KR101832948B1 - 신경교종 및 종양의 서브세트 내 tert 프로모터 돌연변이 - Google Patents

신경교종 및 종양의 서브세트 내 tert 프로모터 돌연변이 Download PDF

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Abstract

본 발명자는 60개 다른 유형의 1,230개의 종양을 조사하고 낮은(<15%) 및 높은(≥15%) 빈도의 TERT 프로모터 돌연변이를 갖는 유형으로 나뉜다는 것을 발견하였다. 9개의 TERT-높은 종양 유형은 거의 항상 상대적으로 낮은 속도로 자기 재생되는, 흑색종, 지방육종, 간세포암, 요로상피암, 혀의 편평세포암, 수모세포종, 및 신경교종(83%의 1차 교모세포종, 가장 일반적인 종양 유형을 포함하는)의 아류형을 포함하는 조직에서 시작되었다. TERT 및 ATRX 돌연변이는 상호 배타적이므로, 이들 2개의 유전적 메커니즘은 동등한 선택적인 성장 이점을 부여함을 나타낸다. 텔로미어와 종양 형성간의 관계를 이해하는 의미에 더하여, TERT 돌연변이는 요로 및 간 종양의 조기 검출을 위한 바이오마커(biomarker)를 제공하며 뇌 종양의 분류 및 예측을 돕는다.

Description

신경교종 및 종양의 서브세트 내 TERT 프로모터 돌연변이{TERT Promoter Mutations in Gliomas and a Subset of Tumors}
본 발명은 돌연변이 검출 영역에 관한 것이다. 특히, 이는 인간 게놈의 비-코딩 영역 내 돌연변이에 관한 것이다.
텔로미어(telomere)는 염색체 보전에 필요한 진핵세포 염색체의 말단에 위치하는 핵단백질 복합체이다. 텔로미어의 수백의 뉴클레오티드는 각 염색체 말단에 캡(cap)을 반복하고, 텔로머라제 활성의 부재시, 각 세포 분열로 텔로미어는 짧아진다(1). 결국, 캡이 벗겨진(uncapped) 텔로미어는 세포 사멸 또는 노화를 일으킨다. 암 세포는 끝없이 분열하는 것으로 보이며 따라서, 이 운명을 피하기 위하여 어떠한 텔로미어 유지 메커니즘이 필요하다. 텔로머라제 활성은 일반적으로 정상 세포보다 암세포에서 더 높으므로, 텔로머라제가 어떻게든 암 세포 내에서 활성화된다고 처음부터 믿어졌다(2-6). 그러나, 그 후 텔로머라제가 오직 최종 분화 세포에서 비활성이며 자기 재생되는 조직 내 정상 줄기세포는 텔로머라제 활성을 유지한다는 것을 깨달았다(1, 7-9). 정상 줄기세포는 포유류의 긴 수명(인간은 100년 이상 가능) 동안 복제해야 하기 때문에, 이러한 세포가 또한 텔로머라제 활성을 유지해야한다는 것은 명백하다. 정상 줄기세포가 암의 전구물(progenitors)이라고 생각될 수 있기 때문에, 암 세포 내에서 특별히 텔로머라제를 활성화시킬 필요는 없을 것이다; 효소는 일반적으로 세포 증식에 필요한 수백의 다른 효소 및 단백질과 같이, 전구체(precursors) 형태로 이미 활성을 가지고 있었다.
이러한 견해는 텔로미어 길이를 유지하는 또 다른 메커니즘, 즉, 텔로미어의 대안적 연장(Alternative Lengthening of Telomere, ALT)의 발견에 의해 이의가 제기되었다(10-12). ALT는 텔로머라제 활성의 부재시 발생하며 상동 재조합에 의존하는 것으로 보인다. 이는 육종(sarcomas), 췌장 신경내분비종양(pancreatic neuroendocrine tumor), 및 뇌 종양(brain tumor)와 같은 특정 종양 유형이 특히 높은 비율로 발생하나, 대장, 유방, 폐, 전립선, 또는 췌장의 이들 종양 유형과 같은 가장 일반적인 종양 유형에서는 거의 발생하지 않는다(13). 텔로머라제 활성이 이미 이들의 전구체에서 구조적으로 활성화된 경우, 왜 암 세포는 ALT를 필요로 하는 것일까? 이 질문은 많은 ALT 암이 텔로미어에서 서로 상호작용하는 단백질을 암호화하는 유전자인 ATRX(alpha thalassemia /mental retardation syndrome X-linked) 또는 DAXX (death-domain associated protein)에서 돌연변이를 가진다는 것을 발견함으로써 강조되었다(10, 11). 아마도, 기능성 ATRX/DAXX 복합체의 부재는 ALT에서 결과적으로 상동 재조합이 되게 한다. 최소한, 이들 데이터는 텔로미어가 유지되도록 하는 유전적 변이에 대하여 선택적 이점이 있을 수 있으며 텔로머라제가 암의 모든 정상 줄기세포 전구체에서 무기한 활성화되지 않는다는 개념과 양립가능하다.
텔로머라제 역전사 효소(telomerase reverse transcriptase , TERT) 프로모터의 돌연변이가 ~70%의 흑색종(melanoma) 및 다양한 조직 유형으로부터 유래된 적은 수의 종양 세포주에서 발생한다는 것을 발견함으로써 암 내 텔로머라제 활성에 유전적 변이가 필요하지 않다는 개념에 대한 또 다른 이의가 제기되었다(14, 15). 중요하게, 폐, 위, 난소, 자궁, 또는 전립선암으로부터 유래된 110개의 세포주 중 오직 5개만이 TERT 프로모터 돌연변이를 갖는 반면, 다양한 다른 종양 유형으로부터 유래된 37개의 세포주 중 19개의 돌연변이가 발견되었다. 드물게 보통의 상피 암에서 발견되나 비상피세포(nonepithelial cells), 특히 육종 및 뇌 종양으로부터 유래된 종양에서 더욱 흔히 발견되는 이 상황은 ALT의 상황과 유사하다(13).
환자에 있어 종양의 영향을 예측하는데 도움이 될 뿐만 아니라, 종양을 검출, 모니터, 및 특정하는데 도움이 되는 바이오마커에 대한 기술이 계속해서 요구되고 있다.
인용된 각 참고문헌의 개시사항은 본원에 참조로서 분명히 포함된다.
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본 발명의 일 양태에 따르면, 방법은 인간의 핵산 시료를 검사하기 위하여 제공된다. 인간의 핵산 시료는 검사되고 텔로머라제 역전사 효소(TERT) 유전자의 프로모터 내 체세포 돌연변이의 존재가 결정된다. 핵산은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 암으로부터 유래된다: 육종(sarcoma), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 요로암(urinary tract cancer), 두경부암(head and neck cancer), 수모세포종(medulloblastoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 핍지교종(oligodendroglioma), 및 핍지성상세포종(oligoastrocytoma).
