normálny ektocervix vykazoval silné farbenie jadra len v bazálnej vrstve, a žiadnu jadrovú expresiu v povrchových diferencovaných bunkách. Naproti tomu, ukázalo sa silné jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu. Vyskytlo sa určité farbenie endocervikálnej sliznice, ale minimálne farbenie endocervikálnych bunkových jadier.

Polyklonálna anti-ľudská MCM6 bola použitá aj na farbenie štyroch sterov HSIL a štyroch sterov LSIL (z ktorých každý obsahoval normálne bunky krčku maternice). V každom prípade sa ukázalo jadrové farbenie SIL buniek. Navyše sa objavilo určité pozadie cytoplazmatického farbenia keratinocytov a určité farbenie endocervikálnych jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.

-34Príklad 13

Ďalšie farbiace experimenty s anti-MCM7 protilátok

Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM7 bola použitá na farbenie troch mrazených rezov normálneho krčku maternice, šiestich mrazených rezov HSIL a mrazeného rezu krčku maternice SCC (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).

Normálny ektocervix vykazoval farbenie jadra len v bazálnej vrstve, a žiadnu jadrovú expresiu v povrchových diferencovaných bunkách. Bolo vidieť určité farbenie pozadia, cytoplazmy keratinocytov. Naproti tomu, ukázalo sa silné jadrové farbenie veľkej väčšiny HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu. Vyskytlo sa určité farbenie endocervikálnej sliznice a slabé farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.

Polyklonálna anti-ľudská MCM7 bola použitá aj na farbenie dvoch sterov LSIL (z ktorých každý obsahoval normálne bunky krčku maternice). V každom prípade sa ukázalo jadrové farbenie SIL buniek. Navyše sa objavilo určité pozadie cytoplazmatického farbenia keratinocytov a určité farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.

Polyklonálna anii-Xenopus MCM7 (potvrdená krížová reaktivita s ľudskou MCM7 Western blotom a lokalizáciou na tkanivových rezoch) bola použitá na farbenie mrazených rezov HSIL. Objavilo sa jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu.

Metódy

Príprava sterov krčku maternice

Čerstvé stery sa fixovali (5 minút v zmesi acetón:metanol v pomere 50:50) a vysušili sa vzduchom. Po potlačení endogénnej peroxidázovej aktivity (ako bolo opísané vyššie), sa bunky permeabilizovaii (v 4mM deoxycholáte sodnom 10 minút), premývali sa (TBS s 0,25% Tritónom X-100) a blokovali sa cez noc 10% kozím sérom v TBS. Primáme protilátky boli nariedené na 1 v 200 v TBS s obsahom 1% BSA a inkubované cez noc pri 4 °C. Sklíčka sa potom premývali 3x5 minút v TBS,

-35nasledovala biotinylovaná králičia sekundárna protilátka (Dáko) v riedení 1 v 500 v TBS s obsahom 1% BSA, 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5-minútových premývaniach v TBS sa pridal komplex streptavidín-biotín-chrenovej peroxidázy (Dáko) v riedení 1 v 500 v TBS na 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5minútových TBS premývaniach sa pridal substrát diaminobenzidín v koncentrácii 1 % v TBS s obsahom 0,005% hydrogénperoxidu a inkuboval sa 10 minút pri laboratórnej teplote. Reakcia sa zastavila vymytím vodou z vodovodu a sklíčka sa jemne farbili hematoxylínom, dehydratovali sa v stupňovaných etanoloch a vyčistili sa v xyléne. Aplikovali sa krycie sklíčka s DPX prichytávacím médiom.

Imunofluorescencia

Čerstvo zozbieraný materiál zo sterov krčku maternice sa rozsuspendoval v 0,5 ml PBS a fixoval sa pridaním 0,5 ml 8% formaldehydu a naniesol sa na polylyzínové krycie sklíčka. Krycie sklíčka sa spracovali ako je opísané vRomanowski a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10189-10194. Po blokovaní v 5% BSA/PBSfTritón X-100 a SDS sa inkubovali s primárnou protilátkou, premyli sa, inkubovali sa so sekundárnou protilátkou (FITC konjugovaná anti-králičia protilátka Amersham 1:100) a kontrastne sa farbili na DNA s propidium jodidom/RNAázou A (obe od Sigma v koncentrácii 50 ng/ml), premývali sa a spevnili sa v glycerol/PBS/fenyléndiamíne.

Fluorescenčné obrazy sa zachytávali na BioRad MRC 1024 skenovacom laserovom konfokálnom mikroskope použitím dvojkanálovej (FITC & Texas Red) metódy. Pre niektoré obrazy sa zachytávali konfokálne série v 1 až 2 pm krokoch a potom sa premietli ako jeden rám (obrázky 4a a c). Normálne a nádorové prsníkové tkanivo sa čerstvo odobralo z mastektomických vzoriek. Tenké plátky (< 1 mm) sa fixovali v 4% paraformaldehyde 30 minút a potom sa spracovali ako je uvedené vyššie, ale bol poskytnutý dlhší čas na inkubáciu s oboma protilátkami a na premývania.

Príklad 14

Slepé porovnávanie uskutočnenia podľa predloženého vynálezu so štandardným Pap farbením

-36Uskutočnil sa slepý pokus na porovnanie detekčnej účinnosti použitím protilátok proti MCM5 so štandardným Pap farbením uskutočňovaným na steroch získaných od žien navštevujúcich kolposkopické kliniky pre ambulantných pacientov v lokálnych nemocniciach.

Z tabuľky 1 je zrejmé, že z 26 prípadov stanovených ako pozitívne rutinným Pap farbením, bolo všetkých 26 zhodnotených pozitívne protilátkovým testom podľa vynálezu. Zo 16 prípadov, ktoré boli stanovené ako negatívne rutinným Pap farbením, bolo 13 negatívnych aj pri stanovovaní protilátkovým testom.

