JPH07509780A - ピリジニウム架橋検定のための方法及びキット - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ピリジニウム架橋検定のための方法及びキット１、発明の分野 本発明は、ヒト尿サンプル中の生体の遊離のピリジニウム架橋（ｐｙｒｉｄｉｎ ｉｕｍ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ）のレベルを測定するための方法に、並びにその方 法における使用のための抗体試薬及びキットに関する。

４８：６４１−６４４　（１９８９）。

２７：１８７　（１９９２）。

Ｍａｃｅｋ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｚ、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、旦：２コアー２４ ０（１９８７）。

Ｏｇａｗａ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎｅ、皿：１２５１−１２５７　（１９Ｂ２）。

Ｒｏｂｉｎｓ、Ｓ、Ｐ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、２０７＋６１７−６２０　（１ ９Ｂ２ａ）。

Ｒｏｂｉｎｓ、Ｓ、Ｐ、、ｉｎ　”ＣｏｌＣｏ１１ａ　ｉｎ　Ｈｅａｌｔｈ　ａ ｎｄＤｉｓｅａｓｅ”　（Ｗｅｉｓｓ、、丁、Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、） ｐｐ、１６０−１７８゜Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｑｓｔｏｎａ、Ｅｄｉ ｎｂｕｒｇｈ　（１９８２ｂ）。

Ｒｏｂｉｎｓ、Ｓ、Ｐ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２１５；１６７−１７３　（１ ９８〕）。

Ｒｏｂｉｎｓ、Ｓ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ　Ｄｉｓ 。

４５：９６９−９７３　（１９１１！６）。

Ｒｏｂｉｎｓ、Ｓ、Ｐ、、ｅｔ　ａユ、、Ｂ１０Ｃｈユｍ−ＢＩＯｐｈｙＳ、Ａ ｃｔａ。

旦＾丘：２コ］−２３９（１９８７）。

５ｅｉｂｅｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｒｈｅｕｒｎａｔｏｌ　１亘：９６４−９７ ０　（１９Ｂ９）。

Ｗｏｎｇ、Ｓ、Ｓ、、Ｃｅｍ’ｓｔ　ｏｆ　Ｐ　ｏｔｅ’ｎ　Ｃｏｎ’ｕ　ａｔ ’ｏｎ　ａｎｃＩＣｏｓｓ−ｉｎｋ’ｎ　、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａ ｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ　（１９９１）。

３、発明の背景 高レベルの骨再吸収、及び骨形成と骨再吸収との間の異常バランスを特徴とする ヒトにおける様々な症状が存在する。これらの中でより一般的なものは、骨粗し よう症、バクエツト病、及び骨の良性及び悪性腫瘍の進行に関連する症状並びに 例えば前立腺又は胸の初期腫瘍から骨細胞へ転移した転移癌である。コラーゲン 代謝における変化に関連する他の症状は、骨軟化（ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａｌ ）疾患、伺傳病（ｒｉｃｋｅｔｓ）　、子供における異常成長、腎性骨ジストロ フィー、及び薬物−誘発性オステオペニアを含む。骨代謝における不規則性は、 しばしば甲状腺治療の副作用及び甲状腺症状それ自体、例えば、初期甲状腺低下 症及び甲状腺中毒症並びにクッシング病である。

骨再吸収の失調又は骨形成と骨再吸収との間の異常バランスを特徴とする他の疾 患か尿中のピリジニウム架橋（ｐＹｒｉｄｉ旧ｕｍｃｒｏｓｓｌｉｎｋｓ）の変 化したレベルにより検出されることができるというとが認識されている（Ｒｏｂ ｉｎｓ、　＋９８２ｂ；　Ｍａｃｅｋ；　Ｂｌａｃｋ）　ｏ多数のコラーゲン含 存組織から生じる架橋は、その環窒素がリジン又はヒドロキシリシンのいずれか のイプシロン・アミノ基から誘導される中央の３−ヒドロキシ・ピリジニウム環 を含む化合物の形態を呈する（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ。

＋９７８；　Ｒｏｂｉｎｓ、１９８２ａ；　Ｇｕｎｊａ−３ｍｉｔｈ；　Ｏｇａ ｗａ；　Ｅｙｒｅ）。

尿中に見られるピリジニウム架橋化合物は、４つの一般的なりラス：（１）約４ ００ダルトンの分子量をもつ遊離の生来の架橋（ＦｕｊｉｍｏｔＯ）、（２）約 ５５０〜１．０００ダルトンの間の分子量をもつ糖添加架橋及び架橋ペプチド形 態（Ｒｏｂｉｎｓ、　１９８３）、（３）　１．０００〜３，５００ダルトンの 間の分子量をもつ架橋ペプチド形態（Ｒｏｂｉｎｓ、　１９８３．１９８４．１ ９８７；ｔ（ｅｎｋｅｌ　Ｅｙｒｅ）、及び（４）３．５００ダルトンを上回る 分子量をもつ架橋ペプチド形態、に群分けされることができる。正常な大人にお いては、これらの形態は、全尿中架橋の約３８％の（１）　、４０％の（２）　 、１５％の（３）、及び７％の（４）を占める（Ｄａｎｉｌｏｆｆ）。正常な大 人の尿中の遊離架橋（上記群１）の約８０％は、その環窒素がヒドロキシリシン から生じているピリジノリン（ｐｙｒｉｄｉｎｏｌ　１ｎｅ（Ｐｙｄ））であり 、そして約２０％は、その環窒素かりシンから生じているデオキシピリジノリン （ｄｅｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｏｌｉｎｅ（Ｄｐｄ））である。このＰｙｄ／Ｄｐ ｄ比は、尿中の他の３クラスの架橋におおまかに適用できる。高分子量の架橋は 酸加水分解により遊離の架橋に変換されることができる（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ、　 １９７Ｂ）。

尿中のピリジニウム架橋の測定方法は提案されている。これらの方法の中に１つ は、全加水分解Ｐｙｄ、すなわち、尿中架橋の強い加水分解により作られたＰｙ ｄを、ＨＰＩ、Ｃにより分離されたその加水分解Ｐｙｄビークを定量することに より、測定することを含む（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ。

１９８３）。熟成までの全加水分解２１６間の関係は、上記研究者により、′全 加水分解Ｐｙｄ／クレアチニンに対する比として測定され、ここで、クレアチニ ンのレベルは架橋レベルを尿濃度及び骨格質量に標準化するために使用される。

この比は、子供の尿中で高く、そして大人にわたり比較的定常であり、高齢にお いて僅かに増加する。上記筆者は、これが高齢において観察される骨質量の損失 に対応するかもしれないと推測している。

′　リウマチ様関節炎をもつ患者の加水分解尿中の全架橋の上昇レベルについて の研究は、この疾患を診断する方法として示唆されている（Ｂｌａｃｋ、　１９ ８９）。（ＨＰＬＣにより測定された全架橋のクレアチニンに対する比として表 された）リウマチ様関節炎をもつ患者についての全加水分解架橋のレベルは対照 と比べたとき５倍上昇した。しかしながら、全加水分解Ｄｐｄてはなく全加水分 解Ｐｙｄだけが測定可能な増加を示した。

加水分解法を使用したより詳細な研究において、５ｅｉｂｅｌ他はリウマチ様及 び骨関節炎の両方において対照に対してのＰｙｄ及びＤｐｄ架橋の分泌における 有意な増加を示した。Ｐｙｄ架橋についての最も顕著な増加はリウマチ様関節炎 をもつ患者において存在した（Ｓｅｉｂｅり。

検定方法、例えば、直前に記載したようなものであって、加水分解サンプルから の架橋又は比加水分解サンプルからの架橋サブフラクションの）ＩＰＬｃ定量を 含むものは、実施するのにかなり時間が掛かり且つ高価であり、そして骨代謝失 調における広範なスクリーニング又は治療をモニタリングするために実行するこ とができない。

イムノアッセイも尿中架橋の測定のために提案されている。米国特許第４．９７ ３．６６６号は、骨コラーゲンと会合する特異的なペプチド伸長を特徴とする特 異的ピリジニウム架橋の尿中の検出による骨再吸収の測定のための検定について 開示している。骨コラーゲンと会合すると推定されるペプチド伸長をもつ２つの 特異的存在物について記載されている。これらは、パンエツト病、すなわち、高 速度の骨形成及び破壊を含むことで知られる病気を患う患者の尿から得られる。

この検定は、その架橋ペプチドに対して調製された抗体とのその特異的ペプチド 断片又は伸長を含む架橋化合物の免疫特異的結合に頼る。検定される架橋ペプチ ドの濃度が全尿中架橋に関係するかどうか又はどのように関係するかどうかは、 明らかでない。

Ｒｏｂｉｎｓは、加水分解Ｐｙｄに特異的な抗体の使用による尿中のピリジノリ ンの測定のための技術について記載している（Ｒｏｂｉｎｓ）。この方法は、そ の抗体がＰｙｄの加水分解形態に特異的であることが発見されたという限定をも ち、これは、テストされる尿サンプルが加水分解条件下で最初に処理されるべき ことを要求する。加水分解処理は、この検定の時間及び費用を増加させ、そして 他の生来のピリジニウム架橋の測定を排除する。

コラーゲン含存組織のピリジニウム架橋含量は、組織タイプに従って量及び組成 において変化することが知られている。Ｐｙｄ架橋は、軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇ ｅ）　、骨（ｂｏｎｅ）、椎間板（ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃｓ ）、靭帯（ｌｉｇａｍｅｎｔｓ）　、及び大動脈中に発見された。Ｐｙｄ架橋よ りも一般的に優勢ではないＤｐｄ架橋は、骨、歯、靭帯、及び大動脈中に発見さ れた。組織ピリジニウム架橋中のＤｐｄの割合は、骨中で最も高いようであり、 これは約３＝１〜４：１間のＰｙｄ：Ｄｐｄ比をもつ。軟骨中のピリジニウム架 橋は、他方において、主にＰｙｄを含む。

理想的には、尿中のピリジニウム架橋レベルに基き骨代謝を評価するための検定 方法は、（ａ）そのサンプルの酸加水分解についての必要性を回避するために、 非加水分解法サンプルを使用するべきであり、そして（ｂ）慣用のＨＰＬＣベー スのテストにわたる分析の時間及び費用を減少させるために、生来の遊離のピリ ジニウム種を検出するための抗体試薬を使用するべきである。

４、発明の要約 本発明は、生来の遊離のピリジノリン、生来の遊離のデオキシピリジノリン、又 は両方に特異的なモノクロナール抗体試薬を提供する。

１つの態様においては、本発明は、ヒト被験者における骨コラーゲン分解活性の 検定方法を含む。拳法においては、被験者からの尿サンプルが、生来の遊離のピ リジノリン及び生来の遊離のデオキシピリジノリンから成る群から選ばれたピリ ジニウム架橋と免疫特異的に反応することができるモノクロナール抗体と、反応 する。このモノクロナール抗体は、約３・１よりも大きな、そして好ましくは、 約５１よりも大きな、選択されたピリジニウム架橋とに対する反応性と分子量に おいて１．０００ダルトンを上回る尿中ピリジニウム・ペプチドとに対する反応 性との比をもつ。

１つの態様においては、本モノクロナール抗体は、生来の遊離ピリジノリンに特 異的であり、そして約５．１よりも大きな、生来の遊離ピリジノリンに対する反 応性と生来の遊離デオキシピリジノリンとに対する反応性との比をもつ。第二の 態様においては、本モノクロナール抗体は、生来の遊離デオキシピリジノリンに 特異的であり、そして約２５．１よりも大きな、生来の遊離デオキシピリジノリ ンに対する反応性と生来の遊離ピリジノリンとに対する反応性との比をもつ。他 の態様においては、本モノクロナール抗体は、生来の遊離ピリジノリン及び生来 の遊離デオキシピリジノリンに特異的であり、そして２１〜Ｉ：２の間の、生来 の遊離ピリジノリンに対する反応性と生来の遊離デオキシピリジノリンとに対す る反応性との比をもつ。

より一般的には、生来の遊離ピリジノリンに対する反応性と生来の遊離デオキシ ピリジノリンに対する反応性との比は、５．ｌ超えから１２５未満までにあるこ とかできる。

尿サンプルは、本検定を妨害することができるサンプル成分（例えば、タンパク 質）を除去するために、ニトロセルロース・フィルター又は他の好適な分離媒質 を通過させられることができる。

他の態様においては、本発明は、拳法における使用のためのモノクロナール抗体 試薬を含む。この抗体試薬は、生来の遊離ピリジノリン及び生来の遊離デオキシ ピリジノリンから成る群から選ばれた遊離のピリジニウム架橋への免疫特異的結 合を、そして約３＝１よりも大きな、選択されたピリジニウム架橋とに対する反 応性と分子量においてＩ、　０００ダルトンを上回る尿中ピリジニウム・ペプチ ドとに対する反応性との比を、特徴とする。

また、本発明は、先に記載したような抗体試薬の調製における使用のための免疫 原をも含む。この免疫原は、好ましくは水溶性カルボジイミドによりタンパク質 担体に結合された、生来の又は加水分解形態のいずれかにおける、遊離のＰｙｄ 又は遊離のＤｐｄから成る。

１つの好ましいタンパク質担体は、ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔヘモシアニン である。

また、先に記載した抗体試薬中での使用のためのモノクロナール抗体の調製方法 も本発明を形成する部分である。拳法は、（ａ）担体タンパク質に付着した遊離 のピリジノリン又は遊離のデオキシピリジノリンにより免疫感作された動物から の膵臓細胞、及び（ｂ）不死化融合パートナ−の融合生成物から成るハイブリド ーマを作り、そして選択された生来の遊離のピリジニウム架橋に免疫反応性であ るハイブリドーマを選択すること、を含む。担体タンパク質に付着された遊離の ピリジニウム架橋は、形態において生来のもの又は加水分解されたものであるこ とかてきる。

他の態様においては、本発明は、ヒト被験者における骨コラーゲン分解のレベル の検定における使用のだめのキットを含む。このキットは、生来の遊離のピリジ ノリン及び生来の遊離のデオキシピリジノリンから成る群から選択されたピリジ ニウム架橋と免疫特異的に反応することができ、そして約３．１を超える、選択 されたピリジニウム架橋に対する反応性と、分子量において１．０００ダルトン を上回る尿中ピリジニウム・ペプチドに対する反応性との比をもつ、抗体試薬を 含む。また、本キットは、サンプル中の遊離のピリジニウム架橋との上記抗体試 薬の反応により形成される免疫複合体の量を検出するための検出手段を含む。

好ましくは、この検出手段は、比色定量シグナルを作り出すのに有効なリポータ −酵素を含む。但し、他の様式を使用することができる。

１つの一般的な態様においては、本キットは、先に記載したような抗体試薬であ ることができる表面付着結合剤をもつ固相支持体、又は生来の遊離のピリジニウ ム架橋を含む。他の一般的な態様においては、本キットは、ＥＭＩＴ配置（ＥＭ ＩＴ　ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を使用する。

他の態様においては、本発明は、生来の遊離のピリジノリン及び生来の遊離のデ オキシピリジノリンから成る群から選択されたピリジニウム架橋と免疫特異的に 反応することができるポリクロナール抗体試薬を含む。この抗体試薬は、約３＝ １を超える、好ましくは、約５：ｌを超える、選択されたピリジニウム架橋に対 する反応性と、分子量においてｉ、　ｏｏｏダルトンを上回る尿中ピリジニウム ・ペプチドに対する反応性との比をもち、そして先に討議した方法及びキットに おいて使用されることかできる。

他の態様においては、本発明は、尿中分析物を定量するだめの検定法を含む。こ の検定においては、尿サンプルを、その分析物の通過を許容しなから抗体に非特 異的に結合する物質を除去するのに有効な膜を通して濾過する。濾過された尿サ ンプルを、サンプル中の分析物の量に比例してその固体支持体にその抗体を結合 させるのに有効な条件下で、その分析物と抗原−抗体複合体を形成させるのに有 効な結合性試薬と、反応させる。好ましいフィルター膜は、ニトロセルロース、 Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＣＤ、及びＩｍｍｏｂ　ｉ　１ｏｎ−３ＰＱを含む。

本発明の上記及び他の目的及び構成は、以下の発明の詳細な説明を添付図面と併 せて読むときにより十分に明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１八−ＩＣは、本発明に従う検定の態様の実施における段階について説明して いる。

図２は、４４尿サンプル中の、本発明のモノクロナール抗体試薬を使用して測定 された生来の遊離のピリジノリン濃度（ｙ軸）、体１（ＰＬＣにより測定された 全（加水分解）ピリジノリン濃度、の線形回帰プロットを示している。

図３は、本発明に従う検定法を使用して測定されたときの、転移癌患者における ものと比較した正常患者における生来の遊離のピリジノリンのレベルを示してい る。

図４は、本発明に従う検定法を使用して測定されたときの、重度の骨粗しよう症 及び股関節部骨折をもつと診断された患者（群ｌ）、股関節部骨折をもたない骨 粗しよう症をもつと診断された患者（群２）、及び年齢を合わせた対照患者、に おける生来の遊離のピリジノリンのレベルを示している。

図５は、本発明に従う検定法を使用して測定されたときの、正常患者（群１）、 代謝性骨疾患症状をもつ患者（群２）、及び腫瘍学患者、における生来の遊離の デオキシピリジノリンのレベルを示している。

図６は、本発明に従う検定法を使用して測定されたときの、エストロゲン治療の 前及び１年後の骨粗しよう症患者における生来の遊離のデオキシピリジノリンの レベルを示している。

図７Ａ−７Ｂは、本発明に従う検定の他の態様の実施における段階を説明してい る。

図８は、カップリング試薬ＥＤＣを介して酵素に結合したピリジノリン又はデオ キシピリジノリン分子の数の関数としてのグルコース−６−ホスフェート・デヒ ドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）Ｉ）の残存酵素活性を示している。

