SK5592000A3 - Determination of cellular growth abnormality - Google Patents
Determination of cellular growth abnormality Download PDFInfo
- Publication number
- SK5592000A3 SK5592000A3 SK559-2000A SK5592000A SK5592000A3 SK 5592000 A3 SK5592000 A3 SK 5592000A3 SK 5592000 A SK5592000 A SK 5592000A SK 5592000 A3 SK5592000 A3 SK 5592000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- cells
- sample
- mcm5
- target polypeptide
- tissue
- Prior art date
Links
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 193
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 101
- 101001017545 Homo sapiens DNA replication licensing factor MCM5 Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 102100034001 DNA replication licensing factor MCM5 Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 66
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 101001018431 Homo sapiens DNA replication licensing factor MCM7 Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 102100033711 DNA replication licensing factor MCM7 Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 101000963174 Homo sapiens DNA replication licensing factor MCM3 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 101000583807 Homo sapiens DNA replication licensing factor MCM2 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102100039606 DNA replication licensing factor MCM3 Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 claims abstract description 20
- 101000615280 Homo sapiens DNA replication licensing factor MCM4 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102100021389 DNA replication licensing factor MCM4 Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 101001018484 Homo sapiens DNA replication licensing factor MCM6 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102100033720 DNA replication licensing factor MCM6 Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 90
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 62
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 46
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 43
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 38
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 37
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 35
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 21
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 12
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 12
- -1 Dbf4 Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 10
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 claims description 6
- 101000945740 Homo sapiens Cell division cycle 7-related protein kinase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000052165 human CDC7 Human genes 0.000 claims description 5
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 5
- 101100005729 Caenorhabditis elegans cdc-14 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 4
- 101000583797 Homo sapiens Protein MCM10 homolog Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030962 Protein MCM10 homolog Human genes 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 21
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 abstract description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 15
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 abstract description 11
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 abstract description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 abstract description 3
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 abstract description 2
- 102100027047 Cell division control protein 6 homolog Human genes 0.000 abstract 1
- 101000914465 Homo sapiens Cell division control protein 6 homolog Proteins 0.000 abstract 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 115
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 56
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 38
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 32
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 29
- 108010051862 Methylmalonyl-CoA mutase Proteins 0.000 description 22
- 102100030979 Methylmalonyl-CoA mutase, mitochondrial Human genes 0.000 description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 19
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 17
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 16
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 15
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 15
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 15
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 14
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 13
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 12
- 102100030960 DNA replication licensing factor MCM2 Human genes 0.000 description 12
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 11
- 101000697544 Homo sapiens SCL-interrupting locus protein Proteins 0.000 description 11
- 102100028029 SCL-interrupting locus protein Human genes 0.000 description 11
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 11
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 11
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 10
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 10
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 10
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 7
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 7
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 7
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 7
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 7
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 6
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 6
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 5
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 102000053540 human MCM5 Human genes 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 4
- 101150053401 ORC2 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 4
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 3
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 3
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 3
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 3
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MPVDXIMFBOLMNW-ISLYRVAYSA-N 7-hydroxy-8-[(E)-phenyldiazenyl]naphthalene-1,3-disulfonic acid Chemical compound OC1=CC=C2C=C(S(O)(=O)=O)C=C(S(O)(=O)=O)C2=C1\N=N\C1=CC=CC=C1 MPVDXIMFBOLMNW-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000013165 Bowen disease Diseases 0.000 description 2
- 208000019337 Bowen disease of the skin Diseases 0.000 description 2
- 101150061050 CIN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 2
- 101001126977 Homo sapiens Methylmalonyl-CoA mutase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000001126 Keratosis Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 2
- 102000052464 human MCM3 Human genes 0.000 description 2
- 102000052599 human MCM7 Human genes 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 2
- 101150095319 orc1 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 201000005825 prostate adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 210000002163 scaffold cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 208000022158 tubulovillous adenoma Diseases 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 208000036832 Adenocarcinoma of ovary Diseases 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000007879 Atypical Squamous Cells of the Cervix Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 101150070189 CIN3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 230000004707 G1/S transition Effects 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000009875 Ki-67 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010020437 Ki-67 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000042265 MCM family Human genes 0.000 description 1
- 108091077637 MCM family Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000016304 Origin Recognition Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010067244 Origin Recognition Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010061328 Ovarian epithelial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000006994 Precancerous Conditions Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000014604 Specific Language disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 description 1
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 description 1
- 201000007201 aphasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000005068 bladder tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 208000016420 cervical intraepithelial neoplasia grade 2/3 Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 101150005988 cin2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002574 cystoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 101150093523 dbf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000000881 depressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000005274 electronic transitions Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009841 epithelial lesion Effects 0.000 description 1
- 229940089063 epitol Drugs 0.000 description 1
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001280 germinal center Anatomy 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007825 histological assay Methods 0.000 description 1
- 102000048557 human MCM2 Human genes 0.000 description 1
- 102000050409 human MCM4 Human genes 0.000 description 1
- 102000047273 human MCM6 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010073095 invasive ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N iodane Chemical compound [125IH] XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000000990 laser dye Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005004 lymphoid follicle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000016044 mixed lobular and ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 208000013371 ovarian adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006588 ovary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 1
- 238000005353 urine analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57411—Specifically defined cancers of cervix
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Liquid Crystal Substances (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
Description
Spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke jedinca a kit
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka stanovenia buniek vo vzorke tkaniva, buniek alebo tekutiny s ohľadom na detekciu abnormality bunkového rastu, najmä potenciálnych (alebo skutočných) nádorových buniek. Uskutočnenia predloženého vynálezu sú užitočné najmä na skríning vzoriek ako napríklad sterov krčka maternice od žien, aby sa detegovali tie bunky krčku maternice, ktoré sú abnormálne. Vynález je použiteľný aj na zhodnotenie buniek iných tkanivových vzoriek, ako napríklad vzoriek prsníka, ako je experimentálne demonštrované nižšie. Vzorky, o ktorých sa zistí, že sú abnormálne, môžu byť podrobnejšie preskúmané a ďalej sa môžu skúmať stav buniek v tkanive. Po identifikácii malígneho alebo pred-malígneho stavu môže nasledovať vhodná liečba a následné rozsiahlejšie diagnostické postupy.
Doterajší stav techniky
Predložený vynález je založený na prekvapujúcom zistení, že na detekciu abnormálnych buniek môžu byť použité špecifické väzobné molekuly nasmerované proti konkrétnym proteínom pred-iniciačného komplexu DNA replikácie. Výnimočne užitočné sú v predloženom vynáleze väzobné molekuly nasmerované proti Cdc6. Výnimočne užitočné sú aj väzobné molekuly nasmerované proti MCM proteínom, najmä MCM5. Tu zahrnuté experimentálne dôkazy ukazujú, že špecifické väzobné molekuly nasmerované proti Cdc6, a aj molekuly nasmerované proti MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 alebo MCM7 sú oveľa účinnejšie pri označovaní abnormalít bunkového rastu v tkanivových vzorkách ako protilátky proti PCNA a Ki67. A priori by sa dalo očakávať, že Cdc6 a MCM's poskytnú podobné výsledky ako Ki67 a PCNA, keďže všetky tieto proteíny môžu byť považované za „proliferačné markery“. Na vzorkách z krčku maternice, ktoré sa podrobili antigénovému prehľadávaniu (sterilizácia alebo autoklávovanie), nižšie uvedené výsledky experimentov ukázali,
-2že pre všetky tieto proteíny sú získané výsledky podobné, ale existuje jasný rozdiel medzi stermi z krčku maternice a zamrazenými vzorkami. Takéto vzorky, ktoré sú primárne zaujímavé z hľadiska skríningových účelov, nie sú dostatočne veľké, aby sa sterilizovali. Vo vzťahu ku skríningu sú zaujímavé najmä veľmi silné a jasné výsledky získané zhodnotením vzoriek krčka maternice použitím anti-Cdc6 alebo anti-MCM väzobných molekúl, vysoká úroveň farbenia abnormálnych buniek a farbenie v celej hrúbke v LSIL vzorkách. Z toho vyplýva užitočnosť zhodnocovania sterových vzoriek odobratých z epiteliálneho povrchu krčka maternice - a naozaj sú tu nižšie overené experimentálne. Farbenie v celej hrúbke je viditeľné aj v HSIL vzorkách.
Experimentálne stanovenie abnormality v tkanive prsníka, v moči, v krvi a v sére potvrdilo všeobecnosť uskutočnení podľa vynálezu. Ďaiší dôkaz je poskytnutý použitím rovnakých protilátok na detekciu prítomnosti dysplastických alebo neoplastických buniek v telesných tekutinách biochemickými metódami, ktoré môžu byť automatizované. Tu uvedené príklady zahŕňajú detekciu rakoviny mechúra analýzou moču a detekciu leukémie a lymfómu analýzou krvi. Vhodnou metódou na takúto analýzu je disociáciu zosilňujúci lantanidový fluorescenčný imunotest, DELFIA (Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorescence Immunoassay). Zahrnuté je aj demonštrovanie detekcie prípadov sarkómu a karcinómu prostredníctvom DELFIA v krvi.
Epitel krčka maternice je v podstate zložený z dvoch odlišných typov buniek: so šupinového epitelu a so stĺpcového epitelu, pričom každý z týchto epitelov sa nachádza v anatomicky odlišnej oblasti tkaniva. Šupinový epitel sa nachádza na vonkajšej strane (ectocervix) otvoru krčku maternice (os), zatiaľ čo stĺpcový epitel vybieha do vnútorného kanála krčku maternice (endocervix). Tieto dva odlišné typy epiteliálnych buniek sa spájajú v blízkosti otvoru krčku maternice, v mieste nazývanom šupinovo-stĺpcové spojenie. Šupinovo-stĺpcové spojenie je klinicky veľmi dôležité, keďže to je oblasť, kde vzniká väčšina malignit. Aby bola diagnostika platná, mali by stery krčka maternice obsahovať bunky z tejto oblasti. Ster by mal obsahovať stĺpcové, ako aj šupinové epitolové bunky, aby bolo isté, že ster je z tejto oblasti.
-3Väčšina rakoviny krčku maternice vzniká v šupinovo-stĺpcovom spojení zo šupinového epitelu, ktorý je viacvrstvovým dynamickým systémom kmeňových buniek, ktoré sa konštantné obnovujú. Samotný kompartment kmeňových buniek sa nachádza vedľa základnej membrány vo vnútri vrstvy základných buniek. Delením kmeňových buniek vznikajú parabazálne, stredné a povrchové bunkové deriváty. Tieto sú bežne definované tak vo vzťahu ku ich charakteristickej morfológii, ako aj vo vzťahu ku ich umiestneniu vo vnútri šupinového epitelu. Prechod z bazálnych buniek, umiestnených v najhlbšej vrstve šupinového epitelu, do povrchových buniek na jeho povrchu je spojený s progresívnou diferenciáciou a s progresívnym ubúdaním proliferácie až pokiaľ nie sú povrchové šupinové epiteliálne bunky na povrchu krčku maternice terminálne diferencované.
Pri dysplázii sa zvyšuje bunková proliferácia a zároveň sa znižuje diferenciácia buniek, keď postupujú cez šupinový epitel. Typicky zahŕňa najprv skríning krčku maternice zhodnotenie sterov odobratých z povrchu epitelu, pričom cytopatológ hľadá abnormability vzorky povrchu, kde je znížená diferenciácia ako výsledok dysplázie.
V neskorom fetálnom štádiu, počas dospievania a v tehotenstve sú stĺpcové bunky v spojení nahradené šupinovým epitelom procesom metaplázie. Metaplastické šupinové bunky, ktoré nahrádzajú stĺpcové bunky sú veľmi citlivé voči karcinogénom. Normálna metaplázia by sa nemala zamieňať s abnormálnou dyspláziou vo vnútri šupinového epitelu a v súvislosti s kontextom skríningu môže byť dôležitá schopnosť rozlišovať medzi metaplastickými a dysplastickými bunkami.
Napriek intenzívnemu a nákladnému národnému skríningovému programu je rakovina krčku maternice ôsmou najbežnejšou malignitou u žien v UK a najbežnejšou malignitou u žien mladších ako 35 rokov (Kampaň výskumu rakoviny, Cancer of the cervix uteri. 1994, CRC: London). V rozvinutom svete je to najbežnejšia malignita a hlavná príčina smrti žien medzi 35 a 45 rokom, s odhadom 437 000 nových prípadov za rok (Kampaň výskumu rakoviny, Cancer - world perspectives,. 1995, CRC: London).
Väčšina prípadov predstavuje karcinóm šupinových buniek (SCC) a je silne asociovaná s infekciou vysoko rizikovými typmi ľudských papillomavírusov, ako 16,18 a 31 (Park, a iný, Cancer, 1995, 76 (10 dod.): str. 1902-1913) Rakovina krčka
-4maternice je vhodná na prevenciu skríningom populácie, keďže zahŕňa dobre definované neinvazívne intraepiteliálne štádiá (Wright a iný, Precancerous lesions of the cervix, in Blaustein's pathology of the female genital tract. R.J. Kurman, Vydáv. 1994, Springer-Verlag: New York. str. 229-278). Šupinové intraepiteliálne abnormality môžu byť klasifikované použitím 3 radových (CIN) alebo 2 radových (Bethesda) systémov. Rôzne histologické abnormality značne korelujú s typom infikujúceho HPV a s DNA ploiditou, klonalitou a s prirodzenou históriou lézie. Podľa klasifikácie Bethesda systémom nízky stupeň šupinových intraepiteliáinych lézií (LSIL), zodpovedajúci CIN1 a HPV infekcia krčku maternice (HPVI) vo všeobecnosti predstavujú produktívne HPV infekcie s relatívne nízkym rizikom progresie do invazívnej choroby (Wright a Kurman. A critical review of the morphological classification Systems of preinvasive lesions of the cervix: the scientific basis for shifting the paradigm, in Papillomavirus reviews: current research on papillomaviruses, C. Lacey, Vydáv. 1996, Leeds University Press: Leeds). Vysoký stupeň šupinových intraepiteliáinych lézií (HSIL), zodpovedajúci CIN2 a CIN3, znamená vyššie riziko progresie ako CIN1 (LSIL), na oba sa pozerá ako na potenciálne prekurzory malignity. Hoci je možné odhadnúť približné riziko malignity pre každú kategóriu epiteliálnej lézie, v súčasnosti nie je možné stanoviť približnú pravdepodobnosť progresie pre individuálny prípad.
V roku 1943 Papanicolau a Trout zaviedli Pap sterový test na detekciu rakoviny krčku maternice u žien. Je to cytologický skríningový test a pravdepodobne je dokázané, že je to najúspešnejší verejný prostriedok na stanovenie zdravotného stavu zavedený na prevenciu rakoviny. V niektorých krajinách sa potvrdilo sa, že masové skríningové programy, v ktorých sú ženám robené testy sterov krčku maternice najmenej raz za každé tri až päť rokov, ako veľmi účinné pri znižovaní hodnôt úmrtnosti a chorobnosti v prípadoch rakoviny krčka maternice. Napríklad v Britskej Kolumbii a vo Fínsku znížil organizovaný skríning úmrtnosť na rakovinu krčku maternice o 70 %. Ak sa rakovina krčka maternice deteguje skoro, je ju možné jednoducho liečiť.
Napriek týmto úspechom je skutočná celosvetová situácia deprimujúca. Zo stoviek tisíc žien, u ktorých sa každoročne vyvinie rakovina krčku maternice, viac ako 50 % zomrie na túto chorobu. Sedemdesiat päť percent zo všetkých týchto žien
-5bude v rozvojovom svete, kde kvôli finančným prekážkam nie sú aplikovateľné masové skríningové programy s použitím dostupných metodológií. Aj v mnohých rozvinutých krajinách bol pokles ochorenia v poslednej dekáde nevýznamný, pričom vplyv cytologického skríningu bol oveľa menší ako sa očakávalo. Navyše experti pozorovali podstatný podiel prípadov invazívnej rakoviny krčku maternice u pacientiek, ktoré boli pravidelne skrínované, najmä u mladých žien.
Hlavnými dôvodmi, prečo cytologický skríning niekedy zlyhá pri detekcii rakoviny krčku maternice, sú veľké intervaly medzi testami a aj vysoký počet falošne negatívnych výsledkov (10 až 30 %) (Pap Cytology screening: Most of the benefits reaped? WHO a EUROGIN vydáva správu o kontrole rakoviny krčku maternice. Press Release WHO/25, marec 1997).
Vysoký počet falošne negatívnych výsledkov odráža skutočnosť, že interpretácia Pap sterov je jedným z najťažších morfologických úkonov. Výsledky Pap steru sú ťažšie interpretovateľné ako výsledky odsatia s tenkou ihlou, cytologického testovania telesných tekutín alebo biopsií, kvôli zložitosti a variabilite populácie zmiešaných buniek, ktorá sa nachádza v stere a kvôli širokému rozsahu zápalových a opravných procesov, ktoré nastávajú v krčku maternice. V bunkovej populácii sa vyskytujú aj cyklické zmeny, zmeny indukované tehotenstvom a zmeny, ktoré nastávajú v období po menopauze. Pretože gynekologická cytológia je taká zložitá, je obdobie školenia cytotechnológov veľmi dlhé; vyžaduje si vzdelaného študenta a vysoký stupeň disciplíny a zručnosť v rozoznávaní vzorov. Aj po ukončení zodpovedajúceho školiaceho programu potrebujú cytotechnológovia niekoľko rokov praktických skúseností predtým, ako môžu presne posúdiť či je výsledok Pap steru normálny alebo abnormálny. Podobne, hoci patológovia môžu byť školení na interpretáciu histologických rezov, potrebujú ďalšie špecializované školenie v cytopatológii, aby získali adekvátne schopnosti na organizáciu a vedenie cytologického laboratória a na uskutočňovanie príslušných diagnóz, ktoré sa týkajú abnormálnych sterov.
Dvomi hlavnými problémami spojenými s Pap skríningovými programami sú zjavne nevylúčiteľné falošne negatívne výsledky (10 až 30 %) a relatívne vysoké náklady na skríning. Preto sa teraz zvažujú alternatívne prístupy na skríning krčku maternice. Najbežnejšie diskutovanými návrhmi sú použitie HPV DNA testovania a
-6typovania ako primárnej skríningovej modality alebo ako dodatku ku Pap sterom a použitie nástrojov, ktoré môžu automaticky skrínovať bežne odoberané Pap stery, čím sa zníži potreba relatívne vysoko platených cytotechnológov a cytopatológov (Richart, Cancer Supplement, 1995, 76(10): 1919-1927; Birdsong, Human Pathology, 1996, 27(5): 468-481).