본 발명의 또 다른 양태는 변형된 핵산 프로브이다. 이는 18개 이상의 인간 TERT 프로모터의 뉴클레오티드를 포함한다. 18개의 뉴클레오티드는 C228A 또는 C229A를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 변형된 핵산 프라이머이다. 이는 18개 이상의 인간 TERT 프로모터의 뉴클레오티드를 포함한다. 18개의 뉴클레오티드는 C228A 또는 C229A를 포함한다.
이들 및 본 명세서를 읽은 당업자에게 명백할 다른 구현예는 암 환자의 치료 관리를 위한 새로운 도구와 기술을 제공한다.
본 발명자는 종양을 특정하는데 유용한 분석법을 개발하였다. 이 분석은 핵산 돌연변이, 특징적으로 5번 염색체의 비-코딩 영역 내 단일 뉴클레오티드 돌연변이인 바이오마커를 포함한다. 돌연변이는 텔로머라제 역전사 효소(telomerase reverse transcriptase , TERT)의 프로모터 영역 내 특정 위치, 특히 1,295,228; 1,295,229; 및 1,295,250(hg19)에 위치한다. 이러한 돌연변이는 텔로머라제 역전사 효소의 발현을 증가시키는 효과를 갖는다.
본 방법에서 사용될 수 있는 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 및/또는 생물학적 체액를 포함하는 시료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 시료의 예로는 조직, 세포, 생검(biopsies), 혈액, 림프, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 점액 및 눈물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 시료는 조직 시료(생검과 같은)일 수 있다. 생물학적 시료는 개체로부터 직접(예를 들어, 혈액 또는 조직 시료 채취에 의해) 또는 제3자(예를 들어, 의료인 또는 실험실 기술자와 같은 중개자로부터 받는)로부터 얻을 수 있다. 핵산은 분석 전 분리되거나 및/또는 정제될 수 있다. 여러 세대에 걸친 배양으로 증식된 세포주로부터 핵산을 얻지 않으며, 이는 이러한 세포주가 생체 내(in vivo) 종양 형성을 반영하지 않는 불멸화(immortalization) 및 배양 과정에서 돌연변이를 발생시키기 때문이다.
핵산은 증폭(amplification) 및 혼성화(hybridization) 및 핵산 서열화(sequencing)와 같은 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 프라이머 및 프로브는 돌연변이 특이적일 수 있다. 대안적으로, 프라이머는 포괄적일 수 있으며, 돌연변이든 아니든, 잠재적으로 변이된 영역을 포함하는 영역을 증폭할 수 있다. 제2차 기술이 그 후 돌연변이를 확인하는데 사용될 수 있다.
돌연변이는 종양 DNA와 인간 환자의 정상 조직의 DNA 비교를 통해 체세포로서 확인할 수 있다. 정상 또는 대조 DNA는 암에 관여되지 않은 조직으로부터 얻을 수 있다. 대조 DNA에는 없는 종양 DNA 내 돌연변이의 존재는 돌연변이가 체세포 돌연변이임을 나타내며, 즉, 이는 유전되지 않는다.
본 방법에 사용되는 프로브 및 프라이머는 특히 혼성화 및/또는 주요 합성을 위한 분석시 적합한 염기서열 및 기능을 갖는 한 사용할 수 있는 화학을 가질 수 있다. 특정 프로브 및 프라이머는 변형된 또는 대안적 백본 화학(backbone chemistry), 또는 레이블(labels) 또는 효소와 같은 추가적 모이어티(moieties), 또는 프로브 또는 프라이머의 TERT 유전자 프로모터-혼성화 서열과 인접한 TERT 유전자 프로모터 영역에서 발견되지 않는 추가적 염기서열과 같은 자연적으로 발생하지 않는 화학을 선택적으로 가질 수 있다. 변형된 또는 대안적 화학은 예를 들어, 자연적으로 발생하는 핵산에 비례하여 뉴클레오티드의 안정성을 증가시키거나 또는 혼성화를 증가시킬 수 있다. 프로브 및/또는 프라이머는 또한 어레이(arrays) 또는 비드(beads)와 같은 고체 지지체(supports)에 결합될 수 있다.
일반적으로 프로브 및 프라이머는 다른 비-표적 서열에 대한 위혼성화 없이 원하는 표적 서열에 대한 특이적 혼성화를 달성하기에 충분히 길다. 일반적으로 이러한 핵산의 크기는 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 22개 이상, 24개 이상, 26개 이상, 28개 이상, 또는 30개 이상의 뉴클레오티드 및 200개 미만, 150개 미만, 125개 미만, 100개 미만, 75개 미만, 50개 미만, 또는 40개 미만의 뉴클레오티드이다.
특정 암 내 TERT 프로모터 바이오마커의 높은 유병률은 초기 단계에서 암을 검출하고 일단 진단받은 환자에 있어 진행 또는 재발의 증거를 찾는데 이를 유용하게 한다. 이러한 검출 및 모니터링은 혈장, 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 및 소변, 및 기타 체액과 같은 시료 또는 조직에서 수행될 수 있다. 분석 핵산의 재료인 종양은 1차 종양 또는 전이된 것일 수 있다.
TERT 프로모터 돌연변이가 검사 핵산 중 하나에서 확인되면, 치료 또는 예방이 권장되거나 및/또는 수행될 수 있다. TERT 프로모터 돌연변이의 존재 또는 부존재는 종양의 아류형(subtype) 또는 종양의 세포 유형 재료를 더욱 유사한 종양군으로 특정할 수 있으며, 권장 또는 처방된 치료를 개선하거나 또는 계획을 모니터링한다. 적합한 치료는 감시 대기(watchful waiting), 화학요법, 방사선 치료, 생물학적 치료, 수술, 또는 기타 적합한 관리를 포함할 수 있다. TERT 프로모터 돌연변이가 확인되면, 항체 및 억제성 RNA 분자와 같은 억제제가 또한 사용될 수 있다.
본 발명자는 암 내의 텔로머라제 활성화의 원인이 되는 메커니즘에 대한 가설을 공식화하였다. 본 발명자는 세포 분열 동안 텔로미어 길이가 유지되는 두 가지 방법을 제시한다: (i) 빠르게 재생되는 조직의 줄기세포에서 발생하는 텔로머라제 활성의 후생적 조절을 통한 방법, 및 (ii) TERT 프로모터 내 돌연변이 또는 DAXX 또는 ATRX 내 또는 돌연변이와 같이, 텔로미어 길이를 유지하는 체세포 돌연변이를 통한 방법. 위장관 및 피부의 상피 또는 골수의 암과 같이 끊임없이 자기 재생하는 조직에서 비롯되는 이들 암은 텔로머라제가 이미 이들의 전구체 세포 내에서 후생적으로 활성화되었으므로 텔로미어-유지 돌연변이를 가질 개연성이 낮다. 반대로, 뉴런, 교세포(glial cells), 섬유아세포(fibroblasts), 간세포(hepatocytes), 섬세포(islet cells), 및 췌장 도관 상피 세포와 같이 끊임없이 자기 재생하지 않는 세포에서 발생하는 종양은 흔히 돌연변이를 갖는다. 이 가설의 추론은 높은 빈도의 ALT를 나타내는 종양 유형은 또한 높은 빈도의 TERT 돌연변이를 나타내며, 이들 돌연변이는 상호 배타적인 방식으로 분산될 것이라는 것이다. 다양한 암 유형에서 TERT 프로모터 돌연변이의 역할과 관련된 다른 질문의 답뿐만 아니라 이들 가설을 검사하기 위하여, 본 발명자는 다수의 종양 내 TERT 프로모터 돌연변이의 유병률을 판단하였다.
