JPS62122594A - 抗ニコチンと抗コチニン抗体（モノクロ−ナル等）、及びそのニコチンとコチニン測定への使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １更公互 この発明はニコチン、ニコチン及び／またはそれらの誘
導体と結合する抗体（とモノクローナル抗体）に関する
ものであり、さらにニコチンまたはニコチン測定にこれ
らの産物を使うことを含んでいる。

見胛血Ｌｔ ニコチンはタバコの主要なアルカロイドであり、哺乳動
物ではニコチンはその主要な代謝物である（Ｅ、Ｒ，ボ
ウマン、　Ｌ、Ｂ、ターンプル、■、マツケニス、Ｊｒ
、を週」［塞］１光秀υ１詩工１２７巻、９２頁（１９
５９年）、Ｊ、ゴロ−１Ｐ、ジェンナー、青ＪＩＬ論−
文６巻３５頁（１９７５年）を見よ、〕。ニコチンの含
有量を追跡することはニコチンに対してよりも必要であ
る。ニコチンは半減期が比較的長く、その含量は長期間
喫煙者に比較的一定に残留し。

その濃度が一般に急速に代謝されるニコチンのそれより
かなり高いことにおいて、ニコチンはタバコ消費のより
信頼性の高い指標と考えられている（Ｊ、Ｊ、ランボン
、Ｈ，Ｂ、シーカ、■、ファン・フナキス、生化学１２
巻５０２５頁（１９７３年）　；　Ｊ、Ｊ、ランボン、
１１．ファン・フナキス、酵素学研究法８４巻６２８頁
（１９８２年）　；　Ｎ、Ｊ、ハレイ、　Ｃ，Ｍ、アク
セルロッド、Ｔ、Ａ、ミルトン、アメリカ公衆健康雑誌
７３巻１２０４頁（１９８３年）　；　Ｎ、Ｌ、ベノビ
ツツ薬物濫用年）、を見よ〕。（Ｎ、Ｌ、ベノビツツ（
前出）はまた他の産物例えば−酸化炭素やチオシアネー
トをタバコ消費の指標として使うことの相対的な利点に
ついて論じている。〕 生理的な液体におけるニコチンまたはニコチンを測定す
るためにはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　（注１）
が使われている［Ｊ、Ｊ、ランボン等（１９７３年）直
敷、Ｊ、Ｊ、ランボン、■、アアン・フナガスクロマト
グラフィー、ガスクロマトグラフ質量分析法や高速液体
クロマトグラフィー等も使われている〔これらの技法の
利点と限界の比較はＮ、Ｌ、ヘソピック（前出）をみよ
〕。ＲＩＡは一般に著しいタバコ利用者の研究には満足
しうるが“受動的喫煙者″（タバコの煙に好まざる状態
で曝される者）にはもっと敏感な測定法が必要とされ、
その結果多量の生体液試料の濃縮はタバコ消費につづく
全身に分布した後の薬物減少期の間の含量を測定するた
めには必要とされない。生体液試料の濃縮の必要性をさ
けることは唾液や尿を分析するときそのｐｌ＋やイオン
強度の変化が抗原抗体の結合を乱したりその妨害をおこ
すのでとくに重要である。

ＲＩＡのもう一つの欠点は放射性材料に付ずいする本質
的な問題である。それ故放射性材料を使わず低濃度の抗
原にも鋭敏で再現性（結果が一定に出る）やコスト性等
のような他の必要要件をもつ試験法が必要である。

現在まで競合免疫法（注２）を開発する問題はニコチン
もコチニンもその官能部分が抗体結合に利用されるよう
に残されているように固相に結合しなかったということ
である。このことは競合免疫法を行うのに必要な複合体
であるところの固相に結合した抗体抗原複合体の形成を
妨げていた。

もう一つの問題はニコチン、コチニンあるいはその誘導
体に特異的なモノクローナル抗体（注３）を開発するこ
とができなかったことにある。モノクローナル抗体は一
般に対象の抗原に特異的な抗体量が抗血清に存在するよ
うな分離されていない抗体群を使うときよりも正確にモ
ニターできるのでより大きな分析精度が得られる。

３１塚ｌ」１ ポリペプチドとニコチンの誘導体（３′−ヒドロキシメ
チルニコチン・ヘミサクシネートとポリ−Ｌ−リジン）
の結合体とポリペプチドとコチニン誘導体（４′−カル
ボキシコチニンとポリ−Ｌ−リジン）の結合体を開発し
た。これらはともに固相に結合しうる。さらにモノクロ
ーナル抗体を開発したが、その一つはニコチンまたはニ
コチン結合体に、もう一つはコチニンまたはコチニン結
合体と結合する。これらの生成物は精確な、再現性のあ
るＥＬＩＳＡを実行でき、低濃度の抗原の測定と放射性
物質の必要性の排除に適している。しかしながら、（以
下に述べる）発明の展開にみられる内容は定量には酵素
よりも放射性のトレーサを使っている。

簡単に言えば、ＥＬＩＳＡはニコチンに結合し遊離のハ
プテン（注４）と共に抗体を加えることによって行われ
る。適当な酵素を抗体に結合し後に加えられる基質に対
する酵素の作用が目的とする測定可能な結果（典型的に
は蛍光あるいは色の強さ）を示す。そしてその結果が結
合した抗体量と相関がある。既知の濃度のパ遊離の”ハ
プテンをはじめに使うことによってハプテン濃度対パ目
的とする結果″の検量線ができる。

未知のハプテン濃度のテスト試料が使われるときそれら
を使うことから得られる“目的とする結果″は遊離のハ
プテンの量を定量するためにグラフと共に使われる。

好しい例にはモノクローナル抗体がＥＬＩＳＡで使われ
る。しかしながら、ネズミ（マウス）のモノクローナル
抗体（注５）はスタフィロコッカス・アウレウスのプロ
ティンＡに共有結合で結合した西洋ワサビのペルオキシ
ダーゼ（ＨｒＰ　−５ｐＡ）とはよく結合しない（これ
は酵素ＨｒＰが基質の〇−）二二レンジアミンに作用す
る適当の酵素−蛋白結合体の例である）。かくしてＨｒ
Ｐ−５ｐＡに結合しない第２抗体が加えられる。この第
２の抗体はまたネズミのモノクローナル抗体と結合し、
それによって″サンドイッチＩが形成される。

この第２のパ抗モノクローナル抗体抗体″は好しくはウ
サギの杭コチニン抗体である。

ある別の内容ではモノクローナル抗体は使われずその代
り、ウサギの抗血清（分離していない抗体）が使われる
。これは直接ＨｒＰ−５ｐＡと結合しかつ第２抗体が必
要でありそして「サンドイッチは作られない」からであ
る。

この発明はまたＯ−フェニレンジアミン基質に作用する
西洋ワサビのペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン結
合体やウンベリフェリル燐酸基質に作用するストレプト
アビジンを介して結合したビオチン化アルカリホスファ
ターゼを含む（これらに限定するものでない）ＨｒＰ　
−ＳｐＡ以外の酵素−蛋白結合体の使用が含まれている
。

その他多くの酵素−基質系もまたこの分野で訓練した者
には明らかであろう。加うるにＳｐＡは放射性物質でラ
ベルされうる（そのときは酵素／基質は省かれる）、そ
してこの系はこの発明の“′サンドウィッチ″免疫測定
法に使われる。

既述のように、多くの異なった抗体（ポリクローン）が
ｉｎ　ｖｉｖｏ（生きた動物の体内で）で作られている
がモノクローナル抗体の一群を分離することに問題があ
る。ニコチン、コチニン及び上述の誘導体に対する一群
のネズミのモノクローナル抗体は次のようにして分離さ
れる。

１、　　疫原性の結合　の作成 ニコチンとコチニンが非免疫原性（ｉｎ　ｖｉｖｏで抗
体の産生を起こさない）であり、免疫原性のキャリア分
子と結合するのに適切な官能基を欠いている限り、それ
らは免疫原性のキャリアに結合するのに適せしめるよう
に変えねばならない。ニコチンとコチニンから３１−ヒ
ドロキシメチルニコチン・ヘミサクシネートと４′−カ
ルボキシコチニンが調製されキーホールリムペットのヘ
モシアニン（ＫＬＨ）の遊離のアミノ基とコバレントに
結合された〔詳細にはランボン等；１１（１９７３年前
出）及びランボンとファン・フナキス著ｕ　　’ｆ−＠
　’Ａ　’　（１９８２年前出）に述べられている〕。