Predchádzajúca metóda ostáva problematická. Pri použití in situ metód pre HPV sú problémy s citlivosťou a s predpokladanou pozitívnou hodnotou. Použitie PCR na HPV DNA detekciu deteguje tak vysoký podiel HPV infekcie vo všeobecnej populácii, že použitie HPV DNA testovania na klinický skríning sa považuje za otázne.
Druhý prístup zahŕňa automatizáciu. Množstvo spoločností v súčasnosti vyvíja a predáva automatizované skríningové zariadenia. Vo všeobecnosti takéto zariadenia využívajú video skener s vysokou rozlišovacou schopnosťou na zachytenie obrazov, ktoré sa potom digitalizujú a analyzujú sériou algoritmov a údaje potom prechádzajú cez interferenčnú sieť, prostredníctvom ktorej bolo zariadenie trénované na rozoznávanie medzi normálnymi a abnormálnymi bunkovými zložkami. Dúfa sa, že s ďalším rozvojom softwaru a hardwaru bude môcť byť automatický skríning braný do úvahy na primárny skríning, hoci v tomto čase US FDA neschválil používanie žiadneho zariadenia na predbežný alebo nezávislý skríning Pap sterov. To, že spoločnosti sú pripravené značne investovať do takéhoto nákladného a zložitého prístupu v snahe prekonať problémy bežného testovania Pap sterov ilustruje vážnosť týchto problémov a úprimnú potrebu riešenia.
Stanovenie bunkových proliferačných markerov v minulosti neposkytlo žiadne takéto riešenia a odborníci v oblasti boli skeptickí v tom, že proliferačné markery poskytnú užitočné klinické informácie (Halí a Coates, Histopathology, 1995, 26:105112). Verí sa, že meracie parametre bunkovej proliferácie poskytnú objektívne informácie o nádoroch, ale napriek množstvu štúdií je len málo priamych dôkazov, že použitie bunkových proliferačných markerov, ako PCNA, Ki67 atď. predstavuje skutočné zlepšenie bežného, optimálne použitého, histologického stanovenia. Niekoľko štúdií sa zaoberalo aj kritickým problémom relatívnej hodnoty
-7proliferačných markerov v porovnaní so štandardným histopatologickým stupňovaním a určovaním štádií.
Pokusy použiť imunocytochemické alebo imunofluorescenčné farbenie s automatizovaným skríningom krčku maternice boli limitované nešpecifickým farbením normálnych buniek. Napríklad sa ukázalo, že epiteliálny membránový antigén (EMA) farbí neoplastické bunky z krčku maternice s CIN, ale bolo publikované aj farbenie niektorých metaplastických buniek z normálneho krčku maternice. Preto, hoci je dostupná technológia na meranie imunohistologického farbenia, v tomto čase žiadny zo strojov na automatický skríníng, ktoré sú na trhu alebo v pokročilom štádiu vývoja, nepoužíva imunohistochémiu.
Najširšie študovanými markermi proliferácie sú Ki67, protein s neznámou funkciou, a PCNA (jadrový antigén proliferujúcich buniek) (Yu a Filipe, Histochemical Journal, 1993, 25: 843-853). PCNA sa podieľa na predlžovaní pri DNA replikácii a na mechanizme DNA opravy. Preto je prítomný počas prebiehajúcej DNA syntézy replikáciou alebo počas opravy.
Pôvodcovia predloženého vynálezu študovali proteíny, ktoré sa zúčastňujú na skoršom iniciačnom štádiu DNA replikácie. Týmito sú Cdc6 a proteíny MCM2-7 rodiny (MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7). Willliams a iný (1997) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:142-147) publikovali, že ľudské HeLa bunky v kultúre exprimujú Cdc6 počas proliferačných bunkových cyklov, ale že WI38 ľudské diploidné fibroblasty zastavia expresiu Cdc6, keď sa stlmia vyhladovaním cez sérum. Tu je ukázané, že tieto pozorovania sú rozšírené na iné bunkové línie a iné druhy. MCMs sa nachádzajú v G1 fáze jadra (pred DNA syntézou) a progresívne sa premiestňujú z chromatínu do rozpustnej nukleoplazmy počas syntézy DNA. Je tu ukázané, že chýbajú v chromatíne aj v pokojovom štádiu. Demonštruje sa tu tiež, že MCM5 nie je prítomný v diferencovaných bunkách krčku maternice a prsníkov.
Na základe týchto skutočností známych z doterajšieho stavu techniky by sa očakávalo, že MCMs alebo Cdc6 antiséra napodobňujú distribúcie PCNA alebo Ki67. Ďalší dôkaz pre takéto očakávanie pochádza od Hiraiwa a iných (Int. J. Cancer, 1997, 74: 180-184), ktorí zistili podobné imunofarbiace charakteristiky pre PCNA a MCM7 (hCD47) v niekoľkých ľudských tkanivách a v troch typoch ľudských nádorov.
-8Pôvodcovia predloženého vynálezu však prekvapujúco zistili dramatické odlišnosti v potenciálnych diagnostických hodnotách MCMs a Cdc6 v porovnaní s PCNA a Ki67.
Pôvodcovia testovali antiséra proti ľudskému MCM proteínu a ľudskému Cdc6 na cytológiu krčku maternice. Študovali rezy normálnych a chorých ľudských krčkov maternice a stery krčku maternice. Porovnali výsledky s výsledkami získanými použitím PCNA a Ki67. Cdc6 protilátky alebo MCM (napr. MCM5) protilátky detegovali LSIL (HPVI/CIN 1) lézie v krčku účinnejšie ako protilátky proti PCNA alebo Ki67. Navyše, v podstate všetky bunky LSIL (HPVI/CIN 1) alebo HSIL (HPVI/CIN 2/3) lézií boli farbené. To je v rozpore s farbením inými proliferačnými markermi, ako napríklad PCNA. Z toho vyplýva, že špecifické väzobné molekuly nasmerované na proteíny pred-iniciačného komplexu DNA replikácie, najmä Cdc6 alebo MCM proteíny (ako MCM5, ale tu ilustrované aj MCM2, MCM3, MCM4, MCM6 a MCM7) majú výnimočnú diagnostickú hodnotu na skorú detekciu atypických alebo neoplastických buniek. Na vzorkách krčku maternice, ktoré sa podrobili vyhľadávaniu antigénu (sterilizácia alebo autoklávovanie), a ktoré sa fixovali formalínom a zabalili sa parafínom, dávali anti-Cdc6 a anti-MCM protilátky podobné vzory farbenia ako vzory získané s PCNA, ale zrejmé boli oveľa lepšie výsledky na steroch, čerstvých a mrazených vzorkách.
Takže predložený vynález sa vo všeobecnosti týka rôznych uskutočnení spôsobov a prostriedkov na detekciu konkrétneho cieľového polypeptidu alebo mRNA kódujúcej cieľový proteín, v tkanivách, tekutinách alebo bunkách jedinca, zvyčajne vo vzorke odobratej z tela.
Cieľové polypeptidy podľa predloženého vynálezu ako Cdc6 a MCM proteíny, ako MCM5, sa môžu odlíšiť od iných bunkových proliferačných markerov, ktoré nie sú užitočné v predloženom vynáleze, tým, že sú zahrnuté v pred-iniciačnom komplexe DNA replikácie. Môžu byť odlíšené tým, že odchádzajú z chromatínu počas pokojového štádia a diferenciácie. Napríklad ORC2 (Gavin a iný, 1995, Science 270, 1667-1671), ktorý nie je cieľom na použitie v predloženom vynáleze, sa môže od proteínov ako Cdc6 a MCM5 odlíšiť tým, že ostáva naviazaný na chromatín v pokojových bunkách. Orc2 nie je tlmený v pokojových bunkách, hoci iné zložky ORC komplexu, ako Orc1, sa môžu správať odlišne. Cdc6 je v pokojovom
-9štádiu a počas diferenciácie rýchlo tlmený. Kultivované bunky zastavené v GO len na 48 hodín neobsahujú žiadny detegovateľný Cdc6 proteín. Cdc6 nie je detegovateľný v bunkách zastavených in vitro na dlhšie časové obdobie alebo v ex vivo diferencovaných bunkách. Bunky zastavené in vitro sérovým hladovaním alebo kontaktnou inhibíciou strácajú na chromatín naviazané MCMs (po niekoľkých dňoch), hoci celková hladina MCMs v bunkách významne neklesá najmenej 14 dní. Bunky, ktoré sa diferencujú in vitro (napr. HL-60 bunky indukované k diferenciácii s DMSO alebo TPA), tlmia MCM3, ale netlmia Orc2 (Musahl, Aussois Meeting on DNA Replication, Aussois, France June 1997). Diferencované bunky z tkanív ex vivo neexprimujú MCM proteíny ako MCM2 a MCM5. Šesť MCM proteínov MCM2MCM-7 vytvára multiproteínový komplex, ktorý sa rozdeľuje na dva subkomplexy: MCM3 a MCM5 dimér; MCM2-4-6-7 tetramér. MCM3 a MCM5 môžu odchádzať z chromatínu počas S fázy oveľa pomalšie ako MCM2-4-6-7 (Kubota et al., 1997, EMBO J. 16, 3320-3331). MCMs sú na chromatín naviazané v G1, odchádzajú počas S fázy a sú v jadre, ale nie sú naviazané na chromatín v G2. Cdc6 sa správa podobne v kvasinkách, hoci okrem odchodu z chromatínu je aj degradovaný, hladiny proteínu sa dramaticky znižujú pri G1/S prechode. Podľa predloženého vynálezu môžu byť zahrnuté ďalšie zložky pred-iniciačného komplexu DNA replikácie. Príklady zahŕňajú ľudské homológy kvasinkových zložiek, ako Cdc7 proteín kináza (Chapman a Johnston, Exp. Celí Res., 1989,180 419-428 (kvasinky), Sao a iný, 1997, EMBO J., 16, 4340-4351 (ľudský - tlmený v pokojovom štádiu), Dbf4, regulačná podjednotka Cdc7 proteín kinázy (Jackson et al., 1993, Mol. Celí Biol. 13 2899-2908 (kvasinky), Masai et al., Cold Spring Harbor Meeting on Eukaryotic DNA Replication, 3-7. september 1997 (ľudský)), Cdc14 proteín fosfatáza (Hogan a Koshland PNAS USA, 1992, 89, 3098-3102 (kvasinky)), Cdc45, ktorý je spojený s MCMs a má rovnaký fenotyp (Zou a iný, Mol. Celí. Biol., 1997,17, 553-563 (kvasinky), Takisawa a iný, Cold Spring Harbor Meeting On Eukaryotic DNA Replication, 3-7 september 1997 (Xenopus)), MCM10, ktorý sa spája s MCMs a má podobný fenotyp (Merchant a iný, 1997, Mol. Celí Biol. 17 3261-3271). Cieľovými polypeptidmi podľa predloženého vynálezu môžu byť akékoľvek zložky DNA pred-replikačného komplexu, zložky replikačne kompetentného chromatínu, zložky podieľajúce sa na obmedzení DNA replikácie na jeden krát za bunkový
-10cyklus, zložky replikačnej licencie podieľajúce sa na povolení chromatínu pre jedno kolo DNA replikácie a zložky zostavené v počiatkoch replikácie pred iniciáciou DNA replikácie.
Aminokyselinová sekvencia ľudského Cdc6 je opísaná vo Williams a iný, 1997, PNAS USA 94: 142-147, GenBank Katalógové č. U77949.
Sekvencia ľudského MCM2 je opísaná v Todorov a iný, 1994, J. Celí Sci., 107, 253-265, GenBank Katalógové č. X67334.
Sekvencia ľudského MCM3 je opísaná v Thommes a iný, 1992, Nucl. Acid Res., 20, 1069-1074, GenBank Katalógové č. P25205.
Sekvencia ľudského MCM4 je opísaná v Ishimi a iný, 1996, J. Biol. Chem., 271, 24115-24122, GenBank Katalógové č. X74794.
Sekvencia ľudského MCM5 je opísaná v Hu a iný, 1993, Nucleic Acids Res., 21, 5289-5293, GenBank Katalógové č. X74795.
Sekvencia ľudského MCM6 je opísaná v Holthoff a iný, 1996, Genomics, 37, 131-134, GenBank Katalógové č. U46838.
Sekvencia ľudského MCM7 je opísaná v Hu a iný, 1993, Nucleic Acids Res., 21, 5289-5293.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke z jedinca, ktorý zahŕňa detegovanie cieľového polypeptidu vo vzorke, pričom cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie; s podmienkou, že ak je cieľovým polypeptidom MCM7, vzorka nie je podrobená vyhľadávaniu antigénu alebo sterilizácii/autoklávovaniu.
Iné uskutočnenie vynálezu zahrnuje spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke krčku maternice od jedinca, ktorý zahŕňa uvedenie vzorky do kontaktu so špecifickým väzobným členom alebo špecifickými väzobnými členmi nasmerovanými proti cieľovému polypeptidu a stanovenie viazania sa špecifického väzobného
-11 člena alebo väzobných členov na vzorku, pričom cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie.
Iné uskutočnenie predloženého vynálezu poskytuje spôsob kategorizácie tkaniva ako (i) normálne alebo (ii) potenciálne alebo skutočne pre-nádorové alebo nádorové, dysplastické alebo neoplastické, pričom spôsob zahŕňa stanovenie viazania špecifického väzobného člena nasmerovaného proti cieľovému polypeptidu, ako bolo diskutované vyššie, vo vzorke tkaniva. Vzor alebo stupeň viazania sa môže byť porovnávaný so vzorom alebo stupňom známym z normálnej vzorky a/alebo známym z abnormálnej vzorky.
Pôvodcami predloženého vynálezu bol nezávisle klonovaný ľudský Cdc6, ako je tu opísané, ale prvé zverejnenie jeho klonovania urobili Williams a iný, ktorých článok (PNAS USA 94:142-147, 1997) poskytuje úplnú aminokyselinovú sekvenciu. Ako je tu experimentálne demonštrované, anti-Cdc6 väzobné molekuly sú veľmi účinné na označovanie abnormalít v rôznych tkanivách najmä vo vzorkách krčku maternice, výhodne v steroch. V porovnaní s týmto, žiadna väzba nenastáva v normálnom tkanive krčku maternice v sterovej vzorke.
Aminokyselinové sekvencia ľudského MCM5 je opísaná v Hu a iný, 1993, Nucleic Acids Res., 21, 5289-5293, GenBank katalóg, č. X74795. Tu uvedený experimentálny dôkaz ukazuje, že väzobné molekuly nasmerované proti nemu, ako Cdc6, sú veľmi účinné na označovanie abnormalít v rôznych tkanivách, najmä vzorkách krčku maternice, výhodne v steroch. Získanie protilátok proti MCM5 s vysokou afinitou sa zdá byť jednoduchšie ako pre Cdc6, čo môže odrážať vyššiu antigénnosť.
Ďalší, tu zahrnutý experimentálny dôkaz ukazuje, že väzobné molekuly nasmerované proti MCM2, proti MCM3, proti MCM4, proti MCM6 alebo proti MCM7 sú tiež účinné na označovanie abnormalít vo vzorkách tkaniva, ako napríklad sterov krčku maternice. Zistilo sa, že anti-MCM5 protilátky poskytujú silnejší farebný vzor ako anti-MCM2 a anti-MCM7 protilátky, tak celkovo, ako aj v množstve buniek. Zistilo sa, že anti-Cdc6 protilátky poskytujú podobný vzor farbenia ako anti-MCM5.
Takže viazanie sa (napr.) anti-Cdc6 alebo anti-MCM špecifického väzobného člena na vzorku umožňuje kategorizáciu tkaniva, podľa ktorej je vzorka stanovená ako abnormálna, potenciálne alebo skutočne pred-nádorová alebo nádorová,
- 12dysplastická alebo neoplastická. Podľa súčasnej praxe, pri získaní pozitívneho výsledku použitím Pap testu, je možné pozitívne testovaných jedincov ďalej skúmať, napríklad prostredníctvom bioptického testovania a/alebo opakovaným skríningom. Je celkom bežné, že výsledkom pred-nádorového potenciálu nie je skutočné nádorové štádium. Typicky sa používa šesťmesačný skríning na sledovanie progresie alebo regresie dyspiázie, aby sa umožnila príslušná a vhodne načasovaná terapeutická intervencia, ak je to potrebné.
Ak sa tkanivo kategorizuje ako potenciálne alebo skutočne pred-nádorové alebo nádorové na základe detekcie abnormality vo vzorke tkaniva podľa predloženého vynálezu, budú vyžiadané príslušné diagnostické a/alebo klinické postupnosti. Treba poznamenať, že vynález nie je obmedzený na detekciu abnormality bunkového rastu, ktorá je nevyhnutne pred-nádorová alebo nádorová. Môžu byť detegované iné poruchy bunkovej proliferácie ako je demonštrované príkladmi uvedenými nižšie, vrátane psoriázy (pozri príklad 24 nižšie) a zápalovej choroby vnútorností, ako napríklad vredovej kolitídy a Crohnovej choroby (príklady 33 a 34). Okrem toho, že zápalové choroby vnútorností sú poruchami bunkovej proliferácie, môžu byť prekurzormi rakovinového stavu, hoci nie u všetkých pacientoch, takže ich detekcia prostredníctvom predloženého vynálezu môže byť použitá na poskytnutie hodnotných výsledkov na bližšie štúdium následnosti. Pri zápalovom ochorení vnútorností môže nastať odlupovanie buniek čreva a vnútorností, čo umožňuje, aby sa uskutočnila analýza vzoriek fekálií, a prípravu buniek z týchto vzoriek. Nižšie uvedený príklad 32 opisuje farbenie fekálnych sterov pripravených izolovaním buniek z fekálií.
Predložený vynález môže byť použitý na predbežný skríning vzoriek pred ďalšou analýzou. Predložený vynález môže byť použitý na skríning alebo analýzu vzoriek predtým testovaných použitím dostupnej techniky, ako Pap sterovým testom alebo ThinPrep 2000 testom. Nižšie uvedené experimenty tiež ukazujú, že Pap kmeňová analýza a analýza podľa predloženého vynálezu, s použitím príslušnej protilátky, sa môžu uskutočňovať na rovnakých prípravkoch. Takže stery krčka maternice môžu byť napríklad testované použitím tak bežného Pap sterového testu, ako aj testu podľa predloženého vynálezu.
- 13Ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu poskytuje spôsob označovania abnormálnych buniek vo vnútri tkanivovej vzorky, ktorý zahŕňa uvedenie vzorky do kontaktu so špecifickým väzobným členom nasmerovaným proti cieľovému polypeptidu, ako Cdc6, MCM5 alebo inému MCM, ako bolo diskutované, v podmienkach, pri ktorých sa špecifický väzobný člen viaže na abnormálne proliferujúce bunky a nie na normálne bunky. To či sa špecifický väzobný člen viaže alebo nie na vzorku, sa môže stanoviť na určenie prítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek vo vzorke.
