JP3944499B2

JP3944499B2 - タンパク質に結合した糖化最終産物の測定方法

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Publication number: JP3944499B2
Application number: JP2004249523A
Authority: JP
Inventors: 香代子棚橋; 克己川野; 望日比
Original assignee: SRL, INC.
Current assignee: SRL, INC.
Priority date: 2004-08-30
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2007-07-11
Anticipated expiration: 2016-10-30
Also published as: JP2005003690A

Description

本発明は、タンパク質に結合した糖化最終産物の測定方法に関する。本発明の方法は、糖尿病、動脈硬化、老化等の診断、治療効果の判定及び予後の予測に有用である。

メイラード反応は食品化学の領域では周知の反応で、グルコース等の還元性の糖とタンパク質が非酵素的に結合し、シッフ塩基を形成し、アマドリ転移生成物となる前期反応と、さらにそれらが複雑な反応過程を経て褐変、蛍光、分子間架橋を形成する後期反応とに分けることができる。この後期反応によって生成した物質を糖化最終産物（Advanced glycation end products, AGE) と呼んでいる。このＡＧＥは、ピラリン、ペントシジン、カルボキシメチルリジン、クロスリン等の各種構造物の総称であり、タンパク質に結合したＡＧＥは、糖尿病、動脈硬化、老化等の各種病変部に多くなることが知られており、糖尿病性合併症の発症原因物質の１つとされ、このＡＧＥ生成を阻害する薬剤によって合併症の発症が抑えられるとの報告もある。そのため、タンパク質に結合したＡＧＥを測定することにより、それら合併症の進展を捉えることが期待されている。

従来、タンパク質に結合したＡＧＥの免疫測定法は、何らの処理を行なうことなくそのまま測定されていた。

タンパク質に結合したＡＧＥは、従来法により測定可能であるが、その測定感度をより高めることができれば好ましいことは言うまでもない。

従って、本発明の目的は、従来の方法よりも測定感度が高い、タンパク質に結合したＡＧＥの測定方法を提供することである。

タンパク質は通常、三次元的に折り畳まれている。本願発明者らは、鋭意研究の結果、三次元的に折り畳まれたタンパク質の外側だけでなく、その内側にもＡＧＥが結合していることを見出し、検体を先ずタンパク変性剤で処理してタンパク質を変性させてから測定することにより、測定されるＡＧＥの量を増やすことができ、それによって測定感度を高めることができることを見出した。さらに、上記タンパク変性剤での処理を、還元剤の非存在下で、かつ、塩基性条件下で行なうことにより、タンパク質に結合した、ＡＧＥ予備軍となる糖類を該処理中にＡＧＥに転化させて測定することが可能であり、それによって今後ＡＧＥに転化される糖類をも測定して、ＡＧＥが関与するとされる動脈硬化症や各種糖尿病合併症等に罹患する可能性の大小を診断することが可能であることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、タンパク質に結合した糖化最終産物を含む検体に還元剤の非存在下で、pH10〜12.5において、ドデシル硫酸ナトリウムとプロテイナーゼＫとを併用することなくタンパク変性剤を作用させ前記タンパク質を変性させ、次いで検体中の糖化最終産物を免疫測定することから成る、タンパク質に結合した糖化最終産物の測定方法を提供する。

本発明により、検体中のＡＧＥ結合タンパク質を高感度に測定できる方法が提供された。本発明の方法は、糖尿病、動脈硬化等の診断、治療効果の判定及び予後の予測の精度向上に大いに貢献するものと期待される。さらに、本発明によれば、タンパク質に結合した、ＡＧＥ予備軍となる糖類を該処理中にＡＧＥに転化させて測定することが可能であり、それによって今後ＡＧＥに転化される糖類をも測定して、ＡＧＥが関与するとされる動脈硬化症や各種糖尿病合併症等に罹患する可能性の大小を診断することが可能である

本発明の方法に供される検体としては、血液、血清、尿、髄液等の体液及び生体内組織を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

ＡＧＥは種々のタンパク質に結合することが知られており、本発明の方法により測定されるＡＧＥ結合タンパク質は、生体内に存在するいずれのものであってもよく、複数種類のＡＧＥ結合タンパク質の混合物であってもよい。ＡＧＥが結合するタンパク質の例として、血清アルブミン、ヘモグロビン、ＬＤＬ、β₂−ミクログロブリン、コラーゲン、水晶体クリスタリン、ミエリン等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

