BRPI0414030B1 - método para detectar desordens neoplásicas, dispositivos de diagnóstico in vitro, dispositivo híbrido de captura, uso de uma fase sólida, métodos para desenvolver kits e métodos para avaliação de diagnóstico de desordens neoplásicas - Google Patents

Abstract

"método para detectar desordem neoplásicas em uma amostra corporal solubilizada". a presente invenção se refere a um método para diagnóstico precoce de desordens neoplásicas tais como cânceres, bem como seus estágios precursores, particularmente cânceres do trato respiratório, sistema urinário, trato reprodutivo, câncer associado com infecção por hpv ou câncer do trato anogenital, a partir de amostras solubilizadas. a invenção está também direcionada para kits de teste úteis para essa finalidade, bem como dispositivos de diagnóstico in vitro. o desenvolvimento desses kits e dispositivos de diagnóstico in vitro para a finalidade acima também é um aspecto da presente invenção.

Description

“MÉTODO PARA DETECTAR DESORDENS NEOPLÁSICAS, DISPOSITIVOS DE DIAGNÓSTICO IN VITRO, DISPOSITIVO HÍBRIDO DE CAPTURA, USO DE UMA FASE SÓLIDA, MÉTODOS PARA DESENVOLVER KITS E MÉTODOS PARA AVALIAÇÃO DE DIAGNÓSTICO DE DESORDENS NEOPLÁSICAS” [001] A presente invenção se refere a um método para diagnóstico precoce de desordens neoplásicas tais como cânceres e seus estágios precursores, particularmente, cânceres que afetam as vias respiratórias, o sistema urinário, o aparelho reprodutivo, câncer associado com infecção por HPV ou câncer das zonas anogenitaís, a partir de amostras corporais solubilizadas.

Fundamentos da Invenção [002] Programas de prevenção têm sido oferecidos para a maioria dos diferentes cânceres desde meados dos anos cinquenta, Para o câncer do colo do útero existe um amplo programa da população estabelecido em vários países desenvolvidos. Todavia, programas de detecção similares são aplicáveis para outros tipos de câncer e os respectivos estágios precursores tais como e.g, cânceres do sistema urinário, das vias respiratórias e outros. O câncer de colo do útero é usado como um exemplo para ressaltar as desvantagens do presente cenário preventivo. Todavia, os fatos são mutatis mutantis aplicáveis para outros programas preventivos para qualquer tipo de câncer.

[003] Com relação à neoplasia intraepitelial de colo do útero e às lesões glandulares de colo do útero, os programas preventivos são principalmente baseados no exame morto lógico e cito lógico de citologia do cérvix uterino, o que é chamado de teste Papanicolau (Pap), o qual é feito com base em exames ginecológicos de rotina em intervalos regulares na mulher a partir do 20° ano em diante. Por meio da morfología das células, os smears são divididos em vários graus de intensidade de alterações celulares displásicas. De acordo com o teste Pap l-V, esses graus de intensidade são denominados como displasia normal, displasia média, displasia levemente séria, displasia séria e carcinoma invasivo, respectívamente. Se o teste de Pap induzir a um resultado notável, será realizada uma pequena biópsía e um exame histopatológico, através do qual o tipo e intensidade da displasia serão determinados e classificados como neoplasía intraepitelial de colo do útero (CIN1-3).

[004] Apesar de todos os programas preventivos, o câncer de colo do útero que conduz a 400.000 novos casos por ano, é a segunda mais frequente desordem neoplásica na mulher. Isso é inter alia devido ao fato de que até 30% dos resultados do teste Pap individual são falso-negativos.

[005] Na detecção convencional para neoplasía intraepitelial de colo do útero, são usadas zaragatoas (swabs) para detecção de lesões neoplásicas do cérvix uterino. No procedimento de detecção, diferentes tipos de lesões precisam ser distinguidos.

[006] As causas das lesões podem, por exemplo, ser inflamações (devido a agentes infecciosos ou danos físicos ou químicos) ou desordens neoplásicas. Nos exames morfológicos as lesões de diferentes características são difíceis de serem disfinguidas. Assim, para examinar exudados (swabs) e citologia (smears) cervícais, citologistas e patologistas precisam ser especial mente treinados e mesmo examinadores experimentados possuem uma alta variação inter- e intra-observadora na avaliação de um diagnóstico baseado em espécimes citológicos. Em geral, o resultado do exame é baseado na interpretação subjetiva de critérios de diagnóstico pelo patologista de exame/cítologista. Como resultado, a taxa de falso-positivo e falso-negativo nos testes de detecção permanece alta mente insatisfatória.

[007] Todavia, a reprodutibilidade dos resultados de exame pode ser aumentada pelo uso de ferramentas moleculares. Ainda, o problema com a preservação e preparação das amostras pode não ser superada através do uso adicional de marcadores moleculares. Uma outra complicação quando se realiza exames cítológicos e histológicos para fins de detecção e especíalmente quando se aplica métodos para a detecção de marcadores moleculares se origina das cuidadosas precauções na preservação das amostras para não causar artefatos ou resultados impróprios.

[008] Isso é em parte devido à instabilidade da informação moríoiógica baseada na célula e em parte à instabilidade dos marcadores moleculares serem detectados durante os testes. Se as amostras não forem preparadas ou estocadas de maneira apropriada, a informação baseada na célula, ou mesmo a informação molecular pode ser perdida, ou pode ser alterada. Assim, o diagnóstico pode ser impossível, ou pode ser propenso a artefatos. Por exemplo, a interpretação de biópsias, ou preparações citológicas, é frequentemente tomada difícil ou impossível por células danificadas (física ou bio-/quimicamente). Além disso, com relação às amostras de tecidos ou biópsias, a preservação de constituintes moleculares das amostras, que são submetidas a uma rápida modificação, é sofisticada devido ao tempo que decorre até penetração da amostra total pelos preservativos apropriados.

[009] Embora o acima seja mostrado usando câncer de colo do útero como um exemplo os fundamentos totais também se aplicam à programas preventivos de desordens neoplãsicas em geral a medida que o problema de outras entidades cancerosas é quase a mesma. Geralmente, métodos de diagnostico suportados morfo logicamente desenvolvidos rotineiramente na arte mostram duas maiores desvantagens. Primeiramente, os métodos são altamente dependentes da percepção individual dos examinadores. Em segundo lugar, a informação morfológica é totalmente sensível aos processos de deterioração e, assim, à produção de artefatos após preparação das amostras. Ambos os aspectos contribuem para reprodutibilidade imprópria dos resultados.

[010] Consequentemente, é objetivo da presente invenção proporcionar um método pelo qual desordens neoplásícas tais como cânceres e seus estágios precursores possam ser diagnosticados com antecedência e com confiabilidade, Além disso, uma diferenciação deve ser possível por esse método com relação às alterações inflamatórias benignas ou metaplásicas a partir de desordens neoplásícas tais como lesões displásicas e pré-cânceres. Além disso, a presente invenção proporciona métodos para a detecção de cânceres em meio biológico a partir de amostras solubilizadas. As amostras podem ser de qualquer tipo incluindo células em uma solução de preservação de células como é usado para métodos de citologia em meio líquido (Liquid-based cytology - LBC), [011] A descoberta dos inventores que o uso de amostras de LBC como uma fonte de material de amostra para o desenvolvimento de kits de teste de diagnostico para avaliação baseada em bioquímica não celular de diagnóstico de condições médicas relevantes é um outro aspecto da presente invenção. Na arte amostras LBC são usadas para desenvolvimento de formatos de ensaio de base celular. A lise das amostras da forma como aqui descrita, todavia, permite os inventores basear o desenvolvimento dos kits bioquímicos em material de amostra que é adequado para proporcionar informação sobre o andamento da doença nos pacientes a partir de outros procedimentos de diagnostico no mesmo material de amostra.

[012] Um método para detecção de ácidos nucieícos de HPV a partir de amostras LBV é descrito por Digene Corp. Esse método usa amostras LBG como base para a análise. A detecção de ácidos nucleicos de HPV é realizada após lise das células contidas nas amostras LBC. Nesse método nenhuma normalização da quantidade da amostra LBC a ser empregada na detecção em meio bioquímico não celular do ácido nuciéico HPV, é empregada com relação a informação obtida a partir da espécie cito lógica preparada fora da mesma amostra LBC, O método descrito por Digene é, consequentemente, restrito a mera medição quantitativa, Qualquer quantitativo em meio bioquímico não celular ou mesmo método semi-quantitativo necessita informação da composição das amostras obtidas tanto a partir de marcadores bioquímicos como a partir de microscópio ou análise de citometria de fluxo da amostra. Na presente invenção o uso de amostras LBC para a avaliação de diagnostico ou para desenvolvimento de kits e dispositivos para diagnóstico in viiro possibilita uma forma precisa e comparável de proporcionar informação cito lógica para o teste bioquímico de meio não celular, O emprego de normalização bioquímica com relação a marcadores indicativo da presença ou ausência de células ou tipos de células pode ser omitido, A vantagem de usar amostras LBC nesse sentido é que a informação citologícamente baseada na célula é direta em relação à espécie LBC homogênea e, assim, proporciona valiosa informação precisa para uso na avaliação dos resultados dos testes bioquímicos em melo não celular, [013] Um método para detecção de marcadores moleculares a nível de proteína ou de ácido nuciéico a partir de espécimes solubilizadas por outro lado é descrito em várias publicações. Todavia, não é feita nenhuma relação ao uso de amostras LBC como uma fonte da espécie de amostra. Geralmente, métodos LBC são aplicados na arte para possibilitar avaliação aperfeiçoada morfológica das espécimes citológicas. O campo de aplicação das amostras LBC é, consequentemente, indicado somente para citologia. Com base na descrição da preparação do estado da arte de uma amostra LBC para subsequente solubilização da amostra para teste bioquímico não está descrito. Além disso, a descrição quanto às vantagens de procedimentos LBC se afastam da aplicação de amostras LBC em qualquer método que não é encontrado na avaliação morfologica celular dos espécimes. De acordo com os achados dos inventores, o uso de amostras LBC como uma fonte para determinação bioquímica em meio não celular de níveis de proteína em espécimes solubilizadas proporciona a vantagem de que os resultados podem ser diretamente comparados a um espécime citológico. A análise bioquímica a base de proteína nesse sentido pode servir como um, por exemplo, pré-teste ou para proporcionar informação adicional ou mesmo para confirmar um resultado citologicamente equivocado. Em modalidades adicionais, a informação obtida a partir do teste bioquímico em meio não celular pode ser para o desenho dos procedimentos cítológicos a serem aplicados.

[014] O método de desenvolvimento aqui descrito é, assim, de grande valor para alcançar kits eficazes e confiáveis e dispositivos de diagnóstico in-vitro. O método para desenvolvimento de kits e dispositivos de diagnóstico in-vitro, como aqui descrito, atinge comparabilidade dos resultados gerados por análise bioquímica em meio não celular com resultados citologicamente avaliados por meio de normalização. Essa normalização da amostra para aplicação no formato de teste bioquímico é realizada com relação à informação na amostra LBC obtida a partir da espécime cítológica preparada a partir da amostra LBC, Essa informação compreende e.g. celularidade da amostra LBC, informação com relação ao volume da amostra LBC, informação com relação ao volume da amostra LBC, informação com relação à massa da amostra LBC ou com relação aos parâmetros acessíveis somente via a geração de espécime de fina camada fora da amostra LBC. Nesse sentido, os inventores proporcionam, pelos métodos conforme aqui reivindicados, um método confiável para desenvolvimento de kits e dispositivos de diagnóstico in-vítm a base de amostras LBC.

Sumário da Invenção [015] A presente invenção está direcionada para um método para detectar desordens neoplásicas a partir de uma amostra corporal solubilizada de um indivíduo humano. O método compreende as etapas de: (a) obter uma amostra corporal a partir de um indivíduo humano; (b) solubilizar a amostra corporal de um indivíduo humano em um meio de lise; e, (c) determinar a sobre-expressão de um inibidor de quinase dependente de ciclina na amostra corporal solubilizada pela comparação do nível do dito inibidor de quinase dependente de ciclina dentro da dita amostra corporal solubilizada com o nível presente em uma amostra corporal humana saudável solubilizada. As amostras para uso no método da presente invenção pode ser de qualquer tipo incluindo células em uma solução de preservação de células como é usado para métodos de citología em meio líquido.

[016] A presente invenção é ainda direcionada para um kit de teste para determinar o nível de inibidores de quinase dependente de ciclina que compreende sondas especificas para o dito inibidor de quinase dependente de ciclina e um meio de lise para solubilização de uma amostra corporal, O kit de teste pode ser um dispositivo de diagnóstico in-vitro.

[017] Em certas modalidades da presente invenção o kit é provido como um dispositivo de diagnostico in-vitro. Consequentemente» a presente invenção também é direcionada para um dispositivo de diagnóstico in-vitro compreendendo sondas direcionadas contra um inibidor de quinase dependente de ciclina, para medir o inibidor de quinase dependente de ciclina em uma amostra solubilizada.

[018] A presente invenção é, além disso, direcionada para um método de desenvolvimento de kits e dispositivos de diagnóstico in-vitro para avaliação de diagnóstico de condições médicas relevantes a partir de amostras corporais solubilizadas, onde o desenvolvimento é realizado usando amostras corporais providas como células preservadas em um meio de preservação de células e onde as células preservadas sào dirigidas e preparadas para uso em processos de exame citológicos tais como processos de Cítologia em Meio Liquido, As amostras dirigidas para processos de cítologia em meio líquido (a seguir denominado como amostras LBC) são solubilizadas em um meio de lise apropriado e são usadas para desenvolver atividades de kits e dispositivos de diagnóstico in vitro para detecção de condições médicas relevantes a partir de amostras corporais solubilizadas a base de análise bioquímica em meio não celular.

[019] A presente invenção também está direcionada para um método para avaliação de diagnóstico de condições medicamente relevantes por análise bioquímica em meio não celular da presença ou da ausência e ou do nível de molécula marcadora em amostras corporais solubilizadas, onde a amostra corporal é uma amostra LBC e onde a detecção de moléculas marcadoras é realizada pela detecção da presença ou da ausência e ou do nível de proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos ou fragmentos dos mesmos nas ditas amostras solubilizadas. As moléculas marcadoras que podem ser aplicadas para esse método estão descritas acima como “moléculas marcadoras características para condições medicamente relevantes”. O método pode ser aplicado em qualquer condição medicamente relevante.

Breve Descrição dos Desenhos [020] A Figura 1 mostra os valores OD retomados em um teste ELISA que detecta o nível de p16INK4a em amostras de colo do útero solubilizadas, para detalhes experimentais ver Exemplo 1.

Descrição Detalhada da Invenção [021] A presente invenção está baseada nas descobertas dos depositantes de que os produtos do gene inibidor de quinase dependente de ciclína são superexpressos em muitas desordens neopiãsicas tais como cânceres, e.g., cânceres do trato respiratório, cânceres do aparelho reprodutivo, cânceres do sistema urinário, cânceres associados com HPV ou cânceres das zonas anogenitais, particularmente câncer de colo do útero, e estágios precursores desses cânceres, respectivamente. Exemplos desses inibidores de quinase dependente de ciclina são proteínas p14, p15INK4b, pl6,NK4a, pigINK4c) pi9INK4d, p2iWAF1/ci:P1 e p27Klpl. A proteína pUARF, que não é por função um inibidor de quinase dependente de ciclina, deve dentro do contexto da presente invenção ser incluída na expressão “inibidor de quinase dependente de ciclina”.

[022] O deposítante descobriu que a Intensidade da superexpressão de inibidor de quinase dependente de ciclina como detectado em espécimes citológicas se correlaciona com o grau de displasia como detectado em correspondentes espécimes histológicas.

[023] De acordo com a invenção, as descobertas dos depositantes são usadas para um método para o diagnóstico precoce de desordens neoplásicas tais como cânceres e seus estágios precursores, que compreende determinar a superexpressão de inibidores de quinase dependente de ciclina em uma amostra corporal, [024] De acordo com invenção, os procedimentos de exame citológico e/ou histoiógico podem ser suportados ou mesmo substituídos pelo uso de marcadores moleculares. Tais marcadores podem, e.g., ser usados em reações de coloração ímuno-citoquimica, ou durante reações de hibridização in-situ. Combinações de exames morfológicos e reações de coloração imuno-citoquimicas baseadas em moléculas marcadoras, característica para desordens neoplásícas tais como cânceres, e.g., do cérvix uterino, da bexiga ou do pulmão, podem conduzir a aumentados resultados. O exame morfológico permanece laborioso e consumidor de tempo e, assim, caro, mesmo quando suportado pelos métodos moleculares, que tornam os resultados mais confiáveis. Adicionalmente, o diagnóstico a nível morfológico da célula e, mesmo suportado por parâmetros moleculares, sujeito a percepção individual da morfoiogia pelos examinadores individuais. Assim, o diagnóstico é dependente da pessoa que realiza os exames.

[025] Os inventores, além disso, poderíam mostrar que em casos específicos os marcadores moleculares podem ser usados como ferramentas de diagnóstico sem suporte adicional pelos exames morto lógicos de base celular. Métodos para diagnóstico de desordens neoplásícas tais como cânceres somente a um nível molecular, sem o suporte da informação de base celular, são restritos a casos, onde os marcadores ou níveis de marcadores são específicos para a condição a ser caracterizada, Isso é especialmente verdadeiro, se os marcadores são substancias não humanas. Por exemplo, a detecção de infecções vira is pode ser realizada em soluções de amostras, porque a característica de marcadores para a presença de vírus em tecidos não ocorre em tecidos humanos não afetados.

[026] Todavia, os inventores descobriram que certos inibidores de quínase dependente de ciclína humanos podem servir como um marcador para cânceres em procedimentos de detecção a base de marcador bioquímico, embora seja uma proteína reguladora do ciclo celular sendo expressa em baixos níveis em qualquer célula humana que prolifera normalmente em certos estágios do ciclo celular.

[027] Os inibidores dependentes de ciclina para uso na presente invenção compreendem os inibidores de quínase dependentes de ciclina pU, p15INK4b, p16INK4a, p18INK4c, p19INK4d, p21WAF1/GIP1 e p27KIP1. Além dos inibidores de quinase dependente de ciclina, a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular codificada por uma estrutura de leitura alternativa do gene p16INK4a pode também ser usada para um método como aqui descrito. Para conveniência» dentro do contexto da presente invenção a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular» que não é por função um inibidor de quinase dependente de ciclina» deve ser incluída na expressão Inibidor de quinase dependente de ciclina”.

[028] "p 16” ou inibidor pi8INK4a de quinase dependente de ciclina” como aqui usado se refere a inibidor p16INK4a de quinase dependente de ciclina (também denominado como CDKN2 ou MTS1) o gene do qual está localizado na região cromossomal 9p2l pi 6INK4a foi primeiro descrito em Serrano, M„ etal„ Nature, 1993 Dec 16; 366(6456):704-7. Os termos "p16INK4ai' ou inibidor p16INK4a de quinase dependente de ciclina em suas formas gramaticais como usado no contexto da presente invenção se refere a ácidos nucleicos bem como a moléculas de polipeptideos, “pi 6INK4a” ou inibidor p1giMK4a qUjnase dependente de ciclina” compreende assim e.g,, RNA (mRNA, hnRNA, etc.)» DNA (cDNA, DNA genómico» etc.)» proteínas» polipeptideos, proteoglicans, glicoproteínas e respectivos fragmentos dessas moléculas.

[029] O nível de inibidores de quinase dependente de ciclina ou outras moléculas marcadoras como se usa aqui se refere a um valor semi-quantítativo, bem como a um valor quantitativo com relação à quantidade do marcador (inibidores de quinase dependente de ciclina ou outras moléculas marcadoras) presentes na amostra. O valor quantitativo pode, por exemplo» ser representado em termos de uma concentração. Um valor se mi-quantitativo pode ser expresso em termos de uma escala de níveis, por exemplo» níveis não detectãveis, baixos níveis» níveis intermediários, altos níveis ou qualquer outro modo adequado. O nível de um marcador tal como» por exemplo, pl6INK4a pode também ser representado em termos de um parâmetro dependente tal como a intensidade de um sinal gerado em um formato de ensaio em resposta a presença de, por exemplo, um inibidor de quínase dependente de ciclina. Em certas modalidades o nível pode também se referir a uma determinação qualitativa da presença de uma molécula marcadora.