図９Ａ及び９Ｂは、Ｐｙｄ−特異的モノクロナール抗体（９Ａ）及びＰｙｄ特異 的ポリクロナール抗体の増加濃度の存在中のＰｙｄ−標識Ｇ６ＰＤＨの残存酵素 活性のプロットを示している。

図１０は、図７Ａ−７Ｃ中に示した検定配置を使用して得られた標準曲線を示し ている。

本明細書中で使用するとき、以下の用語は、以下の定義をもつ：”Ｐｙｄ”又は “ピリジノリン“又は遊離のピリジノリン”とは、式中、その環窒素がヒドロキ シルリシル残基のεアミノ基から生じている、以下の（＋）において示される化 合物をいい、そしてＤｐｄ”又は“デオキシピリジノリン”又は遊離のデオキシ ピリジノリン”とは、式中、その環窒素がリシル残基のεアミノ基から生じてい る、以下の（Ｉ＋）において示される化合物をいう。

“遊離の架橋（Ｆｒｅｅ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｓ）”とは、化合物（１）又は（ Ｉ＋）、あるいはそれらの混合物をいう。

”糖添加ピリジノリン（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｐｙｒｉｄｉｎｏｌｉｎｅ ）”又は”ｇｌｙｃ。

−ｐｙａ“とは、式中、グリコジル基かＰｙｄの脂肪族ヒドロキシル基に共存結 合した化合物（＋）の糖添加形態をいう。同定されている２つのｇｌｙｃｏ−Ｐ ｙｄ架橋は、Ｇａ１−Ｐｙｄ及びＧｌｃ−Ｇａｌ−Ｐｙｄてあって、これはそれ ぞれ以下の式（ＩＩ＋）及び（１ｖ）において示される。

“Ｐｙｄ−ペプチド“又は“ピリジノリン−ペプチド“とは、式中、その化合物 内の３つのアミノ酸残基の中の１以上がペプチド結合を介して追加のアミノ酸残 基に結合されている化合物（１）のペプチド誘導体化形態をいう。同様に、”Ｄ ｐｄ−ペプチド”又は”デオキシピ酸残基の中の１以上がペプチド結合を介して 追加のアミノ酸残基に結合されている化合物（Ｉ　ｌ）のペプチド誘導体化形態 をいう。

”ピリジニウム−ペプチド”とは、Ｐｙｄ−ペプチドとＤｐｄ−ペプチドの混合 物をいう。

’１ｏｏｏダルトンを超える分子量をもつＰｙｄ−ペプチド“又は“ｐｙｄ−ペ プチド（ＭＷ＞　１０００）”とは、１．０００分子量カットオフをもつ透析膜 により保持されたＰｙｄ−ペプチドをいう。

“１０００ダルトンを超える分子量をもつＤｐｄ−ペプチド“又は”Ｄｐｄ−ペ プチド（ＭＷ＞　１０００）”とは、ｉ、　ｏｏｏ分子量カットオフをもつ透析 膜により保持されたＤｐｄ−ペプチドをいう。

’ｐｙｄ架橋”とは、遊離又は誘導体化形態のいずれかにおいて化合物（１）を 含む尿中のピリジニウム架橋をいう。Ｐｙｄ架橋は、Ｐｙｄ、ｇ＋ｙｃｏ−ｐｙ ａ及びＰｙｄ−ペプチドを含む。同様に、”Ｄｐｄ架橋“とは、遊離又は誘導体 化形態のいずれかにおいて化合物（１１）を含む尿中のピリジニウム架橋をいう 。“Ｄｐｄ架橋“は、Ｄｐｄ及びＤｐｄ−ペプチドを含む。

”ピリジニウム架橋”とは、遊離及び／又は誘導体化形態における化合物（１） 及び／又は（ＩＩ）を含むピリジニウム架橋をいう。

”全ｏ−ｐｙｄ″とは、Ｐｙｄ架橋をＰｙｄに加水分解することにより作られた 全加水分解Ｐｙｄをいう。同様に、“全１トＤｐｄ”とは、ＤＦＩｄ架橋をＤｐ ｄに加水分解することにより作られた全加水分解Ｄｐｄをいう。

”加水分解−Ｐｙｄ“又は“Ｈ−Ｐｙｄ”とは、６Ｎ　）ＩｃＩ中で１１０℃に おいて１６時間Ｐｙｄ架橋を加水分解することにより作られたＰｙｄをいう。同 様に、”加水分解−Ｄｐｄ”又は”Ｈ−Ｄｐｄ”とは、６Ｎ　ＨＣｌ中で１１０ °Ｃにおいて１６時間Ｄｐｄ架橋を加水分解することにより作られたＤｉｅｄを いう。

“生来のＰｙｄ”又は”Ｎ−ｐｙａ”　とは、加水分解条件に供されない尿から 得られたＰｙｄをいう。同様に、″生来のＤｐｄ”又はＮ−Ｄｌｌｄ“とは、加 水分解条件に供されない尿から得られたＤｐｄをいう。

″生来の遊離のピリジノリン及び生来の遊離のデオキシピリジノリンから成る群 から選ばれたピリジニウム架橋と免疫特異的に反応することができる“モノクロ ナール抗体（又は抗体試薬）とは、尿サンプル中に存在することができる他の抗 原性材料に対して、生来の遊離のピリジノリン、生来の遊離のデオキシピリジノ リン、又はその両方に免疫特異的なモノクロナール抗体をいう。生来の遊離のピ リジノリン及び生来の遊離のデオキシピリジノリンに対するモノクロナール抗体 の反応性（アフィニティー）の比が、約５：１以上から、約１＝２５未満までの レンジに、その間のすべての比を含んで、あることができる。

“約３．■を超える、選択されたピリジニウム架橋に対する反応性と、分子量に おいてｉ、ｏｏｏダルトンを上回る尿中ピリジニウム・ペプチドとの反応性との 比”の意味は、生来の遊離のピリジノリン対生来の遊離のデオキシピリジノリン についてのその抗体の相対的な特異性に依存する。抗体が、２：１を超える、生 来の遊離のピリジノリンに対する反応性と生来の遊離のデオキシピリジノリンに 対する反応性との比をもつ場合には、このフレーズは、Ｎ−Ｐｙｄに対する反応 性とＰｙｄ−ペプチド（ＭＷ＞１０００）に対する反応性との比をいう。抗体が 、ｌ：２未満である、生来の遊離のピリジノリンに対する反応性と生来の遊離の デオキシピリジノリンに対する反応性との比をもつ場合には、このフレーズは、 Ｎ−Ｄｐｄに対する反応性とＤｐｄ−ペプチド（ＭＷ＞１０００）に対する反応 性との比をいう。２：１〜１：２の間の又はこれの等しい生来の遊離のピリジノ リンに対する反応性と生来の遊離のデオキシピリジノリンに対する反応性との比 をもつモノクロナール抗体については、このフレーズは、Ｎ−Ｐｙｄに対する反 応性とＰｙｄ−ペプチド（ＭＷ＞　１０００）に対する反応性との比、及びまた 、Ｎ−Ｄｐｄに対する反応性とＤｐｄ−ペプチド（ＭＷ＞ｔｏｏｏ）　Ｌこ対す る反応性との比が、約３゜１を超える。

Ｉｌ、抗体試薬の調製 本セクションは、約３．１を超える、そして好ましくは、約５：ｌを超える、生 来の遊離ピリジニウム架橋に対する反応性と、１．０００ダルトンを上回る尿中 ピリジニウム・ペプチドに対する反応性との比により証明されるような、生来の 遊離のピリジニウム架橋（Ｎ−Ｐｙｄ。

Ｎ−Ｄｐｄ　、又は両方のいずれか）に特異的であるモノクロナール及びポリク ロナール抗体（”抗体試薬”）の生産について記載する。

抗体が生来の遊離のピリジノリンに結合するためのものである場合には、その抗 体は、好ましくは、約５：１を超える、好ましくは約２０：ｌを超える、そして より好ましくは約１００：１を超える、生来の遊離のピリジノリンに対する反応 性と、生来の遊離デオキシピリジノリンに対する反応性との比をもつ。

抗体が生来の遊離のデオキシピリジノリンに結合するためのものである場合には 、その抗体は、好ましくは、約５：１を超える、好ましくは約２５＝１を超える 、そしてより好ましくは約１００：ｌを超える、生来の遊離のデオキシピリジノ リンに対する反応性と、生来の遊離ピリジノリンに対する反応性との比をもつ。

抗体か生来の遊離のピリジノリン及び生来の遊離のデオキシピリジノリンに結合 するためのものである場合には、その抗体は、好ましくは、約２．１〜１：２の 間の、生来の遊離のピリジノリンに対する反応性と、生来の遊離デオキシピリジ ノリンに対する反応性との比をもつ。

本発明に係る抗体試薬は、好ましくは、約５　ｘ　１０７１モルを超える選択さ れたピリジニウム種（Ｎ−Ｐｙｄ又はＮ−Ｄｐｄ）についての結合アフィニティ 一定数をもつ。

Ａ、免疫原 抗体試薬を作るために使用される免疫原は、担体分子、典型的には担体タンパク 質、例えば、Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した Ｄｐｄ又はｐｙａである。

ｐｙａは、生米のＰＹｄ（Ｎ−Ｐ）’ｄ）又は加水分解されたｐｙｄ（Ｈ−Ｐｙ ｄ）であることができる。同様に、Ｄｐｄは、生来のＤｐｄ（Ｎ−Ｄｐｄ）又は 加水分解されたＤＩ）ｄ（Ｈ−Ｄｐｄ）であることができる。Ｎ−Ｄｐｄ又はＮ −ｐｙｃｔを得るために、尿中の他のピリジニウム化合物からのＮ−Ｄｐｄ又は Ｎ−Ｐｙｄのグロス分離を、実施例２中に記載するように、尿の分画により達成 することができる。簡単に言えば、尿の濃縮物を、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０ カラムに適用し、そしてすべてのピリジニウムを含む両分を溶出させる。

次にこの溶出物をクエン酸ナトリウムにより平衡化したホスホセルロースのカラ ムに適用し、そして塩により溶出させ、単一ピークにおいて遊離架橋を得る。こ のサンプルは加水分解条件に供されないので、このピークは、Ｎ−ＤＩ）ｄ及び Ｎ−Ｐｙｄ形態（′遊離の架橋“）だけではなく、ｇｌｙｃｏ−Ｐｙｄをも含む 、先に記載したようなＧａ１−Ｐｙｄ及び及びＧｌｃ−Ｇａｌ−Ｐｙｄを含む。

次に、さらなる精製を、便利には、例えば、スルホン化ポリスチレン・ビーズ上 のイオン交換、又はＨＰＬＣを使用した標準的な方法により行う。この分離にた めの典型的なプロトコールは、例えば、Ｂｌａｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　＋９８ ８．５ｅｉｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９、及び実施例２の中にある。

あるいは、加水分解ｐｙｄ又はＪｌｄは、例えば、Ｂｌａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８８中に記載されたように精製された、骨コラーゲン又は尿中のピリジニ ウム架橋の酸加水分解により作られることができる。

担体タンパク質へのＰｙｄ又はＤｐｄのカップリングは、典型的には、標準的な 方法に従って、１のカップリング末端において、Ｐｙｄ又はＤｐｄの遊離のカル ボキシル基の中の１つへのアミド結合を、そして他のカップリング末端において 、その担体タンパク質へのアミド又はエステル又はジスルフィド結合を形成する 二価カップリング剤を使用した、標準的なカップリング方法による。

あるいは、好ましい態様においては、Ｐｙｄ又はＤｐｄは、これもまたよく知ら れた方法に従って、例えば、水溶性カルボキシル活性化剤、例えば、ＥＤＣ（１ −（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド）の存在中、そ のタンパク質に直接的に結合されることができる。後者のアプローチを、実施例 ３において説明する。この例は、ＥＤＣ活性化によるｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐ ｅｔヘモシアニン（ＫＬＨ）　ヘのＤｐｄのカップリングについて記載する。ペ プチド抗原による担体タンパク質の誘導体化のための一般的なカップリング反応 は、Ｈａｒｌｏｗ　（１９８８）、　ｐｐ、　７７−８７及びＷｏｎｇ　（１９ ９１）中に与えられている。

Ｂ、モノクロナール抗体試薬 モノクロナール抗体試薬を作るために、先に記載した免疫原を、動物、例えば、 マウスを免疫感作させるために使用し、これから、抗原−特異的リンパ球を不死 化のために得ることができる。好適でることが判明している１つの動物は１．Ｉ ａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＭＮ）から入 手可能な′自己免疫性（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ）”ＭＲＬ／ＭｐＪ−１ｐｒマウ スである。

Ｎ−Ｐｙｄに特異的な抗体か望ましい場合には、Ｐｙｄ−免疫原か典型的に使用 される。同様に、Ｎ−Ｄｐｄに特異的な抗体が望ましい場合には、Ｄｐｄ−免疫 原が典型的に使用される。Ｐｙｄ及びＤｐｄの両方を認識する抗体を、Ｐｙｄ− 免疫原又はＤＩ）ｄ−免疫原を使用して得ることができる。

Ｂ、　Ｉ　Ｎ−Ｐｙｄモノクロナール抗体Ｎ−Ｐｙｄに特異的なモノクロナール 抗体試薬を作るために、マウスを、実施例４中に大要を示すように、Ｈ−Ｐｙｄ −ＫＬＨ免疫原の一連の注射を使用して免疫感作させることができる。最初の免 疫感作の約８週間後、膵臓細胞を収穫し、そしてＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３　ミ エローマ細胞系と融合させる。首尾よく融合した生成物の選択は、公開された方 法に従って、ならしＳ−ＤＭＥＭ培地中のＨＡＴ中で行われることができる（一 般的には、Ｈａｒｌｏｗ、　ｐＨ，１９６−２１２を参照のこと。）。次に首尾 よい融合生成物を、実施例８中に記載するものと類似の競合的イムノアッセイ処 方を使用して、Ｎ−Ｐｙｄとの免疫反応性についてスクリーンする。Ｎ−ｐｙｃ ｔへの高いアフィニティー結合を示す細胞系を、限界希釈法によりサブクローン 化し、そしてＮ−ｐｙｔｉについての高い結合アフィニティーをもつ抗体の生産 についてさらにスクリーンする。

上記手順により得られ、モしてＮ−Ｐｙｄについての高い抗体アフィニティーを 与える１つのサブクローン化された細胞系を、本明細書中で、Ｍａｂ−ＸＸＶ− ３６６−３８１１−ＩＡＩＯと命名する。この細胞系のサンプルは、Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐ ａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ　２０８５２により寄託 されており、そしてＡＴＣＣ第８８１１０８９号と指定されている。

抗体試薬を作るために、上記ハイブリドーマ細胞系を、好適な培地（ｈａｒｌｏ ｗ、　ｐｐ、　２４７−２７０）　、例えば、以下の材料及び方法のセクション 中に記載するように補われたＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ修飾Ｅａｇｌｅ’　ｓ培地 （ＤＩＪＢＭ）中で、培養する。モノクロナール抗体（”Ｍａｂｓ”）を、上記 培地から収穫し、そして公開された方法（ｔ（ａｒｌｏｗ　９１１．２７１−３ １８）に従って濃縮及び保存することができる。

先に述べたように、本発明の重要な特徴は、尿中のより大きな分子量のピリジニ ウム架橋に対するＮ−Ｄｐｄ及びＮ−Ｐｙｄについての抗体試薬の特異性である 。Ｎ−Ｐｙｄ　、　Ｎ−Ｄｐｄ　、及び他の尿中ピリジニウム架橋についての抗 体試薬の相対的特異性は、実施例１０中に詳説されるように、Ｎ−ＰＹｄについ ての競合的結合検定により測定されることができる。

簡単に言えば、Ｎ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄ　、並びに等モル量（それぞれ１５０ μＭ）中に２０の一般的アミノ酸を含むアミノ酸を含む様々な精製された架橋サ ンプルを、そのサンプル中のピリジニウム架橋がその抗体への結合についてその 支持体結合Ｎ−Ｐｙｄと競合する条件下で、付着されたＮ−Ｐｙｄをもつ固相支 持体の上で、限定された量の抗体試薬と反応させる。固相支持体への抗体の結合 の程度は、その抗体試薬についてのそのサンプル架橋の相対的反応性の尺度を提 供する。

実施例ＩＯ中に大要を示す手順に従って、Ｎ−ＰＹｄ　５Ｎ−Ｄｐｄ　５ｐｙｄ −ペプチド（ＭＷ＞１．０００）、及びアミノ酸混合物（一般的な２０アミノ酸 のそれぞれ＋５０　ｕＭ）０）、細胞系Ｐｙｄ　ＸＸＶ−３６６−３８１１−Ｉ Ａ１０カラ０）　（−／　クロナール抗体への結合のレベルを、調査した。それ ぞれのサンプルの見かけのＰｙｄ濃度を、精製Ｎ−Ｐｙｄを使用して確立された 標準曲線を使用して測定した。それぞれのサンプルのパーセント反応性を、全Ｈ −ＰｙｄについてＩＩＰＬＣにより測定されたサンプル中の全ＰＹｄ架橋濃度（ １００倍）に対する、又はＮ−Ｄｐｄサンプルの場合における全Ｈ−Ｄｐｄにつ いてのＨＰＬＣにより測定されるような全Ｄｐｄ−架橋濃度（１００倍）に対す る、（上記のＮ−Ｐｙｄ標準曲線を使用して測定された）見かけの濃度の比とし て、計算した。結果を表１中に示す。ここで、Ｎ−Ｐｙｄとの反応性を１００％ として定義した。

表から分かるように、モノクロナール抗体試薬は、Ｎ−Ｄｐｄに対してＮ−ＰＹ ｄについて高く選択性であり、約３：ｌを超える、そして本ケースにおいては、 ５：１を超える、生来の遊離ピリジノリンに対する反応性と、生来の遊離デオキ シピリジノリンに対する反応性との比を、示している。また、この試薬は、（全 Ｐｙｄ含量について定量され）テストされたピリジニウム−ペプチド形態を上回 ってＮ−Ｐｙｄについて選択性であり、約１００：ｌを超える、分子量において １．０００ダルトンを上回るピリジノリン・ペプチドに対する反応性の比を示す 。

