FI119990B - N-peptidin kerrosimmuunimääritysmenetelmä - Google Patents

N-peptidin kerrosimmuunimääritysmenetelmä Download PDF

Info

Publication number
FI119990B
FI119990B FI955894A FI955894A FI119990B FI 119990 B FI119990 B FI 119990B FI 955894 A FI955894 A FI 955894A FI 955894 A FI955894 A FI 955894A FI 119990 B FI119990 B FI 119990B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
monoclonal antibody
hanp
peptide
amino acid
recognizes
Prior art date
Application number
FI955894A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI955894A (fi
FI955894A0 (fi
Inventor
Yoshito Numata
Hidehisa Asada
Keiji Dohi
Takahiro Fukunaga
Yasushi Taniguchi
Original Assignee
Shionogi & Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi & Co filed Critical Shionogi & Co
Publication of FI955894A0 publication Critical patent/FI955894A0/fi
Publication of FI955894A publication Critical patent/FI955894A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI119990B publication Critical patent/FI119990B/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
    • G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808—Automated or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/829—Blood

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

N-peptidin kerrosimmuunimäärityömenetelmä - Sandwich-immun-analys för N-peptid 5 Keksinnön tausta 1. Keksinnön ala
Keksintö liittyy sydämen vajaatoiminnan ja kroonisen munuaisten vajaatoiminnan kliiniseen diagnosointiin käyttökelpoisen N-peptidin määritysmenetelmään, joka on nopea ja 10 helppokäyttöinen, tässä menetelmässä käytettävään mono- klonaaliseen vasta-aineeseen, ja tätä monoklonaalista vasta-ainetta tuottavaan hybridoomaan.
2. Tekniikan tason kuvaus 15 Humaanieteispeptidiä (hANP) syntyy elimistössä peptidinä, joka sisältää 126 aminohappoa ja josta käytetään nimitystä hANP(126) (γ-hANP). Tämä γ-hANP kerääntyy eteisjyväsiin ja sitä erittyy vasteena eteisestä tulevalle paineärsykkeelle. Tällöin γ-hANP pilkkoutuu hANP(1-98):ksi (N-peptidi) ja 20 hANP(99-126):ksi (a-hANP) ja vapautuu samanaikaisesti ve reen .
a-hANP:n pitoisuus veressä heijastaa sydämen toimintakuntoa • · · · ja se toimii markkerina sydämen vajaatoiminnassa ja krooni- • · · 25 sessa munuaisten vajaatoiminnassa, ja diagnostisiin tarkoi- • · · tuksiin on jo käytetty a-hANP:n immuunimääritystä. Immuuni- • · · !**/ määrityksessä on kuitenkin joitain haittapuolia. Määrityk- • · · :·· : seen tarvitaan esimerkiksi hyvin pitkää reaktioaikaa (3 päi- • · · :.· * vää) ja a-hANP:n immunologinen aktiivisuus pienenee huomat- 30 tavasti näytteen talteenotto- ja varastointitoimenpiteiden ’•'•S aikana siitä syystä, että α-hANP on pysymätön veressä [tätä on käsitelty julkaisussa Tsuji, T., et ai., Clin. Chim. Acta 225 (1994) 171 - 177] . Tästä poiketen on N-peptidi o;-hANP:tä • · *.,I stabiilimpi ja sitä poistuu verestä vähemmän kuin a-hANP:tä, : : ··· 35 jonka konsentraatio kiertävässä veressä on suun. Näiden • · · :#t : syiden johdosta on kehitetty N-peptidin immuunimääritys.