[030] Devido a expressão de inibidores de quínase dependente de ciclina (e.g. p16INK4a) em certos tipos de células benignas presentes nas amostras corporais (e.g. espécimes de colo de útero, espécimes da cavidade oral, urina, escarro, etc.) o diagnóstico de desordens neoplásicas baseado no nível de inibidores de quínase dependente de ciclina sem informação adicional da morfologia celular parece ser difícil ou impossível. Era sabido na arte que até 30% dos espécimes de colo de útero, pouca a muitas células metaplásicas podem ser ímunorreativas para inibidor p16INK4a de quinase dependente de ciclina em nível moderado para alto. Além disso, células endometriais que podem sob certas circunstâncias estar presentes em zaragatoas (swabs) cervicais, podem ser positivas para p16INK4a. Em procedimentos de testes citológicos ou h isto lógicos, esse fato não influencia o diagnóstico porque os tipos de células podem ser facilmente dístinguidos das células displásicas com relação as suas morfologias celulares.

[031] Surpreendentemente os inventores descobriram que definindo um valor limiar de inibidores de quinase dependente de ciclina (p16INK4a) é possível detectar ou diagnosticar dísplasias mesmo sem conhecimento da morfologia celular.

[032] A expressão “desordens neoplásicas" em todas as formas gramaticais como usado no contexto da presente invenção se refere a cânceres de qualquer tipo e origem e estágios precursores dos mesmos, respectivamente. Desta forma o termo “desordem neoplásica" compreende a matéria identificada pelos termos “neoplasia”, “neopiasma” “câncer", *‘pré-cancer” ou iumor”. Também, a contrapartida citológica para condições histológicas identificadas como “displásicas" ou como “displasia” devem estar dentro do escopo do termo “desordem neoplásica” como aqui usado.

[033] Desordens neoplásicas para as quais os métodos da presente invenção podem ser aplicados compreendem, por exemplo, lesões neoplásicas do aparelho respiratório, do sistema urinário, do aparelho gastrointestinal, do aparelho anogenital, desordens neoplásicas associadas à infecção com HPV e outros. Elas podem ser cânceres do aparelho respiratório, do sistema urinário, do aparelho reprodutivo ou cânceres anogenitais, cânceres associados a HPV e particularmente câncer de colo do útero. Em relação a esse último, seus estágios precursores, e.g., neoplasias intraepitelial (CINI-I(II), carcinomas in situ (CIS), etc., devem ser particularmente mencionados. O termo “estágios precursores" em todas as suas formas gramaticais como aqui usadas compreende todos os estágios precursores e precursores de cânceres ou quaisquer outras malignidades. Com relação ao precursor de câncer de colo do útero ou estágios preliminares como aqui usados, pode e.g. se referir aos estágios de neoplasias intraepitelial cervicais como identificado por sistemas apropriados de classificação tais como e.g. a classificação GIN (GIN I - CIW 1(11) a classificação PAP (PAP I - PAP V) ou a Classificação Bethesda (NILM, LSIL, HSIL).

[034] Com relação aos cânceres do aparelho respiratório eles podem compreender qualquer condição maligna do aparelho respiratório tal como, e.g., câncer do pulmão, dos alvéolos, dos bronquíolos, da árvore brônquica e dos brônquios, do espaço nasoíaringeal, a cavidade oral, a faringe, cavidade nasal e o sino paranasal. O câncer de pulmão, tal como câncer de pulmão tipo em não pequenas células, carcinoma de pulmão epidermóide, carcínoma de pulmão do tipo células pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma do pulmão do tipo células largas, carcinoma do pulmão adeno-epidermóide, tumor carninóide do pulmão, tumor da glândula bronquíal ou mesotelioma (maligno). Um estudo sobre os tumores do aparelho respiratório pode ser encontrado em Colby TV, et al.: Tumors of the Lower RespiratoryTract, Atlas of Tumor Pathology, Third Series, Fascicle 13, AFiP: Washington 1995,", o qual é aqui incorporado para referência.

[035] Os tumores do sistema urinário podem compreender câncer de bexiga, câncer do rim, pélvis renal, câncer do ureter e da uretra, etc. Tumores do sistema reprodutivo podem compreender câncer e estágios precursores do mesmo do câncer de ovário, do ureter, dos testículos, da próstata, do epidídimo, etc.

[036] Em certas modalidades da invenção, desordem neoplásica se refere, geralmente, a desordens neoplãsicas associadas a HPV, A invenção nesse sentido é aplicada à desordens neoplásicas associadas a HPV e especialmente tipos de HPV de alto risco e tipos de GHPV mucosal. O HPV de alto risco pode compreender subtipos tais como HPV 16,18,31,33,35,39,45, 51, 52, 56 e 58. Marcadores para infecção por HPV pode, por exemplo, compreender produtos de expressão de genes de HPV L1, L2, E2, E4, E5, E6 ou E7.

[037] A expressão "amostra corporal” compreende quaisquer amostras corporais de qualquer tipo e natureza. Exemplos dessas amostras são secreções, zaragatoas (swabs), lavagens, fluidos corporais, sêmen, amostras de tecidos e de células, sangue, escarro, urina, fecais, bílis, secreções gastrintestinaís, linfática, medulares, aspirações e biópsias de órgãos tais como biópsias com agulha do por punção e aspirados com agulha (fina). Em particular, smears, zaragatoas e biópsias sáo indicados quando a preocupação é a detecção de cânceres anogenital, e.g., cãnceres de colo do útero. O termo biópsia como usado em todo esse texto deve compreender qualquer tipo de biópsia conhecida daqueles especialistas na arte. Assim, as biópsias como usado no contexto da presente invenção pode compreender, por exemplo, amostras de ressecção de tumores, amostras de tecidos preparadas por meio de endoscopia ou biópsias de órgãos obtidas com agulha ou por punção. As biópsias podem compreender espécimes obtidas por vários diferentes métodos tais como biópsias com bisturí frio, biópsias LEEP (cirurgia de alta frequência por alça) (Loop Electrocautery Excisional Procedure), etc.

[038] Amostras corporais como usado no contexto da presente invenção pode compreender amostras fixas ou preservadas de tecido ou de célula. Amostras de tecido ou de células podem e.g., estar preservadas em uma coleção padrão de amostras, em estoque ou meio de transporte, conhecidos daqueles especialistas na arte tais como e.g. meios de preservação comercial mente disponíveis (solução de formalina, Cytyc "PreservCyt" ou “CytoLyt”, Dígene "Universal Collection Médium", Tripath Imagíng "Cytorich", etc.). Em uma modalidade da invenção, as amostras de tecido ou de células providas em meio padrão de coleção de amostra sâo amostras citológicas em meio liquido (amostras LBC) que são preparadas de acordo com ou análogas a métodos empregados for métodos citológicos LBC conhecidas daqueles especialistas na arte. Meios adequados de preservação de células podem conter uma mistura de um ou mais dentre os selecionados do grupo de álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos, metal-ions ou sublimatos, éteres, etc. para preservação de componentes celulares. Os álcoois incluem metanol, etanol, (n-ou í-) propanol, (n-, i- ou í-) butanol ou álcoois superiores ramificados ou lineares. Aldeídos incluem formaldeído, acetaldeido, glutaraldeído, etc. Podem Cetonas tais como Acetona podem ser usadas. Ácidos para uso nos meios padrões de amostra incluem ácidos orgânicos (ácido acético, ácido tricloroacetico, ácido salícílico, ácido pícrico) ou ácidos inorgânicos tais como e.g. ácido crômico. Soluções padrões de amostra podem compreender metais tais como prata, cobre, cromo, mercúrio, osmio, urânio. Soluções de sais tais como uranil-acetato, potassiumbicromato, sulfato de amônia, etc, Podem ser componentes dos meios de preservação.

[039] Células preservadas em meios adequados (alcoóis, etc.) ou amostras fixas de tecido podem ser usadas como amostras de insumo nos métodos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, a amostra padrão pode e.g., compreender amostra de escarro, uma zaragatoa cervical, um zaragatoa oral, uma zaragatoa uretal ou semelhante que tenha sido transferida para um meio de preservação contendo álcool.

[040] Além disso, amostras corporais que foram submetidas a condições de lise da célula imediatamente após obtenção das amostras podem ser usadas em métodos aqui descritos. Os inventores descobriram uma série de maneiras robustas, rápidas e fáceis de preservar as propriedades moleculares de amostras, onde a informação morto lógica das amostras é perdida. As amostras podem ser, por exemplo, preparadas em uma forma reproduzível e fácil de armazenar e transportar pela solubilização dos componentes celulares da amostra de matéria prima em um meio adequado de iise imediatamente após, ou mesmo durante a obtenção da amostra. Fluidos corporais podem ser diretamente transferidos do corpo de um indivíduo para um meio contendo detergentes adequados e substâncias preservativas. Além disso, amostras de tecidos podem ser imediatamente transferidas para condições de iise desnaturante (eventualmente suportadas pelas forças físicas) e, assim, preservadas, Usando ingredientes apropriados no meio de Iise, os componentes moleculares da amostra original podem ser preservados, e não pode ocorrer nenhuma degradação. A degradação por atividades enzimáticas pode, por exemplo, ser minimizada pelo uso de inibidores enzimáticos. Assim, a solução de amostras teste no dito meio de Iise pode representar as propriedades moleculares de uma amostra teste no momento da solubilização.

[041 ] De acordo com a presente invenção, as amostras corporais podem ser solubilizadas em qualquer meio adequado de lise. Esses meios adequados de lise podem, por exemplo, ser soluções aquosas de agentes caotrópícos tais como, por exemplo, ureia, GuaSCN, Formamida, de detergentes tais como detergentes aníônicos {e.g., DAS, N-lauril sarcosína, deoxicolato de sódio, alquil-ari! sulfonatos, sulfatos alcoólicos (graxos) de cadeia longa, sulfatos olefínicos, e sulfonatos olefínicos, sulfatos e sulfonatos de alfa olefina, monoglicerídeos sulfatados, éteres sulfatados, sulfosuccinatos, sulfonato de alcano, ésteres de fosfato, isotionatos de alquil, ésteres de sucrose), detergentes catiónicos (e.g- cloreto de cetil trimetiamonio), detergentes não-iônicos (e.g, Tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100, NP-40, Igepal CA-630, N-Octil-Glucosid) ou detergentes anfóteros (e.g CHAPS, 3-dodecil-dímetiIamonio-propano-1-sulfonato, óxido de laurildimetilamina) e/ou de hidróxidos alcalinos tais como e.g, NaOH ou KOH, Geralmente, qualquer liquido adequado pode ser usado como um solvente no meio de lise da presente invenção. O líquido pode ser orgânico ou inorgânico e pode ser um líquido puro, uma mistura de líquidos ou uma solução de substâncias no líquido, e pode conter substâncias adicionais para aumentar as propriedades dos solventes. Em certas modalidades onde a lise das células pode ser alcançada sem o uso de detergentes, podem ser usados como solventes soluções hiper- ou hipotônicas ou soluções tampão ou simplesmente água ou um liquido orgânico. Qualquer líquido que é adequado para solubilizar os componentes celulares de amostras corporais no total ou em partes pode ser considerado como um meio de lise, como aqui usado. Assim, os meios de lise, como aqui usado, não precisam conter substâncias tampão ou possuir capacidade de tamponamento. Todavia, em certas modalidades da invenção os meios de lise podem possuir capacidade de tamponamento e podem conter substâncias tampão.

[042] Em uma modalidade, o meio de lise é designado, de maneira que são solubílizadas células, debris celulares, ácidos nucleicos, polipeptídeos, lipídeos e outras biomoléculas potencialmente presentes na amostra matéria prima, [043] Em modalidades adicionais da presente invenção, o solvente pode ser designado para assegurar solubilização diferencial de componentes específicos da amostra corporal, deixando outros componentes não solubilizados.

[044] O meio de lise para solubilização da amostra de acordo com a presente invenção pode, adicionalmente, compreender um ou mais agentes que previnem a degradação dos componentes dentro das amostras matéria prima. Tais componentes podem, por exemplo, compreender inibidores enzimáticos, tais como inibidores de proteinase, inibidores de RNAse, inibidores de DNAase, etc. Em uma modalidade da presente invenção, a amostra é lisada direta mente na forma obtida a partir dos testes individuais, Inibidores de proteinase, por exemplo, podem compreender inibidores de serina proteinases, inibidores de cisteína proteínases, inibidores de aspartil proteinase, inibidores de metaloproteinases, inibidores de proteinases ácidas, inibidores de proteínases alcalinas, ou inibidores de proteínases neutras. Em certas modalidades da presente invenção, a inibição de enzimas pode ser alcançada por meio químico tai como, por exemplo, desnaturação das enzimas por meio de concentração salina, pH, agentes caotrópicos ou semelhantes.

[045] Um uma outra modalidade da presente invenção, a amostra corporal pode ainda ser purificada antes de ser lisada. Esses procedimentos de purificação podem, por exemplo, compreender retirada de contaminantes por lavagem, tais como muco ou semelhantes, separação ou concentração de componentes celulares, preservação e transporte das células. Em uma modalidade, por exemplo, as células podem ser separadas por meio de citometria de fluxo ou outras formas adequadas de seleção de células conhecidas daqueles especialistas na arte. Assim, os componentes celulares das amostras matéria prima são incluídas em uma única solução de amostra.

[046] A preparação de uma amostra para uso em um método como aqui descrito pode também compreender diversas etapas de preparações adicionais da amostra, tal como separação de componentes insolúveis, isolamento de polipeptídeos ou de ácidos nucleícos, preparação de peptídeos de fase sólida fixa ou de ácidos nucleícos ou preparação de contas, de membranas ou de slides aos quais as moléculas a serem determinadas são acopladas de forma cova lente ou não-covalente.

[047] A expressão “determinar a hiperexpressão de proteínas inibidoras de quínase dependente de ciclina” compreender quaisquer métodos que sejam adequados para detectar a expressão de proteínas inibidoras de quinase dependente de ciclina ou seus mRNAs codíficantes e uma amplificação dos correspondentes genes, respectivamente. De forma a detectar uma hiperexpressão, a amostra corporal a ser examinada pode ser comparada com uma correspondente amostra corporal originária de uma pessoa saudável ou s partir de uma região sem a doença do respectivo órgão. Essa amostra pode estar presente em uma forma padronizada.

[048] A comparação com amostras corporais normais saudáveis pode ser alcançada por diferentes métodos. Em uma modalidade da presente invenção, a comparação pode ser realizada diretamente incluindo uma reação de controle com um tecido ou amostra celular não doentes. Esses tecido ou amostra celular não doentes podem ser providos a partir de uma pessoa saudável ou de uma região não doente do indivíduo humano sob exame ou a partir de células de cultura de células que são conhecidas por mostrar as propriedades de células não doentes com relação à expressão de inibidor de quinase dependente de ciclina. Em uma outra modalidade, a comparação pode ser realizada indiretamente pela comparação do nível de inibidor de quinase dependente de cíclina dentro da amostra sob investigação com um nível do dito inibidor de quinase dependente de cíclina conhecido estar presente nas amostras normais saudáveis. O conhecimento acerca do nível para tecido normal saudável ou para amostras celulares pode ser derivado de uma série representativa de testes ou a partir de publicações cientificas que proporcionam informação do nível de expressão do inibidor de quinase dependente de ciclina em células normais saudáveis. A comparação pode ser realizada empregando um valor para a concentração proteína ou de ácido nucléico de inibidores de quinase dependente de ciclina; de outra forma, pode ser empregado um valor característico dependente da concentração de proteína ou de ácido nucléico tal como a densidade ótica sob condições reacíonais definidas. De outra maneira, o valor conhecido pode ser representado por um controle substituto tal como um peptídeo ou uma proteína recombinante. Assim, o nível de pl6INK4a presente em amostras normais saudáveis pode ser representado por uma amostra controle de uma proteína recombinante ou um peptídeo no procedimento de teste.

[049] Geralmente, a comparação do nível presente na amostra sob investigação com relação a um valor determinado em cada procedimento simples de teste ou para um pré-determinado valor. O valor pré-determinado pode ser globalmente determinado para o procedimento de teste. Em outro aspecto, o valor pode ser válido somente para um certo lote de reagentes de teste. Por exemplo, o valor de referência pode ser válido somente para um período de calibraçào definido e pode ser definido quando da calibração do processo de teste.

[050] Por exemplo, o nível de inibidor de quinase dependente de ciclina em uma amostra saudável cervical humana pode ser determinado a partir de uma solução de amostra padronizada. Uma solução de amostra padronizada pode compreender uma solução de um pool de solubilizado de células normais ou amostras normais de tecido. O pool de amostras pode, e.g., ser um pool de espécimes cito lógicas com diagnóstico normal pré-avaliado a partir de uma população selecionada, ou um pool de células normais obtido de espécimes histológicas. Além disso, um pool de células normais pode se obtido a partir de uma cultura de tecido de células epiteliais cervicais normais. A solução de amostra pode, e.g., ser padronizada com relação ao conteúdo das células por ml de solução de amostra. Pode ser aplicado qualquer outro parâmetro para padronização. A solução de amostra pode, e.g., ser provida em uma forma padronizada para assegurar estabilidade e reprodutíbitidade dos resultados de teste. Em certas modalidades, essa solução pode ser provida como um componente do kit para comparação ou finalidades de calibração.

[051] Em certas modalidades, a etapa de comparação do nível de inibidores de quinase dependente de ciclina presente em uma amostra do paciente com um nível conhecido estar presente em uma amostra corporal normal saudável é concretizada empregando um valor de corte (cut-off) ou um valor limiar para a concentração do respectivo inibidor de quinase dependente de ciclina. O corte nesse contexto é um valor {por exemplo uma concentração de proteína pl6INK4a dado pro exemplo em mg/ml ou densidade ótica medida sob condições definidas em um teste ELISA) que é adequado para separar amostras normais saudáveis de amostras adoentadas. Por exemplo, todas as amostras apresentando valores acima do valor de corte são consideradas ser displásicas, onde as amostras apresentando valores abaixo do valor de corte são consideradas estar saudáveis.

[052] Em certas modalidades, o limiar ou corte pode ser ajustado de uma maneira a separar desordens neoplásicas de alto grau (HSIL ou desordens neoplásicas correspondendo por exemplo a carcinoma invasivo, displasia de alto grau ou lesões CIN 3 histologicamente avaliadas) de todos os estágios menos severos de desordens neoplásicas (e.g,, LSIL). Em certas modalidades, o corte pode ser definido para diferenciar amostras saudáveis (NILM) de desordens neoplásicas incluindo estágios precursores (LSIL e HSIL), Assim, é possível adaptar o formato de teste de maneira a ajustar a diferentes tarefas tais como detecção precoce de lesões e mesmo precursores das lesões ou detecção de lesões que necessitam de terapia imediata.

[053] A (super) expressão de inibidores de quínase dependente de ciclina pode ser detectada a nível de ácido nucleico e a nível de proteína, respectivamente. Com relação à detecção a nível de proteína, é possível usar, por exemplo, anticorpos que são direcionados contra inibidores de quinase dependente de ciclina. Esses anticorpos podem ser usados em uma maioria de variados métodos tais Western blot, ELISA ou ímunoprecípítação. Pode ser favorável fixar os anticorpos em veículos sólidos tais como placas ELISA, vasos de reação, contas, esferas, membranas, colóídes tais como metais coloidais (e.g., ouro), membros porosos, superfícies de capilares (e.g., teste de fluxo direto), tiras de teste ou partículas de látex. Com relação à detecção a nível de ácido nucléico podem ser aplicados métodos tais como técnicas de amplificação de ácido nucléico ou técnicas de hibridização. Técnicas de amplificação de ácido nucléico compreendem todos os tipos de etapa única ou reações de multi-etapas tais como reações em cadeia. Reações em cadeia compreendem, mas não estão limitadas a, PCR, NASBA, RT PCR, LCR, etc. As reações de hibridização compreendem quaisquer reações de hibridização com qualquer tipo de sistema de relato. Reações de captura híbrida com subsequente detecção de ácidos nucleicos híbridos por meio de anticorpos, direcionados contra os ditos híbridos. Exemplos para aplicação de reações híbridas para detecção de expressão a nível de RNS transcritos são, por exemplo, reações de hibridização de RNA in-situ.