Zo zvyšných troch jeden prípad obsahoval farbené nezrelé metaplastické šupinové bunky, ktoré vykazovali reaktívne zmeny na základe zápalu. Čo sa týka ďalších dvoch prípadov opätovným preskúmaním Pap farbenia sa potvrdilo, že obsahujú abnormálne (LSIL) bunky, tzn. boli falošne pozitívne, čo sa dá použitím predloženého vynálezu eliminovať.

Tieto výsledky demonštrujú, že použitím protilátkového testu podľa predloženého vynálezu nedochádza k strate informácií z Pap farbenia, len sa objaví prírastok informácií. To umožňuje, aby akékoľvek možné zlyhanie protilátkového testu bolo poistené použitím bežného Pap farbenia.

Príklad 15

Analýza vzoriek moču pacientov s malignitami močového traktu

Na detekciu ľudského MCM bol určený disociáciu zosilňujúci lantanidový fluorescenčný imunotest, DELFIA, použitím dvoch odlišných králičích polyklonálnych anti-hMCM5 antisér.

Základom sendvičového testu je imobilizácia nadbytku špecifickej protilátky na povrchu (tu polystyrénové mikrotitračné jamky) - tzn. „zachytenie“ protilátky. Po väzobnej reakcii primárnej protilátky nasleduje pridanie sekundárnej (tu europium) značenej protilátky so špecifitou k odlišným epitopom. Po ukončení imunoreakcie sa odmyjú nadbytočné materiály a po pridaní zosilňovacieho roztoku sa meria časovo rozlíšenou fluorescenciou (Wallac Oy) v časovo rozlišovacom fluorometri. Signál je proporcionálny ku koncentrácii analytického činidla.

-37Použitý bol nasledujúci test:

1. Pokrytie s polyklonálnou králičou anti-MCM5 protilátkou (1600 ng/jamku) cez noc (4 °C);

2. 3 x premývanie s DELFIA premývacím tlmivým roztokom (Wallac Oy);

3. Blokovanie v 5% BSA/PBS 1 hodinu;

4. 3 x premývanie s DELFIA premývacím tlmivým roztokom (Wallac Oy);

5. Väzbová reakcia s primárnu protilátkou (1:3 riedenie analytického činidla vo Wallac multi tlmivom roztoku s 0,02% TWEEN) cez noc (4 °C);

6. 4 x premývanie s DELFIA premývacím tlmivým roztokom (Wallac Oy);

7. Väzobná reakcia so sekundárnou protilátkou s európium značenou polyklonálnou králičou anti-MCM5 protilátkou (4 ²⁰Eu/lgG) 3 hodiny;

8. 6 x premývanie s DELFIA premývacím tlmivým roztokom (Wallac Oy);

9. Pridanie posilovacieho roztoku a 10 minútové inkubovanie s miešaním. Meranie časovo rozlíšenej fluorescencie na časovo rozlišovacom fluorometri (Wallac Oy).

Použitím polyklonálneho králičieho anti-MCM5 antiséra z dvoch odlišných králikov a rekombinantného MCM5 v 5% BSA/PBS ako analytického činidla sa získala štandardná krivka medzi 13pM a 41250pM. Koncentrácia hMCM5 vo vzorke sa stanovila porovnaním impulzov vzorky v DELFIA teste so štandardnou krivkou urobenou z rekombinantným hMCM5 5% BSA/PBS. Ešte lepšia citlivosť sa dá očakávať pri použití monoklonálnych protilátok.

Vzorky moču od pacientov s malignitami močového traktu z Addenbrookes nemocnice, Cambridge, UK sa centrifugovali (50 až 150 ml) pri 3000 rpm (SIGMA 4K10, 7 min, 4 °C) a rozpustné frakcie z bunkového peletu sa vyrobili hypotonickým napučiavaním, homogenizáciou a slanou extrakciou DNA-viazaných proteínov. Rozpustné frakcie sa testovali použitím MCM5 DELFIA a biochemické údaje sa porovnávali s diagnostickými správami na urologických patologických službách nemocnice.

Z piatich vzoriek, ktoré boli klinicky stanovené ako pozitívne malígne, boli 4 stanovené ako pozitívne použitím DELFIA podľa vynálezu (80 %), pričom vykazovali merateľné množstvá MCM5 (29 až 85 pM). Zo šiestich vzoriek, ktoré boli klinicky stanovené ako negatívne z hľadiska malignity, vykazovali všetky DELFIA odpovede podobné nulovému štandardu.

-38Príklad 16

Analýza vzoriek krvi pacientov s akútnou a chronickou leukémiou/lymfómom

DELFIA opísaná v príklade 15 bola použitá na testovanie vzoriek krvi získaných od pacientov s akútnou a chronickou leukémiou/lymfómom zAddenbrookes Nemocnice, Cambridge. Krv sa centrifugovala pri 3000 rpm (SIGMA 4K10, 7 min, 4 °C) a rozpustné frakcie z bunkového peletu sa vyrobili hypotonickým napučiavaním, homogenizáciou a slanou extrakciou DNA viazaných proteínov. Rozpustné frakcie sa následne testovali použitím DELFIA.

Zo 6 malígnych prípadov bolo 5 otestovaných ako pozitívnych použitím DELFIA podľa predloženého vynálezu (83 %), pričom vykazovali merateľné množstvá MCM5 (24-1945 pM). Zo 6 kontrolných vzoriek (krv od diabetických ambulantných pacientov) dávali všetky odpovede podobné nulovému štandardu.

Príklad 17

Sérologická detekcia metastatickej malignity

Testy sa uskutočňovali so sérom pacientiek s metastatickou prsníkovou a vaječníkovou rakovinou z Addenbrookes Nemocnice, Cambridge, UK použitím DELFIA opísanej v príklade 15.