簡単には２５＋ｗｇの１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノ−プロピルカルボジイミド）　（ＥＤＡＣ；ニュ
ーヨーク州、ロックビルセンターのバイオラドラボラト
リーズから購入）をｐＨ６，８で１．０＋ｏｎの水ニド
カシ、１．ｏｍＱノ水（ｐＨ６，８）ニ入れた５０ｎ＋
ｇのニコチンまたはコチニン誘導体と５０ｍｇのＫＬＨ
（ミズーリ州セントルイス市ジクマケミカル社から購入
）の溶液に攪拌しながら滴下した。室温で１６時間後、
免疫原はセファデックスＧ　−５０Ｍのカラム（１，９
Ｘ３５ｃｍ、ファルマシア社ニューシャーシー州ビス力
タウェイ）で湿潤充填し、ｐＨ７，２の０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣＱ　−０，０５Ｍ　リン酸ソーダで溶出するクロマ
トグラフィーで低分子量成分を分離した。ボイド容量に
相当する両分（１，５ｍＱ、マーカーとしてブルーデキ
ストラン２０００を使って予め測定した）を集めた。ニ
コチンとコチニン誘導体のとり込みはＫＬＨだけとハプ
テン−ＫＬＨ結合体の間で２６０ｎ＋ｉにニコチンとコ
チニンが吸収する波長）での光の吸収における差を測定
することによって定量にＫＬ旧分子当り６〜１８分子と
算出された。

上述のハプテン誘導体はこのテストの標準として使われ
た。

２、マウスの免疫 免疫原にニコチンまたはコチニン誘導体−ＫＬＨ結合体
）を注射することで抗体産生が起こる。

これら結合体はキャリヤーに対しての結合の場所が両者
の官能基と正反対側にあるので、ニコチンやコチニンに
非常に特異的な抗体を形成させる〔ランボン等（１９７
３年）般澁、ランゴン、ファン・フナキス（１９８２）
、ｐｒｉＸを見よ〕。

５頭の雌の８週令ＢＡＬＢ／Ｃマウス（マサチュセッツ
州、ウィルモントン市、チャールスリバーブリーディン
グラボラトリーズ）の群がまず免疫され、それから全部
で３回、２１日はなれて。

１００、μｇの免疫原を腹腔と皮下注射することでブー
スト（追加免疫）した。免疫原は等量（０，５ｍ　Ｑ　
）の完全フロイント・アジュバント（ペンシルバニア州
、コクランピル市のカペルラボラトリーズ）でエマルジ
ョンにした。ラジオイムノ沈殿法〔ランボン等（１９７
３年、前出）に詳細にのべられている〕によって測定さ
れるように各群の５頭のマウスとも全てニコチンまたは
コチニンに対する血清抗体が産生された。このラジオイ
ムノ沈降法は最適に希釈したウサギの杭コチニン全イム
ノグロブリン（Ｉｇ：カペルラボラトリーズ）で行われ
たが、これに１分間当り１０，０００カウント（ｃｐｍ
）の（ｓ）−（−）−［’　）Ｉ）−ニコチン（２，４
Ｃｉ／ｍ　ｍｏＱｅ；ニューイングランドニュクレア）
または（Ｓ）−（−）−（３Ｈ）−コチニン（２，４Ｃ
ｉ／ｍ　ｍｏ　Ｑ　ｅ）が加えられた。　これらはラン
ボン、ファン・フナキス（１９８２年Ｕ）で述べられて
いる酵素的方法によって調製された〔３Ｈ〕−ニコチン
のラセミ体から作られた。これらの放射性トレーサーは
天然に存在するアイソマーに相当する。

その後、最も高い血清含量の抗ニコチンまたは抗コチニ
ン抗体をもった各群のマウスに食塩溶液で５０μｇの免
疫原をさらに静脈注射した。

３日後、このマウスの牌細胞をハイブリドーマ産生のた
めに収かくした。

３、細胞融合 牌細胞をミエローマ（悪性化した細胞）と融合するとき
生成される細胞（ハイブリドーマ）は迅速に再生産しう
るし、それによって大量の抗体を分泌させる。

細胞融合はＧ・ケーラー、Ｃ・ミルシュタイン、欧州免
疫雑誌第６巻５１１頁（１９７６）に記述されている確
立された方法を修正して行った。こまかにつぶした牌ぞ
うをステンレススチール網を通し、血清フリーのダルベ
ツコ−の最少必須培地（ＤＭＥＭ）［１１Ｑ当り２Ｘ１
０７ケの牌細胞に希釈した。等容量（各ｔｏｎ　Ｑ　）
の牌細胞と非Ｉｇ分泌型のネズミのミエローマ細胞（Ｐ
３　Ｘ６３−Ａｇ、８．６５３　；５　Ｘ　１０’／ｍ
　Ｑ　）をペレットにして１ｍＱの５０％ポリエチレン
グリコール１４５０　（メリーランド州ゲイザースバー
グのベセスダ、リサーチ、ラボラトリーズ）に懸濁した
。それから１０分間かけて血清フリーのＤＭＥＭで最終
濃度５％のポリエチレングリコールになるよう希釈した
。遠沈後、細胞塊は１０％の仔牛脂児血清、５％のＮＣ
ＴＣ１０９培地、１％の非必須の最少必須培地アミノ酸
（１００Ｘ　）、１％のピルビン酸ソーダ（１００ｘ　
）を含む完全ＤＭＥＭに再懸濁し、５　Ｘ　１０’ｃｅ
Ｌｌｓ／ｍ　Ｑにした。細胞を９６穴のマイクロタイタ
ープレート（コースタ−；マサチュセッツ州ケンブリッ
ヂ）の各ウェルに５　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ／ｍ　Ｑで
播き３７℃−晩加湿した７％Ｃ０２気流下で培養した。

次の３日毎にＨＡＴ（０，１ｍＭヒボキサンチン、　４
Ｘ１０−’Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−’Ｍチミ
ジンを含む選択培地）を含む完全ＤＭＥＭＯ，１ｍ　Ｑ
を各ウェルに加えた。融合後１０〜１４日ハイブリドー
マが殆んど全面に達したとき上清を（Ｓ）−（−）−（
’Ｈ）ニコチンと（Ｓ）−（−）−［’旧コチニン（１
０，ＯＯＯｃｐｍを加えた）を使い、　ランボン等（１
９７３）やランボン、ファン・フナキス（１９８２）に
示された方法による免疫沈降法によってニコチンとコチ
ニンに対する抗体の検査をした。

ニコチンの融合の場合、４８０ウエルの中４４４（９２
，５％）が細胞の生育で陽性、４４４の陽性ウェルの中
４０がニコチンに対する抗体を産生ずるハイブリドーマ
を含んでいた。コチニンの融合の場合４７８／４８０ウ
エル（９９，６％）が細胞の生育を示し、４７８の陽性
ウェルの中４４が抗コチニン抗体を産生する細胞を含ん
でいた。沈降の後バックグラウンドレベル（７０ｃｐｍ
）の８倍大きな放射能を生成する上清のみを測定法のた
めのモノクローナル抗体産生に使われるに十分な親和性
（結合強度）の抗体を産生じていると見做された。

４、ハイブリドーマの培２とクローニング適切にニコチ
ンに結合する１３株と適切にコチニンに結合する１０株
のハイブリドーマをクローン化しくすなわち継代化し）
９６穴ウエルのマイクロタイタープレート（コースタ−
）で２〜４回限界希釈（注７）によってクローン化した
。その各ウェルには１０４個／ウェルの濃度のマウス胸
腺細胞のフィーダ一層とに前日から培養しておいた（こ
れが成育刺激剤として働く）。（Ｖ、Ｔ、７ｔ　イ。

Ｌ、Ａ、ヘルゼンベルグ著細胞免疫学における選択され
た手法３５１頁（１９８０年）をみよ〕。高親和力を示
す（ラジオ免疫沈降法で測定して）ノ１イブリドーマは
２４穴のクラスタープレート（コースタ−製）に増殖さ
せ、その５Ｘ１０’個の細胞を増殖の各ステージで後で
使うために液体窒素で凍結した。

各々１３と１０株のもとの標本のうちニコチン結合性の
クローン化細胞９株と４株のコチニン結合性クローン化
ハイブリトーマの１０７個の細胞を予めブリスタン（ア
リドリツチ、ケミカル社。

ウィスコンシン州ミルウオーキー）を２週間前に投与し
たＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔的投与した（Ｊ。

Ｖ、ゴーディング、免疫学的技法雑誌３９巻２８５頁（
１９８０年）をみよ〕。　プリスタンは腹水の生産を促
がし、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてハイブリドーマを迅速に
生育させることによって多量の抗体を産生ずることにな
る。７〜１０日後腹水を各マウスから集め、同一のウェ
ルから得たハイブリドーマを投与したマウスからの腹水
をプールして一８０°Ｃに保存した。

