KR20210026616A - 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20210026616A
KR20210026616A KR1020190107643A KR20190107643A KR20210026616A KR 20210026616 A KR20210026616 A KR 20210026616A KR 1020190107643 A KR1020190107643 A KR 1020190107643A KR 20190107643 A KR20190107643 A KR 20190107643A KR 20210026616 A KR20210026616 A KR 20210026616A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
reverse transcriptase
primer
tert
mutation
telomerase reverse
Prior art date
Application number
KR1020190107643A
Other languages
English (en)
Inventor
김경미
강소영
Original Assignee
지니너스 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 지니너스 주식회사 filed Critical 지니너스 주식회사
Priority to KR1020190107643A priority Critical patent/KR20210026616A/ko
Priority to US17/638,609 priority patent/US20220333207A1/en
Priority to PCT/KR2020/011395 priority patent/WO2021040404A1/ko
Publication of KR20210026616A publication Critical patent/KR20210026616A/ko
Priority to KR1020210078170A priority patent/KR102406618B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/125—Specific component of sample, medium or buffer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 PCR 프라이머 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 이용하여 특정 조건에서 tert 유전자를 증폭시킬 수 있는 바, TERT의 변이를 검출할 수 있다.

Description

텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 PCR 프라이머 조성물 및 이의 용도{PCR primer composition for detecting mutation of telomerase reverse transcriptase and uses thereof}
텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 PCR 프라이머 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
텔로미어(telomere)는 진핵생물 염색체의 말단 구조물로서, 올리고뉴클레오티드 셔열이 반복되는 구조이다. 텔로미어는 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지하는 기능을 가지고 있는데, 세포가 분열할 때마다 그 길이가 조금씩 짧아지며 세포분열이 일정한 횟수를 넘어서게 되면 그 길이가 아주 짧아지면서 해당 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 체세포를 제외한 생식세포와 암세포는 텔로미어가 줄어들지 않아 무한 증식이 가능한데, 이는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되면서 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문이다. 특정 질병에서 이 텔로미어 말단이 비정상적으로 빠르게 손실되어 미성숙 세포의 노화 또는 퇴화가 유도된다.
한편, 텔로머라제 역전사 효소(telomerase reverse transcriptase, TERT)는 암세포 증식에 영향을 주는 단백질로, 상기 단백질 돌연변이 유전체를 검사하여 암을 진단할 수 있다. TERT는 유두 갑상선 암의 재발 위험 등을 예측하는 정확한 지표로 알려져 있으며 이를 통해 일부 뇌종양 환자의 예후와 전이 위험성을 예측할 수 있다. 그러나, TERT는 고유의 특성 때문에 실제로 사용되기 어렵다. 구체적으로 유전자 검사를 하기 위해서는 유전체를 증폭시켜야 하는데 TERT는 그 특성상 효율이 떨어지기 때문이다. 따라서, TERT 단백질 돌연변이 유전체를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 방법의 연구가 필요하다.
일 양상은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 텔로머라제 역전사 효소(Telomerase reverse transcriptase, TERT)의 변이 검출을 위한 PCR 프라이머 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 프라이머 조성물을 포함하는 TERT의 변이 검출을 위한 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 프라이머 조성물에 증폭하고자 하는 핵산 주형을 혼합하는 단계; 상기 혼합물에 대한 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 증폭 산물에서 텔로머라제 역전사 효소의 변이를 검출하는 단계를 포함하는 텔로머라제 역전사 효소의 변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 텔로머라제 역전사 효소(Telomerase reverse transcriptase, TERT)의 변이 검출을 위한 PCR 프라이머 조성물을 제공한다.
상기 변이는 TERT 유전자의 프로모터에 발생한 것으로서 구체적으로 서열번호 3으로 표시되는 유전자의 124번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환된 것; 및/또는 서열번호 3으로 표시되는 유전자의 146번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 반응용 완충용액, dNTP, 또는 DNA 중합효소를 포함하는 것일 수 있다. 상기 반응용 완충용액으로는 Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgSO4, MgCl2 등의 성분을 포함하는 통상의 PCR 증폭용 완충용액을 적절히 변형하여 사용할 수 있다. 상기 4종의 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 의미하며, 사용 할 수 있는 DNA 중합효소 또한 특정한 효소로 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 PCR 증폭용 프라이머는 20 μL PCR 반응액 기준으로 1 pmole 내지 50 pmole 범위의 농도로 사용할 수 있으며, 적절한 프라이머 농도는 당업자가 용이하게 결정할 수 있음이 자명하다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 실험상의 편의, PCR 반응산물에 의한 오염방지, DNA 중합효소와 dNTP의 안정화 및 반응성 향상을 도모하기 위하여 염료 및/또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 염료로는 브로모페놀 블루(Bromophenol blue), 크실렌 시아놀(Xylene cyanole), 브로모크레졸 레드(Bromocresol red) 또는 크레졸 레드(Cresol red) 중 하나 이상을 사용할 수 있고, 안정화제로는 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit, PEG-8000 또는 다가 알콜(Polyol) 중 하나 이상을 사용할 수 있다. 