Dva prípady sarkómu a tri prípady karcinómu (prsníkový a vaječníkový adenokarcinóm) vykázali merateľné množstvá MCM5.

Príklad 18

Príprava „pan-MCM“ polyklonálnej protilátky na použitie podľa vynálezu

Prípravok polyklonálnej protilátky schopný viazať MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7 sa získal nasledovne.

Peptid WCIDEFDKMSDMRTAC, zodpovedajúci konsenzus sekvencii spoločnej pre MCM rodinu proteínov, sa syntetizoval použitím t-BOC chémie. Peptid sa konjugoval na PPD (purifikovaný proteínový derivát - tuberkulín).

-39Králiky sa imunizovali injekciou v 21 dňových intervaloch. 10 dní po tretej imunizácii sa odobralo sérum a bolo použité v následných experimentoch (označované ako „pan-MCM“ protilátka v nasledujúcich experimentálnych príkladoch).

Príklad 19

Farbenie normálneho prsníkového a prsníkového nádorového tkaniva s anti-Cdc6, anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7 a pan-MCM protilátkami

Histologické vzorky normálneho prsníka (od pacientiek, ktoré sa podrobili operáciám na redukciu prsníkov) a histologické vzorky potvrdených duktálnych a lobulárnych karcinómov sa farbili protilátkami proti Cdc6, MCM2, MCM5 a MCM7 a pan-MCM protilátkou. Anti-MCM2 protilátka bola BM28 myšou monoklonálnou protilátkou komerčne dostupnou od Transduction Laboratories (pozri ich Katalóg protilátok z roku 1998). Farbenie sa uskutočňovalo individuálne pre každú protilátku ako je opísané.

Skúmané boli tak vo formalíne fixované vzorky obalené parafínom, ktoré sa sterilizovali, ako aj mrazené vzorky.

V súlade s etickými pravidlami potvrdenými nemocnicou sa využili formalínom fixované ľudské tkanivá obalené parafínom získané diagnostickou biopsiou alebo po resekcii v Addenbrooke Nemocnici. Z týchto tkanív sa odrezali päť mikrometrové rezy na APES (aminopropyltrietoxysilánom) pokryté podložné sklíčka, ktoré sa v xyléne zbavili vosku a prešli cez alkoholy a vodu. Tkanivá sa varili tlakom v citrátovom tlmivom roztoku, aby sa uľahčilo vyhľadávanie epitopu, nasledovalo premývanie v Tris-tlmenom fyziologickom roztoku (TBS). Endogénna peroxidázová aktivita sa potlačila inkubáciou v 0,6% hydrogénperoxide v TBS počas 30 minút.

Rezy sa premyli v TBS a blokovali sa s 10% kozím sérom v TBS do 2 hodín.

Primárne protilátky sa riedili v TBS s obsahom 0,1% Tritónu a 1% hovädzieho sérového albumínu (BSA). Sto mikrolitrov sa pridalo ku každému rezu a sklíčka sa inkubovali pri 4 °C vo vlhkej komore.

-40Sklíčka sa potom premývali v TBS s obsahom 0,025% Tritónom, nasledovala inkubácia v biotinylovanej kozej anti-králičej sekundárnej protilátky (DÁKO) v pomere 1:500 v TBS s obsahom 1% BSA počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote. Po premývaniach v TBS bol na farbenie sklíčok použitý systém strepavidínu a chrenovej peroxidázy využívajúci diaminobenzidín. Reakcia sa zastavila odmytím vo vode a sklíčka sa jemne kontrastne farbili s Harrisovým hematoxylínom, dehydratovali sa v stupňovaných etanoloch a vyčistili sa v xyléne. Aplikovali sa krycie sklíčka s DEPEX prichytávacím médiom.

Mrazené rezy sa pripravili ako je opísané vyššie v príklade 7 s výnimkou toho, že blokovanie s 10% kozím sérom sa uskutočňovalo 30 minút a nie cez noc.

V normálnom prsníkovom tkanive sa fen 1 až 3 % duktálnych a lobuiárnych buniek farbilo pozitívne. Stromálne bunky boli negatívne.

až 80 % abnormálnych buniek v rôznych prsníkových karcinómoch, vrátane nízko- a vysokostupňových lézii a lobulárneho a duktálneho typu, bolo pozitívne farbených, pričom okolité stromálne bunky a zápalové bunky ostali nezafarbené.

Tieto výsledky sa získali jednotlivo s každou protilátkou.

Uskutočnilo sa porovnanie s anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami. Na parafínových rezoch dávalo anti-PCNA farbenie podobné výsledky ako anti-MCM5 a anti-Cdc6, zatiaľ čo anti-Ki67 protilátky poskytovali len slabé, fokálne farbenie. Na mrazených rezoch vykazovalo farbenie s anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami oveľa lepšie výsledky ako s anti-PCNA alebo anti-Ki67 protilátkami.

Príklad 20

Farbenie normálnej prostaty a adenokarcinómu prostaty použitím protilátok proti MCM5, MCM7 a pan-MCM

V parafíne obalené histologické vzorky normálneho tkaniva a adenokarcinómu prostaty, pripravené ako bolo opísané pre prsníkové tkanivo v príklade 19, sa farbili anti-MCM5, anti-MCM7 a pan-MCM protilátkami v oddelených experimentoch.

-41 Normálne prípady vykazovali menej ako 10 % pozitívne farbených buniek s každou protilátkou, zatiaľ čo adenokarcinómy vykazovali farbenie 30 až 50 % nádorových buniek, pričom okolité stromálne bunky a zápalové bunky ostali nesfarbené.