V ďalšom uskutočnení predložený vynález poskytuje použitie špecifického väzobného člena nasmerovaného proti cieľovému polypeptidu, ako bolo diskutované, na determináciu, stanovenie alebo diagnostiku prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálnej bunkovej proliferácie, abnormalít bunkového rastu, dysplázie, neoplázie alebo potenciálne alebo skutočne pred-nádorového alebo nádorového štádia v tkanive alebo vo vzorke tkaniva.
Špecifické väzobné molekuly môžu byť poskytnuté v kite, ktorý môže obsahovať inštrukcie na použitie podľa predloženého vynálezu. Takéto kity sú poskytnuté ako ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu. Môže byť zahrnuté jedno alebo viac iných reakčných činidiel, ako napríklad značkovacie molekuly atď. (pozri nižšie). Reakčné činidlá môžu byť umiestnené vo vnútri nádob, ktoré ich chránia pred vonkajším prostredím, ako napríklad utesnené liekovky. Kit môže obsahovať jeden alebo viacero materiálov na odobratie samotnej testovacej vzorky v závislosti na sledovanom tkanive napr. vata na špajli na odobratie buniek z bukálnej dutiny, striekačku na odobratie vzorky krvi, špachtla na odobratie steru krčka maternice, nástroj na biopsiu atď. (takéto komponenty sú vo všeobecnosti sterilné). Kit môže obsahovať ktorýkoľvek, ktorúkoľvek kombináciu alebo všetky z nasledujúcich: blokovacie činidlá na zníženie nešpecifického farbenia, uskladňovací tlmivý roztok na zachovanie aktivity väzobných molekúl počas skladovania, farbiaci tlmivý roztok a/alebo premývací tlmivý roztok na použitie počas protilátkového farbenia, pozitívnu kontrolu, negatívnu kontrolu atď. Pozitívna a negatívna kontrola môžu byť použité na zhodnotenie aktivity a správneho využitia použitých reakčných činidiel, môžu byť poskytnuté v kite, v súlade s predloženým vynálezom. Kontroly môžu obsahovať vzorky, ako napríklad rezy tkaniva, bunky fixované na krycích
- 14sklíčkach atď., o ktorých je známe, že sú buď pozitívne, alebo negatívne na prítomnosť cieľa, ako Cdc6 alebo MCM5. Návrh a použitie kontrol je štandardný a spadá do rutinných schopností priemerných odborníkov v oblasti.
Vzorky môžu byť odobraté z tela použitím akýchkoľvek bežných prostriedkov alebo techník. Na skríning krčku maternice môžu byť použité štandardné sterové vzorky. Alternatívne môže byť použitá ThinPrep 2000 technológia (Cytec Corp, Boxboorugh, Mass., USA). Toto bolo potvrdené US FDA ako zámena bežnej metódy prípravy Pap steru. Vzorka sa odoberá do kvapalného média namiesto stierania buniek na sklenené sklíčko. Automatizovaný procesor (ThinPrep 2000 zariadenie) je potom použitý na zozbieranie buniek z kvapaliny a ich uloženie do tenkej vrstvy na sklenené sklíčko na analýzu. Na odohranie endoteliálnych buniek napr. z krčku maternice alebo z bukálnej dutiny môže byť použitá špachtla alebo vata na špachtli. Vzorky krvi alebo tekutiny môžu byť odobraté použitím striekačky alebo ihly. Vzorky iných tkanív môžu byť odobraté biopsiou alebo tkanivovým rezom.
Vo výhodných uskutočneniach sa vzorky nepodrobia vyhľadávaniu antigénu alebo sterilizácii/autoklávovaniu. Antigénové vyhľadávanie bolo pre priemerných odborníkov v oblasti dlho štandardným. Hiraiwa a iný sa odvolávajú na Shin a iných (1991) Lab. Invest. 64, 693-702, ktorý poskytujú príkladný prístup. Vzorky môžu byť čerstvé alebo zmrazené ale vo všeobecnosti nie sú fixované formalínom alebo obalené parafínom. Ako bolo diskutované, v najvýhodnejšom uskutočnení je vzorkou ster krčku maternice. Stery krčku maternice nie sú dostatočne robustné na to, aby sa sterilizovali. Navyše ošetrenie vyhľadávaním antigénu nie je vo všeobecnosti dostatočne vodivé na skríning, kde sa vyžaduje vysoká výkonnosť.
Tu uvedené experimentálne príklady uskutočnení podľa predloženého vynálezu demonštrujú aplikovateľnosť na kŕčok maternice, vrátane testovaných sterov krčka maternice, na prsníkové, malignity a malignity močového traktu (testované tak na bioptických tkanivových vzorkách, ako aj na cytologických steroch moču), na malignity hrubého čreva, pľúc, močového mechúra, pokožky, hrtana, ezofágu, priedušnice, lymfatických uzlín a hematologických malignít, ako aj na krv a sérum na dokázanie metastatického sarkómu a karcinómu. Predložený vynález môže byf ďalej použitý na stanovenie pred-malígnych abnormalít sekrečných
-15epiteliálnych buniek krčku maternice (žľazová intra-epiteliálna neoplázia, GIN) alebo pred-malígnych abnormalít v iných tkanivách. Výnimočne vhodné môže byť použitie na cytologické alebo biochemické zhodnotenie iných klinických vzoriek, v ktorých môže byť detekcia neoplastických buniek alebo ich odlišností od buniek, vykazujúcich reaktívne zmeny, veľmi ťažká. Takéto vzorky zahŕňajú sputum, vzorky bronchio-alveolárneho výplachu, moč a stery tráviaceho traktu (zahŕňajúc ezofágus, žalúdok a pankreas, tak žlčovod, ako aj pankreatický kanál). Predložený vynález môže byť použitý na histologické alebo biologické zhodnotenie tkaniva, kde stanovenie proliferácie môže umožniť presnejšiu predpoveď klinického výstupu, a/alebo racionálnejší výber terapie. Vzorky môžu obsahovať malignity žľazových buniek (napr. pľúc, prsníka, hrubého čreva, prostaty, žalúdka), šupinatých buniek (napr. pľúc, pokožky, ezofágu) alebo iných epiteliálnych bunkových typov (napr. močového mechúra, močovodu, obličky, vaječníka).
Vysoký stupeň špecificity pozorovaný v nižšie opísaných experimentoch s anti-Cdc6 protilátkami a anti-MCM protilátkami, vrátane anti-MCM2, anti-MCM3, anti-MCM4, anti-MCM5, anti-MCM6 a anti-MCM7 protilátok, ktoré boli testované na rade rakovín prsníka, poskytuje imunocytologické a biochemické prístupy na diagnostiku rakoviny prsníka. To môže byť použité na vzorky biopsie prsníka alebo na vzorky odsané tenkou ihlou (FNA) alebo na vzorky tekutiny z mliečnych žliaz, čo umožňuje použitie na skríningové programy.
Vzorky, ktoré sa majú uviesť do kontaktu s väzobným členom, v súlade s rôznymi uskutočneniami predloženého vynálezu, môžu byť pripravené použitím akejkoľvek dostupnej techniky, ktorá umožňuje naviazanie špecifickej väzobnej molekuly na cieľový polypeptid, ako napríklad Cdc6, MCM5 alebo iné MCM ako bolo diskutované, stanovenie hladín nukleovej kyseliny, enzymatickej aktivity atď., podľa rôznych uskutočnení predloženého vynálezu. Rôzne techniky sú štandardné v oblasti, napr. (pre molekuly ako protilátky viažuci cieľový polypeptid) ako sú techniky používané na fixovanie buniek na Pap test.
Reaktivita väzobného člena, ako napríklad protilátky, môže byť v normálnej alebo testovanej vzorke stanovená akýmkoľvek vhodným prostriedkom. Pripevnenie príveskov s jednotlivými reportérovými molekulami je jednou možnosťou.
Reporterové molekuly môžu priamo alebo nepriamo generovať detekovateľné a
-16výhodne merateľné signály. Pripojenie reportérových molekúl môže byť priame alebo nepriame, kovalentné, napr. cez peptidovú väzbu alebo nekovalentné. Spojenie prostredníctvom peptidovej väzby môže byť výsledkom rekombinantnej expresie génovej fúzie kódujúcej väzobnú molekulu (napr. protilátku) a reporterovú molekulu.
Jedným uprednostňovaným spôsobom je kovalentné spojenie každého väzobného člena s jednotlivým fluorochrómom, fosforom alebo laserovou farbičkou so spektrálne izolovanou absorpciou alebo s emisnými vlastnosťami. Vhodné fluorochrómy zahŕňajú fluoresceín, rodamín, fýkoerytrín a Texaskú červeň. Vhodné chromogenické farbičky zahŕňajú diaminobenzidín.
Iné reporterové molekuly zahŕňajú makromolekulové koloidálne častice alebo časticový materiál, ako latexové guličky, ktoré sú kolorované, magnetické alebo paramagnetické, a biologicky alebo chemicky účinné činidlá, ktoré môžu priamo alebo nepriamo zapríčiniť detegovatefné signály, ktoré sa dajú vizuálne pozorovať, elektronicky detegovať alebo inak zaznamenať. Tieto molekuly môžu byť enzýmy, ktoré katalyzujú reakcie, ktoré vyvíjajú alebo menia farby alebo napríklad spôsobujú zmeny elektrických vlastností. Môžu byť molekulárne excitabilé, takže výsledkom elektronickej tranzície medzi dvoma energetickýmistavmi sú charakteristické spektrálne absorpcie alebo emisie. Môžu zahŕňať chemické entity používané na konjunkciu s biosenzormi. Môžu byť použité biotín/avidínový alebo biotín/streptavidinový a alkalický fosfatázový detekčný systém. Ďalšími príkladmi sú chrenová peroxidáza a chemiluminiscencia.
Spôsob stanovenia väzby nie je znakom predloženého vynálezu a odborníci v oblasti sú schopní vybrať vhodný spôsob podľa ich preferencií a všeobecných znalostí.
V nižšie opísaných experimentoch bola použitá chrenová peroxidáza. Ďalšie experimenty sa uskutočnili použitím alkalickej fosfatázy, pričom sa dosiahli podobné výsledky (napríklad so stermi krčku maternice). Alkalická fosfatáza môže byť citlivejším detekčným systémom ako chrenová peroxidáza, ale vyvinutá farba je menej kompatibilná s PAP farbením.
Nižšie je uvedený jeden protokol na protilátkové farbenie sterov krčku maternice, ktorý bol použitý v uskutočneniach podľa vynálezu.
-171. Fixovať čerstvý ster 5 minút v zmesi acetón:metanol v pomere 50:50. (Alternatívnym východiskovým bodom, ak je ster predtým fixovaný s Cytofixom alkoholovým a voskovým ošetrením, ktoré je štandardne používané v UK na ošetrenie vzoriek sterov pri odobratí, na umožnenie bezpečného transportu do skríningového centra - je odstrániť Cytofix lúhovaním v metylovaných alkoholoch počas 10 minút. Ak bol ster pokrytý akoukoľvek inou ochrannou vrstvou, môže byť použitý akýkoľvek vhodný postup na vystavenie vzorky farbeniu protilátkou).
2. Premývať v Tris tlmenom fýziologickom roztoku (TBS) 5 minút.
3. Premývať za účelom permeabilizácie v 4mM deoxycholáte sodnom v TBS 15 minút.
4. Premývať v TBS s 0,3% Tritónom X100 5 minút.
5. Opakovať krok 4.
6. Premývať v TBS s 0,025% Tritónom X100 5 minút.
7. Odsať prebytočnú kvapalinu bez toho, aby sa mohlo tkanivo vysušiť.
8. Preniesť podložné sklíčka do vlhkej komory a umiestniť na každé sklíčko 200 μΙ 10% kozieho sérového reakčného činidla v TBS na minimálne 2 hodiny (alebo cez noc).
9. Odsať prebytočnú kvapalinu bez toho, aby sa mohlo tkanivo vysušiť.
10. Umiestniť 200 μΙ primárnej protilátky nariedenej v TBS s obsahom 0,1% Tritónu a 1% BSA na každé podložné sklíčko a nechať cez noc pri 4 °C na orbitálnej miešačke.
11. Preniesť podložné sklíčka na stojany a premývať v TBS s 0,3% Tritónom X100 5 minút.
12. Premývať v TBS s 0,025% Tritónom X100 5 minút.
13. Opakovať krok 12.
14. Odsať prebytočnú kvapalinu bez toho, aby sa mohlo tkanivo vysušiť.
15. Preniesť podložné sklíčka do vlhkej komory a umiestniť na každé sklíčko 200 μΙ biotinylovanej kozej anti-králičej sekundárnej protilátky (Dáko) v pomere 1:500 v TBS s obsahom 1% BSA počas 1 hodiny.
16. Pokiaľ sú podložné sklíčka v sekundárnej protilátky vyrobiť SABC roztok.
17. Preniesť podložné sklíčka na stojany a premývať v TBS 5 minút.
-1818. Umiestniť podložné sklíčka do endogénneho peroxidázového blokovacieho činidla s 0,6% hydrogénperoxidázou na 10 minút.
19. Premývať v TBS 5 minút.
20. Dvakrát opakovať krok 19.
21. Preniesť podložné sklíčka do vlhkej komory a na každé sklíčko umiestniť 200 μΙ SABC roztoku na 30 minút.
22. Preniesť podložné sklíčka na stojany a premývať s TBS 5 minút.
23. Dvakrát opakovať krok 22.
24. Vyvíjať 10 minút v DAB roztoku.
25. Premývať v tečúcej vode z vodovodu 5 minút.
26. Na 6 sekúnd umiestniť podložné sklíčka do Harrisovho hematoxylínového roztoku.
27. Premývať v tečúcej vode z vodovodu 1 minútu.
28. Diferencovať v 0,5% kyseline chlorovodíkovej 1 až 2 sekundy.
29. Premývať v tečúcej vode z vodovodu 5 minút.
30. Preplachovať v 50% metanole 2 minúty.
31. Preplachovať v 70% metanole 2 minúty.
32. Preplachovať v 90% metanole 2 minúty.
33. Preplachovať v 100% metanole 2 minúty.
34. Na 2 minúty umiestniť do Orange G pracovného roztoku.
35. Preplachovať v 100% metanole 7 sekúnd a jemne premiešavať.
36. Opakovať krok 35.
37. Na 2 minúty umiestniť do EA50 roztoku.
38. Preplachovať v 100% metanole 7 sekúnd a jemne premiešavať.
39. Opakovať krok 38.
40. Umiestniť podložné sklíčka na 5 minút do xylénu kvôli vyčisteniu.
41. Dvakrát opakovať krok 40.
42. Aplikovať krycie sklíčka s použitím DEPEX rámika.
Stery na imunofluorescenciu môžu byť pripravené podobným spôsobom (a aj boli). Po sekundárnej protilátke sa inkubujú v streptavidín FITC-konjugovanej protilátke 1 hodinu a farbia sa kontrastnou farbou na vyfarbenie DNA s propidium
-19jodid/RNAáza A (obe od Sigma v množstve 50 ng/ml), potom sa premývajú a upevnia v glycerol/PBS/fenyléndiamíne.
Výhodné väzobné molekuly na použitie v uskutočneniach predloženého vynálezu zahŕňajú protilátky, prirodzené ligandy pre cieľ, malé molekuly, ktorých cieľom je jeden alebo viacero epitopov na cieli a väzobné domény T-bunkových receptorov.
Protilátky, ktoré sú špecifické pre predmetný cieľ, ako napríklad Cdc6, MCM5 alebo iné MCM, sa môžu získať štandardnými technikami v oblasti. Spôsoby výroby protilátok zahŕňajú imunizáciu cicavca (napr. myši, potkana, králika, koňa, kozy, ovce, opice alebo vtáka, ako napríklad kurčaťa) proteínom alebo jeho fragmentom alebo bunkou alebo vírusom, ktorý exprimuje cieľový proteín alebo jeho fragment. Možná je aj imunizácia s DNA, ktorá kóduje cieľový polypeptid. Protilátky sa môžu z imunizovaných zvierat získať použitím rôznych techník známych v oblasti a skrínovať výhodne použitím viazania sa protilátky na predmetný antigén. Použité môžu byť napríklad Western blotingové techniky alebo imunoprecipitácia (Armitage et el, 1992, Náture 257: 80-82).
Výroba monoklonálnych protilátok je v oblasti dobre zavedená. Monoklonálne protilátky sa môžu podrobiť technikám rekombinantnej DNA technológie na výrobu iných protilátok alebo chimérnych molekúl, ktoré si zachovávajú špecificitu pôvodnej protilátky. Takéto techniky môžu zahŕňať zavedenie DNA kódujúcej imunoglobulínovú variabilnú oblasť, alebo oblasti determinujúce komplementaritu (CDRs) protilátky do konštantných oblastí, alebo konštantných oblastí s hraničnými oblasťami, rôznych imunoglobínov. Pozri napríklad EP 184187A, GB 2188638A alebo EP-A-0239400. Hybridom produkujúci monoklonálnu protilátku sa môže podrobiť genetickej mutácii alebo iným zmenám, ktoré môžu alebo nemusia meniť väzobnú špecificitu produkovaných protilátok.
Ako alternatíva alebo doplnok ku imunizácii cicavca peptidom, sa môže protilátka špecifická pre cieľ získať z rekombinatne vyrobenej knižnice exprimovaných imunoglobínových variabilných domén, napr. použitím lambda bakteriofágu alebo vláknitého bakteriofágu, ktoré nesú na svojom povrchu funkčné imunoglobínové väzobné domény, pozri napríklad W092/01047. Knižnica môže byť naivná, ktorá je konštruovaná zo sekvencií získaných z organizmu, ktorý nebol
-20imunizovaný cieľom, alebo môže byť konštruovaná použitím sekvencii získaných z organizmu, ktorý bol vystavený predmetnému antigénu (alebo jeho fragmentu).
Protilátky sa môžu modifikovať mnohými spôsobmi. V skutočnosti, ak z kontextu nevyplýva niečo iné, má byť výraz protilátka považovaný za taký, ktorý pokrýva akúkoľvek špecifickú väzobnú látku, ktorá má protilátkovú antigénovú väzbovú doménu. Takže to pokrýva protilátkové fragmenty, deriváty a funkčné ekvivalenty, vrátane akéhokoľvek polypeptidu, ktorý obsahuje imunoglobínovú väzobnú doménu, či už prirodzeného alebo syntetického. Zahrnuté sú aj chimérne molekuly, ktoré obsahujú imunoglobínovú väzobnú doménu alebo ekvivalent, fúzovaný s iným polypeptidom. Klonovanie a expresia chimérnych protilátok sú opísané v EP-A-0120694 a EP-A-0125023.