[054] Em certas modalidades da presente invenção, a detecção das moléculas marcadoras é realizada a partir de uma solução de amostras corporais solubilizadas. Desta forma, a detecção pode ser realizada em solução ou usando reagentes fixados em uma fase sólida.

[055] Uma fase sólida como usado no contexto da presente invenção pode compreender várias modalidades de substâncias sólidas tais como superfícies planares, partículas (incluindo micro-, nano-partículas ou mesmo partículas menores). Em certas modalidades, as partículas podem ser providas como esferas, contas, colóides ou semelhantes, [056] A fixação de reagentes à fase sólida em um kit de teste ou em um dispositivo de diagnostico ín-vítro pode ser realizada através de fixação direta ou fixação indireta, Fixação direta pode ser realizada por ligação covalente, ligação não co vai ente, associação, ou adsorção à superfícies. Fixação indireta pode ser realizada através de ligação do anticorpo a agentes os quais são diretamente fixados em fases sólidas. Agentes de ligação incluem, por exemplo, avidina, streptavidina, biotina, digioxingenina ou semelhantes, [057] A detecção de um ou mais marcadores moleculares pode ser realizada em uma única mistura de reação ou em duas ou mais misturas de reação separadas. As reações de detecção para diversas moléculas marcadoras podem, por exemplo, ser realizadas simultaneamente em vasos de reação de multí-poços, A reação de detecção para moléculas marcadoras pode compreender uma ou mais reações adicionais com agentes detectores que tanto reconhecem as moléculas marcadoras iniciais, como preferencial mente reconhecem as moléculas anteriores (e.g., anticorpos primários) usadas para reconhecer os marcadores iniciais. A reação de detecção pode ainda compreender uma reação de relato indicando o nível dos marcadores característico para as desordens celulares proliferai ivas ou para marcadores de normalização.

[058] Â reação de detecção para detectar o nível de inibidores de quínase dependente de ciclina em amostras solubilizadas pode ser realizada em solução ou com reagentes fixados em fases sólidas. Em certas modalidades, a reação de detecção pode ser realizada em solução, esses procedimentos podem compreender quaisquer métodos adequados para a detecção de interações moleculares (ligação de um anticorpo ou agente de ligação similar) em solução. Os métodos para determinação de interação molecular [alteração na condutividade, alterações de massa, de luz-, de UV-, de IR-, alterações espectrométricas magnéticas, ressonância de plasma, etc.) são conhecidos daqueles especialistas na arte. Em certas modalidades a detecção pode compreender um método onde um complexo de reagente de detecção ligado a um antígeno é adsorvido a uma fase sólida para fins de detecção. Assim, uma ligação não-covalente dos elementos à fases sólidas no curso da reação de detecção ou mesmo antes do início da reação de detecção pode ser usada em um método de acordo com a presente invenção.

[059] Uma sonda para detecção das moléculas marcadoras pode ser qualquer molécula que especificamente se liga às ditas moléculas marcadoras. A sonda pode, por exemplo, ser um agente de ligação de antígeno tal como anticorpos [monoclonal ou policlonal), fragmentos de anticorpo ou moléculas artificiais compreendendo epítopos de ligação a antígeno, moléculas de ligação de DNA ou RNA taís como proteínas ou ácidos nucleicos. Ácidos nucleicos que se ligam a outros ácidos nucleicos podem, por exemplo, ser oligonucleotídeos para fins de detecção ou iniciadores (primers). Em certas modalidades, mesmo moléculas de nucleotídeos maiores podem ser aplicadas para reações de hibridízação. Uma molécula é dita reconhecer uma outra molécula se ela interage especifica mente com aquela molécula. Interação especifica pode, por exemplo, ser ligação especifica a outra molécula ou da outra molécula. O termo “anticorpo” em todas as suas formas gramaticais, no contexto da presente invenção, se refere de forma geral a moléculas de ligação de antígeno incluindo, porém não limitado, a anticorpos monoclonais ou policlonais, fragmentos de anticorpos, epítopos de ligação de antígeno, mini-anticorpos, peptídeo míméticos com propriedades de ligação à antígeno, “anticalins” e anticorpos bivalentes e bi-específicos (díabodies).

[060] A reação de relato pode ser qualquer evento que produz um sinal em resposta a presença do marcador ou a uma ligação de uma sonda específica para um marcador. Por exemplo, pode servir como reação de relato uma reação que produz um composto colorido, um composto fluorescente, um composto que emite luz, um composto que emite radiação, ou a concentração de um ou mais desses compostos para uma concentração detectável em uma área pré-determinada de um dispositivo de teste.

[061] Formatos aplicáveis para a reação de detecção de acordo com a presente invenção podem ser técnicas de blotting, tais como Western-Blot, Soutbern-blot, Northern-blot. As técnicas de blotting são conhecidas daqueles especialistas na arte e podem ser realizadas, por exemplo, como eletro-blots, semidry-blots, vácuo-blots ou dot-blots. Além disso, métodos imunológicos para detecção de moléculas podem ser aplicados, tais como, por exemplos, ensaios de imuno-precipitaçâo ou imunobíológicos, tais como EIA, ELISA, RIA, ensaios de fluxo lateral, FIA (imunoensaio fluorescente) (usando membros porosos ou capilares), tiras ímunocromatográficas, ensaios de fluxo direto, ensaios de aglutinação por látex, etc. Imunoensaios para uso na invenção podem compreender imunoensaios competitivos, bem como não competitivos, tais como, ensaios do tipo sandwich.

[062] Em abordagens baseadas em ácido nucléico, podem ser aplicadas técnicas de híbridização ou amplificação. Técnicas de hibridização podem, e.g., compreender qualquer técnica de hibridização conhecida daqueles especialistas na arte. Em certas modalidades a hibridização pode ser realizada como um ensaio de captura híbrida empregando anticorpos direcionados contra moléculas híbridas de DNA-RNA para a detecção. Reação de amplificação pode ser empregada como PCR, NASBA, RT-PCR, LCR ou outras reações em cadeia. De outro modo, mesmo reações em etapa única ou sequenciais que não sejam reações em cadeia podem ser aplicadas para amplificação de ácido nucléico.

[063] Em certas modalidades da invenção, teste a base de imunoqu(micos ou ácido nucléico podem ser realizadas usando dispositivo de teste para laboratórios clínicos. Esse dispositivo de teste pode compreender qualquer dispositivo adequado para teste a base de imunoqu ímicos ou a base de ácido nucléico incluindo qualquer formato tal como dispositivos de teste de ponto de cuidado (point-of-care-testing), bem como dispositivos de bancada ou laboratoriais. Os dispositivos podem ser, e.g., providos como sistemas de plataforma aberta ou fechada. O sistema pode ser baseado em qualquer metodologia adequada tal como placas de microtitulação, placas de multipoços, sistemas de fluxo direto ou de fluxo lateral, sistemas a base de microchip ou a base de arranjos (arrays) ou sistemas a base de contas ou de membranas. Os métodos de detecção empregados podem compreender quaisquer métodos conhecidos daqueles especialistas na arte úteis para reações de detecção a base de imunoqu ímicos ou de ácidos nucleicos. Esses sistemas de detecção podem ser, por exemplo, sistemas luminescentes (eletroluminescêncía, bioluminescência, fotolumínescência, radioluminescência, quimioluminescência, eletroquimio-luminescência, sistemas a base de fluorescência, sistemas de detecção a base de condutividade, radiação {luz, UV, raio-X, gama, etc.) ressonância de plasma {e.g., Ressonância de Plasma de Superfície [Surface Plasmon Resonance-SPR]) ou qualquer outro método conhecido.

[064] O termo membro poroso como aqui usado geralmente se aplica a qualquer arranjo tri dimensional de substâncias porosas. Esse membro poroso pode» por exemplo» compreender compostos como membranas, contas ou outros, [065] Através da presente invenção é possível diagnosticar cânceres precocemente» i.e., em seus estágios precursores.

[066] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um kit para realizar um método de acordo com a invenção, Esse kit compreende, por exemplo: (a) um reagente para detector a expressão de inibidor de quinase dependente de ciclina, e.g.» uma sonda direcionada contra uma proteína ou ácido nucléico de inibidor de quinase dependente de ciclina e partes dos mesmos, respectivamente; (b) um meio de líse para solubilízaçâo de uma amostra corporal; (c) agentes auxiliares convencionais» tais como tampões, veículos» marcadores, etc., e opcionalmente, (d) um agente para reações controle» e.g., proteínas ou ácido nucléico de inibidores de quinase dependente de ciclina e partes dos mesmos, respectivamente, ou uma preparação de células, [067] Alem disso, um ou diversos dos componentes individuais podem estar presentes. Por exemplo, pode estar presente o reagente de detecção e outros reagentes fixados a uma fase sólida. Em uma modalidade da presente invenção, o kit compreende um reagente para detecção de p16INK4a fixado a fases sólidas e sem reagentes de detecção de outras específicidades fixados a fases sólidas, [068] Em certas modalidades da invenção, os kits para detecção de inibidores de quinase dependente de ciclina são providos como dispositivos de diagnóstico in-vitro.

[069] Geralmente, o meío de lise incluído em um kit de acordo com a presente invenção pode ser qualquer solvente adequado conhecido daqueles especialistas na arte. O meio de lise para uso no kit pode, por exemplo, ser soluções orgânicas ou aquosas de agentes caotrópicos tais como ureia, GuaSCN, Formamída, de detergentes tais como detergentes aniônícos (e.g. SDS, N-lauril sarcosina, deoxicolato de sódio, alquil-aril sulfonatos, sulfatos de alcoóis (graxo) de cadeia longa, sulfatos e sulfonatos olefínicos, sulfatos e sulfonatos de alfa olefina, monoglicerídeos sulfatados, éteres sulfatados, sulíosuccinatos, sulfonatos de alcano, ésteres de fosfato, alquil isotionatos, ésteres de sucrose), detergentes catiônicos (e.g. cloreto cetil trimetílamônio), detergentes não-tônicos (e.g. Tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100, NP-40, Igepal CA-630, N-Octyl-Glucosid) ou detergentes anfóteros (e.g CHAPS, sulfonato de 3-Dodecil-dimetilamonio-propano-1-sulíonato, oxido de Laurildimetilamina oxide) e/ou hidróxidos alcalinos tais como e.g, NaOH ou KOH. Em certas modalidades, onde a lise de células pode ser alcançada sem o uso de detergentes, soluções hiper- ou hipotônicas ou tampões ou simplesmente água ou um liquido orgânico pode ser usado como solvente. Qualquer liquido que seja adequado para solubilizar os componentes celulares de amostras corporais na totalidade ou em partes pode ser considerado como um meio de lise como aqui usado. Assim, meios de lise, como aqui usado, não precisam conter substâncias tampão ou possuir capacidade de tamp ona mento, [070] Em certas modalidades da invenção, de forma a obter-se ótimos resultados do ensaio, o pH de um meio de lise que pode diretamente aplicado ao sistema de ensaio está ao redor do neutro. Em modalidades adicionais o pH do meio de lise está na faixa de 4 a 10. Em outras certas modalidades, o pH está na faixa de 5 a 9. Em uma modalidade preferida, o pH está na faixa de 6 a 8. Em uma modalidade mais preferida, o pH está na faixa de 6,5 a 7,5.

[071] Exemplos de meios de lise podem, por exemplo, ser selecionados a partir das composições dadas na Tabela 1.

Tabela 1 nd: não determinado; +/-: fraco; +: bom; ++: muito bom; +++: excelente;

[073] Em certas situações, o inibidor de quinase dependente de ciciína pi g|NK4a pode ser degradado nas amostras solubilizadas e pode, assim, ser detectado. Isso é particularmente verdadeiro, se as amostras são diretamente transferidas para um meio de lise e estocadas no mesmo por certo período de tempo. Para evitar a degradação, o meio de lise pode, ainda, compreender uma ou mais agentes que evitam a degradação de componentes dentro das amostras de matéria prima. Esses componentes podem, por exemplo, compreender inibidores de enzima tais como inibidores de proteinase, inibidores de RN Ase, inibidores de DNAase, etc. Os inibidores podem, e.g., compreender inibidores de proteinase selecionados das composições mostradas na Tabela 2.

[074] Tabela 2 [075] Inibidores de DNase e RN ase são conhecidos daqueles especialistas na arte e podem ser aplicados sob certas condições adequadas para uso em um meio de lise de acordo com a presente invenção.

[076] Para fins de estabilização, o meio de líse pode também compreender (e.g., albumina tal como albumina de soro bovino ou albumina de soro de carneiro ou outras proteínas a granel) para competir na degradação com as proteínas da amostra. Proteínas a granel podem, e,g,, estar presentes em combinação com inibidores de proteinase ou podem ser adicionadas em lugar dos inibidores de proteinase. Em uma modalidade, o solvente pode ser selecionado para ser compatível com o ensaio de desempenho {e.g,, ELISA), de maneira que as amostras solubilizadas possam ser diretamente aplicadas ao ensaio.

[077] Em algumas modalidades da presente invenção, o meio de lise pode ser adaptado de forma a permitir estabelecer um valor específico de corte.

[078] Em certas modalidades da invenção o kit pode ser provido como um dispositivo de diagnóstico in vitro. Um dispositivo de diagnóstico in viíro é um kit definido acima, que é para acessar o diagnóstico de uma condição médica relevante de amostras corporais de humanos ou de animais. Em certas modalidades da invenção um dispositivo de diagnóstico in vitro deve ser qualquer dispositivo que esteja dentro do escopo da definição de dispositivo médico de diagnóstico in viíro, como apresentado na Diretiva 98/79 EC conforme o Artigo 1 (b): [079] “dispositivo de diagnóstico in vitro" significa qualquer dispositivo médico que é um produto reagente, calibrador, material controle, kit, instrumento, aparelho, equipamento, ou sistema, se usado sozinho ou em combinação, com intenção do fabricante de ser usado in vitro para o exame de espécimes, incluindo doações de sangue e de tecido, derivado do corpo humano, única ou principal mente para a finalidade de proporcionar informação referente a um estado fisiológico ou psicológico; ou referente a uma anormalidade congênita, ou para determinar a segurança e compatibilidade com receptores em potencial; ou para monitorar medidas terapêuticas,” [080] O dispositivo de diagnóstico in vítro pode também ser aplicado aos IVD da Classe I norte-americana e geralmente aos dispositivos de diagnóstico in vítro que são fornecidos sem reivindicar seu desempenho de diagnóstico. Consequentemente, também qualquer tipo de ASR ou semelhante deve ser entendido ser um dispositivo de diagnóstico como aqui usado. Em uma modalidade da presente invenção, o dispositivo de diagnóstico in vítro é caracterizado por reagentes de detecção fixados em fase sólida específicos para inibidor de quinase dependente de ciclina. Em uma modalidade, os reagentes de detecção são específicos para inibidor pl6INK4a de quinase dependente de ciclina.

[081] Na arte, existem alguns dispositivos de diagnóstico que empregam reagentes para detecção de inibidor de quinase dependente de ciclina pt 6INK4a em espécimes histològícos e citológicos. Esses dispositivos de diagnóstico in vítro são dispositivos de detecção a base de células que detectam antígeno p16INK4a em células ou tecidos, não em amostras solubílizadas.

[082] Inibidores de quinase dependente de ciclina como o p1giNK4a qüe sã0 antígenos intracelulares, podem unicamente ser acessíveis a reagentes de detecção em solução após permeabilização das células. Assim, a aplicação de diagnóstico in vitro dos reagentes para a detecção de inibidor de quinase dependente de ciclina p16WK4a! conhecidos na arte excluí a fixação dos reagentes de detecção a uma fase sólida. A arte não ensina o projeto de kits de teste ou diagnóstico in vitro contendo p16INK4a -reagentes de detecção fixados em fase sólida, Uma abordagem para avaliar o diagnóstico com base em amostras solubilizadas parece não ser viável na arte e não foi sugerido anteriormente.

[083] Deste modo» um aspecto da presente invenção é proporcionar um dispositivo de diagnóstico in vitro compreendendo sondas dirigidas contra inibidores de quínase dependente de ciclina fixadas a uma fase sólida que permite a avaliação do diagnóstico de carcinomas e suas lesões precursoras em uma amostra solubilízada. Em certas modalidades da presente invenção, as sondas podem, por exemplo, compreender ácidos nucleicos, anticorpos ou fragmentos dos mesmos direcionados contra proteína p14ARF ou pi 6,NK4a. Uma vantagem dos dispositivos de diagnóstico in vitro da presente invenção é permitir a avaliação fácil e econômica de diagnóstico de cânceres e suas lesões precursoras. O teste pode ser adequado para propósitos de seleção ou separação, bem como para propósito de diagnóstico e pode ser aplicado em diagnóstico primário bem como para monitorar o desenvolvimento da doença. Os dispositivos de diagnóstico in vitro podem, em certas modalidades, ser aplicados para uso em laboratórios clínicos, teste de ponto de cuidado (point-of-care-testing) ou mesmo para teste automático.

[084] Os dispositivos de diagnóstico in vitro compreendendo reagentes fixados em fase sólida para detecção de inibidores de quinase dependente de ciclina podem ser úteis para a detecção de várias diferentes entidades cancerosas e suas respectivas lesões precursoras. Os dispositivos de diagnóstico in vitro podem ser aplicados para análise de quaisquer tipos de amostras corporais lisadas.

[085] As sondas podem ser fixadas a uma fase sólida via fixação direta ou via fixação indireta. A fixação direta pode ser feita por ligação cova lente ou não-covalente ou por associação à superfícies. A fixação indireta pode ser feita através de ligação do anticorpo a agentes que por si próprios são diretamente fixados às fases sólidas, Esses agentes podem compreender anticorpos ou seus agentes de ligação tais como avidina, estreptavidina, biotina, digíoxingenina, ou semelhantes.

[086] Os dispositivos de diagnóstico in vitro contemplados na invenção são selecionados do grupo que consiste em: (a) um dispositivo ELISA compreendendo anticorpos direcionados contra inibidor de quinase dependente de ciclina fixado a placas de ELISA, tiras de ELISA ou poços de ELISA; (b) dispositivo de teste de fluxo lateral, compreendendo anticorpos direcionados contra inibidor de quinase dependente de ciclina fixado em tiras de teste, partículas de ouro coloidal ou partículas de látex; (c) dispositivo de ensaio de fluxo direto que compreende anticorpos direcionados contra inibidor de quinase dependente de ciclina fixado a um membro poroso, ou a uma superfície de capilares; (d) dispositivo de ensaio de aglutinação de látex, compreendendo anticorpos direcionados contra inibidor de quinase dependente de ciclina fixado em partículas de látex; e, (e) um dispositivo de imunoensaio, anticorpos direcionados contra inibidor de quinase dependente de ciclina fixado em contas, membranas ou microesferas.

[087] Os dispositivos ELISA podem ser de qualquer tipo conhecido daqueles especialistas na arte, Esses dispositivos compreendem dispositivos para formato de ELISA do tipo “sandwich"; para formatos de ELISA competitivos e qualquer outro formato de ELISA.

[088] Em uma modalidade da presente invenção o dispositivo de diagnóstico in vitro compreende um meio de lise para solubiüzação da amostra. Em uma modalidade adicional da invenção, o dispositivo de diagnóstico in vitro compreende reagentes para detecção de um específico inibidor de quinase dependente de ciclina fixado a fases sólidas e sem reagentes de detecção de outras especificidades fixados a fases sólidas.

[089] Dispositivos de ensaio de fluxo lateral para uso como dispositivo de diagnóstico de acordo com a presente invenção são quaisquer dispositivos de ensaio de fluxo lateral que empregam pelo menos um reagente de ligação a inibidores de quinase dependente de ciclina fixado a uma fase sólida, Esses dispositivos podem empregar vários mecanismos para visualização do resultado do teste. Em certas modalidades, os testes podem empregar reagentes de detecção secundários direcionados contra inibidores de quinase dependente de ciclina ou outros componentes que participam no teste acoplados a entidades detectáveis. As entidades detectáveis podem compreender ouro coloídal, partículas de látex (coloridas) e outros.