Príklad 21

Farbenie normálneho hrubého čreva a karcinómu hrubého čreva použitím protilátok proti MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM a Cdc6

Histologické resekčné vzorky adenokarcinómu hrubého čreva a tubulovilózneho adenómu sa farbili oddelene s protilátkami proti MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM a Cdc6. Týmito protilátkami sa farbili aj normálne vzorky.

V normálnom tkanive každá protilátka farbila len spodnú tretinu krýpt hrubého čreva, pričom povrchovejšie diferencované bunky v kryptách ostali nesfarbené.

Tak v tubulovilóznom adenómovom, ako aj v adenokarcinómovom tkanive bolo viac ako 50 % nádorových buniek pozitívne sfarbených každou protilátkou, pričom nedochádzalo k farbeniu okolitých spojovacích tkanivových elementov.

Tak mrazené, ako aj parafínom obalené vzorky sa skúmali ako bolo uvedené pre prsnikové tkanivo v príklade 19. Výsledky boli podobné ako medzi anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami na jednej strane, a anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami na druhej, tzn. že mrazené vzorky boli s anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami farbené vynikajúco v porovnaní s farbením získaným použitím anti-PCNA a anti-Ki67 protilátok.

Príklad 22

Farbenie normálneho tkaniva a karcinómu pľúc s protilátkami proti MCM2, MCM5, MCM7 a pan-MCM

V parafíne obalené histologické vzorky biopsií alebo resekcií od pacientov s karcinómom šupinových buniek alebo adenokarcinómom pľúc sa farbili s antiMCM2, anti-MCM5, anti-MCM7 a pan-MCM protilátkami. Vzorky sa pripravili ako je

-42opísané pre prsníkové tkanivo v príklade 19. Farbenie sa porovnávalo s farbením normálneho parechýmového pľúcneho tkaniva.

V normálnom tkanive bolo farbenie proliferatívnej frakcie veľmi slabé..

Vo všetkých karcinómoch bolo viac ako 30 % nádorových buniek pozitívnych, pričom nedochádzalo k farbeniu okolitých zápalových alebo spojovacích tkanivových buniek.

Príklad 23

Farbenie močového mechúra, tak normálneho, ako aj karcinómového, s anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7, pan-MCM a anti-Cdc6 protilátkami

Histologické vzorky z biopsií a prechodných bunkových karcinómov, odobrané cystoskopiou, sa farbili s anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7, pan-MCM a antiCdc6 protilátkami.

V tkanive normálneho močového mechúra sa detegovaio silné farbenie bazálnej vrstvy prechodného epitelu, pričom viaceré povrchové diferencované bunky ostali nesfarbené. Vo fragmentoch obsahujúcich karcinóm sa dysplastické bunky v celej hrúbke farbili in situ pozitívne.

Prípady invazívneho prechodného bunkového karcinómu vykazovali 50 až 100 % jadrové farbenie nádorových buniek, pričom nedochádzalo k farbeniu stromáinych a zápalových zložiek.

Tak mrazené, ako aj v parafíne obalené vzorky sa skúmali ako je uvedené pre prsníkové tkanivo v príklade 19. Výsledky boli podobné ako medzi anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami na jednej strane, a anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami na druhej, tzn. že mrazené vzorky boli s anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami farbené vynikajúco v porovnaní s farbením získaným použitím anti-PCNA a anti-Ki67 protilátok.

Príklad 24

Farbenie rôznych vzoriek kože s anti-MCM5 protilátkami

-43S anti-MCM5 protilátkami boli farbené histologické vzorky normálnej kože, kože hyperplastických stavov (vrátane psoriázy), solárnych keratóz, Bowenovej choroby a invazívnych karcinómov šupinových buniek.

V normálnej koži sa predominantne farbila bazálna vrstva epitelu a farbili sa aj príležitostné bunky spodnej tretiny epidermy, ale povrchovejšie diferencované bunky ostali nesfarbené.

V prípadoch psoriázy sa predominantnejšie farbili najspodnejšie 3 až 4 vrstvy epidermy, čo odrážalo zvýšenú rýchlosť obmieňania v pokožke.

Solárne keratózy a Bowenove ochorenie (karcinóm in situ) vykazovali farbenie všetkých dysplastických buniek v epiderme až do úplnej hrúbky.

V invazívnych karcinómoch šupinových buniek sa farbilo viac ako 70 % buniek, pričom dobre diferencované nádory obsahovali malé škvrny negatívne diferencovaných buniek pri keratínových guličkách.

Príklad 25

Farbenie larynxu s anti-MCM5 protilátkami

Histologické vzorky normálneho a karcinómového larynxu, pripravené ako bolo opísané pre parafínom obalené vzorky prsníkového tkaniva v príklade 19, sa farbili anti-MCM5 protilátkou.

V normálnych prípadoch sa farbili len bazálne proliferatívne epiteliálne bunky (menej ako 10 %).

V karcinómoch sa farbilo viac ako 50 % buniek jadrovým farbením. Stromálne a zápalové bunky boli všade negatívne.

Príklad 26

Farbenie ezofágu s anti-MCM5 protilátkami

Histologické vzorky normálneho a karcinómového ezofágu, pripravené ako bolo opísané pre parafínom obalené vzorky prsníkového tkaniva v príklade 19, sa farbili anti-MCM5 protilátkou.

-44V normálnych prípadoch sa farbili len bazálne proliferatívne epiteliálne bunky (menej ako 10 %).

V karcinómoch sa farbilo viac ako 50 % buniek jadrovým farbením. Stromálne a zápalové bunky boli všade negatívne.

Príklad 27

Farbenie priedušnice s anti-MCM5 protilátkami

Histologické vzorky normálnej a karcinómovej priedušnice, pripravené ako bolo opísané pre parafínom obalené vzorky prsníkového tkaniva v príklade 19, sa farbili anti-MCM5 protilátkou.