Ｂ、ハプテンとポリペプチドの会合体の作成例ハプテン
を固相に結合させるために、ポリペプチド（ポリ−Ｌ−
リジン）に結合したニコチンまたはコチニンを調製した
。これにはＡ、Ｐ、ジー、Ｊ。

Ｊ、ランボーン分ｍζ亀１１６巻５２４頁（１９８１）
に述べられているメトトレキセートと５−メチルテトラ
ヒドロ葉酸の結合による方法の新しい修正法によって行
った。簡単には１　、５＋ｏｇの３′−ヒドロキシメチ
ルニコチン・ヘミサクシネートまたは４′−カルボキシ
コチニンを０．３＋ｓｆｌの０．００３Ｍ燐酸バッファ
ー（ρ）１６．３５）に入れ、ポリ−Ｌ−リジン〔分子
数４０，０００（シグマケミカル社ミズーリ州セントル
イス〕の５　ｍｇ／ｍ　Ｑ溶液１．０＋＋Ｑを加えた。

ＥＤＡＣの１．ＯｍＱを５　Ｈ／ｍ　Ｑの緩衝液溶液と
して攪拌しながら滴下し、そして溶液を１６時間４℃に
おいた。

Ｃ，ポリペプチド−ハプテン結へ　の性質ポリ−Ｌ−リ
ジン結合体は低分子の非結合成分はプラスチックプレー
ト（すなわち固相）に結合しないから精製せずに使った
（データは示していない）。その結合体は０．０２％ア
ジ化ソーダの存在で４℃では少くとも５ケ月保存でき、
また−８０℃で０．０３＋ｗＱづつに分注して凍結する
と抗体結合活性の損失は殆んど起らなかった。

ポリリジンに結合したハプテンの量を定量するために生
産物夫々の１．０！ＩＱを低分子成分を除くためにセフ
ァデックスＰＤ−１ｏカラム（ファルマシア製）でクロ
マトグラフィーを行い、ＰＨ６，３５の０．０３Ｍリン
酸−食塩緩衝液で溶出した。ポリリジンの濃度は標準と
して既知量のポリリジンをおきＢＣＡ蛋白測定法（ピア
スケミカル社、イリノイ州ロックフォード）を゛使って
定量した。ポリリジンが２６０ｎｍで大きな吸収がない
以上ニコチンとコチニンは既知量のハプテン誘導体を含
む標本で得られる２６０ｎ＋ｏでの吸光度を比較するこ
とで測定できた。ポリリジン１モル当り４．３モルのニ
コチンと１１．６モルのコチニンに相当する量があるこ
とがわかった。

哺乳動物の抗体はいくつかの明確な群（クラス）に分け
られる。ある与えられたクラスの中にあるものは同じイ
ソタイプであると言われる。

抗体は２つのパ軽い″ポリペプチド鎖と２つの°″重い
″ポリペプチド鎖とからなり折りたたまれた状態のとき
にはお互いに別々の３次元構造をとる。哺乳類のＬ鎖は
″カッパ″か５“ラムダ″のいずれかである。

モノクローナル抗体のイソタイプとＬ鎖の構造を決める
ために杭コチニンＩｇ試薬（リットンインダストリーズ
、メリーランド州ロックヴイル）を使って行った。０．
００３Ｍの燐酸塩バッファー（ｐＨ７，２）で１　：　
１０００に希釈したニコチンまたはコチニンーポリリジ
ン結合体０．１ａＱを４℃、２４時間９６ウエルのフレ
キシブルポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレート（
ダイナチック製ヴアージニア州アレキサンドリア）の平
底のウェルでインキュベートした。プレートは０．０Ｉ
ＭＥＤＴＡと０．１％ゼラチンを含む０．００５Ｍベロ
ナール緩衝化等脹食塩水（ｐＨ７，４、ＶＢＳ　−ＥＯ
＋　Ａ　−ｇｅ　Ｑ緩衝液）で洗い、　プレート上の残
った結合部位を０．５％ゼラチンを含むＶＢＳ　−ＥＤ
ＴＡ液０．２＋＋＋Ｑで１時間３７℃でインキュベート
することによってブロックした。プレートを洗浄した後
ＭｃＡｂ（ＶＢＳ−ＥＤＴＡ−ｇｅ　Ｑで希釈した腹水
０．１ｍ１２）を加え、３７℃で１時間インキュベート
した。プレートを洗い、マウスのイソタイプのＩｇＧ１
、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ−４、ＩｇＭ、Ｉｇ
ＡあるいはマウスのカッパまたはラムダのＬ鎖（製造者
によって指示された希釈の０．１ｍＱ）に特異的なウサ
ギＩｇＧ抗体を加えた。　これら異なったイソタイプを
含むウェルでは適当なウサギ抗体がそのアイソタイプに
結合し従ってプレートに付着するだろう。

プレートを３７℃で１時間培養して、洗い、結合した抗
体を標識する。　ために０．１ｍ１２のＨｒＰ標識した
ヤギの抗ウサギＩｇ（１：１０００）を加えた。室温で
１時間インキュベートした後プレートを洗い、０．０１
５％のＨ，Ｏ□を含むＱ、０５Ｍ燐酸塩−０，０２５Ｍ
クエン酸塩バッファー（ＰＨ５，０）にとかした０、０
４％Ｏ−フェニレンジアミン基質の０．１＋ＦＩを加え
て（これが）ＩｒＰによって作用するとき色を出す）、
さらに室温で１０〜２０分間インキュベートした。

発色反応は０．０５ｍＱの４ＮＩｌ、　ＳＯ４を加える
ことで停止し、４９０ｎｍの吸光度（波長は発色の強さ
を測定することに適している）をバイオチックＥＬＩＳ
Ａリーダーで測定した。

現在９ケの抗ニコチン抗体のうち３つはＩｇＧｌｋ（“
Ｋ”はカッパＬ鎖を意味している。）で４つはＩｇＧ１
−ラムダで１ケはＩｇ０２ｋ、１つはＩｇＭ−ラムダで
あった。

４ケの抗コチニン抗体のうち、２つはＩｇＧ１にで１つ
はＩｇＧ２ｂｋでありまた１つはＩｇＡラムダであった
。

２、　いろいろなアイソタイプの性 研究のために選択されたモノクローナル抗体の性質を調
べた。結合親和定数（Ｋ；結合の強さの指標）はＲ，ミ
ュラー：・逸ｄ糺１Ｊ支迭］１甚、３４巻３４５頁（１
９８０年）に記載の方法によって測定した。腹水中の抗
体濃度もＲ，ミュータ（前出）の方法で測定した。

もしアイソタイプがあればどのアイソタイプがＨｒＰ−
３ｐＡに直接結合するかどうかを第２抗体が必要かどう
かまたそれが結合に影響するかどうかを知るために調べ
たかった。その結果は第１表にまとめられている（後記
）。

第１表の結果は第２抗体（ＥＬＩＳＡでは“サンドイッ
チ”を形成する）では同じ量のＨｒＰ　−ＳｐＡと結合
するのに必要な量は非常に少ない。それ故ＨｒＰ−５ｐ
Ａに直接結合しないアイソタイプ（例えばＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ　、　ＩｇＧ、　）でも“サンドイッチ”法に使うこ
とは適当である。ＳｐＡと直接結合するアイソタイプ（
ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ、ｂ）は第２抗体が用いられるとき
は等量のＳｐＡに結合するに必要な量はずっと少ないこ
とも興味深い。この効果はウサギのＩｇＧが全てＳｐＡ
に結合するということによっているようであり（Ｊ、Ｌ
ゴーディング、免疫学技法雑！２０巻２４１頁（１９７
８年）をみよ〕、また個々のマウス抗体に対して複数の
ウサギ抗体が結合することを示している。

３、抗体選択と特異性 ハプテンに対するモノクローナル抗体の特異性を測るこ
とも望ましい。すなわち、どの程度にそれらがデザイン
されたハプテンに構造的に関連した化合物に結合するか
である。

前記載の９株の抗ニコチン及び４株の抗コチニン産生ハ
イブリドーマを５−（−）−ニコチンと５−（−）−コ
チニン（注８）・・・これらは天然に存在する異性体で
ある（注９）・・・に対して最も特異性の高い抗体を産
生ずるものをみつけるために検定を行った。検定法もハ
プテンそれ自体よりもＫＬＨに対してハプテンも加った
結合基に指向する抗体について選択している。この結合
基（カルボジイミド）はまた固相に結合されるポリ−Ｌ
−リジンの結合体と共通である。　かくして正確なＥＬ
ＩＳＡのためには遊離のハプテンに特異的な抗体の選択
は困這が伴なう。