[090] Os dispositivos de ensaio de fluxo lateral para uso na presente invenção podem compreender dispositivos baseados em capilaridades ou em membros porosos (tais como membranas, contas ou outros arranjos tri dimensionais de substâncias porosas). Dependendo da modalidade o tamanho de poros ou capilares precisa ser ajustado para assegurar ótimas condições de fluxo, [091] Um outro aspecto da presente invenção é o uso de uma fase sólida na qual são fixados ou aderidos reagentes de detecção ou sondas direcionadas contra inibidores de quinase dependente de ciclina para a fabricação de um kit de teste ou de um dispositivo de diagnóstico in vitro ou para a fabricação de um kit de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades da invenção as sondas são anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Em outras modalidades as sondas são oligonucleotídeos, [092] As fases sólidas que podem ser usadas para a fabricação de um kit de teste ou de um dispositivo de diagnóstico in vitro estão descritas acima e compreendem qualquer fase sólida adequada. Em certas modalidades, as fases sólidas são membranas, membros porosos, superfícies planas, placas de multipoços (com superfícies planas ou não-planas), colóides, partículas e outros. Todas as fases sólidas nas quais as sondas para detecção de inibidores de quinase dependente de cíclina podem ser fixados, podem ser usadas para a fabricação de kits e dispositivos de diagnóstico in vitro de acordo com a presente invenção. A fabricação desse kit de acordo com a presente invenção pode compreender qualquer ação adequada a proporcionar um dispositivo de diagnóstico in vitro acabado. Essas ações compreendem todas as atividades de fabricação, além do empacotamento, montagem de componentes individuais, re-etiquetação, etc.

[093] Em um aspecto da presente invenção é proporcionar um método para desenvolver os kits e os dispositivos de diagnóstico in vitro para diagnóstico de condições medicamente relevantes a partir de amostras corporais soiubilizadas, onde o desenvolvimento é realizado usando amostras corporais providas como células preservadas em um meio de preservação e onde se pretende que as células preservadas sirvam, e sejam preparadas para uso em processos de exame citológíco tal como processos Citológicos Baseados em Líquidos. As amostras que se pretende que sirvam para processos Citológicos Baseados em Liquido (doravante denominadas como amostras LBC) são soiubilizadas em um meio de líse apropriado e são usadas para atividades de desenvolvimento de kits e dispositivos de diagnóstico in vitro para detecção de condições medicamente relevantes a partir de amostras corporais soiubilizadas com base de análises bioquímicas não baseadas em análises em células.

[094] De acordo com a presente invenção, o uso de amostras LBC para avaliação de diagnóstico ou para desenvolvimento de kits e dispositivos de diagnóstico in vitro podem, por exemplo, proporcionar uma maneira segura e comparável de fornecer informação citoiógica para o teste bioquímico de base não celular. Essa maneira é alcançada pelo emprego de normalização da amostra com relação à informação obtida do espécime citológico preparado fora da mesma amostra LBC. A normalização bioquímica com relação a marcadores indicativos da presença ou ausência de células ou tipos de células é omissa em tais métodos. A vantagem de se usar amostras LBC a esse respeito é que a informação citologicamente a base de células está diretamente relacionada ao espécime LBC homogêneo e, assim, proporciona valiosa informação segura para uso na avaliação dos resultados de teste bioquímico de base não celular.

[095] Na arte o campo de aplicação de amostras LBC é para permitir avaliação morfológtca aperfeiçoada de espécimes citológicos. O campo de aplicação das amostras LBC é, consequentemente, classicamente indicado somente para citologia.

[096] De acordo com a presente invenção, o uso de amostras LBC como fonte de determinação bioquímica de base não celular de níveis de proteína em espécimes solubilizadas proporciona a oportunidade de que os resultados do teste bioquímico de base não celular podem ser direta mente comparados a um espécime citológico, A análise bioquímica a base de proteína nesse sentido serve como, por exemplo, um pré-teste ou para fornecer informação ou mesmo para confirma um resultado citologicamente equivocado. Em modalidades adicionais, a informação obtida a partir do teste bioquímico de base não celular pode ser para o desenho de procedimentos citológicos a serem aplicados. Uma vantagem desse método para desenvolvimento de produtos é que o mesmo espécime, no qual se faz o diagnóstico de um indivíduo, pode ria ser usado para avaliar o resultado baseado bioquimicamente. Deste modo, se assegura a comparabilidade do resultado bioquímico com o diagnóstico.

[097] Amostras LBC como usadas no contexto da presente invenção são quaisquer amostras celulares que sejam preservadas em uma coleção de amostra» esto cagem ou meio de transporte padrão» conhecidos daqueles especialistas na arte, tal como por exemplo, meios de preservação comercial mente disponíveis, Cytyc "PreservCyt" ou “CytoLyt”, Digene "Universal Collection Médium", Tripath Imaging "Gytorich", etc.). Amostras LBC» consequentemente» compreendem amostras de células em qualquer meio de preservação de células adequado que possa conter uma mistura de um ou mais selecionados do grupo que consiste em álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos, íons de metais ou sublimados, éteres, etc. para preservação de componentes celulares. Os álcoois incluem metanol, etanol, (n- ou i-) propanol, (n-, i- ou t-) butanol ou álcoois ramificados ou não ramificados superiores. Aldeídos incluem formaldeído, acetaldeído, glutaraldeído, etc. Cetonas tais como acetone pode ser usada. Ácidos para uso em meios de amostra padrão incluem ácidos orgânicos (ácido acétíco, ácido tricloro-acético, ácido salicílico, ácido pícrico) ou ácidos inorgânicos tais como e.g. ácido crômico. As soluções de amostra padrão podem compreender metais tais como prata, cobre, cromo, mercúrio, ósmio, urânio. Soluções de sais tais como acetato de uranil, bicromato de potássio, sulfato de amorno, etc. podem ser componentes do meio preservativo.

[098] Amostras LBC podem ser amostras de qualquer tipo de células tomadas para varias finalidades de diagnóstico. Atualmente, as amostras LBC com respeito a diagnóstico em saúde humana são preparadas a partir de qualquer região do corpo onde os procedimentos de teste citológico e/ou microbioiógico são indicados ou parecem ser razoáveis. Acredita-se que para uma variedade de espécimes citológicas as amostras LBC proporcionam uma maneira que minimiza a perda de células e preserva o detalhe morfológico. Amostras LBG de acordo com a presente invenção, consequentemente, compreendem amostras obtidas como Aspirados com Agulhas Finas. Aspirados com Agulhas Finas podem compreender espécimes de varias fontes, tais como e.g., de mama, tireoide (por exemplo de nódulos), rins, pâncreas, próstata, pulmão, nódulos linfáticos, pleura, massas do pescoço, ovários, sínovia, massas tu morais, etc. As amostras LBC podem, além disso, ser preparadas usando fluidos corporais. Fluidos corporais adequados compreendem uma ampla faixa de fluidos obtidos do corpo humano ou animal compreendendo, porém não limitado a, por exemplo, ascitos, licor cerebroespínhal, pus ou efusões. Efusões sejam onde for que apareçam no corpo podem ser submetidas a LBC. Alguns exemplos para efusões sâo efusões pericardial, pleural, sinovial e abdominal. Fluidos corporais aos quais LBC pode ser aplicado compreendem, além disso, por exemplo fluidos presentes em alguns tumores ou cistos tais como, por exemplo, cistos mamários, cistos do ovário, ou outros. As amostras obtidas em forma líquida do corpo compreendem ainda espécimes de mucosa, tal como escarro, O LBC é amplamente aplicado a qualquer tipo de espécime cito lógico esfoliativo. Esses espécimes citológico esfoliativos sâo obtidos por vários métodos tais como e.g,, por qualquer tipo de exudado, escovação, raspagem, smear, etc. Os espécimes tais como lavados, duchas, etc. a partir de qualquer região do corpo deve ser entendido ser espécime cito lógica esfoliativo. Lavados e duchas podem ser obtidos a partir de uma ampla faixa de regiões corporais incluindo, porém não limitado a, epitélio mucoso, pele, qualquer epitélio corporal interno ou externo ou semelhante. Epitélio mucoso podem ser aqueles epitélios do trato gastrointestinal, do sistema urinário, do trato anogenital, do trato respiratório, do reto, da uretra, do cervix, da vagina, da vuIva, da cavidade oral, da cavidade endometrial, etc. Toada a gama de espécimes citológícas esfoliativas podem ser submetidas a métodos de LBC, [099] Kits usados no contexto da presente invenção são composições de componentes providos para desempenho de um procedimento de teste analítico. O kit pode compreender todos ou alguns reagentes e materiais necessários para desempenho adequado do teste. Além disso, o kit pode, em certas modalidades da invenção, compreender instruções para uma adequada aplicação dos componentes do kit incluindo e.g.» um protocolo de teste exemplar, informações de advertência e perigo e, ainda, informação adicional para o usuário do kit.

[0100] Um dispositivo de diagnóstico in vitro é um kit como anteriormente definido, que se pretende que sirva para avaliação de diagnóstico de uma condição medicamente relevante de amostras corporais de humano ou animal. Em certas modalidades da invenção, um dispositivo de diagnóstico in vitro deve ser qualquer dispositivo que esteja dentro do escopo da definição de dispositivo médico de diagnóstico in vitro conforme apresentado na Diretiva 98/79 EG, conforme o Artigo 1 (b): [0101] 'dispositivo de diagnóstico in vitro" significa qualquer dispositivo médico que é um produto reagente, calibrador, material controle, kit, instrumento, aparelho, equipamento, ou sistema, se usado sozinho ou em combinação, com intenção do fabricante de ser usado in vitro para o exame de espécimes, incluindo doações de sangue e de tecido, derivado do corpo humano, única ou príncípalmente para a finalidade de proporcionar informação referente a um estado fisiológico ou psicológico; ou referente a uma anormalidade congênita, ou para determinar a segurança e compatibilidade com receptores em potencial; ou para monitorar medidas terapêuticas.” [0102] O dispositivo de diagnóstico in vitro pode também ser aplicado aos IVD da Classe I norte-americana e geralmente aos dispositivos de diagnóstico in vitro que são fornecidos sem reivindicar seu desempenho de diagnóstico. Consequentemente, também qualquer tipo de ASR ou semelhante deve ser entendido ser um dispositivo de diagnóstico como aqui usado. Em certas modalidades da presente invenção, os kits de teste e os dispositivos de diagnóstico in vitro aos quais os métodos para desenvolvimento aqui descritos se aplicam são kits de teste e dispositivos de diagnóstico in vitro para a detecção a base proteínas ou peptídeos de marcadores moleculares.

[0103] Os procedimentos para os quais os kits e dispositivos de diagnóstico in vitro sob desenvolvimento devem ser aplicados de acordo com a presente invenção incluem detectar os níveis de moléculas marcadoras características de condições medicamente relevantes nas amostra de teste com base na análise bioquímica não baseada em células. Os marcadores adequados para esses procedimentos de teste de acordo com a presente invenção podem ser de várias origens. O padrão de expressão de um marcador, que é adequado para a detecção de condições medicamente relevantes em questão, pode ser dependente do status proliferativo de células, do status de diferenciação, do tipo de célula ou do tipo de organismo. Mais adiante são mostrados exemplos de marcadores apropriados.

[0104] O termo diagnóstico como aqui usado com relação aos kits e dispositivos de diagnóstico in vitro aqui sob desenvolvimento, geralmente compreende qualquer tipo de avaliação da presença ou ausência de uma condição medicamente relevante. Diagnóstico, assim, compreende processos tais como seleção para a pré-disposição para uma condição medicamente relevante, seleção para o precursor de uma condição medicamente relevante, seleção para uma condição medicamente relevante, diagnóstico clinico ou patológico de uma condição medicamente relevante, etc. Diagnóstico ou avaliação como aqui usado pode, ainda, compreender avaliação de prognóstico ou provisão de informação para estratificação da terapia do paciente com base no teste bioquímico de base não celular. Diagnóstico de condições medicamente relevantes, como aqui usado, pode compreender exame de qualquer condição, que é detectável a nível cito lógico, hístológico, bioquímico ou biológico molecular, que possa ser útil com relação a saúde humana e/ou ao corpo. Esses exames podem compreender, e.g., métodos de diagnóstico médico e estudos de pesquisa nas ciências da vida. Em uma modalidade da invenção, o método é usado para diagnóstico de condições medicamente relevantes, tais como por exemplo, doenças. Essas doenças podem, por exemplo, compreender desordens caracterizadas por proliferação do tipo não natural de céiuias ou tecidos.

[0105] Em uma modalidade, o diagnóstico pertence ao diagnóstico de desordens neoplãsicas e seus estágios precursores, para monitoramento do curso da doença nas desordens neoplásícas e para detecção de células tumorais disseminadas, por exemplo, no decorrer do diagnóstico de doença residual mínima. O método de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser usado no decorrer de diagnóstico clínico ou patológico de cânceres e seus estágios precursores, ou em testes de rotina como realizados para desordens neoplãsicas particulares tais como, por exemplo, para exame de exudados e.g., em testes de seleção ou separação de lesões cervícais, duchas bronquiais para câncer de pulmão ou de evacuações para lesões do trato gastrointestinal, e.g., lesões coloretais.

[0106] O método de desenvolvimento de kits e dispositivos de diagnóstico in vstro de acordo com a presente invenção é aplicável em kits e dispositivos de diagnóstico in vitro para a detecção e diagnóstico de todos os tipos de condições medicamente relevantes.

[0107] As condições medicamente relevantes como usado de acordo com a presente invenção podem, por exemplo, ser composições de tecidos, fluidos corporais, secreções, lavagens ou exudados. Essas condições podem, por exemplo, compreender a composição celular de fluidos corporais, tais como a composição de sangue, a composição de licor cérebro-espinhal ou a composição de sêmen. Nesse contexto, as composições serão, por exemplo, a presença ou ausência de tipos particulares de células (e.g., patógenos tais como vírus, etc., células pré-neoplásicas, neoplâsicas e/cu diplásicas, etc.), a presença ou ausência de padrões de diferenciação de tipos particulares de células, o número total de um tipo particular de célula (e.g., eritrócitos, leucócito,s esperma, etc.), o número total de todas as células de qualquer tipo de célula ou a fração de células de outras características presentes ou ausentes na amostra.

[0108] Além disso, as condições medicamente relevantes também podem compreender desordens relacionadas às células, ou aos tecidos. As condições a serem diagnosticadas podem compreender parâmetros relacionados às células em amostras citológicas ou histológicas. As condições podem compreender um padrão de diferenciação de células em uma amostra de tecido, tal como amostras de ressecção cirúrgica, biópsias, exudados, duchas, etc. Essas condições podem compreender e.g., desordens congênitas, desordens inflamatórias, desordens mecânicas, desordens traumáticas, desordens vasculares, desordens degenerativas, desordens de crescimento, desordens benignas, neoplasmas malignos. Um outro aspecto das condições de acordo com a presente invenção pode compreender condições caracterizadas pela presença ou ausência de características proliferai ivas. Condições caracterizadas pela presença ou ausência de características proliferativas podem, por exemplo, ser desordens proliferai ivas de células.

[0109] As desordens proliferativas de acordo com a presente invenção compreendem doenças caracterizadas por propriedades anormais de crescimento de células ou tecidos comparadas às propriedades de crescimento de células ou tecidos de controle normais. O crescimento de células ou tecidos pode, por exemplo, ser acelerado de maneira anormal, desacelerado ou pode se regulado de maneira anormal. A regulação anormal como acima usado pode compreender qualquer forma de presença ou ausência de respostas do tipo não natural das células ou tecidos à influência que regulam o crescimento que ocorre naturalmente. AS anormalidades no crescimento das células ou tecidos podem, por exemplo, ser neoplástcas ou hiperplásicas.

[0110] Em uma modalidade, as desordens proliferativas celulares sáo desordens neoplásicas tais como tumores. Tumores podem compreender tumores da cabeça e do pescoço, tumores do trato respiratório, tumores do trato anogenital, tumores do trato gastrointestinal, tumores do sistema urinário, tumores do sistema reprodutivo, tumores do sistema endócrino, tumores do sistema nervoso central e periférico, tumores da pele e seus apêndices, tumores dos tecidos brandos e dos ossos, tumores do sistema linfopoiético e hematopoiético, etc. Os tumores podem compreender, por exemplo, neoplasmas tais como tumores benignos e malignos, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas ou displasias. Em uma modalidade particular, o tumor é, por exemplo, câncer da cabeça e do pescoço, câncer do trato respiratório, câncer do trato anogenital, câncer do trato gastrointestinal, câncer da pele e de seus apêndices, câncer do sistema nervoso central e periférico, câncer do sistema urinário, câncer do sistema reprodutivo, câncer do sistema endócrino, câncer dos tecidos brandos e dos ossos, câncer do sistema hematopoiético e linfopoiético.

[0111] Tumores do trato anogenital podem compreender câncer do períneo e pele escrotal, câncer cervical, câncer da vulva, câncer da vagina, câncer do pênis, câncer do anus, etc. Câncer cervical pode compreender lesões escamosas, lesões glandulares ou outros tumores epiteliais.LesÕes escamosas compreendem, e,g„, neoplasias intraepiteliais cervicais (displasía média, moderada e severa}, carcinoma In situ, carcinoma escamoso celular (e.g., queratinizante, não-queratinizante, verrugosos, verrugas, papilar, semelhante a linfoepitelioma). Lesões glandulares podem compreender hiperplasias atípicas, adenocarcinoma in situ, adenocarcinoma {tais como mucoso, endometrióide, células claras, adenoma maligno, papilar, adenocarcinoma ceroso ou mesonéfrico). Outros tumores e pite li ais podem compreender carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células vítreas, carcinoma cístíco adenoide, carcinoma basal adenoide, tumor ca rei nó ide, carcinoma de células pequenas e carcinoma não diferenciado. Para mais informação detalhada, conferir em Kurman, R., Norris, H., et al., Tumors of the Gervix, Vagina, and Vulva, Atlas of Tumor Pathology, 1992, AFIP, cujo conteúdo é aqui incorporado para referência.

[0112] Tumores gastrointestinais podem compreender câncer de cólon, câncer de ascendentes do cólon e dos descendentes do cólon, dos transversais do cólon, do sígmóíde, do reto, câncer do intestino delgado, câncer do jejuno, câncer do duodeno» câncer gástrico, câncer esofagiano, câncer do fígado, câncer da bilis, câncer do sistema biliar, câncer pancreátíco, etc. Uma revisão completa sobre lesões gastrointestinais é apresentada em “Hamilton Sr, Aaltonen LA (Eds.): World Health Organization Classification of Tumours, Pathology and Genetícs of Tumors of the Digestive System, IARG Press: Lyon 2000,” que é aqui incorporado para referência.

[0113] Tumores do trato respiratório podem compreender qualquer condição maligna do trato respiratório tal como, e.g., câncer do pulmão, dos alvéolos, dos brônquios, da árvore bronquíal e dos brônquios, do espaço nasofaringeral, da cavidade oral, da faringe, da cavidade nasal, e do sinus paranasal. Câncer do pulmão tal como o câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células nâo-pequenas, carcinoma de pulmão de células escamosas, carcinoma de pulmão de células pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma de pulmão de células grandes, carcinoma de pulmão adeno escamoso, tumor carcinóide do pulmão, tumor da glândula bronquíal ou mesotelioma {maligno). Uma revisão sobre tumores do trato respiratório pode ser encontrada em “Colby TV, et al.i Turno rs of the Lower RespiratoryTract, Atlas of Tumor Pathology, Third Series, Fascicle 13, AFIP: Washington 1995” que é aqui incorporado para referência.

[0114] Tumores do sistema urinário podem compreender câncer de bexiga, câncer do rim, pélvis renal, câncer dos ureteres e câncer da uretra, etc. Tumores do sistema reprodutivo podem compreender câncer e estágios precursores do mesmo do ovário, do útero, dos testículos, da próstata, do epidídimo, etc.

[0115] Em todos os casos, os métodos para os quais os kits e dispositivos de diagnóstico in vitro sob desenvolvimento pelo método de acordo com a presente invenção, também se aplicam a estágios precursores das lesões, tumores ou cânceres.

[0118] Em uma modalidade, o método pertence a detecção de células tu morais disseminadas ou metástases, [0117] Em uma modalidade da invenção o câncer é, por exemplo, câncer cervical, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer da cavidade oral, etc.