• · • · ♦ ♦ · ♦ • ♦ 2
Aikaisemmin on raportoitu, että sellaisen N-peptidin immuunimääritys, joka on edellä mainitun 7~hANP:n N-terminaalinen peptidi, on käyttökelpoinen sydämen vajaatoiminnan ja kroonisen munuaisten vajaatoiminnan diagnosoinnissa [tätä 5 kysymystä on käsitelty julkaisuissa Sundsfjoed, J.A., et ai., J. Clin. Endocrionol. Metab. 66 (1988) 605 - 610; Itoh, H., et ai., J. Clin. Endocrinol. 67 (3) (1988) 429 - 437;
Burckley, M.G., et ai., Clin. Sei 77 (1989) 573 - 579; ja
Burckley, M.G., et ai., Clin. Chim. Acta 191 (1990) 1-14], 10 Kaikki aiemmin raportoidut N-peptidin immuunimääritykset perustuvat kompetitiivisiin radioimmuunimääritys (RIA) -menetelmiin, joissa käytetään yhden tyyppistä vasta-ainetta. Tämän johdosta menetelmien käyttöön vaaditaan pitkää aikaa (3 - 4 päivää), rajoitetulla alueella (noin 4 °C) 15 olevia lämpötilaolosuhteita ja/tai monimutkaista suoritusta (toisin sanoen eristämistä Sep-pak C-18:lla), joka vaatii veriplasman esikäsittelyä [tätä on käsitelty julkaisuissa Sundsfjoed J.A., et ai., edellä; ja Burckley, M.G., et ai., (1990), edellä]. Tämän lisäksi kaikissa näissä immuuni-20 määrityksissä on ongelmia, kuten vähäinen tarkkuus ja heikko toistettavuus. Täten on ollut tarvetta kehittää N-peptidin nopea ja helppokäyttöinen määritysmenetelmä.
• · · • · · ·
Keksinnön yhteenveto 25 Tämän keksinnön mukainen N-peptidin tai sen prekursorin mää- • · · ritysmenetelmä sisältää vaiheet, jotka ovat: inkuboidaan • · · *’1.1 seosta, jota sisältää näytettä ja N-peptidin tunnistavaa • · · ··· · ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta; lisätään seokseen • · · ' • · · *·1 ' N-peptidin tunnistavaa leimalla varustettua toista mono- 30 klonaalista vasta-ainetta, minkä jälkeen seoksen inkubointia jatketaan; ja havaitaan tulokseksi saatu antigeeni-vasta- • · ♦ :: : ainekompleksi seoksesta.
: nistavaa ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta ja · · • · *..1^ Vaihtoehtoisesti tämän keksinnön mukainen N-peptidin tai sen • · Ύ 35 prekursorin määritysmenetelmä sisältää vaiheet, jotka ovat: »·· * inkuboidaan seosta, joka sisältää näytettä, N-peptidin tun- • · 3 leimalla varustettua N-peptidin tunnistavaa toista mono-klonaalista vasta-ainetta, ja havaitaan tulokseksi saatu antigeeni-vasta-aine-kompleksi seoksesta.
5 Yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa ensimmäinen tai toinen monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa N-peptidin aminohapposekvenssin asemasta 43 asemaan 66 ulottuvan osan.
Vielä yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa ensimmäinen 10 tai toinen monoklonaalinen vasta-aine on 7B6.
Vielä yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa toinen ensimmäisestä tai toisesta monoklonaalisesta vasta-aineesta on 7B6 ja toinen on monoklonaalinen vasta-aine, joka tun-15 nistaa N-peptidin aminohapposekvenssin ja jonka tunnistuskohta poikkeaa 7B6:n tunnistuskohdasta.
Vielä yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa toinen ensimmäisestä tai toisesta monoklonaalisesta vasta-aineesta 2 0 tunnistaa N-peptidin aminohapposekvenssin asemasta 43 ase maan 66 ulottuvan osan ja toinen N-peptidin aminohappo-sekvenssin asemasta 1 asemaan 25 ulottuvan osan.
• · · • · « ·
Vielä yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa toinen • · · 25 monoklonaalinen vasta-aine on KY-ANP-III.
• · · • · · • · • * • · * • · ·
Vielä yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa ensimmäinen • · · ••j · monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa N-peptidin amino- i · · • happosekvenssm asemasta l asemaan 25 ulottuvan osan ja toi- 30 nen monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa N-peptidin amino- !.·.· happosekvenssin asemasta 43 asemaan 66 ulottuvan osan.