検定法は５−（−）−（’Ｈ）ニコチンとＳ−（−）−
Ｃ’　Ｈ）−コチニンを使って従来法の放射免疫測定法
で行った。２つの抗体（抗ニコチン４０２Ｃ１０と抗コ
チニンの３０５Ｅ５）の特異性を以下に詳述するサンド
イッチＥＬＩＳＡ法の修正法によって分析した。要約す
ると特異性は固相のハプテンへのモノクローナル抗体の
結合を５０％まで阻害するのにどの程度の構造的に関連
した物質を加えることが必要かをみることによって決め
た。測定には０．０１２μｇのニコチン−またはコチニ
ンーポリリジン結合体と１ニア２９，０００に希釈した
抗ニコチン及び抗コチニンでコーティ、ングしたウェル
で実施した。

０．０１ｍ　Ｑの順番に希釈した標準ニコチンまたはコ
チニン（抗体特異性を評価するための既知量の阻害剤）
、　あるいは検体（例えば唾液）を使った修正法ではモ
ノクローナル抗体とインキュベートする前に０．０４ｍ
Ｑのカゼイン緩衝液を加えた。最大のＡ４９゜の値（即
ち最大抗体結合）は阻害剤の代りにカゼイン緩衝液（０
，０１＋＋＋　Ｑ　）を使って定量した。′対照のウェ
ル”では抗体結合はないが、緩衝液をモノクローナル抗
体の代りに用いた。対照の値は２回または３回くり返し
定量した後の結果として第■表（後出）に示されている
。

第■表からは抗ニコチンでは６−ヒドロキシニコチン（
代謝物ではない）がテストした化合物の中で最も効果的
であることがわかる。（Ｓ）−（−）−ニコチンを使っ
たとき５０％阻害に必要な量よりも５倍はど多く必要で
ある。他のニコチン代謝物（例えばニコチンＮ−オキシ
ド）やコチニン誘導体（例えばデスメチルコチニンとコ
チニンーＮ−オキシド）、関連のタバコアルカロイド（
例えばノルニコチン、アナバシン、ミオスミン）、天然
に存在する物質（例えば、ニコチンアミド）などは阻害
活性は弱かった。（Ｒ）−（＋）−ニコチンは天然に存
在する異性体に比べて２５倍多く５０％阻害に必要であ
った。（Ｓ）−（−）−ニコチンの立体特異性（５〜４
５倍）は９種の抗ニコチンＭｃＡｂについてもみられ、
この結果は上記の検定法に内在する選択性を反映してい
る。

同様に第■表では抗コチニン３０５Ｅ５が（Ｓ）−（−
）−コチニンに特異的であることがわかる。デスメチル
コチニン（代謝産物ではない）でさえ５０％阻害に同類
のハプテンに比べて１３倍多く必要とし比較的不活性の
阻害剤であった。ピリジンやピロリドンだけや成るいは
ピロリドン環系をもつ他のいくつかの化合物は１．ＯＱ
Ｏｎｇの量でのイムノアッセイでは３０％以上阻害する
ことはなかった（データは示されていない）。

もう一つの感度測定法はモノクローナルの抗ニコチン４
０２Ｃ１０と抗コチニンの３０５Ｅ５を用い（Ｓ）−（
−）−ニコチンと（Ｓ）−（−）−コチニンについて行
われた相方のハプテンに対するバネ良／良″ハプテンー
モノクローナル抗体結合を比較することである（第１図
に示されている。） 抗ニコチン抗体では、５０％阻害には０．２５ｎｇのニ
コチンと１１０００ｎのコチニンを必要とした。対照的
にわずか０．０５ｎｇのニコチンで１５％阻害を示した
。抗コチニン抗体では０．１２ｎｇのコチニンが５０％
の結合を阻害し、一方４５０ｎｇのニコチンが相応の阻
害に必要であった。同類のハプテンを用いて同様な阻害
曲線を阻害剤のない状態で１．０〜・１．２のＡ４９０
値を示すように希釈したＭｃＡｂ夫々について得た（デ
ータは示してない）。９種の抗ニコチン抗体では０．０
９１−０．５１ｎｇの（Ｓ）−（−）−ニコチンにおい
て５０％阻害が得られた。４種の抗コチニン抗体では０
．０３８〜０．１２０ｇの（Ｓ）−（−）−コチニンが
５０％阻害を示した。

二°コチンとコチニンのＥＬＩＳＡはＡ、Ｐ、ジー、Ｊ
、Ｊ。

ランボーン分析生化学１１６巻５２４頁（１９８１年）
に記載の一般的な固相ＥＬＩＳＡ法の新しい変法（よく
似た方法ではあるが）で行った。

９６穴のポリ塩化ビニルのマイクロタイタープレト（ダ
イナチック製）のウェルを０．００３Ｍ燐酸バツアアー
（ｐＨ６，３５）で希釈した０、１ｎＱのニコチン−ま
たはコチニンーポリ−Ｌ−リジン結合体を入れて４℃で
一晩インキユベートすることによってコーティングした
。それからウェルをニュートリショナル・バイオケミカ
ル入社（オハイオ州りリーブランド市）から得た０、２
％のビタミン・フリーのカゼインと０．０１ＭＥＤＴＡ
を含む０．０１Ｍトリス緩衝化食塩水（ＰＨ７，６）で
あるカゼイン緩衝液０．２１１Ｑで一回洗浄し、　プレ
ート上の空いた部分を同緩衝液で室温１時間インキュベ
ートすることによってブロックした（注１０）。この時
点でプレートは少なくとも７日間分析に影響することな
く４℃で保存できる。それからプレートを１度０．２ｍ
Ｑのカゼイン緩衝液で洗い全量を０．１＋ｍ１２で分析
を行った。

２、結合を測　する実施例 ＭｃＡｂ結合を測定するために・以上の調製後。

０．０５ｎ＋Ｑの希釈した腹水を０．０５１１ＩＱのカ
ゼイン緩新液に加えそしてプレートを４℃で一晩インキ
ユベートした。ウェルを３回０．２ｍＱのカゼイン緩衝
液で洗った後、過剰のウサギＩｇＧ杭コチニンＩｇＧ（
またはＩｇＭまたはＩｇＡのモノクローナル抗体が使わ
れるときには杭コチニンの全Ｉｇ）を０．１ｍ１２加え
、　プレートを室温で１．５時間インキュベートした。

それからウェルを３回カゼイン緩衝液で洗い、　０．１
ｍＱの１（ｒＰ−５ｐＡ　（ザイムドラボラトリーズ社
、カリフォルニア州南すンフランシスコ）と室温で１時
間インキュベートした。０．２ＩｌＩＱのＰＢＳ−０，
０５％ツイーン２０（ｐＨ７，４）で６回洗った後、０
．１ｍＱの０−フェニレンジアミン基質で（アイソタイ
プの分類に使ったように）を加え、室温で２０〜２５分
間インキュベートした。色の生成を４Ｎ）Ｉ、　ＳＯ２
を０．０５ＩＤＱ加えることによって停止しモしてＥＬ
ＩＳＡリーダーでＡ、、ｏｎ＋ａの値を測定した。

３、工】１はし贋友定 結合体とＭｃＡｂをコーティングする至適条件は抗ニコ
チン抗体４０２Ｃ１０と抗コチニン抗体３０５Ｅ５につ
いて第２図に示されているように結合曲線から決定した
。腹水を順次希釈して０．００４から０．１１μ＆のポ
リリジンに相当する結合体とインキュベートすることに
よってコーティングしたウェルに加えた。　この範囲は
０．１３〜３．４ｎｇのニコチン、　または０．２５〜
６．８ｎｇのコチニンに相当する。比色計の実際に作動
する範囲（例えば１．Ｏ〜１．５）でＡ４９゜値を与え
るに要する腹水の希釈の逆数で定義した゛′抗体価′″
は標準の分析条件で確定された。実際には、至適の分析
感度を与える試薬の組合せ（第２図参照）と腹水あるい
は結合体の点で最も経済的な組合せを選択した。

第２抗体なしの分析法とは反対に、サンドイツチ法でウ
サギＩｇＧ杭コチニンＩｇを使う利点は第３図に示す代
表的な結果によって示されている。

′なお第３図において、コーティングしたウェルは全て
０．０１２μｇのコチニンーポリリジンで調製し、−２
°Ａｂ＝第２抗体添加せず、＋２°Ａｂ＝第２抗体添加
したものである。抗コチニン抗体３０９Ｇ５（ＩｇＧＩ
Ｋのアイソタイプ）は１：１００の希釈でもＨＲＰ−５
ｐＡには直接結合しない。しかしその抗体値はサンドイ
ッチ法で約７２９，０００で低濃度で高い結合を示した
。他の抗体（３０５Ｅ５が使われた）はＩｇＧ２ｂＫの
アイソタイプであるが、ウサギの杭コチニンＩｇＧなし
にＨＲＰ−３ｐＡに結合する。