[0118] Desenvolvimento como usado no contexto da presente invenção pertencerá a todas as atividades de desenho e desenvolvimento realizadas para permitir a um fabricante a produção controlada de um kit acabado ou um dispositivo de diagnóstico in vitro acabado para distribuição comercial ou venda do dito kit ou dispositivo de diagnóstico in vitro. O desenvolvimento de kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro como usado no contexto da presente invenção, assim, pertencerá a todas as atividades em conexão com o desenho e desenvolvimento, verificação do desenho e desenvolvimento, validação de desenho e de desenvolvimento, avaliação de dados de desempenho, avaliação dos dados de segurança e eficácia dos kits e dispositivos de diagnóstico in vitro, Em uma modalidade o desenvolvimento pertencerá ao teste de produtos de desenho e desenvolvimento de kits e dispositivos de diagnóstico in vitro por sua idoneidade com relação a finalidade de uso pretendido. Uso pretendido nesse sentido deverá ser entendido como as finalidades de detecção ou de diagnóstico para as quais se aplicará o kit ou o dispositivo de diagnóstico in vitro.

[0119] Os kits e dispositivos de diagnóstico in vitro desenvolvidos de acordo com um método como aqui descrito são caracterizados pelo fato da detecção de moléculas marcadoras características para condições medicamente relevantes serem realizadas com base na análise bioquímica de base não-celular, Análise bioquímica de base não-celular como usado no contexto da presente invenção se refere a todos os métodos onde é detectado um analíto ou uma molécula marcadora em uma solução, onde nenhuma informação sobre a morfologia celular ou sobre a arquitetura do tecido é usada para avaliação do diagnóstico. (Células e tecidos remanescentes não precisam necessariamente estar ausentes de cada solução.) A dita análise bioquímica de base não celular se fundamenta em informação obtida a partir da detecção da presença ou ausência de uma ou mais moléculas na solução sob investigação ou a partir da detecção de níveis de uma ou mais moléculas marcadoras sob investigação. Em certas modalidades da presente invenção os kits e os dispositivos de diagnóstico in vitro são desenhados para detectar uma única molécula m arcado ra. Em outras modalidades da presente invenção os kits e os dispositivos de diagnóstico in vitro são desenhados para detectar um jogo de moléculas marcadoras. Geralmente, o método de desenvolvimento como aqui descrito pode ser aplicado a diversos tipos de kit e dispositivos de diagnóstico in vitro. A descrição das diferentes modalidades de kits e dispositivos de diagnóstico in vitro ê apresentada anteriormente.

[0120] A detecção das ditas moléculas marcadoras no decorrer da análise bioquímica de base não celular pode ser realizada em solução ou usando reagentes fixados a uma fase sólida. Em certas modalidades da presente invenção, a detecção das moléculas marcadoras pode ser realizada a partir de uma solução de amostras corporais dissolvidas. Assim, a detecção pode ser realizada em solução ou usando reagentes fixados a uma fase sólida. Uma fase sólida como usado no contexto da presente invenção pode compreender varias modalidades de substâncias sólidas tais como superfícies planas, partículas (incluindo micro-, nanoparticulas ou mesmo partículas menores). Em cartas modalidades as partículas podem ser fornecidas como contas, colóides ou semelhantes. A fixação de reagentes à fase sólida em um kit de teste ou em um dispositivo de diagnóstico in vitro pode ser efetuada via fixação direta ou via fixação indireta. A fixação direta pode, por exemplo, ser efetuada por ligação covalente ou não covalente ou associação à superfícies. A fixação indireta pode ser efetuada através de ligação dos reagentes (e.g., anticorpos, sondas, etc.} a agentes que por si mesmos são direta mente fixados à fase sólida. Esses agentes podem compreender anticorpos ou outros agentes de ligação como estreptavidina, biotina ou semelhante. A detecção de um ou mais marcadores moleculares pode ser realizada em uma única mistura de reação ou em duas ou mais misturas de reação separadas. As reações de detecção para diversas moléculas marcadoras podem, por exemplo, ser realizadas simultaneamente em recipientes de reação de mutti-poços, ou conforme o caso, podem ser em uma única ou duas ou mais tiras de teste separadas. As características marcadoras para as desordens proliferativas de células podem ser detectadas usando reagentes que reconhecem especificamente essas moléculas. A reação de detecção no caso de mais de um marcador ser para ser detectado, pode ser compreender um ou mais reações adicionais com agentes de detecção que tanto reconhecem as moléculas marcadoras iniciais como preferencialmente reconhecem as moléculas anteriores (e.g., anticorpos primários) usadas para reconhecer os marcadores iniciais. A reação de detecção pode ainda compreender uma reação de relato indicando o nível dos marcadores característicos das desordens proliferai ivas das células. Moléculas m arcado ras como usado no contexto da presente invenção deverão em todo momento se referir a moléculas marcadoras características para condições medicamente relevantes. Os termos ‘'molécula marcadora" ou “molécula marcadora característica para condições medicamente relevante" em todas as suas formas gramaticais como usado no contexto da presente invenção se refere ácidos nucleicos, bem como a moléculas de polipeptídeos. Essas moléculas marcadoras, assim, compreendem RNA (mRNA, hnRNA, etc.), DNA {cDNA, genômico DMA, etc.), proteínas, polipeptídeos, proteoglicanos, giícoproteínas e os respectivos fragmentos dessas moléculas.

[0121] Um nível de uma molécula marcadora como aqui usado se refere a um valor semiquantitativo, bem como quantitativo com relação à quantidade do respectivo marcador presente em uma amostra. Um valor quantitativo pode, e.g., ser representado em termos de uma concentração. Um valor semiquantitativo pode ser expresso em termos de uma escala de níveis, e.g., níveis não detectáveis, baixos níveis, níveis intermediários, altos níveis ou qualquer outro modo adequado. O nível de um marcador também pode ser representado em termos de um parâmetro dependente tal como a intensidade de um sinal gerado em um formato de ensaio em resposta a presença de uma molécula marcadora.

[0122] Uma sonda para a detecção das moléculas marcadoras como usado no contexto da presente invenção deverá ser qualquer molécula que, especificamente, se liga às ditas moléculas marcadoras. A sonda pode, por exemplo, se um agente de ligação de antígeno tal como anticorpos (monoclonal ou policlonal), fragmentos de anticorpo ou moléculas artificiais compreendendo epítopos de ligação a antígeno, moléculas de ligação de DNA ou RNA tais como proteínas ou ácidos nucleicos. Ácidos nucleicos que se ligam a outros ácidos nucleicos podem, por exemplo, ser ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) ou oligonucieotídeos (RNA, D NA, PNA, ácidos nucleicos artificiais, etc,) para finalidades de detecção ou iniciadores, [0123] A molécula é dita reconhecer outra molécula se ela interage especificamente com aquela molécula. Interação especifica pode, por exemplo, ser ligação específica a, ou da outra molécula.

[0124] A reação de relato pode, por exemplo, ser uma reação que produz um composto colorido. Em uma modalidade da presente invenção as substâncias de relato correlacionadas a marcadores particulares desenvolvem diferentes cores. Em uma outra modalidade, o relato especifico do marcador de normalização pode ser uma molécula que extínga o sinal produzido pela molécula de relato especifica para o marcador, característica da condição medicamente relevante, em dependência com o nível do marcador de normalização presente na amostra. Ainda em outra modalidade as reações de relato podem produzir corantes fluorescentes com diferentes comprimentos de onda característicos. Em outra modalidade da presente invenção a reação de relato pode compreender reações de emissão de luz com diferentes comprimentos de onda característicos para as substancias de relato específicas para qualquer marcador a ser detectado. Em uma outra modalidade da presente invenção a reação de relato pode compreender a emissão de radiação radioativa e métodos adicionais para visualizar ou quantificar a radiação. Em uma modalidade as diferentes moléculas marcadoras podem ser reconhecidas por agentes, que contenham radio-nuclídeos que emitem radiação com diferentes propriedades energéticas, de maneira que poderíam ser distinguidos os sinais que se referem a moléculas marcadoras.

[0125] Formatos aplicados para as reações de detecção aplicados aos kits e dispositivos de diagnóstico ín vitro de acordo com a presente invenção podem ser técnicas de blotiing, tais como Western-blot, Southern-blot, Northern-blot. As técnicas de blottíng são conhecidas daqueles especialistas na arte e podem ser realizadas por exemplo como eletro-blots, semidry-bloís, vácuo-blots ou dot-blots, Além disso, podem ser aplicados métodos imunológicos para detecção de moléculas, tais como, por exemplo, imunoprecipitação ou ensaios imunológicos, tais como EIA, ELISA, RIA, ensaios de fluxo lateral, ensaios de fluxo direto, tiras imunocromatográficas, etc. Imunoensaios para uso na invenção podem compreender irrtunoensaios competitivos, bem como imunoensaios não competitivos.

[0126] Em certas modalidades de kits e de dispositivos de diagnóstico in viíro desenvolvidos de acordo com o método da presente invenção o teste a base de imunoquímico ou ácido nucléico podem ser realizados usando um dispositivo de teste para laboratórios clínicos. Esses dispositivos de teste podem compreender qualquer dispositivo adequado para teste imunoquímico ou a base de ácido nucléico incluindo qualquer formato tal como dispositivo de teste de ponto de cuidado, bem como dispositivos de bancada ou de laboratório. Os dispositivos podem ser, por exemplo, providos como sistemas de plataforma aberta ou fechada. O sistema pode ser baseado em qualquer metodologia adequada tal como, e.g., empregando placas de microtitulaçáo, placas de multi-poços» sistemas de fluxo direto ou fluxo lateral, microchip, sistemas baseados em arranjo ou sistemas a base de contas ou membranas. Os métodos de detecção empregados podem compreender quaisquer métodos conhecidos daqueles especialistas na arte útil para reações imunoquímicas ou baseadas em ácidos nucleicos. Esses sistemas de detecção podem ser, por exemplo, sistemas luminescentes (eletroluminescência, bioluminescência, fotoluminescência, radioluminescéncia, quimioluminescência, eletroquimio-luminescência), sistemas baseado em fluorescência, sistemas de detecção baseados em condutivídade, radiação (luz, UV, raio-X, gama, etc.) ou qualquer outro método conhecido.

[0127] O método de detecção do nível de moléculas marcadoras, para as quais os kits e os dispositivos de diagnóstico in vitro serão desenhados e desenvolvidos de acordo com os métodos aqui descritos, é em uma modalidade da presente invenção, qualquer método que seja adequado para detectar mesmo pequenas quantidades de moléculas específicas em amostras biológicas. Além disso, pode ser aplicado qualquer método para detecção das moléculas marcadoras com relação a sensibilidade. A reação de detecção de acordo com a presente invenção pode compreender, por exemplo, reações de detecção ao nível de ácidos nucleicos e/ou reações de detecção a nível de polipeptídeos. Em uma modalidade da invenção, a detecção das moléculas marcadoras pode compreender a detecção de variantes de cortes específicos. Em outra modalidade da presente invenção, o método de detecção pode compreender a detecção de modificações de moléculas marcadoras tais como fosforilação ou glicosilação, etc., de polipeptídeos ou da metilação de moléculas de ácido nucléico em a mostras .

[0128] Em certas modalidades da presente invenção, pode ser determinada a detecção do estado da metílação de ácidos nucleicos de genes tais como pl6,NK4â, p14ARF, TSLC1, Claudin, pRB, Her-2/Neu, p53, p21c,P1WAF\ p27KIP1 ou outros. A presença ou ausência de hípermetilação ou detecção do estado de LOH com base na metílação pode ser indicativa da presença de uma condição medicamente relevante.

[0129] Em uma modalidade da invenção, os kits e dispositivos de diagnóstico in vitro são desenhados em uma maneira que a detecção do nível de moléculas marcadoras é realizada pela detecção do nível de ácidos nucleicos que codificam para as moléculas marcadoras ou fragmentos das mesmas presentes na amostra. Os meios para detecção de moléculas de ácido nucléico são conhecidos daqueles especialistas na arte, O procedimento para a detecção de ácidos nucleicos pode, por exemplo, ser realizado por uma reação de ligação da molécula a ser detectada a sondas de ácido nucléico complementares, proteínas com especificidade de ligação para ácidos nucleicos ou qualquer outra entidade que reconhece especificamente e que se liga aos ditos ácidos nucleicos. Esse método pode ser realizado também in viíro ou em diretamente ín-sítu, por exemplo no decorrer de uma reação de detecção por tingimento, Uma outra maneira de detectar as moléculas marcadoras em uma amostra a nível de ácidos nucleicos, realizada de acordo com a presente invenção, é a reação de amplificação de ácidos nucleicos, que pode ser realizada de uma maneira quantitativa tal como, por exemplo, reação em cadeia de polimerase. Em uma modalidade da presente invenção e.g., RT PCR em tempo real pode ser usado para quantificar o nível de RNA marcador em amostras de desordens proliferai ivas de células, [0130] Em uma outra modalidade da invenção, os kits e dispositivos de diagnóstico in vitro são desenhados em de uma maneira que a detecção do nível de moléculas marcadoras é realizada pela determinação do nível de expressão de uma proteína, A determinação das moléculas marcadoras ao nível da proteína pode, por exemplo, ser realizada em uma reação compreendendo um agente de ligação específico para a detecção de moléculas marcadoras, Esses agentes de ligação podem compreender, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação de antígenos, anticorpos híbridos bifuncionais, peptídeos miméticos contendo epítopos de ligação de antígeno mínimos, etc. Os agentes de ligação podem ser usados em muitas diferentes técnicas, por exemplo, em western-blot, ELISA, RIA, EIA, ensaio de fluxo direto, ensaio de fluxo lateral, aglutinação com látex, tiras imunocromatográficas ou imunoprecipitação. Geralmente, a detecção baseada em agente de ligação pode ser realizada também in vitro como diretamente in situ, por exemplo no decorrer de uma reação de tíngimento ímunocitoquimica. Qualquer outro método adequado para determinar a quantidade de polipeptídeos particulares em soluções de amostras biológicas pode ser usado de acordo com a presente invenção, [0131] Métodos para a detecção dos estados modificados de moléculas de acido nucléico e/ou polipeptídeos são conhecidos daqueles com conhecimento ordinário na arte, [0132] Métodos para detecção de metilação de ácidos nucleicos são conhecidos daqueles especialistas na arte e podem compreender, por exemplo, métodos que empregam pré-tratamento químico de ácidos nucleicos com e,g., bísulfito de sódio, permanganato ou hidrazina, e subsequente detecção da modificação por meio de endonucleases de restrição específicas ou por meio de sondas específicas e.g., no decorrer de uma reação de amplificação, A detecção de metilação pode, além disso, ser realizada usando endonucleases de restrição específicas de metilação. Métodos para a detecção de estados de metilação em ácidos nucleicos estão, por exemplo, descritos nos pedidos de patente EP02010272.9, US5856Ü94, W00031294, US6331393, etc. Os documentos citados são aqui incorporados para referência, [0133] A detecção de estados modificados de polipeptídeos pode, por exemplo, compreender agentes de ligação que reconhecem especifícamente estados modificados ou não modificados de polipeptídeos. Alternativamente, enzimas tais como fosfatases ou glicosilases podem ser usadas para remover modificações nas moléculas. A presença ou ausência de modificações pode, assim, ser detectada por determinação de massa ou carga das moléculas por meio de eletroforese, cromatografia, espectrometria de massa, etc,, antes ou subsequente à incubação com uma respectiva enzima.

[0134] Em uma modalidade adicional da presente invenção, os kits e dispositivos de diagnóstico são desenhados de uma maneira que a detecção de uma serie de moléculas marcadoras é realizada a nível de polipeptídeos e simultaneamente a detecção de uma serie adicional de moléculas marcadoras e/ou de todas ou algumas das mesmas moléculas marcadoras é realizada a nível de ácidos nucleicos.

[0135] Moléculas marcadoras associadas com condições celulares medicamente relevantes podem, por exemplo, ser moléculas que tenham influência sobre e/ou reflitam a proliferação e/ou características de diferenciação de células e/ou tecidos. Essas moléculas podem compreender, por exemplo, proteínas regulatórias do ciclo celular, proteínas associadas com duplicação de DNA, proteínas t rans membranas, proteínas receptoras, proteínas transdutoras de sínas, proteínas que se ligam ao cálcio, proteínas contendo domínios de ligação de DMA, metaloproteinases, quinases, inibidores de quinase, chaperonas, proteínas de embriogenesis, proteínas de choque térmico ou enzimas que modificam outras proteínas postranslacíonalmente regulando assim sua atividade, ou ácidos nucleicos que codificam para as proteínas nomeadas. Também, os mRNA que codificam para as proteínas nomeadas podem ser moléculas marcadoras úteis de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o marcador associado com a desordem proliferativa celular pode, por exemplo, ser unicamente expresso em células afetadas pela desordem, pode não ser expresso nas ditas células ou pode ser superexpresso nas ditas células.

[0136] Os kits e dispositivos de diagnóstico in vitro desenvolvidos de acordo com o método aqui descrito compreende uma ou mais moléculas marcadoras (proteínas bem como ácidos nucleicos) escolhidos a partir de proteínas reguladoras do ciclo celular ou ácidos nucleicos que codificam para as mesmas (e..g, p53, pRb, p14ARF), cíclinas (e.g. ciclina A, ciclina B, ciclina E), inibidores de quinase dependente de ciclina (tais como e.g. pl3.5, pl4, p15INK4b, p16INK4a, p18INK4c, p19INK4d, p21WAF1/clp\ p27KIP1), antígenos associados com tumores (e.g. MDM-2, MCM2, MCM5, MCM6, CDG2, CDC6, ld’1, osteopontina, GRP, Claudin, dipeptidase renal GD46, ber2/neu, receptor TGFB(ll), genes supressores de tumores, marcadores associados a HPV (e.g, derivados de genes de genes HPV L1, L.2, E1, E2, E4, E5, E6 ou E7, etc,), antígenos de superfície celular (e.g. citoqueratínas, cateninas ou outros) ou semelhantes. Em certas modalidades as moléculas marcadoras detectadas pelos kits e dispositivos de diagnóstico ín viiro desenvolvidos de acordo com o método aqui descrito podem compreender genes engajados na duplicação de DNA tais como e..g, proteínas ou ácidos nucleicos do complexo de pré-iniciação ou da forquilha de duplicação. Essas moléculas podem, por exemplo, compreender marcadores de proliferação (proteínas bem como ácidos nucleicos) tais como helicases, (tal como helicase eucariótica he li case ou proteínas MCM [MCM2, MCM3, MCM4, MCMõ, MCM6, MCM7J, proteína TP como descrito no W00050451 e WO0217947 [também denominada HELAD1, Pomfil2, Unc-53], quinases ou fosfatases engajadas no processo de duplicação tais como e.g. CDC6, GDG7 proteína quínase, Dbf4, proteína fosfatase CDG14, CDC45 e MCM10), proteínas engajadas na forquilha de duplicação processadora (tal como e.g, PGNA ou DNA polimerase delta, proteína de duplicação A (RPA), fator de duplicação G (RFC), FEN1), moléculas necessárias para a manutenção da proliferação celular (tais como Ki67, Ki-S5 ou Ki-S2), etc. Geralmente, o método para desenvolvimento de kits e dispositivos de diagnóstico in viiro aqui descritos, é adequado para kits e dispositivos de diagnóstico in vitro baseados em várias moléculas marcado ras características de condições medicamente relevantes. Em uma modalidade as moléculas marcadoras para uma condição medicamente relevante pode ser um marcador para tumores (marcadores tumorais). As moléculas marcadoras características de tumores podem, por exemplo, ser proteínas que são expressas de uma maneira não natural em tumores comparados ao tecido de controle normal. A expressão não natural como aqui usado pode compreender níveis aumentados ou diminuídos de expressão, ou falta de expressão, ou expressão de formas do tipo não natural das respectivas moléculas. A expressão de formas não naturais de uma proteína pode compreender a expressão de formas mutantes de proteínas, que surgem por inserção, deleção ou substituição, ou mutações localizadas (frameshift) ou quaisquer outros tipos conhecidos de mutações em proteínas ou ácidos nucleicos. Em todos os casos a expressão de proteínas não natural ou níveis não naturais de proteínas, as proteínas, polipeptídeos ou fragmentos dos mesmos, ou ácidos nucleicos que codificam essas proteínas, polipeptídeos ou fragmentos desses ácidos nucleicos podem ser usados como marcadores moleculares associados com tumores e podem, assim, ser compreendidos como termo “marcadores tu morais” como usado no contexto da presente invenção. Proteínas que mostram expressão do tipo não natural em associação com tumores são descritas, por exemplo, nos documentos WO9904265A2, WO0149716A2, WO0055633A2 e WO0142792A2, que são incorporados aqui para referência.