참고문헌 14 및 15에 공지된 결과뿐만 아니라 하기에 나타낸 결과는 도입시 제기한 가설 중 하나를 뒷받침하며 다른 것들을 반박하는 증거를 제공한다. 이들 가설 중 첫번째는 TERT 돌연변이는 정상적 상황에서 끊임없이 자기 재생하지 않는 조직으로부터 유래된 종양에서 오직 얻을 것이라는 것이다. 이 가설은 부분적으로 뒷받침된다: 압도적인 대다수의 TERT 프로모터 돌연변이는 계속해서 자기-재생하지 않는 조직으로부터 유래된 종양에서 발생하였다. TERT-H 종양 유형은 오직 흑색종, 신경교종의 특정 아류형, 수모세포종, 혀의 편평세포암(squamous cell carcinoma), 지방육종, HCC, 및 요로암을 포함한다. 요로의 정상 이행세포(transitional cell)는 매우 낮은 증식 지수(0.64% ± 0.52%)를 가지며, 위장관, 골수, 또는 피부의 지수보다 훨씬 낮다(38). 정상 간세포는 또한 흔히 전환되지 않으며(39), 교세포는 자기 재생에 대한 제한된 능력을 갖는 것으로 생각된다(40).
두 개의 다른 관찰은 또한 상기 가설을 뒷받침한다. 소아 1차 GBM은 드물게 TERT 돌연변이를 포함하는 반면(11%), 성인 1차 GBM은 흔히 포함하였다(83%). 소아 GBM은 아마도 종양 개시 시간에 여전히 분할하고 있는 세포로부터 유래되며, 따라서, 유전적 돌연변이를 통해 텔로머라제를 활성화시킴으로써 부여되는 선택적 이점이 없다. 반대로, 성인 GBM은 아마도 유사분열 후 세포로부터 유래되며, 이들은 텔로머라제 활성을 필요로 할 것이다. 유사하게, 수모세포종은 일반적으로 보통 성인에서 유지되지 않는 높은 자기 재생 속도를 갖는 전구체 세포로부터 발생하는 배아성 종양이다. 이 발견은 TERT 돌연변이를 갖는 수모세포종 환자의 평균 연령이 TERT 돌연변이를 갖지 않는 수모세포종 환자의 평균 연령보다 상당히 높다는 본 발명자의 관찰과 일치한다.
TERT 돌연변이는 오직 비-자기-재생하는 조직에서 발생한다는 가설이 거짓임을 나타내는 예외가 있다. 혀를 따라 늘어선 상피는 계속해서 자기 재생하나, 많은 혀의 편평상피암(squamous carcinomas)은 TERT 돌연변이를 가졌다. 또한, 혀의 편평상피는 구강의 다른 편평상피보다 더 적게 자기 재생할 것이라 확실히 예상되지 않으나, 후자는 거의 TERT 돌연변이를 갖지 않았다. 이 발견은 혀의 편평상피암이 다른 구강 편평상피암보다 시작점(origin)의 다른 세포로부터 유래한다는 것을 제시한다. 반대로, 비-자기 재생하는 조직으로부터 유래된 종양 유형의 서브세트는 오직 TERT-H이다. 예를 들어, TERT-H 종양은 활막 육종(synovial liposarcomas)이 아닌 점액성 지방육종(myxoid liposarcomas)을 포함하였다. 또한, 췌장의 세포(랑게르한스 섬 및 도관 상피 세포)는 거의 재생하지 않으나, 모든 유형의 췌장의 종양(췌장 신경내분비종양, 소엽암(acinar carcinomas), 및 췌장의 도관 선암)은 모두 TERT-L이었다. 본 발명자가 현재 내릴 수 있는 최대 결론은 비-자기 재생하는 세포 유형은 TERT-H 종양의 주요 재료이나, 비-자기 재생은 TERT 프로모터 돌연변이를 가진 종양세포가 인접 세포에 걸쳐 선택적 성장 이점을 가질 것인지 여부를 판단하는 요소 중 오직 하나라는 것이다.
상기에서 제기한 가설의 첫 번째 추론은 ALT를 나타낸 종양 유형은 TERT 프로모터 돌연변이를 가진 이들 유형일 것이라는 것이었다. 이 추론은 최소한 일반적 용어로 이들 데이터에 의해 철저히 반박된다. CNS 및 지방육종의 종양 유형이 높은 빈도의 TERT 프로모터 돌연변이뿐만 아니라 높은 빈도의 ALT를 가지고 있지만, 이들 종양 유형은 규칙이 아닌 예외이다. 예를 들어, 췌장 신경내분비종양은 매우 높은 빈도의 ALT를 가지지만 TERT 돌연변이의 증거는 없다. 반대로, 방광 암은 흔히 TERT 돌연변이를 가지지만 ALT를 전혀 가지지 않는다(13). 또한, 심지어 신경교종 중, 소아 GBM은 높은 빈도의 ALT 및 낮은 빈도의 TERT 돌연변이를 갖는 반면, 성인 GBM은 반대의 경향을 가진다.
두 번째 추론은 TERT 돌연변이에 의해 제공되는 선택적 이점이 ATRX 돌연변이(ALT을 부여하는)에 의해 제공되는 이점과 동일할 것이라는 것이다. 이 가설은 ATRX 암호화 및 TERT 프로모터 돌연변이가 모두 일반적인 신경교종에서 가장 효과적으로 실험되었다. 이 때 ATRX 및 TERT 돌연변이에 대하여 철저한 상호 배타성이 있었으며(P < 0.0001), 이는 이 생각을 강하게 뒷받침한다.