さらに、この試薬は、テストされたアミノ酸混合物との最小の交差反応性（〈１ ％）を示す。

より一般的には、Ｎ−Ｐｙｄに特異的であるＭａｂ試薬は、上記の検定により測 定されるとき、５：ｌを超える、好ましくは、ＩＯ＋１を超える、より好ましく は、２５：１を超える、そして本ケースにおいては、１００：１を超える、生来 の遊離のピリジノリン（Ｎ−Ｐｙｄ）及びＰｙｄ−ペプチド（ＭＷ＞１０００） に対する反応性をもつ。

８．２　Ｎ−Ｄｐｄモノクロナール抗体Ｎ−Ｄｐｄに特異的であるモノクロナー ル抗体試薬を作るために、Ｎ−。

Ｐｙｄ　Ｍａｂｓを得るための先の手順を使用することができる。但し、Ｄｐｄ −ＫＬＨを免疫原として使用し、そして免疫反応性スクリーニングをＮ−Ｄｐｄ のための検定により行う。この手順により得られ、モしてＮ−Ｄｐｄについての 高い抗体アフィニティーを与える１つのサブクローン化細胞系は、本明細書中、 Ｍａｂ−Ｄｐｄ−１１−７Ｂ６−ＩＦ４−ＩＨＩ　１として命名する（実施例５ 参照）。

この抗体試薬は、上記ハイプリドーマ細胞系から作られ、そして、Ｎ−Ｐｙｄ　 Ｍａｂｓのために先に記載した同一の一般的手順により保存される。

Ｎ−Ｄｐｄ　、　Ｎ−Ｐｙｄ　、及び他の尿中ピリジニウム架橋についての抗体 試薬の相対的特異性は、先に記載したようなアプローチ（セクション８．１）に より測定されることができるが、付着Ｎ−Ｄｐｄをもつ固相支持体を使用する。

実施例１０中に大要を示す手順に従って、Ｎ−Ｄｐｄ　、　Ｎ−Ｐｙｄ　、　Ｄ ｐｄ−ペプチド（ＭＷ＞１．０００）、及びアミノ酸混合物（一般的な２０アミ ノ酸のそれぞれ１５０　μＭ）の、細胞系Ｍａｂ−Ｄｐｄ−ＩＩ−７８６−ＩＦ ４−ＩＨＩＩからのモノクロナール抗体への結合のレベルを、調査した。それぞ れのサンプルの見かけのＤｐｄ濃度を、精製Ｎ−Ｄｐｄを使用して確立された標 準曲線を使用して測定した。それぞれのサンプルのパーセント反応性を、全Ｈ− Ｄｐｄについて）ＩＰＬｃにより測定されたサンプル中の全Ｄｐｄ架橋濃度（１ ００倍）に対する、又はＮ−Ｐｙｄサンプルの場合における全ｏ−ｐｙｄについ てのＨＰＬＣにより測定されるような全Ｐｙｄ−架橋濃度（１００倍）に対する 、（上記のＮ−Ｄｐｄ標準曲線を使用して測定された）見かけのＮ−Ｄｐｄ濃度 の比として、計算した。結果を表２中に示す。ここで、Ｎ−Ｄｐｄとの反応性を １００χとして定義した。

表２ 表から分かるように、モノクロナール抗体試薬は、Ｎ−ｐｙｃｔに対してＮ−１ ）９ｄについて高く選択性であり、約１００：１を超える、生来の遊離のデオキ シピリジノリンに対する反応性と、生来の遊離のピリジノリンの対する反応性と の比を示す。また、この試薬は、（Ｄｐｄ含量について定量され）テストされた ピリジニウム−ペプチド形態を上回ってＮ−Ｄｐｄについて選択性であり、約３ ＝１を超える、そして好ましくは約５：ｌを超える、分子量において１．０００ ダルトンを上回るデオキシピリジノリン・ペプチドに対する反応性の比を示す。

さらに、この試薬は、テストされたアミノ酸混合物との最小の交差反応性（＜１ ％）を示す。

より一般的には、Ｄｐｄに特異的であるＭａｂ試薬は、上記の検定により測定さ れるとき、５：１を超える、好ましくは、１０：１を超える、より好ましくは、 ２５：１を超える、そして本ケースにおいては、Ｉｏｏ：ｌを超える、生来のデ オキシピリジノリン（Ｎ−Ｄｐｄ）及びＤｐｄ−ペプチド（ＭＷ＞１０００）に 対する反応性をもつ。

競合的アフィニティーをもっＮ−Ｐｙｄ及びＮ−ＤＩ）ｄに結合するモノクロナ ール抗体試薬を作るために、Ｎ−Ｐｙｄ　Ｍａｂｓ及びＮ−Ｄｐｄ　Ｍａｂｓを 得るだめの先の手順を使用することができる。但し、免疫原はＰｙｄ−ＫＬＨ又 はＤｐｄ−にＬ）Ｉであることができ、そして免疫反応性スクリーニングをＮ− Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄのための別個の検定により行う。免疫原としてＨ−Ｄｐｄ −ＫＬＨを使用して上記手順により得られ、そしてＮ−Ｄｐｄ及びＮ−Ｐｙｄに ついての高い抗体アフィニティーを与える１つのサブクローン化細胞系を、本明 細書中、Ｍａｂ　Ｐｙｄ／Ｄｐｄ−Ｖ−６Ｈ２−２Ｈ４−ＩＥ４として命名する （実施例６参照）。

この抗体試薬は、上記ハイブリドーマ細胞系から作られ、そしてＮ−Ｐｙｄ　Ｍ ａｂｓのために先に記載した同一の一般的手順により保存される。

Ｎ−Ｄｐｄ　、　Ｎ−Ｐｙｄ　、及び他の尿中ピリジニウム架橋についての抗体 試薬の相対的特異性は、先に記載したようなアプローチ（セクションＢ、ｌ及び ８．２）により測定されることができる。本ケースにおいては、Ｐｙｄ／Ｄｐｄ −Ｖ−６Ｈ２−２Ｈ４−ＩＥ４細胞系を使用して作られた抗体について、それぞ れのサンプルのパーセント反応性を、全）１−ＤｐｄについてＨＰＬＣにより測 定されたサンプル中の全Ｄｐｄ架橋濃度（１００倍）に対する、又はＮ−ＰＹｄ サンプルの場合における全Ｈ−ＰｙｄについてのＨＰＬＣにより測定された全Ｐ ｙｄ−架橋濃度（１００倍）に対する、（上記のＮ−Ｄｐｄ標準曲線を使用して 測定された）見かけのＮ−Ｄｌｌｄ　８度の比として、計算した。結果を表３中 に示す。ここで、Ｎ−Ｄｐｄとの反応性を１００％として定義した。

表から分かるように、このモノクロナール抗体試薬は、競合的アフィニティーを もってＮ−Ｄｐｄ及びＮ−Ｐｙｄを認識し、ｌ：ｌに近い交差反応性比をもつ。

また、この試薬は、テストされたピリジニウム−ペプチド形態（Ｐｙｄ及びＤｐ ｄペプチドの両方）を上回ってＮ−Ｄｐｄについて選択性であり、約３：１を超 える、そして本ケースにおいては、９：ｌを超える、分子量において１，０００ ダルトンを上回るピリジニウム・ペプチドに対する反応性の比を示す。さらに、 この試薬は、テストされたアミノ酸混合物との最小の交差反応性（５％）を示す 。

より一般的には、Ｐｙｄ／Ｄｐｄ−特異的であるＭａｂ試薬は、約２．１〜ｌ： ２間の生来の遊離ピリジノリン（Ｎ−Ｐｙｄ）及び生来の遊離デオキシピリジノ リン（Ｎ−Ｄｐｄ）に対する反応性をもつ。

８．４　アフィニティー・クロマトグラフィ一本発明に係る抗体試薬を、例えば 、プールした尿素をこのようなマトリックスに通過させることにより、コラーゲ ン組織から得られた生来の遊離ピリジニウム架橋を結合させ、そして集めるため の、標準的なアフィニティー・クロマトグラフィー法に従って、アフィニティー ・クロマトグラフィー・マトリックス中で、使用することもできる。Ｎ−ＰＹｄ の単離のために、Ｎ−ｐｙａに特異的である抗体試薬をそのマトリックス中で使 用することができる。あるいは、Ｎ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄの両方の単離のため に、競合的アフィニティーにより両方に結合する抗体を使用する。得られた生来 の遊離の架橋を、適宜、実施例１及び２中に記載する方法により、さらに精製す ることができる。

Ｃ１ポリクロナール抗体 ポリクロナール抗体調製は、本分野において一般的に知られた免疫学的プロトコ ール、例えば、Ｈａｒｌｏｗ、　ｐｐ、　９３−１１５に従って、好適な唾乳類 被験体、例えば、ウサギ又はマウス中に免疫原を注射することを含む。典型的に は、ウサギは、アジュバント中の免疫原により皮下注射され、そしてブースター 免疫感作が２−３週間毎に皮下又は訪中注射により与えられ；マウスは、同様の スケジュールに従って腹膜内注射されることができる。血液を、例えば、それぞ れの免疫感作注射の１−２週間後に、間隔をおいて採取する。抗血清を、標準的 な免疫沈降方法（Ｈａｒｌｏｗ、　ｐｐ、　４２３−４７０）に従って、Ｎ−Ｐ Ｙｄ又はＮ−Ｄｐｄに関する抗体形成を測定するために、滴定することができる 。

ウサギにおけるポリクロナール抗体のｌ産生方法の詳細を、実施例１９中に与え る。

ポリクロナール抗血清についての結合アフィニティ一定数は、公知の方法により （例えば、免疫沈降又はＥＬＩＳＡ検定を使用した５ｃａｔｃｈａｒｄ分析によ り；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｓｅｇｅｌ参照）決定されることができ、そして選択 されたピリジニウム種に対して特異的である抗血清中の抗体についての平均結合 アフィニティ一定数を表す。ウサギ■１−８がら得られたポリクロナール抗体は 、５ｃａｔｃｈａｒｄ分析により測定されるように、約１　ｘ　１０’のＮ−Ｐ ｙｄについての結合定数をもつ。

選択されたピリジニウム種及び他のピリジニウム架橋についての抗体試薬の相対 的な結合特異性を、先にセクションＢに記載され、そして実施例１０中に詳説す るような競合的結合検定により測定することができる。表３．５は、ウサギＶｉ ８から得られた抗−Ｐｙｄ抗血清の相対的結合特異性を示しており、ここで、Ｎ −Ｐｙｄとの反応性を１００％として定義した。

表から分かるように、Ｎ−ｐｙａに特異的であり、Ｎ−Ｄｐｄとの１０％未満の 交差反応性を、Ｐｙｄ−ペプチド（ＭＷ＞１０００）との５％未満の交差反応性 を、そしてアミノ酸混合物との中程度（〜１２％）の交差反応性を示す。本発明 の１つの態様に従えば、ポリクロナール抗体試薬は、先の抗原−競合検定により 測定されるような、３：ｌを超える、そして好ましくは約５＝１を超える、選択 された生来の遊離のピリジニウム種（Ｎ−Ｐｙｄ、　Ｎ−Ｄｐｄ　、又は両方） 及び分子量においてｉ、　ｏｏｏダルトンを上回る尿中ピリジニウム・ペプチド に対する反応性をもつ。

ＩＩ＋、イムノアッセイ・キット 他の態様において、本発明は、ヒト被験者におけるコラーゲン分解レベルの検定 における使用のための診断キットを含む。このキットは、（ａ）生来の遊離のピ リジノリン及び生来の遊離のデオキシピリジノリンから成る群から選ばれたピリ ジニウム架橋と免疫特異的に反応することができ、約３；ｌを超える、好ましく は約５：１を超える、選択されたピリジニウム架橋に対する反応性と、分子量に おｐｓて１．０００ダルトンを上回る尿中ピリジニウム・ペプチドに対する反応 性との比をもつ、抗体試薬、及び（ｂ）その抗体試薬とその遊離のピリジニウム 架橋との反応により形成された免疫複合体の量を検出するための検出手段、を含 む。好ましい態様においては、この検出手段は、比色定量シグナル、すなわち、 分光光度計により測定されることができるシグナルを作るために有効なものであ る。

１つの一般的な態様においては、このキットは、その抗体試薬と免疫反応性であ るサンプル中の生来の遊離のピリジニウム架橋の量に比例してその検出試薬中の リポータ−基に結合するのに有効な表面付着結合性分子をもつ固相支持体を含む 。

説明の目的のために、サンプル中のＮ−ＰＹｄを測定するための、このようなキ ットの特定の態様を、図ＩＡ−１ｃ中に（１０）において示す。

キット内の固相支持体（１２）は、結合剤が吸着され又は化学的に付着されるこ とかできる１表面をもつ。化学的に誘導体化されることができる基、又はタンパ ク質吸着において有効な表面をもつ様々なガラス及びポリマー樹脂支持体か利用 できる。１つの好ましい態様においては、このキットは、マイクロタイター・プ レート内の９６ウエルを提供し、ここでは、そのウェル表面は、このキ・ソトに おける固相支持体表面を形成する。

キット（１０）における結合剤は、Ｎ−Ｐｙｄであり、図中、例えば、（１６） においてＰｙｄ（Ｎ）分子により示される。この結合剤は、固相に、本ケースに おいては、９６ウエル・マイクロタイター・プレート内のそおれぞれのウェルに 、卵白アルブミン−ビオチン複合体、例えば、ＩＫＩＡ中複合体（１８）をその ツエル表面に最初に吸着させ、次にＮ−Ｐｙｄ−ストレプトアビジン複合体、例 えば、複合体（２０）をその吸着したビオチンへの付着させることにより、付着 される。あるいは、卵白アルブミン−ビオチン複合体の吸着を省略することがで き、そしてＮ−Ｐｙｄ−ストレプトアビジンをその固体支持体に直接に結合させ ることができる。Ｎ−Ｐｙｄコート・マイクロタイ、ター・プレートを作る方法 を、実施例８及び９中に詳説する。

このキット内の抗体試薬を図ＩＢ及びＩＣ中（２２）において示し、これは、先 のセクション中に記載したモノクロナール抗体を含む。図ＩＢ中に示されるよう に、サンプル中のピリジニウム架橋、例えば、（２６）において示されるＮ−Ｐ ｙｄ架橋は、その抗体試薬との結合について表面結合Ｎ−ＰＹｄと競合する。サ ンプル架橋との抗体試薬の反応により形成された免疫複合体を、この図中で（２ ８）において示す。

このキット内の検出試薬は、図ＩＣ中（２４）において示されたリポータ−標識 第二抗体であり、これは、固体支持体に付着された５−ｐｙｄにそれ自体か結合 する抗体試薬に結合するのに有効である。リポータ−標識抗体、例えば、酵素標 識抗体は、商業的に入手可能であり又は様々なリポータ一部分について容易に構 築される（Ｈａｒｌｏｗ、　ｐｐ。

３１９−３５８）。酵素標識抗体内の１つの好ましい酵素は、アルカリ性ホスフ ァターゼであり、これは、ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質と反応し、４０ ５ｎｍにおける強い吸収をもつ着色生成物を作ることができる。

リポータ−標識第二抗体は、このキット内のモノクロナール抗体試薬が免疫感作 マウスから得られる場合には、典型的には、抗−１ｇＧ抗体、例えば、抗−マウ スＩｇＧ抗体である。ここで、（先のようなＮ−Ｐｙｄと免疫反応性である）抗 体試薬は”リポータ−標識性“である。なぜなら、その抗体試薬がそのリポータ −標識第二抗体との反応により標識されるようになるからである。リポータ−標 識性抗体試薬の他の例は、検出目的のためのリポータ−標識されたストレブ　′ トアビジン又はビオチン標識されたパートナ−と反応することができるビオチン −又はストレプトアビジン−標識抗体を含む。

他の態様においては、この検出試薬は、リポータ−１例えば、酵素により標識さ れた、抗−Ｐｙｄ抗体試薬それ自体であることができる。

このキットにおける検出手段は、リポータ−の検出に必要な必要基質をも含むこ とができる。

′　固相支持体をもつキットの他の態様においては、この支持体に付着された結 合剤（結合分子）は、セクションＩＩ中に記載した抗体である。この抗体は、標 準的な方法に従って、例えば、化学的誘導体化又はプロティンＡ又は抗−１ｇＧ 抗体、によるその抗体のアフィニティー結合を含む様々な公知の方法によりその 固体支持体に付着されることができる。この態様においては、このキットは、さ らにその支持体上の抗体試薬に結合するためにそのサンプル中のＮ−ｐｙｄと競 合するのに有効なピリジノリン試薬を含む。検出目的のために、このピリジノリ ン試薬は、ピリジノリンに共有結合したリポータ−標識を含むことができる（す なわち、その試薬は、リポータ−標識されたピリジノリンであることができる。

）。あるいは、このピリジノリン試薬は、リポータ−標識性であることができ、 ここで、このピリジノリン試薬は、例えば、対応するリポータ−標識されたスト レプトアビジン又はビオチン分子による認識のために、ビオチン又はストレプト アビジンのような剤に結合されたＰｙｄを含むことができる。

他の特定の態様においては、本キットは、ＥＭＩＴ遠心分離（酵素増加イムノア ッセイ技術（ｅｎｚｙｍｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　 ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、図７Ａ−７Ｃ）を使用する。このアプローチにおいては 、サンプル分析物は、その標識酵素への抗体の結合がその酵素の触媒活性におけ る減少を導くような条件下で、分析物−特異的抗体への結合についてその分析物 標識酵素と競合する。これ故、その酵素の観察された触媒活性は、そのサンプル 中の分析物のレベルに比例し、分析物のレベルが高ければ、より高い酵素活性を 生じさせる。