조성물 내의 염료의 함량은 최종 조성물에 대해 0.0001~0.01 중량% 범위일 수 있고, 0.001~0.005 중량% 또는 0.001~0.003 중량%인 것일 수 있다. 또한, 조성물 내의 안정화제는 최종 조성물 내의 농도가 2~1,000 mM 범위일 수 있고, 100~500 mM 또는 100~300 mM 인 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 PCR 프라이머 조성물을 포함하는 TERT의 변이 검출을 위한 키트를 제공한다. 상기 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 키트는 TERT의 변이를 검출함으로써, 유두 갑상선 암의 재발 위험 등을 예측할 수 있으며 이를 통해 일부 뇌종양 환자의 예후와 전이 위험성을 예측할 수 있다. 일 구체예의 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다. 또한, 상기 TERT 변이 검출용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 변이 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이 항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 질량 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 상기 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. 상기 MRM(Multiple reaction monitoring) 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군, 또는 동일 개체의 단백질 발현 수준과 암을 가진 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 또한, 변이 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 암의 발병 여부를 진단할 수 있다.
다른 양상은 상기 프라이머 조성물에 증폭하고자 하는 핵산 주형을 혼합하는 단계; 상기 혼합물에 대한 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 증폭 산물에서 텔로머라제 역전사 효소의 변이를 검출하는 단계를 포함하는 텔로머라제 역전사 효소의 변이를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 증폭 반응은 80 내지 100℃에서 5 내지 25분 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭을 수행하기 위한 온도는 80 내지 100℃, 80 내지 95℃, 80 내지 90℃, 85 내지 100℃, 85 내지 95℃¸또는 87 내지 97℃인 것일 수 있다. 이때, 증폭을 수행하기 위한 온도가 상기 범위 미만인 경우, 비특이적인 산물이 증폭될 수 있다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 증폭 반응이 일어나지 않거나 효율이 떨어지는 문제점이 있다. 또한, 상기 증폭을 수행하기 위한 시간은 5 내지 25분, 5 내지 20분, 5 내지 15분, 5 내지 10분, 10 내지 25분, 10 내지 20분, 또는 15 내지 25분인 것일 수 있다. 이때, 상기 증폭을 수행하기 위한 시간이 상기 범위 미만인 경우, 증폭반응이 일어나지 않거나 효율이 떨어지는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 비특이적인 산물이 증폭될 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 상기 증폭 반응은 35 내지 45 사이클 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭 반응은 35 내지 45 사이클, 35 내지 42 사이클, 35 내지 40 사이클, 37 내지 45 사이클, 37 내지 42 사이클, 38 내지 42 사이클, 또는 40 내지 45 사이클 동안 수행되는 것일 수 있다. 이때, 증폭 사이클이 상기 범위 미만인 경우, 증폭반응이 일어나지 않거나 효율이 떨어지는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 비특이적인 산물이 증폭될 수 있다는 문제점이 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 증폭 반응 시에 베타인(betaine)을 추가로 첨가하는 것일 수 있다. 상기 베타인 시약은 주형 DNA에 G+C 비율이 높거나 반복적인 염기 배열, 또는 복잡한 구조로 인해 발생되는 PCR의 효율 저하 및 비특이적 증폭 문제 등을 해결하기 위해 사용되는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 프라이머 조성물을 이용할 경우, 종래 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행할 때와 비교하여 증폭 효율이 우수하다는 이점이 있다. 구체적으로, 종래 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행할 경우, second PCR을 이용하여 2차 PCR을 수행하여야 하는데, 일 양상에 따른 프라이머 조성물을 사용하여 PCR 반응을 수행할 경우에는 1회 실시만으로도 증폭이 가능하다. 또한, 손상된 DNA에 대하여도 증폭이 가능하므로 더 정확한 증폭 산물을 얻을 수 있으며 실험 수행자에 상관없이 일정한 결과를 얻을 수 있다.
텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 PCR 프라이머 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 이용하여 특정 조건에서 tert 유전자를 증폭시킬 수 있는 바, TERT의 변이를 검출할 수 있다. 또한, 증폭산물의 크기가 비교적 큼에도 불구하고 FFPF(formalin-fixed paraffin-embedded) 조직에서의 변이를 효과적으로 검출할 수 있다.
도 1은 텔로머라제 역전사 효소의 프로모터 지역의 유전자 서열 및 및 돌연변이 위치를 표시한 그림이다. 유전자 서열에서 노란색 음영 처리된 부분은 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 위치를 나타내며, 프로모터의 124번째 및 146번째 뉴클레오티드인 C를 나타낸다.
도 2a는 TERT 유전자 야생형의 염기서열을 표시한 그림이다. 화살표는 각각 야생형의 146 및 124 번째 뉴클레오티드(C)를 표시한 것이다.
도 2b는 TERT 유전자의 제1 돌연변이 서열을 표시한 그림이다. 제1 돌연변이는 146번째 위치한 뉴클레오티드인 C가 T로 치환된 것이다.
도 2c는 TERT 유전자의 제2 돌연변이 서열을 표시한 그림이다. 제2 돌연변이는 124번째 위치한 뉴클레오티드인 C가 T로 치환된 것이다.