이들 결과는 또한 많은 대답없는 질문을 제기한다. 신경교종과 같은 일부 종양 유형에서, 본 발명자는 모든 종양이 TERT 또는 ATRX 내에서 돌연변이를 통해 유전적으로 활성화된 텔로미어 유지 프로그램을 가진다는 것을 상상할 수 있다. 그러나, 췌장 신경내분비종양과 같이 흔히 ATRX 돌연변이를 갖는 다른 종양 유형에서, TERT 프로모터 내 돌연변이가 아니라면, ALT를 나타내지 않는 경우의 텔로머라제의 활성화는 무엇이 담당하는가? 유사하게, ALT 및 TERT 돌연변이가 모두 흔히 발견되지 않는, 활막 육종 또는 골육종(osteosarcomas)과 같은 비-자기 재생하는 세포 유형으로부터 유래되는 이들 종양 내 텔로머라제 활성은 무엇이 담당하는가? 또한, 가끔 TERT 프로모터 돌연변이를 갖는 TERT-L 유형 중 개별 종양이 있다(예를 들어, 자궁경부암, 난소암, 및 참조문헌 15에서, 폐암). 동일한 조직병리학적 아류형의 다른 것으로부터 가끔 발생하는 이들 암을 어떻게 구별할 것인가? 엑솜(exome)에 한정하지 않는 전체-게놈 서열화 연구는 이들 질문에 대한 답을 제공할 것이다.
본 명세서에 기록된 결과는 기본적인 과학적 의미뿐만 아니라 실용성을 가진다. 방광암의 3분의 2는 TERT 프로모터 돌연변이를 가지며, 이는 방광의 침습성(invasive) 요로상피암(urothelial carcinoma)에서 아직까지 가장 일반적으로 변이된 유전자로 만든다. 이들 환자군에서 복합성 치료에도 불구하고 지속적으로 높은 사망률을 고려할 때, 이들 돌연변이는 초기 단계에서 방광암을 검출하고 진단받은 환자에 있어 진행 또는 재발의 증거를 찾는데 이상적인 비뇨기 바이오마커를 나타낸다(41). 유사하게, HCC 및 신경교종 아류형 내 TERT 프로모터 돌연변이의 높은 유병률은 조기 검출(HCC) 또는 모니터링을 위한 바이오마커의 훌륭한 후보를 제공한다(혈장 내 HCC 및 뇌척수액 내 신경교종)(42, 43).
또 다른 실용적 의미는 진단을 포함한다. 본 발명자는 TERT 프로모터 또는 ATRX 돌연변이를 가진 종양이 다른 전구체 세포로부터 유래되는 것 및 전구체 세포의 어느 하나의 유형이 이러한 돌연변이가 없는 종양의 전구체인 그들 유형과 다르다는 것을 추측한다. 이 구별은 임상적으로 의미있는 방법으로 종양의 분류에 도움을 줄 수 있다. 예를 들어, 도 2는 신경교종의 3가지 가장 일반적인 유형에서 발생하는 주요 유전적 변이를 보여준다. 도 2 A-C의 데이터에 기초하여, 본 발명자는 TERT 돌연변이가 없으나 ATRX 돌연변이를 포함하는 핍지교종이, 핍지교종에 비해 더욱 성상세포종과 유사하게 행동할 것과 그 반대의 경우를 추측한다. 유사하게, TERT 돌연변이를 갖지 않는 1차 GBM(전체의 15%)은 일반적으로 TERT 돌연변이가 없는 후기의 점진적 성상세포종과 더욱 유사하게 행동할 것이다. 이러한 가능성은 TERT 돌연변이를 가지지 않는 이들 1차 GBM 환자가, 평균적으로, 다른 1차 GBM 환자보다 더욱 오래 생존하였다는 관찰에 의해 뒷받침된다(도 3).
도 1. TERT 프로모터 돌연변이의 빈도; 26개의 종양 유형 중 15개 또는 그 이상의 종양을 분석하였다. 신경교종(Gliomas)은 1차 GBM, 성상세포종(2차 GBM뿐만 아니라 성상세포종 등급 Ⅱ 및 Ⅲ을 포함), 및 핍지교종으로 나뉜다.
도 2. 신경교종 아류형 내 선택된 유전자의 돌연변이. (A) 51개의 1차 GBM 내 TERT 돌연변이의 분화 및 다른 유전적 사건. (B) 등급 Ⅱ-Ⅲ 성상세포종 및 등급 IV 2차 GBM을 포함하는 40개의 성상세포종의 TERT 돌연변이의 분화 및 다른 유전적 사건. (C) 45개의 핍지교종의 TERT 돌연변이의 분화 및 다른 유전적 사건. (D) 24개의 핍지성상세포종의 TERT 돌연변이의 분화 및 다른 유전적 사건. 세계 보건 기구 종양 등급은 각 컬럼 아래에 표시된다. 빈칸은 종양 내 WT 상태를 의미한다.
도 3. TERT 프로모터-변이된 종양을 갖는 1차 GBM 환자의 생존. TERT 프로모터 변이된 상태로 계층화된 50명의 1차 GBM 환자의 Kaplan-Meier 분석. TERT 프로모터 WT 종양을 가진 환자(n = 13)가 TERT 프로모터-변이된 종양을 가진 환자(n = 37)에 비해 더 오래 살아남았다; TERT 프로모터 WT 종양을 가진 환자의 평균 생존기간은 27개월이었으며, TERT 프로모터-변이된 종양을 가진 환자의 14개월과 비교하였다. 추정 위험비(hazard ratio)는 0.38이었다(95% 신뢰구간 = 0.18, 0.81; P = 0.01, 로그순위 검정).
상기의 개시는 일반적으로 본 발명을 설명한다. 본원에 개시된 모든 참고문헌은 참조로서 분명히 포함된다. 보다 완전한 이해는 하기 특정 실시예를 참조하여 얻을 수 있으며, 이는 오직 예시의 목적으로 본원에 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1-방법
모든 임상 정보 및 조직은 본 연구에 물질을 기증한 다양한 기관으로부터 동의 및 임상 시험 심사 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 얻었으며, 이들은 건강 보험 양도 및 책임에 관한 법률(Health Insurance Portability and Accountability Act)에 따라 얻었다. 조직 절편은 DNA 정제를 위해 사용되는 세포의 ≥50%이 종양성이라는 것을 보장하고 조직병리학적 진단을 확인하기 위하여, 위원회에서 승인받은 병리학자에게 검토되었다. M13가 서열 5'-tgtaaaacgacggccagt-3' (SEQ ID NO: 3)를 갖는 보편적인 서열화 프라이밍 위치(sequencing priming site)인, 서열 5'-M13- GGCCGATTCGACCTCTCT-3' (SEQ ID NO: 1) 및 5'-AGCACCTCGCGGTAGTGG-3' (SEQ ID NO: 2)를 갖는 올리고뉴클레오티드는 표준 방법을 이용한 Sanger 서열화를 위한 C228 및 C250(chr5: 1,295,228; chr5: 1,295,250, 각각; hg19)를 포함하는 근위(proximal) TERT 프로모터를 PCR-증폭하는데 사용되었다(44). ALT 상태뿐만 아니라 1차 GBM 복사체 수(copy number) 데이터는 참고문헌 37, 45, 및 46에서 공지된 데이터로부터 유추하였으며, OTX2 복사체 수 발현은 참고문헌 27에서 공지된 데이터로부터 유추하였다. 뇌 종양 환자를 Duke에 있는 Tisch 뇌 종양 센터에서 처리하였다. 본 연구의 목적을 위하여, 2차 GBM은 낮은-등급 신경교종(등급 I-Ⅲ의 이전 진단 후 >1년 절제된 GBM을 나타내며, 모든 다른 GBM은 1차 GBM으로 간주되었다. 소아 GBM 시료를 21 세 이전에 발생하는 이들 시료로 정의하였다.