しかしながら抗体を１　：　９０００に希釈してもＡ４
１゜の値は０．９０のプラトーの値となった。この結果
は全ての試験が０．０１２μｇであるウェルに結合した
コチニン結合体（注目）が限界試薬であったことを示し
ている。しかしながらウサギの第２抗体を使うと抗体値
は２Ｘ１０”より大きくなり（すなわち結合は著しく増
加する）、２．０以上のＡ４１０値が１　ニア２９，０
００あるいはそれ以下に希釈した腹水でさえも得られる
。

第１表にまとめた結果はまた抗ニコチン及び抗コチニン
抗体ともその抗体値はサンドイッチＥＬＩＳＡで著しく
高められた。

Ｆ、唾液試料の　折倒 非喫煙者数人から唾液試料をとり、ニコチンとコチニン
について分析した。陰性のすなわちＥＬＩＳＡの限界（
唾液ｍＱ中ニコチン５ｎｇ、コチニン２ｎｇ）以内で検
出できなかったこれらの検体はいろいろな濃度のニコチ
ンまたはコチニンを加えて回収率（注１２）及び同−試
料内（注１３）と試料量分析（注１４）の変異係数を調
べた。第■表（最後に添付した）にみられるように５〜
５００ｎｇ／ＩＩＩＱａ度範囲では正確である。変異係
数も良好で低濃度のニコチン（１０ｎｇ／ｍＱ）やコチ
ニン（５ｎｇ／ｍ　Ｑ　）でのみ１０％を超えている。

さらに、ニコチン、コチニンの分析は２４人の唾液検体
について行われその８人は非喫煙者と主張した。８人の
非喫煙者はＥＬＩＳＡ及び従来のＲＩＡで正しく同定で
き喫煙していると言った者も正解であった。非喫煙者の
うち３人はＥＬＩＳＡで検出される低濃度の唾液アルカ
ロイド量（２５ｎｇ／ｆｌｌｎ以下）であった。これは
彼等″受身的な″喫煙が・より敏感なＥＬＩＳＡによっ
て検出できたことを示す。

第４図に示す結果はＥＬＩＳＡとＲＩＡの結果の間でよ
い相関を示している（相関係数は１．０に近い）。

標準曲線も４人の非喫煙者から集めた唾液で全ての希釈
をカゼイン緩衛液で行って調製した（Ｓ）−（−）−ニ
コチンまたは（Ｓ）−（−）−コチニンで作成した。テ
ストしたコチニン量は５　、５０．５００ｎｇ／ｍ　Ｑ
でこの値は受身的、軽度、重度喫煙者に予想される濃度
を反映してい、る（注１５）。

希釈していない対照の唾液（１０μＱ）が存在していて
も緩衝液を使って得られた標準結果に比べて非特異的抗
体結合または非特異的阻害による妨害はなかった（デー
タは示していない）。

テストの後、これら唾液試料は別の研究のため集められ
、１〜２年間−２０℃で凍結保存した。

この保存条件下でニコチン、コチニンは安定である。

Ｇ、ウサギ抗血清によるＥＬＩＳＡの例Ｊ、Ｊ、ランゴ
ーン等：生化学（１９７３年）ＭｉＬ。

Ｊ、Ｊ、ランゴーン、Ｉ１．ファンフナキス：籠皇互叉
族（１９８２年）１番に記載されているように調製され
たウサギの抗血清を使っての同様なＥＬＩＳＡも開発さ
れた。　この分析法ではウサギのＩｇＧ全てがＨＲＰ　
−ＳｐＡに結合するから第２抗体を必要としない（Ｊ、
Ｌゴーディング逸兼３Ｊ３ｊぢ１に２０巻２４１頁（１
９７８年）〕。６種のコチニン抗血清でやって５０％阻
害値はコチニン０．３〜１．２の間にあり抗体価はｉ　
ｏｏ　、　ｏｏｏ〜１５０，０００にあった。テストし
た単一のウサギ抗ニコチン血清では３．９ｎｇのニコチ
ンが５０％阻害に必要だった。抗体価は９，０００であ
った。　それ故ＥＬＩＳＡはＭｃＡｂで著しく敏感にな
りＭｃＡｂの抗体価はウサギの抗血清を使うときより一
様に高かった。さらに阻害カーブはＭｃＡｂでは非常に
急であり（注１６）おそらく、モノクローナル抗体を使
ったときの検定法にある内在性の感度とウサギの血清に
は結合体−ハブテン結合基に向けられた抗体がへテロで
あることによりと思われる（データは示さなかった）。

ウサギの抗血清はＥＬＩＳＡではさらに４０〜５０倍希
釈でき従来のＲＩＡに比肩しうる感度を得たことはまた
興味深い。

先に述べたとおり、結合した抗原の量を測定するのにＨ
ｒＰ−３ｐＡ以外の蛋白／酵素系を使うことが可能であ
る。ＳＰＡ以外のタンパクはそこに存在するＩｇＧがＳ
ｐＡと反応し結果を変えるので血清や血漿でＥＬＩＳＡ
を行う必要である。多くの変法がこの分野の専門家には
明白ではあるがいくつかの例だけを以下に示す。

ａ・二町易ソ丑土ｊΣ乙白ε仁く炙か任’ＸＰＡポリ塩
化ビニルのマイクロタイタープレート（ダイナチック　
ラボラトリーズ）のウェルを夫々３ＩＩＭノリン酸塩／
＜）７７　０．１ｍＱテ夫に０．０１２μｇのポリリジ
ンコチニンと０．０２４μｇのポリリジン−ニコチンを
コーティングしてｐＨ６，３で４℃−晩インキユーベー
トした。吸引除去した後。

ウェルをカゼインバッファーで１時間室温でブロックし
、同バッファー２００μＱで一回洗ってもう一度吸引し
た。分析は０．０５＋ｅＱの希釈腹水、０．０２５ｒａ
　Ｑ検体、０．０２５ｍ　ｍ　（７）ニー　：Ｉチンま
たはコチニン（どちらでもよいが）を使って阻害カーブ
のために１ウェル当り０．１ｍＡの全量で行った。

プレートを４℃で一晩インキユーベートし、それからカ
ゼインバッファーで１１５００希釈したビオチンを結合
したヒツジの杭コチニンエｇＧ（クーパーバイオメディ
カル社）の１００μＱを添加した。

４時間室温でインキニーベートした後、プレートを洗い
、それから０．１ｍＱの西洋ワサビペルオキシダーゼ結
合ストレプトアビジン（ザイムド製、カゼインバッファ
ーで１１５００に希釈）を加えた。９０分間室温でイン
キニーベートした後、プレートを０．０５％のツイーン
２ｏを含むＰＢＳ　２００μＱで５回洗い０−フェニレ
ンジアミン基質（１０ｒａｇ／ｒａＱ、りん酸−クエン
酸バッファーで１：１０に希釈）を加え、反応は室温で
、２０〜３０分インキユーヘートシタ後０．０５ｍ　Ｑ
　（７）　４　Ｎ　Ｈ，ＳＯ２を加えることによって停
止したａ　　４９０ｎｔａにおける吸光度をＥＬ−３１
０ＥＩＡリーダー（バイオーテックィンストルメンツ社
バーモント州バーリングトン）で各ウェルについて定量
した。

