CN102033056B - 抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法。该方法包括如下步骤：1)向离体的癌症细胞中转入靶标膜蛋白受体的基因，所述靶标膜蛋白受体的基因被荧光蛋白标记，得到重组癌症细胞；2)将重组癌症细胞和待鉴定物质进行孵育，孵育完毕后再加入靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完毕后加入多聚甲醛的PBS溶液将重组癌症细胞进行固定，得到待检测细胞样品I；3)将待检测细胞样品I单分子荧光成像，得到细胞图像，进而得到各个荧光点的漂白步数，分析图像统计其荧光点的漂白步数，以判断该待鉴定物质是否对膜蛋白受体聚集具有抑制作用。该方法具有操作简便，快捷，鉴定周期短，花费小，可以鉴定各种抑制膜蛋白受体聚集的药物。

Description

抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法

技术领域

本发明涉及抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法。

背景技术

癌症一直是人类健康的最大杀手。细胞的过度增殖是癌症发生和发展的原因，而且细胞的过度增殖一般都与配体诱导细胞信号通路尤其是生长因子信号通路的过度激活有关。因此抑制这种细胞信号通路的过度激活，成为治疗癌症的重要途径。生长因子细胞信号通路的激活首先是通过配体与其膜蛋白受体在细胞膜上结合，使受体产生自聚或异聚而被激活。然后通过激活的受体再磷酸化下游通路的蛋白，使其下游蛋白被激活，从而激活整个信号通路。因此，筛选出能截断激活信号通路的任一环节的化合物就能发展治疗癌症的药物。

目前抗癌药物分子的主要筛选方法之一是首先通过计算机模拟从化合物库中找出一些能与信号通路相关蛋白结合的候选物，然后对这些候选物分子进行细胞水平的实验，检测其是否能够抑制其配体诱导的下游蛋白的磷酸化水平，通过重复这些生化实验来达到抗癌药物筛选的目的，再进一步进行动物实验。但是在筛选过程中普遍存在周期长，操作复杂，花费高的问题，难以实现简便快捷的药物筛选。因此，有必要发展一种简单快捷的药物筛选方法。

单分子荧光方法是近年来迅速发展起来的一种检测技术。该方法不仅有极高的灵敏度，而且还能展现出大量分子检测时所掩盖下单个分子的行为，已日益广泛地应用于细胞水平对生物分子结构和功能的动态变化、分子间相互作用和生化反应的动力学过程的研究。但目前还未见有利用该方法鉴定抗癌药物的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物鉴定方法。

本发明提供的药物鉴定方法，包括如下步骤：

1)向离体的癌症细胞中转入靶标膜蛋白受体的基因，所述靶标膜蛋白受体的基因被荧光蛋白标记，得到重组癌症细胞；

2)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和待鉴定物质进行孵育，孵育完毕后再加入所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完毕后将所述重组癌症细胞进行固定，得到待检测细胞样品I；

3)将步骤2)得到的待检测细胞样品I置于全内反射显微镜的物镜上进行单分子荧光成像，得到所述待检测细胞样品I的细胞图像，进而得到各个荧光点的漂白步数B：

4)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完毕后将所述重组癌症细胞进行固定，得到待检测细胞样品II，将所述待检测细胞样品II按照与步骤3)完全相同的步骤进行单分子荧光成像，得到各个荧光点的漂白步数A；

5)如果所述漂白步数B中的两步漂白所得二聚体的比例小于所述漂白步数A中两步漂白所得二聚体的比例，则所述待鉴定物质为候选的抗癌药物。

上述方法的步骤1)中，所述癌症细胞均为离体的，并经过孵育的。所述离体的癌症细胞为Hela细胞或MCF7细胞，优选Hela细胞；所述靶标膜蛋白的受体为TβRII，所述靶标膜蛋白受体的配体为TGFβ1；所述荧光蛋白为GFP；所述靶标膜蛋白受体的基因是通过TβRII-GFP质粒转入所述离体的癌症细胞中；所述孵育步骤中，温度为37℃，优选37℃，时间为18-30小时，优选24小时。所述孵育步骤是在培养基中进行的。各种能够孵育该癌症细胞的培养基均适用，如可为胎牛血清体积百分比为10％的DMEM培养基。所述孵育步骤中，孵育后的细胞覆盖度为70-90％，优选80％。