실시예 2
본 발명자는 본 발명자의 실험실 내 표본의 가용성에 의존하여 흔한 종양 유형의 20개 이상의 개별 표본 및 희귀 종양 유형의 적은 표본의 평가를 시도하였다. 우리의 파일럿 연구에서 상당한 수의 돌연변이를 보인 이들 종양 유형에서, 추가적 종양을 평가하였다. 인용된 독창적인 논문에서 이미 충분히 평가되었기 때문에 흑색종 및 폐, 위, 및 식도의 종양은 제외하였다(14, 15). 세포주가 아닌 1차 종양이 사용되었을 때, 본 발명자는 DNA 정제에 사용된 조직 블록의 동결 절편의 조직병리학적 검사를 통해 종양성 세포의 비율이 >50%이라는 것을 보장하였다. 종양 함량이 <50%인 경우, 본 발명자는 종양 함량이 >50%으로 풍부하도록 병변을 미세해부(microdissect)하였다. 프라이머는 각각, TERT ATG 시작 위치의 상류인 위치 124 및 146 bp와 일치하는 이전에 나타낸 2개의 TERT 돌연변이-C228T 및 C250T-를 포함하는 영역을 증폭하기 위한 것이다(14, 15). 그 후 PCR 단편은 종래의 Sanger 서열화에 의해 정제 및 분석하였다.
모든 것에서, 본 발명자는 1,230개의 종양 표본 및 확인된 231개의 돌연변이(18.8%)에서 TERT 프로모터 돌연변이를 평가하였다(표 1). C228T 및 C250T 돌연변이는 각각, 77.5% 및 20.8%의 변이를 차지하였다. 또한, 본 발명자는 이전에 관찰되지 않은 4개의 돌연변이를 검출하였다: 3개의 C228A 돌연변이 및 1개의 C229A 돌연변이. C228T 및 C250T 돌연변이의 대표적인 서브세트(n = 59)뿐만 아니라 이들 4개의 돌연변이 모두는 종양 내 돌연변이를 포함하는 환자의 정상 조직 내 부재에 의해 입증되는 체세포이다.
TERT 프로모터 돌연변이의 빈도
종양 유형* 종양의 수 변이된 종양의 수(%)
연골육종(chondrosarcoma) 2 1 (50)
신경외배엽종양(dysembryoplastic neuroepithelial tumor) 3 1 (33.3)
자궁내막암(endometrial cancer) 19 2 (10.5)
상의세포종(ependymoma) 36 1 (2.7)
섬유육종(fibrosarcoma) 3 1 (33.3)
신경교종† 223 114 (51.1)
간세포암 61 27 (44.2)
수모세포종 91 19 (20.8)
점액섬유육종(myxofibrosarcoma) 10 1 (10.0)
점액성 지방육종(myxoid liposarcomas) 24 19 (79.1)
신경모세포종(neuroblastoma) 22 2 (9)
골육종 23 1 (4.3)
난소의, 투명세포암(clear cell carcinoma) 12 2 (16.6)
난소의, 저등급 장액성(serous)암 8 1 (12.5)
고립섬유성종양(solitary fibrous tumor, SFT) 10 2 (20.0)
두경부의 편평세포암 70 12 (17.1)
자궁 경관의 편평세포암 22 1 (4.5)
피부의 편평세포암 5 1 (20)
방광의 요로상피암 21 14 (66.6)
상부 비뇨기 상피의 요로상피암 19 9 (47.3)
*급성 골수성 백혈병(n = 48), 폐포 횡문근 육종(n = 7), 변칙적 지방 종성 종양(n = 10), 유방암(n = 88), 담관육종(n = 28), 중앙부/종래의 연골육종(n = 9), 만성 림프성 백혈병(n = 15), 만성 골수성 백혈병(n = 6), 대장 선암(n = 22), 배아성 횡문근 육종(n = 8), 감각신경모세포종(n = 11), 연부조직 점액성 연골육종 (n = 3), 간의 섬유판막암종(fibrolammellar carcinoma)(n = 12), 담낭암(n = 10), 위장관 기질종양(n = 9), 간모세포종(n = 3), 평활근 육종(n = 3), 종래 지방종(n = 8), 저등급 섬유점액성 육종(n = 9), 악성 말초 신경막종양(n = 3), 갑상선 수질암(n = 24), 수막종(n = 20), 중피종(n = 4), 췌장의 소엽암(n = 25), 췌장의 도관선암(n = 24), 췌장 신경내분비종양 (n = 68), 전립선암(n = 34), 척추세포종(n = 9), 활막 육종(n = 16), 또는 미분화된 다형성 연부 조직 육종(n = 10) 시료에서는 돌연변이가 발견되지 않았다.
†신경교종은 11개의 아류형을 포함한다; 표 2 참조.
신경교종 아류형 내 TERT 돌연변이
신경교종 아류형 WHO 등급 연구된 종양의 수 TERT 프로모터 돌연변이를 가진 종양의 수 TERT 돌연변이를 가진 종양(%)
1차 GBM, 성인 IV 78 65 83
1차 GBM, 소아 IV 19 2 11
성상세포종 II 8 0 0
성상세포종 Ⅲ 27 4 15
성상세포종 IV 5 0 0
핍지교종 II 19 12 63
핍지교종 Ⅲ 26 23 88
핍지성상세포종 II 9 2 22
핍지성상세포종 Ⅲ 15 4 27
1,230개의 종양은 60개의 종양 유형을 나타내었다. 26개의 이들 종양 유형 중, 15개 이상의 개별 종양을 평가하였다(총 1,043 개별 종양을 포함)(도 1). 남아있는 종양 유형에서, 어느 정도는 이들 종양 유형이 일반적으로 서양 집단에 있어 흔하지 않기 때문에 오직 적은 수의 시료(2-12)가 가능하였다(표 1). 본 연구에 15 이상의 개별 종양이 가능하였던 종양 유형은 명확한 구분이 가능하다. 18개의 이들 종양 유형은 오직 때때로 TERT 프로모터 돌연변이를 가졌으며(0 내지 3개의 돌연변이, 각 유형의 0-15%의 종양을 포함)(도 1). 본 발명자는 이들이 낮은 빈도의 TERT 프로모터 돌연변이를 가지므로 이들 종양 유형을 TERT-low(TERT-L)로 분류하였다. TERT 프로모터 돌연변이의 상대적으로 높은 유병률 때문에8개의 다른 종양 유형은 TERT-high(TERT-H)로 분류하였다(각 유형의 16-83%의 종양).