他の可能性ある酵素／基質の組合せの多くは比色による
ＥＬＩＳＡに適しているもので第Ｖ表に掲ている。

ｂ・−」の凱四Ｂ込 ポリスチレン製マイクロタイタープレート（イムロン２
；ダイナチック　ラボラトリーズ社ヴアージニア州アレ
キサンドリア）を用い３ｍＭのリン酸緩衝液のそれぞれ
０．００４μｇのポリリジンーコチニン及び０．０１６
μｇのポリリジン−ニコチン結合体（０，１ｍＭ）をコ
ーティングし、ｐｉ（６，３で４℃−晩インキユーベー
トした。液を吸引除去した後、ウェルを０．２ｍ１２の
カゼイン緩衝液（０，０１ＭＥＤＴＡと０．２％ビタミ
ンフリーのカゼインにュートリショナル・バイオケミカ
ルズ社、オハイオ州クリーブランド）を含むｐＨ７，６
の０．０ＩＭトリス緩衝化食塩水〕で１時間室温におき
ブロックした。それから０．２ｍＭの同バッファーで一
度洗い再び吸引除去した。分析は０．０５ｍＱの希釈腹
水（０，０２５ｍ　Ｑの検体）と０．０２５ｍ　Ｑのニ
コチンまたはコチニンを使ってウェル当り全量が０．１
ｍＭで行った。プレートを一晩４℃でインキニーベート
し、３回０．２ｍＭのカゼインバッファーで洗い、　そ
れからカゼインバッファーで１／２５０に希釈した０、
１ｍＭのビオチン結合したヒツジの杭コチニンＩｇＧ　
（クーパー・バイオケミカル社製、ベンシイレバニア州
マルバーン）を加えた。３時間室温でインキニーベート
した後、プレートを３回０．２＋ｏＱのカゼインバッフ
ァーで洗い、各ウェルにストレプトアビジン（０，５μ
ｇ）を加えて１時間室温でインキニーベートした後、前
のように洗った。各ウェルに０．１ｍＭのビオチン化し
たアルカリフォスファターゼ（ザイムド社製、カリフォ
ルニア州南すンフランシスコ）を加えた後プレートを１
時間室温でインキュベートし、ツレカラ０．０５％（７
）ツイーン２０ヲ含ｔｉ’ＰＢ５０．２ｍＭで洗いさら
にｐＨ１，６のｏ、ｏＩＭトリス緩衝化食塩水０．２＋
ａｆｉで３回洗浄した。２．５１１ＩＭの４−メチルウ
ンベリフェリル燐酸をジェタノールアミン（２０％（ｖ
／ｖ）　）ρ旧０．０．　１ｍＭ　ＭｇＣＱ２．９ｍＭ
のレバミソールを含む緩衝液にとがした基質０．１ｍ１
２を加えた。

蛍光をマイクロフルオル・蛍光計（ダイナチックラボラ
トリーズ社）で励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎ
ｍで測定した。基質を加えた直後と３０分後にプレート
を読んだ（プレート暗所に置いておく）。

いろいろな抗体について得られた結果は第■表に示され
ている（後出）。

蛍光ＥＬＩＳＡの用途に適する別の酵素／基質の組み合
わせ（及び別の検出法も含めて）は第■表に掲げられて
いる。

２、放射性標識 モノクロール抗体の分析に放射能の定量を使うことも可
能である。例えば［１２ｓＩ　］　ＳｐＡはマイクロタ
イタープレート法でもポリリジン結合体をコーティング
したプラスチックの試験管でもっと大容量（例えば最終
液量１．０ｍＭ）でも使用可能である。しかし、［１２
’　Ｉ　］　ＳｐＡは感度と便利さから言ってマイクロ
タイタープレートにょるＥＬＩＳＡに勝る明らかな利点
をもたないし、検体が大量（例えば０．１ｍＭ）で分析
できるとしても試薬も大量に必要とする。ニコチンやコ
チニンの検出感度では１０倍程度低いことも分っている
。

３、−　法のＲＩＡにおけるモノクローナル抗体［”’
　Ｉ　］標識のハプテンがハプテン−ポリリジン及びハ
プテン−免疫原結合体と同じ結合基をもつ限りにはＭｃ
Ａｂを従来のＲＩＡ［ランボーン等（１９７３年）　Ａ
ＨｆＳ　；ランゴーン、ファンフナキス（１９８２年）
ＭＭ］を改良するために使えるものと思われる。ＲＩＡ
では未分離のポリクローナル抗体を使っているときには
あるものだけが結合基に引きつけられ従って分析感度を
低下させるのでモノクローナル抗体でスクリーニング段
階をすることは結果を改良する。

４、今後の研究におけるモノクローナル抗体ＥＬＩＳＡ
　（あるいは同様な方法）を能動的及び受動的タバコ消
費者の健康に対するリスクについて大規模な研究に使用
することに加えて、上記のＭｃＡｂはそれ自体抗ニコチ
ン抗体結合部位に特異的な抗イデイオタイプを産生ずる
免疫原として使用される（Ｎ、に、シャーン、ヌＵえ邊
礪生」しΩエフ１’）　　）ＬｔＷｆ９ｅ　　）　１２
５Ｃ巻３７３頁（１９７４年）；Ｃ，Ａ、ボナ、■１．
ケーシー著モノクローナル抗体と抗イデイオタイブ抗体
：レセプターの構造と機能のためのプローブ、１４１頁
（１９８４年）を見よ〕。これらの抗−イディオタイプ
は（Ｓ）−（−）−ニコチンに特異的な脳のレセプター
の研究に有用と思われる。

岑−−■ 次の細胞はベイラー医科大学（テキサス州ヒユーストン
市ムーアサンド通１２００，７７０３０）から入手がで
きるし、また寄託しである。

Ａｎｔｉ−ｎｉｃｏｔｉｎｅ　３０１Ｃ４Ａｎｔｉ−ｎ
ｉｃｏｔｉｎｅ　３０２Ａ１２Ａｎｔｉ−ｎｉｃｏｔｉ
ｎｅ　４０２Ｃ１０Ａｎｔｉ−ｎｉｃｏｔｉｎｅ　３０
２Ｇ３Ａｎｔｉ−ｎｉｃｏｔｉｎｅ　３０３Ｃ５Ａｎｔ
ｉ−ｎｉｃｏｔｉｎｅ　３０３Ｃ１ＯＡｎｔｉ−ｎｉｃ
ｏｔｉｎｅ　２０３Ｇ３Ａｎｔｉ−ｎｉｃｏｔｉｎｅ　
３０４Ａ４Ａｎｔｉ−ｎｉｃｏｔｉｎｅ　３０４Ａ７Ａ
ｎｔｉ−ｃｏｔｉｎｉｎｅ　３Ｑ５Ｅ５Ａｎｔｉ−ｃｏ
ｔｉｎｉｎｅ　２０６Ｆ８Ａｎｔｉ−ｃｏｔｉｎｉｎｅ
　３０８Ｃ１１Ａｎｔｉ−ｃｏｔｉｎｉｎｅ　３０９Ｇ
５これらの寄託細胞は受託者のベイラー医科大学から一
般に利用できる。しかしながら、寄託細胞の利用は行政
行為によって支持された特許権の低下において当該発明
を実施するための許可を構成するものでないことを理解
すべきである。

■、最終見解 上記のモノクローナル抗体、ポリペプチド結合体、ハイ
ブリドーマ及び試験法についての記載は例示にすぎず、
限定を意としているものでないことを強調する。これに
ついて、ニコチンとコチニンに結合する他のモノクロー
ナル抗体やそのような抗体を産生ずる他のハイブリドー
マや免疫測定法に使うことのできる検出用分子はこれら
関連の生産物を使う他の全ての方法がそうであるように
この発明の概念の中にあることが注目される。この発明
のための保護は特許請求の範囲にみられるものによって
のみ限定され、これらの特許請求の範囲の対象物に相当
する全てを含んでいる。

（以下余白） □“１　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　
　　　を（ζ　　　卜　ｈ　　　　　心 る＠！１ｂ　　　　　　　ぐ　　　　　会セ（注１）　
ラジオイムノアッセイでは抗原が放射性標識のトレーサ
ーになるように処理される。形成される抗原−抗体複合
体の量（これが当該の試料検体中の抗原量と直接関連し
ている）は複合体の放射能の強さを測ることによって定
量される。実施例はランボーン等、生化学（１９７３年
）麟をみよ。

（注２）　競合免疫測定法はその言葉が意味するように
一つの抗体に結合する２つの抗原の間での競合によって
操作する。以下にのべる固相競合法では抗！（コチニン
またはニコチンの誘導体）は固体の表面に結合され、″
フリー”の抗原試料とともに抗体が加えられる。より多
くの６′フリー″の抗原が存在すると利用可能の抗体の
対して結合した抗体が″“競合で追いだされる”程度が
大きくなる。すなわち固相に結合した低濃度の抗原は試
料中の高１度の“フリー″の抗原し相関している。

（注３）　動物は多くの異なった種類のリンパ球（すな
わち特殊な血液あるいは血球細胞）をもち夫々が抗原の
単一の抗原認識部位を探しあてることのできる特別な構
造をもった抗体を産生ずることができる。−たび動物が
抗原に侵されるとその抗原に特異的な抗体を産生ずるリ
ンパ球がその侵入者を征服するために大量の抗体を無数
に分泌することをはじめる（再生産するニクローン化す
る）。これらの抗体は分子構造において同一で全て同じ
クローンをなしてい；そのために″モノクローナル抗体
”と呼ばれている。しかしながら生きた動物ではたとえ
モノクローナル抗体が作られても他の抗原に対する他の
抗体が一緒に必ず存在している。それ故に動物の血液ま
たは血清は“ポリクローナル抗体″と呼ばれる混合体で
しかない。

