KR102011971B1 - 발현수준의 차이를 나타내는, 난소암 진단용 바이오마커 - Google Patents

Abstract

난소암 진단을 위한 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 조성물, 키트, 및 방법에 의하면, 난소암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 수술 또는 치료 후 환자 난소암 조직의 유전자 발현도를 기준으로 예후를 예측할 수 있도록 함으로써, 난소암 환자가 적절한 예후 조치를 받는 것을 가능하게 할 수 있다. 또한, 동양인 특히, 한국인 난소암 환자들의 유전자 프로파일링 데이터를 확보하고 상기 데이터를 분석함으로써, 종래 서양인의 데이터를 기반으로 이루어지고 있는 난소암 환자들의 예후 예측의 문제점을 극복할 수 있다.

Description

발현수준의 차이를 나타내는, 난소암 진단용 바이오마커{Biomarkers for the diagnosis of ovarian cancer, indicating differences in expression levels}

난소암 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

난치성 난소암(high-grade serous ovarian cancer) 환자의 70%는 대부분 암으로 인해 사망에 이르게 된다. 표준치료란, 수술 이후에 받게 되는 항암 요법이다. 항암치료 이후 6개월 이내에 약 25%의 환자들에게서 암이 재발하고, 5년 이상 생존할 확률이 31%에 불과하므로, 표준치료 외의 새로운 치료법 개발이 필요한 상황이다. 암 유전체지도(The Cancer Genome Atlas, TCGA) 연구자 컨소시엄에서는 새로운 치료법 개발을 위해 약 300명의 난소암 환자들을 대상으로 엑솜 데이터(exome data)와 mRNA 발현데이터 및 후성유전학(epigenetics) 데이터를 생산하고 분석함으로써 환자들의 특징을 파악하였다. 그러나, 상기 연구에는 환자들 대부분이 유럽인들이라는 것과 이들 데이터 분석에서는 예후의 큰 차이를 보이는 환자 클러스터 또는 유전자 발현 마커 리스트를 찾지 못했다는 문제점이 있다.

본 발명자들은 다양한 병기의 한국인 난소암 환자들의 데이터를 확보하고 분석하여, 난소암에서의 새로운 발현 유전자리스트를 선별함으로써, 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 AIM2, CD2, CD244, CD27, CD274, CD40, CD68, CD8A, CSF2RB, CSF3R, CTLA4, CXCR3, EVI2B, FOXL2, GZMA, GZMB, HAVCR1, IDO1, IL1R2, IL2RA, IL32, IL6, IRF8, LAG3, LTB, MNDA, PDCD1, PDCD1LG2, PRF1, RASGRP1, SELL, SLAMF1, SOD2, TAP1, TIGIT, TNFRSF6B 또는 TNFSF15의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 AIM2, CD2, CD244, CD27, CD274, CD40, CD68, CD8A, CSF2RB, CSF3R, CTLA4, CXCR3, EVI2B, FOXL2, GZMA, GZMB, HAVCR1, IDO1, IL1R2, IL2RA, IL32, IL6, IRF8, LAG3, LTB, MNDA, PDCD1, PDCD1LG2, PRF1, RASGRP1, SELL, SLAMF1, SOD2, TAP1, TIGIT, TNFRSF6B 또는 TNFSF15의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 를 포함하는 난소암 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 AIM2, CD2, CD244, CD27, CD274, CD40, CD68, CD8A, CSF2RB, CSF3R, CTLA4, CXCR3, EVI2B, FOXL2, GZMA, GZMB, HAVCR1, IDO1, IL1R2, IL2RA, IL32, IL6, IRF8, LAG3, LTB, MNDA, PDCD1, PDCD1LG2, PRF1, RASGRP1, SELL, SLAMF1, SOD2, TAP1, TIGIT, TNFRSF6B 또는 TNFSF15의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소암 진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 일 양상에서의 진단은 난소암의 여부 및/또는 그 정도, 즉, 진행 상태를 확인하는 것이며, 치료 또는 수술 후의 예후, 즉 재발 가능성의 여부를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 난소암을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 난소암을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히, 본 명세서에서는 본 발명의 난소암을 가지는 개체로부터 분리된 조직에서 변화되는 단백질 또는 유전자일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제"는 난소암 환자에서 증가 또는 감소하는 마커인 AIM2, CD2, CD244, CD27, CD274, CD40, CD68, CD8A, CSF2RB, CSF3R, CTLA4, CXCR3, EVI2B, FOXL2, GZMA, GZMB, HAVCR1, IDO1, IL1R2, IL2RA, IL32, IL6, IRF8, LAG3, LTB, MNDA, PDCD1, PDCD1LG2, PRF1, RASGRP1, SELL, SLAMF1, SOD2, TAP1, TIGIT, TNFRSF6B 또는 TNFSF15의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출 및/또는 정량에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 구체적으로, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 예를 들어, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다. 이때, 상기 유전자들의 핵산 정보는 Genebank 등에 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하고, 상세하게는 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 마커의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 예를 들어, 상기 마커 유전자가 코딩하는 단백질 또는 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으며, 상기 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한 본 명세서의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공한다. 상기 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 구체적으로, 상기 키트는 난소암 진단 마커인 AIM2, CD2, CD244, CD27, CD274, CD40, CD68, CD8A, CSF2RB, CSF3R, CTLA4, CXCR3, EVI2B, FOXL2, GZMA, GZMB, HAVCR1, IDO1, IL1R2, IL2RA, IL32, IL6, IRF8, LAG3, LTB, MNDA, PDCD1, PDCD1LG2, PRF1, RASGRP1, SELL, SLAMF1, SOD2, TAP1, TIGIT, TNFRSF6B 또는 TNFSF15의 단백질 발현 수준을 그 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현양을 측정함으로써, 난소암을 진단할 수 있다. 상기 키트에는 난소암 진단 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제, 예를 들어, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제, 예를 들어, 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항체의 면역결합단편을 포함할 수 있다.