TERT-L 종양 유형은 유방, 전립선, 갑상선, 췌장, 담낭, 자궁, 및 대장의 상피성 종양(이전 연구에 기초한 폐, 위, 및 식도의 종양뿐만 아니라)(14, 15) 및 백혈병을 포함하는 가장 일반적인 암의 일부를 포함한다. 사실상, 본 발명자가 연구한, 총 546개의 종양을 포함하는 30개의 종양 유형 중 임의의 표본에서 TERT 돌연변이가 확인되지 않았다(표 1). 활막 육종, 척색종(chordomas), 신경모세포종(neuroblastomas), 골육종, 및 상의세포종(ependymomas)과 같은 일부 비상피암은 또한 TERT-L이었다.
8개의 TERT-H 종양 유형을 확인하였다(이전에 나타낸 흑색종에 추가하여) (14, 15). 이들 종양은 CNS의 종양, 요로의 이행세포 암, 간세포암, 점액성 지방육종, 및 구강암을 포함하였다. 이전 연구에서 오직 적은 수의 TERT-H 종양(다른 흑색종보다)을 검사하였으나 신경교종, 간세포, 및 구강암 내 돌연변이가 검출되었으며, 이는 이들 종양 유형 내 높은 빈도의 돌연변이에 기초하여 예상할 수 있다(표 1).
실시예 3
육종(Sarcomas).
가장 높은 빈도의 TERT 프로모터 돌연변이 중 하나가 점액성 지방육종(24개의 종양 중 19개, 79%가 돌연변이를 가진)에서 발견되었다. 점액성 지방육종은 모든 지방육종 및 ~10%의 모든 성인 연부 조직 육종의 3분의 1 이상을 차지하였다(16). 환자는 상대적으로 어리고, 30 내지 50살의 피크 연령 범위를 가진다. 유전적 수준에서, 가장 특징적인 변화는 FUS 및 DDIT3 유전자의 융합으로 이어지는 t(12;16)(q13;p11) 염색체 전좌이다(16, 17). 이들 종양의 세포적 시작은 알 수 없으나, 지방선구 모세포(preadipocytic progenitor cells) 및 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)가 연관되어 있다(18); 배 발생 후, 이들 세포의 유사분열 호라성은 낮을 것으로 생각된다. 손상 없이 자기 재생하지 않는 중간엽 세포로부터 유래되는 것으로 생각되는 다른 육종 또한, TERT-H이 아니었다(표 1). 이들 육종은 활막 육종 (16개의 종양 중 0%) 및 골육종 (23개의 종양 중 4.3%)을 포함하였다. 아주 흥미롭게도, 점액성 지방육종은 이전에 상대적으로 높은 유병률의 ALT(38개의 종양 중 24%)를 갖는 것으로 나타내었다(13, 19). 집계된 데이터는 점액성 지방육종이 거의 항상 유전적으로 TERT 프로모터 돌연변이 또는 ALT를 통해 텔로미어 유지 유전자를 활성화시킨다는 개념과 양립가능하다.
간세포암(hepatocellular carcinomas).
간세포암(HCCs)은 전세계적으로 암 사망률의 세번째 주요 원인이며, 미국에서 발생이 증가하고 있다(20). 미국의 대부분의 HCC는 B 또는 C형 간염 바이러스 감염과 관련되어 있는 반면, 다른 것들은 알코올성 간경변과 관련되어 있다; 본 발명자가 평가한 44%의 HCC 시료는 TERT 프로모터 돌연변이를 갖는다(27/61). 이 발견은 이 종양 유형에서 관찰된 것 중TERT를 아직까지 가장 흔하게 변이된 유전자로 만든다(21, 22). 돌연변이는 단계 I의 잘 분화된 HCCs의 39%에서 관찰되었으므로, 종양 형성시 상대적으로 조기 발생하는 것으로 보인다(표 S1). TERT 돌연변이는 어느 기초 간 질환이 없는 경우뿐만 아니라 바이러스 관련 종양에서도 유사한 빈도로 관찰되었다(표 S1). 또한 성별, 나이, 또는 민족과 관련하여 TERT 프로모터 돌연변이의 유병률의 차이점은 없었다(표 S1). ALT는 이전에 연구된 121개의 HCCs 중 7%에서 관찰되었다(13).
요로암(Urinary tract cancers).
방광의 요로상피암은 미국 남성에서 4번째로 가장 흔한 유형이다. 2013년에, 73,000명이 넘는 환자가 미국에서만 대략 15,000명의 사망으로 이어지는 방광암으로 진단될 것이다(23). 본 발명자가 연구한 방광 중 21개의 요로상피암의 3분의 2가 TERT 프로모터 돌연변이를 가지고 있었다. 본 발명자는 종양의 조직병리학적 아류형에 대하여 훨씬 덜한 해부학적 위치인 상부 요로의 19개의 요로상피암을 평가할 수 있었다. 19개의 상부 요로 요로상피암 중 9개가 TERT 돌연변이를 가지고 있었다. 따라서, TERT 돌연변이는, 아직까지 방광 또는 상부 요로의 요로상피암에서 확인되는 가장 흔히 변이된 유전자이다(24). 방광 암 내 ALT의 유병률은 매우 낮다(188개의 암 중 1%)(13).
두경부암(Head and neck cancers).
두경부암은 대부분 항상 편평세포암(squamous cell carcinomas)이며 구강 내벽(뺨, 경구개 및 연구개, 혀, 성문상부(supraglottis), 등의 점막)에 걸쳐 발생할 수 있다. 이는 세계에서 여섯번째로 가장 흔한 암이며, 2012년에 미국에서 50,000건아 발생하였다. 본 발명자는 본 발명자가 평가한 70개의 구강 암 중 17%에서 TERT 프로모터 돌연변이를 확인하였다. 그러나, TERT 프로모터 돌연변이를 가진 경우의 해부학적 분화가 현저하였다: 70개의 총 경우 중 오직 23개가 경구 혀, 양쪽꼬리(two-tailed))에서 유래되었으나, TERT 프로모터 돌연변이를 가진 12개의 암 중 11개가 경구 혀에 있었다(P < 0.0001, Fisher의 정확 확률검정(Fisher exact probability test)(표 S2). 이 특별한 선택성의 기준은 혀 내막의 편평상피(squamous epithelium) 및 구강을 포함하는 두경부의 다른 부분에서 공유되는 특징으로 주어지므로 특이하다. 또한, 본 발명자는 또 다른 위치(자궁 경관)의 22개의 편평세포암(squamous cell carcinoma)을 평가하였으며 오직 하나의 TERT 돌연변이(4.5%)를 발견하였다(표 1). 대부분의 자궁의 편평세포암 및 두경부 편평세포암의 서브세트는 인간 유두종 바이러스(papillomavirus)에 의해 유발되며, 이는 E6 및 E7 바이러스성 종양 유전자(oncogenes)의 발현에 의해 텔로머라제를 활성화시킬 수 있다(25). 이들 발견은 인간 유두종 바이러스 감염 및 TERT 돌연변이가 편평세포암에서 텔로머라제를 활성화시키기 위한 대안적 메커니즘일 수 있다는 가능성을 제기한다. 본 발명자는 가능한 데이터를 가진 적은 수의 환자 때문에 TERT 프로모터 돌연변이 및 HPV 상태 또는 다른 임상 매개변수 사이의 상관관계를 검사할 수 없었다(표 S2). 41개의 구강암을 포함하는 70개의 두경부암에서 확인된 ALT 사례는 없었다(13).