V normálnych prípadoch sa farbili len bazálne proliferatívne epiteliálne bunky (menej ako 10 %).

V karcinómoch sa farbilo viac ako 50 % buniek jadrovým farbením. Stromálne a zápalové bunky boli všade negatívne.

Príklad 28

Farbenie lymfatických uzlín, tak normálnych, ako aj s radou lymfómov, použitím anti-MCM5 protilátkou

Tak mrazené, ako aj parafínom obalené histologické vzorky sa pripravili z reaktívnych lymfatických uzlín a rady Hodgkinových a iných ako Hodgkinových lymfómov, ako je opísané pre prsnikové tkanivo v príklade 19.

V reaktívnych lymfatických uzlinách sa silno farbili bunky v germinálnom centre lymfoidných folikúl a v parafolikulárnych oblastiach boli príležitostne roztrúsené pozitívne bunky.

V lymfómoch sa jadrovo farbilo viac ako 50 % malígnych lymfoidných buniek.

Príklad 29

Analýza urinárnych cytologických sterov s anti-MCM5 protilátkou

-45Vzorky moču sa zozbierali od pacientov s prechodným bunkovým karcinómom a od normálnych pacientov navštevujúcich urologickú kliniku. Dvadsať mililitrov moču sa scentrifugovalo pri 3 000 g 10 minút, supernatant sa odstránil a pelet sa resuspendoval v 50 μΙ supernatantu. Toto sa rozotrelo na APES sklíčka a tie sa fixovali v alkohole.

Sklíčka sa premývali v Tris tlmenom fyziologickom roztoku (TBS), potom sa permeabilizovali v 4mM deoxycholáte sodnom 10 minút. Sklíčka sa premývali s TBS s 0,025% Tritónom a blokovali sa s 10% kozím sérom v TBS 2 hodiny. Predabsorbovaná anti-MCM5 protilátka sa nariedila v TBS s obsahom 0,1% Tritónu a 1% BSA a 200 mikrolitrov sa pridalo na každé sklíčko. Inkubovalo sa cez noc pri 4 °C vo vlhkej komore na orbitálnej miešačke.

Sklíčka sa premývali v TBS s obsahom 0,025% Tritónu, nasledovalo inkubovanie v biotinylovanej kozej anti-králičej sekundárnej protilátke (DÁKO) v pomere 1:500 v TBS s obsahom 1% BSA, 1 hodinu pri laboratórnej teplote. Endogénna peroxidáza sa blokovala s 0,6% hydrogénperoxidom v TBS, 10 minút, nasledovalo premývanie v TBS. Na farbenie sklíčok sa použil systém streptavidínu a chrenovej peroxidázy používajúci substrát diaminobenzidín. Reakcia sa zastavili vymývaním vodou a sklíčka sa jemne farbili Harrisovým hematoxylínom a nasledovalo farbenie s Orange G a EA50 (PAP farbenie).

V šiestich prípadoch prechodného bunkového karcinómu, sa v urinárnych cytologicých steroch pripravených týmto spôsobom a farbených s anti-MCM5 protilátkou silne farbili všetky malígne prechodné bunky, pričom v pozadí boli nefarbené zápalové a šupinové bunky. Podobné stery vyrobené z moču normálnych ľudí navštevujúcich urologické kliniky sa nefarbili ani šupinové, ani normálne prechodné bunky.

Príklad 30

DELFIA vzoriek normálnych krčkov maternice a vzoriek krčku maternice od pacientov so šupinovými intraepiteliálnymi léziami

-46Disociáciu zosilňujúci lantanoidový fluorescenčný imunotest (DELFIA) sa určil na detekciu ľudského MCM5 použitím dvoch rozličných polyklonálnych anti-MCM5 antisér ako je opísané v príklade 15 vyššie.

Anylazovali sa dve vzorky normálneho krčku maternice a dve vzorky HSIL krčku maternice. Tkanivové vzorky sa solubilizovali hypotonickým napučiavaním a homogenizáciou a nasledovala slaná extrakcia DNA viazaných častíc.

Dve normálne vzorky vykázali odpovede podobné nulovým štandardom.

Dve HSIL vzorky boli stanovené ako pozitívne, z čoho vyplýva, že abnormalita vo vzorke krčku maternice sa môže detegovať použitím imunotestu.

Príklad 31

Farbenie rôznych nádorových tkanív s anti-MCM5 protilátky

Histologické vzorky rôznych karcinómov a leukemickej kostnej drene sa farbili s anti-MCM5 protilátkami a výsledky boli nasledovné:

V karcinómoch žalúdka sa farbilo viac ako 50 % nádorových buniek.

V karcinómoch obličiek sa farbilo 30 až 50 % nádorových buniek.

V karcinómoch vaječníkov sa farbilo 30 až 50 % nádorových buniek.

V karcinómoch semenníkov sa farbilo 30 až 50 % nádorových buniek.

Pri kostnej dreni s akútnou leukémiou sa farbilo viac ako 90 % nádorových buniek.

Príklad 32

Farbenie sterov hrubého čreva

Fekálny materiál zozbieraný od zdravých pacientov a povrchové lúpavé kolonocyty sa extrahovali z fekálnych vzoriek prostredníctvom magnetických guličiek potiahnutých epiteliálne špecifickými protilátkami, dodávanými firmou Dynal AS (Oslo, Nórsko) použitím spôsobu opísaného vo W097/09600.

Extrahovaná zmes magnetických guličiek a epiteliálnych buniek v TBS (Tristlmený fyziologický roztok) s obsahom 0,025% Tritónu. Po fixácii v 4% tlmenom

-47paraformaldehydom sa bunky premyli v TBS a z výsledného bunkového peletu sa urobili stery. Tieto sa potom ošetrili ako stery vzoriek moču.