일 구체예의 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

또한, 상기 난소암 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 LISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 질량 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 상기 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. 상기 MRM(Multiple reaction monitoring) 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군, 또는 동일 개체의 단백질 발현 수준과 난소암을 가진 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 또한, 난소암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 난소암의 발병 여부를 진단할 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 AIM2, CD2, CD244, CD27, CD274, CD40, CD68, CD8A, CSF2RB, CSF3R, CTLA4, CXCR3, EVI2B, FOXL2, GZMA, GZMB, HAVCR1, IDO1, IL1R2, IL2RA, IL32, IL6, IRF8, LAG3, LTB, MNDA, PDCD1, PDCD1LG2, PRF1, RASGRP1, SELL, SLAMF1, SOD2, TAP1, TIGIT, TNFRSF6B 또는 TNFSF15의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 를 포함하는 난소암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

일 구체예의 정보제공방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 AIM2, CD2, CD244, CD27, CD274, CD40, CD68, CD8A, CSF2RB, CSF3R, CTLA4, CXCR3, EVI2B, FOXL2, GZMA, GZMB, HAVCR1, IDO1, IL1R2, IL2RA, IL32, IL6, IRF8, LAG3, LTB, MNDA, PDCD1, PDCD1LG2, PRF1, RASGRP1, SELL, SLAMF1, SOD2, TAP1, TIGIT, TNFRSF6B 또는 TNFSF15의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현양 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현양을 측정함으로써 알 수 있다. 개체의 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 것은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 적절히 수행할 수 있다. 예를 들어, 개체의 난소암 조직을 단백질 추출용 버퍼 또는 핵산 추출용 버퍼로 균질화한 다음, 원심부리 후, 얻어진 상등액을 개체의 시료로 사용할 수 있다. 상기 개체는 난소암의 진단 또는 난소암 치료 후의 예후, 즉 재발 여부를 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 또는 인간 (Homo sapiens)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 한국인일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있다. 상기 mRNA 발현 수준의 측정은, 예를 들어, 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)을 이용할 수 있다. 또한, 상기 단백질 발현 수준의 측정은, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅(Wetern blotting), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay) 또는 면역형광법(immunofluorescence)을 이용할 수 있다.

일 구체예의 정보제공방법은 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 난소암 환자의 시료에서 마커 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 정상 대조군의 동일한 마커 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하여 비교함으로써, 환자 시료에서 마커 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 더 증가하거나 또는 더 감소하는 정도에 따라 난소암 여부 및 그 정도를 측정할 수 있으며, 상기 난소암 환자가 치료 또는 수술 후의 환자일 경우, 재발 여부를 예측할 수 있다.