수모세포종(Medulloblastomas).
수모세포종은 유년기에 가장 흔한 악성 뇌 종양이다(26). TERT 돌연변이는 본 발명자가 평가한 91개의 수모세포종 중 21%에서 발생하였다. 구강 암과 마찬가지로, TERT 돌연변이는 수모세포종 환자에서 무작위로 분포되지 않았다. 수모세포종은 보통 젊은 나이에 진단되는 반면, TERT 돌연변이를 가진 이들 수모세포종은 이보다 상당히 노령에서 진단되었다(평균 = 6 vs. 16세, P = 0.0012, 비동일 분산(unequal variances)을 가정한 t 검정, 양쪽꼬리)(도 S1A). 이 관찰은 TERT 프로모터 돌연변이를 갖는 종양 유형의 선택성의 기초를 이해하는데 중요한 의미를 가진다(Discussion); 90명의 환자 중 45명은 OTX2(orthodenticle homeobox 2) 유전자 증폭 및 발현에 대하여 이전에 평가되었으며, 전사 인자 내 변이는 수모세포종의 임상적으로 구별되는 분자 아류형과 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다(27). OTX2 발현은 TERT 프로모터 돌연변이를 가진 수모세포종 환자에서보다 TERT 프로모터 돌연변이가 없는 수모세포종 환자에서 >100배 높았다(도 S1B 내 로그스케일 주목). OTX2 발현의 높은 수준은 일반적으로 OTX2 유전자 증폭의 결과이다(도 S1C). TERT 프로모터 돌연변이와 진단시 고령과의 연관성 및 OTX2 이 과발현되지 않는 것은 수모세포종의 특정 임상 및 분자 아류형에서 발생한다는 가능성을 제기한다. TERT 돌연변이가 풍부할 수 있는 수모세포종의 분자 아류형은 유아가 아닌 소닉 헤지호그(sonic hedgehog) 아류형일 수 있으며, 이는 진단시 고령과 OTX2의 낮은 발현이 특징이다(28, 29). 이 연관성을 더욱 결정적으로 만들기 위하여 추가 연구가 필요할 것이다. ALT는 이전에 연구된 55개의 수모세포종 중 7%에서 관찰되었다(13).
신경교종(Gliomas).
신경교종은 가장 일반적인 CNS 종양 유형이며 작년에 미국에서 >14,000명의 사망을 차지하였다(30). 세계 보건 기구(World Health Organization)가 세운 조직병리학적 및 임상적 기준은 이들 종양을 몇몇 아류형으로 특정하는데 사용된다(30). 본 발명자는 4가지 주요 아류형을 개별적으로 고려하였다(표 S3).
1차 교모세포종(primary glioblastoma).
이들 1차 교모세포종(GBMs)은 성인에서 가장 일반적인 악성 뇌 종양으로, 모든 두개강내 종양(intracranial tumors) 중 ~17%를 차지하며, 이들은 최악의 생존률을 부여한다(평균 ~15개월)(31). 이들 높은-등급(등급 IV) 종양은 검출가능한 전구체 병변이 없으며 신규(de novo) 종양으로서 언급되고 있다. TERT 프로모터 돌연변이의 유병률은 성인의 GBM에서 현저하게 높았다(78개의 종양 중 83%)(표 S3). 이 유병률은 이 종양 유형 내 어느 다른 유전적 돌연변이의 유병률보다 높다(32). 이들 발견은 GBM에서 발견되는 TERT mRNA의 높은 수준 및 텔로머라제 활성을 담당하는 분자 메커니즘을 제공한다(33).
78개의 1차 GBM 종양 중 51개의 경우, 임상적 데이터뿐만 아니라 다른 일반적인 유전적 변이의 데이터가 가능하다(도 2A). 흥미롭게도, 1차 GBM의 전형적인 분자의 특징인 EGFR 증폭은 독점적으로 TERT 돌연변이를 가진 종양에서 발생하였다(P = 0.0006, Fisher의 정확 확률검정, 양쪽꼬리). 반대로, TERT 돌연변이와 TP53 돌연변이 또는 CDKN2A 결실(deletion) 사이의 연관성은 확인되지 않았다. 중요한 것은, TERT 프로모터 돌연변이의 빈도는 성인 환자에 비해 소아 환자(19개의 종양 중 11%)의 1차 GBM에서 상당히 적었다(Discussion)(표 S3). ALT는 105명의 성인 GBM 중 11% 및 소아 GBM 중 44%에서 관찰되었다(즉, TERT 프로모터 돌연변이에서 관찰된 경향의 반대)(13). TERT 돌연변이를 가지지 않는 1차 GBM 환자는 이러한 돌연변이를 갖는 환자에 비해, 평균적으로, 상당히 오래 생존하였다(평균 = 27 vs. 14개월, 로그순위 검정에 의한 P = 0.01)(도 S3).
성상세포종(astrocytomas).
침윤성 성상 세포 종양은 흔히 수술로 절제되는 원래의 병변보다 높은 등급의 재발성 병변으로 종종 진행된다. 이는 대부분 등급 Ⅱ 또는 Ⅲ이지만, 등급 IV(이 지점에서 종종 제2차 GBM으로 불리는)로 진행할 수 있다. 어느 단계의 성상세포종도 거의 TERT 프로모터 돌연변이를 포함하지 않았다(40개의 총 시료 중 10%)(표 S3). 대신에, 더욱 흔히 IDH1(isocitrate dehydrogenase 1) 또는 IDH2(isocitrate dehydrogenase 2) 돌연변이(40개의 종양 중 75%), ATRX 돌연변이(40개의 종양 중 70%), 및 TP53 돌연변이(40개의 종양 중 73%)를 포함하였다(도 2B). ALT는 57개의 성상세포종 중 63%에서 관찰되었으며, 이는 ATRX 돌연변이의 높은 유병률과 일치한다(13). IDH1 돌연변이 종양 내 활성화된 TERT 돌연변이의 부족은 또한 이들 병변에서 관찰되는 TERT mRNA 부족 및 텔로머라제 활성에 의해 뒷받침된다(33).
핍지교종(oligodendrogliomas).