Ukázalo sa, že funkcia viazania antigénov sa môže uskutočňovať fragmentmi celej protilátky. Príkladom väzobných fragmentov sú (i) Fab fragment pozostávajúci z VL, VH, CL a CH1 domén; (ii) Fd fragment pozostávajúci z VH a CH1 domén; (iii) Fv fragment pozostávajúci z VL a VH domén jednej protilátky; (iv) dAb fragment (Ward, E.S. et al., Náture 341, 544-546 (1989)), ktorý pozostáva z VH domény; (v) izolované CDR oblasti; (vi) F(ab')2 fragmenty, bivalentný fragment obsahujúci dva spojené Fab fragmenty (vii) jednoreťazcové Fv molekuly (scFv), v ktorých sú VH doména a VL doména spojené peptidovým spojovníkom, ktorý umožňuje spojenie dvoch domén tak, že vytvárajú antigén viažuce miesto (Bird a iný, Science, 242, 423-426, 1988; Huston a iný, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) bišpecifické jednoreťazcové Fv diméry (PCT/US92/09965) a (ix) diabody, multivalentné alebo multišpecifické fragmenty konštruované génovou fúziou (WO94/13804; P. Holliger a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448,1993).
Rekombinantná expresia polypeptidov, vrátane protilátok a fragmentov protilátok, je v oblasti dobre známa.
Systémy klonovania a expresie polypeptidu v rozličných odlišných hostiteľských bunkách sú dobre známe. Vhodné hostiteľské bunky zahŕňajú baktérie, cicavčie bunky, kvasinky a bakulovírusové systémy. Cicavčie bunkové línie dostupné v oblasti na expresiu heteroiógneho polypeptidu zahŕňajú vaječníkové bunky čínskeho škrečka, HeLa bunky, obličkové bunky mladých škrečkov a mnohé
-21 iné. Bežným, výhodným bakteriálnym hostiteľom je E. coli. Výhodnými hostiteľmi na bakulovírusovú expresiu sú hmyzie bunky, ako napríklad SF9 bunková línia.
Vybrané alebo skonštruované môžu byť vhodné vektory, ktoré obsahujú príslušné regulačné sekvencie, vrátane promótorových sekvencii, terminátorových fragmentov, polyadenylačných sekvencii, sekvencii zosilňovačov, markerových génov a iných sekvencii, ak je to vhodné. Podrobnosti pozri napríklad v Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2. vydanie, Sambrook a iný, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Transformačné postupy závisia na použitom hostiteľovi, ale sú dobre známe.
Po produkcii prostredníctvom expresie kódujúcej nukleovej kyseliny protilátky alebo iných špecifických väzobných molekúl nasmerovaných proti cieľu užitočnému v predloženom vynáleze, ako Cdc6, sa môže táto získať a môže byť izolovaná, ak je to nevyhnutné, konjugované s príslušnou značkou alebo reportérovým činidlom, a môže byť poskytnutá na použitie na stanovenie prítomnosti alebo neprítomnosti abnormalít bunkového rastu vo vzorke tkaniva, ako napríklad v stere krčku maternice, v súlade s predloženým vynálezom, ako je opísané.
Hladiny Cdc6 a MCM expresie v nádoroch sú oveľa vyššie ako hladiny v normálnych tkanivách a tieto antigény sa môžu uvoľňovať do krvného riečišťa (napr. nekróziou nádorových buniek) alebo do iných telesných tekutín, napr. moču alebo výkalov. Na detekciu cieľa v telesnej tekutine, napr. sére, môže byť použitá špecifická väzobná molekula, použitím akejkoľvek techniky dostupnej odborníkovi v oblasti, ako DELFIA, ELISA, RIA, Western blot. Progresia a regresia nádoru môže byť monitorovaná napríklad v reakcii na liečbu alebo pri recidíve. Takže krv alebo iné vzorky telesných tekutín, napr. moču, prostatickej tekutiny, tekutiny z prsnej bradavky, seróznych a ascitických výtokov, cerebrospinálnej tekutiny a aj výkalov, môžu byť zhodnotené podľa predloženého vynálezu. Napríklad je možné testovať vzorku krvi na prítomnosť cieľového polypeptidu, ako napríklad MCM5 a Cdc6 použitím DELFIA, ELISA, RIA, napr. ako je opísané vo Williams a iný, Clin. Chem. Acta, 1986, 155, 329-344.
Stanovenie viazania sa na cieľ in vivo môže byť použité na identifikáciu lokalizácie abnormálnych buniek v tele. Jedincovi môžu byť podávané značené väzobné molekuly proti cieľu podľa predloženého vynálezu a viazanie sa môže
-22stanoviť vo vnútri tela. Keď je na protilátku pripojený rádionukleotid ako jód-125, indium-111, táiium-201 alebo technícium-99m, ak je táto protilátka lokalizovaná výhodne v nádore a nie v normálnych tkanivách, prítomnosť rádioznačky v nádorovom tkanive sa môže detegovať a kvantifikovať použitím gama fotoaparátu alebo scintigrafie. Kvalita získaného obrazu nádora priamo koreluje s pomerom signál.prerušenie. Rádioznačenie s techníciom-99m je opísané v Pak a iný (1992), Nucl. Med. Biol. 19; 699-677. Zhrnutie zobrazovania rakoviny anti-CEA protilátkami je poskytnuté Goldenbergom D.M, Int. J. of Biol. Markers 1992, 7; 183-188. Predložený vynález sa samozrejme vzťahuje na špecifické väzobné členy nasmerované proti cieľovým polypeptidom, ako boli opísané, na použite v akomkoľvek spôsobe na diagnostiku choroby ľudí alebo zvierat.
Pre Cdc6 a MCM proteíny bola publikovaná ATPázová enzymatická aktivita (Zwerschke a iný, 1994, J. Biol. Chem. 269, 23351-23356; Ishimi a iný, Cold Spring Harbor Meeting on Eukaryotic DNA Replication, 3.-7. september 1997). Tieto proteíny môžu mať iné enzymatické aktivity, napríklad helikázovú aktivitu ako je publikované Ishimim a inými, (Ibid.). Hladina cieľového proteínu podľa predloženého vynálezu môže byť stanovená prostredníctvom determinácie jeho enzymatickej aktivity vo vzorke. Napríklad boli vyvinuté špecifické chromogénne substráty pre enzymatickú aktivitu enzýmov, ako chrenová peroxidáza (diaminobenzidín) a βgalaktozidáza (X-GAL).
Expresia Cdc6, MCM5 a iných cieľových proteínov môže byť stanovená na úrovni nukleovej kyseliny, napríklad stanovením hladín mRNA. Williams a iný, (Cold Spring Harbor Meeting On Eukaryotic DNA Replication, 3.-7. september 1997) publikovali expresiu Cdc6 mRNA v základni krýpt tenkého čreva myších vnútorností. Spôsoby detekcie RNA sú v oblasti dobre známe a zahŕňajú Northern blot, kvapkový blot, in situ hybridizáciu, kvantitatívnu RT-PCR. Nukleová kyselina izolovaná a/alebo purifikovaná z jednej alebo viacerých buniek alebo knižnica nukleových kyselín odvodená od nukleovej kyseliny izolovanej a/alebo purifikovanej z buniek (napr. cDNA knižnica odvodená od mRNA izolovanej z buniek), môže byť sondovaná v podmienkach selektívnej hybridizácie a/alebo môže byť podrobená špecifickej reakcii na amplifikáciu nukleovej kyseliny, ako napríklad polymerázovej reťazovej reakcii (PCR). Viazanie sa sondy na cieľovú nukleovú kyselinu sa môže
-23merať použitím akejkoľvek z rôznych techník, ktoré má k dispozícii odborník v oblasti. Napríklad, sondy môžu byť rádioaktívne, fluorescenčné alebo enzymaticky značené. Iné spôsoby, ktoré nepoužívajú značenú sondu, zahŕňajú skúmanie polymorfizmov dĺžky reštrikčných fragmentov, amplifikáciu použitím PCR, štiepenie RNázou a sondovanie s alelovo špecifickými oligonukleotidmi.
Z praktických dôvodov, alebo aspoň z komerčných dôvodov, berúc do úvahy náklady a čas, je stanovenie expresie cieľového proteínu na úrovni proteínu vo všeobecnosti výhodnejšie ako stanovenie na úrovni nukleovej kyseliny.
Uskutočnenia predloženého vynálezu budú teraz ilustrované s odvolaním sa na experimentálne príklady. Ďalšie aspekty a uskutočnenia predloženého vynálezu budú pre odborníka v oblasti zrejmé.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava protilátok
Protilátky pre Cdc6 boli pripravené použitím nasledujúceho protokolu.
Identifikovali sa exprimované sekvenčné prívesky kódujúce fragmenty ľudského Cdc6-podobného proteínu (GenBank prístupové čísla: T90351, H59204, N69246m AA045217, AA099980) na základe ich slabej sekvenčnej homológie s ľudským Orc1 a kvasinkovým Cdc6/Cdc18. Korešpondujúce knižničné klony sa získali od IMAGE Consortium (Research Genetics Inc., USA) a sekvenovali sa oba reťazce použitím ABI PRISM 377 sekvenčného prístroja (Applied Biosystems). Konsenzus sekvencie všetkých piatich klonov obsahovali otvorený čítací rámec s 563 aminokyselinami. Porovnanie s následne publikovanou sekvenciou ľudského Cdc6 (Williams a iný, 1997) odhalilo 99,7% homológiu na proteínovej úrovni. Dva oddelené fragmenty ľudského Cdc6 zodpovedajúce aminokyselinám 145 až 360 a 364 až 547 boli klonované ako Xbal-BamHI fragmenty do pET23a expresného vektora (Novagen) a exprimovali sa v E. coli CL41 kmeni. Rekombinantné proteínové fragmenty sa purifikovali Ni+2 agarózovou afínitnou chromatografiou (Qiagen) a použili sa na imunizáciu. Protilátky sa vyvolali a afinitne purifikovali ako
-24už bolo predtým opísané (Romanowski a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10189-10194). Tri protilátky rozoznávali predominantný pás s veľkosťou 62 kD v celkových extraktoch HeLa buniek a v jadrových extraktoch.
Protilátky proti MCM5 boli pripravené nasledovne:
PCR primery boli navrhnuté na základe publikovanej sekvencie ľudského MCM5 (Hu a iný, 1993, Nucl. Acid Res. 21, 5289-5293). Fragment MCM5 kódujúcej sekvencie zodpovedajúci aminokyselinám 367 až 582 sa amplifikoval z reverzne transkribovanej HeLa cDNA a klonoval sa ako Sphl-Bglll fragment do pQE70 expresného vektora (Qiagen). Proteín sa exprimoval v BL21 E. coli bunkách a purifikoval sa použitím Ni2+ agarózovej afinitnej chromatografie (Qiagen). Protilátky sa vyvolali ako už bolo predtým opísané (Romanowski a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10189-10194).
Príklad 2
Vzťah Cdc6 a MCM5 ku bunkovej proliferácii
Predtým sa Western blotom ukázalo, že nesmrteľná ľudská bunková línia HeLa exprimuje Cdc6 a MCM5 počas bunkového cyklu (Williams a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:142-147; Schulte a iný, Eur. J. Biochem., 1996, 235, 144151). V súčasnosti bolo publikované tlmenie Cdc6 v pokojových Wi38 ľudských fibroblastoch Wílliamsom a inými, 1997. Pôvodcovia predloženého vynálezu tiež ukázali prostredníctvom Western blotu, že Cdc6 expresia je tlmená, keď sa myšie 3T3 fibroblasty dostanú do pokojového štádia kontaktnou inhibíciou (obrázok 1 A).
NIH 3T3 bunková línia sa zastavila rastom po súvislú vrstvu. Kultúry sa držali v pokojovom štádiu 7 dní. Bunky opustili G0 zastávku rozdelením trypsínom a premiestnením na nové platne. Rozpustné (supernatant) a jadrové (pelet) proteínové extrakty sa pripravovali v trojhodinových intervaloch a oba extrakty sa podrobili imunoblotingu s protilátkami proti ľudskému MCM5, Orc2 a Cdc6.
Orc2 (pozri Gavin a iný, kvôli klonovaniu - Science (1995) 270, 1667-1671) ostáva naviazaný na chromatín v pokojových bunkách (G0) a významne sa nezvyšuje, keď bunky vstúpia do bunkového cyklu. Na rozdiel od neho MCM5 sa
-25nedal detegovať v chromatín viažucej frakcii (pelet) pokojových buniek, aj keď rozpustná frakcia obsahovala významné množstvá MCM5. Na rozdiel od MCM5, Cdc6 úplne chýbal v pokojových bunkách, ale expresia tohto proteínu sa rýchlo indukovala, keď bunky vstúpili do bunkového cyklu. Podobné výsledky sa získali aj s ľudskou EJ 13 bunkovou líniou (odvodenou od rakoviny močového mechúra).
Z týchto výsledkov vyplýva, že neprítomnosť Cdc6 v pokojových bunkách je všeobecným fenoménom.
Tieto štúdie boli rozšírené o imunofluorescenciu a aplikáciu anti-Cdc6 a antiMCM5 protilátok na celé bunky.
Zistilo sa, že expresia Cdc6 a MCM5 je tiež tlmená, keď sa novorodenecké ľudské fibroblasty (NHF) dostanú do pokojového štádia kontaktnou inhibíciou. NHF rástli do súvislej vrstvy a udržiavali sa v pokojovom štádiu tri dni. Bunky sa dostali z GO zastávky oddelením trypsínom a prenesením na nové platne. Vo viacerých časových bodoch sa potom zozbierali celé bunky od odchodu z GO fázy po vstup do S-fázy. Farbenie propidium jodidom bolo použité na odhalenie DNA a výsledky sa porovnali s farbením vzoriek s anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami.
Pokojové (GO) bunky nevykazovali žiadnu Cdc6 imunoreaktivitu a veľmi slabý signál s anti-MCM5 protilátkou. Avšak počas vstupu do bunkového cyklu a S-fázy bola pozorovaná silná jadrová imunoreaktivita na Cdc6 a MCM5.
Tieto štúdie mohli naznačovať, že anti-Cdc6 protilátky môžu poskytnúť marker na proliferáciu buniek, podobný s PCNA alebo Ki67. Ani PCNA, ani Ki67 sa neosvedčili ako uspokojujúce na cytológiu krčku maternice.
Príklad 3
Anti-Cdc6 a anti-MCM5 väzobné molekuly detegujú abnormálne (napr. nádorové) bunky oveľa účinnejšie ako PCNA alebo Ki67 protilátky
Výsledky načrtnuté v príklade 2 naznačujú, že Cdc6 expresia mohla napodobovať expresiu PCNA alebo Ki76, z ktorých ani jeden sa neosvedčil ako uspokojivý na cytológiu krčku maternice. Pôvodcovia predloženého vynálezu porovnávali protilátky proti týmto proteínom na rezoch normálneho alebo chorého krčku maternice.
-26Imunofarbenie SILs krčku maternice na bežné proliferačné markery PCNA a Ki67 vykazuje odlišný charakter imunoreaktivity v porovnaní s farbením na Cdc6 alebo MCM5. V normálnom krčku protilátky proti všetkým štyrom antigénom ukazovali pozitívne imunofarbenie epiteliálnych buniek obmedzené na bazálne a parabazálne vrstvy. Nebolo pozorované žiadne farbenie metaplastických, stromálnych alebo zápalových buniek. Tak v nízkom, ako aj vo vysokom stupni SILs (LSIL a HSIL) vykazovali protilátky proti Cdc6 a MCM5 pozitívne imunofarbenie väčšiny (> 95 %) abnormálnych buniek. Naproti tomu imunofarbenie na PCNA a Ki67 bolo pozitívne len v menšine populácie (< 30 %) abnormálnych buniek oboch stupňov SILs. Koilocyty, ktoré sa vyznačujú LSIL a odrážajú HPV cytopatický účinok, vykazovali všetky pozitívne imunofarbenie s Cdc6 a MCM5, zatiaľ čo len menšina populácie (20 %) vykazovala pozitívne farbenie na PCNA alebo Ki67.
Oveľa vyššia úroveň farbenia abnormálnych buniek poskytuje zrejmú výhodu pri použití anti-Cdc6 alebo Anti-MCM5 väzobných molekúl voči anti-PCNA a antiKi67 molekulám ph skríningu krčku maternice, pri ktorom sa vzorky tkaniva najbežnejšie odoberajú stermi povrchu epitelu.
Na sklenené podložné sklíčka sa odrezali 5 pm rezy a zbavili sa vosku v xyléne. Endogénna peroxidázová aktivita sa potlačila inkubovaním v 0,6% hydrogénperoxide v 100% metanole počas 3 až 5 minút pri laboratórnej teplote. Sklíčka sa premývali vo fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku 2x5 minút a potom sa blokovali približne 100 μΙ na rez 10% fetálneho hovädzieho séra (FCS) vo fosfátom tlmenom fýziologickom roztoku (PBS). Sklíčka sa odvodnili a nadbytok séra sa odsal. Primárne protilátky boli nariedené na 1 v 20 v PBS s obsahom 2,5% FCS a ku každému rezu sa pridalo 25 až 50 μΙ. Inkubovalo sa 45 minút pri laboratórnej teplote vo vlhkej komore. Sklíčka sa potom premývali 3x5 minút v PBS, následne sa blokovali s 20% králičím sérom pre anti-Ki67 alebo anti-PCNA a 20% oslím sérom pre anti-Cdc6 alebo anti-MCM5 v PBS počas 15 minút. Po vysušení blokovacej protilátky a odsatí sklíčok sa pridala biotinilovaná králičia antimyšia sekundárna protilátka (pre anti-Ki67 alebo anti-PCNA) alebo oslia anti-králičia (pre anti-Cdc6 alebo anti-MCM5) v riedení 1 v 200 v PBS s obsahom 10% normálneho ľudského séra na 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5minútových premývaniach v PBS sa pridal komplex streptavidín-biotín-chrenovej
-27peroxidázy v riedení 1 v 500 v PBS na 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5minútových PBS premývaniach sa pridal substrát diaminobenzidín v koncentrácii 1 % v 100 mM Tris.CI (pH 7,6) s obsahom 0,005% hydrogénperoxidu a inkuboval sa 5 minút pri laboratórnej teplote. Reakcia sa zastavila vymytím vodou z vodovodu a sklíčka sa jemne farbili Gillovým hematoxylínom, dehydratovali sa v stupňovaných etanoloch a premývali 2x6 minút v xyléne. Aplikovali sa krycie sklíčka s DPX prichytávacím médiom.