일 양상의 바이오마커는 난소암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 수술 또는 치료 후 난소암 환자 조직의 유전자 발현도를 기준으로 예후를 예측할 수 있도록 함으로써, 난소암 환자가 적절한 예후 조치를 받는 것을 가능하게 할 수 있다. 또한, 동양인 특히, 한국인 난소암 환자들의 유전자 프로파일링 데이터를 확보하고 상기 데이터를 분석함으로써, 종래 서양인의 데이터를 기반으로 이루어지고 있는 난소암 환자들의 예후 예측의 문제점을 극복할 수 있다.

도 1은 난소암 예후예측용 바이오마커 선별방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 난소암 예후에 따라 발현량의 차이가 큰 유전자들의 네트워크를 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 준비예 ]

연구에 사용된 환자 샘플은 분당차병원에서 난소암 수술을 받은 환자들로, Institutional Review Board의 승인심사를 거쳐 상기 환자들의 조직을 수득하였으며, 각 샘플의 정보를 하기 표 1에 나타냈다. 하기 표 1에 나타난 54명의 환자 중 예후가 좋은 환자는 17명, 난소암이 재발한 환자는 29명이고, 항암치료에 반응하지 않아 예후가 좋지 않은 환자는 8명이다.

특징	구분	환자 수 (54)
나이	<40	3
	[40 ~ 50)	15
	[50 ~ 60)	23(43.4%)
	[60 ~ 70)	6
	[70 ~ 80)	7
병기	I	4
	II	2
	III	44 (81.5%)
	IV	3
	NA	1

[ 실시예 ]

실시예 1. 데이터 생성 및 1차 유전자리스트 선별

상기 준비예에서 수득한 환자 54명에 대하여, Illumina HiSeq2500를 이용하여 전체 유전체 발현(whole-mRNA sequencing, RNAseq) 데이터를 생성하였다. 이후, mRNA 발현 프로파일링(profiling) 분석을 통해 상기 전체 유전체 발현 데이터에서 난소암 치료 예후에 따라 발현 차이가 큰 유전자 471개를 선별하고, mRNA 발현을 분석하였다. 구체적으로, The Cancer Genome Atlas (TCGA)의 mRNA sequencing pipeline을 사용하여 mRNA의 발현을 분석하였다. 또한, MapSplice v2.1.6을 사용하여 Transcript에 매핑(mapping)하고 RSEM-1.2.5 및 NCBI hg19 RefSeq을 사용하여서 상기 471개 각각 유전자에 대한 mRNA의 양을 측정하였다. 이후, 예후가 좋지 않은 난소암 환자 37명에서 발현이 감소한 분자생물학적 경로 및 이들에서 발현이 통계학적으로 유의미하게 변한 유전자를 하기 표 2에 나타냈다.

KEGG 경로	p-값	보정된 p-값	유전자 리스트
사이토카인-사이토카인 리셉터 상호작용(Cytokine-cytokine receptor interaction)	6.08E-08	1.13E-15	IFNG, CSF3, CD27, CCL4L2, CCL4, IL1B, IL2RA, TNFSF15, TNFRSF6B, CCR5, CXCR1, IL6, CXCR6, FASLG, MET, CXCL5, CXCL9, TNFRSF1B, CXCR2, CSF3R, IL2RG, TNFRSF10C, IL12RB1, CCL5, CD40, IL1R2, CXCL3, LTB, IL21R, CXCR3, CCL18, IL2RB, TNFRSF14, CSF2RB
NK 세포 매개 세포독성(Natural killer cell mediated cytotoxicity)	4.06E-15	7.52E-13	CD244, ITGAL, IFNG, KIR2DL4, HCST, FCER1G, FASLG, ICAM2, RAC2, LCP2, TNFRSF10C, PRF1, ITGB2, GZMB, VAV1, KIR2DS4, CD48, FCGR3B, ZAP70, KLRD1, MICB, KLRK1, LCK
조혈세포 계통(Hematopoietic cell lineage)	1.55E-11	2.85E-09	CD38, IL1R2, CD2, CD3D, CD8B, CD5, CD8A, IL6, CSF3, FCGR1A, IL2RA, IL1B, CD7, CD3G, CSF3R, CD3E
케모카인 신호 경로(Chemokine signaling pathway)	2.44E-10	4.46E-08	CCL5, VAV1, CXCL3, CCL18, GNAI1, FGR, CXCR3, DOCK2, HCK, CCL4, NCF1, WAS, CCL4L2, ITK, CXCR1, CCR5, CXCL5, CXCR6, RAC2, CXCR2, CXCL9
T 세포 신호 경로(T cell receptor signaling pathway)	4.54E-10	8.27E-08	CD8A, PDCD1, LCK, ZAP70, CD8B, RASGRP1, CD3D, VAV1, CD3E, CD3G, LCP2, GRAP2, IFNG, PTPRC, CTLA4, ITK
1차 면역결핍(Primary immunodeficiency)	1.07E-09	1.93E-07	PTPRC, IL2RG, CD3E, CD3D, CD40, LCK, ZAP70, CD8B, CD8A, TAP1
세포접착 분자(Cell adhesion molecules)	7.06E-08	1.27E-05	CD274, CD8B, CD8A, PDCD1, SPN, ITGB2, CD2, CD40, PDCD1LG2, ICAM2, ITGB7, SELL, PTPRC, ITGAL, CTLA4
보체(Complement) 및 응고 캐스케이드(coagulation cascades)	6.85E-05	1.21E-02	C4BPA, TFPI, FGA, C1QA, SERPINA1, C1QC, C1QB, FGB
톨 유사 리셉터 신호 경로(Toll like receptor signaling pathway)	2.07E-04	3.63E-02	TLR8, IL6, IL1B, CCL4, CXCL9, LBP, TLR2, CCL5, CD40