すなわち異なった（ポリ）−クローンから生じている。

（注４）　ハプテンは特殊な抗体に親和性をもつ小さな
分子である。この場合はコチニンあるいはニコチン。

（注５）　マウスはしばしばモノクローナル抗体を作る
ために使われる。

（注６）免疫沈降法では高いカウントは対象の試料上清
が採取されるウェルにより多くの抗原が結合しているこ
とを意味している。

（注７）″限界希釈”は各ウェルの液の中に１ケのハイ
ブリドーマが存在するように実験者が狙った点に細胞を
含む培養液を希釈することをいう。

（注８）抗ニコチン及び抗コチニン抗体の特異性を決め
るために使われた（Ｓ）−（−）−ニコチン、（Ｓ）−
（−）−コチニン、及び他の化合物は市販のものを購入
したか、または先に報告したようにして合成した（Ｊ、
Ｊ、ラゴーン、■、ファン・フナキス、髪素呈叉仄（１
９１１１２年）賽り出−；Ａ、カストンゲイ、■、ファ
ン・フナキス、１１１週Ｊ【祐工、８４巻、６４１頁（
１９８２年）〕。（Ｒ）−（＋）−ニコチンはニコチン
のエナンチオマーのラセミ混合物を天然の異性体を立体
特異的に分解する微生物のシュードモナス・プチダとイ
ンキュベートすることで調製した［Ｍ、Ｃ，ブトラグリ
ア、Ａ、トメツコ、ＧＦ＠　　　　／４：ヨ血３９巻１
０６７頁（１９８０年）をみよ。］。イリノイ州ペオリ
ア市のアメリカ合衆国農務省のＡ、Ｊ、リヨン博士がこ
の細菌（ＮＲＲＬ　Ｂ−８０６１）を供給した。

（注９）ハプテン誘導体の合成は立体異性の産物の混合
物を生産することに注目せよ。

すなわち、生産されるモノクローナル抗体はこれら未分
離の立体異性体がマウスに投与されるのに使われるから
これら全ての立体異性体に対するものとなる。

（注１０）予備的な実験では、緩衝液中０．２％のカゼ
インを使うと、対照のウェルにおける４９０ｎｍのバッ
クグラウンド吸収は無視でき（０，０５単位以下）、並
行試験での読みは１０％以下にあった。反対にゼラチン
、卵白アルブミン、トリのＩｇＧ、　ＢＳＡ（０，５％
までの濃度で）をカゼインの代りに使うと。

バックグランドは有意に高＜　（Ａ、、。はモノクロー
ナル抗体のないウェルで０．１〜０．３であった）、精
度はよくなかった。

（注目）　　それ故に一つの調製試料は４００，０００
回の分析に使える。また０、３と０．０６＋ａｇの４′
−カルボキシコチニンを使って結合体を作った（データ
は示していない）が、分析感度や抗体価に関して利点は
みられなかった。