[0137] Em uma modalidade da invenção, o marcador característico para a condição medicamente relevante pode ser uma proteína reguladora do ciclo celular como, por exemplo, uma ciclina, uma quínase dependente de ciclina ou um inibidor de quínase dependente de ciclina. Em uma outra modalidade da invenção, o marcador característico para a condição medicamente relevante pode ser um marcador associado com uma infecção viral transitória ou persistente. A infecção viral pode compreender uma infecção pelo vírus do papíloma humano (HPV) como um HPV de alto risco ou baixo risco. O HPV de alto risco pode compreender subtipos de HPV tais como e.g., 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 and 58. Os marcadores para infecção por HPV podem, por exemplo, compreender produtos de expressão de HPV dos genes de HPV L1, L2, E2, E4, E6 ou E7. Em uma terceira modalidade da invenção, um marcador característico para uma infecção viral pode ser usado em combinação com qualquer outro marcador para uma condição medicamente relevante tal como, e.g., em combinação com uma proteína reguladora do cicio celular. Combinações de moléculas marcadoras, que pode ser de especial interesse com relação a associação do HPV são, por exemplo, descritas no documento W00208764 que será aqui incorporado para referência.

[0138] Em uma modalidade, as proteínas reguladoras do ciclo celular para uso em combinação com marcadores de HPV podem, por exemplo, ser escolhidas do grupo que consiste em pRb, p53, pl4ARF, inibidores de quinase dependente de ciclina. Em uma modalidade especial, por exemplo, pode se usar p16INK4a em combinação com marcadores para HPV (e.g, LI, L2, E2, E4, E5, E6 OU E7), [0139] Em certas modalidades da presente invenção, é realizada a detecção do transcrito ou nível de proteína de genes de HPV. Nesse sentido, a normalização da amostra empregada no teste bioquímico de base não celular para a informação de certa informação cito lógica preparada a partir da mesma amostra LBC pode ser de certa vantagem. Em uma modalidade da presente invenção, é efetuada uma normalização da amostra para uso no teste bioquímico de base não celular com relação ao volume de amostra LBC necessário para preparar espécime de ThinPrep™ usando o processador Gytyc™ ThinPrep™. Isto pode produzir resultados comparáveis sem importar a quantidade de ácidos nucleicos de HPV em comparação com as células presentes na amostra. Se essa normalização for omitida não se efetuará a correlação de infecção por HPV com a celularidade.

[0140] Para o método de detecção de condições medicamente relevantes conforme aqui descrito quaisquer moléculas marcadoras podem ser aplicadas principalmente para diversas condições medicamente relevantes.

Todavia, certas moléculas marcadoras são conhecidas estar associadas com condições medicamente relevantes específicas. Aqueles de conhecimento na arte sabem quais as moléculas marcadoras poderíam ser usadas de maneira razoável em um método de acordo com a presente invenção para a detecção de uma condição medicamente relevante em uma amostra corporal solubilizada. Na Tabela 3 abaixo são apresentados exemplos de condições medicamente relevantes e moléculas marcadoras adequadas para aplicação em um método de acordo com a invenção. A informação é para exemplificação do método como aqui descrito e não para restringir o escopo da invenção, que está estabelecido de maneira geral aplicável a moléculas conhecidas que aqueles de conhecimento na arte sabem estarem associadas com condições medicamente relevantes.

Tabela 3 [0141] As moléculas marcadoras para condições medicamente relevantes de acordo com a presente invenção podem ser características para a presença ou ausência de uma condição medicamente relevante. Em uma modalidade da presente invenção as moléculas marcadoras podem ser características para propriedades específicas de condições medicamente relevantes. Essas características podem compreender o potencial de progressão, informação de prognóstico, comportamento com relação a certos tratamentos terapêuticos da condição medicamente relevante. As moléculas marcadoras características para condições medicamente relevantes podem, desta forma, ser moléculas marcadoras úteis para a determinação de prognóstico de indivíduos afetados pelas condições medicamente relevantes ou para estratificação de terapia de indivíduos afetados pelas condições medicamente relevantes. Isso pode, em certas modalidades, se aplicar a determinação de presença ou ausência da expressão de certas moléculas marcadoras que são indicativas de prognóstico positivo ou negativo em condições medicamente relevantes específicas (e.g., nível de expressão de p16, Her-2/Neu, Brca-2, Claudina ou outras em câncer de mama, etc.). Exemplos de moléculas marcadoras que permitem avaliar o prognóstico de indivíduos afetados com condições medicamente relevantes são conhecidos dos especialistas na arte. Quaisquer marcadores conhecidos de procedimentos citológico ou h isto lógico podem ser usados em um método de acordo com a presente invenção. A avaliação de prognóstico pode, por exemplo, ser realizada durante o após o diagnóstico primário da condição medicamente relevante, durante ou após (cirutgia) tratamento da condição medicamente relevante ou em qualquer outro estágio do histórico da respectiva condição medicamente relevante. Em outras modalidades o método de acordo com a presente invenção pode ser usado para estratificação de tratamento de indivíduos afetados com condições medicamente relevantes. Essa estratificação pode, por exemplo, compreender a seleção de certos compostos terapêuticos no sentido de procedimentos de Teradiagnósticos (como usado, e.g., para seleção de pacientes para terapia com Herceptina ou semelhante), seleção de pacientes para quimioterapia, para radioterapia ou qualquer outra decisão sobre o tratamento terapêutico adicional de indivíduos ou geraimente para a decisão sobre o tratamento medico de indivíduos como a verificação de prosseguimento ou semelhantes.

[0142] Em certas modalidades da presente invenção as moléculas marcadoras características para condições medicamente relevantes podem ser marcadores indicativos de progressão da condição medicamente relevante. Em certas outras modalidades da presente invenção, as moléculas marcadoras características de condições medicamente relevantes podem ser usadas em combinação com moléculas marcadoras características de uma mera presença da dita condição medicamente relevante.

[0143] O desenvolvimento de acordo com a presente invenção é realizado usando amostras LBC como material cru. Em uma modalidade da presente invenção, os kits ou dispositivos de diagnóstico tn vitro desenvolvidos de acordo com o método aqui descrito são para uso com qualquer tipo de amostra corporal solubilizada. Em outra modalidade da presente invenção os kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro desenvolvidos de acordo com o método aqui descrito são para uso com amostra LBC unicamente. Nesse caso, o kit ou o dispositivo de diagnóstico in vitro é desenvolvido e fabricado para análise de amostras LBC solubilizadas como um teste adjunto ou teste conjunto à análise citológica ou como um teste autônomo.

[0144] O método para desenvolvimento de kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro de acordo com a presente invenção está direcionado para o desenvolvimento de kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro para formatos de teste bioquímico. Nesses formatos de teste, é detectada a presença ou ausência e/ou o nível de moléculas marcadoras nas amostras solubilizadas. A solubilização das amostras corporais é realizada usando um meio de lise adequado conforme anteriormente detalhado, O desenvolvimento de um kit ou dispositivo de diagnóstico in vitro de acordo com a presente invenção faz uso de amostras LBC para desenho, desenvolvimento, verificação de desenho e desenvolvimento, validação de desenhos e desenvolvimento. Além disso, um método para desenvolvimento de kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro com base em amostras LBC como aqui usado é qualquer método que emprega amostras LBC para proporcionar documentação técnica e/ou de evidência de segurança e eficácia para finalidade de esclarecimentos para a autoridade reguladora ou aprovação dos respectivos kit ou dispositivo de diagnóstico in vitro junto às autoridades regulatórias e, se aplicável, órgãos reguladores (notificados). O método de desenvolvimento de kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro como aqui descrito pode empregar amostras LBC em todos os estágios do desenho, desenvolvimento, verificação, validação, provisão de dados para a submissão regulatória e escIarecimentos/aprovação, ou pode empregar amostras LBC somente em um ou algumas das etapas mencionadas dos desenho e desenvolvimento dos kit ou do dispositivo de diagnóstico in vitro. Em uma modalidade da invenção o método de desenvolvimento de kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro de acordo com a presente invenção é um método para desenho e desenvolvimento dos ditos kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro, onde as amostras LBC são usadas para desenho e desenvolvimento, verificação e/ou validação. Em uma outra modalidade da invenção, o método de desenvolvimento de kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro é um método para provisão de dados para a apresentação reguladora e esclarecimentos/aprovação de kits e/ou dispositivos de diagnóstico in vitro junto as autoridades regulatórias nacional ou regional e/ou órgãos regulatórios (notificados) nacionais ou regionais, onde as amostras LBC são usadas para provisão de dados técnicos, dados de desempenho, ou dados de segurança e eficácia com relação ao kit ou ao dispositivo de diagnóstico in vitro. Em uma outra modalidade da invenção, o método de desenvolvimento de kits ou dispositivos de diagnóstico in vitro é um método onde os últimos métodos são combinados.

[0145] O método de desenvolvimento de kits e dispositivos de diagnóstico in vitro como aqui detalhado faz uso de amostras LBC em qualquer forma que seja adequada para recolher dados sobre as características de desempenho do kit ou do dispositivo sob desenvolvimento. Geralmente, as amostras LBC são usadas como uma fonte de amostras corporais para serem usadas no decorrer do desenvolvimento do kit ou do dispositivo de diagnóstico in vitro. Em uma modalidade da presente invenção, a amostra LBC é fornecida como um espécime solto, onde o espécime citológico foi preparado a partir da amostra LBC antes, durante ou após o uso de partes da amostra LBC para o método de desenvolvimento de acordo com a presente invenção. Em uma outra modalidade, a amostra LBC foi obtida unicamente para fins de uso em um método de desenvolvimento de acordo com a invenção. Nesse caso uma segunda, e pode ser uma terceira, amostra LBC ou ainda a amostra preparada por métodos não convencionais de camada delgada para avaliação citológica pode ter sido obtida antes ou após a amostragem da respectiva amostra LBC usada no método de desenvolvimento de acordo com a presente invenção.

[0146] Com relação às amostras LBC usadas no método de acordo com a presente invenção, a informação relativa aos procedimentos citológicos pode estar presente ou ausente. Essa informação compreende, e.g., o volume de uma amostra LBC necessário para a preparação de uma informação de preparação de camada delgada adequada ou informação sobre o conteúdo celular do espécime de LBC» informação sobre a idoneidade do espécime LBC ou procedimento de amostragem subjacente, informação sobre a informação de diagnóstico avaliada com base no espécime citológíco, informação sobre a doença e diagnóstico do paciente, etc.

[0147] Em um método de acordo com a presente invenção, a amostra LBC obtida é usada tanto em sua totalidade ou somente em partes. Em certas modalidades da invenção, o volume total de uma amostra LBC é usado para finalidade de desenvolvimento. Em outra modalidade o número total de células contidas na amostra é usado para a finalidade de desenvolvimento. Ainda em outra modalidade somente uma fração do volume total ou do número total de células contidas na amostra original LBC é usado para finalidade de desenvolvimento.

[0148] Em um método de acordo com a presente invenção pode ser aplicada uma normalização da amostra LBC. Em certas modalidades da invenção» pode ser aplicada uma normalização da amostra LBC para assegurar a presença de uma quantidade comparável de células nos processos de desenvolvimento realizados usando a amostra LBC. Isso pode ser alcançado pela normalização do volume da amostra LBC com relação ao volume da dita amostra necessária para a preparação de um espécime de camada delgada apropriado. A preparação de um espécime de camada delgada pode ser realizada por qualquer método adequado tal como, e.g.» empregando processador ThinPrep™ ou semelhante. Nesse caso, o volume da fração da amostra LBC para emprego no processo de desenvolvimento de acordo com a presente invenção pode ser desconsiderado. Em certas outras modalidades, a normalização da amostra LBC é realizada com relação ao volume da amostra submetida ao procedimento de teste. Nesse caso a quantidade de células presente na fração da amostra LBC para emprego no processo de desenvolvimento de acordo com a presente invenção pode ser desconsiderado. Exemplos de desempenho de normalização conforme aqui descrito são apresentados nos Exemplos 4ff.

[0149] Um outro aspecto da presente invenção é um método para avaliação de condições medicamente relevantes por análise bioquímica de base nâo celular da presença ou ausência e ou do nível de molécula marcadora em amostras solubilizadas, onde a amostra corporal é uma amostra LBC. Em certas modalidades da invenção o método para avaliação de diagnóstico compreende uma normalização da quantidade de amostra aplicada ao teste bioquímico de base não celular com relação a informação acessível a partir de uma preparação cítológica (e.g., camada delgada) gerada a partir de uma amostra LBC. Essa informação pode, e.g., ser informação sobre a celuiaridade da amostra. Nesse sentido, a celularidade deve ser entendida como o conteúdo celular por mL presente no meio, A celularidade pode ser referir a um conteúdo total de células de qualquer tipo ou natureza. Em outras modalidades, o termo celularidade pode ser referir ao conteúdo de tipos específicos de células definidas na amostra LBC. Essas células podem ser, por exemplo, células definidas por meio da fonle ou da localização (e.g., células endocervicais, células ectocervícais» células endometriais, células cervicais, células vagínais), células definidas pelo estado de proliferação e/ou diferenciação (e.g,, células metaplásicas, células displásicas, células infectadas por HPV, etc.) ou qualquer outro tipo definido de células.

[0150] O método de detecção aqui descrito nesse sentido pertence a detecção de moléculas marcadoras tais como ácidos nucleicos ou proteínas ou peptídeos e aos respectivos fragmentos dos mesmos. Em certas modalidades, a detecção de moléculas marcadoras é realizada pela detecção da presença ou ausência e ou o nível de proteínas, peptídeos ou fragmentos dos mesmos nas amostras solubilizadas. As moléculas marcadoras que podem ser aplicadas para esse método são descritas cima como “moléculas marcadoras características para condições medicamente relevantes". O método pode ser aplicado a qualquer condição medicamente relevante como acima definido. Em outras modalidades da invenção, são detectados ácidos nucleicos de moléculas marcadoras características para as condições medicamente relevantes. Ácidos nucleicos como usado nesse sentido é definido acima na descrição da invenção.

[0151] A detecção das moléculas marcadoras nos métodos como aqui descrito se refere a qualquer método de detecção adequada como acima definido. Em certas modalidades a detecção de proteínas e peptídeos é realizada por meio de detecção imunoquimíca.

[0152] Por meio da presente invenção, é possível diagnosticar desordens neoplásícas tais como cãnceres e seus estágios precursores de maneira precoce. Em particular, estágios precursores de cãnceres podem ser detectados precocemente. Também deve ser enfatizado que é possível fazer uma diferenciação com relação a alterações inflamatórias benignas ou metaplásicas de desordens neoplásicas, Uma outra característica é que os resultados obtidos por um método de acordo com a invenção não dependem de uma avaliação subjetiva, de maneira que, por exemplo, resultados falso-negativos e falso positivos de teste de papanicolau ou de preparações histológicas, podem ser reduzidos ou evitados. Além disso, a presente invenção se distingue por seu manejo rápido e simples, de maneira que eia pode ser usada para medições exaustivas, particularmente em países do terceiro mundo. Assim, a presente invenção representa uma importante contribuição para os diagnósticos dos dias de hoje de doenças cancerosas.

[0153] A invenção é ilustrada ainda pelos seguintes exemplos, os quais não são para serem considerados como limitantes da invenção em escopo ou espírito aos procedimentos específicos neles descritos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Detecção de Neoplasia Intraepitelial Cervical em um formato de teste.

[0154] 33 exudados cervicais providos em um meio de li se foram submetidos a uma detecção a base de ELISA de superexpressão de inibidor de quínase dependente de ciclina p16INK4a em soluções preparadas a partir de células contidas em exudados. O teste ELISA foi realizado como se segue: (A) Use Celular [0155] Exudados cervicais raspados foram colocados em recipientes de 15 ml, contendo 2 ml de meio de lise mtm (% Triton X-100, 0.4% SDS, 0,6mM PMSF em PBS), As células cervicais presentes nos raspados foram lisadas por pelo menos 20h. Os Usados das amostras de exudados cervicais foram então transferidos em tubos de 2 ml e foram centrifugados a 4eC (15 min a 28.000 x g (16.600 rpm Highspeed Centrifuge JEC Multi RF»; o sobrenadante foi transferido para um tubo novo, O sobrenadante pode ser estocado a -2CFC.

(B) Realização do ELISA

[0156] Revestimento das placas de ELISA

[0157] Uma solução padrão de anticorpo específico p16INK4a clone mtm E6H4 foi diluída em PBS para dar uma solução de revestimento pronta para uso.

[0158] Foi adicionada 50 μ! da solução de revestimento a cada poço das placas de ELISA, [0159] Para o revestimento, as placas foram incubadas durante a noite a 4ÇC.

[0160] A solução de revestimento foi removida das placas de ELISA e as placas foram lavadas usando uma lavadora de ELISA automática como segue: • 7 x 250 μΙ de tampão de lavagem (0,1% Tween20 (v/v) em PBS) [0161] Após remoção do remanescente do tampão de lavagem, 300 μΙ de tampão bloque ado r (2% BSA em PBS) foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas por 1 hora sobre um dispositivo de agitação a temperatura ambiente.

Incubação com amostras [0162] Após remoção do tampão de bloqueamento, 100 μΙ da amostra de célula lisada foi adicionada a cada poço. Os lisados de células HeLa foram usados como controle positivo.

[0163] Para fins de calíbração do teste, diferentes concentrações de proteína pi 6INK4a recombinante {0 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 400 pg/ml, 800 pg/ml)foram incluídas no teste.

[0164] As amostras foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente.

[0165] Em seguida, foi realizada a lavagem sobre uma lavadora ELISA automática como segue: • 7 x 250 μΙ de tampão de lavagem. O remanescente do tampão foi removido.

[0166] Incubação com anticorpo de detecção [0167] A solução de trabalho de anticorpo secundário biotinilado clone D7D7 específico para proteína pl6INK4a p16INK4a foi preparada por diluição da solução padrão.

[0168] 100 μΙ de solução de trabalho foi adicionada em cada poço. Após a incubação por 1 hora a temperatura ambiente (TA), a solução de anticorpo foi removida e as placas de ELISA foram lavadas por ma lavadora de ELISA automática. • 7 x 250 μΙ de tampão de lavagem.

[0169] Detecção [0170] Polímeros de est repta vi d i na- H R P (1mg/ml) foram pré-diluídos 1:10 (4μΙ + 36μΙ de tampão de incubação).

[0171] A solução de incubação final foi preparada por diluição 1:30G em tampão de incubação (0,1% BSA em PBS) para uma concentração final de 0,33 μΙ/mL

[0172] Em seguida, o tampão foi removido e as placas foram lavadas manualmente com 200 μΙ de tampão de lavagem por poço 5 vezes.

[0173] Incubação do substrato [0174] Substrato TMB foi equilibrado a 25eC por 1 h no escuro.

[0175] 100 μΙ de solução de substrato foi adicionado em cada poço.

[0176] As placas de ELISA foram incubadas a 25eC por exatamente 15 min no escuro. Então a reação foi parada por adição de 80 μΙ H2S04 2,5 M.

[0177] Dentro de 5 minutos, após parada da reação, foi determinado a OD a 450 nm. Após avaliação dos resultados, cada amostra retornou a um valor para OD.

[0178] Os resultados desse experimento são apresentados na Tabela 4. Os resultados de ELISA foram comparados aos resultados de diagnóstico de um teste de Papanicolau (teste PAP, citologia cervícal) dos mesmos pacientes. As citologias cervicals foram avaliadas de acordo com a Classificação II de Munique (1990). Pap II abrange células benignas, cervicitis e metaplasia, Pap IV abrange displasia severa e careinorna in situ. É evidente que as amostras que retornam um OD maior do que 0,9 no ELISA correspondem a amostras que são classificadas como displásicas pelo teste citológico de PAP convencional.

[0179] Aplicando uma OD de 0,9 como limiar das amostras, os resultados de ELISA podem ser relatados como se segue: Tabela 4 [0182] O teste ELISA é positivo em todas as amostras (100%) de mulheres que tem displasia severa e é negativo em todas as 30 amostras (100%) das mulheres que não possuem displasia.

[0183] Usando o limiar avaliado nesses experimentos, os espécimes citológicos de 300 pacientes foram testados no formato de teste ELISA apresentado. Nesses experimentos, os espécimes identificados como sendo dísplásicos pelo exame citológico também podem ser identificados como displásícos no formato de teste ELISA.