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 대부분의 분자생물학적 경로는 면역반응과 관련된 것으로, 상기 면역반응과 관련된 유전자의 발현이 유의하게 변화한 것을 확인할 수 있었다. 이후, 상기 471개 유전자에 대하여, HumanNet(웹서버) 및 Cytoscape v.3 를 이용하여, 유전자 네트워크를 구축하였다. 구체적으로, 유전자 네트워크의 유전자 노드의 색은 유전자 발현량의 차이를 나타내는 log(fold-change)로 표시하고, 하늘색이 진할수록 예후가 좋지 않은 환자 그룹에서 그 발현이 감소한 유전자이고, 노란색이 진할수록 예후가 좋지 않은 환자 그룹에서 그 발현이 증가한 유전자를 나타낸 것이다. 또한, 네트워크에서 두 개의 유전자가 서로 연결되어 있는 것은 서로 같은 기능을 가지고 있음을 의미한다. 이후, 상기 네트워크 및 표 2에 나타난 유전자와의 관계를 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 예후가 좋지 않은 난소암 환자들에게서 발현이 감소한 유전자(도 2의 하늘색 노드)는 네트워크에서 서로 통계적으로 유의한 정도로 긴밀하게 연결되어(Area Under a ROC curve: 0.74, p-value: 1.15e-55) 기능적인 모듈처럼 작동하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 표 2의 유전자는 대부분 면역 기능과 관련된 유전자이므로, 도 2의 네트워크는 난소암 치료를 위해 작동하는 면역 모듈인 것으로 판단된다.

실시예 2. 발현 유전자 마커 선별

상기 실시예 1에서 선별된 유전자 중, 하기 세 가지 기준을 충족하는 발현유전자 마커리스트를 선별하였다. 구체적으로, 환자의 예후에 따라 발현 차이가 큰 유전자를 선별하기 위하여 edgeR 방법을 사용하여 발현 차이의 통계적 유의성을 측정하였다. 발현 차이가 큰 유전자는 fold change 2가 이상이면서, false discovery raterk 0.05 미만인 유전자이다. 상기 471개 유전자의 기능은 KEGG 분자생물학 경로를 이용하여 분석하였으며, 통계적 유의성은 Fisher's exact test를 사용하였다. 또한, 사람의 기능유전자 분석 네트워크는 웹에서 제공되는 서버 HumanNet(http://www.functionalnet.org/humannet/)을 이용하였다.

첫째, 통계적으로 유의미한 정도가 매우 높은 상위 50개 유전자 중에서, membrane receptor로서 세포작용에 중요하면서 동시에 마커로서 가치가 높은 11개의 유전자를 우선적으로 선별하였다. 둘째, 표준치료에 적합한 환자나 그렇지 못한 환자뿐만 아니라, 면역치료에 적합할 것으로 예상되는 환자들을 선별하기 위해 발현의 차이를 보이는 유전자 중에서 면역반응의 특징을 대표할 수 있는 23개의 유전자를 선별하였다. 셋째, 면역체크포인트(immune checkpoint) 유전자로 알려진 8개의 유전자를 선별하였으며, 상기 세 가지 조건에 의해 선별된 37개 유전자의 특징을 하기 표 3에 나타냈다. 이때, 선별된 상기 유전자들은 상기 세 가지 조건에 중복하여 충족될 수 있다. 예를 들어, CD274 또는 GZMB와 같은 유전자는 상위 50위 안에 포함되는 유전자인 동시에, 면역반응을 대표하거나 또는 면역체크포인트 유전자에 해당한다.