所述步骤2)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和待鉴定物质进行孵育步骤中，温度为37℃，时间为30分钟；再加入所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育步骤中，温度为37℃，时间为15-30分钟，优选15分钟；固定步骤中，各种常用的固定剂均适用，如可选自多聚甲醛的PBS缓冲液、丙酮溶液和乙醇溶液中的至少一种，优选质量百分浓度为4％的多聚甲醛的PBS溶液，该缓冲液pH值为7.2-7.6，优选7.4，温度为2-8℃，优选4℃，时间为15-45分钟，优选30分钟。所述待鉴定物质为式I所示柚皮素或式II所示白藜芦醇。

所述步骤3)和步骤4)中，由单分子荧光图像得到漂白步数的具体方法为：通过观察单个分子的荧光图像，当单个荧光分子突然熄灭时，即为漂白。统计其强度的变化，得到漂白步数；所述荧光点均为像素小于或等于5×5的荧光点。

为了获得更准确的试验结果，上述方法步骤3)和步骤4)可重复若干次，如可重复3-5次。

另外，将所述待检测细胞样品I和II置于全内反射显微镜的物镜上进行单分子荧光成像步骤之前，所述抗癌药物的鉴定方法还包括如下步骤：

分别将所述待检测细胞样品I和II用缓冲液洗涤；所述缓冲液均选自磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的pH值均为7.2-7.6，优选7.4。

所述步骤5)中，所述漂白步数A中两步漂白所得二聚体的比例与所述漂白步数B中的两步漂白所得二聚体的比例之差不小于5％，如可为13.7％或11.4％；所述候选的抗癌药物为能够抑制所述靶标膜蛋白的受体聚集的抗癌药物。

本发明利用单分子荧光成像的方法提供了一种基于膜蛋白受体单分子漂白步数统计的细胞水平鉴定抗癌药物的方法。该方法通过检测药物分子是否可以抑制配体诱导下受体的聚集，从而鉴定有望抑制肿瘤细胞生长的药物候选物。其基本原理是首先是将受体分子进行荧光标记，每一个受体分子连接一个荧光基团，然后在配体的作用下加入药物分子，通过单分子荧光技术观察细胞膜上受体的荧光漂白步数来检测受体的聚集形式。例如如果是一步光漂白，受体就是以单体形式存在。如果是两步光漂白，受体就是以二聚体形式存在。因此在待测化合物存在下，通过检测受体的光漂白步数就可判断待测化合物是否影响膜蛋白受体的聚集程度，从而实现抑制膜蛋白受体聚集的抗癌药物的鉴定。

本发明首先在活细胞中表达带有荧光蛋白的膜受体蛋白，接着加入待鉴定物质候选物，再加入配体。然后利用物镜型全内反射成像技术来检测膜蛋白的聚集，通过膜蛋白受体单分子漂白步数统计来实现药物的鉴定。该方法属于药物鉴定新方法，与其它药物鉴定方法相比具有操作简便，周期短，节省开支等优势，可以鉴定抑制膜蛋白功能化聚集的抗癌药物。