本発明の方法では、先ず、検体にタンパク変性剤を作用させてＡＧＥ結合タンパク質のタンパク質部分を変性させる。ここで、「変性」とは、該タンパク質の三次元構造を変化させてタンパク質の内側の少なくとも一部を露出させることを意味する。このようなタンパク変性剤の例として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤や、尿素、塩酸グアニジン等を挙げることができる。また、タンパク分解酵素も本発明で言う「タンパク変性剤」に含まれる。なぜなら、タンパク分解酵素でＡＧＥ結合タンパク質を処理してそのタンパク質部分を切断することにより、タンパク質の内側の少なくとも一部が露出されるからである。もっとも、タンパク質を切断し過ぎると免疫測定の感度がかえって低下するので好ましくない。上記種々のタンパク変性剤は単独で用いてもよいし、複数のタンパク変性剤を併用してもよい。もっとも、ＳＤＳとプロテイナーゼＫを併用した場合には、免疫測定の感度の上昇が低いのでこれらの併用は望ましくない。上記タンパク変性剤のうち、ＳＤＳが特に好ましい。

タンパク変性剤の使用量は、免疫測定による測定感度が向上する量を適宜選択することにより、各タンパク変性剤に応じて適宜設定することができるが、通常終濃度で０．０１重量％以上が好ましく、免疫測定時の濃度で０．１重量％以下となることが好ましい。

タンパク変性剤を作用させる際には、加熱することが好ましい。加熱により、ＡＧＥ結合タンパク質の変性及び可溶化を容易に促進させることができる。すなわち、処理条件としては、６０℃以上、より好ましくは約１００℃で、５秒〜２０分、より好ましくは５分〜１５分程度が好ましい。

本発明の方法では、今後ＡＧＥに転化される糖類をも測定して、ＡＧＥが関与するとされる動脈硬化症や各種糖尿病合併症等に罹患する可能性の大小を診断したりすることを可能にするべく、還元剤の非存在下でタンパク変性剤処理を行ない、タンパク質に結合した、ＡＧＥ予備軍となる糖類を該処理中にＡＧＥに転化させて測定する。この場合、下記実施例で具体的に示されるように、タンパク変性剤による処理をｐＨ１０〜１２．５の塩基性条件下で行うことにより、感度が顕著に高くなるので、タンパク変性剤による処理をｐＨ１０〜１２．５の塩基性条件下で行う。

上記タンパク変性剤処理後、直ちに氷冷し、冷却後、緩衝液で５〜１０倍程度に希釈することが好ましい。この希釈液に０．１重量％程度のウシ血清アルブミンが含まれていてもよい。また、塩基性条件下でタンパク変性剤処理を行なった場合には、この希釈に先立ち、又は希釈と同時に、リン酸等の酸で中和することが好ましい。

上記のようにタンパク変性剤による処理を行なった後、検体を免疫測定に供し、検体中のＡＧＥを測定する。免疫測定自体は、抗ＡＧＥ抗体を用いた従来の方法により行なうことができる。

すなわち、抗ＡＧＥ抗体は、ＢＳＡ、ＫＬＨ等のキャリアタンパク質とグルコースとを緩衝液中で１２〜４２週間インキュベートすることによりＡＧＥ結合タンパク質を調製し、これを抗原として用いて動物を免疫し、該動物から抗体を常法により回収することにより作製することができる。抗ＡＧＥ抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。抗ＡＧＥ抗体自体及びその作製方法は公知であり、例えば、Hidetaka Nakayama et al., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, Vol.162, No.2, 1989, pp.740-745に記載されている。

免疫測定は、上記抗ＡＧＥ抗体と、検体中のＡＧＥとの抗原抗体反応を利用したいずれの方法によっても行なうことができる。すなわち、測定様式で分類すればサンドイッチ法、競合法、凝集法等のいずれの方法でもよく、また、用いる標識で分類すれば、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法等のいずれであってもよい。これらの免疫測定方法自体はこの分野において周知である。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

参考例１
(1) タンパク変性剤処理
検体としては、ラットの血清を用いた。マイクロチューブに検体０．０１ｍｌと０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）０．０９ｍｌを加えた。さらに、０．６％ＳＤＳを含む０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ生理食塩水（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。このときのｐＨは７．２であった。次いで、この混合液を１００℃で１０分間加熱し、直ちに氷冷した。冷却後、０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）０．８ｍｌを加えて希釈した。