図７Ａ−７Ｂを参照すれば、キット（３０）は、酵素（３４）及び１以上のピリ ジニウム（すなわち、遊離のピリジノリン又は遊離のデオキシピリジノリン）標 識（３６）から形成されたあピリジニウム標識酵素（３２）を含む。図中に示し た態様においては１．ピリジニウム標識（３６）は、遊離のピリジノリンである 。酵素（３４）は、好ましくは、分光光度計により測定されることができる検出 可能な生成物の形成を触媒することができる。本キットにおける使用に好適であ る例示的な酵素は、リューコノストック・メセンテロイド（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ ｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）からのグルコース−６−ホスフェート・デ ヒドロゲナーゼ（０６ＰＤＨ）である。

また、ピリジニウム標識（３６）及び分析物ピリジニウム種（４０）と免疫特異 的に反応することができるピリジニウム特異的抗体（３８）も含まれる。図７Ａ −７Ｃ中に示す態様においては、標識（３６）及び分析物ピリジニウム種（４０ ）は、遊離のピリジノリンである。

酵素（３４）と標識（３６）との間の結合は、直接的な結合又は本分野において 公知の様々なカップリング剤の使用による間接的な結合を介して存在することが できる（例えば、Ｗｏｎｇ、　１９９１）。例えば、好ましい態様においては、 カルボジイミド試薬の存在中ピリジニウム標識（３６）（例えば、ピリジノリン ）と酵素（３４）との反応は、酵素（３４）内のアミノ基又はカルボン酸基と標 識（３６）内のカルボン酸基又はアミノ基との直接カップリングを導く。このよ うな直接結合を形成するための反応条件を、実施例１５中に提供する。あるいは 、標識（３６）、酵素（３４）、又は両方が、その標識とその酵素との間の選択 された長に記載する手順において、ピリジノリンは、カップリング剤、スルホ− ＳＭＣＣ（以下、ＳＭＣＣという）と反応し、マレイミド含有ピリジノリン付加 物を形成する。次にこの付加物は、酵素（３４）の表面上のアミノ基又はスルフ ヒドリル基と反応し、標識酵素（３２）を形成することができる。実施例１６中 に説明するように、酵素は、例えば、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオア セテート（ＳＡＴＡ）により誘導体化され、このピリジノリン付加物と反応性で ある追加の基を導入することができる。カップリング剤５ＰＤＰを使用した類似 のアプローチを実施例１７中に記載する。

標識酵素（３２）の望ましい特性は、（１）その標識酵素が非標識酵素の活性に 関して触媒活性の実質的な量（すなわち、約５％を超える）を保持し、そして（ ２）ピリジニウム標識（３６）へのピリジニウム特異的抗体の結合か標識酵素（ ３２）の活性において検出可能な減少をもたらす、ということである。

したがって、標識酵素を調製するための反応は、その酵素内の活性部位残基の標 識により活性損失を最小化するために活性部位リガンド（例えば、基質又は基質 アナログ）の存在中で行われることかできる。さらに、標識（３６）により標識 されるべき酵素表面基のタイプは、本分野において知られるような、カップリン グ剤及び反応条件の好適な選択により選ばれることができる（Ｗｏｎｇ、　１９ ９１）。

本キットにおける使用に好適である標識酵素の調製においては、幾つかの標識さ れた酵素の候補は、様々なカップリング試薬及びピリジニウム標識：酵素比のあ るレンジを使用して調製されなければならない。ピリジニウム標識　酵素の高い 比は、（その部位における抗体の結合が触媒活性を減少させるであろうように） その活性部位の近くの残基を標識する見込みを増加させるけれとも、このような 高い比は、図８から分かるように、触媒活性のより大きな損失をも導くことがで きる。酵素活性に関してのピリジニウム標識：酵素の最適比は、典型的には、以 下に討議する追加の考慮に基づき決定される。

抗体（３８）は、先にセクション１１中に討議した一般的な方法器こより産生さ れたポリクロナール抗体又はモノクロナール抗体であることができる。典型的に は、生来の遊離にピリジノリン、デオキシピリジノリン、及び高分子量のピリジ ニウム・ペプチド形態に関しての抗体の特異性は、セクションＩＩ中に討議した ように決定され、そして実施例１Ｏ中に説明される。

先に述べたように、標識酵素（３２）への抗体の結合は、酵素の活性における検 出可能な減少を導く。好ましくは、過剰の抗体（３８）ｔ；！、少なくとも約１ ０％程、そしてより好ましくは、少なくとも約２０〜３０％程、標識酵素（３２ ）の触媒活性を減少させることができる。抗体調製物が触媒活性を減少させる能 力は、図９Ａ及び９Ｂ中に例示するアプローチにより評価されることができる。

図９Ａは、セクションＩ１．８．１中に討議したように調製したＰｙｄ−特異的 モノクロナール抗体（Ｖ−６Ｈ２）の増加濃度の関数としてのＰｙｄ−標識Ｇ６ ＰＤＨ（Ｇ６ＰＤＨの１分子当たり〜８分子のＨ−Ｐｙｄ）の活性を示している 。図から分かるように、酵素活性は、１００倍抗体希釈の存在中１００％からｌ θ倍抗体希釈の存在中６０％まで降下した（すなわち、４０％の減少）。図９Ｂ を参照すると、これは、Ｐｙｄ−特異的ポリクロナール抗体（Ｖｌ−８−１９） についてのデータを示すが、４００倍希釈から１０倍希釈への抗体濃度の増加は 、約８０％の活性損失を導いた。

キット（３０）は、抗体（３８）及び分析物（４０）の存在中、酵素（３２）の 触媒活性を測定するための検出試薬をも含むことができる。図７中に例示するキ ットにおいて、ここで、酵素（３２）はＧ６ＰＤＨであるが、この検出試薬は、 ３４０ｎｍにおいて強く吸収性であるニイコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ チド（ＮＡＤＨ）の還元形態を作るための、グルコース−６−ホスフェート及び ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ”　）の酸化形態を含む。

好ましい態様においては、そのキットが多ウェルのマイクロタイター・プレート を提供する場合、酵素（３２）の触媒活性は、時間の関数として吸光度を測定す ることができるマイクロプレート・リーダーを使用して測定される。

例示的なＥＭＩＴ−ベース検定キットの使用を実施例１８中に詳説する。

要約すれば。５０μＬアリコツトのピリジノリン標準又は希釈床サンプルをマイ クロタイター・プレートのそれぞれのウェルに添加し、その後、１００μＬの好 適に希釈した抗体を添加する。そのプレートを選択された時間（例えば、２分間 ）にわたり室温においてインキュベートした後、１００μｍの希釈ＥＤＣ−結合 ビリジノリンーＧ６ＰＤＨ結合体（８Ｐｙｄ／Ｇ６ＰＤ）１分子）を、それぞれ のウェルに添加し、その後室温において（例えば、約５分間）インキュベートす る。最後のインキュベーション期間の後、グルコース−６−ホスフェート及びＮ ＡＤ　”を含む６０μしの基質溶液をそれぞれのウェルに添加し、モしてＧ６Ｐ ＤＨ活性をマイクロプレート・リーダーを使用して３４０ｎｍにおいて測定する 。様々なＰｙｄ標準により測定された活性を、尿サンプル中のＰＹｄのレベルを 測定するために使用されることができるＰｙｄ換算曲線（例えば、図１０参照） を構築するために使用する。サンプル、抗体試薬、及び酵素が一緒に添加される オーダーが実施例１８において使用されるものと異なることができるということ が理解されよう。

先のキットをＮ−Ｐｙｄの検定について説明したけれども、類似の処方か、その キットがＮ−Ｄｐｄ特異的抗体試薬を使用したＮ−Ｄｐｄの測定のためのもの又 は競合性アフィニティーをもってＮ−ＰＹｄ及びＮ−Ｄｐｄに結合する抗体試薬 を使用したＮ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄの合計の測定のためのものである場合に、 使用されることができることが理解されよう。

さらに、本発明に係るキットが放射トレーサー、結合酵素、蛍光性、及び化学発 光性に基づく処方を含む、多数の他の同種及び異種検定処方に改良されることが できるということが理解されよう。

ＩＶ、イムノアッセイ法 本発明に係るイムノアッセイ法は、ヒト被験者における骨コラーゲン分解活性の 検定方法を提供する。本法は、先のセクションＩＩ中に記載された抗体試薬と上 記被験者からの尿サンプルとを反応させ、その抗体とそのサンプル中の生来の遊 離のピリジノリンとの間に免疫複合体を形成させ、そして形成された免疫複合体 の量を計測することを含む。

好ましくは、セクション量中にさらに討議するように、尿サンプルを、そのサン プルをその抗体試薬と反応させる前に、（例えば、濾過を介して）ニトロセルロ ース・フィルター又は膜と接触させ、Ｎ−Ｐｙｄの計測を妨害することができる サンプル中の物質のレベルを減少させる。

先のセクションＩＩＩ中に示すように、尿サンプルと抗体試薬との反応を、様々 な配置を使用した固相方式において、又は同種の検定方式において、行うことが できる。例示的な目的のために、このイムノアッセイ法を図ＩＡ−ＩＣ中に示す ようなものと類似した固相支持体方式を含む検定方式を参照しながら以下に記載 する。

本法の例示的な態様においては、尿サンプルの既知の容量、典型的には１０−１ ００μｍが、Ｎ−ｐｙａ−コートされた固体支持体、例えば、マイクロタイター ・プレート内のウェルに添加し、その後、既知希釈における抗体試薬の既知容量 、典型的には５０−２００μｌを添加する。

固体支持体表面上の混合物を次に、好ましくは、抗体、サンプル・ピリジニウム 架橋、及び表面結合Ｐｙｄの間の平衡を達成するのに有効な条件下で、インキュ ベートする。実施例８中に詳説する方法においては、このインキュベーションを ２−８　’Ｃにおいて一夜行う。

インキ、ベーション後、固体支持体を数回洗浄し、その支持体に非特異的に結合 した抗体を除去し、そして次に支持体結合抗体に特異的に結合するのに有効なリ ボ−ター−標識抗−１ｇＧ抗体等とインキュベートする。便利には、マウスを使 用して得られたモノクロナール抗体については、リボ−ター−標識抗体は、アル カリ性ホスファターゼに結合されたヤギ抗−マウスＩｇＧである。短いインキュ ベーション時間の後、支持体を再び洗浄し、非特異的に結合した材料を除去し、 そしてその支持体に結合した酵素のレベルを、酵素基質の添加により、変換され た基質の分光光度計測定により、測定する。

Ｎ−Ｐｙｄの測定のための典Ｖ的な検定においては、Ｎ−ｐｙｄの増加濃度を含 むＮ−Ｐｙｄ標準を、Ｎ−ＰＹｄ濃度の標準曲線を作成する目的をもって、ウェ ルの幾つかに２連で添加する。次に４０までのサンプルを２連で残りのウェルに 添加し、そして次にそのウェルを先のように検定する。標準曲線をＮ−ＰＹｄの 尿中濃度を測定するために使用する。

測定された濃度を、好ましくは、尿中濃度及び体質量中の変化についてそのサン プルを標準化するために、Ｎ−Ｐｙｄ／クレアチニンの比として表す。尿中クレ アチニン濃度は、標準的な方法、例えば、アルカリ性ビクレートとの反応に基づ くものにより、検定されることかできる（Ｃｏｏｋ、　１９７５）。

尿中のＮ−Ｐｙｄを測定するための検定を、先に記載したように行うが、そのサ ンプル中のＮ−Ｄｐｄの濃度を測定するためのＮ−Ｄｐｄ　ｔｉｌｔ準曲線音曲 線する。本検定方法か競合性アフィニティーをもってＮ−Ｐｙｄ及びＮ−ｏｐｄ に結合する抗体試薬によりＮ−ＰｙｄとＮ−Ｄｐｄとの合計を測定する場合、一 旦、Ｎ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄについての抗体試薬の相対的アフィニティーが確 立されれば、Ｎ−Ｐｙｄ又はＮ−Ｄｐｄのいずれか１つに基く標準曲線がその方 法において十分なものであることが理解されよう。

実施例８は、先のセクションＩ１．８．１中に記載されたＰｙｄ　ＸＸＶ−３Ｇ ６−３Ｂ１１−１ＡＩＯ細胞により産生されたＮ−ｐｙａに特異的なモノクロナ ール抗体を使用して本発明に従って尿中ピリジニウム・レベルを検定するための 典型的な手順を説明している。この検定は。２つの９６ウエル・マイクロタイタ ー・プレート内で行い、それぞれのプレート内の１２ウエルを６のＮ−ＰＹｄ標 準の２連サンプルのために使用し、そしてそれぞれのプレート内の４４ウエルを 閉経後女性からの２２の２連尿サンプルのために使用する。上記６のＮ−ｐｙｃ ｉ標準から作成されたＮ−Ｐｙｄについての標準曲線を、それぞれの未知のサン プルについて、その検定抗体と免疫反応性であるサンプルのピリジニウム架橋の （ｎＭにおける）ａ度を計算するために使用した。先の表１からのデータは、測 定されたピリジニウム濃度が、Ｎ−Ｄｐｄからのほんの僅かな寄与を伴って、そ のサンプル中のＮ−ＰＹｄをほとんど完全に原因とすることを示している。

上記４４サンプルからの測定されたピリジニウム架橋濃度を、ＨＰＬＣにより測 定された全ｏ−ｐｙｃｉ濃度に対してプロットし、図２中に示す散乱プロットを 与えた。この図中の最適適合回帰線は、等式ｙ＝−１０，４０７＋　０．４０３ １０ｘにより与えられる。これ故、この検定おいて測定されたピリジニウム架橋 濃度は、約０．３−０．５間の勾配、特にこのデータのセットにおいては、０． ４０３の勾配を伴う線形関係により、サンプル中の全加水分解ピリジノリンの濃 度に関係する。測定されたピリジニウム架橋濃度と金Ｈ−Ｐｙｄとの間の線形関 係、及びその２つの間の高い相関（ｒ＝０．９８２）は、測定されたピリジニウ ム架橋レベルからその検定における全ｐｙａ　、値の正確な測定を可能にする。

本検定において測定されたＮ−Ｐ）ｌｄレベルが、分解が生じるときコラーゲン 誘導架橋を生成する組織の代謝状態の決定のだめの係数を提供するために使用さ れるとかできるということが理解されよう。

先に討議したように、様々な異常又は病因学的骨代謝症状は、ヒト尿サンプル中 のＮ−Ｐｙｄ及び全Ｐｙｄの両方における変化により、特徴付けられる。さらに 、Ｎ−Ｐｙｄにおける変化は、同様に、Ｎ−Ｄｐｄにおける変化の良好な尺度を 提供する。この後者の点は、以下の表４中のデータにより説明される。この表は 、様々な尿サンプル中の精製されたＮ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄ架橋からＨＰＬＣ により測定された、Ｎ−ＰＶｄ及びＮ−Ｄｐｄのレベルを示している。

これらの結果は、結合組織の過剰な破壊を特徴とする疾患を患うていると知られ た患者における遊離架橋の劇的に上昇したレベルを示している。

表５は、様々なの患者群における加水分解後に測定された反応性の全架橋のパー センテージとしてのＮ−ＰＹｄ及びＮ−Ｄｐｄの割合を示している。

表５ 表５中に見られるように、（全Ｐｙｄのパーセンテージとしての）Ｎ−ｐｙｄ及 び（全Ｄｐｄのパーセンテージとしての）Ｎ−Ｄｐｄのパーセンテージは、対照 と比べたとき異常症状をもつ患者において相対的に変化がなく、尿中で測定され たＮ−Ｐｙｄレベルは、その尿の加水分解後に測定された全ｏ−ｐｙａレベルが 表す（ｒｅｆｌｅｃｔ）のとコラーゲン分解における同一の増加を表し；そして 同様に、尿中で測定されたＮ−Ｄｐｄレベルは、全Ｈ−Ｐｙｄレベルが表すのと コラーゲン分解における同一の増加を表す。

■、　尿サンプルの前−濾過 他の態様においては、本発明は、尿中分析物の定量のための検定を含む。この検 定においては、尿サンプルを、分析物が通過するのを許容しながら、抗体に非特 異的に結合する物質を除去するのに有効である膜を通して濾過する。濾過された サンプルを、そのサンプル中の分析物の量に比例してその固体支持体にその抗体 を結合させるのに有効な条件下で、その分析物との抗原−抗体複合体を形成さ本 性は、尿サンプル中に変化量において存在する物質がイムノアッセイの感度、精 度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）　、及び正確さくａｃｃｕｒａｃｙ）を妨害すること ができるという発見に基く。妨害物質（単数又は複数）は、個体から個体まで変 化し、そして同一の個体から得られた異なるサンプルにおいて変化することもで きる。

本発明に従えば、妨害物質（単数又は複数）は、（ｉ）選択された閾量を下回る サンプル中の妨害物質（単数又は複数）のレベルを減少させるために適切である 結合能力、及び（１１）問題の分析物についての低いアフィニティー、すなわち 、サンプル処理後の分析物の濃度がサンプル処理前と本質的に同じであること、 を特徴とする分離媒体（例えば、フィルター膜）と尿サンプルとを接触させるこ とにより、除去されることができる。この分離媒体のための他の望ましい特徴は 、操作の迅速性及び小さな保持容量を含む。

分離媒体として使用することができる材料は、その分析物の性質に従って変化し 、そしてニトロセルロース−ベース材料、疎水性／高タンパク質−結合材料、及 び帯電親水性材料を含む。この媒体の形態（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）は、 様々な形態であってストリップ、ビーズ、カートリッジ、フィルター・ディスク 、又は例えば、スピン濾過装置含むものを呈することができる。妨害物質の除去 における分離媒体の効力は、以下に記載する方法により評価されることができる 。

１つの好ましい態様においては、実施例＋３−１４に説明するように、この分離 媒体は、速いサンプルの通過を提供するスピン濾過装置として形状化される。あ るいは、この分離媒体は、結合するための選択された時間にわたりサンプル中に 置かれ、そしてこれにより、そのサンプルからその妨害物質を除去されることが できる。本発明の支援において行われた研究は、その分離媒体が膜の形態を呈す る場合、小さな孔サイズ（例えば、約０．４５μｍ未満、及び好ましくは約０． １　μｍ未満）が、その妨害物質についての膜の結合能力を増加させることかで きるということを、示唆する。