（注１２）　　”回収率″は単純に加えられたハプテン
量が最終的に回収されたかどうかを測定することを意味
している。

（注１３）　　”分析的変異係数″′は同じ日に行った
分析結果にみられる偏差の尺度である。

（注１４）　　”分析間変異係数″は別の日に行った分
析結果にみられる偏差の尺度である。

（注１５）　　コチニンはタバコには存在しないがその
唾液における濃度は血しよう中のそれと同じである。

（注１６）　　傾斜の急な阻害曲線（例えば第１図のよ
うな阻害率％に対する抗原量をプロットすることによっ
て得られる）が望ましい。

なぜなら同じ量の抗体に結合するのに曲線が浅い場合に
必彎な抗原よりも少ない抗原で済むことを示している。

この高められた結合がよりよい分析間相関を生んでいる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナルの抗ニコチン４０２Ｃ１０と抗
コチニンの３０５Ｅ５を用い（Ｓ）−（−）−ニコチン
と（Ｓ）−（−）−コチニンについて行われた相方のノ
Ａブテンに対する１′不良ｌ良′すＸブテン−モノクロ
ーナル抗体結合の比較を示す説明図、第２図は、結合体
とＭｃＡｂをコーティングする至適条件を決定する抗ニ
コチン抗体４０２Ｃ１Ｏと抗コチニン抗体３０５Ｅ５と
の結合曲線図、第３図はサンドイツチ法でウサギＩｇＧ
杭コチニンＩｇを使う利点を示す説明図、第４図は［Ｅ
ＬＩＳＡとＲＩＡの相関を示し、（Ａ）は唾液中のニコ
チン、（Ｂ）は唾液中のコチニンを示す説明図である。 特許出願人　ベイラーカレッジオブメデイシン代理人　
弁理士　月　　村　　　　　茂　（外１名）丁−ｍ− ・−μ！粘 ）几２＃）　ソ 、Ｉ−Ｃ！＋− 昂２図 篤３目 ７復水の年］又 篤４０ （Ａ） ＥＬ亀ＳＡ（ＭｃＡｂ） （Ｂ） ＥＬＩＳＡ（Ｍｃ　Ａｂ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ニコチンまたは３′−ヒドロキシメチルニコチン・
   ヘミサクシネートとポリ−Ｌ−リジンを含む結合体に結
   合するモノクローナル抗体。 ２、それがネズミの抗体である特許請求の範囲１のモノ
   クローナル抗体。 ３、それがＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ま
   たはＩｇＧ２ｂである特許請求の範囲１のモノクローナ
   ル抗体。 ４、コチニンまたは４′−カルボキシコチニンとポリ−
   Ｌ−リジンを含む結合体に結合するモノクローナル抗体
   。 ５、それがネズミの抗体である特許請求の範囲４のモノ
   クローナル抗体。 ６、それが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、
   またはＩｇＧ２ｂである特許請求の範囲４のモノクロー
   ナル抗体。 ７、ニコチンまたはコチニンに結合するモノクローナル
   抗体を産生するハイブリドーマを作成し、ニコチンまた
   はコチニンに結合するモノクローナル抗体を分離するこ
   とを含むニコチンまたはコチニンと結合するモノクロー
   ナル抗体を作る方法。 ８、ハイブリドーマがニコチンまたはコチニンの誘導体
   をタンパクの担体と結合し、そのタンパク−ハプテン結
   合体でネズミを免疫し、免疫グロブリン非分泌性のネズ
   ミミエローマ細胞とネズミの脾細胞を融合することによ
   って作られたネズミのハイブリドーマである特許請求の
   範囲７の方法。 ９、誘導体が３′−ヒドロキシメチルニコチン・ヘミサ
   クシネートまたは４′−カルボキシコチニンであり、タ
   ンパク性誘導体がキーホールかさ貝のヘモシアニンであ
   り、さらに生じるハイブリドーマをクローニングしてク
   ローニングしたハイブリドーマをニコチンまたはコチニ
   ン結合性のモノクローナル抗体を分離するに先立って腹
   腔内で生育させる特許請求の範囲８の方法。 １０、特許請求の範囲７、８または９のいずれかの工程
   で作られた方法。 １１、ニコチンまたは３′−ヒドロキシメチルニコチン
   ・ヘミサクシネートとポリ−Ｌ−リジンを含む結合体と
   結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
   。 １２、ネズミのハイブリドーマである特許請求の範囲１
   １のハイブリドーマ。 １３、ミエローマ細胞を抗ニコチン抗体を産生する免疫
   原性細胞と融合することによって作られる特許請求の範
   囲１１のハイブリドーマ。 １４、ニコチンを免疫原性担体分子と結合し、出来た結
   合体で対象の動物を免疫することによって免疫原性細胞
   が作られる特許請求の範囲１３のハイブリドーマ。 １５、担体分子がキーホールかさ貝のヘモシアニンであ
   り動物がマウスである特許請求の範囲１４のハイブリド
   ーマ。 １６、コチニンまたは４′−カルボキシコチニンとポリ
   −Ｌ−リジンを含む結合体に結合するモノクローナル抗
   体を分泌するハイブリドーマ。 １７、ハイブリドーマがネズミのハイブリドーマである
   特許請求の範囲１６のハイブリドーマ。 １８、ミエローマ細胞を杭コチニン抗体を産生する免疫
   原性細胞と融合することによって作られる特許請求の範
   囲１６のハイブリトーマ。 １９、免疫原性の細胞がコチニンを免疫原性の分子と結
   合し、できた結合体を動物に免疫することによって作ら
   れる特許請求の範囲１８のハイブリドーマ。 ２０、担体分子がキーホールかさ貝のヘモシアニンで対
   象動物がマウスである特許請求の範囲１９のハイブリド
   ーマ。 ２１、ニコチンまたは３′−ヒドロキシメチルニコチン
   ・ヘミサクシネートとポリ−Ｌ−リジンを含む結合体と
   結合する薬理学的に有効な量のモノクローナル抗体を生
   体液に加えることを含む動物生体液中のニコチンまたは
   コチニンの存在を測定する方法。 ２２、その測定が非アイソトープ性である特許請求の範
   囲２１の方法。 ２３、その測定が酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ
   ）である特許請求の範囲２２の方法。 ２４、酵素が西洋ワサビのペルオキシダーゼまたはビオ
   チン化したアルカリフォスファターゼでそれが夫々Ｏ−
   フェニレンジアミン基質またはウンベリフェリン燐酸基
   質に作用する特許請求の範囲２３の方法。 ２５、抗体がネズミのモノクローナル抗体である特許請
   求の範囲２１から２４までの方法。 ２６、分析される生体液がヒトの唾液または尿である特
   許請求の範囲２１から２４までの方法。 ２７、分析される生体液がヒトの唾液または尿である特
   許請求の範囲２５の方法。 ２８、分析法がサンドイッチ型固相分析法で３′−ヒド
   ロキシメチルニコチン・ヘミサクシネートとポリ−Ｌ−
   リジンを含む結合体が固相に結合され抗抗体がモノクロ
   ーナル抗体を結合する特許請求の範囲２１から２４まで
   の方法。 ２９、分析法がサンドイッチ型の固相分析で３′−ヒド
   ロキシメチルニコチン・ヘミサクシネートとポリ−Ｌ−
   リジンが固相に結合され、ウサギの抗マウス抗体がネズ
   ミのモノクローナル抗体に結合する特許請求の範囲２５
   の方法。 ３０、杭モノクローナル抗体抗体に結合し、３′−ヒド
   ロキシメチルニコチン・ヘミサクシネートとポリ−Ｌ−
   リジンを含む結合体を固相に結合し、フリーのニコチン
   とモノクローナル抗体を加えることを含むニコチンに対
   する生体液のサンドイッチタイプ固相ＥＬＩＳＡにおい
   てニコチンを結合するモノクローナル抗体を使用する方
   法。 ３１、酵素が西洋ワサビのペルオキシダーゼまたはビオ
   チン化したアルカルフォスファターゼでモノクローナル
   抗体がネズミの抗体で抗モノクローナル抗体抗体がウサ
   ギの杭マウスのものである特許請求の範囲３０の方法。 ３２、コチニンに対する生体液分析においてコチニンと
   ４′−カルボキシコチニン及びポリ−Ｌ−リジンを含む
   結合体と結合する抗体を使用する方法。 ３３、その分析法が非アイソトープ型である特許請求の
   範囲３２の方法。 ３４、その分析法がＥＬＩＳＡである特許請求の範囲３
   ３の方法。 ３５、酵素が西洋ワサビのペルオキシダーゼである特許
   請求の範囲３４の方法。 ３６、抗体がネズミのモノクローナル抗体である特許請
   求の範囲３２から３５の方法。 ３７、分析すべき動物の生体液がヒトの唾液または尿で
   ある特許請求の範囲３２から３５の方法。 ３８、分析すべき生体液がヒトの唾液または尿である特
   許請求の範囲３６の方法。 ３９、分析法がサンドイッチ型固相法で４′−カルボキ
   シコチニンとポリ−Ｌ−リジンが固相に結合され、抗抗
   体がモノクローナル抗体に結合される特許請求の範囲３
   ２から３５までの方法。 ４０、分析法がサンドイッチ型の固相法で４′−カルボ
   キシコチニンとポリ−Ｌ−リジンを含む結合体が固相に
   結合されウサギの杭マウス抗体がネズミのモノクローナ
   ル抗体に結合される特許請求の範囲３６の方法。 ４１、酵素を抗モノクローナル抗体抗体に結合し、４′
   −カルボキシコチニンとポリ−Ｌ−リジンを含む結合体
   を固相に結合し、フリーのコチニンとモノクローナル抗
   体を加えることを含むコチニンの生体液サンドイッチ型
   固相ＥＬＩＳＡ法でコチニンを結合するモノクローナル
   抗体を使う方法。 ４２、酵素が西洋ワサビのペルオキシダーゼまたはビオ
   チン化したアルカルフォスファターゼで、モノクローナ
   ル抗体がネズミの抗体で、抗モノクローナル抗体抗体が
   ウサギの抗マウスのものである特許請求の範囲４１の方
   法。 ４３、ニコチンまたは３′−ヒドロキシメチルニコチン
   ・ヘミサクシネートとポリ−Ｌ−リジンを含む結合体に
   結合するモノクローナル抗体を含む複合体。 ４４、モノクローナル抗体がネズミのモノクローナル抗
   体である特許請求の範囲４３の複合体。 ４５、モノクローナル抗体がＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１
   、ＩｇＧ２ａ、またはＩｇＧ２ｂである特許請求の範囲
   ４３の複合体。 ４６、それに結合する抗モノクローナル抗体抗体を含む
   特許請求の範囲４３から４５までの複合体。 ４７、抗モノクローナル抗体抗体に結合する酵素を含む
   特許請求の範囲４６の複合体。 ４８、抗モノクローナル抗体抗体がウサギの抗マウスの
   ものである特許請求の範囲４６の複合体。 ４９、コチニンまたは４′−カルボキシコチニンとポリ
   −Ｌ−リジンを含む結合体に結合するモノクローナル抗
   体を含む複合体。 ５０、モノクローナル抗体がネズミのモノクローナル抗
   体である特許請求の範囲４９の複合体。 ５１、モノクローナル抗体がＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１
   、ＩｇＧ２ａ、またはＩｇＧ２ｂである特許請求の範囲
   ４９の複合体。 ５２、それに結合される抗モノクローナル抗体抗体を含
   む特許請求の範囲４９から５１までの複合体。 ５３、抗モノクローナル抗体抗体に結合される酵素を含
   む特許請求の範囲５２の複合体。 ５４、抗モノクローナル抗体抗体がウサギの抗マウス抗
   体である特許請求の範囲５２の複合体。 ５５、３′−ヒドロキシメチルニコチン・ヘミサクシネ
   ートとポリ−Ｌ−リジンを含む結合体。 ５６、プラスチックに結合した特許請求の範囲５５の結
   合体。 ５７、それに結合される抗体をもつ特許請求の範囲５５
   または５６の結合体。 ５８、それと結合される酵素をもつ特許請求の範囲５７
   の結合体。 ５９、抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲
   ５７の結合体。 ６０、４′−カルボキシコチニンとポリ−Ｌ−リジンを
   含む結合体。 ６１、プラスチックに結合した特許請求の範囲６０の結
   合体。 ６２、それに結合される抗体をもつ特許請求の範囲６０
   または６１の結合体。 ６３、それと結合される酵素をもつ特許請求の範囲６２
   の結合体。 ６４、抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲
   ６２の結合体。 ６５、結合体を固相に結合し、フリーのニコチンと抗体
   を同時に加え、結合される抗体の量を定量するステップ
   を含む固相競合法において３′−ヒドロキシメチルニコ
   チン・ヘミサクシネートとポリ−Ｌ−リジン結合体を使
   う方法。 ６６、抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲
   ６５の方法。 ６７、抗体がウサギの抗血清の中にあるものであり、抗
   体の添加ステップがウサギの抗血清を加えることによっ
   てなされる特許請求の範囲６５の方法。 ６８、抗体に結合され基質に対して作用する酵素が結合
   した抗体の量を定量するために使われる特許請求の範囲
   ６５または６７の方法。 ６９、結合体を固相に結合し、フリーのニコチンと抗体
   を同時に添加し、結合した抗体量を定量するステップを
   含む固相競合法において４′−カルボキシコチニン・ヘ
   ミサクシネートとポリ−Ｌ−リジンの結合体を使う方法
   。 ７０、抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲
   ６９の方法。 ７１、抗体がウサギの抗血清中にあるもので抗体の添加
   ステップがウサギの抗血清を加えることによってなされ
   る特許請求の範囲６５の方法。 ７２、抗体と結合され基質に作用する酵素が結合した抗
   体の量を測定するために使われる特許請求の範囲６９ま
   たは７１の方法。 ７３、固相にポリペプチドを結合するときハプテンの官
   能基が抗体との結合に利用できるよう残されているよう
   にハプテンに結合されたポリペプチドを含む結合体。 ７４、ポリペプチドがポリ−Ｌ−リジンでハプテンが４
   ′−カルボキシコチニンまたは３′−ヒドロキシメチル
   ニコチン・ヘミサクシネートである特許請求の範囲７３
   の結合体。