(2) 免疫測定
(i) 抗ＡＧＥ抗体の調製
種々のタンパク質と、グルコースとを０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中にて、１２〜４２週間インキュベートし、各種ＡＧＥ化タンパク質を調製した。この方法により作製したＡＧＥ化ＫＬＨを公知の方法（H. Nakayama et al., 上掲）により家兎に免疫し、抗血清を回収し、これを抗ＡＧＥ抗体とした。作製した抗ＡＧＥ抗体は、前述の各種ＡＧＥ化タンパク質と反応した。また、標準ＡＧＥ化タンパク質として使用しているＡＧＥ化ウシ血清アルブミンをＮａＢＨ₄にて室温３０分間還元したものを用い、その処理の有無による作製した抗体との反応性を調べたところ、作製した抗体は両者ともに同程度反応した。このため、作製した抗体はＡＧＥを認識していることが示された。

(ii)ＥＬＩＳＡ
標準ＡＧＥ化ウシ血清アルブミンを２８０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）をＥＬＩＳＡプレートに０．１ｍｌずつ分注し、４℃にて一晩固相化した。さらに、このプレートを洗浄し、次いで１％ウシ血清アルブミン含有０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）を０．１ｍｌずつ分注し、室温にて４時間インキュベートし、プレートをブロッキングした。

(1) でタンパク変性剤処理した検体液０．１ｍｌと、(i) で作製した抗ＡＧＥ抗体（１万倍希釈）０．１ｍｌとを先に調製したＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃、一晩反応させた。

このように反応させたＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、必要濃度に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製Ｐ０３９９）を分注し、室温、４時間反応させた。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、発色基質であるテトラメチルベンジジンを反応させ、硫酸で反応を停止させた後、吸光度を測定した。

既知濃度の標準ＡＧＥ化タンパク質について上記操作を行なって検量線を作成し、これに基づいて血清検体中のＡＧＥ量を求めた。結果を図１に示す。本参考例の結果は、図１中、「中性ＳＤＳ」のハッチングを付した棒グラフで示される。

参考例２
検体をタンパク変性剤で処理する前に、最終濃度０．０５ＭのＮａＢＨ_４で室温で３０分間検体を処理し、その後透析したことを除き、参考例１と同じ操作を行なった。結果を図１に示す。本実施例の結果は、図１中、「中性ＳＤＳ」の黒塗りの棒グラフで示される。

実施例１
検体としては、ラットの血清を用いた。マイクロチューブに検体０．０１ｍｌと０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）０．０４ｍｌを加えた。次に０．２ＭＮａＯＨを０．０５ｍｌ加えた。さらに、０．６％ＳＤＳを含む０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ生理食塩水（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。このときのｐＨは１１．７であった。次いで、この混合液を１００℃で１０分間加熱し、直ちに氷冷した。冷却後、０．２Ｍリン酸０．０３ｍｌを加え、中和した。次いで、０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）０．７７ｍｌを加えて希釈した。

このように処理した検体について、参考例１と同様に免疫測定を行なった。結果を図１に示す。図１中、本実施例の結果は、「塩基性ＳＤＳ」のハッチングを付した棒グラフに示されている。

参考例３
検体をタンパク変性剤で処理する前に、最終濃度０．０５ＭのＮａＢＨ₄で室温で３０分間検体を処理し、その後透析したことを除き、実施例１と同じ操作を行なった。結果を図１に示す。本参考例の結果は、図１中、「塩基性ＳＤＳ」の黒塗りの棒グラフで示される。

参考例４
検体としては、ラットの血清を用いた。マイクロチューブに検体０．０１ｍｌと０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）０．０９ｍｌを加えた。さらに、０．６％ＳＤＳを含む０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ生理食塩水（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。さらに、２ＭＮａＢＨ_４／０．０５ＭＮａＯＨ０．００５ｍｌを加えた。このときのｐＨは７．５であった。次いで、この混合液を１００℃で１０分間加熱し、直ちに氷冷した。冷却後、０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）０．８ｍｌを加えて希釈した。

このように処理した検体について、参考例１と同様に免疫測定を行なった。結果を図１に示す。図１中、本参考例の結果は、「中性ＮａＢＨ_４ＳＤＳ」のハッチングを付した棒グラフに示されている。

参考例５
検体をタンパク変性剤で処理する前に、最終濃度０．０５ＭのＮａＢＨ_４で室温で３０分間検体を処理し、その後透析したことを除き、参考例４と同じ操作を行なった。結果を図１に示す。本参考例の結果は、図１中、「中性ＮａＢＨ_４ＳＤＳ」の黒塗りの棒グラフで示される。

参考例６
検体としては、ラットの血清を用いた。マイクロチューブに検体０．０１ｍｌと０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）０．０４ｍｌを加えた。次に０．２ＭＮａＯＨ０．０５ｍｌを加えた。さらに、０．６％ＳＤＳを含む０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ生理食塩水（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。さらに、２ＭＮａＢＨ_４／０．０５ＭＮａＯＨ０．００５ｍｌを加えた。このときのｐＨは１１．７であった。次いで、この混合液を１００℃で１０分間加熱し、直ちに氷冷した。冷却後、０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）０．７７ｍｌを加えて希釈した。