Sériové rezy normálneho krčku maternice boli farbené na PCNA, ΚΪ67, MCM5 a Cdc6 použitím príslušných protilátok. Všetky tieto protilátky vykazujú podobné charakteristiky imunoreaktivity s pozitívnymi bunkami, ktorá je obmedzená len na bazálne a parabazálne vrstvy.
Sériové rezy s nízkym stupňom SIL (CINI) krčku maternice boli farbené na PCNA, Ki67, MCM5 a Cdc6 použitím protilátok. Dysplázia je nápadná v spodnej tretine šupinového epitelu a je spojená s vírusovými zmenami týkajúcimi sa HPV (koilocytóza), pričom tieto zmeny sú rozšírené na povrch. PCNA a Ki67 vykazujú škvrnitú fokálnu imunoreaktivitu, ktorá je obmedzená na spodnú tretinu epitelu, a v ktorej je len malá časť atypických buniek pozitívne sfarbená. Na rozdiel od nich, Cdc6 a MCM5 vykazujú imunoreaktivitu v celej hrúbke s pozitívnym farbením všetkých atypických buniek vrátane koilocytov vo vrchnejších vrstvách epitelu.
Sériové rezy s vysokým stupňom SIL boli farbené použitím PCNA, Ki67, MCM5 a Cdc6 protilátok. Dysplázia je prítomná vo všetkých vrstvách epitelu. PCNA a Ki67 vykazujú podobné charakteristiky imunoreaktivity s farbením v celej hrúbke, ale len menšinová časť populácie atypických buniek je pozitívna (do približne 30 %). Cdc6 a MCM5 tiež vykazujú farbenie v celej hrúbke epitelu. Avšak v značnom kontraste s PCNA a Ki67, Cdc6 a MCM5 vykazujú pozitívne farbenie všetkých atypických buniek.
Z týchto výsledkov vyplýva výnimočná užitočnosť použitia anti-Cdc6 alebo anti-MCM5 špecifických väzobných molekúl na stanovenie stavu krčku maternice prostredníctvom zhodnotenia viazania v sterovej vzorke. Stery sú vzorkou len vrchnej povrchovej vrstvy buniek z krčka maternice, takže je dôležité mať vysokú úroveň farbenia. Takáto vysoká úroveň farbenia získaná s anti-Cdc6 a anti-MCM5 v skorých štádiách abnormality (nízky stupeň SIL, CINI), ktorá nie je dosiahnutá s
-28anti-PCNA, ani anti-Ki67, je veľmi významná. Navyše farbenie v celej hrúbke získané použitím anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátok na LSIL vzorkách, ale nie antiPCNA, ani anti-Ki67 protilátkami, zvýrazňuje výnimočnú užitočnosť anti-Cdc6 a antiMCM5 pre zhodnotenie sterových vzoriek v skorých štádiách potenciálnej predmalignity.
Príklad 4
Cdc6 a MCM5 protilátky detegujú abnormálne bunky v steroch krčku maternice
Príklad 3 demonštruje hodnotu anti-Cdc6 a anti-MCM5 väzobných molekúl na stanovenie potenciálnych pred-malígnych lézií v rezoch krčku maternice. Ďalšie experimentálne výsledky ukazujú, že sú rovnako účinné pri detekcii abnormálnych buniek v prípravkoch steru krčku maternice.
Stery krčku maternice sa fixovali 10 minút vo formaldehyde (4%, čerstvo pripravený z paraformaldehydu vo fosfátom tlmenom fýziologickom roztoku). Fixovaný materiál sa potom farbil s anti-Cdc6 protilátkami (1:200) alebo anti-MCM5 protilátkami (1:200) a nasledovala oslia anti-králičia polyklonálna protilátka konjugovaná s fluoresceínizotiokyanátom (Amersham; 1:100). Celková DNA sa označila propidium jodidom. Obrazy sa získali použitím skenovacej laserovej konfokálnej mikroskopie (Bio-Rad MRC 1024). Na týchto obrázok je celková DNA červená, Cdc6 alebo MCM5 imunofarbenie je zelené, takže imunoreaktivita jadra sa zdá žltá.
Príklady normálnych sterov krčku maternice vykazujú charakteristický pás paralelne zoradených endocervikálnych buniek a zmiešanej populácie povrchových a metaplastických šupinových buniek. Nie je tam žiadny dôkaz špecifickej anti-Cdc6 alebo anti-MCM5 imunoreaktivity s ktoroukoľvek z testovaných protilátok.
Abnormálne stery obsahujúce dyskaryotické bunky (atypické šupinové bunky) vykazujú pozitívne farbenie troma rozličnými anti-Cdc6 protilátkami a anti-MCM5 protilátkou. Koilocyty tiež vykazujú silnú imunoreaktivitu s anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami. Žiadna z priľahlých povrchových šupinových/metaplastických buniek nevykazuje Cdc6 alebo MCM5 imunoreativitu.
-29Výsledky boli získané použitím rôznych anti-Cdc6 protilátok, ktoré prednostne farbia LSI L bunky, vrátane koilocytov, naproti veľmi nízkemu pozadiu v steroch normálnych krčkov maternice alebo v normálnych bunkách v steroch abnormálneho krčku. Tieto výsledky sa získali aj použitím anti-MCM5 protilátky.
Podobné výsledky sa ukázali s protilátkami proti MCM5.
Príklad 5
Cdc6 a MCM5 protilátky prednostne farbia nádorové bunky v prsníku
Anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátky boli testované na inom mieste bežných rakovín, v prsníku. Fixovanie a farbenie prsníkového tkaniva bolo rovnaké ako bolo opísané v príkladoch 3 a 4 pre stery krčku maternice.
Anti-Ced6 a anti-MCM5 protilátky boli testované na rade rakovín prsníka.
Zatiaľ čo normálny prsník nevykazuje žiadny dôkaz imunofarbenia, bolo pozorovanie silné pozitívne farbenie tak s anti-Cdc6, ako aj anti-MCM5 protilátkami v rôznych histologických typoch rakoviny prsníka vrátane nízko a vysoko invazívneho duktálneho karcinómu. Nízko stupňový slizničný karcinóm tiež vykazuje silné pozitívne farbenie oboma protilátkami. Dôležité je, že normálne stromálne bunky v blízkosti nádora boli negatívne.
Príklad 6
Analýza vzoriek krvi
Archívne vzorky krvi od pacientov s roztrúsenou metaplastickou chorobou boli testované na prítomnosť MCM5 a Cdc6 použitím enzymaticky spojeného imunosorbentného testu ako je opísané vo Williams a iný, Clin. Chem. Acta, 1986, 155, 329-344. Množstvo rozpustného MCM5 a Cdc6 v sére koreluje s dávkou nádora.
Príklad 7
Porovnanie sterov a mrazených rezov s tkanivovými rezmi obalenými v parafínovom vosku, ktoré sa podrobili vyhľadávaniu antigénu
-30Imunoperoxidázové farbenie 5 μηπ rezov zahŕňajúcich formalínom fixované tkanivové rezy obalené parafínovým voskom normálneho krčku (sedem vzoriek), LSIL (päť vzoriek), HSIL (šesť vzoriek) a šupinového bunkového karcinómu (šesť vzoriek) sa uskutočňovalo s protilátkami proti Ki67, PCNA, MCM5 a Cdc6.
Na sklenené podložné sklíčka sa odrezali 5 pm rezy a zbavili sa vosku v xyléne. Endogénna peroxidázová aktivita sa potlačila inkubovaním v 0,6% hydrogénperoxide v 100% metanole počas 30 minút pri laboratórnej teplote. Sklíčka sa premývali 2 minúty v ultračistej vode a potom sa varili tlakom 2 minúty v tlmivom roztoku citrátu sodného. Sklíčka sa premývali v Tris tlmenom fyziologickom roztoku (TBS) 2x5 minút a potom sa blokovali približne 100 μΙ na rez 10% kozieho séra v TBS. Sklíčka sa odvodnili a nadbytok séra sa odsal. Primárne protilátky boli nariedené na 1 v 200 v TBS s obsahom 1% BSA a ku každému rezu sa pridalo 100 μΙ. Inkubovalo sa cez noc, pri 4 °C vo vlhkej komore. Sklíčka sa potom premývali 3 x 5 minút v TBS, nasledovala biotinylovaná kozia anti-králičia sekundárna protilátka v riedení 1 v 500 v TBS s obsahom 1% BSA, 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5-minútových premývaniach v TBS sa pridal komplex streptavidín-biotínchrenovej peroxidázy v riedení 1 v 500 v TBS na 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5-minútových TBS premývaniach sa pridal substrát diaminobenzidín v koncentrácii 1 % v TBS s obsahom 0,005% hydrogénperoxidu a inkuboval sa 10 minút pri laboratórnej teplote. Reakcia sa zastavila vymytím vodou z vodovodu a sklíčka sa jemne farbili hematoxylínom, dehydratovali sa v stupňovaných etanoloch a vyčistili sa v xyléne. Aplikovali sa krycie sklíčka s DPX prichytávacím médiom.
Imunoperoxidázové farbenie mrazených tkanivových rezov normálneho krčku (osem vzoriek), HSIL (deväť vzoriek) a LSIL (osem vzoriek) sa uskutočňovalo s protilátkami proti PCNA, Ki67, MCM5 a Cdc6.
Mrazené rezy sa fixovali 10 minút v acetóne. Endogénna peroxidázová aktivita sa potlačila inkubovaním v 0,6% hydrogénperoxide v 100% metanole 30 minút. Rezy sa potom premývali v TBS a blokovali sa cez noc s 10% kozím sérom v TBS. Primárne protilátky sa nariedili v pomere 1/200 v TBS s obsahom 1% BSA a inkubovali sa cez noc pri 4 °C. Potom nasledoval postup so sekundárnou protilátkou ako je opísaný vyššie pre fixované tkanivové rezy.
-31 Citlivosť farbenia s anti-MCM5 a anti-Cdc6 protilátkami bola oveľa vyššia ako s anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami, keď sa aplikovali na mrazené rezy.
Na normálnych, LSIL a šupinových bunkových nádorových tkanivách fixovaných vo formalíne, obalených v parafíne a vystavených sterilizácii, poskytovali anti-PCNA, anti-MCM7, anti-MCM5 a anti-Cdc6 podobné charakteristiky farbenia. V porovnaní s nimi bol KÍ67 oveľa menej citlivý, len s fokálnym slabím farbením LSIL a šupinových karcinómových buniek.
Príklad 8
Farbenie mrazených rezov a tkanív podrobených vyhľadávaniu antigénu s antiMCM7 protilátkami
Štyri mrazené rezy krčku maternice klasifikované ako HSIL boli farbené s anti-MCM7 protilátkou.
Pozorované boli rovnaké charakteristiky farbenia ako pri farbení s anti-Cdc6 a anti-MCM5 protilátkami.
Tento výsledok sa líši od výsledkov Hiraiwa a iných (Int. J. Cancer, 1997, 74: 180-184), ktorí zistili podobné imunofarbiace charakteristiky pre PCNA a MCM7 (hCDC7) v niekoľkých ľudských tkanivách a v troch typoch ľudských nádorov, ktoré sa podrobili protokolom na vyhľadávanie antigénu.
Avšak v súlade s Hiraiwa a inými sa zistilo, že farbiace charakteristiky získané pre anti-MCM7 protilátky na normálnom krčku, LSIL a šupinových bunkových karcinómových tkanivových rezoch obalených v parafíne, ktoré sa podrobili vyhľadávaniu antigénu, sú podobné s charakteristikami získanými pre antiPCNA protilátky. Ako je uvedené v príklade 7, farbiace charakteristiky pre antiMCM5 a anti-Cdc6 protilátky na takto pripravených rezoch boli tiež podobné s charakteristikami PCNA protilátok.
Príklad 9
Farbenie s anti-MCM2 protilátkami
-32Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM2 bola použitá na farbenie dvoch mrazených rezov normálneho krčku maternice a štyroch mrazených rezov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).
Normálny ektocervix vykázal farbenie jadra len v bazálnej vrstve, bez expresie v povrchových diferencovaných bunkách. Naproti tomu nastalo jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu. Endocervikálne bunky boli negatívne.
Príklad 10
Farbenie s anti-MCM3 protilátkami
Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM3 bola použitá na farbenie mrazeného rezu normálneho krčku maternice a dvoch mrazených rezov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).
Normálny ektocervix vykazoval dosť granulárne farbenie jadra len v bazálnej vrstve, a žiadnu jadrovú expresiu v povrchových diferencovaných bunkách. Bolo vidieť určité farbenie pozadia, cytoplazmy keratinocytov. Naproti tomu, ukázalo sa jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu. Vyskytlo sa určité farbenie endocervikálnej sliznice, hoci jadrové farbenie endocervikálnych buniek bolo negatívne.
Polyklonálna anti-ľudská MCM3 bola použitá aj na farbenie štyroch sterov HSIL a dvoch sterov LSI L (z ktorých každý obsahoval normálne bunky krčku maternice). V každom prípade sa ukázalo jadrové farbenie SÍL buniek. Navyše sa objavilo určité pozadie cytoplazmatického farbenia keratinocytov a určité farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.
Polyklonálna arňi-Xenopus MCM3 bola použitá na farbenie mrazených rezov HSIL. Krížová reaktivita anti-Xenopus MCM3 protilátok s ľudskou MCM3 sa potvrdila Western blotom a lokalizáciou na tkanivových rezoch. Objavilo sa jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu.
Príklad 11
Farbenie s anti-MCM4 protilátkami
-33Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM4 bola použitá na farbenie mrazeného rezu normálneho krčku maternice a dvoch mrazených rezov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).
Normálny ektocervix vykazoval dosť granulárne farbenie jadra len v bazálnej vrstve, a žiadnu jadrovú expresiu v povrchových diferencovaných bunkách. Bolo vidieť určité farbenie pozadia, cytoplazmy keratinocytov. Naproti tomu, ukázalo sa jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu so silným farbením povrchových jadier. Vyskytlo sa slabé farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.
Polyklonálna anti-ľudská MCM4 bola použitá aj na farbenie dvoch sterov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálne bunky krčku maternice). V každom prípade sa ukázalo jadrové farbenie HSIL buniek. Navyše sa objavilo určité pozadie cytoplazmatického farbenia keratinocytov a určité farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.
Príklad 12
Farbenie s anti-MCM6 protilátkami
Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM6 bola použitá na farbenie mrazeného rezu normálneho krčku maternice a dvoch mrazených rezov HSIL (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).
Normálny ektocervix vykazoval silné farbenie jadra len v bazálnej vrstve, a žiadnu jadrovú expresiu v povrchových diferencovaných bunkách. Naproti tomu, ukázalo sa silné jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu. Vyskytlo sa určité farbenie endocervikálnej sliznice, ale minimálne farbenie endocervikálnych bunkových jadier.
Polyklonálna anti-ľudská MCM6 bola použitá aj na farbenie štyroch sterov HSIL a štyroch sterov LSIL (z ktorých každý obsahoval normálne bunky krčku maternice). V každom prípade sa ukázalo jadrové farbenie SIL buniek. Navyše sa objavilo určité pozadie cytoplazmatického farbenia keratinocytov a určité farbenie endocervikálnych jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.
-34Príklad 13
Ďalšie farbiace experimenty s anti-MCM7 protilátok
Králičia polyklonálna anti-ľudská MCM7 bola použitá na farbenie troch mrazených rezov normálneho krčku maternice, šiestich mrazených rezov HSIL a mrazeného rezu krčku maternice SCC (z ktorých každý obsahoval normálny epitel krčka maternice).
Normálny ektocervix vykazoval farbenie jadra len v bazálnej vrstve, a žiadnu jadrovú expresiu v povrchových diferencovaných bunkách. Bolo vidieť určité farbenie pozadia, cytoplazmy keratinocytov. Naproti tomu, ukázalo sa silné jadrové farbenie veľkej väčšiny HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu. Vyskytlo sa určité farbenie endocervikálnej sliznice a slabé farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.
Polyklonálna anti-ľudská MCM7 bola použitá aj na farbenie dvoch sterov LSIL (z ktorých každý obsahoval normálne bunky krčku maternice). V každom prípade sa ukázalo jadrové farbenie SIL buniek. Navyše sa objavilo určité pozadie cytoplazmatického farbenia keratinocytov a určité farbenie endocervikálnych bunkových jadier pri použitom riedení primárnej protilátky.
Polyklonálna anii-Xenopus MCM7 (potvrdená krížová reaktivita s ľudskou MCM7 Western blotom a lokalizáciou na tkanivových rezoch) bola použitá na farbenie mrazených rezov HSIL. Objavilo sa jadrové farbenie HSIL buniek v celej hrúbke abnormálneho epitelu.
Metódy
Príprava sterov krčku maternice
Čerstvé stery sa fixovali (5 minút v zmesi acetón:metanol v pomere 50:50) a vysušili sa vzduchom. Po potlačení endogénnej peroxidázovej aktivity (ako bolo opísané vyššie), sa bunky permeabilizovaii (v 4mM deoxycholáte sodnom 10 minút), premývali sa (TBS s 0,25% Tritónom X-100) a blokovali sa cez noc 10% kozím sérom v TBS. Primáme protilátky boli nariedené na 1 v 200 v TBS s obsahom 1% BSA a inkubované cez noc pri 4 °C. Sklíčka sa potom premývali 3x5 minút v TBS,
-35nasledovala biotinylovaná králičia sekundárna protilátka (Dáko) v riedení 1 v 500 v TBS s obsahom 1% BSA, 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5-minútových premývaniach v TBS sa pridal komplex streptavidín-biotín-chrenovej peroxidázy (Dáko) v riedení 1 v 500 v TBS na 30 minút pri laboratórnej teplote. Po troch 5minútových TBS premývaniach sa pridal substrát diaminobenzidín v koncentrácii 1 % v TBS s obsahom 0,005% hydrogénperoxidu a inkuboval sa 10 minút pri laboratórnej teplote. Reakcia sa zastavila vymytím vodou z vodovodu a sklíčka sa jemne farbili hematoxylínom, dehydratovali sa v stupňovaných etanoloch a vyčistili sa v xyléne. Aplikovali sa krycie sklíčka s DPX prichytávacím médiom.