上記分離媒体及びその下でその分離媒体が使用される条件は、検定される特定の 分析物にあつらえられる。一般的には、最初に、その分析物についての低いアフ ィニティー又はその妨害物質（単数又は複数）についての高いアフィニティーの いずれかに基き候補の分離材料をスクリーンすることが存用である。

分析物の特定の分離媒体への結合は、分析物の既知レベルを含む１以上の標準的 な溶液を使用して評価されることができる。好ましくは、川原溶液を、上記妨害 物質（単数又は複数）の効果を回避するために使用する。上記の標準的な溶液を 、上記の分離媒体と接触させ（例えば、濾過させ）、そしてその分析物を、いず れかの分析物がその分離媒体に結合されたかどうかを決定するために検定する。

他のアプローチにおいては、上記妨害物質（単数又は複数）を含む尿サンプルの 分析物−含量を、その妨害物質により影響されない分析方法（例えば、ＨＰＬＣ ）を使用して測定する。その分離媒体とそのサンプルとの接触後に測定された分 析物のレベルの変化の存在は、その媒体のさらなる特徴付けが保証されるという ことを示している。

特定の分離媒体による妨害物質（単数又は複数）の捕獲は、多数のアプローチに より評価されることができる。例えば、分析物を測定するために使用するイムノ アッセイは、その分析物の存在の有無にかかわらず、その妨害物質の存在を報告 する検定を提供するために修飾されることができる。図１２中に説明するように 、妨害物質は、分析物−特異的抗体の非存在中、マイクロタイター・プレートの 固体支持体にリボ−ター−標識抗−抗体の結合のレベルを測定する検定を使用し て検出されることかてきる。この固体支持体への抗−抗体のこのような非特異的 結合を引き起こす尿サンプルを、次に、そのサンプルにより引き起こされるこの ような非特異的結合を減少させ又は削除するための候補の分離媒体の有効性を評 価するために使用することができる。

一旦、妥当な分離媒体が同定されれば、その材料の組成及び結合能力を、その分 析物のイムノアッセイの要求に従って最適化することができる。

典梨的には、この分析物を競合形式において検定し、ここで、その尿サンプルを 、リボ−ター−標識競合分析物の存在中で分析物−特異的抗体試薬と反応させ： 抗体試薬と競合分析物との間に形成される免疫複合体の量は、その尿サンプル中 に存在する分析物の量に逆比例する。普通には、分析物−特異的抗体試薬又はリ ボ−ター−標識競合分析物のいずれかを、表面−付着結合分子として、固体支持 体上に固定化する。あるいは、サンドイッチ検定形式を使用する。

ここでは、分析物を結合させるための第一抗体を、固体支持体上に固定化し、そ してリポータ−により（例えば、酵素−標識抗一抗体）により標識付けされる又 はされることができる第二抗体を、その第一試薬に結合される分析物を検出する ために、使用する。

代表的なイムノアッセイにおける妨害物質の効果を、表６中に示すデータにより 説明する。これらのデータは、分析物としてＮ−Ｐｙｄによる、図１中に説明す るイムノアッセイ形式を使用して得られる。

実施例１１中に詳説するように、ニトロセルロース・フィルターとの接触の前後 の６の尿サンプルのアリコツトを検定し、そしてそれぞれのサンプル中の分析物 の見かけのレベルを１セツトのＮ−ｐｙａ標準溶液から得られたデータとの比較 により測定した。

表６ 表６から分かるように、Ｎ−ＰＹｄの測定濃度は、ニトロセルロース・フィルタ ー・ディスクを介しての妨害物質の除去後約７−４５パーセント程増加し、これ は、サンプル間の妨害の程度における広いバラツキを示している。その上、濾過 サンプルにより得られた分析物の濃度は、ＨＰＬＣにより測定されるとき、サン プル中のＮ−Ｐｙｄ濃度と高く相関し、これは、妨害物質によるサンプルのバラ ツキが分離媒体との接触により大きく取り除かれることを示している。

実施例１２中に記載する研究において、妨害物質が、添加された抗−分析物抗体 の非存在中固体支持体への酵素標識抗体抗体の結合を仲介物質することが示され る。４４の尿サンプルを抗−分析物抗体の非存在中実施例８中に記載するＮ−Ｐ ｙｄのための検定形式を使用して評価した。テストされた４４サンプルの中で、 ８つが０．０２吸収ユニツトを上回る光学密度の読みを作り出し、これは、固体 支持体への酵素標識抗体の直接的な非−Ｐｙｄ−特異的結合を仲介する物質（単 数又は複数）の存在を示している。固体支持体への抗体のこの非分析物−特異的 結合は、他のリボ−ター−標識抗−抗体、例えば、ウサギ抗−マウス抗体によっ ても観察される。

表７は、スピン−フィルター装置内のニトロセルロース膜を通してのサンプルの 通過の前後の、実施例１２からの８のやっかいな尿サンプルにより得られた（実 施例１３）。この表は、先の濾過によらず、テストされた尿サンプルは、０．３ ６〜０．１０１の吸収ユニットのレンジにある光学密度の読みを生じさせたこと を示している。しかしながら、尿サンプルがニトロセルロース膜を通してのスピ ン−濾過されたとき、光学密度の読みは、そのサンプルのすべてについて０．０ ２吸収ユニツト未満に減少された。これ故、ニトロセルロース膜は、固体支持体 への抗−抗体の非特異的結合が実質的に減少されるような妨害物質を除去するた めに作動である。

このような非特異的結合の発生が検定される特定の分析物に依存しないことか理 解されよう。それ故、本発明に従って、妨害物質（単数又は複数）を除去するた めの尿サンプルの濾過が、多種多様な分析物についてのイムノアッセイにおいて 使用されることができる。

表８及び９は、尿サンプルからの妨害物質（単数又は複数）の除去において有用 であることが見っがった３つの分離媒体の比較効果を説明している（実施例１４ ）。表８は、濾過前後の１６の尿サンプルにより得られた光学密度の読み（ＯＤ ）を示している。表から分かるように、濾過前のサンプルについての光学密度の 読みは、０．０−０．９０５吸収ユニツトのレンジにある（第二列）。しかしな がら、ＩｍｍｏｂｉＩｏｎ−ＣＤ（ＣＤ）及びＩｍｍｏｂｉ　Ｉｏｎ−３ＰＱ（ ＳＰＱ）フィルターを通してのサンプルのスピン−濾過は、二１−ロセルロース （ＮＣ）により得られた結果と同様に、ゼロまでそのサンプルの光学密度の読み を減少させた（３−５列参照）。

表９は、ニトロセルロース（Ｎｃ）、［ｍｍｏｂｉ　Ｉｏｎ−ＣＤ（ＣＤ）、及 びｉｍｍｏｂｉである。

Ｖ［、適用 先に述べたように、コラーゲン含有組織のピリジニウム架橋含量は、組織タイプ に従って変化する。Ｐｙｄ架橋は、軟骨、骨、椎間円板、靭帯、及び大動脈内に 見られる。Ｄｐｄ架橋は、一般的に、Ｐｙｄ架橋よりも少なく、そして骨、歯、 靭帯、及び大動脈内に見られる。

組織ピリジニウム架橋中のＤｐｄの割合は、骨において最も高いようであり、そ れは、約３＝１〜４：ｌの間のＰｙｄ：Ｄｐｄ比をもつ。

増加した尿中Ｄｐｄ（及びＰｙｄ）レベルを特徴とし、そしてこれ故、骨分群の 上昇速度を併発する症状は、例えば、骨粗しよう症、パフエツト病、甲状腺機能 低下症、骨関節炎を含む。上昇Ｐｙｄ及びＤｐｄレベルを含む他の症状は、骨代 謝を変更し又は骨組織内で確立されるようになる様々な形態の代謝性癌を含む。

本発明は、Ｎ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄの上昇尿中レベルがヒトにおける増加した コラーゲン分解活性の信頼できる指標であるという発見に部分的に基く。Ｎ−ｐ ｙｔｉの又はＮ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄの両方の上昇レベルの測定は、増加した コラーゲン分解の一般的な指標として役立つ。本発明に従ったＤｐｄ−特異的抗 体を介しての尿中Ｎ−Ｄｐｄの測定は、骨の上昇分解についての相対的に特異的 なマーカーとして役立つ。

本発明は、先に記載した症状の管理に関連した抗再吸収療法の監視においても有 用である。

さらに、Ｎ−Ｐｙｄについての検定がＮ−Ｄｐｄについての検定との組み合わせ において使用される場合、本発明は、Ｄｐｄ架橋の割合が骨中に見られる割合よ りも（Ｐｙｄ架橋に対して）実質的に小さいコラーゲン−合作組織の破壊に関連 する顕著な症状に作用である。例えば、リウマチ様関節炎においては、Ｄｐｄ架 橋において相対的に低い結合組織の破壊に関連するようであり、尿中のＮ−ｐｙ ｄ体Ｎ−ＤｐｄＯ比は、増加した骨分群単独により観察される比に比べて上昇さ れる。

図３は、転移癌患者からの尿サンプル中の上昇Ｎ−Ｐｙｄレベルの検出のための 、図ＩＡ−ＩＣ中に示す検定形態におけるＰｙｄ−特異的抗体試薬の使用につい て説明している。この図の左の上に示した点の列は、健康な被験者の群内で測定 された（Ｐｙｄ／クレアチニンとして表された）Ｎ−Ｐｙｄのレベルである。こ の図の右の上に示した点の列は、転移癌をもつと診断された患者において測定さ れたＮ−Ｐｙｄレベルである。

このデータは上昇したＮ−ｐｙａレベルをもつ患者を現し、これは、その患者の 腫瘍学的症状における類似の骨関連を示している。

図４は、骨粗しよう症患者からの尿サンプル中の上昇Ｎ−ＰＹｄレベルを検出す るためのＰｙｄ−特異的モノクロナール抗体試薬の使用について説明している。

図の右の上の点の列（群１）は、２７の対照被験者（年齢７Ｏ−９０）の群内で 測定された（Ｐｙｄ／クレアチニン比として表された）Ｎ−Ｐｙｄレベルである 。点の中央の列は、明白又は疑いのある骨粗しよう症をもつ２０の患者（年齢７ ｌ−９９）において測定されたＮ−Ｐｙｄレベルである（群２）。左の上の点の 列（群３）は、重度の骨粗しよう症関連大腿頚部骨折をもつ３０の患者において 測定されたＮ−ＰＹｄレベルである。このデータは、年齢を合わせた対照群（群 １）に比較して、骨粗しよう症患者群の両方（２及び３）における尿中Ｎ−ｐｙ ａの上昇レベルを示している。

尿中Ｄｐｄの上昇レベルの検出のための、本発明に従うＤｐｄ−特異的モノクロ ナール抗体の使用を、図５中に説明する。この試験においては、Ｎ−Ｄｐｄの検 出に改良した、図ＩＡ−ＩＣ中に示す検定形態を使用した。この図中に左手内の 点は、健康な患者の群についての（Ｄｐｄ／クレアチニン比として表された）測 定Ｄｐｄレベルである。この図中の中央の列内に点は、診断された骨代謝失調を もつ患者を含む患者集団から測定されたＤｐｄレベルである。この口内の点の右 手の列は、Ｉｌ！瘍学的患者の群についての測定された［ｌｐｄレベルである。

このテストは、上昇されたＤｐｄレベルをもつ患者、すなわち、その腫瘍学的症 状かおそらく骨関連を含むような患者を、同定する。

図６は、骨粗しよう症のための治療下の女性におけるＤｐｄ−特異的モノクロナ ール抗体の使用について説明する。この研究においては、Ｄｐｄレベルは、治療 前（図中の白捧）及びエストロゲン療法の１年後（網棒）に測定した。患者の中 の７人において、Ｄｐｄレベルにおける測定可能な降下が治療伴い観察され、こ れは、この治療が骨再吸収における望ましい減少を作り出していることを示して いる。治療によりＤｐｄレベルが上昇した残る２つのケースにおける結果は、別 の治療が考慮されるべきであることを示すことができる。

これまでの記述から、本発明の目的がどのように適合するかを理解することがで きる。生来の遊離の架橋検定は、非−加水分解法サンプルをもって使用されるこ とができ、これにより、初期の酸加水分解段階の必要性を回避する。本検定は、 抗体試薬を使用し、そしてこれ故、本分野において公知の多数の便利且つ速い検 定形式に改良されることができる。その上、尿サンプル中の、生来のｐｙｄＳＤ ｐｄ、又は両方のレベルの評価を提供することにより、本発明は、様々なコラー ゲン−関連の病因学的状態を検出及びモニターするために使用されることができ る。

以下の実施例は、本発明に従う抗体試薬の製造方法及び検定法について説明する 。これらの実施例は、例示的であり、いがなる方法においても、本発明の範囲を 限定することを意図されない。

ｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来；　ε（２８０ｎｍ、　１％）　 ＝　１．１５ｍ１／＋Ｈ−ｃｍ；硫酸アンモニウム中の懸濁液）、グルコース− ６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）、及びニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド （ＮＡＤ）をＢｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入した。５，５ ゛−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、システィン・ヒドロクロ リド、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、スルホ スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキ シレート（ｓｕｌｆａ−３ＭＣＣ）、！−エチルー３−（３−ジメチルアミノ− プロピル）カルボジイミド−ＨＣＩ（ＥＤＣ）、及びＮ−スクシンイミジル３− （２−ビリジルージチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）をＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃ ｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。ｐ−ニトロフェニルホスフェート錠剤（各２ ０ｍｇ）　、Ｎ−エチル・マレイミド（ＮＥＭ）、及びジェタノールアミンをＳ 　ｉ　ｇｍａから購入した。透析チューブを５ｐｅｃｔｒａ　Ｐｏｒから購入し た。マイクロタイター・プレート（９６−ウェル）をＮｕｎｃ及びＣｏ５ｔａｒ 　Ｃａｒｐから購入した。マイクロタイター・プレート内の溶液の吸収値をＭｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐ、（Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ ）からのＶ−Ｍａχマイクロプレート・リーダーを使用して測定した。試薬の遅 い一滴ずつの添加を、ＬＫＢからのＭｉｃｒｏｐｅｒｐｌｅｘ螺動ポンプ＃２１ ３２を使用して行った。

Ａ、　モノクロナール抗体のための試薬能の自己免疫性ＭＲＬ／ＭｐＪ−１ｐｒ 　７ウスをＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＢａｒＨａｒｂｏｒ、　 Ｍａｉｎｅから購入したあ。

マウス非−分泌性Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞、並びにマウス単球 −マクロファージ細胞系Ｐ３８８Ｄ１（ＩＬ−１）及びＪ７７４Ａ、　１をＡｍ ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ ）、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄから購入した。

アジュバントＲｉｂｉ及びＲｉｂｉ（ＣＷＳ）をＲＩＢＩ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｉｎｃ、、　Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｍｏｎｔａｎａがら購入した。５ｏ％ＰＥＧ 　１５００（ポリエチレン・グリコール１５００、水中の５０％（Ｗ：Ｖ））を Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ。

Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、１ｎｄｉａｎａから購入した。ＨＡＴ及びＨＴをＳ ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉ ｓｓｏｕｒｉから購入した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａ ｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、ＮＣＴＣ−１０９、及びゲンタマイシンを Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋから購入した。

胎児クローン・ウシ血清はＨｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ 、、　Ｌｏｇａｎ、　Ｕｔａｈからのものであった。オキサロ酢酸及びインシュ リンは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙからのものであった。

Ｓ−ＤＭＥＭを以下のように配合した。ここで、パーセンテージは、最終培地中 の最終容量パーセンテージを示す：　ＤＭＥＭ（８０％）　、ＮＣＴＣ−１０９ （１０％）、胎児クローン・ウシ血清（１０％）、オキサロ酢酸（１ｍＭ）　、 Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）　、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びインシュ リン（１０μｇ／ｍｌ）。

ならし培地の調製のために、マウス単球細胞系Ｐ：３８８ＤＩ（ＩＬ−１）、又 は交換可能な状態で、細胞系Ｊ７７４Ａ、　ｌをＳ−ＤＭＥＭ培地中で培養し、 １週間に２回１．４に分けた。３日間毎に、組織培養上清を０．２ミクロン・フ ィルターを通して濾過し、そして次に４ｍＭ　Ｌ−グルタミンを補った。得られ た濃縮ならし培地をＳ−ＤＭＥＭのための２０！％補足物として使用し、ハイブ リドーマ細胞を生じさせた。

特にことわらないかぎり、ＰＢＳは、０．０１Ｍ燐酸塩及び１５０ｍＭ　ＮａＣ １を含むバッファー、ｐｔ（７として定義される。

ｐｙａ及びＤｐｄについてのＨＰＬＣ分析を本質的にＢｌａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、 　（１９８８）により記載されたように行った。簡単に言えば、尿サンプルをブ タノール及び氷酢酸により調整し、４：ｌ：１混合物（ブタノール：酢酸：サン プル、ｖ：ｖ：ｖ）を作り、そしてＣＦＩセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）カート リッジ上に適用し、その後、４：１１ブタノール：酢酸：水により洗浄した。遊 離の架橋（及びｇｌｙｃｏ−Ｐｙｄ）だけが保持された。この遊離の架橋を水に よりＣＦＩセルロースから溶出させた。溶出した材料を１ｍｌ／分において流さ れ、そして２９５１ｍの励起、３９５ｎｍの放射における蛍光をモニタリングさ れる水−アセトニトリル（１０分間にわたる３−１７％）グラジェントを使用し てＣＩ８逆相カラム（Ｒａｉｎｉｎ、　Ｃｌ３−８０−２００−Ｃ３）上で分析 した。移動相は、０．１％ＨＦＢＡを含んでいた。