附图说明

图1为待检测细胞样品I(左图)和待检测细胞样品II的细胞图像(右图)。

图2为TβRII-GFP单体的漂白曲线(左图)和TβRII-GFP二聚体的漂白曲线(右图)。

图3为在有无配体存在下和Hela细胞上，对照组和柚皮素，白藜芦醇浓度都为50μM时，TβRII-GFP质粒漂白步数的统计。

图4为在有无配体存在下和MCF7细胞上，对照组和柚皮素浓度都为50μM时，TβRII-GFP质粒漂白步数的统计。

图5为分别在阳性对照，柚皮素和白藜芦醇上观察小鼠肺脏上的肿瘤结节数。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例孵育步骤所用培养基为购自Gibco公司的胎牛血清体积百分比为10％的DMEM培养基，所用TGFβ1购自R&D公司，所用MCF7细胞购自北京协和细胞库，所用多聚甲醛购自sigma公司，货号为158127，所用培养皿均为购自北京科友佳生物技术有限公司的35mm的玻璃底培养皿。

本发明中涉及的相关术语定义如下：漂白步数的定义为统计单个荧光分子随时间漂白的强度；相关的，一步漂白的定义为单个荧光分子强度统计有一个漂白台阶，两步漂白的定义为单个荧光分子强度统计有两个漂白台阶。一步漂白的荧光分子就是漂白步数为一的，即为单体，两步漂白的荧光分子就是漂白步数为二，即为二聚体；该步骤所得所述候选的抗癌药物为能够抑制靶标膜蛋白受体聚集的抗癌药物。所述二聚体由两个所述靶标膜蛋白受体形成。两步漂白所得二聚体的比例是指两步漂白所得二聚体的个数占由一步漂白所得单体和两步漂白所得二聚体总个数的比例。

下述实施例中所用全内反射显微镜均购自Olympus公司，该全内反射显微镜均包括如下的光学部件：购自Melles Griot公司的氩离子激光器，激发滤色片，分光镜，物镜，反射镜，发射滤色片和探测器EMCCD。物镜是数值孔径为1.45的100X全内反射专用物镜，使用时需加镜油；样品台用于承载细胞的培养皿(折射率为1.52)，探测器为高灵敏度的EMCCD。光路工作过程如下：激光器作为激发光源发出激光，激光穿过发射滤色片后到达分光镜，然后被反射入物镜，最后达到样品；样品被激发后发射荧光，荧光通过物镜后又穿过分光镜，然后到达反射镜，被反射镜反射后穿过发射滤色片，最后被EMCCD接收。

实施例1

1)将已经准备好的HeLa细胞传到35mm玻璃底培养皿中37℃孵育24小时，使其细胞覆盖度达到80％，然后将TβRII-GFP质粒转染到此培养皿中，使其终浓度为1μg/ml，在无血清DMEM中37℃孵育5h，使TβRII-GFP蛋白在HeLa细胞上得到表达，得到重组癌症细胞，再用无血清DMEM冲洗此培养皿3-5次。

所用TβRII-GFP质粒(Single-molecule imaging reveals transforming growth factor-β-induced type II receptor dimerization；Wei Zhanga，Yaxin Jianga，Qiang Wangb，Xinyong Maa，Zeyu Xiaoa，Wei Zuob，Xiaohong Fanga，1，and Ye-Guang Chenb，PNAS，September 15，2009，vol.106，no.37，15679-15683)，该质粒可从中国科学院化学研究所获得。

2)将柚皮素加入步骤1)所用细胞培养皿中，使其终浓度为50μM，在无血清DMEM37℃孵育1h。接着将配体TGFβ1加入此培养皿中，使其终浓度为10ng/ml，37℃孵育15min。再将多聚甲醛质量百分比为4％的多聚甲醛的PBS缓冲液(pH值为7.4)加入此培养皿中于4℃固定30min，用PBS缓冲液(pH值为7.4)清洗3-5次，得到待检测的细胞样品I。

3)将步骤2)得到的待检测细胞样品I置于全内反射显微镜的物镜上进行单分子荧光成像，得到待检测细胞样品I的细胞图像，所得图像如图1左图所示，对该待检测细胞样品I的细胞图像进行分析，统计小于或等于5×5像素的荧光亮点，得到各个荧光点的漂白步数B；