Imunofluorescencia
Čerstvo zozbieraný materiál zo sterov krčku maternice sa rozsuspendoval v 0,5 ml PBS a fixoval sa pridaním 0,5 ml 8% formaldehydu a naniesol sa na polylyzínové krycie sklíčka. Krycie sklíčka sa spracovali ako je opísané vRomanowski a iný, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10189-10194. Po blokovaní v 5% BSA/PBSfTritón X-100 a SDS sa inkubovali s primárnou protilátkou, premyli sa, inkubovali sa so sekundárnou protilátkou (FITC konjugovaná anti-králičia protilátka Amersham 1:100) a kontrastne sa farbili na DNA s propidium jodidom/RNAázou A (obe od Sigma v koncentrácii 50 ng/ml), premývali sa a spevnili sa v glycerol/PBS/fenyléndiamíne.
Fluorescenčné obrazy sa zachytávali na BioRad MRC 1024 skenovacom laserovom konfokálnom mikroskope použitím dvojkanálovej (FITC & Texas Red) metódy. Pre niektoré obrazy sa zachytávali konfokálne série v 1 až 2 pm krokoch a potom sa premietli ako jeden rám (obrázky 4a a c). Normálne a nádorové prsníkové tkanivo sa čerstvo odobralo z mastektomických vzoriek. Tenké plátky (< 1 mm) sa fixovali v 4% paraformaldehyde 30 minút a potom sa spracovali ako je uvedené vyššie, ale bol poskytnutý dlhší čas na inkubáciu s oboma protilátkami a na premývania.
Príklad 14
Slepé porovnávanie uskutočnenia podľa predloženého vynálezu so štandardným Pap farbením
-36Uskutočnil sa slepý pokus na porovnanie detekčnej účinnosti použitím protilátok proti MCM5 so štandardným Pap farbením uskutočňovaným na steroch získaných od žien navštevujúcich kolposkopické kliniky pre ambulantných pacientov v lokálnych nemocniciach.
Z tabuľky 1 je zrejmé, že z 26 prípadov stanovených ako pozitívne rutinným Pap farbením, bolo všetkých 26 zhodnotených pozitívne protilátkovým testom podľa vynálezu. Zo 16 prípadov, ktoré boli stanovené ako negatívne rutinným Pap farbením, bolo 13 negatívnych aj pri stanovovaní protilátkovým testom.
Zo zvyšných troch jeden prípad obsahoval farbené nezrelé metaplastické šupinové bunky, ktoré vykazovali reaktívne zmeny na základe zápalu. Čo sa týka ďalších dvoch prípadov opätovným preskúmaním Pap farbenia sa potvrdilo, že obsahujú abnormálne (LSIL) bunky, tzn. boli falošne pozitívne, čo sa dá použitím predloženého vynálezu eliminovať.
Tieto výsledky demonštrujú, že použitím protilátkového testu podľa predloženého vynálezu nedochádza k strate informácií z Pap farbenia, len sa objaví prírastok informácií. To umožňuje, aby akékoľvek možné zlyhanie protilátkového testu bolo poistené použitím bežného Pap farbenia.
Príklad 15
Analýza vzoriek moču pacientov s malignitami močového traktu
Na detekciu ľudského MCM bol určený disociáciu zosilňujúci lantanidový fluorescenčný imunotest, DELFIA, použitím dvoch odlišných králičích polyklonálnych anti-hMCM5 antisér.
Základom sendvičového testu je imobilizácia nadbytku špecifickej protilátky na povrchu (tu polystyrénové mikrotitračné jamky) - tzn. „zachytenie“ protilátky. Po väzobnej reakcii primárnej protilátky nasleduje pridanie sekundárnej (tu europium) značenej protilátky so špecifitou k odlišným epitopom. Po ukončení imunoreakcie sa odmyjú nadbytočné materiály a po pridaní zosilňovacieho roztoku sa meria časovo rozlíšenou fluorescenciou (Wallac Oy) v časovo rozlišovacom fluorometri. Signál je proporcionálny ku koncentrácii analytického činidla.
-37Použitý bol nasledujúci test:
1. Pokrytie s polyklonálnou králičou anti-MCM5 protilátkou (1600 ng/jamku) cez noc (4 °C);
2. 3 x premývanie s DELFIA premývacím tlmivým roztokom (Wallac Oy);
3. Blokovanie v 5% BSA/PBS 1 hodinu;
4. 3 x premývanie s DELFIA premývacím tlmivým roztokom (Wallac Oy);
5. Väzbová reakcia s primárnu protilátkou (1:3 riedenie analytického činidla vo Wallac multi tlmivom roztoku s 0,02% TWEEN) cez noc (4 °C);
6. 4 x premývanie s DELFIA premývacím tlmivým roztokom (Wallac Oy);
7. Väzobná reakcia so sekundárnou protilátkou s európium značenou polyklonálnou králičou anti-MCM5 protilátkou (4 20Eu/lgG) 3 hodiny;
8. 6 x premývanie s DELFIA premývacím tlmivým roztokom (Wallac Oy);
9. Pridanie posilovacieho roztoku a 10 minútové inkubovanie s miešaním. Meranie časovo rozlíšenej fluorescencie na časovo rozlišovacom fluorometri (Wallac Oy).
Použitím polyklonálneho králičieho anti-MCM5 antiséra z dvoch odlišných králikov a rekombinantného MCM5 v 5% BSA/PBS ako analytického činidla sa získala štandardná krivka medzi 13pM a 41250pM. Koncentrácia hMCM5 vo vzorke sa stanovila porovnaním impulzov vzorky v DELFIA teste so štandardnou krivkou urobenou z rekombinantným hMCM5 5% BSA/PBS. Ešte lepšia citlivosť sa dá očakávať pri použití monoklonálnych protilátok.
Vzorky moču od pacientov s malignitami močového traktu z Addenbrookes nemocnice, Cambridge, UK sa centrifugovali (50 až 150 ml) pri 3000 rpm (SIGMA 4K10, 7 min, 4 °C) a rozpustné frakcie z bunkového peletu sa vyrobili hypotonickým napučiavaním, homogenizáciou a slanou extrakciou DNA-viazaných proteínov. Rozpustné frakcie sa testovali použitím MCM5 DELFIA a biochemické údaje sa porovnávali s diagnostickými správami na urologických patologických službách nemocnice.
Z piatich vzoriek, ktoré boli klinicky stanovené ako pozitívne malígne, boli 4 stanovené ako pozitívne použitím DELFIA podľa vynálezu (80 %), pričom vykazovali merateľné množstvá MCM5 (29 až 85 pM). Zo šiestich vzoriek, ktoré boli klinicky stanovené ako negatívne z hľadiska malignity, vykazovali všetky DELFIA odpovede podobné nulovému štandardu.
-38Príklad 16
Analýza vzoriek krvi pacientov s akútnou a chronickou leukémiou/lymfómom
DELFIA opísaná v príklade 15 bola použitá na testovanie vzoriek krvi získaných od pacientov s akútnou a chronickou leukémiou/lymfómom zAddenbrookes Nemocnice, Cambridge. Krv sa centrifugovala pri 3000 rpm (SIGMA 4K10, 7 min, 4 °C) a rozpustné frakcie z bunkového peletu sa vyrobili hypotonickým napučiavaním, homogenizáciou a slanou extrakciou DNA viazaných proteínov. Rozpustné frakcie sa následne testovali použitím DELFIA.
Zo 6 malígnych prípadov bolo 5 otestovaných ako pozitívnych použitím DELFIA podľa predloženého vynálezu (83 %), pričom vykazovali merateľné množstvá MCM5 (24-1945 pM). Zo 6 kontrolných vzoriek (krv od diabetických ambulantných pacientov) dávali všetky odpovede podobné nulovému štandardu.
Príklad 17
Sérologická detekcia metastatickej malignity
Testy sa uskutočňovali so sérom pacientiek s metastatickou prsníkovou a vaječníkovou rakovinou z Addenbrookes Nemocnice, Cambridge, UK použitím DELFIA opísanej v príklade 15.
Dva prípady sarkómu a tri prípady karcinómu (prsníkový a vaječníkový adenokarcinóm) vykázali merateľné množstvá MCM5.
Príklad 18
Príprava „pan-MCM“ polyklonálnej protilátky na použitie podľa vynálezu
Prípravok polyklonálnej protilátky schopný viazať MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7 sa získal nasledovne.
Peptid WCIDEFDKMSDMRTAC, zodpovedajúci konsenzus sekvencii spoločnej pre MCM rodinu proteínov, sa syntetizoval použitím t-BOC chémie. Peptid sa konjugoval na PPD (purifikovaný proteínový derivát - tuberkulín).
-39Králiky sa imunizovali injekciou v 21 dňových intervaloch. 10 dní po tretej imunizácii sa odobralo sérum a bolo použité v následných experimentoch (označované ako „pan-MCM“ protilátka v nasledujúcich experimentálnych príkladoch).
Príklad 19
Farbenie normálneho prsníkového a prsníkového nádorového tkaniva s anti-Cdc6, anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7 a pan-MCM protilátkami
Histologické vzorky normálneho prsníka (od pacientiek, ktoré sa podrobili operáciám na redukciu prsníkov) a histologické vzorky potvrdených duktálnych a lobulárnych karcinómov sa farbili protilátkami proti Cdc6, MCM2, MCM5 a MCM7 a pan-MCM protilátkou. Anti-MCM2 protilátka bola BM28 myšou monoklonálnou protilátkou komerčne dostupnou od Transduction Laboratories (pozri ich Katalóg protilátok z roku 1998). Farbenie sa uskutočňovalo individuálne pre každú protilátku ako je opísané.
Skúmané boli tak vo formalíne fixované vzorky obalené parafínom, ktoré sa sterilizovali, ako aj mrazené vzorky.
V súlade s etickými pravidlami potvrdenými nemocnicou sa využili formalínom fixované ľudské tkanivá obalené parafínom získané diagnostickou biopsiou alebo po resekcii v Addenbrooke Nemocnici. Z týchto tkanív sa odrezali päť mikrometrové rezy na APES (aminopropyltrietoxysilánom) pokryté podložné sklíčka, ktoré sa v xyléne zbavili vosku a prešli cez alkoholy a vodu. Tkanivá sa varili tlakom v citrátovom tlmivom roztoku, aby sa uľahčilo vyhľadávanie epitopu, nasledovalo premývanie v Tris-tlmenom fyziologickom roztoku (TBS). Endogénna peroxidázová aktivita sa potlačila inkubáciou v 0,6% hydrogénperoxide v TBS počas 30 minút.
Rezy sa premyli v TBS a blokovali sa s 10% kozím sérom v TBS do 2 hodín.
Primárne protilátky sa riedili v TBS s obsahom 0,1% Tritónu a 1% hovädzieho sérového albumínu (BSA). Sto mikrolitrov sa pridalo ku každému rezu a sklíčka sa inkubovali pri 4 °C vo vlhkej komore.
-40Sklíčka sa potom premývali v TBS s obsahom 0,025% Tritónom, nasledovala inkubácia v biotinylovanej kozej anti-králičej sekundárnej protilátky (DÁKO) v pomere 1:500 v TBS s obsahom 1% BSA počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote. Po premývaniach v TBS bol na farbenie sklíčok použitý systém strepavidínu a chrenovej peroxidázy využívajúci diaminobenzidín. Reakcia sa zastavila odmytím vo vode a sklíčka sa jemne kontrastne farbili s Harrisovým hematoxylínom, dehydratovali sa v stupňovaných etanoloch a vyčistili sa v xyléne. Aplikovali sa krycie sklíčka s DEPEX prichytávacím médiom.
Mrazené rezy sa pripravili ako je opísané vyššie v príklade 7 s výnimkou toho, že blokovanie s 10% kozím sérom sa uskutočňovalo 30 minút a nie cez noc.
V normálnom prsníkovom tkanive sa fen 1 až 3 % duktálnych a lobuiárnych buniek farbilo pozitívne. Stromálne bunky boli negatívne.
až 80 % abnormálnych buniek v rôznych prsníkových karcinómoch, vrátane nízko- a vysokostupňových lézii a lobulárneho a duktálneho typu, bolo pozitívne farbených, pričom okolité stromálne bunky a zápalové bunky ostali nezafarbené.
Tieto výsledky sa získali jednotlivo s každou protilátkou.
Uskutočnilo sa porovnanie s anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami. Na parafínových rezoch dávalo anti-PCNA farbenie podobné výsledky ako anti-MCM5 a anti-Cdc6, zatiaľ čo anti-Ki67 protilátky poskytovali len slabé, fokálne farbenie. Na mrazených rezoch vykazovalo farbenie s anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami oveľa lepšie výsledky ako s anti-PCNA alebo anti-Ki67 protilátkami.
Príklad 20
Farbenie normálnej prostaty a adenokarcinómu prostaty použitím protilátok proti MCM5, MCM7 a pan-MCM
V parafíne obalené histologické vzorky normálneho tkaniva a adenokarcinómu prostaty, pripravené ako bolo opísané pre prsníkové tkanivo v príklade 19, sa farbili anti-MCM5, anti-MCM7 a pan-MCM protilátkami v oddelených experimentoch.
-41 Normálne prípady vykazovali menej ako 10 % pozitívne farbených buniek s každou protilátkou, zatiaľ čo adenokarcinómy vykazovali farbenie 30 až 50 % nádorových buniek, pričom okolité stromálne bunky a zápalové bunky ostali nesfarbené.
Príklad 21
Farbenie normálneho hrubého čreva a karcinómu hrubého čreva použitím protilátok proti MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM a Cdc6
Histologické resekčné vzorky adenokarcinómu hrubého čreva a tubulovilózneho adenómu sa farbili oddelene s protilátkami proti MCM2, MCM5, MCM7, pan-MCM a Cdc6. Týmito protilátkami sa farbili aj normálne vzorky.
V normálnom tkanive každá protilátka farbila len spodnú tretinu krýpt hrubého čreva, pričom povrchovejšie diferencované bunky v kryptách ostali nesfarbené.
Tak v tubulovilóznom adenómovom, ako aj v adenokarcinómovom tkanive bolo viac ako 50 % nádorových buniek pozitívne sfarbených každou protilátkou, pričom nedochádzalo k farbeniu okolitých spojovacích tkanivových elementov.
Tak mrazené, ako aj parafínom obalené vzorky sa skúmali ako bolo uvedené pre prsnikové tkanivo v príklade 19. Výsledky boli podobné ako medzi anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami na jednej strane, a anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami na druhej, tzn. že mrazené vzorky boli s anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami farbené vynikajúco v porovnaní s farbením získaným použitím anti-PCNA a anti-Ki67 protilátok.
Príklad 22
Farbenie normálneho tkaniva a karcinómu pľúc s protilátkami proti MCM2, MCM5, MCM7 a pan-MCM
V parafíne obalené histologické vzorky biopsií alebo resekcií od pacientov s karcinómom šupinových buniek alebo adenokarcinómom pľúc sa farbili s antiMCM2, anti-MCM5, anti-MCM7 a pan-MCM protilátkami. Vzorky sa pripravili ako je
-42opísané pre prsníkové tkanivo v príklade 19. Farbenie sa porovnávalo s farbením normálneho parechýmového pľúcneho tkaniva.
V normálnom tkanive bolo farbenie proliferatívnej frakcie veľmi slabé..
Vo všetkých karcinómoch bolo viac ako 30 % nádorových buniek pozitívnych, pričom nedochádzalo k farbeniu okolitých zápalových alebo spojovacích tkanivových buniek.
Príklad 23
Farbenie močového mechúra, tak normálneho, ako aj karcinómového, s anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7, pan-MCM a anti-Cdc6 protilátkami
Histologické vzorky z biopsií a prechodných bunkových karcinómov, odobrané cystoskopiou, sa farbili s anti-MCM2, anti-MCM5, anti-MCM7, pan-MCM a antiCdc6 protilátkami.
V tkanive normálneho močového mechúra sa detegovaio silné farbenie bazálnej vrstvy prechodného epitelu, pričom viaceré povrchové diferencované bunky ostali nesfarbené. Vo fragmentoch obsahujúcich karcinóm sa dysplastické bunky v celej hrúbke farbili in situ pozitívne.
Prípady invazívneho prechodného bunkového karcinómu vykazovali 50 až 100 % jadrové farbenie nádorových buniek, pričom nedochádzalo k farbeniu stromáinych a zápalových zložiek.
Tak mrazené, ako aj v parafíne obalené vzorky sa skúmali ako je uvedené pre prsníkové tkanivo v príklade 19. Výsledky boli podobné ako medzi anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami na jednej strane, a anti-PCNA a anti-Ki67 protilátkami na druhej, tzn. že mrazené vzorky boli s anti-MCM a anti-Cdc6 protilátkami farbené vynikajúco v porovnaní s farbením získaným použitím anti-PCNA a anti-Ki67 protilátok.
Príklad 24
Farbenie rôznych vzoriek kože s anti-MCM5 protilátkami
-43S anti-MCM5 protilátkami boli farbené histologické vzorky normálnej kože, kože hyperplastických stavov (vrátane psoriázy), solárnych keratóz, Bowenovej choroby a invazívnych karcinómov šupinových buniek.
V normálnej koži sa predominantne farbila bazálna vrstva epitelu a farbili sa aj príležitostné bunky spodnej tretiny epidermy, ale povrchovejšie diferencované bunky ostali nesfarbené.
V prípadoch psoriázy sa predominantnejšie farbili najspodnejšie 3 až 4 vrstvy epidermy, čo odrážalo zvýšenú rýchlosť obmieňania v pokožke.
Solárne keratózy a Bowenove ochorenie (karcinóm in situ) vykazovali farbenie všetkých dysplastických buniek v epiderme až do úplnej hrúbky.
V invazívnych karcinómoch šupinových buniek sa farbilo viac ako 70 % buniek, pričom dobre diferencované nádory obsahovali malé škvrny negatívne diferencovaných buniek pri keratínových guličkách.
Príklad 25
Farbenie larynxu s anti-MCM5 protilátkami
Histologické vzorky normálneho a karcinómového larynxu, pripravené ako bolo opísané pre parafínom obalené vzorky prsníkového tkaniva v príklade 19, sa farbili anti-MCM5 protilátkou.
V normálnych prípadoch sa farbili len bazálne proliferatívne epiteliálne bunky (menej ako 10 %).
V karcinómoch sa farbilo viac ako 50 % buniek jadrovým farbením. Stromálne a zápalové bunky boli všade negatívne.
Príklad 26
Farbenie ezofágu s anti-MCM5 protilátkami
Histologické vzorky normálneho a karcinómového ezofágu, pripravené ako bolo opísané pre parafínom obalené vzorky prsníkového tkaniva v príklade 19, sa farbili anti-MCM5 protilátkou.
-44V normálnych prípadoch sa farbili len bazálne proliferatívne epiteliálne bunky (menej ako 10 %).