도 3a는 비교예 1의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 표시한 그림이다.
도 3b는 비교예 1의 프라이머 서열을 사용하여 TERT 유전자 증폭을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 비교예 2의 역방향 프라이머 서열을 표시한 그림이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. TERT의 변이 검출을 위한 프라이머 설계
텔로머라제 역전사 효소의 변이를 검출하기 위한 PCR 증폭 반응을 수행하기 위하여 프라이머 디자인을 설계하였다. 먼저, primer 3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)에 접속하여 타겟으로 하는 텔로머라제 역전사 효소의 뉴클레오타이드 시퀀스를 입력하였다. 다음으로 general settings에서 프라이머 크기 (250-400bp), 온도(60℃), primer GC%(50)등의 조건을 입력한 후, pick primer를 클릭하였다. 도출된 여러 종류의 중에서, 본 발명의 조건과 맞는 프라이머를 선택하였다. .
실시예 2. TERT의 변이 검출 확인
상기 실시예 1에서 설계한 프라이머를 이용하여 텔로머라제 역전사 효소의 변이를 검출하였다. 5X band doctor를 포함하여 PCR mixture를 만든 후, PCR 조성이 완성되면 PCR 기계를 이용하여 DNA를 증폭시켰다. PCR 반응 조건은 일반적인 조건으로 수행하였다. 구체적으로, PCR 믹스 (10pM 정방향 및 역방향 프라이머 각각 1㎕, 10X 반응 완충액 2 ㎕, 5 mM dNTP 2㎕, 50U/㎕ Taq polymerase 1㎕)에 위의 주형 7㎕와 H2O 6㎕를 섞어 반응액을 준비한다. 다음으로, 95℃에서 15분, 95℃에서 20초, 58℃에서 40초, 72℃에서 1분의 과정을 40회 반복하였다. 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm 이상에서 10초 정도 스핀다운 하여 뚜껑에 묻어있는 용액을 떨구고, 증폭된 PCR 산물을 0.2% 아가로즈 겔에 넣은 후, 100V에서 전기영동을 실시하였다.
도 2d는 실시예 1의 프라이머를 이용해 텔로머라제 역전사 효소의 변이를 증폭한 후, 아가로즈 겔에 전기영동한 결과이다. 도 2d에서 M; 100 bp 래더마커, S; 시료, POS; 양성 대조군, NEG; 음성대조군을 나타낸다.
도 2d에 나타난 바와 같이, 증폭된 PCR 산물은 346bp인 것을 확인할 수 있었다.
[비교예]
비교예 1. 갑상선 암에서의 TERT 변이 검출용 프라이머를 사용한 경우
Highly prevalent TERT promoter mutations in aggressive thyroid cancers(2013.09.24 자 공개) 문헌에 개시된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 TERT의 변이를 검출하였다.
도 3a는 비교예 1의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 표시한 그림이다. 정방향 및 역방향 프라이머의 위치를 각각 하늘색 박스로 표시하였고, 역방향 프라이머의 위치는 표적 위치와 매우 가까우므로 진단랩에서 역방향 프라이머를 이용하여 시퀀싱할 경우 표적 지역의 증폭이 불가능하다.
도 3b는 비교예 1의 프라이머 서열을 사용하여 TERT 유전자 증폭을 수행한 결과를 나타낸다. 비교예 1의 프라이머 서열을 사용하여 TERT 유전자의 증폭을 수행한 경우, 시퀀싱 결과의 판독이 불가능하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
비교예 2. 신경교종에서의 TERT 변이 검출용 프라이머를 사용한 경우
TERT promoter mutations occur frequently in gliomas and a subset of tumors derived from cells with low rates of self-renewal(2013.02.26 자 공개) 문헌에 개시된 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 TERT의 변이를 검출하였다.
도 4는 비교예 2의 역방향 프라이머 서열을 표시한 그림이다. 공지된 비교예 2의 정방향 프라이머 서열은 오류가 있는 것으로 뉴클레오티드의 위치를 찾을 수 없다. 따라서, 비교예 2의 텔로머라제 역전사 효소의 뉴클레오티드 염기 서열에서, 실시예 1의 정방향 프라이머와 100% 일치하는 서열을 찾을 수 없는바, 프라이머에 의한 서열 증폭이 불가능하다.
비교예 3. 비교예 1 및 2의 프라이머를 혼합하여 사용한 경우
상기 비교예 1의 정방향 프라이머 및 비교예 2의 역방향 프라이머를 사용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 TERT의 변이를 검출하였다.
그 결과, 비교예 1 및 2와 마찬가지로 판독이 불가능하거나 실시예 1의 프라이머와 100% 일치하는 서열을 찾을 수 없었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Samsung Life Public Welfare Foundation <120> PCR primer composition for detecting mutation of telomerase reverse transcriptase and uses thereof <130> PN126718 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TERT <400> 1 agtggattcg cgggcacaga 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TERT <400> 2 agcacctcgc ggtagtgg 18 <210> 3 <211> 577 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TERT <400> 3 gcgcgggcgg ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg 60 ggccaggccg ggctcccagt ggattcgcgg gcacagacgc ccaggaccgc gcttcccacg 120 tggcggaggg actggggacc cgggcacccg tcctgcccct tcaccttcca gctccgcctc 180 ctccgcgcgg accccgcccc gtcccgaccc ctcccgggtc cccggcccag ccccctccgg 240 gccctcccag cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc tctcctcgcg gcgcgagttt 300 caggcagcgc tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca cccccgcgat 360 gccgcgcgct ccccgctgcc gagccgtgcg ctccctgctg cgcagccact accgcgaggt 420 gctgccgctg gccacgttcg tgcggcgcct ggggccccag ggctggcggc tggtgcagcg 480 cggggacccg gcggctttcc gcgcgctggt ggcccagtgc ctggtgtgcg tgccctggga 540 cgcacggccg ccccccgccg ccccctcctt ccgccag 577