该步骤具体检测条件如下：激光器为氩离子激光器(Melles Griot公司)，激发波长为488nm，激发滤色片为488/10nm带通滤色片(Chroma公司)，发射滤色片为HQ525/50M(Chroma公司)，激发功率为5mW。探测器为EMCCD(Andor iXon DU-897DBV)，成像时EMCCD温度设为-70℃，增益为300。细胞样品为室温。

所得TβRII-GFP的单分子图像如图1左图所示，统计该图像中荧光点的漂白步数B。

4)将步骤1)所得重组癌症细胞和靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完毕后将重组癌症细胞进行固定，得到待检测细胞样品II，所得图像如图1右图所示，对该待检测细胞样品II的细胞图像进行分析，统计小于或等于5×5像素的荧光亮点，得到各个荧光点的漂白步数A；

统计细胞图像中小于或等于5×5像素的荧光亮点后，如果是如图2左边所示的一步漂白的曲线则为TβRII-GFP单体。如果是如图2右边所示的两步漂白的曲线则为TβRII-GFP二聚体。

结果如下：单个荧光点的漂白步数统计如图3所示，不加入待鉴定药物时，加入配体后，TβRII-GFP产生聚集，漂白步数A中，两步漂白所得TβRII-GFP二聚体的比例为38.9±2.8％。而加入50μM柚皮素孵育1h后，漂白步数B中两步漂白所得TβRII-GFP二聚体比例下降到25.2±1.5％，该TβRII-GFP聚集的比例明显减小，说明柚皮素可明显抑制配体诱导的抑制TβRII-GFP聚集，是一种抗癌药物。

按照与用柚皮素鉴定完全相同的步骤，仅将柚皮素替换为白藜芦醇，所得结果如下：

加入50μM白藜芦醇孵育1h后，漂白步数B中TβRII-GFP的聚集没有变化，漂白步数A和B中形成的TβRII-GFP二聚体比例是一样的，均为40.0％±2.9％，则白藜芦醇不能抑制配体诱导的TβRII-GFP的聚集，不是能够抑制TβRII-GFP聚集的抗癌药物。

生化实验验证：

为了验证单分子荧光鉴定方法的有效性，按照如下步骤进行动物实验：

如图4所示，将4T1细胞接种于Balb/c小鼠第四脂肪垫下，15万/只。接种3天分组，每组十只，阳性对照组灌胃溶液(0.2％CMC-Na水溶液)，给药组分别灌胃给药柚皮素、白藜芦醇各100mg/kg，共给药21天，处死动物，观察肺脏上转移的肿瘤结节数。

将阳性对照组溶液直接让小鼠喝下去。

所得结果如图5所示。由图可知，经过柚皮素处理后肺脏上肿瘤的结节数明显地减少而白藜芦醇却不能。这与前述用单分子荧光方法鉴定所得结果几乎相同。因此本发明提供的膜蛋白受体单分子漂白步数统计的方法可用来鉴定抗癌药物。

实施例2、

按照与实施例1完全相同的方法及步骤，对待鉴定药物进行鉴定，仅将所用Hela细胞替换为MCF7细胞。

统计细胞图像中小于或等于5×5像素的荧光亮点。如果是如图2左边所示的一步漂白的曲线则为TβRII-GFP单体。如果是如图2右边所示的两步漂白的曲线则为TβRII-GFP二聚体。

结果如下：单个荧光点的漂白步数统计如图4所示，不加入待鉴定药物时，加入配体后，TβRII-GFP产生聚集，漂白步数A中TβRII-GFP二聚体比例为37.7±2.9％。而加入50μM柚皮素孵育1h后，漂白步数B中TβRII-GFP聚集的比例明显减小，TβRII-GFP二聚体比例下降到26.3±1.8％。

生化实验验证：

为了验证单分子荧光鉴定方法的有效性，按照如下步骤进行动物实验：

如图4所示，将4T1细胞接种于Balb/c小鼠第四脂肪垫下，15万/只。接种3天分组，每组十只，阳性对照组灌胃溶液(0.2％CMC-Na水溶液)，给药组分别灌胃给药柚皮素、白藜芦醇各100mg/kg，共给药21天，处死动物，观察肺脏上转移的肿瘤结节数。