V PAP farbených steroch sa nachádzala zmes magnetických guličiek, nejaká celulóza a bunkové úlomky; a prítomné boli mnohé stĺpcové epiteliálne bunky z hrubého čreva a niekoľko šupinových buniek z análneho kanála.

Pri farbení s anti-MCM5 protilátkami sa získali podobné výsledky pre normálne a abnormálne bunky, ako pre močový mechúr alebo kŕčok maternice.

Príklad 33

Farbenie rezov čriev od pacientov s vredovou kolitídov

V parafíne obalené rezy čriev od prípadov aktívnej vredovej kolitídy sa farbili protilátkami proti MCM5.

Vo všetkých testovaných rezoch približne 50 % povrchových epiteliálnych buniek vykazovalo expresiu MCM5 v zapálených oblastiach. Pri aktívnych vredových kolitídach je prítomný veľký počet lymfocytov a aj tieto bunky vykazujú častú jadrovú expresiu MCM5.

Analyzované boli aj rezy pokojovej vredovej kolitídy (tzn. bez aktívneho zápalu). Vo všetkých týchto rezoch sa epiteliálne bunky nefarbili s MCM5. Z malého počtu lymfocytov prítomných pri pokojovej vredovej kolitíde sa len ojedinelá bunka jadrovo farbila s MCM5.

Zistilo sa, že v parafínom obalených rezoch je farbenie pri aktívnej a pokojovej vredovej kolitíde podobné pre MCM5 a pre PC NA.

Príklad 34

Farbenie rezov čriev od pacientov s Crohnovou chorobou

Farbenie v parafíne obalených rezov čriev od pacientov s aktívnou

Crohnovou chorobou dokázalo jadrovú expresiu MCM5 v povrchových epiteliálnych bunkách pri oblastiach vredov a zápalu. Lymfocyty v zapálených tkanivách tiež vykázali častú jadrovú expresiu MCM5.

-48Testované bolo aj tkanivo čreva od pacientov s pokojovou Crohnovou chorobou, a tak povrchové epiteliálne bunky, ako aj malý počet prítomných lymfocytov, boli negatívnye na MCM5.

Podobné výsledky sa získali pre anti-MCM5 protilátky, ako aj pre anti-PCNA protilátky v parafínom obalených prípadoch aktívnej a pokojovej Crohnovej choroby.

Porovnanie medzi anti-MCM5 a anti-PCNA farbením urobeným na mrazených rezoch a na rezoch obalených v parafíne dokázalo, že v mrazených rezoch je farbenie s anti-MCM5 protilátkami vynikajúce v porovnaní s farbením s anti-PCNA protilátkami, pričom je farbených viac jadier.

Príklad 35

Farbenie normálneho a rakovinového endometria s anti-MCM5 protilátkami

Mrazené a v parafíne obalené rezy normálneho a rakovinového endometria sa farbili s anti-MCM5 protilátkami.

Dobré farbenie sa ukázalo v rakovinovom endometriu v porovnaní s normálnym tkanivom, a vynikajúce farbenie v mrazených rezoch v porovnaní s rezmi obalenými v parafíne.

Príklad 36

Farbenie bunkovej monovrstvy steru krčku maternice (ThinPrep)

Po urobení steru na APES sklíčku sa štetec/špachtľa, použitá na odobratie steru krčka maternice, umiestnila do 75% metanolu a zvyšné bunky sa odstránili vortexovaním. Suspenzia buniek sa naniesla do vrstvy na 20% sacharózu, scentrifubovala sa pri 3 000 rpm, 5 minút a bunkový pelet sa resuspendoval v 200 mikrolitroch vody. 50 mikrolitrov sa umiestnilo na každé sklíčko, bunky sa nechali usadiť a odstránila sa voda. Sklíčka sa potom ošetrili ako v príklade 29 (urinárne cytologické stery) a aplikovalo sa PAP farbenie.

V rôznych experimentoch boli výsledky získané pre jednovrstvové stery rovnaké ako výsledky získané s bežnými stermi. Použitie jednovrstvových

-49prípravkov môže byť výhodné v tom, že sú odstránené slizničné a väčšina zápalových buniek.

Diskusia

Tu opísané výsledky ukazujú, že tak Cdc6, ako aj MCM5 sú tlmené v normálnych diferencovaných tkanivách in vivo a chýbajú v chromatíne v rade pokojových cicavčích buniek v kultúre. To naznačuje, že tieto proteíny môžu mať potenciálnu hodnotu ako bunkové proliferačné markery. Hiraiwa a iný demonštrovali, že MCM7 môže byť imunolokalizovaný v rôznych typoch nádorov, ako v benígnych nádoroch kože a malígnych nádoroch žalúdka, pankreasu a hrubého čreva, s podobnou distribúciou ako PCNA. Z toho vyvodili, že MCM7 imunolokalizácia môže byť použitá ako index bunkovej proliferácie v tkanivových rezoch. Avšak, ako už bolo poznamenané vyššie, experti v oblasti patológie sú skeptickí v tom, že meranie bunkových proliferačných rýchlostí v nádoroch markermi ako PCNA a Ki68 sa nebude dať klinicky použiť, keďže je len málo priamych dôkazov o tom, že takéto markery predstavujú skutočné zlepšenie bežných histologických hodnotení, ako odstupňovania a určovania štádií, keď sú optimálne použité.

Tu publikované pozorovania ukazujú, že špecifické väzobné molekuly nasmerované proti Cdc6, MCM5 a MCM7 vykazujú oveľa vyšší stupeň špecificity pre potenciálne pred-malígne bunky v čerstvých a mrazených krčkov maternice SILs, ako bežné proliferačné markery, ako napríklad PCNA a Ki67. Anti-Cdc6 a antiMCM5 sú schopné jednoznačne odlíšiť abnormálne bunky v LSIL a HSIL od normálnych buniek, vrátane endocervikáIných, ektocervikálnych, metaplastických a stromálnych buniek.