全尿中架橋を１１０°ＣにおいてＨＣＩ中で１６時間尿サンプルを加水分解し、 その後、先のＣＦＩ処理及びＨＰＬＣ分析することにより測定した。

１１ＰＬｃ分離は、加水分解されたＰｙｄ及びＤｐｄ分画を産生じ、これから、 全Ｈ−Ｐｙｄ及び全Ｈ−Ｄｐｄを定量した。

ヒト尿を４０ｐｓｉの背圧を加えて３０００　Ｄ分子カット−オフ・フィルター （Ｆｉｌｔｏｎ　Ｃｏ、）を通して濾過した。次に濾液を凍結乾燥させ、そして ０．２Ｍ酢酸により元の容量のｌ／２０に再構築した。

次に濃縮法を０．２Ｍ酢酸により平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０２，６ ｘ　９５ｃｍカラム上に適用した。このカラム材料からの溶出液を先に記載した ように遊離のＰｙｄ及びＤｐｄについて分析した。遊離架橋含有画分を共にプー ルし、ｐＨ２，０に調整し、そしてＩ　ｘ　１８　ｃｍカチオン交換カラム（Ｌ ａｃａｒｔｅ　Ｃｏ、、　ＵＫ）上に適用した。

Ｇｌｙｃｏ−Ｐｙｄ　、　Ｎ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄをその後、０．１Ｍクエン 酸ナトリウムｐＨ４，２によりそのカラムから溶出させた。集めた画分を先によ うなＩＩＰＬｃ分析により架橋の存在について分析した。特定の架橋（ｇｌｙｃ 。

−ＰＳ・ｄ、Ｐｙｄ及びＤｐｄ）を含む画分を共にプールし、そして分析用２． ５Ｘ　１０　ｃｍ逆相Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）上に適用し、これをその後 ０．１％ＨＦＢＡを含むアセトニトリルの２−２０％グラジェントにより展開さ せた。

分離された画分（Ｎ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄ）を別々に集め、そして凍結乾燥に より濃縮した。この乾燥残渣を０．２Ｍ酢酸中で再構築し、そして４°Ｃにおい て保存した。最終材料の純度を重量計及び元素分析により測定した。

尿中架橋−ペプチドを、１０００　Ｄ分子量カット−オフ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒ ａ−Ｐａｒ）を使用してヒト尿の消費的透析により調製した。このペプチド画分 の全Ｐｙｄ架橋及び全Ｄｐｄ架橋含量を、６Ｎ　ＭＣＩにより１１０°Ｃにおい て１６時間ペプチド・サンプルを加水分解し、その後の全Ｈ−ＰＶｄ及び全Ｈ− ＤｐｄのＨＰＬＣ分析により、測定した。

Ｈ−ＰＹｄ及びＨ−Ｄｐｄの調製的な量を、Ｂｌａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ８８）により記載されているように加水分解された粉末ウシ又はヒツジの骨から 得た。

以下の手順は、生来の遊離のピリジノリン、生来の遊離のデオキシピリジノリン 、又は両方に対するモノクロナール又はポリクロナール抗体を得るための免疫原 かどのように調製されることができるかについて説明する。以下のＡ及びＢ中の 手順は、Ｐｙｄ−免疫原に関して記載されており；　Ｄｐｄ−免疫原は、ＰＹｄ Ｑ代わりのＤｐｄにより、同一のアプローチを使用して調製される。

Ａ、Ｐｙｄ−ＢＳＡ免疫原 ０、ＩＭＭＥＳ中の９ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び３．８ｍｇのｐ ｙｄ　、　ｐＨ５，０から成る３、１ｍｌの溶液に、８８ｍｇのＥＤＣを含む０ ．８８ｍ１の水溶液を添加した。室温において４時間反応させた混合物を次に燐 酸塩バッファー生理食塩水吐７．０（ＰＢＳ）に対して消費的に透析した。

ＵＶ及び蛍光測定は、１モルのアルブミン当たりに置換された５、８モルのピリ ジノリンを示した。

Ｂ、Ｐｙｄ−ＫＬＨ免疫原 ｐＨ５±０．５に調整した水中の乾燥Ｈ−Ｐｙｄ（６ｍｇ）ノ溶液（２００ｕ　 ］　）　ｌニー、ＰＢＳ中のＫｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔヘモシアニン（ＫＬ Ｈ）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液の２ｍｌを添加した。この混合物に、３０ｍｇの固体 １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ，Ｐ ｉｅｒｃｅ）を添加し、そして１０分間後、別の３０＋ＨのＥＤＣを添加し、そ してその反応を室温において４時間進行させた。次にこの反応混合物をＰＢＳに 対して消費的に透析し、その後、このＰｙｄ−ＫＬ）Ｉ免疫原を集め、そして保 存した。

実施例４ 抗−Ｐｙｄモノクロナール抗体の調製 Ａ、　免疫感作プロトコール 雌の生後５週間の自己免疫性ＭＲＬ／ＭｐＪ−１ｐｒマウスを以下のプロオドコ ールを使用して免疫感作させた： １静脈内 融合の日に、免疫感作マウスをＣＯｌにより殺し、そしてその膵臓をそのマウス から切除し、そして３７°Ｃに余熱した５ｍｌの血清不合ＤＭＥＭ培地を含む培 養皿内に入れた。膵臓に付着した脂肪組織の除去後、その膵臓を５ｍｌの血清不 含ＤＭＥＭ培地により洗浄した。次に、この膵臓を小片に切断し、これを、７ｍ ｌの血清不含ＤＭＥＭ培地を含む細胞ホモゲナイザー内に入れ、そしてその細胞 を均質化し、細胞懸濁液を作った。

Ｂ、　融合プロトコール 以下の段階を室温において行った。

上記の膵臓細胞懸濁液（血清不含ＤＭεＭ培地中の〜２　ｘ　１０”細胞）及び 対数期のＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３　ミエローマ細胞（血清不含ＤＭＥＭ培地中 の〜７　ｘ　１０７細胞）を、４００ｘｇにおいて１０分間独立して遠心分離し た。

得られた細胞ペレットを５０ｍＬ遠心分離管内の血清不合ＤＭＥＭ培地（１０ｍ ｌ）中に一緒に懸濁させ、そして次に、１０分間４０（ｂａｇにおいて遠心分離 した。この上澄液を完全に取り去り、そのその遠心分離管を叩きその細胞ペレッ トをほぐした。

細胞融合のために、５０％ＰＥＧ　１５００の溶液（４ｍｌ）を９０秒間にわた ありピペットにより穏やかに混合しながら上記の管に滴下した。次に、血清不含 ＤＭＥＭ（４ｍｌ）を１分間にわたり滴下した。Ｓ−ＤＭＥＭ（４０ｍｌ）を次 に穏やかに混合しながら２分間にわたり添加し、その後、その混合物をさらに２ ．５分間にわたりピペットにより混合した。得られた混合物を４００ｘｇにおい て１０分間遠心分離した。その上清の完全な除去後、その細胞を２０％Ｐ３８８ Ｄ１−ならしＳ−ＤＭＥＭ培地中のＨＡＴの３２０ｍ１中に懸濁させた。この細 胞懸濁液を１６の９６−ウェル培養プレート中白にプレートし、２００μｌ／ウ エル、そしてこのプレートを次に７％Ｃｏｔを含む雰囲気中で３７℃においてイ ンキュベートした。この細胞混合物を、３及び７日目に、１００μＩ／ウエルの 古い培地を取り出し、そして１５０１１１／ウエルのＨＡＴ培地（３日目）又は ＨＴ培地（７日目）のいずれかを添加することにより、飼養した。これらのウェ ルを融合の７〜ＩＯ日後（こスクリーンした。

首尾よい融合生成物を実施例８中に記載するようなＮ−Ｐｙｄイムノアッセイ形 式を使用して免疫反応性についてスクリーンした。Ｎ−ＰＹｄへの高いアフィニ ティー結合を示した細胞系を限界希釈法によりサブクローン化し、そしいさらに 、Ｎ−ｒ’ｙｔｉについての高い結合アフィニティーをもつ抗体の産生について スクリーンした。Ｎ−Ｐｙｄのついての高い抗体アフィニティーを与えたサブク ローン化細胞系の中の１つを、本明細書中、Ｍａｂ　Ｐｙｄ−ＸＸＶ−３６６− ３８１１−ＩＡＩＯト命名スル。

この細胞系により産生された抗体の特異性は先の表１中に示されている。

抗−Ｄｐｄモノクロナール抗体を、実施例３におけるように調製したＤｐｄ−Ｋ ｌ、１１免疫原を使用して、実施例４中に記載したて手順により調製した。マウ スの免疫感作手順は、実施例４におけるものと同じである。但し、Ｒｉｂｉ（Ｃ ＷＳ）をＲｉｂｉの代わりのアジュバントとして使用し、マウス当たり７５μｇ の免疫原を、１００μｇの代わりに第四免疫感作段階（融合から１８８日目にお いて使用した。

首尾よい融合生成物を実施例９中に記載するＮ−Ｄｐｄイムノアッセイ形式を使 用して免疫反応性についてスクリーンした。Ｎ−Ｄｐｄへの高いアフィニティー 結合を示した細胞系を限界希釈法によりサブクローン化し、そしいさらに、Ｎ− Ｄｐｄについての高い結合アフィニティーをもつ抗体の産生についてスクリー、 ンした。Ｎ−Ｄｐｄのついての高い抗体アフィニティーを与えたサブクローン化 細胞系の中の１つを、本明細書中、Ｍａｂ　Ｄｐｄ−１１−７Ｂ６−１Ｆ４−Ｉ ＨＩＩ　と命名する。この細胞系により産生された抗体の特異性は先の表２中に 示されている。

Ｎ−Ｐｙｄ及びＮ−Ｄｐｄの両方に特異的なモノクロナール抗体を、免疫原とし てＨ−Ｄｐｄ−ＫＬＨ（実施例３）を使用して、実施例５中の手順により調製し た。首尾よい融合生成物を実施例９中に記載するＮ−Ｄｐｄイムノアッセイ形式 を使用して免疫反応性に゛ついてスクリーンした。Ｎ−Ｄｐｄへの高いアフィニ ティー結合を示した細胞系を限界希釈法によりサブクローン化し、そしいさらに 、トｐｙａ及びＤｐｄの両方についての高い結合アフィニティーをもつ抗体の産 生についてスクリーンシタ。Ｎ−ｐｙａ及びＤｐｄの両方についての高い抗体ア フィニティーを与えたサブクローン化細胞系の中の１つを、本明細書中、Ｍａｂ 　Ｐｙｄ／Ｄｐｄ−Ｖ−６１（２−２８４−ＩＥ４と命名する。この細胞系によ り産生された抗体の特異性は先の表３中に示されている。

ストレプトアビジンへのＨ−Ｐｙｄの結合を、カップリング剤、ＳＭＣＣを介し て１（−Ｐｙｄにチオール化ストレプトアビジンをカップリングさせることによ り達成した。チオール化ストレプトアビジンを以下のようにＮ−スクシンイミジ ル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、　Ｐｉｅｒｃｅ）と 反応させることにより製造した。ＰＢＳ中の５ｍｇのストレプトアビジンの０． ７５ｍ１溶液に、２６０μｇの５ＰＤＰを含むジメチルホルムアミド２１μＬを 添加した。この混合物を室温において１時間反応に供し、そして次にＰＢＳに対 して透析した。５ＰＤＰ−標識ストレプトアビジンを１０ｍＭの最終濃度までジ チオトレイトールを添加することにより減少させた。室温において１時間のイン キュベーションの後、このチオール化ストレプトアビジンをＧ−２５カラム上で 精製した。

Ｈ−ｐｙｃｔ−ストレプトアビジンを作るために、ジメチルホルムアミド（４μ ｌ）中にスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１− カルボキシレート（ＳＭＣＣ，Ｐｉｅｒｃｅ）の１８０μｇを含む溶液を、１０ ０μｌのＰＢＳ中に０．５ｍｇのチオール化ストレプトアビジン及び５０μｇの ｏ−ｐｙａを含む溶液に添加した。この混合物を室温において３時間反応させ、 そして次にＰＢＳに対して透析した。得られたＰｙｄ−ストレプトアビジンの分 光光度計分析は、ストレプトアビジンの１当量当たりに結合した１〜２当量の間 のピリジノリンを示した。

Ｈ−Ｄｐｄ−ストレプトアビジンを上記と同一の手順によりにより調製した。但 し、Ｈ−ＤｐｄをＨ−ｐｙａの代わりに使用した。

ビオチン−標識卵白アルブミン及びＨ−Ｐｙｄ−ストレプトアビジン（実施例７ ）をそのマイクロプレート・コーティングにおいて使用した。

卵白アルブミンのビオチニル化を、４００マイクロリツターのジメチルホルムア ミド中のｌ　Ｏｍｇのビオチン−Ｘ−２，４−ジニトロフェノール−Ｘ−Ｌ−リ ジン、スクシンイミジル・エステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を１ ５０ｍｇの卵白アルブミンを含むＰＢＳの１０ｍ１溶液に添加することにより、 行った。この混合物を室温において２時間反応させ、その後０２５カラム・クロ マトグラフィーにかけた。分光光度計による分析は、１モルの卵白アルブミン当 たりに置換された２つのビオチンを示した。

９６−ウェル・マイクロタイター・プレート内のウェルを以下のようにＮ−ｐｙ ａによりコートした。それぞれのウェルに、ＰＢＳ中３．８μｇ／ｍｌにおいて ビオチン−卵白アルブミンの１５０マイクロリツターを添加し、その後２−８° Ｃにおいて一夜インキュベーションを行った。

このウェルをＰＢＳにより洗浄し、そして１ｍｇ／ｍｌにおいて２００μｌの卵 白アルブミンを添加することによりブロックし、そして室温において一夜インキ ュベーションを行った。次にそのウェルをＰＢＳにより２回洗浄した。ＰＢＳ中 １００μｇ／ｍｌにおいてＨ−ｐｙｄ−ストレプトアビジンを含む溶液の１５０ μｌをビオチン−卵白アルブミン・コート・マイクロプレートの各ウェルに添加 した。室温における１時間のインキュベーションの後、そのウェルをＰＢＳによ り２回洗浄した。残りの液体を３７°Ｃにおいて対流において一夜乾燥させるこ とによりそのウェルから除去した。

Ｂ、検定プロトコール Ｎ−Ｐｙｄ標準溶液及び尿サンプルを２連でテストした。この標準溶液は、検定 バッフｙ　−（ＰＢＳ中、０．０５％ＮａＮ　ｓ　、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２ ０．及び０．１％ＢＳＡ）中のＯｎＭ　、　２５ｎＭ、７５ｎＭ、　２５０ｎＭ 　、７５０ｎＭ　、及び３０００ｎＭのＮ−Ｐｙｄから成っていた。尿サンプル を、検定に先立って遠心分離（スピン濾過）によりニトロセルロース膜を通して 濾過した。

先に調製したマイクロタイター・プレートを使用して、２０μｌ／ウエルの標準 溶液をコートされたプレート内の９６ウエルの中の１２に２連で添加し、そして ４４尿サンプルの中のそれぞれの２０μｌ／ウエルを２つのマイクロタイター・ プレートのウェルに２連で添加した。

検定バッフｙ　（ＰＢＳ中、０．０５％ＮａＮ　２．０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２ ０、及びＯ９１％ＢＳＡ）中の１００μｌ／ウエルのＭＡｂ　３Ｇ６−３８１１ −ＩＡｌｏ（１：１００．０００希釈）を添加した。標準又はサンプル及びＭＡ ｂ混合物を４°Ｃにおいて一夜インキユベートした。１００μｌ／ウェルのヤギ 抗−マウスＩｇＧ　＋　Ｍ（Ｈ十し）−アルカリ性ホスファターゼ結合体（Ｐｉ ｅｒｃｅ、　Ｎｏ、　３１３３０．検定バッファー中ｉ　：　＋ｏｏｏ希釈）を そのプレートに添加し、そして室温において１時間インキュベートした。

それぞれのウェルに、１００μＬの酵素基質溶液（１ｍＭ　ＭｇＣ１２を含む、 １．０Ｍジェタノールアミン、ｐＨ９，８中の２ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニ ルホスフェ−ｔ−（Ｓｉｇｍａ））に添加した。室温において３０分間インキュ ベートした後、５０μｌの３．　ＯＮ　ＮａＯＨをそれぞれのウェルに添加し、 その酵素反応を停止させた。４０５ｎｍにおける光学密度を次にＶｍａｘリーダ ー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐ、）により測定した。

２連サンプルからの光学密度リーダー（４０５ｎｍ）を平均し、そしてＮ−Ｐｙ ｄ標準からの平均リーダーを、ＯＤ読み対Ｎ−Ｐｙｄ濃度の標準曲線を構築する ために使用した。この曲線から、それぞれの尿サンプル中の遊離のＮ−Ｐｙｄ架 橋濃度を測定した。クレアチニン濃度をアルカリ性ピクレート関連検定を使用し て測定した（Ｃｏｏｋ、　１９７５）。

同一の尿サンプルを、実施例２中に記載した）ＩＰＬｃ法により全Ｐｙｄについ て定量した。簡単に言えば、尿サンプルをＨＣＩ（６Ｎ）中で１１０°Ｃにおい て１６時間加水分解し、その後、ＣＦＩ前処理及び全ｏ−ｐｙｄについてのＨＰ ＬＣ分析を行った。

図２は、イムノアッセイ法（ｙ軸）により測定されたピリジニウム架橋（ｎＭに おける）対ＨＰＬＣにより測定された全Ｈ−ｐｙａの散乱ブロワ。

トを示す。このプロット中の線は、ＨＰＬＣの全Ｐｙｄ値の関数としてイムノア ッセイ値を相関させる最適線形回帰式である。

実施例９ 抗−Ｄｐｄモノクロナール抗体試薬を使用したイムノアッセイＡ、　Ｈ−Ｄｐｄ −コート・マイクロタイター・プレート９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのそれ ぞれのウェルに、Ｈ−Ｄｐｄ−ストレプトアビジン（ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍ ｌ）を含む１００μｍの溶液を添加した。４°Ｃにおいて一夜インキユベーショ ンした後、そのウェルを空にし、そして次に室温における少なくとも１時間又は ４°Ｃにおける一夜卵白アルプミン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ　１５０μｌ／ウエ ル）とインキュベーションによりブロックした。インキュベーション後、このプ レートをＰＢＳにより３回洗浄した。