将阳性对照组溶液直接让小鼠喝下去。

所得结果如图5所示。由图可知，经过柚皮素处理后肺脏上肿瘤的结节数明显地减少而白藜芦醇却不能。这与前述用单分子荧光方法鉴定所得结果几乎相同。因此本发明提供的膜蛋白受体单分子漂白步数统计的方法可用来鉴定抗癌药物。

Claims (6)

1.一种抗癌药物的鉴定方法，包括如下步骤：

1)向离体的癌症细胞中转入靶标膜蛋白受体的基因，所述靶标膜蛋白受体的基因被荧光蛋白标记，得到重组癌症细胞；

2)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和待鉴定物质进行孵育，孵育完毕后再加入所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完毕后将所述重组癌症细胞进行固定，得到待检测细胞样品I；

3)将步骤2)得到的待检测细胞样品I置于全内反射显微镜的物镜上进行单分子荧光成像，得到所述待检测细胞样品的细胞图像，进而得到各个荧光点的漂白步数B；

4)将所述步骤1)所得重组癌症细胞和所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育，孵育完毕后将所述重组癌症细胞进行固定，得到待检测细胞样品II，将所述待检测细胞样品II按照与步骤3)完全相同的步骤进行单分子荧光成像，得到各个荧光点的漂白步数A；

5)如果所述漂白步数B中的两步漂白所得二聚体的比例小于所述漂白步数A中两步漂白所得二聚体的比例，则所述待鉴定物质为候选的抗癌药物；

漂白步数的定义为统计单个荧光分子随时间漂白的强度；一步漂白的定义为单个荧光分子强度统计有一个漂白台阶，两步漂白的定义为单个荧光分子强度统计有两个漂白台阶；一步漂白的荧光分子就是漂白步数为一的，即为单体，两步漂白的荧光分子就是漂白步数为二，即为二聚体；所述二聚体由两个所述靶标膜蛋白受体形成；两步漂白所得二聚体的比例是指两步漂白所得二聚体的个数占由一步漂白所得单体和两步漂白所得二聚体总个数的比例；

所述步骤1)中，所述离体的癌症细胞是经过孵育的；

所述离体的癌症细胞为Hela细胞或MCF7细胞，

所述荧光蛋白为GFP；

所述靶标膜蛋白的受体为TβRII，所述靶标膜蛋白受体的配体为TGFβ1；

所述步骤1)中，所述靶标膜蛋白受体的基因是通过TβRII-GFP质粒转入所述离体的癌症细胞中；

所述步骤5)中，所述候选的抗癌药物为能够抑制所述靶标膜蛋白的受体聚集的抗癌药物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)孵育步骤中，温度为37℃，时间为18-30小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)将步骤1)所得重组癌症细胞和待鉴定物质进行孵育步骤中，温度为37℃，时间为30分钟；

再加入所述靶标膜蛋白受体的配体进行孵育步骤中，温度为37℃，时间为15-30分钟；

将所述重组癌症细胞进行固定的步骤中，固定剂为质量百分浓度为4％的多聚甲醛的PBS缓冲液，所述固定剂的pH值为7.2-7.6，温度为2-8℃，时间为15-45分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述荧光点均为像素小于或等于5×5的荧光点。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，所述漂白步数A中两步漂白所得二聚体的比例与所述漂白步数B中的两步漂白所得二聚体的比例之差不小于5％。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将所述待检测细胞样品I和II置于全内反射显微镜的物镜上进行单分子荧光成像步骤之前，所述抗癌药物的鉴定方法还包括如下步骤：

分别将所述待检测细胞样品I和II用缓冲液洗涤；所述缓冲液均选自磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的pH值均为7.2-7.6。

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