V karcinómoch sa farbilo viac ako 50 % buniek jadrovým farbením. Stromálne a zápalové bunky boli všade negatívne.
Príklad 27
Farbenie priedušnice s anti-MCM5 protilátkami
Histologické vzorky normálnej a karcinómovej priedušnice, pripravené ako bolo opísané pre parafínom obalené vzorky prsníkového tkaniva v príklade 19, sa farbili anti-MCM5 protilátkou.
V normálnych prípadoch sa farbili len bazálne proliferatívne epiteliálne bunky (menej ako 10 %).
V karcinómoch sa farbilo viac ako 50 % buniek jadrovým farbením. Stromálne a zápalové bunky boli všade negatívne.
Príklad 28
Farbenie lymfatických uzlín, tak normálnych, ako aj s radou lymfómov, použitím anti-MCM5 protilátkou
Tak mrazené, ako aj parafínom obalené histologické vzorky sa pripravili z reaktívnych lymfatických uzlín a rady Hodgkinových a iných ako Hodgkinových lymfómov, ako je opísané pre prsnikové tkanivo v príklade 19.
V reaktívnych lymfatických uzlinách sa silno farbili bunky v germinálnom centre lymfoidných folikúl a v parafolikulárnych oblastiach boli príležitostne roztrúsené pozitívne bunky.
V lymfómoch sa jadrovo farbilo viac ako 50 % malígnych lymfoidných buniek.
Príklad 29
Analýza urinárnych cytologických sterov s anti-MCM5 protilátkou
-45Vzorky moču sa zozbierali od pacientov s prechodným bunkovým karcinómom a od normálnych pacientov navštevujúcich urologickú kliniku. Dvadsať mililitrov moču sa scentrifugovalo pri 3 000 g 10 minút, supernatant sa odstránil a pelet sa resuspendoval v 50 μΙ supernatantu. Toto sa rozotrelo na APES sklíčka a tie sa fixovali v alkohole.
Sklíčka sa premývali v Tris tlmenom fyziologickom roztoku (TBS), potom sa permeabilizovali v 4mM deoxycholáte sodnom 10 minút. Sklíčka sa premývali s TBS s 0,025% Tritónom a blokovali sa s 10% kozím sérom v TBS 2 hodiny. Predabsorbovaná anti-MCM5 protilátka sa nariedila v TBS s obsahom 0,1% Tritónu a 1% BSA a 200 mikrolitrov sa pridalo na každé sklíčko. Inkubovalo sa cez noc pri 4 °C vo vlhkej komore na orbitálnej miešačke.
Sklíčka sa premývali v TBS s obsahom 0,025% Tritónu, nasledovalo inkubovanie v biotinylovanej kozej anti-králičej sekundárnej protilátke (DÁKO) v pomere 1:500 v TBS s obsahom 1% BSA, 1 hodinu pri laboratórnej teplote. Endogénna peroxidáza sa blokovala s 0,6% hydrogénperoxidom v TBS, 10 minút, nasledovalo premývanie v TBS. Na farbenie sklíčok sa použil systém streptavidínu a chrenovej peroxidázy používajúci substrát diaminobenzidín. Reakcia sa zastavili vymývaním vodou a sklíčka sa jemne farbili Harrisovým hematoxylínom a nasledovalo farbenie s Orange G a EA50 (PAP farbenie).
V šiestich prípadoch prechodného bunkového karcinómu, sa v urinárnych cytologicých steroch pripravených týmto spôsobom a farbených s anti-MCM5 protilátkou silne farbili všetky malígne prechodné bunky, pričom v pozadí boli nefarbené zápalové a šupinové bunky. Podobné stery vyrobené z moču normálnych ľudí navštevujúcich urologické kliniky sa nefarbili ani šupinové, ani normálne prechodné bunky.
Príklad 30
DELFIA vzoriek normálnych krčkov maternice a vzoriek krčku maternice od pacientov so šupinovými intraepiteliálnymi léziami
-46Disociáciu zosilňujúci lantanoidový fluorescenčný imunotest (DELFIA) sa určil na detekciu ľudského MCM5 použitím dvoch rozličných polyklonálnych anti-MCM5 antisér ako je opísané v príklade 15 vyššie.
Anylazovali sa dve vzorky normálneho krčku maternice a dve vzorky HSIL krčku maternice. Tkanivové vzorky sa solubilizovali hypotonickým napučiavaním a homogenizáciou a nasledovala slaná extrakcia DNA viazaných častíc.
Dve normálne vzorky vykázali odpovede podobné nulovým štandardom.
Dve HSIL vzorky boli stanovené ako pozitívne, z čoho vyplýva, že abnormalita vo vzorke krčku maternice sa môže detegovať použitím imunotestu.
Príklad 31
Farbenie rôznych nádorových tkanív s anti-MCM5 protilátky
Histologické vzorky rôznych karcinómov a leukemickej kostnej drene sa farbili s anti-MCM5 protilátkami a výsledky boli nasledovné:
V karcinómoch žalúdka sa farbilo viac ako 50 % nádorových buniek.
V karcinómoch obličiek sa farbilo 30 až 50 % nádorových buniek.
V karcinómoch vaječníkov sa farbilo 30 až 50 % nádorových buniek.
V karcinómoch semenníkov sa farbilo 30 až 50 % nádorových buniek.
Pri kostnej dreni s akútnou leukémiou sa farbilo viac ako 90 % nádorových buniek.
Príklad 32
Farbenie sterov hrubého čreva
Fekálny materiál zozbieraný od zdravých pacientov a povrchové lúpavé kolonocyty sa extrahovali z fekálnych vzoriek prostredníctvom magnetických guličiek potiahnutých epiteliálne špecifickými protilátkami, dodávanými firmou Dynal AS (Oslo, Nórsko) použitím spôsobu opísaného vo W097/09600.
Extrahovaná zmes magnetických guličiek a epiteliálnych buniek v TBS (Tristlmený fyziologický roztok) s obsahom 0,025% Tritónu. Po fixácii v 4% tlmenom
-47paraformaldehydom sa bunky premyli v TBS a z výsledného bunkového peletu sa urobili stery. Tieto sa potom ošetrili ako stery vzoriek moču.
V PAP farbených steroch sa nachádzala zmes magnetických guličiek, nejaká celulóza a bunkové úlomky; a prítomné boli mnohé stĺpcové epiteliálne bunky z hrubého čreva a niekoľko šupinových buniek z análneho kanála.
Pri farbení s anti-MCM5 protilátkami sa získali podobné výsledky pre normálne a abnormálne bunky, ako pre močový mechúr alebo kŕčok maternice.
Príklad 33
Farbenie rezov čriev od pacientov s vredovou kolitídov
V parafíne obalené rezy čriev od prípadov aktívnej vredovej kolitídy sa farbili protilátkami proti MCM5.
Vo všetkých testovaných rezoch približne 50 % povrchových epiteliálnych buniek vykazovalo expresiu MCM5 v zapálených oblastiach. Pri aktívnych vredových kolitídach je prítomný veľký počet lymfocytov a aj tieto bunky vykazujú častú jadrovú expresiu MCM5.
Analyzované boli aj rezy pokojovej vredovej kolitídy (tzn. bez aktívneho zápalu). Vo všetkých týchto rezoch sa epiteliálne bunky nefarbili s MCM5. Z malého počtu lymfocytov prítomných pri pokojovej vredovej kolitíde sa len ojedinelá bunka jadrovo farbila s MCM5.
Zistilo sa, že v parafínom obalených rezoch je farbenie pri aktívnej a pokojovej vredovej kolitíde podobné pre MCM5 a pre PC NA.
Príklad 34
Farbenie rezov čriev od pacientov s Crohnovou chorobou
Farbenie v parafíne obalených rezov čriev od pacientov s aktívnou
Crohnovou chorobou dokázalo jadrovú expresiu MCM5 v povrchových epiteliálnych bunkách pri oblastiach vredov a zápalu. Lymfocyty v zapálených tkanivách tiež vykázali častú jadrovú expresiu MCM5.
-48Testované bolo aj tkanivo čreva od pacientov s pokojovou Crohnovou chorobou, a tak povrchové epiteliálne bunky, ako aj malý počet prítomných lymfocytov, boli negatívnye na MCM5.
Podobné výsledky sa získali pre anti-MCM5 protilátky, ako aj pre anti-PCNA protilátky v parafínom obalených prípadoch aktívnej a pokojovej Crohnovej choroby.
Porovnanie medzi anti-MCM5 a anti-PCNA farbením urobeným na mrazených rezoch a na rezoch obalených v parafíne dokázalo, že v mrazených rezoch je farbenie s anti-MCM5 protilátkami vynikajúce v porovnaní s farbením s anti-PCNA protilátkami, pričom je farbených viac jadier.
Príklad 35
Farbenie normálneho a rakovinového endometria s anti-MCM5 protilátkami
Mrazené a v parafíne obalené rezy normálneho a rakovinového endometria sa farbili s anti-MCM5 protilátkami.
Dobré farbenie sa ukázalo v rakovinovom endometriu v porovnaní s normálnym tkanivom, a vynikajúce farbenie v mrazených rezoch v porovnaní s rezmi obalenými v parafíne.
Príklad 36
Farbenie bunkovej monovrstvy steru krčku maternice (ThinPrep)
Po urobení steru na APES sklíčku sa štetec/špachtľa, použitá na odobratie steru krčka maternice, umiestnila do 75% metanolu a zvyšné bunky sa odstránili vortexovaním. Suspenzia buniek sa naniesla do vrstvy na 20% sacharózu, scentrifubovala sa pri 3 000 rpm, 5 minút a bunkový pelet sa resuspendoval v 200 mikrolitroch vody. 50 mikrolitrov sa umiestnilo na každé sklíčko, bunky sa nechali usadiť a odstránila sa voda. Sklíčka sa potom ošetrili ako v príklade 29 (urinárne cytologické stery) a aplikovalo sa PAP farbenie.
V rôznych experimentoch boli výsledky získané pre jednovrstvové stery rovnaké ako výsledky získané s bežnými stermi. Použitie jednovrstvových
-49prípravkov môže byť výhodné v tom, že sú odstránené slizničné a väčšina zápalových buniek.
Diskusia
Tu opísané výsledky ukazujú, že tak Cdc6, ako aj MCM5 sú tlmené v normálnych diferencovaných tkanivách in vivo a chýbajú v chromatíne v rade pokojových cicavčích buniek v kultúre. To naznačuje, že tieto proteíny môžu mať potenciálnu hodnotu ako bunkové proliferačné markery. Hiraiwa a iný demonštrovali, že MCM7 môže byť imunolokalizovaný v rôznych typoch nádorov, ako v benígnych nádoroch kože a malígnych nádoroch žalúdka, pankreasu a hrubého čreva, s podobnou distribúciou ako PCNA. Z toho vyvodili, že MCM7 imunolokalizácia môže byť použitá ako index bunkovej proliferácie v tkanivových rezoch. Avšak, ako už bolo poznamenané vyššie, experti v oblasti patológie sú skeptickí v tom, že meranie bunkových proliferačných rýchlostí v nádoroch markermi ako PCNA a Ki68 sa nebude dať klinicky použiť, keďže je len málo priamych dôkazov o tom, že takéto markery predstavujú skutočné zlepšenie bežných histologických hodnotení, ako odstupňovania a určovania štádií, keď sú optimálne použité.
Tu publikované pozorovania ukazujú, že špecifické väzobné molekuly nasmerované proti Cdc6, MCM5 a MCM7 vykazujú oveľa vyšší stupeň špecificity pre potenciálne pred-malígne bunky v čerstvých a mrazených krčkov maternice SILs, ako bežné proliferačné markery, ako napríklad PCNA a Ki67. Anti-Cdc6 a antiMCM5 sú schopné jednoznačne odlíšiť abnormálne bunky v LSIL a HSIL od normálnych buniek, vrátane endocervikáIných, ektocervikálnych, metaplastických a stromálnych buniek.
Vzhľadom na uvedené boli anti-Cdc6 a anti-MCM protilátky aplikované na stery krčkov maternice od pacientov so SILs a od zdravých pacientov. Výsledky boli prekvapujúce s ohľadom na zarážajúci stupeň špecificity a senzitivity pozorovanej pre tieto proteíny. Pozorovalo sa silné jadrové a cytoplazmatické farbenie tak v neoplastických bunkách, ako aj v HPV-infikovaných koilocytoch. Pozitívne imunofarbenie sa identifikovalo aj v metaplastických šupinových bunkách s hraničnými abnormalitami (atypické šupinové bunky neistého významu). Avšak
-50zvyšná zmiešaná populácia normálnych buniek v stere, vrátane ektocervikálnych buniek, endocervikálnych buniek, šupinových metaplastických buniek a zápalových buniek (tak lymfocytov, ako aj neutrofilov) bola negatívna pri Cdc6 a MCM imunofarbení.
Citlivosť anti-MCM5, anti-Cdc6 a anti-MCM7 je oveľa vyššia ako anti-PCNA, keď sa aplikujú na stery krčku maternice a na mrazené rezy, ale tieto protilátky majú podobné charakteristiky farbenia, po aplikácii na tkanivo fixované vo formalíne, obalené parafínom a vystavené vyhľadávaniu antigénu sterilizáciou. Stery krčku maternice a iné cytologické vzorky, ako aj mrazené rezy, sú menej robustné ako formalínom fixované, v parafíne obalené tkanivové rezy, a tak sa nemôžu variť tlakom.
Prekvapujúca špecificita a citlivosť Cdc6 a MCM protilátok, keď sa aplikujú na stery krčku maternice, poskytuje predpoklady na zavedenie biochemicko/imunocytologického postupu hromadného automatizovaného skríningu krčku maternice. Navyše, tieto protilátky môžu pomôcť zlepšiť detekciu a klasifikáciu LSILs, pre ktoré v súčasnosti existujú intrapozorovacie a interpozorovacie variácie pri určení stupňa aj medzi odborníkmi v oblasti cytológie krčku maternice. Použitie týchto protilátok bude tiež pomáhať identifikovať HSILs s vysokou presnosťou a objektivitou, a tak pomôže znížiť vysoký počet falošne negatívnych výsledkov, čo je hlavný problém spojený so súčasnými globálnymi programami na skríning krčku maternice.
Ako bolo uvedené, ďalšie experimentálne príklady zhodnotenia prsníkového tkaniva, vzoriek žalúdka, obličiek, vaječníkov, semenníkov, hrubého čreva, moču a krvi (tak od leukemických/lymfómových pacientov, ako aj pacientov s metastatickým sarkómom a adenokarcinómom), tiež tkanív zápalových ochorení vnútorností, vrátane vredovej koiitídy a Crohnovej choroby a príklady zhodnotenia fekálnych sterov naznačujú všeobecnosť uskutočnení predloženého vynálezu, ktorý sa nevzťahuje len na skríning krčku maternice, hoci zhodnotenie vzoriek krčku maternice, najmä sterov krčku maternice, je výhodným medzi rôznymi uskutočneniami. Okrem cytológie je demonštrovaná aj aplikácia biochemických techník.
-51 Výsledky slepého pokusu porovnávajúceho uskutočnenie podľa predloženého vynálezu s hodnotením sterov krčku maternice použitím štandardného PAP stierania, ktorý je opísaný v príklade 14, vyššie, potvrdzujú vynikajúcu využiteľnosť vynálezu.
Všetky tu uvedené dokumenty sú zahrnuté prostredníctvom ich citácie.
Tabuľka 1
Porovnávanie anti-Mcm5 protilátkového testu a bežného Pap testu v slepom pokuse s pacientmi zavolanými späť na kolposkopické kliniky
Výsledky štandardného Pap testu | ||||
normál | nízky stupeň | vysoký stupeň | ||
Anti-Mcm5 protilátkový test | Prítomnosť pozitívnych buniek | 3a | 9 | 17 |
Absencia pozitívnych buniek | 13 | 0 | 0 |
a) pozri text
Claims (48)
- PATENTOVÉ NÁROKY py 559-&0oo1. Spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke jedinca, ktorý zahŕňa detegovanie cieľového polypeptidu vo vzorke, vyznačujúci satým, že cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie; s podmienkou, že ak je cieľovým polypeptidom MCM7, vzorka nie je podrobená vyhľadávaniu antigénu alebo sterilizácii/autoklávovaniu.
- 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7 proteínkinázy, Dbf4, Cdc14 proteínfosfatázy, Cdc45 a MCM10.
- 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, M C M 6 a MCM7.
- 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je Cdc6.
- 5. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM2.
- 6. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM3.
- 7. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM4.
- 8. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM5.-539. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM6.• 10. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cieľovým ► polypeptidom je MCM7.w
- 11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa uvedenie vzorky do kontaktu so špecifický väzobným členom alebo špecifickými väzobnými členmi nasmerovanými proti cieľovému polypeptidu a stanovenie viazania sa špecifického väzobného člena alebo členov na vzorku.
- 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že špecifický väzobný člen alebo špecifické väzobné členy sú nasmerované proti viacerým z uvedených cieľových polypeptidov.
- 13. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa t ý m , že sa testuje vzorka tkaniva.
- 14. Spôsob podľa nároku 13,vyznačujúci sa tým, že vzorka tkaniva je čerstvá alebo mrazená.•
- 15. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že vzorka tkaniva nie je fixovaná formalínom alebo obalená parafínom.«
- 16. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že vzorka tkaniva sa nepodrobí antigénovému vyhľadávaniu alebo sterilizácii/autoklávovaniu.
- 17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 16, vyznačujúci sa t ý m , že tkanivo je vybrané z pľúc, prsníka, hrubého čreva, prostaty, žalúdka, kože, ezofágu a močového mechúra.-5418. Spôsob podľa nároku 17, vy z n a č u j ú c i sa t ý m , že tkanivo je prsníkové tkanivo.
- 19. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa t ý m , že sa testuje vzorka buniek.
- 20. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa t ý m , že vzorkou je tekutina odobratá od jedinca.
- 21. Spôsob podľa nároku 20, vy z n a čuj ú c i sa t ý m , že vzorka buniek je poskytnutá z uvedenej tekutiny.
- 22. Spôsob podľa nároku 20 alebo 21, vy z n a č u j ú c i sa tým, že tekutinou je krv.
- 23. Spôsob podľa nároku 20 alebo 21, vyznačujúci sa tým, že tekutinou je moč.
- 24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 23, vyznačujúci sa t ý m , že sa skrínuje populácia jedincov.
- 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že osoby sú kategorizované ako osoby s tkanivami, ktoré sú (i) normálne alebo (ii) abnormálne, vrátane potenciálne alebo skutočne pred-nádorových alebo nádorových, dysplastických alebo neoplastických buniek.