Vzhľadom na uvedené boli anti-Cdc6 a anti-MCM protilátky aplikované na stery krčkov maternice od pacientov so SILs a od zdravých pacientov. Výsledky boli prekvapujúce s ohľadom na zarážajúci stupeň špecificity a senzitivity pozorovanej pre tieto proteíny. Pozorovalo sa silné jadrové a cytoplazmatické farbenie tak v neoplastických bunkách, ako aj v HPV-infikovaných koilocytoch. Pozitívne imunofarbenie sa identifikovalo aj v metaplastických šupinových bunkách s hraničnými abnormalitami (atypické šupinové bunky neistého významu). Avšak

-50zvyšná zmiešaná populácia normálnych buniek v stere, vrátane ektocervikálnych buniek, endocervikálnych buniek, šupinových metaplastických buniek a zápalových buniek (tak lymfocytov, ako aj neutrofilov) bola negatívna pri Cdc6 a MCM imunofarbení.

Citlivosť anti-MCM5, anti-Cdc6 a anti-MCM7 je oveľa vyššia ako anti-PCNA, keď sa aplikujú na stery krčku maternice a na mrazené rezy, ale tieto protilátky majú podobné charakteristiky farbenia, po aplikácii na tkanivo fixované vo formalíne, obalené parafínom a vystavené vyhľadávaniu antigénu sterilizáciou. Stery krčku maternice a iné cytologické vzorky, ako aj mrazené rezy, sú menej robustné ako formalínom fixované, v parafíne obalené tkanivové rezy, a tak sa nemôžu variť tlakom.

Prekvapujúca špecificita a citlivosť Cdc6 a MCM protilátok, keď sa aplikujú na stery krčku maternice, poskytuje predpoklady na zavedenie biochemicko/imunocytologického postupu hromadného automatizovaného skríningu krčku maternice. Navyše, tieto protilátky môžu pomôcť zlepšiť detekciu a klasifikáciu LSILs, pre ktoré v súčasnosti existujú intrapozorovacie a interpozorovacie variácie pri určení stupňa aj medzi odborníkmi v oblasti cytológie krčku maternice. Použitie týchto protilátok bude tiež pomáhať identifikovať HSILs s vysokou presnosťou a objektivitou, a tak pomôže znížiť vysoký počet falošne negatívnych výsledkov, čo je hlavný problém spojený so súčasnými globálnymi programami na skríning krčku maternice.

Ako bolo uvedené, ďalšie experimentálne príklady zhodnotenia prsníkového tkaniva, vzoriek žalúdka, obličiek, vaječníkov, semenníkov, hrubého čreva, moču a krvi (tak od leukemických/lymfómových pacientov, ako aj pacientov s metastatickým sarkómom a adenokarcinómom), tiež tkanív zápalových ochorení vnútorností, vrátane vredovej koiitídy a Crohnovej choroby a príklady zhodnotenia fekálnych sterov naznačujú všeobecnosť uskutočnení predloženého vynálezu, ktorý sa nevzťahuje len na skríning krčku maternice, hoci zhodnotenie vzoriek krčku maternice, najmä sterov krčku maternice, je výhodným medzi rôznymi uskutočneniami. Okrem cytológie je demonštrovaná aj aplikácia biochemických techník.

-51 Výsledky slepého pokusu porovnávajúceho uskutočnenie podľa predloženého vynálezu s hodnotením sterov krčku maternice použitím štandardného PAP stierania, ktorý je opísaný v príklade 14, vyššie, potvrdzujú vynikajúcu využiteľnosť vynálezu.

Všetky tu uvedené dokumenty sú zahrnuté prostredníctvom ich citácie.

Tabuľka 1

Porovnávanie anti-Mcm5 protilátkového testu a bežného Pap testu v slepom pokuse s pacientmi zavolanými späť na kolposkopické kliniky

	Výsledky štandardného Pap testu
normál	nízky stupeň	vysoký stupeň
Anti-Mcm5 protilátkový test	Prítomnosť pozitívnych buniek	3a	9	17
Absencia pozitívnych buniek	13	0	0

a) pozri text

Claims (48)

1. PATENTOVÉ NÁROKY py 559-&0oo

   1. Spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke jedinca, ktorý zahŕňa detegovanie cieľového polypeptidu vo vzorke, vyznačujúci satým, že cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie; s podmienkou, že ak je cieľovým polypeptidom MCM7, vzorka nie je podrobená vyhľadávaniu antigénu alebo sterilizácii/autoklávovaniu.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7 proteínkinázy, Dbf4, Cdc14 proteínfosfatázy, Cdc45 a MCM10.
3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, M C M 6 a MCM7.
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je Cdc6.
5. 5. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM2.
6. 6. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM3.
7. 7. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM4.
8. 8. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM5.

   -539. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM6.

   • 10. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým ► polypeptidom je MCM7.

   w
9. 11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa uvedenie vzorky do kontaktu so špecifický väzobným členom alebo špecifickými väzobnými členmi nasmerovanými proti cieľovému polypeptidu a stanovenie viazania sa špecifického väzobného člena alebo členov na vzorku.
10. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že špecifický väzobný člen alebo špecifické väzobné členy sú nasmerované proti viacerým z uvedených cieľových polypeptidov.
11. 13. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa t ý m , že sa testuje vzorka tkaniva.
12. 14. Spôsob podľa nároku 13,vyznačujúci sa tým, že vzorka tkaniva je čerstvá alebo mrazená.

    •
13. 15. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že vzorka tkaniva nie je fixovaná formalínom alebo obalená parafínom.