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 텔로머라제 역전사 효소(Telomerase reverse transcriptase, TERT)의 변이 검출을 위한 PCR 프라이머 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 변이는 서열번호 3으로 표시되는 유전자의 124 번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환된 것; 및 서열번호 3으로 표시되는 유전자의 146번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환된 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 반응용 완충용액, dNTP, 또는 DNA 중합효소를 포함하는 것인 조성물.
  4. 청구항 1의 프라이머 조성물을 포함하는 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출을 위한 키트.
  5. 청구항 1의 프라이머 조성물에 TERT 유전자의 핵산 주형을 혼합하는 단계;
    상기 혼합물에 대한 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
    증폭 산물에서 텔로머라제 역전사 효소의 변이를 검출하는 단계를 포함하는 텔로머라제 역전사 효소의 변이를 검출하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 증폭 반응은 80 내지 100℃에서 5 내지 25분 동안 수행되는 것인 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 증폭 반응은 35 내지 45 사이클 동안 수행되는 것인 방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하는 단계에서, 베타인(betaine)을 추가로 첨가하는 것인 방법.
  9. 청구항 5에 있어서, 상기 증폭 산물의 크기는 330 내지 400bp인 것인 방법.
KR1020190107643A 2019-08-30 2019-08-30 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도 KR20210026616A (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190107643A KR20210026616A (ko) 2019-08-30 2019-08-30 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도
US17/638,609 US20220333207A1 (en) 2019-08-30 2020-08-26 Pcr primer composition for detecting mutation of telomerase reverse transcriptase, and use thereof
PCT/KR2020/011395 WO2021040404A1 (ko) 2019-08-30 2020-08-26 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도
KR1020210078170A KR102406618B1 (ko) 2019-08-30 2021-06-16 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190107643A KR20210026616A (ko) 2019-08-30 2019-08-30 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210078170A Division KR102406618B1 (ko) 2019-08-30 2021-06-16 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210026616A true KR20210026616A (ko) 2021-03-10