[0184] Os resultados mostram que a quantificação da proteína pl6'NK4a 0m amosíra solubilizada de paciente permite detectar displasías a partir das amostras. O diagnóstico no presente exemplo está baseado na comparação do nível de p16INK4a determinado em uma especifica amostra de paciente ao nível que se sabe estar presente em amostras normais não displásicas. A comparação é realizada no formato de teste pela aplicação de um valor limiar para a OD determinada em ELISA acima cuja amostra é para ser classificada como positiva.

Exemplo 2: Deteccão de Neoplasia Intraeoitelial em um formato de teste de Fluxo Lateral [0185] Nove exudados eervicaís em solução PreservCyt (Cytyc Corporation, Boxborough, MA Cytyc Corporation, Boxborough, MA) foram submetidos ao teste convencional PAP e simultaneamente à detecção a base de fluxo lateral de superexpressão de Inibidor de quinase dependente de cíclina P16INK4a em soluções preparadas a partir de suspensões de células obtidas dos exudados. O teste de fluxo lateral foi realizado como segue; (A) Lise Celular [0186] 10 ml das suspensões celulares a partir de amostras de exu dados cervícais individuais providas como materiais fixados por PreservCyt™ foram transferidos para um recipiente de reação de 15 ml. As amostras foram centrifugadas por 15 min a temperatura ambiente a 1500 x g (3000 rpm, Heraeus Varifuge, rotor 8074); o sobrenadante foi descartado, e o metanol remanescente foi deixado evaporar (15 min a temperatura ambiente); o pellet foi solubilízado em 500 μΙ de tampão de lise e transferido para um recipiente de reação de 15 ml, A solução foi centrifugada a 4aC (15 min a 28000 x g (16600 rpm Microcentrífuge Biofuge fresco); o sobrenadante foi transferido para um tubo novo. O sobrenadante pode ser estocado a -20-C. (B) Realização do Ensaio de Fluxo Lateral [0187] Aplicação de anticorpo de captura à membrana [0188] Solução padrão de anticorpo específico p16INK4a clone mtm E6H4 foi diluída em TBS (contendo 1% de albumina de soro bovino), para dar uma solução de eletroimunotransferência pronta para uso com uma concentração de 1 mg anticorpo/ml. A solução pronta para uso foi transferida para uma membrana de nitrocelulose em 30μΙ/30αη. Mechas de Whatman foram anexadas em uma extremidade da nitrocelulose e as barras submersas secas durante 1 hora a 37eC. Então, se deixou equilibrar na temperatura ambiente e se cortaram as barras de imersão de 4 mm de largura.

[0189] Preparação da solução de Conjugado [0190] A solução padrão de anticorpo específico pl6,NK4a clone mtm D7D7, conjugada a ouro coloidal (40 nm de tamanho de partícula) foi diluída em TBS (contendo 1% de albumina de soro bovino) para dar uma solução de anticorpo de detecção pronta para uso com uma concentração final de 1,0 OD a 520nm.

[0191] Incubação com amostras [0192] Então, 20 μΙ das amostras de células lisadas foram adicionados a uma solução de anticorpo de detecção pronta para uso em um poço de mícrotitulação e misturadas, A barra de imersão, revestida com anticorpo de captura clone E6H4, foi adicionada ao poço, a amostra foi lavada e deixou-se correr até seu termino. O sinal foi lido enquanto a barra ainda estava úmída.

[0193] Resultados [0194] Em nosso formato de teste, 2 amostras (amostras 1 e 2) classificadas como PAP IVa por tingimento de PAP e, assim, contendo células displãsicas, apresentaram claramente bandas roxas visíveis na área em que havia anticorpo de captura. Em contraste, nenhuma banda foi detectada nas outras 7 amostras (amostras 3-9), classificadas como PAP ll-lll por tingimento por PAP e, assim, não continham células displásicas.

[0195] O ELISA foi realizado pelos mesmos protocolos dados no Exemplo 1. Os resultados estão mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 [0197] A invenção, e a maneira e processo de fabricar e usar esta, são descritos agora em termos completos, claros, concisos e exatos para permitir qualquer pessoa especialista na arte a qual eia pertence fazer e usar a invenção. Deve ser entendido que o anteriormente relatado descreve modalidades preferidas da presente invenção e que modificações podem ser feitas sem se afastar do escopo da presente invenção conforme determinado nas reivindicações. Para ressaltar de maneira particular e reivindicar de maneira distinta a matéria técnica considerada como invenção, as reivindicações concluem esse relatório.

Exemplo 3; Detecção de transcritos..p16INK4a and p14arf por RT- PCR

[0198] Amostras cervícais de 50 indivíduos foram usadas para análise. Para cada indivíduo foram obtidas duas amostras, uma em Meio de Coleção Universal e outra em solução PreservCyt™. Ambas as amostras foram obtidas durante a mesma sessão de exame. Para cada um dos indivíduos estava disponível um diagnóstico baseado na análise de um espécime de camada delgada cervical preparado da solução PreservCyt™. 20 das amostras incluídas no presente estudo foram escolhidas para serem diagnosticadas como NILM, 20 amostras foram escolhidas para ser LSIL e 10 amostras foram escolhidas para ser HSIL. De todas as amostras o nível de transcritos de p16INK<5a e de p14ARF foram determinados a nível de rtiRNA por RT-PCT de acordo com o protocolo seguinte.

[0199] Para desempenho da análise, as células foram peletizadas a partir de soluções UCM e PreservCyt™ por centrifugação. As peletes obtidas foram diretamente submetidas ao procedimento de preparação de RNA.

[0200] A pelete foi diluída e re-suspensa em Tampão RLT pronto para uso. Após adicionar 70% de etanol ao lísado homogeneizado a suspensão foi misturada por pipetagem.

[0201] Purificação e isolamento de RNA foi realizado usando colunas GlAamp Spin de acordo com as instruções do fabricante.

[0202] A concentração de RNA foi determinada foto métrica mente a 260 nm. Para a reação de transe ri ptase reversa foram usados de 100 ng até 500 ng RNA. O DNA foi degradado pela reação de Dnase como segue.

[0203] 17,0 pLRNA (6-30ng/pL) [0204] 1,0 pIGrau I Amp DNAse (1 Unit/pl)(lnvitrogen) [0205] 2,0 pITampão Reação DNAse (10x){lnvítrogen) [0206] 20, ΟμΙ Volume total [0207] A incubação foi realizada por 15 min a 25°C e reação foi parada pela adição de 2μΙ EDTA 25 mM e incubação por 10 Min a 65 *€.

[0208] A síntese de cDNA foi realizada usando o volume total de transcriptase reversa Omniscrípt usando Dnase digerida na presença de RNAsin.

[0209] A reação foi realizada por 2 h a 37°C e subsequentemente 5 min a 93 °G. Em seguida a mistura foi estocada a 4°C, Isso rendeu uma solução de cDNA pronta pra uso para a Taqman-PCR (corresponde a uma concentração de cDNA de cerca de 7-36 ng/5pl). Para uso na RT-PCR a mistura de reação 40μΙ cDNA foi diluída com 30μ! RNase-livre de água para um volume de 70 μΙ. Os iniciadores usados foram: Inícíador p16INK4a, dianteiro: 5’-CGA ATA GTT ACG GTC GGA GG-3’ Iniciador p16INK4a, reverso. 5’-ACC AGC GTG TGC AGG AAG-3’ Iniciador p14ARF, dianteiro: 5'-CCG CCG CGA GTG AGG GTT-3" Iniciador p14ARF, reverso. 5’-TGC CGA TC A TC A ΤΘΑ CGT GGT CT-3' Gomo reações de PCR controles para 6-actina e GAPDH foram realizados usando os inici adores: Iniciador (63) β-Actin, dianteiro: 5’-CGT AAA AGC CAC CCC ACT TGT C-3’ Iniciador (64) β-Actin, reverso: -ATG GTA TGA GGT GGG GTG TGT G-3 Iniciador GAPDH, dianteiro: 5’-ACC AGA GTG GAT GCC ATG AC-3’ Iniciador GAPDH, reverso: 5’-TCC AGG ACC GTG TTG GTG TA-3* Cada iniciador foí usado em uma concentração de 300nmol. A mistura de reação para RT-PCR era composta como segue: 12,5 μΙ SYBR-Umíx 0,25 μΙ Mtx Iniciador 7,25 μΙ Wasser für die Molekularbiologie 5.0 μΙ solução cDNA 25.0 μΙ volume total As condições para a etapa 2 do PC R em Tempo Real (RT) são: 1a. Etapa: 50¾ 2 Min, 95¾ 10 Min 2a Etapa: 95¾ 15 seg, 60¾ 1 Min 10 sec, 40 Ciclos [0210] A avaliação dos resultados de RT-PCR foi realizada pela estimação do grau de superexpressão dos transcritos p16IN:K4a com base no nível de transcritos detectados nos espécimes da amosta comparado com os níveis de transcritos presentes em tecido normal ou espécimes de células. A normalização com relação ao nível de genes mantidos em casa detectados em cada amostra foi realizada para os níveis de pl4ARF antes da análise da superex pressão. Uma superexpressão de 0 a 24 vezes comparado para tecido normal foi considerada como não relevante. Somente níveis de superexpressão de pi6,NK4a e pl4ARF maiores do que 24 vezes foram consideradas como signifícatívamente níveis de transcrito elevado nas amostras. Deve ser ressaltado que esse esquema de avaliação é somente um de adequados métodos igualmente severos. Aqueles especialistas na arte sabem como os resultados de RT-PCR podem ser usados para estimar níveis de transcritos e fazer correlações com parâmetros clínicos dos espécimes. O Limiar mencionado nesse exemplo é exemplificativo e pode variar dependendo das condições.

[0211] Os valores obtidos do espécime UCM de uma amostra e o correspondente espécime PreservCyt™ apresentaram o mesmo resultado.

[0212] A comparação do nível de transcrito detectado para o diagnóstico do espécime correlacionado a partir da citologia mostrou boa correlação entre níveis elevados de transcrito e a presença de lesões cervícais diagnosticadas com base nos espécimes de camada delgada citológícos.

[0213] A correlação foi como se segue.

Tabela 6 [0214] O experimento mostra que um método para detecção de nível de transcrito de p1 6INK4a e p14ARF em amostras cervícais lis adas é adequado para avaliação do diagnóstico de lesões cervícais e seus precursores. As soluções de preservação celular testadas de ambos os genes testados podem ser usadas para adição na avaliação de diagnóstico de neoplasia intraepitelial cervical, onde p16lNK4a mostra resultados ligeiramente melhores do que p14ARF

Exemplo 4: Análise de captura híbrida de níveis de transcrito de plgiNK^a e pi 4arf em amostras citolóqicas em meio liquido a partir de exudados da. cavidade oral escarro e exlidados cervicais [0215] Cada 10 amostras LBC em solução PreservCyt™ ou CytoLyt™, respectívamente de exudados cervicais de indivíduos com lesão HSIL diagnosticada, de escarro de indivíduos com câncer de pulmão de células pequenas, e exudados da cavidade oral de indivíduos com câncer da cavidade oral foram usadas para cada molécula marcadora no presente exemplo (foram incluídas em total de 20 espécimes para cada entidade cancerosa). Para cada espécime cervica! e oral, uma análise de captura híbrida para a presença de tipos de hrHPV e de transcritos de p16INK4a e p14ARF foi realizada. A captura híbrida para tipos de hrHPV foi realizada usando teste HybridCaptrue hc2 da Digene Corp. A análise de captura híbrida para os transcritos de inibidores de quinase dependente de ciclína foi realizada como descrito abaixo, (A) Use Celular [0216] Para o presente exemplo a quantidade de amostra LBC era dependente do conteúdo celular da amostra LBC. Um espécime de camada delgada de cada amostra foi preparado usando um processador Cytyc ThinPrep™. A massa da amostra LBC foi determinada antes e após a preparação do espécime de camada delgada. Como o processador ThinPrep™ consome a cada processamento somente a quantidade de amostra necessária para uma densidade celular especifica no filtro, o volume consumido é uma medida para a concentração celular relativa na amostra LBC. No presente exemplo, a partir de cada LBC duas vezes a massa consumida para a preparação do espécime de camada delgada pelo processador TninPrep™ foi aplicada para a análise de captura híbrida. (Foram excluídas as amostras para a qual a celularidade da amostra LBC foi muito baixa.) Para realização da análise as células foram peletizadas a partir de soluções de CytoLyt™ e PreservCyt™ por centrífugação, [0217] A pelete foi diluída e re-suspensa em Tampão RLT pronto para uso. Após adição de etanol 70% ao lísado homogeneizado a suspensão foi misturada por pipetagem.

[0218] A purificação e isolamento de RNA foram realizados usando colunas QIAamp Spin de acordo com as instruções do fabricante.

[0219] Para detecção do p16INK4a mRNA foi usada uma mistura de sondas de oligonucleotídeo DNA 40-mer especifico para ρ16,ΝΚ4δ and p14ARF

As sondas mais adequadas na mistura tinham as seguintes sequências: p14ARF: 5’-GGT CCG CCA CTC GGG CGC TGG CCA TC A TC A TGA CGT GGT C-3’ 5’-GGG ACT GGG GGG GTG GGG ATG ATG ATG ACC TGG TCT TGT A -3’ 5*-TGG GGG GGT GGG CAT GAT GAT GAG GTG GTG TTC TAG GAA G-3’ 5’-CGC TGG GGA TGA TGA TGA GGT GGT GTT CTA GGA AGC GGG T -3’ 5-CCC ATG ATC ATG ACC TGG TCT TCT AGG AAG GGG GTG GTG G -3’ 5’-CAT CAT CAT GAG GTG GTG TTC TAG GAA GGG GGT GGT GGG CTA G-3’ 5’-TGG GGA TGA TGA TGA CGT GGT GTT GTA GGA AG-3’ 5’-ATG ATG ATG ACC TGG TGT TGT AGG AAG GGG GTG GTG GGG TAG-3’ [0220] É vantajoso colocar as sondas sobre as bordas entre o Exon 1 β e Exon 2 para assegurar que somente mRNA especifico de p14ARF seja reconhecido pelas sondas {a situação é similar para condições de PCR específicas para p16,NK4a e p14ARF respectivamente; pares de ínícíadores poderíam ser selecionados para cobrir a cercania do Exon dentro do amplificado). Qualquer outra sonda que reconheça p14ARF mRNA pode similarmente ser usada. As sondas descritas nesse exemplo são usadas como um exemplo e não devem ser entendidas como limitadoras do escopo da invenção, Sequencia de sonda compreendendo as sequências acima ou fragmentos das mesmas podem, similarmente serem usadas para um método aqui descrito.

[0221] Para pl6,NK4a as sequências da sonda promissora para são as seguintes: 5-CTC CGC CAC TCG GGC GCT GCC CAT CAT CAT GAC CTG GAT CGG-3’ 5’-ACT CGG GCG CTG CCC ATC ATC ATG AGG TGG ATC GGC CTG-3’ 5’-CGG GCG CTG CCC ATC ATC ATG AGC TGG ATC GGC CTG CG A-3’ 5’-GCT GCC CAT CAT CAT GAC CTG GAT CGG CCT CCG ACC GTA A-3’ 5’-CAT CAT CAT GAC CTG GAT CGG CCT CCG ACC GTA ACT ATT C-3' 5’-ATC ATC ATG ACC TGG ATC GGC CTC CGA CCG TA A CTA TTC GGT GC-3’ 5’-AGC AGC TCC GCC ACT CGG GCG CTG CCC ATC ATC ATG ACC TGG ATC-3’ 5’-ATC ATC ATG ACC TGG ATC GGC CTC CGA CCG TA A CTA TTC-3f 5’-TCA TCA TGA CCT GGA TCG GCC TGG GAC CGT AAG TAT TCG GT-3’ [0222] Similar como a situação com pl4ARF para pl6INK4a as sondas preferencial mente são colocadas para se sobreporem com a cercania do Exon 1a a Exon 2. Essa condição podería assegurar que p16INK4a seja reconhecido e não outro transcrito de mRNA do local INK4. Além disso, os comentários dados para as sondas para p14ARF se aplicam aqui mutantis mutatis.

[0223] A mistura de sonda rotulada foi adicionada ao extrato de RNA celular total. Para hibridização a mistura foi incubada a 6SoC por 30 min.

(B) Realização do ELISA

[0224] Para a detecção de híbridos de RNA-DNA, foram usadas placas de microtitulação revestidas com anticorpos híbridos de anti-RNA-DNA vendidas por Digene Gorp. A solução de hibridização foi adicionada diretamente às placas de microtitulação e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram lavadas de acordo com as instruções do fabricante. A detecção foi realizada usando anticorpo híbrido anti-RNA-DNA secundário e reagentes de detecção providos por Digene Gorp.

[0225] O ensaio de captura híbrida revelou resultados positivos para p16INK4a para todas as espécimes cervicais. Esse resultado estava em concordância com todas as espécimes cervicais que deram positivo para hrHPV por captura híbrida. Cerca da metade das espécimes cancerosas da cavidade oral foi testada como superexpressaão de p16INK4a. Todas essas espécimes sendo positiva para p16INK4a foram testadas para hrHPV por hc2. Houve significante correlação entre HPV positivo e superexpressão de p16INK4a em câncer da cavidade oral. Para câncer de pulmão de pequenas células pi 6 pôde ser detectado como positivo em 8 das 10 dos casos testados.

Todos os resultados para p16lNK4a obtidos pelo teste de captura híbrida foram confirmados por análise ímunocitoquimica das espécimes de camada delgada.

[0226] Para pi 4ARF os resultados para amostras cervicais foram comparáveis aqueles para p16INK4a. Para câncer de células pequenas dois dos 10 casos sob investigação mostraram positividade para 14AFR em captura híbrida. Esse resultado podería ser confirmado por ímunocitoquimica. Nas amostras LBC da cavidade oral pi 4ARF pôde ser detectado em 7 dos 16 casos em concordância com os achados de ímunocitoquimica.

[0227] Os resultados mostram que os inibidores de quínase dependente de ciciina em um formato de teste de captura híbrida de amostras LBC podem ser usados para avaliação de diagnóstico de diversas entidades de câncer severo.

[0228] Os resultados sugerem que o teste bioquímico pode ser usado como um teste adjunto ou conjunto a um teste cito lógico.

Exemplo 5: Analise imunoauimica de níveis de proteína de p16'NK4a. Her-2/Neu e p14arf em amostras cito lógicas em meio líquido a partir de urina, escarro, aspirados de agulha fina de mama e de exudados cervicais.

[0229] 10 exudados cervicais com uma classificação citológica como HSIL, 10 amostras de escarro com câncer de pulmão de células pequenas oito logicamente diagnosticado, 10 amostras de urina de indivíduos com diagnostico de tumores de bexiga e 10 aspirados de agulha fina de indivíduos diagnosticados com DCIS, todos providos em meio PreservCyt™ foram submetidos a centrifugação das células e subsequente solubilização das células em um meio de lise. Depois da detecção baseada em ELISA de nível de expressão de inibidor de quínase dependente de ciciina p16INK4a, de p14ARF e de HER-2/Neu em soluções preparadas de células contidas nos exudados.

[0230] O teste ELISA foi realizado como segue. (A) Lise celular [0231] Cada 10 mL de amostras LBC foram centrifugados para permitir que as células sedimentassem, Ã pelete celular é dissolvida [TEMPO] em JOOpl de meio de iise tampão de lise mtm (2% Triton X-100» 0,4% SDS, 0,6mM PMSF em PBS) por mistura e incubação por 10 Min a 80°C. Os lisados das amostras LBC foram então centrifugados a 4Ό (15 min a 28.000 x g (16.600 rpm HighspeedCentrifuge 3EG Muiti RF));-o sobrenadante foi transferido para um tubo novo. O sobrenadante pode ser estocado a -20 °C, (B) Realização de ELISA

[0232] Revestimento das placas ELISA

[0233] Para cada proteína se preparou placas de ELISA separadas como segue. As soluções padrão dos anticorpos primários específicos para p16INK4a, p14ARF e HER-2/Neu foram diluídas em PBS para dar uma solução de revestimento pronta para uso.

[0234] Para p16INK4a se usou um clone mtm E6H4 para revestimento de placas de ELISA, Para p14ARF foi usado anticorpo policlonal direcionado contra p14ARF disponibilizado por Galbiochem. Para Her-2/Neu foi usado anticorpo policlonal da DakoCytomation para revestimento.