유전자	log(fold-change)	p-값	false discovery rate	특징
AIM2	-1.83	1.68.E-04	1.19.E-02	면역체크포인트
CD2	-1.56	2.76.E-04	1.64.E-02	T 세포 활성
CD244	-1.39	1.26.E-03	4.17.E-02	T 세포 활성억제
CD27	-1.45	3.58.E-04	1.97.E-02	T 세포 활성
CD274	-2.18	9.06.E-08	5.56.E-05	발현차이 상위유전자, APC, T세포 억제
CD40	-1.17	3.74.E-05	4.61.E-03	APC 활성
CD68	-1.10	8.10.E-04	3.29.E-02	대식세포
CD8A	-2.15	7.24.E-07	2.43.E-04	CD8+ T 세포
CSF2RB	-2.11	6.25.E-07	2.33.E-04	발현차이 상위유전자
CSF3R	-2.03	3.77.E-07	1.62.E-04	발현차이 상위유전자
CTLA4	-1.53	4.98.E-04	2.42.E-02	CD4+ T 세포, 면역체크포인트
CXCR3	-1.42	5.66.E-04	2.63.E-02	수지상세포
EVI2B	-1.13	9.02.E-04	3.42.E-02	호중성 과립구
FOXL2	2.43	1.17.E-03	4.02.E-02	암 유전자
GZMA	-1.94	2.55.E-05	3.53.E-03	Cytolytic Activity
GZMB	-2.45	1.99.E-07	1.09.E-04	발현차이 상위유전자, 수지상세포
HAVCR1	-4.62	4.17.E-08	3.06.E-05	발현차이 상위유전자
IDO1	-2.51	3.75.E-06	8.44.E-04	면역체크포인트
IL1R2	-3.22	5.81.E-10	9.98.E-07	발현차이 상위유전자
IL2RA	-2.24	6.36.E-07	2.33.E-04	발현차이 상위유전자
IL32	-1.27	1.72.E-04	1.20.E-02	CD4+ T 세포
IL6	-3.77	1.12.E-08	1.01.E-05	발현차이 상위유전자
IRF8	-1.68	1.77.E-06	4.94.E-04	수지상세포
LAG3	-1.50	4.11.E-04	2.12.E-02	T 세포 억제
LTB	-3.35	1.23.E-10	3.53.E-07	발현차이 상위유전자
MNDA	-1.24	3.93.E-04	2.07.E-02	호중성 과립구
PDCD1	-1.87	1.63.E-05	2.50.E-03	면역체크포인트
PDCD1LG2	-1.55	1.74.E-04	1.20.E-02	APC 억제
PRF1	-2.19	1.09.E-06	3.42.E-04	Cytolytic Acitivity
RASGRP1	-1.45	7.11.E-07	2.43.E-04	발현차이 상위유전자
SELL	-1.50	1.70.E-04	1.19.E-02	호중성 과립구
SLAMF1	-1.54	3.51.E-04	1.97.E-02	APC, T세포 활성
SOD2	-1.33	9.94.E-05	8.30.E-03	발현차이 상위유전자
TAP1	-1.05	4.31.E-04	2.17.E-02	MHC
TIGIT	-1.60	9.49.E-05	8.21.E-03	T 세포 억제, 면역체크포인트
TNFRSF6B	-3.53	1.64.E-12	2.82.E-08	발현차이 상위유전자
TNFSF15	-1.51	9.55.E-04	3.56.E-02	APC 억제

따라서, 일 양상의 선별방법에 의해 선별된 유전자 마커의 발현 프로파일링을 통해, 난소암 환자들의 치료 예후를 효과적으로 예측할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (1)

1. CD274, CSF2RB, CSF3R, GZMB, HAVCR1, IL1R2, IL2RA, IL6, LTB, RASGRP1, SOD2 및 TNFRSF6B의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소암의 치료 또는 수술 후의 재발 예측용 조성물.

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