Family

ID=74685686

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190107643A KR20210026616A (ko) 2019-08-30 2019-08-30 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도
KR1020210078170A KR102406618B1 (ko) 2019-08-30 2021-06-16 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210078170A KR102406618B1 (ko) 2019-08-30 2021-06-16 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220333207A1 (ko)
KR (2) KR20210026616A (ko)
WO (1) WO2021040404A1 (ko)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101832948B1 (ko) * 2013-02-18 2018-02-28 듀크 유니버시티 신경교종 및 종양의 서브세트 내 tert 프로모터 돌연변이
WO2015153808A1 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 The Johns Hopkins University Tert and braf mutations in human cancer

Also Published As

Publication number Publication date
US20220333207A1 (en) 2022-10-20
WO2021040404A1 (ko) 2021-03-04
KR20210075954A (ko) 2021-06-23
KR102406618B1 (ko) 2022-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Green et al. Developmental validation of the Quantifiler™ real-time PCR kits for the quantification of human nuclear DNA samples
US11674186B2 (en) Synthetic nucleic acid control molecules
EP2314717B1 (en) Polynucleotide primers for the detection of mutations in EGFR
WO2017134455A1 (en) Biological methods for diagnosing active tuberculosis or for determining the risk of a latent tuberculosis infection progressing to active tuberculosis and materials for use therein
CN113881806A (zh) 基于CRISPR/Cas12a技术检测新冠病毒和69/70突变株的方法及试剂盒
US20230323464A1 (en) Method for predicting prognosis of patients having early breast cancer
KR102406618B1 (ko) 텔로머라제 역전사 효소의 변이 검출용 pcr 프라이머 조성물 및 이의 용도
KR101935018B1 (ko) 급성관동맥증후군 후 우울증 발병 위험성 예측용 마커 및 이의 용도
Saberzadeh et al. Genetic variations of 21 STR markers on chromosomes 13, 18, 21, X, and Y in the south Iranian population
KR101998252B1 (ko) 난소암 진단용 바이오마커 및 이의 용도
CN112029836A (zh) 检测braf基因突变的核酸组合物及试剂盒和braf基因突变的检测方法
KR20220056665A (ko) 현미부수체 불안정성 진단용 마커 조성물 및 프라이머 세트
KR102011970B1 (ko) 난소암의 진단을 위한 t 세포 관련 바이오마커
KR102011972B1 (ko) 난소암의 치료 또는 수술 후의 재발 예측을 위한 바이오마커
KR102011971B1 (ko) 발현수준의 차이를 나타내는, 난소암 진단용 바이오마커
KR102042710B1 (ko) 면역체크 포인트와 관련된, 난소암 진단용 바이오마커
CN112176067B (zh) 一种基于Y-STR基因座和Y-Indels基因座的复合扩增体系及其使用的引物组合
CN110396540B (zh) 一种血友病基因突变位点的检测方法
Koksal et al. A tetra-primer polymerase chain reaction approach for the detection of JAK2 V617F mutation
Genuardi et al. Targeted Locus Amplification as Marker Screening Approach to Detect Immunoglobulin (IG) Translocations in B-Cell Non-Hodgkin Lymphomas
WO2015066530A1 (en) Methods for nucleic acid amplification
Abdalrahman et al. Using a Rapid, Accurate, and Cost-Effective QiaXcel Advanced Platform for Microsatellite Instability Detection in Colorectal Carcinoma in North of Iraq.
Munkhtogtokh et al. Combination of upstream primer-multuplex PCR (UP-mpcr) and capillary electrophoresis for equine genetic analysis
REPEAT et al. REPLICATIVE RNA REPORTER SYSTEMS
飯島将司 New molecular diagnostic kit to assess Y-chromosome deletions in the Japanese population

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X601 Decision of rejection after re-examination
A107 Divisional application of patent