• · ·
Vielä yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa ensimmäinen • · *..! monoklonaalinen vasta-aine on KY-ANP-III ja toinen on 7B6.
: : ·;· 35 • · · ·’ Vielä yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa toinen monoklonaalinen vasta-aine varustetaan radioisotooppileimal- 4 la, entsyymileimalla, kolloidikultaleimalla, fluorisoivasta yhdisteestä muodostuvalla leimalla tai luminesoivasta yhdisteestä muodostuvalla leimalla.
5 Vielä yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa toinen monoklonaalinen vasta-aine varustetaan radioisotooppileimal-la tai entsyymileimalla.
Vielä yhden tämän keksinnön kohteen mukaisesti siitä saadaan 10 käyttöön monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa asemasta 43 asemaan 66 ulottuvan N-peptidin aminohapposekvenssin osan.
Yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa monoklonaalinen 15 vasta-aine on 7B6.
Vielä yhden tämän keksinnön kohteen mukaisesti siitä saadaan käyttöön hybridooma, joka tuottaa edellä mainittua mono-klonaalista vasta-ainetta.
20
Yhdessä tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa hybridooma on hiiren hybridooma 7B6 (FERM-BP-4878).
• · · • · · ·
Vielä yhden tämän keksinnön kohteen mukaisesti siitä saadaan • · · ^ · 25 käyttöön N-peptidin tai sen prekursorin immuunimääritys- • · · I testipakkaus, joka sisältää edellä mainittuja monoklonaali- • · · · siä vasta-aineita.
• · • · · • · · • · · · • · · * Kuvatun keksinnön avulla on siten mahdollista saavuttaa 30 edut, jotka ovat (l) se, että keksinnöstä saadaan käyttöön ϊ.ί.· N-peptidin ja sen prekursorin kerrosimmuunimääritysmenetel- mä, joka menetelmä on erittäin käyttökelpoinen sydämen vajaatoiminnan, munuaisten vajaatoiminnan ja jonkin muun ve- *..! renkiertojärjestelmään vaikuttavan taudin diagnosoinnissa,· > : ”* 35 (2) se, että siitä saadaan käyttöön kyseisessä menetelmässä '•S ’ käytettävä monoklonaalinen vasta-aine; (3) se, että siitä saadaan käyttöön monoklonaalista vasta-ainetta tuottava • · 5 hybridooma ja (4) se, että siitä saadaan käyttöön tätä mono-klonaalista vasta-ainetta sisältävä N-peptidin tai sen pre-kursorin immuunimääritystestipakkaus.
5 Nämä ja muut tämän keksinnön edut ovat alan ammattimiehelle ilmeisiä näiden tutustuttua ja ymmärrettyä seuraavan yksityiskohtaisen selityksen käyttämällä apuna keksinnön liitteenä olevia piirroksia.
10 Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio IA on esitys tunnetun monoklonaalisen vasta-aineen KY-ANP-III reagoivuudesta N-peptidi(1-25):n ja N-peptidi(43-67):n kanssa.
15 Kuvio IB on esitys tämän keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen 7B6 reagoivuudesta N-peptidi(1-25):n ja N-pep-tidi(43-67):n kanssa.
Kuvio 2 on esitys tämän keksinnön mukaisen kerros-RIA:n 20 standardikäyrästä.
Kuvio 3 on esitys kliinisillä näytteillä tutkitusta laimennuskäyrästä käyttämällä tämän keksinnön mukaista ker-ros-RIA:ta.
• · · • · · :. 25 • · ♦ • · ♦ / 1 Kuvio 4 on esitys standardikäyrästä tämän keksinnön mukai- • ♦ ♦ ··1 · sessa kerros-EIA:ssa.
• ♦ • · · • · · ··· · • · · l.: 1 Kuvio 5 on esitys kliinisillä näytteillä tutkitusta 30 laimennuskäyrästä käyttämällä tämän keksinnön mukaista ker- : ros-EIA:ta.