- 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že tkanivo alebo bunky osôb kategorizovaných ako osoby, ktoré majú abnormálne tkanivo, sa podrobia ďalšiemu skúmaniu alebo analýze.
- 27. Spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu vo vzorke krčku maternice-55od jedinca, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa uvedenie vzorky do kontaktu so špecifickým väzobným členom alebo špecifickými väzobnými členmi nasmerovanými proti cieľovému polypeptidu a stanovenie viazania sa špecifického väzobného člena alebo väzobných členov na vzorku, pričom cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie.
- 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že vzorka je ster krčku maternice.
- 29. Spôsob podľa nároku 27 alebo 28, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7 proteínkinázy, Dbf4, Cdc14 proteinfosfatázy, Cdc45aMCM10.
- 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7.
- 31. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je Cdc6.
- 32. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM2.
- 33. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM3.
- 34. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM4.
- 35. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM5.-5636. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM6.
- 37. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že cieľovým polypeptidom je MCM7.
- 38. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 37, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že špecifický väzobný člen alebo špecifické väzobné členy sú nasmerované proti viacerým z uvedených cieľových polypeptidov.
- 39. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 38, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa skrínuje populácia jedincov.
- 40. Spôsob podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že osoby sú kategorizované ako osoby s tkanivami, ktoré sú (i) normálne alebo (ii) abnormálne, vrátane potenciálne alebo skutočne pred-nádorových alebo nádorových, dysplastických alebo neoplastických buniek.
- 41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa t ý m , že tkanivo alebo bunky osôb kategorizovaných ako osoby, ktoré majú abnormálne tkanivo, sa podrobia ďalšiemu skúmaniu alebo analýze.
- 42. Spôsob stanovenia prítomnosti alebo neprítomnosti abnormálne proliferujúcich buniek alebo abnormalít bunkového rastu v jedincovi, ktorý zahŕňa detekovanie cieľového polypeptidu alebo mRNA kódujúcej cieľový polypeptid v tkanive, tekutine alebo bunkách jedinca, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie; s podmienkou, že ak sa spôsob uskutočňuje na vzorke odobratej jedincovi a cieľovým polypeptidom je MCM7, vzorka nie je podrobená vyhľadávaniu antigénu alebo steriiizácii/autoklávovaniu.-5743. Spôsob podľa nároku 42, vyznačujúci sa tým, že tkanivo, tekutina alebo bunky vo vzorke sú odobraté z jedinca.
- 44. Spôsob podľa nároku 43, vyznačujúci sa tým, že vzorkou je k* tkanivo.b
- 45. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že vzorka je čerstvá alebo mrazená.
- 46. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že vzorka nie je fixovaná formalínom alebo obalená parafínom.
- 47. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že vzorka tkaniva sa nepodrobí antigénovému vyhľadávaniu alebo sterilizácii/autoklávovaniu.
- 48. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 42 až 47, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa skrínuje populácia jedincov.
- 49. Spôsob podľa nároku 48, vyznačujúci sa tým, že osoby sú kategorizované ako osoby s tkanivami, ktoré sú (i) normálne alebo (ii) abnormálne, vrátane potenciálne alebo skutočne pred-nádorových alebo nádorových, dysplastických alebo neoplastických buniek.* %»'
- 50. Spôsob podľa nároku 49, v y z n a č u j ú c i sa tý m , že tkanivo alebo bunky osôb kategorizovaných ako osoby, ktoré majú abnormálne tkanivo, sa podrobia ďalšiemu skúmaniu alebo analýze.
- 51. Kit, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nasledujúce zložky (i) a (ii):(i) špecifický väzobný člen alebo špecifické väzobné členy nasmerované proti jednému alebo viacerým cieľovým polypeptidov, pričom cieľový polypeptid je členom prediniciačného komplexu DNA replikácie, a-58(ii) inštrukcie na použitie špecifického väzobného člena alebo členov v spôsobe podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 48.
- 52. Kit podľa nároku 51, vy z n a č u j ú c i sa t ý m , že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, Cdc7 proteínkinázy, Dbf4, Cdc14 proteínfosfatázy, Cdc45 a MCM10.
- 53. Kit podľa nároku 52, vyznačujúci sa tým, že cieľový polypeptid je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Cdc6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6 a MCM7.
54. Kit podľa nároku polypeptidom je Cdc6. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 55. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM2. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 56. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM3. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 57. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM4. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 58. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM5. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým 59. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM6. 53, vyznačujúci s a tým, w ze cieľovým 60. Kit podľa nároku polypeptidom je MCM7. 53, vyznačujúci s a tým, že cieľovým -5961. Kit podľa ktoréhokoľvek z nárokov 51 až 60, v y z n a č u j ú c i sa tým, že špecifický väzobný člen alebo špecifické väzobné členy sú namierené proti viacerým z cieľových polypeptidov.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9722217.8A GB9722217D0 (en) | 1997-10-21 | 1997-10-21 | Determination of cellular growth abnormality |
GBGB9724134.3A GB9724134D0 (en) | 1997-11-14 | 1997-11-14 | Determination of cellular growth abnormality |
GBGB9804156.9A GB9804156D0 (en) | 1998-02-26 | 1998-02-26 | Determination of cellular growth abnormality |
GBGB9810560.4A GB9810560D0 (en) | 1998-05-15 | 1998-05-15 | Determination of cellular growth abnormality |
GBGB9817075.6A GB9817075D0 (en) | 1998-08-05 | 1998-08-05 | Determination of cellular growth abnormality |
PCT/GB1998/003153 WO1999021014A1 (en) | 1997-10-21 | 1998-10-21 | Determination of cellular growth abnormality |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK5592000A3 true SK5592000A3 (en) | 2000-10-09 |
Family
ID=27517431
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK559-2000A SK5592000A3 (en) | 1997-10-21 | 1998-10-21 | Determination of cellular growth abnormality |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1025444B1 (sk) |
JP (2) | JP2000511291A (sk) |
CN (1) | CN1282422A (sk) |
AT (1) | ATE290213T1 (sk) |
AU (1) | AU751754B2 (sk) |
BR (1) | BR9813127A (sk) |
CA (1) | CA2305872C (sk) |
CO (1) | CO5080817A1 (sk) |
DE (1) | DE69829198T2 (sk) |
DK (1) | DK1025444T3 (sk) |
ES (1) | ES2239407T3 (sk) |
GB (1) | GB2332515B (sk) |
HU (1) | HUP0004134A2 (sk) |
IL (1) | IL135602A0 (sk) |
IS (1) | IS5456A (sk) |
MA (1) | MA26557A1 (sk) |
NO (1) | NO20002044L (sk) |
NZ (1) | NZ503996A (sk) |
PE (1) | PE20000121A1 (sk) |
PL (1) | PL340057A1 (sk) |
PT (1) | PT1025444E (sk) |
SK (1) | SK5592000A3 (sk) |
WO (1) | WO1999021014A1 (sk) |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6361954B1 (en) | 1996-05-02 | 2002-03-26 | Cold Spring Harbor Laboratory | Methods of immunoassay for human CDC6 |
GB0018140D0 (en) * | 2000-07-24 | 2000-09-13 | Medical Res Council | Screening for abnormalities |
DE10063112A1 (de) | 2000-12-18 | 2002-06-20 | Bayer Ag | Verfahren zur Erhöhung der klinischen Spezifität bei der Detektion von Tumoren und ihren Vorstufen durch simultane Messung von mindestens zwei verschiedenen molekularen Markern |
DE10063179A1 (de) * | 2000-12-18 | 2002-06-20 | Bayer Ag | Verfahren zur spezifischen Detektion von Tumorzellen und ihren Vorstufen in Gebärmutterhalsabstrichen durch simultane Messung von mindestens zwei verschiedenen molekularen Markern |
KR20030094281A (ko) | 2001-03-12 | 2003-12-11 | 모노젠, 인크. | 세포에 기초한 질병상태의 검출 및 질병상태의 구별 |
EP1369694A1 (en) | 2002-04-09 | 2003-12-10 | MTM Laboratories AG | Method for discrimination of metaplasias from neoplastic or preneoplastic lesions |
JP2006514823A (ja) * | 2002-08-20 | 2006-05-18 | ミレニアム ファーマスーティカルズ インク | 子宮頸癌の同定、評価、予防および治療を行うための組成物、キットおよび方法 |
EP1422526A1 (en) | 2002-10-28 | 2004-05-26 | MTM Laboratories AG | Method for improved diagnosis of dysplasias |
JP2006521794A (ja) * | 2003-02-14 | 2006-09-28 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | Ksp発現と相関関係にある示差発現核酸 |
US7361460B2 (en) | 2003-04-11 | 2008-04-22 | Digene Corporation | Approach to molecular diagnosis of human papillomavirus-related diseases |
US20070122909A1 (en) * | 2003-10-20 | 2007-05-31 | Syssmex Corporation | Method of treating cells |
KR20110027823A (ko) | 2004-03-24 | 2011-03-16 | 트리패스 이미징, 인코포레이티드 | 자궁경부 질환의 검사 방법 및 조성물 |
US7595380B2 (en) | 2005-04-27 | 2009-09-29 | Tripath Imaging, Inc. | Monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of cervical disease |
GB0518877D0 (en) * | 2005-09-15 | 2005-10-26 | Medical Res Council | Markers and methods |
US7632498B2 (en) | 2005-12-19 | 2009-12-15 | Tripath Imaging, Inc. | MCM6 and MCM7 monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of cervical disease |
EP1969147B1 (en) | 2006-01-05 | 2014-07-30 | The Ohio State University Research Foundation | microRNA-based methods for the diagnosis of stomach cancer |
EP2369013A1 (en) | 2006-03-20 | 2011-09-28 | The Ohio State University Research Foundation | Micro-RNA fingerprints during human megakaryocytopoiesis |
DE102006020852A1 (de) | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Robert Bosch Gmbh | Gasdruckbehälter für gasbetriebene Kraftfahrzeuge |
US8465918B2 (en) | 2007-08-03 | 2013-06-18 | The Ohio State University Research Foundation | Ultraconserved regions encoding ncRNAs |
GB0811567D0 (en) * | 2008-06-24 | 2008-07-30 | Cytosystems Ltd | Assay |
JP5960060B2 (ja) | 2009-11-23 | 2016-08-02 | ジ・オハイオ・ステート・ユニバーシティ | 腫瘍細胞の増殖、遊走および浸潤に影響を与えるために有用な物質および方法 |
GB0921873D0 (en) | 2009-12-15 | 2010-01-27 | Cytosystems Ltd | Assay |
CA2816603A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | The Ohio State University Research Foundation | Materials and methods related to microrna-21, mismatch repair, and colorectal cancer |
AU2011329066B2 (en) | 2010-11-15 | 2017-03-09 | The Ohio State University Research Foundation | Controlled release mucoadhesive systems |
WO2012090479A1 (en) * | 2010-12-28 | 2012-07-05 | Oncotherapy Science, Inc. | Mcm7 as a target gene for cancer therapy and diagnosis |
EP2766500A4 (en) | 2011-10-14 | 2015-10-14 | Univ Ohio State | METHODS AND MATERIALS RELATED TO OVARIAN CANCER |
US9481885B2 (en) | 2011-12-13 | 2016-11-01 | Ohio State Innovation Foundation | Methods and compositions related to miR-21 and miR-29a, exosome inhibition, and cancer metastasis |
WO2013102680A1 (en) * | 2012-01-05 | 2013-07-11 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Signature for the diagnosis of lung cancer aggressiveness and genetic instability |
CN105936932A (zh) | 2012-01-20 | 2016-09-14 | 俄亥俄州立大学 | 浸润性和预后的乳腺癌生物标志物标签 |
US11306364B2 (en) | 2012-02-18 | 2022-04-19 | Duke University | TERT promoter mutations in gliomas and a subset of tumors |
KR101832948B1 (ko) * | 2013-02-18 | 2018-02-28 | 듀크 유니버시티 | 신경교종 및 종양의 서브세트 내 tert 프로모터 돌연변이 |
GB201412731D0 (en) * | 2014-07-17 | 2014-09-03 | Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd | Peptides |
AU2016261279B2 (en) * | 2015-05-10 | 2020-12-10 | Ventana Medical Systems, Inc. | Compositions and methods for simultaneous inactivation of alkaline phosphatase and peroxidase enzymes during automated multiplex tissue staining assays |
GB201509907D0 (en) * | 2015-06-08 | 2015-07-22 | Urosens Ltd | Antibodies |
CN107771285A (zh) | 2015-06-08 | 2018-03-06 | 阿奎尔诊断有限公司 | 方法 |
EP3304084B1 (en) | 2015-06-08 | 2022-03-23 | Arquer Diagnostics Limited | Methods and kits |
GB201511196D0 (en) | 2015-06-25 | 2015-08-12 | Cytosystems Ltd | Monoclonal antibodies |
JP6245299B2 (ja) * | 2016-04-27 | 2017-12-13 | バクスアルタ ゲーエムベーハー | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 |
CN106636343B (zh) * | 2016-11-04 | 2021-03-19 | 深圳大学 | 一种检测口腔癌的标志物及其试剂盒 |
GB201820867D0 (en) * | 2018-12-20 | 2019-02-06 | Arquer Diagnostics Ltd | Detection method |
CN112946253B (zh) * | 2019-12-11 | 2022-11-08 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于免疫诊断试剂中固相载体的封闭阶段处理剂及应用和产品 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK144485A (da) * | 1984-03-30 | 1985-10-01 | Syntex Inc | Monoklonale antistoffer |
US5851821A (en) * | 1996-05-02 | 1998-12-22 | Cold Spring Harbor Laboratory | DNA Replication-regulating genes |
EP0812594A1 (en) * | 1996-06-13 | 1997-12-17 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Compounds that interfere with DNA replication in rapidly proliferating cells for use in cancer therapy and methods for screening for such compounds |
US5858683A (en) * | 1996-08-30 | 1999-01-12 | Matritech, Inc. | Methods and compositions for the detection of cervical cancer |
-
1998
- 1998-10-21 CA CA002305872A patent/CA2305872C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-21 DK DK98949123T patent/DK1025444T3/da active
- 1998-10-21 CO CO98061237A patent/CO5080817A1/es unknown
- 1998-10-21 SK SK559-2000A patent/SK5592000A3/sk unknown
- 1998-10-21 NZ NZ503996A patent/NZ503996A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-10-21 PE PE1998000991A patent/PE20000121A1/es not_active Application Discontinuation
- 1998-10-21 DE DE69829198T patent/DE69829198T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-21 BR BR9813127-3A patent/BR9813127A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-10-21 WO PCT/GB1998/003153 patent/WO1999021014A1/en active IP Right Grant
- 1998-10-21 PL PL98340057A patent/PL340057A1/xx unknown
- 1998-10-21 HU HU0004134A patent/HUP0004134A2/hu unknown
- 1998-10-21 EP EP98949123A patent/EP1025444B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-21 MA MA25308A patent/MA26557A1/fr unknown
- 1998-10-21 AT AT98949123T patent/ATE290213T1/de active
- 1998-10-21 PT PT98949123T patent/PT1025444E/pt unknown
- 1998-10-21 GB GB9823069A patent/GB2332515B/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-21 CN CN98812478A patent/CN1282422A/zh active Pending
- 1998-10-21 JP JP11523482A patent/JP2000511291A/ja active Pending
- 1998-10-21 ES ES98949123T patent/ES2239407T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-21 AU AU95502/98A patent/AU751754B2/en not_active Expired
- 1998-10-21 IL IL13560298A patent/IL135602A0/xx unknown
-
2000
- 2000-04-17 IS IS5456A patent/IS5456A/is unknown
- 2000-04-18 NO NO20002044A patent/NO20002044L/no not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-01-15 JP JP2003007249A patent/JP3774196B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69829198D1 (de) | 2005-04-07 |
DK1025444T3 (da) | 2005-06-27 |
JP3774196B2 (ja) | 2006-05-10 |
NZ503996A (en) | 2002-04-26 |
IS5456A (is) | 2000-04-17 |
CA2305872C (en) | 2008-02-19 |
IL135602A0 (en) | 2001-05-20 |
CN1282422A (zh) | 2001-01-31 |
NO20002044L (no) | 2000-06-07 |
BR9813127A (pt) | 2000-08-15 |
HUP0004134A2 (en) | 2001-03-28 |
PT1025444E (pt) | 2005-07-29 |
GB9823069D0 (en) | 1998-12-16 |
EP1025444A1 (en) | 2000-08-09 |
NO20002044D0 (no) | 2000-04-18 |
WO1999021014A1 (en) | 1999-04-29 |
CO5080817A1 (es) | 2001-09-25 |
ATE290213T1 (de) | 2005-03-15 |
GB2332515B (en) | 1999-12-15 |
JP2000511291A (ja) | 2000-08-29 |
AU9550298A (en) | 1999-05-10 |
CA2305872A1 (en) | 1999-04-29 |
EP1025444B1 (en) | 2005-03-02 |
JP2003240786A (ja) | 2003-08-27 |
PL340057A1 (en) | 2001-01-15 |
PE20000121A1 (es) | 2000-02-17 |
GB2332515A (en) | 1999-06-23 |
DE69829198T2 (de) | 2006-01-12 |
AU751754B2 (en) | 2002-08-29 |
ES2239407T3 (es) | 2005-09-16 |
MA26557A1 (fr) | 2004-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7056690B2 (en) | Detection of dysplastic or neoplastic cells using anti-MCM2 antibodies | |
CA2305872C (en) | Determination of cellular growth abnormality | |
US11155878B2 (en) | Method for discrimination of metaplasias from neoplastic or preneoplastic lesions | |
ES2381644T3 (es) | Métodos y composiciones para la detección de enfermedades de cuello uterino | |
EP1388734B1 (en) | Method for solution based diagnosis | |
JP5711196B2 (ja) | 卵巣癌を判定するためのhe4及び他の生化学マーカーの使用 | |
US20030219726A1 (en) | Detection of abnormalities leading to cervical malignancy | |
CA2823460A1 (en) | Diagnostic method | |
JP4190031B2 (ja) | 子宮頸細胞の検定評価 | |
JP2003526777A (ja) | AGUS・PapスミアにおけるMN/CA9タンパク質の発現を用いた診断法 | |
JP2007502995A (ja) | 卵管特異的糖タンパク質レベルを検出することによる婦人科新生物の診断方法 | |
CZ20001502A3 (cs) | Způsob stanovení přítomnosti abnormálně proliferujících buněk | |
MXPA00003892A (en) | Determination of cellular growth abnormality | |
JP2014534432A (ja) | 乳癌用の予測バイオマーカ | |
Foster et al. | Identification of Possible Molecular Markers to Predict the Malignant Tendency of the Prostate Intraepithelial Neoplasia (PIN) Lesions |