    «
14. 16. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že vzorka tkaniva sa nepodrobí antigénovému vyhľadávaniu alebo sterilizácii/autoklávovaniu.
15. 17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 16, vyznačujúci sa t ý m , že tkanivo je vybrané z pľúc, prsníka, hrubého čreva, prostaty, žalúdka, kože, ezofágu a močového mechúra.

    -5418. Spôsob podľa nároku 17, vy z n a č u j ú c i sa t ý m , že tkanivo je prsníkové tkanivo.
16. 19. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa t ý m , že sa testuje vzorka buniek.
17. 20. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa t ý m , že vzorkou je tekutina odobratá od jedinca.
18. 21. Spôsob podľa nároku 20, vy z n a čuj ú c i sa t ý m , že vzorka buniek je poskytnutá z uvedenej tekutiny.
19. 22. Spôsob podľa nároku 20 alebo 21, vy z n a č u j ú c i sa tým, že tekutinou je krv.
20. 23. Spôsob podľa nároku 20 alebo 21, vyznačujúci sa tým, že tekutinou je moč.
21. 24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 23, vyznačujúci sa t ý m , že sa skrínuje populácia jedincov.
22. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že osoby sú kategorizované ako osoby s tkanivami, ktoré sú (i) normálne alebo (ii) abnormálne, vrátane potenciálne alebo skutočne pred-nádorových alebo nádorových, dysplastických alebo neoplastických buniek.
23. 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že tkanivo alebo bunky osôb kategorizovaných ako osoby, ktoré majú abnormálne tkanivo, sa podrobia ďalšiemu skúmaniu alebo analýze.
24. 27. Spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke krčku maternice

    -55od jedinca, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa uvedenie vzorky do kontaktu so špecifickým väzobným členom alebo špecifickými väzobnými členmi nasmerovanými proti cieľovému polypeptidu a stanovenie viazania sa špecifického väzobného člena alebo väzobných členov na vzorku, pričom cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie.
25. 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že vzorka je ster krčku maternice.
26. 29. Spôsob podľa nároku 27 alebo 28, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7 proteínkinázy, Dbf4, Cdc14 proteinfosfatázy, Cdc45aMCM10.
27. 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7.
28. 31. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je Cdc6.
29. 32. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM2.
30. 33. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM3.
31. 34. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM4.
32. 35. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM5.

    -5636. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM6.
33. 37. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM7.
34. 38. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 37, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že špecifický väzobný člen alebo špecifické väzobné členy sú nasmerované proti viacerým z uvedených cieľových polypeptidov.
35. 39. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 38, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa skrínuje populácia jedincov.
36. 40. Spôsob podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že osoby sú kategorizované ako osoby s tkanivami, ktoré sú (i) normálne alebo (ii) abnormálne, vrátane potenciálne alebo skutočne pred-nádorových alebo nádorových, dysplastických alebo neoplastických buniek.
37. 41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa t ý m , že tkanivo alebo bunky osôb kategorizovaných ako osoby, ktoré majú abnormálne tkanivo, sa podrobia ďalšiemu skúmaniu alebo analýze.
38. 42. Spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu v jedincovi, ktorý zahŕňa detekovanie cieľového polypeptidu alebo mRNA kódujúcej cieľový polypeptid v tkanive, tekutine alebo bunkách jedinca, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie; s podmienkou, že ak sa spôsob uskutočňuje na vzorke odobratej jedincovi a cieľovým polypeptidom je MCM7, vzorka nie je podrobená vyhľadávaniu antigénu alebo steriiizácii/autoklávovaniu.

    -5743. Spôsob podľa nároku 42, vyznačujúci sa tým, že tkanivo, tekutina alebo bunky vo vzorke sú odobraté z jedinca.
39. 44. Spôsob podľa nároku 43, vyznačujúci sa tým, že vzorkou je k

    * tkanivo.

    b
40. 45. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že vzorka je čerstvá alebo mrazená.
41. 46. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že vzorka nie je fixovaná formalínom alebo obalená parafínom.
42. 47. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že vzorka tkaniva sa nepodrobí antigénovému vyhľadávaniu alebo sterilizácii/autoklávovaniu.
43. 48. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 42 až 47, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa skrínuje populácia jedincov.
44. 49. Spôsob podľa nároku 48, vyznačujúci sa tým, že osoby sú kategorizované ako osoby s tkanivami, ktoré sú (i) normálne alebo (ii) abnormálne, vrátane potenciálne alebo skutočne pred-nádorových alebo nádorových, dysplastických alebo neoplastických buniek.

    * %

    »'
45. 50. Spôsob podľa nároku 49, v y z n a č u j ú c i sa tý m , že tkanivo alebo bunky osôb kategorizovaných ako osoby, ktoré majú abnormálne tkanivo, sa podrobia ďalšiemu skúmaniu alebo analýze.
46. 51. Kit, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nasledujúce zložky (i) a (ii):

    (i) špecifický väzobný člen alebo špecifické väzobné členy nasmerované proti jednému alebo viacerým cieľovým polypeptidov, pričom cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie, a

    -58(ii) inštrukcie na použitie špecifického väzobného člena alebo členov v spôsobe podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 48.
47. 52. Kit podľa nároku 51, vy z n a č u j ú c i sa t ý m , že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7 proteínkinázy, Dbf4, Cdc14 proteínfosfatázy, Cdc45 a MCM10.
48. 53. Kit podľa nároku 52, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7.

    54. Kit podľa nároku polypeptidom je Cdc6. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 55. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM2. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 56. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM3. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 57. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM4. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 58. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM5. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 59. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM6. 53, vyznačujúci s a tým, w ze cieľovým 60. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM7. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým

    -5961. Kit podľa ktoréhokoľvek z nárokov 51 až 60, v y z n a č u j ú c i sa tým, že špecifický väzobný člen alebo špecifické väzobné členy sú namierené proti viacerým z cieľových polypeptidov.