»·· «I • · · • · ·
Edullisten sovellutusmuotoien kuvaus *..2 Tässä keksinnössä suoritettiin useita tutkimuksia, jotka | ♦ 2 ·;·1 35 tähtäsivät N-peptidin ja sen prekursorin määrittämiseen nopeasti, helposti ja tarkasti. Keksinnön tuloksena valmis- :1·.· tettiin N-peptidin tunnistava monoklonaalinen vasta-aine ja ♦ · 6 konstruoitiin kerrosimmuunimäärityksiä, joissa käytettiin hyväksi kahden monoklonaalisen vasta-aineen yhdistelmää, jotka vasta-aineet tunnistavat kumpikin N-peptidin eri epi-toopit, mitkä seikat yhdessä muodostavat tämän keksinnön.
5
Termi “N-peptidi” tarkoittaa tässä keksinnössä peptidiä, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka ulottuu 7~hANP:n N-terminaalisen osan asemasta 1 asemaan 98. Kun 7-hANP:tä erittyy in vivo -olosuhteissa, niin se pilkkoutuu N-pepti-10 diksi ja o;-hANP:ksi, ja α-hANP sisältää γ-hANPrn aminohappo- sekvenssin asemasta 99 asemaan 126. Termiin “N-peptidin prekursori” sisältyy tässä patenttiselityksessä 7-hANP.
Termi “N-peptidi(X-Y)” tarkoittaa tässä keksinnössä amino-15 happosekvenssiä, joka ulottuu N-peptidin asemasta X asemaan Y. Esimerkiksi termi “N-peptidi(1-25)” tarkoittaa aminohapposekvenssiä, joka ulottuu N-peptidin asemasta l asemaan 25. Termi “N-peptidi(43-66)” tarkoittaa aminohappo- sekvenssiä, joka ulottuu N-peptidin asemasta 43 asemaan 66 20 ja termi “N-peptidi(43-67)” tarkoittaa aminohapposekvenssiä, joka ulottuu N-peptidin asemasta 43 asemaan 67. Termi “N-peptidi(43-66)Cys” tarkoittaa N-peptidin aminohappo- sekvenssiä, jossa N-peptidi (43-66) :n karboksyylipäässä on ”.Y. yksi ylimääräinen kysteiiniryhmä.
• « · :. 25 • · · ’·’·* Termit “N-peptidi” ja “N-peptidin prekursori” tarkoittavat :·: : tässä keksinnössä luonnossa esiintyvää tai kemiallisesti • · : syntetoitua N-peptidiä ja N-peptidin prekursoria, tässä • · · l.: : järjestyksessä ilmoitettuna.
30 : Termi “vasta-aine” tarkoittaa tässä keksinnössä vasta-ainet- • · · ta ja tämän fragmentteja, joihin kuuluvat sellaiset f ragmen-tit kuten vasta-aineen Fab-, Fab’- ja F (ab) 2-fragmentit.
• · · • · • · • · · I · ···* 35 Termi “KY-ANP-lll-vasta-aine”, jonka on valmistanut Nakao,
et ai. (japanilainen julkiseksi tullut patenttijulkaisu NO
2-16 997) , tarkoittaa tässä keksinnössä monoklonaalista • · 7 vasta-ainetta, joka tunnistaa N-peptidi(1-25):sta osan, joka sijaitsee γ-1ιΑΝΡ:η aminohapposekvenssissä asemasta 1 asemaan 25. Monoklonaalista vasta-ainetta tuottava hybridooma on talletettu Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti talle-5 tuslaitokseen Fermentation Research Institute, Agency of
Industrial Science and Technology of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, joka on julkinen talletuslaitos. Talletus tehtiin 18.5.1988 ja sille annettiin talletusnumero FERM BP-1887.
10
Talletus oli elinkykyinen talletushetkellä ja tämän patentin hakijat tulevat korvaamaan sen uudella, mikäli se menettää elinkykynsä.
15 Tämän keksinnön mukaista menetelmää kuvataan seuraavaksi suoritusvaiheiden mukaisessa järjestyksessä. Ellei toisin ole mainittu, voidaan N-peptidin tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta valmistaa ja tätä monoklonaalista vasta-ainetta hyväksi käyttävää kerrosimmuunimääritystä käyttää alan 20 ammattikokemuksen perusteella kyseessä olevaa yleistä menetelmää käyttäen.