Ｂ、　検定プロトコール Ｎ−Ｄｐｄ標準溶液及び尿サンプルを２連でテストした。この標準溶液は、検定 バッファ　（ＰＢＳ中、０．０５％ＮａＮ　２．０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０、 及び０．１％ＢＳＡ）中のＯｎＭ　、２５ｎＭ、　５０ｎＭＳ１００ｎＭ　、　 ２５０ｎＭ　、及び５００ｎＭのＮ−Ｄｐｄから成っていた。尿サンプルを、検 定に先立って遠心分離（スピン濾過）によりニトロセルロース膜を通して濾過し た。

サンプル（１０μｌ／ウエル）の添加後、１００μｌ／ウエルの７Ｂ６−ＩＦ４ −ＩＨ１１モノクロナール抗体（検定バッファーへの組織培養上清の１＝１６０ ０希釈、〜ＩＯｎｇ／ｍｌ抗体）を添加し、そしてその検定プレートを４°Ｃに おいて一夜インキユベートした。そのプレートを３００μｌ／ウエルの洗浄バッ ファーにより３回洗浄した後、１００μｌ／ウエルのヤギ抗−マウスＩｇＧ　＋ 　Ｍ（Ｈ＋Ｌ）−アルカリ性ホスファターゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｎｏ、　 ３１３３００検定バツフアー中１　：　１０００希釈）を添加し、そしてそのプ レートを室温において１時間インキュベートした。次にそのウェルを洗浄バッフ ァーにより３回洗浄した。

結合酵素を先に実施例におけるように検定した、それぞれの未知床サンプルにつ いてのＮ−Ｄｐｄ架橋濃度を標準曲線からの定量化により測定した。

Ｎ−Ｐｙｄ　、　Ｎ−Ｄｐｄ　、ピリジニウム−ペプチド（ＭＷ＞１０００）を 先に記載したように尿サンプルから単離した。このピリジニウム調製物のアリコ ツトを加水分解し、その画分中の架橋をＨ−Ｐｙｄ及びＨ−Ｄｐｄに変換させた 。Ｎ−Ｐｙｄ及びＨ−Ｐｙｄ調製物中のｐｙａの濃度、Ｎ−Ｄｐｄ及びＨ−Ｄｐ ｄ　ｌｌ製物中のＤｐｄの濃度、及びピリジニウム−調製物中のＤｐｄの濃度を 、実施例１におけるようにＨＰＬＣにより測定した。さらに、２゜の一般的アミ ノ酸の等モル混合物を含むアミノ酸溶液、ＰＢＳ中それぞれ１５０μＭを調製し た。

生来の架橋調製物及びアミノ酸混合物のアリコツト（５０μｌ）を先のように調 製したＰｙｄ−コート又はＤｐｄ−コート・マイクロタイター・プレートに２連 で添加し、そしてそれぞれのウェルを適宜実施例８又は９におけるようにピリジ ノリン又はデオキシピリジノリンについて検定した。２連サンプルからの光学密 度の読み（４０５ｎｍ）を平均し、そしてこれらの値から、それぞれのサンプル の見がけのＮ−Ｐｙｄ又はＮ−Ｄｐｄ濃度を精製Ｎ−Ｐｙｄ又はＮ−Ｄｐｄによ り確立された標準曲線を使用して測定した。それぞれのサンプルのパーセント反 応性を、全）１−Ｐｙｄについて、又は全Ｄｐｄ架橋濃度の場合においては全Ｈ −Ｄｐｄについて、ＨＰＬＣにより測定されたサンプル中の全Ｐｙｄ架橋濃度（ １００倍）に対する（標準曲線を使用した。実施例８及び９参照）見かけ濃度の 比として計算した。様々な特異性をもつ抗体により得られた結果を先の表１．２ 及び３中に与える。

２１８１．２１７６．２１５９．２１６７．２１６１、及び２１７２と命名され た６の尿サンプルについてテストした。それぞれのサンプルのアリコツト（４０ ０μｌ）を直径２５ｍｍの０．４５μｍ孔サイズのニトロセルロース・フィルタ ー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＡ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ） を通してシリンジ濾過し、そしてその濾液をチューブ内に集めた。濾過及び非濾 過サンプル材料並びにＮ−Ｐｙｄ標準のアリコツト（１０μｌ）を２連で実施例 ８におけるように調製した９６ウエル・マイクロタイター・プレートのウェルに 添加し、そしてそれぞれのサンプル中のＮ−Ｐｙｄの濃度をＮ−Ｐｙｄ−選択的 ポリクロナール抗体、及びアルカリ性ホスファターゼ−標識ヤギ抗−ウサギ抗体 を使用して、実施例８中に一般的に記載したように測定した。結果を表６中に示 す。

実施例１２ 尿サンプルにより仲介された非特異的結合の評価床サンプルを以下の手順により 妨害材料の存在についてテストした。バッファー、Ｎ−Ｐｙｄ標準、及び４４尿 サンプルのそれぞれのアリコツト（１０μｌ）を２連で２つの９６−ウェルのマ イクロタイター・プレートのウェルに入れた。実施例８中に記載した検定手順を 行った。

但し、抗−Ｎ−Ｐｙｄ抗体を検定バッファーにより又は希釈組織培養物により、 置換した。バッファー単独、希釈組織培養物、又はＮ−Ｐｙｄ標準が添加された ウェルは、ｏ、ｏｉｏ未満の光学密度の読みを与えた。

テストされた４４尿サンプルの中で、８が、０．０２吸収ユニツトを上回る読み を作り出した（表７）。

０．０２を上回る光学密度の読みを作り出した実施例１２からの８の尿ザンブル を、以下のようにスピン濾過に供した。それぞれのサンプルのアリコツト（２０ ０μｌ）を１．５ｍＬマイクロフユージ管内に懸濁させたニトロセルロース・フ ィルター・ユニット内に入れた（フィルター・ユニット及びマイクロタイージを 共に“フィルター・アセンブリー”　という。）　ｏ　（Ｌｉｄａ　Ｍａｎｕｆ ａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｃａｒｐ、　Ｋｅｎｏｓｈａ、　Ｗｌにより構築された）フ ィルター・ユニットは、その下部端において２層のニトロセルロース膜（０，１ μｍの孔サイズ）及び不織ポリエチレン支持体を含むポリプロピレンの円筒状の ハウジング（長さ４０ｍｍ　ｘ外径１０ｍｍ）を含んでいた。このニトロセルロ ース膜の有効濾過断面積は０．２ｃｍ２であった。次にサンプル合作フィルター ・アセンブリーを１５００　ｘ　ｇにおいて２分間遠心分離し、そのサンプルを そのフィルターを通して完全に通過させた。次に、そのサンプルを実施例８中に 記載したように処理したか、抗−Ｐｙｄ抗体の代わりに検定バッファーを使用し た。すへての８つの濾過されたサンプルの測定された光学密度は０．０２未満で あった（表７）。

１６尿サンプルのアリコント（２００μｌ）を、以下の膜の中の１つを含むスピ ン濾過アセンブリー内で遠心分離した二ニトロセルロース（Ｌｉｄａ　Ｍａｎｕ ｆ、　Ｃｏｒｐ、　ｋｏｎｏｓｈａ、　Ｗｌ）　、１ｍｍｏｂｉ１ｏｎ−ＣＤ（ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃａｒｐ、。

Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ、　ｃａｔａｌｏｇ　ｎｏ、　ＩｃＤＭ−０００００） 、及び１ｍｍｏｂｉ　Ｉｏｎ−ＰＳＱ（Ｍｉ　１１ｉｐｏｒｅ、　ｃａｔａｌｏ ｇ　ｎｏ、ＩｓεＱ−０００００）。ニトロセルロース含有フィルター・アセン ブリーを実施例１３中に記載したように遠心分離した。１ｍｍｏｂｉｌｏｎ含有 フィルター・アセンブリーをニトロセルロースを含むものと同様に遠心分離した 。但し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜は、２層よりもむしろ１層であり、０．１　μｍ の孔サイズをもっていた。

濾過及び非濾過床サンプルのアリコツト（１０μｌ）を２連で実施例８における ように調製した９６ウエルのマイクロタイター・プレートのウェルに添加した。

実施例８中に記載した検定手順を行った。但し、抗−Ｎ−Ｐｙｄ抗体を検定バッ ファーにより置き替えた。尿サンプルにより作り出された光学密度の読みを表８ 中に示す（すべての値は、バッファー単独の吸収を差し引くことにより補正され た。）。Ｎ−ＰＹｄ標準により確立された換算曲線を使用して同一サンプル中で 測定されたＮ−Ｐｙｄ濃度を表９中に示す。

硫酸アンモニウム沈降からの沈降したＧ６ＰＤＨ（１１０，０００ＭＷ）（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、１２．００Ｏｒｐｍにおける５分間 の遠心分離により集めた。多数のペレットのアリコツトのそれぞれに、１５０ｍ Ｍ　ＮａＣ１（ＰＢＳ）を含む０゜１Ｍ燐酸塩中の加水分解ｐｙｄ又はＤＩ）ｄ （１５，２３、又は１５０ｍＭ保存溶液）　、ｐＨ７，５を、モル比（８０：ｌ 　、　１３０：ｌ　、又は２００　：　ｌの（Ｐｙｄ又はＤｐｄ対Ｇ６ＰＤＨ） ）において、添加し、そして得られた混合物を混合した。その混合物中のＧ６Ｐ ＤＨの最終濃度は２０ｍｇ／ｍｌであった。

乾燥ＥＤＣの選択量を上記溶液に添加した後（１７０：１．２９０　：　１又は ４６０．１のＥＤＣ対Ｇ６ＰＤＨのモル比）、得られた混合物を４°Ｃにおいて 一夜反応に供した。それぞれの反応混合物からの得られたＰｙｄ−標ｆｌｉＧ６ ＰＤＨを０．０１　Ｍ　ＰＢＳ、　ｐＨ７，０を溶出バッファーとして使用して ＳｅｐｈａｄｅＸ　Ｇ−２５カラム上で、又は０．０１　Ｍ　ＰＢＳ、　ｐＨ７ ，０に対する透析により、精製した。それぞれの結合体中のＰｙｄ対Ｇ６ＰＤ） ｌの比を、２８０ｎｍ　（Ｇ６ＰＤＨ，ε（２８０ｎｍ、１％）　□　１．１５ 　ｍｌ／ｍｇ　−ｃｍ）及び３２６ｎｍ　（Ｐｙｄ、ε（３２６ｎｍ）　＝　５ ４２０ｍ１／ｍｍｏｌ−ｃｍ、　ｐＨ７；又はＤｐｄ　ｅ　（３２６ｎｍ）　□ 　４９３３ｍ１／ｍｍ０１・ｃｍ、　ｐＨ７）における吸収に基づき計算した。

この結合対を一２０℃において５０％グリセロール中に保存した。１：Ｉ３０： ２９０の比におけるＧ６ＰＤＨ、ｐｙｃｉ　、及びＥＤＣは、Ｇ６ＰＤＨの１分 子当たり約８．８のｐｙａ分子により標識付けされたＧ６ＰＤｌ（を与えた。

実施例１６ Ｓｕ　ｌ　ｆ　ｏ−ＳＭＣＣ及び５ＡＴＡを使用したピリジノリン−Ｇ６ＰＤＨ 結合体の調製チオール化Ｇ　６　Ｐ　Ｄ　Ｈを以下のように調製した。Ｇ６ＰＤ Ｈ（２ｍｇ／ｍＬ）及び５モル当量のＮＡＤ＋を含む溶液を０．１　Ｍ　ＰＢＳ 、　ｐｌ　７．５中で調製した。

この溶液に、（１０，５μし）の無水ジメチル・スルホキシド中に溶解した２５ モル当量の５ＡＴＡを添加した。室温において４５分間の反応期間の後、３０モ ル当量のＮＨ２ＯＨ−ＨＣＩを添加し、そして得られた混合物を３０分間反応に 供し、その酵素−結合５ＡＴＡ分子のチオール基を脱保護した。得られたチオー ル化Ｇ６ＰＤＨを残ったＮＨ，ＯＨ−ＨＣＩ及び非結合５ＡＴＡからＰＤ−１０ ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通しての９０Ｏｒｐｍにおける遠心分 離により精製した。

１：１　ノＰｙｄ：ＳＭＣＣ誘導体を以下のように調製した。０．１　Ｍ　ＰＢ Ｓ、　ｐＨ７，５中の加水分解Ｐｙｄ（２９ｍＭ）の激しく攪拌した溶液に、Ｍ ｅＯＨと０．１ＭＰＢＳ、　ｐＨ７，５のｌ＝１混合物の２００μＬ中に１．５ モル当量のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを含む溶液をゆっくりと添加した。得られた透 明な暗琥珀色の溶液をさらに３時間攪拌した。−２０″Ｃにおいて２日間その反 応溶液を保存した後、その溶液を溶出液として１０ｍＭ　ＰＢＳ、　ｐＨ７，５ を使用してＢｉｏＧｅｌ　Ｐ−２（Ｂｉｏｒａｄ）のカラムに通過させた。３つ のｐｙｔｉ含有ピークを３２６ｎｍにおけるＵ■モニタリングにより観察した： 　Ｐｙｄ：ＳＭＣＣ（１：２）；Ｐｙｄ：ＳＭＣＣ（１：１）；及び遊離の（非 誘導体化）Ｐｙｄ、この１：ｌ　Ｐｙｄ：ＳＭＣＣ誘導体を含む両分をプールし 、そしてその濃度を３２６ｎｍにおけるそのＰｙｄのピリジニウム環の吸収に基 づき測定した。

ｐｙａ−標識されたＧ６ＰＤＨをそのＩ：Ｉ　Ｐｙｄ：ＳＭＣＣ誘導体の１．７ ｍＭ溶液（０６ＰＤＨの当量光たり１２モル当量のＰｙｄ：ＳＭＣＣ誘導体）の ６３μＬによる１゜３ｍＬのチオール化０６ＰＤＨ溶液（上記のように調製され たもの、０．８ｍｇ／ｍＬ）の添加により調製した。得られた混合物のｐＨを必 要により調整し、そしてその混合物をアルゴン雰囲気下でシールして室温におい て１時間反応に供した。

残りのチオールのいずれをも、メタノール性マレイミド溶液（Ｉ　Ｍ保存、最終 濃度、５０ｍＭ）との１時間の反応によりキャップした。このキャッピング段階 の後、得られた混合物を暗所内での４℃における１０　ｍＭ　ＰＢＳ、　ｐＨ７ 中の１２−１４．０００　ＭＷカット−オフ透析チューブ内で一夜透析した。透 析後、最終容量を測定し、そしてＧ６ＰＤＨ：Ｐｙｄの比を２８０及び３２６　 ｎｍにおける吸収に基づき計算した。

実施例１７ ｓｕｌｆａ−ＳＭＣＣ及び５ＰＤＰを使用したピリジノリン−０６ＰＤＨ結合体 の調製以下のバッファーを調製し、そして脱気した＋１１５μＭ　ＮＡＤ”（ｐ Ｈ７，５バツフアー）を含む０．０５Ｍ燐酸ナトリウム、　ｐＨ７，５；　１１ ５　ｔｔＭ　ＮＡＤ　”　（１）Ｈ６バツフアー）を含むＯ，１０Ｍ燐酸ナトリ ウム、　ｐＨ６，０゜１）Ｈ７，５バッフ７−中のＧ６ＰＤＨの激しく攪拌した 溶液（２ｍｇ／ｍＬ、　０．５ｍＬ）に、螺動ポンプを使用してｌ−２時間にわ たり無水エタノール中の５ＰＤＰの１９ｍＭ溶液の１４又は４７μＬ（３０又は １００モル当量）を添加した。

添加が完了した後、得られた溶液を４°ＣにおけるｐＨ６バツフアーに対する６ −８，０００又は１２−１４．′０００　ＭＷカット−オフのチューブ材料を使 用して消費的に透析した。透析後、５ＰＤＰ−標識酵素を集め、そしてジチオト レイトール（３０分間５−１５−１Ｏと反応させ、その２−チオピリジン基を除 去し、これによりチオール化酵素を作った。酵素に結合した５ＰＤＰ分子の数を そのジチオトレイトール反応において放出されたピリジン２−チオンの量（Ａ、 、４）を測定することにより決定した。

得られたチオール酵素をｐＨ６バツフアーによりＰＤ−１０脱塩カラム上で精製 し、そしてその酵素の実際のチオール含量（３０及び１００モル当量の５ＰＤＰ によりそれぞれ得られたＧ６ＰＤＨの１分子当たり５及び１０チオール基）をＥ ｌ１ｍａｎ’　ｓ試薬を使用して測定した。

Ｐｙｄ−標識酵素を調製するため、チオール化酵素の溶液（ｐＨ６バツフアー中 ０．８　ｍｇ／ｍＬ；　１モル当量）をｐＨ６バツフアー中のＰｙｄ−ＳＭＣＣ （実施例＋６）の溶液（７０又は１６０μＬ）（それぞれ２０及び４０当量）に 添加し、そして得られた混合物を暗所においてアルゴン雰囲気下４°Ｃにおいて ３時間反応に供した。反応後、メタノール中のＮ−エチル・マレイミドの溶液（ Ｉ　Ｍ）を添加しく最終マレイミド濃度、　５０ｍＭ）、そしてその混合物を１ 時間反応に供した。次に混合物を暗所において４°Ｃにおける１０　ｍＭ　ＰＢ Ｓ、　ｐＨ７に対する１２−１４，０００　ＭＷカット−オフの透析チューブ材 料内で消費的に透析した。Ｇ６ＰＤＨ：Ｐｙｄの比（それぞれ、１．２及びｌ・ ６）を２８０及び３２６ｎｍにおける吸収を測定することにより計算した。