[0235] 50μΙ da solução de revestimento foi adicionado a cada poço das placas ELISA.

[0236] Para revestimento, as placas foram incubadas durante a noite a 4°C.

[0237] A solução de revestimento foi removida das placas de ELISA e as placas foram rinsadas usando uma lavadora automática de ELISA como segue: [0238] 7 x 250μΙ tampão de lavagem (0.1% Tween20 (v/v) em PBS), após remoção do remanescente do tampão de lavagem, 300μI de tampão bloqueador (2% BSA em PBS) foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas por 1 h em um dispositivo com agitação a temperatura ambiente.

[0239] Incubação das amostras [0240] Após remoção do tampão bloqueador, 10ΟμΙ da amostra celular lis ada foi adicionado a cada poço.

[0241 ] Para fins de calibração do teste, diferentes concentrações de proteínas recombinantes (0 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 400 pg/ml, 800 pg/ml) foram incluídas em cada um dos testes.

[0242] As amostras foram incubadas por 1 h em temperatura ambiente.

[0243] Em seguida foi realizada a lavagem em lavadora automática de ELISA como segue: 7 x 250μΙ tampão de lavagem. O tampão remanescente foi removido, [0244] Incubação com anticorpo de detecção [0245] Soluções de trabalho de anticorpos secundários biotinilados específicos para as respectivas proteínas foram preparadas pela diluição de solução padrão. Para p16INK4a foi aplicado um mtm clone D7D7, para p14ARF foi aplicado um anticorpo monoclonal da Calbiochem e para HER-2/Neu foi usado um anticorpo monoclonal da DakoCytomation.

[0246] 100pi da solução de trabalho foi adicionada em cada poço. Após incubação por 1 h em RT, a solução de anticorpo foi removida e as placas de ELISA foram lavadas por uma lavadora ELISA automática.

[0247] 7 x com 250pl tampão de lavagem.

[0248] Detecção [0249] Foram pré-diluídos polímeros de estreptavídína-HRP (img/ml) em proporção 1:10. (4μΙ +36μΙ tampão de incubação); a solução final de incubação foi preparada por diluição 1:300 em tampão de incubação (0,1% BSA em PBS) para uma concentração final de 0,33 pg/rml.

[0250] 100μΙ dessa solução foram adicionados a cada poço e incubados por 1h em RT, [0251] Em seguida, o tampão foi removido e as placas foram lavadas manualmente com 200 μΙ de tampão de lavagem por poço 5 vezes.

[0252] Incubação do substrato [0253] O substrato TMB foi equilibrado a 25°C por 1h no escuro.

[0254] 100μI de solução de substrato foi adicionada a cada poço.

[0255] As placas ELISA foram incubadas a 25 °C por exatamente 15 min no escuro. Então a reação foí parada pela adição de 80 μΙ 2,5M Η2304.

[0256] Dentro de 5 min após a parada da reação, foi determinado o OD 450 nm. Após avaliação dos resultados, cada amostra retornou ao um valor para o OD, Para cda anticorpo foi determinado um limiar de OD usando o valor observado para o fundo.

[0257] Os resultados de ELISA foram comparados aos resultados de diagnóstico da avaliação citológica dos espécimes dos mesmos indivíduos. Os resultados são mostrados na Tabela 7, Tabela 7 [0258] É evidenciado que para pl6INK4a em 100% dos casos testados existiu boa correlação entre o padrão de tingimento de pl6INK4a avaliado citologicamente e positividade de p16INK4a em um formato de teste ELISA usando as amostras de PreservGyt™ solubilizadas para a análise. Para p14ARF a correlação foi 93%. Para Her-2/Neu uma correlação de mais do que 90% entre a detecção imuno-citoquimica da superexpressão e da positividade no formato ELISA pôde ser detectada.

[0259] Os resultados dos exemplos acima mostram que o formato de teste bioquímico usando amostras LBC solubilizadas podem ser aplicados nas mesmas espécimes como a análise imuno-citoquimica. Como o teste bioquímico consome somente uma fração da amostra LBC ele pode ser facilmente aplicado como um adicional à análise imuno-citoquimica.

[0260] Existe uma boa correlação entre os resultados imune-citoquímicos e os resultados de ELISA. Isso mostra que o método de acordo com a invenção é adequado para avaliar diagnóstico em vários tipos de condições medicamente relevantes onde a citoiogia em meio liquido é atualmente aplicada tanto como teste adicional como teste conjunto ou se for o caso pode ser usado como um teste de diagnóstico autônomo.

[0261] Exemplo 6; Análise Imunoquímica e por RT-PCR de níveis de mRNA/proteína de MCM-5 e MCM-2 em amostras em meio liquido a partir de urina.

[0262] 20 amostras LBC de células de urina CytoLyt™ foram usadas para o presente exemplo. O RT-PCR foi realizado da mesma forma como no Exemplo 3. A análise da proteína foi realizada em um formato de teste de tira como dado no Exemplo 2 e em paralelo em um formato ELISA como dado no Exemplo 1.

[0263] Procedimentos experimentais foram realizados como dados nesses Exemplos.

[0264] Foi demonstrado que MCM-5 pode facilmente ser detectado em Usados das amostras LBC da urina. Os resultados obtidos pelo ensaio bioquímico em base não celular, bem como ao nível de ácido nucléico correspondem muito bem aos resultados obtidos a partir da citoiogia. Em citoiogia se usou tingímento ímuno-citologíco para MCM-5 como auxiliar para avaliação de diagnóstico.

Reivindicações

Claims (46)

1. MÉTODO PARA DETECTAR DESORDENS NEOPLÁSiCAS a partir de amostras corporais solubilizadas de um indivíduo humano, caracterizado pelo método compreender as etapas de: (a) solubílizar uma amostra corporal de um indivíduo humano em um meio de lise; em que dita amostra corporal é uma amostra de citologia em meio líquido (LBC - Liquid-based cytology)·, e, (b) determinar a sobre-expressão de uma molécula marcadora selecionada a partir de um grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular; na amostra LBC solubilzada por comparação do nível do dito inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; ou da dita proteína p14ARF reguladora do cício celular dentro da dita amostra LBC solubilizada de um indivíduo humano com o nível presente em uma amostra LBC solubilizada de humano saudável, em que as amostras para a detecção de cânceres são selecionadas a partir de câncer de tecido epitelial da cavidade cervical, câncer em amostras de fluido e tecidos da cavidade oral, câncer em amostras de tecidos das vias aéreas, câncer em amostras de urina e câncer em punções de tecido mamário.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela amostra LBC de um indivíduo humano ser solubilizada: (a) imediatamente após obtenção da amostra; (b) após estocagem e/ou transporte em um tampão de estocagem; ou, (c) após transporte em um tampão de transporte.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser determinado o nível de duas ou mais moléculas marcadoras selecionadas de um grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular.

4. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela detecção das moléculas marcadoras ser realizada usando pelo menos uma sonda especificamente para as moléculas a serem detectadas.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela sonda ser marcada de forma detectável.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo marcador ser selecionado a partir de um grupo que consiste em um radioisótopo, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, um composto eletroluminescente, um composto fluorescente, um quelato de metal, uma enzima, ou uma estrutura ligante biologicamente relevante.

7. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pela sonda ser uma proteína e/ou um ácido nucleico.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pelo menos uma sonda ser um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um minianticorpo, ou um peptídeo mimético compreendendo um epítopo de ligação a antígeno.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pelo menos uma sonda ser um ácido nucleico especificamente hibridizado para uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9 , caracterizado por compreender uma reação selecionada a partir do grupo compreendendo uma reação de hibridização in situ e uma reação de amplificação de ácido nucleico.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela reação de amplificação de ácido nucleico ser PCR, NASBA ou LCR.

12. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo nível da molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular na amostra LBC de um humano saudável ser provida como um valor predeterminado para ajustar um limiar para o procedimento de detecção.

13. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo nível da molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular na amostra LBC de um humano saudável ser determinado a partir de uma solução de amostra padrão, ou a partir de um número representativo de amostras cervicais de humanos saudáveis.

14. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pela determinação da molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular na amostra LBC de um humano saudável ser realizada: (a) durante o procedimento de detecção; (b) durante a calibração do sistema de detecção; (c) uma vez para cada lote de reagente de detecção; ou, (d) como um valor padrão para o método de detecção.

15. DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO, a ser utilizado no método, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por compreender somente sondas de uma especificidade fixada a uma fase sólida, onde as sondas de especificidade única são específicas para uma molécula marcadora selecionada a partir de um grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular para detectar a dita molécula marcadora em uma amostra solubilizada.

16. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela sonda ser um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um minianticorpo, ou um peptídeo mimético compreendendo um epítopo de ligação a antígeno ou um acido nucleico.

17. DISPOSITIVO, de acordo com uma das reivindicações 15 a 16, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um dispositivo ELISA compreendendo anticorpos, fragmentos do mesmo ou agentes que se ligam a antígenos direcionados contra uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular fixada às placas ELISA, fitas ELISA ou poços ELISA; (b) um dispositivo de teste de fluxo lateral, compreendendo anticorpos, fragmentos dos mesmos ou agentes que se ligam a antígenos direcionados contra uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular fixada à fitas de teste, partículas coloidais de ouro ou partículas de látex; (c) um fluxo através de dispositivo de ensaio compreendendo anticorpos, fragmentos dos mesmos ou agentes que se ligam a antígenos direcionados contra uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular fixada a um membro poroso ou à superfície de capilaridades; (d) um dispositivo de ensaio de aglutinação por látex compreendendo anticorpos, fragmentos dos mesmos ou agentes que se ligam a antígenos direcionados contra uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular fixada às partículas de látex; (e) um dispositivo de imunoensaio compreendendo anticorpos, fragmentos dos mesmos ou agentes que se ligam a antígenos direcionados contra uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular fixada às contas ou membranas; (f) um dispositivo de imunoensaio compreendendo anticorpos, fragmentos dos mesmos ou agentes que se ligam a antígenos direcionados contra uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular fixada às microesferas; e, (g) um dispositivo de detecção de ácido nucléico compreendendo sondas especificamente hibridizadas a um produto de gene de ácido nucléico de uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular fixada a uma fase sólida.

18. DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO, a ser utilizado no método, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para determinar o nível de uma molécula marcadora selecionada a partir de um grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular compreendendo uma sonda, selecionada a partir do grupo compreendendo um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um minianticorpo, ou um peptídeo mimético compreendendo um epitopo de ligação à antígeno, e um ácido nucléico especifico para um molécula marcadora selecionada a partir de um grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular e um meio de lise para solubilização de uma amostra LBC.

19. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo meio de lise compreender pelo menos uma composição selecionada a partir do grupo que consiste em agentes caotrópicos, detergentes aniônicos, detergentes catiônicos, detergentes não-iônicos, detergentes anfóteros e composições alcalinas.

20. DISPOSITIVO, de acordo com uma das reivindicações 18 a 19, caracterizado pelo meio de lise compreender pelo menos uma composição selecionada a partir do grupo que consiste em um inibidor de proteinase, um inibidor de DNAse, e um inibidor de RNAse.

21. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo inibidor de proteinase ser selecionado a partir do grupo que consiste em inibidores para serina proteinases, inibidores para cisteína proteinases, inibidores para aspártico proteinases, inibidores para metaloproteinases, inibidores para proteinases neutras, e inibidores para proteinases alcalinas.

22. DISPOSITIVO, de acordo com uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo meio de lise compreender pelo menos um detergente não-iônico e pelo menos um inibidor de proteinase.

23. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo meio de lise conter Triton X-100 e pelo menos um inibidor de serina proteinases.

24. DISPOSITIVO, de acordo com uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado por compreender ainda pelo menos uma molécula marcadora para realizar uma reação de controle positivo, reagentes e tampões comumente usados para realizar a reação de detecção.

25. DISPOSITIVO, de acordo com uma das reivindicações 18 a 24, caracterizado por compreender ainda uma proteína recombinante selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) uma proteína inibidora de quinase dependente de ciclina, onde o inibidor de quinase dependente de ciclina é selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) uma proteína p14ARF reguladora do ciclo celular, fragmentos das mesmas ou peptídeos derivados da dita proteína como moléculas marcadoras para realizar uma reação de controle positivo.

26. DISPOSITIVO HÍBRIDO DE CAPTURA, sendo um dispositivo de pesquisa ou um dispositivo de diagnóstico in vitro, a ser utilizado no método conforme definido em uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por compreender complementares de ácidos nucleicos ou complementares reversos a um ou mais ácidos nucleicos de inibidores de quinase dependente de ciclina, onde o inibidor de quinase dependente de ciclina é selecionado de um grupo que consiste em (i) uma proteína inibidora de quinase dependente de ciclina, onde o inibidor de quinase dependente de ciclina é selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) uma proteína p14ARF reguladora do ciclo celular para detecção de sobre-expressão dos ditos um ou mais inibidores de quinase dependente de ciclina em uma amostra LBC solubilizada.

27. USO DE UMA FASE SÓLIDA à qual anticorpos, fragmentos dos mesmos ou agentes de ligação de antígeno direcionados contra uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado de um grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular, fixados ou aderidos, caracterizado por ser para fabricar um dispositivo de diagnóstico in vitro, conforme definido em uma das reivindicações 18 a 25, para determinação de níveis de uma molécula marcadora selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) uma proteína inibidora de quinase dependente de ciclina, onde o inibidor de quinase dependente de ciclina é selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular em uma amostra solubilizada de um indivíduo humano, onde o dispositivo de diagnóstico in vitro compreende somente sondas de uma especificidade fixada a uma fase sólida, onde as sondas de uma especificidade são específicas para uma molécula marcadora selecionada a partir de um grupo compreendendo: (i) um inibidor de quinase dependente de ciclina selecionado a partir do grupo que consiste em p16INK4a, p14, Her-2/NEU e MCM-5; e (ii) a proteína p14ARF reguladora do ciclo celular.

28. USO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela fase sólida ser selecionada a partir de um grupo compreendendo membros porosos, capilares, membranas, contas, superfícies planas, esferas, microesferas, nanoesferas, partículas coloidais de ouro, partículas de látex e coloides.

29. MÉTODO PARA DESENVOLVER KITS imunoquímicos e dispositivos de diagnóstico in vitro, conforme definidos em uma das reivindicações 15 a 26, para uso na avaliação de diagnóstico de desordens neoplásicas a partir de amostra LBC solubilizadas, caracterizado pelos kits e dispositivos de diagnóstico in vitro serem desenhados para a detecção da presença ou ausência de moléculas marcadoras características para desordens neoplásicas sobre um nível de proteína ou de peptídeo, e onde o desenvolvimento é realizado usando amostras amostra LBC.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pela desordem neoplásica ser câncer de tecido epitelial da cavidade cervical, câncer da cavidade oral, câncer das vias respiratórias, câncer do sistema urinário e câncer de mama.

31. MÉTODO PARA AVALIAÇÃO DE DIAGNÓSTICO DE DESORDENS NEOPLÁSICAS a partir de amostras amostra LBC solubilizadas, caracterizado por compreender: (a) detecção da presença ou ausência e/ou o nível de uma molécula marcadora, conforme definida em uma das reivindicações 1 a 14, característica para uma desordem neoplásica sobre o nível da proteína ou peptídeo; (b) comparar a presença ou ausência e/ou o nível da dita molécula marcadora característica para uma desordem neoplásica com a presença ou ausência e/ou o nível conhecido ser característico para uma amostra LBC saudável sem a doença; e, (c) avaliar o diagnóstico da desordem neoplásica com a comparação entre os níveis encontrados na amostra LBC e aqueles conhecidos serem específicos para amostra LBC saudáveis sem a doença.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pela avaliação do diagnóstico ser baseada em um aspecto selecionado a partir do seguinte: (a) a molécula marcadora característica para desordens neoplásicas ser sobre-expressa nas células contidas na amostra LBC comparadas com a amostra LBC saudável sem a doença; (b) expressão da molécula marcadora característica para desordens neoplásicas ser diminuída ou perdida em comparação à expressão presente na amostra LBC saudável sem a doença; (c) uma forma modificada da molécula marcadora característica para uma desordem neoplásica ser expressa nas células presentes na amostra LBC comparada à molécula marcadora presente nas amostra LBC saudáveis sem a doença.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela desordem neoplásica ser câncer de tecido epitelial da cavidade cervical, câncer da cavidade oral, câncer das vias respiratórias, câncer do sistema urinário e câncer de mama.

34. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pela detecção das moléculas marcadoras ser realizada usando pelo menos uma sonda especificamente para as moléculas a serem detectadas.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pela sonda ser marcada de forma detectável.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo marcador ser selecionado a partir de um grupo que consiste em um radioisótopo, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, um composto eletroluminescente, um composto fluorescente, um quelato de metal, uma enzima, ou uma estrutura ligante biologicamente relevante.

37. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pela sonda ser um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um minianticorpo, ou um peptídeo mimético compreendendo um epítopo de ligação a antígeno.

38. MÉTODO PARA DESENVOLVER KITS e dispositivos de diagnóstico in vitro, conforme definidos em uma das reivindicações 15 a 26, para uso na avaliação de diagnóstico de desordens neoplásicas a partir de amostra LBC solubilizadas, caracterizado pelos kits e dispositivos de diagnóstico in vitro serem desenhados para a detecção da presença ou ausência de moléculas marcadoras características para desordens neoplásicas sobre um nível de ácido nucleico, onde o desenvolvimento é realizado usando amostras amostra LBC, e onde é realizada a normalização da quantidade da amostra LBC com relação à informação obtida da espécie citológica preparada a partir da mesma amostra LBC.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pela desordem neoplásica ser câncer de tecido epitelial da cavidade cervical, câncer da cavidade oral, câncer das vias respiratórias, câncer do sistema urinário e câncer de mama.

40. MÉTODO PARA AVALIAÇÃO DE DIAGNÓSTICO DE DESORDENS NEOPLÁSICAS a partir de amostras amostra LBC solubilizadas, caracterizado por compreender: (a) obter uma quantidade de uma amostra LBC para aplicação em um método bioquímico de detecção não baseado em célula, onde a quantidade da amostra LBC a ser usada no método bioquímico de detecção não baseado em célula é normalizada com relação à informação obtida a partir de espécies citológicas preparadas a partir da mesma amostra LBC; (b) detecção da presença ou ausência e/ou do nível de uma molécula marcadora, conforme definida em uma das reivindicações 1 a 14, característica para uma desordem neoplásica sobre o nível de ácido nucléico; (c) comparar a presença ou ausência e/ou o nível da dita molécula marcadora característica para uma desordem neoplásica com a presença ou ausência do nível conhecido ser característico para uma amostra LBC saudável sem doença; (d) avaliar o diagnóstico sobre a desordem neoplásica sobre a comparação entre os níveis encontrados na amostra LBC e aqueles conhecidos serem específicos para amostra LBC saudáveis sem a doença.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela avaliação do diagnóstico ser baseada em um aspecto selecionado a partir do seguinte: (a) a presença ou ausência de uma molécula marcadora característica para desordens neoplásicas, onde tal presença ou ausência de uma molécula marcadora ser característica para amostras com a doença; (b) a molécula marcadora característica para desordens neoplásicas ser sobre-expressa nas células contidas na amostra LBC comparada à amostra LBC saudável sem a doença; (c) expressão da molécula marcadora característica para desordens neoplásicas ser diminuída ou perdida em comparação com a expressão presente em uma amostra LBC saudável sem a doença; (d) uma forma modificada da molécula marcadora característica para uma desordem neoplásica ser expressa nas células presentes na amostra LBC comparada à molécula marcadora presente nas amostra LBC saudáveis sem a doença.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela desordem neoplásica ser câncer de tecido epitelial da cavidade cervical, câncer da cavidade oral, câncer das vias respiratórias, câncer do sistema urinário e câncer de mama.

43. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pela detecção das moléculas marcadoras ser realizada usando pelo menos uma sonda especificamente para as moléculas a serem detectadas.

44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pela sonda ser marcada de forma detectável.

45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo marcador ser selecionado a partir de um grupo que consiste em um radioisótopo, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, um composto eletroluminescente, um composto fluorescente, um quelato de metal, uma enzima, ou uma estrutura ligante biologicamente relevante.

46. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado pela sonda ser um complementar de ácido nucléico complementar reverso a um ácido nucléico de molécula marcadora.