(1) Immunisaatio N-peptidin tunnistavan monoklonaalisen vasta-aineen valmis- • « · 25 tamiseksi immunisoidaan eläin asianmukaisella antigeenillä.
• · · / ; Eläimenä voidaan käyttää hiirtä, rottaa tai jotakin muuta • · · :·· · vastaavaa eläintä. Antigeeninä voidaan käyttää aminohappo- • · · ί.ί : fragmenttia, joka on N-peptidin osa. Tästä antigeenistä l.; * tehdään immunisointiin sopiva immunogeeni. Tämän antigeenin 30 käyttämiseksi immunogeeninä voidaan esimerkiksi N-pepti- ::: di(43-66)Cys konjugoida kantajaproteiiniin. Kantaja- ·*·’: proteiinina voidaan käyttää materiaaleja, kuten naudan seerumialbumiinia (BSA) , hemosyaniinia ja naudan tio- • t · globuliinia (BTG) , joiden molekyylipaino on suuri. Konju- | · ···* 35 gointiin voidaan käyttää maleimidiyhdistettä tai tätä vas- :*·*: taavaa yhdistettä. Maleimidiyhdiste on bifunktionaalinen »*·,· silloitusreagenssi, joita ovat sukkinimidyyli-4- (N-male- • · 8 imidometyyli)sykloheksaani-l-karboksylaatti (SMCC), m-male-imidobentsoyyli-N-hydroksisukkinimidiesteri (MBS), sukkin-imidyyli-4-(p-maleimidofenyyli)butyraatti (SMPB) sekä sul-fo-MBS, sulfo-SMCC ja muut näitä vastaavat yhdisteet. Näiden 5 silloitusreagenssien sukkinimidyyliryhmä reagoi primaarisen amiinin kanssa ja reagenssi reagoi vielä tiolien kanssa reagoivalla maleimidilla, mistä muodostuu kovalenttinen sidos kysteiiniryhmän tiolin kanssa. Näin saatu immunogeeni emulgoidaan sopivaan adjuvanttiin, kuten Freundin täydelli- 10 seen adjuvanttiin ja immunisaatio suoritetaan käsittelemällä eläintä tulokseksi saadulla emulsiolla intra-peritoneaalisesti. Eläimelle suoritetaan edullisesti tehosteimmunisointi immunogeeni11a intraperitoneaalisesti, ihonalaisesti tai suonensisäisesti useita kertoja useiden 15 viikkojen välein.
(2) Monoklonaalisen vasta-aineen valmistaminen Hybridooma, joka tuottaa N-peptidin tunnistavaa monoklonaa-lista vasta-ainetta, voidaan valmistaa fuusioimalla perna-20 solu myeloomasoluun. Pernasolu on peräisin eläimestä, joka on edullisesti edellä olevassa kohdassa (1) immunisoitu hiiri. Myeloomasolu on peräisin nisäkkäistä ja se on edul-lisesti hiiren myeloomasolu. Solufuusion aikaansaamiseen voidaan käyttää polyetyleeniglykolia tai jotakin muuta tätä • · · • · · \ . 25 muistuttavaa yhdistettä. Haluttu hybridooma voidaan valikoi- • · · **’;1 da fuusion avulla aikaansaatuja hybridoomia seulomalla ja • · · J.i : kloonaamalla.
• · « · · • · · »·· · • · · ϊ Monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi hybridoomaa vil- 30 jellään in vitro- tai in vivo -olosuhteissa. Hybridoomaa : viljellään edullisesti in vivo -olosuhteissa. Esimerkiksi • · · hybridoomaa injektoidaan hiireen intraperitoneaalisesti sellaisen askitesnesteen aikaansaamiseksi, joka sisältää • · · • monoklonaalista vasta-ainetta. Monoklonaalinen vasta-aine • · » 35 voidaan helposti ottaa talteen ja puhdistaa askitesnesteestä ·1·1; millä tahansa alan ammattikokemuksen mukaisella menetelmäl- : lä.