このように処理した検体について、参考例１と同様に免疫測定を行なった。結果を図１に示す。図１中、本参考例の結果は、「塩基性ＮａＢＨ_４ＳＤＳ」のハッチングを付した棒グラフに示されている。

参考例７
検体をタンパク変性剤で処理する前に、最終濃度０．０５ＭのＮａＢＨ_４で室温で３０分間検体を処理し、その後透析したことを除き、参考例６と同じ操作を行なった。結果を図１に示す。本参考例の結果は、図１中、「塩基性ＮａＢＨ_４ＳＤＳ」の黒塗りの棒グラフで示される。

比較例１
検体をタンパク変性剤処理することなく、参考例１と同じ方法により免疫測定を行なった。結果を図１に示す。本比較例の結果は、図１中、「未処理」のハッチングを付した棒グラフで示される。

比較例２
検体を免疫測定に付する前に、最終濃度０．０５ＭのＮａＢＨ_４で室温で３０分間検体を処理し、その後透析したことを除き、比較例１と同じ操作を行なった。結果を図１に示す。本比較例の結果は、図１中、「未処理」の黒塗りの棒グラフで示される。

比較例３
ＳＤＳ処理の際に２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーＫ溶液０．００１ｍｌを加えたこと、前記ＳＤＳ溶液中のＳＤＳ濃度が最終濃度０．３％であったこと、及びタンパク変性剤処理時の条件が６０℃、４時間、その後１００℃、５分間であったことを除き、参考例１と同じ操作を行なった。結果を図１に示す。本比較例の結果は、図１中「ＰｒｏＫ／ＳＤＳ」のハッチングを付した棒グラフで示される。

比較例４
検体を免疫測定に付する前に、最終濃度０．０５ＭのＮａＢＨ₄で室温で３０分間検体を処理し、その後透析したことを除き、比較例３と同じ操作を行なった。結果を図１に示す。本比較例の結果は、図１中、「ＰｒｏＫ／ＳＤＳ」の黒塗りの棒グラフで示される。

図１で示されるように、本発明の方法によれば、比較例の方法に比べて、測定感度が高い。また、塩基性条件下で還元剤の非存在下でタンパク変性剤処理することにより、新生ＡＧＥの生成量が非常に大きくなり、将来ＡＧＥに転化される糖類をも含めて測定する場合には、この条件が非常に優れていることも示された。さらに、現在のＡＧＥ量を測定する場合には、還元剤を含めた方が感度が高くなることも示された。

実施例２、参考例８〜１０
参考例１、実施例１、参考例４及び参考例６記載の方法により、糖尿病患者血清、腎臓透析患者の透析前後の血清及び健常人血清についてＡＧＥ量を測定した。実施例１の方法により行なった場合（実施例２）の結果を図２に、参考例６の方法により行なった場合（参考例８）の結果を図３に、参考例１の方法により行なった場合（参考例９）の結果を図４に、参考例４の方法により行なった場合（参考例１０）の結果を図５に記載する。図２〜５により、本発明の方法が、臨床診断にも適用できることが確認された。

本発明の実施例の方法及び比較例の方法により検体中のＡＧＥ量を測定した結果を示す図である。本発明の１実施例の方法により、各種患者血清及び健常人血清についてＡＧＥ量を測定した結果を示す図である。本発明の１参考例の方法により、各種患者血清及び健常人血清についてＡＧＥ量を測定した結果を示す図である。本発明のさらに他の１参考例の方法により、各種患者血清及び健常人血清についてＡＧＥ量を測定した結果を示す図である。本発明のさらに他の１参考例の方法により、各種患者血清及び健常人血清についてＡＧＥ量を測定した結果を示す図である。

Claims

タンパク質に結合した糖化最終産物を含む検体に還元剤の非存在下で、pH10〜12.5において、ドデシル硫酸ナトリウムとプロテイナーゼＫとを併用することなくタンパク変性剤を作用させ前記タンパク質を変性させ、次いで検体中の糖化最終産物を免疫測定することから成る、タンパク質に結合した糖化最終産物の測定方法。
前記タンパク変性剤はドデシル硫酸ナトリウムである請求項１記載の方法。
前記タンパク変性剤を作用させる際に加熱する請求項１又は２記載の方法。
前記タンパク質変性剤は、タンパク質分解酵素の非存在下で作用させる請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。