성상세포종와 마찬가지로, 핍지교종은 종종 진행하며 이는 흔히 TERT 프로모터 돌연변이를 포함한다(45개의 종양 시료 중 78%)(표 S3). 핍지교종은 유일하게 연구된 C250T 돌연변이가 거의 C228T 돌연변이만큼 많은 종양 유형이었다(비-CNS 종양을 포함하는 모든 유형 중)(Dataset S1). 핍지교종에서, TERT 돌연변이를 갖는 43%의 종양이 C250T 치환체(substitutions)를 포함한 반면, 다른 신경교종에서는, 오직 10%뿐이었다(P < 0.001, Fisher의 정확 확률검정, 양쪽꼬리). 흥미롭게도, ATRX 및 TERT 서열 변이에 대해 평가된 45개의 핍지교종 중 91%가 ATRX 암호화 또는 TERT 프로모터 돌연변이를 포함하며, 이는 텔로미어 유지로 이어지는 유전적 변이가 이 아류형의 종양 형성에 필요하다는 것을 제시한다.
핍지교종은 특징적인 염색체팔 1p 및 19q의 손실을 포함하는 것이 오랫동안 공지되었으며, 이들 손실은 염색체 19q상의 CIC 유전자 활성 및 일부 경우에서, 염색체 1p상의 FUBP1 유전자의 활성을 반영한다(34-36). 따라서, 45개의 핍지교종 중 78%는 이형접합(heterozygosity)의 염색체팔 1p 또는 19q 손실을 포함한다(도 2C)(34-36). 또한, 이들의 거의 모두가 IDH1 또는 IDH2 돌연변이를 포함한다(93%).
핍지성상세포종(oligoastrocytomas).
그들의 이름이 의미하듯이, 이들 종양은 핍지교종 및 성상세포종의 조직학적 특징이 혼합된다. 이 혼합은, 부분적으로, 조직병리학적 또는 임상적 기준을 기초로 또 다른 것으로부터 다양한 신경교종 아류형을 구별하는 어려움을 반영한다(37). 이 종양 아류형의 이러한 유전적 특징은 이 혼합을 반영한다: TERT 프로모터 돌연변이의 유병률(24개의 종양 중 25%)은 염색체 (Chr) 1p/19q 손실 및 IDH1/2, TP53, 및 ATRX 돌연변이의 빈도와 같이 핍지교종 및 성상세포종의 중간이다(도 2D).
실시예 4-ALT vs. TERT .
ALT 는 어느 다른 조직 유형의 종양에서 보다 CNS(특히 신경교종)의 종양에서 흔히 발견된다. TERT 프로모터 돌연변이가 또한 신경교종에서 흔하다는 것을 고려하면, 이들 두개의 특징간의 관계는 확신을 가지고 판단할 수 있다. 도 2에 도시된 종양은 ATRX 내 변이에 대하여 이전에 평가되었으며, 이는 ALT 표현형에 대한 거의 완벽한 대체제(surrogate)이다(11, 37). 우리의 데이터는 ATRX 돌연변이를 가진 50개의 신경교종 및 TERT 돌연변이를 가진 83개의 신경교종이 있음을 나타낸다; TERT 돌연변이를 가진 83개의 종양은 모두 ATRX 돌연변이를 포함하지 않는다(P < 0.0001, Fisher의 정확 확률검정, 양쪽꼬리).
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Claims (29)

  1. 하기를 포함하는 인간의 핵산 시료를 검사하여 하기 선택된 암에 대한 정보를 제공하는 방법:
    인간으로부터 얻은 핵산 시료를 검사하는 단계 및 텔로머라제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase, TERT) 유전자의 프로모터 내 체세포 돌연변이(somatic mutation)의 존재를 판단하는 단계,
    여기서 상기 돌연변이는 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 C가 T로 치환된 돌연변이(C228T), 5번 염색체의 1,295,250위치에서 C가 T로 치환된 돌연변이(C250T), 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 C가 A로 치환된 돌연변이(C228A) 및 5번 염색체의 1,295,229 위치에서 C가 A로 치환된 돌연변이(C229A)로부터 선택된 것으로 검출되는 것이며,
    여기서 핵산은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 암으로부터 얻은 것이다: 점액성 지방육종(myxoid liposarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 점액섬유육종(myxofibrosarcoma), 두경부암(head and neck cancer), 수모세포종(medulloblastoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 핍지교종(oligodendroglioma), 및 핍지성상세포종(oligoastrocytoma).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 두경부암인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 수모세포종인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 암은 신경교종인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 암은 성상세포종인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 암은 핍지교종인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 암은 핍지성상세포종인 것인 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 암은 점액성 지방육종(myxoid liposarcoma)인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 암은 섬유육종(fibrosarcoma)인 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 암은 점액섬유육종(myxofibrosarcoma)인 것인 방법.
  14. 제4항에 있어서, 상기 암은 혀의 편평세포암(squamous cell carcinoma)인 것인 방법.
  15. 제6항에 있어서, 상기 암은 1차 교모세포종(primary glioblastoma)인 것인 방법.
  16. 제6항에 있어서, 상기 암은 성상세포종인 것인 방법.
  17. 제6항에 있어서, 상기 암은 핍지교종인 것인 방법.
  18. 제6항에 있어서, 상기 암은 핍지성상세포종인 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 핵산 시료는 1차 종양으로부터 얻은 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 증폭제(amplicon)를 형성하도록 프로모터 또는 프로모터의 일부를 증폭시킴으로써 검사하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 프로모터의 일부는 텔로머라제 역전사 효소(telomerase reverse transcriptase, TERT) 유전자의 chr5:1,295,228, chr5:1,295,229 및 chr5:1,295,250으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  22. 삭제
  23. 제20항에 있어서, 상기 증폭제는 서열화된 것인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 증폭제는 돌연변이 특이적 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 것인 방법.
  25. 인간 TERT 프로모터의 18개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 변형된 핵산 프로브로서, 상기 18개의 뉴클레오티드는 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 C가 A로 치환된 돌연변이(C228A) 또는 5번 염색체의 1,295,229 위치에서 C가 A로 치환된 돌연변이(C229A)를 포함하는 것인 프로브.
  26. 인간 TERT 프로모터의 18개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 변형된 핵산 프라이머로서, 상기 18개의 뉴클레오티드는 5번 염색체의 1,295,228 위치에서 C가 A로 치환된 돌연변이(C228A) 또는 5번 염색체의 1,295,229 위치에서 C가 A로 치환된 돌연변이(C229A)를 포함하는 것인 프라이머.
  27. 제25항에 있어서, 검출 가능한 라벨을 포함하는 것인 변형된 프로브.
  28. 제26항에 있어서, 인간 TERT 프로모터의 18개의 뉴클레오티드와 인접(contiguous)하지 않은 10개 이상의 뉴클레오티드의 서열을 추가적으로 포함하는 것인 변형된 프라이머.
  29. 제1항에 있어서, 상기 검사단계 전, 핵산은 1차 종양 시료로부터 추출되는 것인 방법.
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