以下の研究において、Ｇ６ＰＤＨ濃度（非標識並びに様々なピリジニウム−標識 形態）を必要により希釈し、マイクロタイター・プレート・ウェルへの添加に先 立ち、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファー、　ｐＨ７，５中の５μｇ／ｍｌの酵素濃 度を達成した。９６−ウェル・マイクロタイター・プレートのそれぞれのウェル に、１００μＬのＴｒｉｓバッファー及び５０μＬの逐次希釈酵素（５μｇ／ｍ １以下）を入れた。対照として、１列のウェルを酵素無しで調製した。そのウェ ルのそれぞれに、２０μＬの基質溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，５中の ２５０ｍＭ　Ｄ−グルコース−６−ホスフェート及び５０　ｍＭ　ＮＡＤ　”　 ）を添加し、そして３４０ｎｍにおける吸収における変化をＶ−Ｍａｘ　ｖイク ロプレート・リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＤｅｖｉｃｅｓＣａｒｐ、　Ｍｅ ｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ）を使用して、時間の関数として記録した。

酵素活性は、典型的にはｍＯＤ／分の単において記録された。

Ｂ、　ピリジニウム−酵素結合体の触媒活性に対する抗体の効果９６−ウェルの マイクロタイター・プレートのウェルに、１００μｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッ ファー、Ｉ））（７，５、及びそのプレートを横切って逐次的に希釈された、５ ０μＬのピリジニウム−特異的抗体を添加した。

次に、それぞれのウェルに、１００μｌのピリジニウム−標識酵素を添加し、抗 体の非存在中約２００−３００ｍＯＤ／分の酵素活性を作り出すのに有効な酵素 濃度を達成した。このプレートを室温における選択時間（５−２０分間）の間イ ンキュベートに供した後、（上記の）５０μｌの基質溶液を添加し、５０ｍＭ　 Ｇ６Ｐ及び１０ｍＭ　ＮＡＤ＋の最終濃度を作り出した。時間の関数としての吸 収における変更を次に３４０ｒ＋ｍにおいて測定し、そして様々な濃度の抗体の 存在中のパーセント”ダウン・モジュレーション”（触媒活性における減少）を 、（１００％活性として定義した）抗体の非存在中で観察された活性に対して測 定した。

Ｃ，ＥＭＩＴ検定 生来の遊離のピリジノリンの尿レベルを測定するために、ピリジノリン標準（５ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｌ）８７．５中の０〜３０００　ｎＭ　Ｐｙｄ）又は尿サ ンブル（Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，５中で１５希釈されたもの）の５０μＬアリコツ トをマイクロタイター・プレートのそれぞれのウェルに添加し、その後開−バッ ファー中で（先のセクションＢ中で測定された）安定して希釈された抗体の１０ ０μＬを添加した。このプレートを選択された時間（２、ｌＯｌ又は３０分間） の間室温においてインキュベートした後、（抗体の非存在中２００−３００ｍＯ Ｄ／分の活性を作り出すのに有効な）１００μｌの希釈ＥＤＣ−カップル・ピリ ジノリン−０６ＰＤ）Ｉ結合体をそれぞれのウェルに添加し、その後、５．１０ ．１５、又は３０分間室温においてインキュベーションを行った。最後のインキ ュベーション期間の後、（上記の）６０μＬの基質溶液をそれぞれのウェルに添 加し、そして先のように３４０μｍにおいてＧ６ＰＤＨ活性を測定した。様々な Ｐｙｄ標準により測定された活性を、Ｐｙｄ換算曲線を構築するために使用した （例えば、図１０参照）。この換算曲線を次に、Ｖ　、、、　Ｍｉｃｒｏｐｌａ ｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃａｒｐ、）を装 備したＳＯｆｔｍａＸ　２゜２２ソフトウェア−を使用して、その尿サンプル中 のＰｙｄのレベルを測定するために使用した。

免疫感作のためのニューシーラント白ウサギ（全部で５９）を以下の表１１中に 示すように、免疫感作プロトコールに従って８群に分割した。免疫感作投与量は 、１．Ｏｍｌ　（７）Ｒｉｂｉアジュバント（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎ。

Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、）と混合された１、Ｏｍｌ　Ｐ ＢＳ中の、Ｐｙｄ−ＢＳＡ（実施例３Ａ）、低−ハブテンｆ’ｙｄ−ＢＳＡ免疫 原（Ｐｙｄ−ＢＳＡのための実施例３Ａにおけるように調製されたが、低いｐｙ ａ　：　ＢＳＡ化学量論をもつもの）、又はＰｙｄ−ＫＬＨ（実施例３Ｂ）、の ２００μｇであった。最初の免疫感作を多■における皮下注射により行い、そし てその後のブースター免疫感作を３週間間隔の訪中において与えた。抗血清をそ れぞれの免疫感作の１０日後に集めた。

採取の間、それぞれの抗血清を実施例８中に記載した検定形式を使用してＰｙｄ 結合アフィニティーについてテストした。簡単に言えば、この血清からの抗−Ｐ ｙｄ抗体の、固体支持体上に固定されたＰｙｄへの結合を、アルカリ性ホスファ ターゼ−標識ヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体試薬を使用して検出した。

免疫感作された動物を、それらの抗血清が以下のパラグラフ中にさらに定める以 下の基準を満足する場合に、保存した：　ＡＡ＜２０％、Ｐｙｄ−ペプチド〈１ ０％、力価＞５０００　、及び全変換シグナルの〉１０％のＯ〜２５ｎＭ　Ｐｙ ｄシグナル分離。

実施例８中に記載した検定形式を使用して測定された、最も強い反応性の抗血清 のプロフィールを、以下の表１２中に示す。第一列は分析のためにプールされた 採血（ｂｌｅｅｄｓ）を示す。″力価（ｔｉｔｅｒ）”と印された列は、イムノ アッセイにおけるＰｙｄ−陰性サンプル（Ｐｙｄが全く存在しない）により１． ２〜１．６の光学密度の読みを達成するのに必要なそれぞれの抗血清の希釈を示 す。”ＡＡ”と印された列は、実施例１０中に記載したアミノ酸混合物とのそれ ぞれの抗血清の交差反応性を示す。Ｐｙｄ−ｐｅｐ＞１０００　ＭＷ”　と印さ れた列は、Ｐｙｄ−ペプチド（〉１０００　ＭＶＩ）とのそれぞれの抗血清の交 差反応性を示す。最後の列は、全変換シグナルの分数としての０及び２５　ｎＭ 　Ｐｙｄサンプルについてのシグナル間の分離を示す。

表から分かるように、ウサギ１１１３　、Ｖ−４、及びＶｒ−８は、０から２５ 　ｎＭまてのＮ−ｐｙｃｔのシグナルの存意な変換を示している。高い活性をも つ血清（Ｖｌ−８）を、本明細書中に記載するＮ−ｐｙａ検定における使用のた めに選択した。

実施例２０ 以下のイムノアッセイを先の表１０及び、１２中に特徴付けたウサギ・ポリクロ ナール抗体Ｖｌ−８、及び実施例８Ａ中に記載したＮ−Ｐｙｄコート・マイクロ タイター・プレートを使用して行った。

Ｎ−Ｐｙｄ標準溶液及び尿サンプルを２連でテストした。尿サンプルを検定に先 立って遠心分離（スピン濾過）によりニトロセルロース膜を通して濾過した。

サンプル又は標準（２５μｌ／ウエル）の添加の後、検定バッファー中に２０． ０００倍に希釈した１２５μｌ／ウエルのＶｌ−８抗血清を添加し、そしてこの 検定プレートを４°Ｃにおいて一夜インキユベートした。このプレートを３００ μｌ／ウエルの洗浄バッファーにより３回洗浄した後、１５０μｌ／ウエルのヤ ギ抗−ウサギＩｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ結合対する（検定バッファー中 １　：　］　０００希釈）を添加し、そしてそのプレートを室温において１時間 インキュベートした。次にこのウェルを洗浄バッファーにより３回洗浄した。

それぞれのウェルに、１５０μし酵素基質溶液（１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚを含む１． ０Ｍジェタノールアミン中の２ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスフェ−）　 （Ｓｉｇｍａ）、　Ｉ）８９．８）を添加した、室温において１時間のインキュ ベーション後、５０μｌの３．　ＯＮ　ＮａＯＨをそれぞれのウェルに添加し、 その酵素反応を停止させた。次に４０５μｍにおける光学密度をＶｍａｘリーダ ー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐ、）により測定した。

２連サンプルからの光学密度の読み（４０５μｍ）を平均し、そしてＮ−Ｐｙｄ 標準からの平均の読みをＯＤの読み対Ｎ−ｐｙａ濃度の標準曲線を構築するため に使用した。この曲線からそれぞれのサンプル中の遊離のＮ−Ｐｙｄ架橋濃度を 測定した。

本発明を特定の態様に関して記載してきたが、様々な変更及び修正が本発明から 外れることなく行われることができると理解されよＨＰＬＣによるＴ−Ｐｙｄ（ ｎＭ） 重度骨粗しよう症　骨粗しよう庁　齢適合対照股関節部骨折　骨折なし Ｆｉｇ、４ 患者群 Ｆｉｇ、５ 患者 Ｆｉｇ、６ ト ひ　さ −ｒ−ｔ　）Ｘｈ −　ト・） ミ　−　か 口。

〉Ｎ ’ｏ　ＣＬ　へ ゛　°峡 ｏ−Ｘｒ″ｎ フ 工　Ｆ　ロ／島 啼　ｍ 口。

℃　龜 ロ　島 り　龜　ｌ 、　ｋ′“　ル２）ｌス　パ ｃ１″　嗜　＝Ｄ″　′ ｎ口 ＜−一、 Ｇ６ＰＤＨ分子当たりのＰｙｄ又はＤｐｄ残基数Ｆｉｇ、ｓ ［Ｐｙｄｌ　（ｎＭ） Ｆｉｇ、１０ 国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９３０７２０３ フロントページの続き （３１）優先権主張番号　０３７，５７１（３２）優先日　１９９３年３月２６ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）優先権主張番号　０３７，６０２（３２）優先日　１９９３年３月２６ 日（３３）優先権主張国　米国（Ｕ　Ｓ　’）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、Ｂ Ｅ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ、　ＦＩ、ＪＰ。

ＫＰ、　ＫＲ，Ｎｏ、　ＮＺ、　ＵＳ （７２）発明者　ダニロフ、ジョージ　ワイ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０４０゜マウンテン　ピユー、ロイド　 ウェイ （７２）発明者　カン、ビオラ　ティー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０２５゜メン口　パーク、レモン　スト リート （７２）発明者　ザク、ロバート　エフ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０１０゜バーリンガム、ロス　モンテス 　１５３６（７２）発明者　ジュー、シン−シャン　シュリアアメリカ合衆国、 カリフォルニア　９５０１４゜カパーティノ、ビスタ　ドライブ　１０１２４（ ７２）発明者　エバンズ、ブライアン　ジエフリーアメリカ合衆国、カリフォル ニア　９５０５４゜サンタ　クララ、　＃３１２　オークグローブドライブ　４ ７０ （７２）発明者　ヒー、ビングレン アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０１０゜バーリンガム、ダファーリンア ベニュ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト被験者における骨コラーゲン分解活性の検定法であって、生来の遊離の ピリジノリン及び生来の遊離のデオキシピリジノリンから成る群から選ばれたピ リジニウム架橋と免疫特異的に反応することができるモノクロナール抗体とヒト 尿サンプルとを反応させ、そのモノクロナール抗体が、約３：１を超える、その 選ばれたピリジニウム架構に対する反応性と、分子量において１，０００ダルト ンを上回る尿中ピリジニウム・ペプチドに対する反応性との比をもち、その反応 により、上記抗体とそのサンプル中に存在するこのように選ばれたピリジニウム 架橋との間に免疫複合体を形成させ、そして 形成された免疫複合体の量を測定する、ことを含んで成る検定法。 ２，モノクロナール抗体が約５：１を超える、生来の遊離のピリジノリンに対す る反応性と、生来の遊離のデオキシピリジノリンに対する反応性との比をもつ、 請求項１に記載の検定法。 ３．測定された生来の遊離のピリジノリンのレベルが約０．３−０．５の勾配を もつ線形関係により、そのサンプル中の全加水分解ピリジノリンの濃度に関係す る、請求の範囲２に記載の検定法。 ４．モノクロナール抗体が約２５：１を超える、生来の遊離のデオキシピリジノ リンに対する反応性と、生来の遊離のピリジノリンに対する反応性との比をもつ 、請求項１に記載の検定法。 ５．モノクロナール抗体が約２：１〜１：２の間の、生来の遊離のピリジノリン に対する反応性と、生来の遊離のデオキシピリジノリンに対する反応性との比を もつ、請求項１に記載の検定法。 ６．反応が、形成された免疫複合体の量に比例する検出可能なシグナルを作り出 すのに有効な条件下で、抗体と尿サンプルとを接触させることを含む、請求項１ に記載の検定法。 ７．サンプル中の選ばれたピリジニウム架橋の量に比例して、免疫複合体を形成 するのに有効な条件下で、表面−付着結合分子をもつ固相支持体と、尿サンプル とを接触させることを含む、請求項１に記載の検定法。 ８．モノクロナール抗体試薬であって：生来の遊離のピリジノリン及び生来の遊 離のデオキシピリジノリンから成る群から選ばれたピリジニウム架橋への免疫特 異的結合、及び 約３：１を超える、選ばれた遊離のピリジニウム架橋に対する反応性と、分子量 において１，０００ダルトンを上回る尿中ピリジニウム・ペプチドに対する反応 性との比、 を特徴とする試薬。 ９．約５：１を超える、生来の遊離のピリジノリンに対する反応性と、生来の遊 離のデオキシピリジノリンに対する反応性との比をもつ、請求項８に記載の試薬 。 １０．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１０８９により同定された細胞系から得られた、請 求項９に記載の試薬。 １１．約２５：１を超える、生来の遊離のデオキシピリジノリンに対する反応性 と、生来の遊離のピリジノリンに対する反応性との比をもつ、請求項８に記載の 試薬。 １２．約２：１〜１：２の間の、生来の遊離のピリジノリンに対する反応性と、 生来の遊離のデオキシピリジノリンに対する反応性との比をもつ、請求項８に記 載の試薬。 １３．抗体の獲得における使用のための免疫原であって、その抗体が、生来の遊 離のピリジノリン及び生来の遊離のデオキシピリジノリンから成る群から選ばれ たピリジニウム架橋と免疫特異的に反応することができ、そのモノクロナール抗 体が、約３：１を超える、その選ばれたピリジニウム架橋に対する反応性と、分 子量において１，０００ダルトンを上回る尿中ピリジニウム・ペプチドに対する 反応性との比をもち、 遊離のピリジノリン及び遊離のデオキシピリジノリンから成る群から選ばれた遊 離のピリジニウム架橋であって且つそれがｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔヘモシア ニンに共有結合により付着されているピリジニウム架橋を含んで成る、免疫原。 １４．共有結合による付着が１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル カルボジイミドを使用して行われる、請求項１３に記載の免疫原。 １５．ヒト被験者における骨コラーゲン分解レベルの検定における使用のための 診断キットであって、 生来の遊離のピリジノリン及び生来の遊離のデオキシピリジノリンから成る群か ら選ばれたピリジニウム架橋と免疫特異的結合に反応することができ、約３：１ を超える、その遊離のピリジニウム架橋に対する反応性と、分子量において１， ０００ダルトンを上回る尿中ピリジニウム・ペプチドに対する反応性との比をも つ抗体試薬、及びこのような遊離のピリジニウム架橋とこの抗体試薬との反応に より形成された免疫複合体の量を検出するための検出手段、を含んで成る診断キ ット。 １６．抗体試薬との結合についてサンプル中に存在する遊離のピリジニウム架橋 と競合するために有効な表面−付着遊離ピリジニウム架橋分子をもつ固相支持体 をさらに含み、そしてその抗体試薬がリポーター標識された又はリポーター標識 可能な抗体である、請求項１５に記載のキット。 １７．抗体試薬が付着される固相支持体、並びに支持体上の抗体試薬との結合に ついてサンプル中に存在する遊離のピリジニウム架橋と競合するために有効であ るリポーター標識された又はリポーター標識可能な遊離のピリジニウム架橋試薬 、をさらに含む、請求項１５に記載のキット。 １８．検出手段が形成された免疫複合体の量に比例した比色計によるシグナルを 作り出すのために有効なリポーター酵素を含む、請求項１５に記載のキット。 １９．検出手段が選ばれたピリジニウム架橋により標識付けされた酵素を含み； その標識付けされた酵素への抗体試薬の結合がその標識された酵素の触媒活性に おける減少を引き起こす場合、その標識付けされた酵素がその抗体試薬への結合 についてそのサンプル中に存在する遊離のピリジニウム架橋と競合するために有 効である、請求項１５に記載のキット。 ２０．尿中の分析物を定量するための検定法であって、（ｉ）ヒト尿サンプルを 獲得し、 （ｉｉ）膜が抗体に非特異的に結合する物質（単数又は複数）を除去するために 有効であるが、分析物を通過させる場合に、ニトロセルロース、ｌｍｍｏｂｉｌ ｏｎ−ＣＤ、及びｌｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＳＰＱから成る群から選ばれたフィルタ ー膜を通してそのサンプルを通過させ、そして（ｉｉｉ）そのサンプル中の分析 物の量に比例してその固体支持体にその抗体を結合させるために有効な条件下で 、その分析物との抗原−抗体複合体を形成させるのに有効な結合試薬と、その濾 過された尿サンプルを反応させる、 を含んで成る検定法。 ２１．濾過がスピン濾過により行われる、請求項２０に記載のイムノアッセイ（ 免疫検定法）。 ２２．複合体が結合試薬と免疫反応性である抗−抗体試薬を介して検出される、 請求項２０に記載のイムノアッセイ。