• · · • · 9 Tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa kerrosimmuuni-määrityksessä, sekä muissa immuunimäärityksissä, kuten kom-petitiivisessa immuunimäärityksessä ja jossakin rauun-5 tyyppisessä kahden vasta-aineen käyttöön perustuvassa immuunimäärityksessä.
(3) Immuunimääritys Tämän keksinnön mukainen immuunimääritys perustuu kerros-10 immuunimääritykseen, joka koostuu vaiheista, jotka ovat: kiinnitetään vasta-aine (ensimmäinen monoklonaalinen vasta-aine) kiinteän faasin pinnalle ja inkuboidaan kiinnitettyä ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta antigeeniä sisältävän näytteen kanssa; lisätään seokseen leimalla varustet-15 tua toista monoklonaalista vasta-ainetta, joka poikkeaa ensimmäisestä vasta-aineesta, ja inkuboidaan tulokseksi saatua seosta; ja havaitaan muodostunut leimalla varustettu antigeeni-vasta-ainekompleksi seoksesta. Tämän keksinnön mukaisessa immuunimäärityksessä voidaan yhtäaikaisesti inku-20 boida näytettä, ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta ja leimalla varustettua toista monoklonaalista vasta-ainetta.
Havaitsemismenetelmän puitteissa sisältää tämän keksinnön ]···. mukainen kerrosimmuunimääritys kerrosradioimmuunimäärityksen • · · I . 25 (RIA), kerrosentsyymi-immuunimäärityksen (EIA), kerros- .* ; fluoroimmuunimäärityksen (FIA), kerroskemiluminesenssi- • · * *·· · immuunimäärityksen (CLIA), kerroskemiluminesenssi-entsyymi- • · · ί.’ · immuunimäärityksen (CLEIA) ja kerrosmääritykseen perustuvan ··· : immuunikromatografisen menetelmän. Voidaan käyttää edulli- 30 sesti RIA:ta ja EIA:ta.
• * · * · · ··· ·*·*: Tämän keksinnön mukainen ensimmäinen monoklonaalinen vasta- aine voidaan immobilisoida kiinteän faasin, kuten mikro- • » « tiitterilevyn, helmen, koeputken, membraanin, suodatin- i · “·’ 35 paperin tai muovisen näytekyvetin pintaan. On erityisen edullista käyttää polystyreenihelmeä.
• · i · · • ·· • · 10 Määritettävät näytteet voivat olla N-peptidiä ja sen pre-kursoria sisältäviä näytteitä, joita ovat veriplasma, seerumi, veri, virtsa ja muut näitä vastaavat näytteet.
5 Tämän keksinnön mukainen toinen monoklonaalinen vasta-aine voidaan varustaa radioisotooppileimalla, entsyymileimalla, fluorisoivasta yhdisteestä muodostuvalla leimalla tai lu-minesoivasta yhdisteestä muodostuvalla leimalla. Leimalla varustaminen voidaan suorittaa millä tahansa alan ammatti-10 kokemuksen perusteella tunnetulla menetelmällä.
Esimerkkejä leimalla varustamisessa käytettävästä radioiso-toopista ovat 14C, 3H, 32P, 125I ja 131I. Edullisessa sovellutusmuodossa voidaan käyttää erityisesti 125I:tä. Nämä 15 radioisotoopit voidaan kiinnittää monoklonaaliseen vasta- aineeseen kloramiini T -menetelmällä, peroksidaasi-menetelmällä, Iodogen-menetelmällä tai Bolton’in ja Hunter’in menetelmällä.
20 Esimerkkejä leimalla varustamisessa käytettävästä entsyymis tä ovat j(?-galaktosidaasi (jSGAL) , alkalinen fosfataasi (ALP) ja piparjuuriperoksidaasi (HRP). Nämä entsyymit voidaan ... kiinnittää monoklonaaliseen vasta-aineeseen Nakane’n mene- «··· telmällä tai Ishikawa et al.’:n menetelmällä (“Enzyme /·,·. 25 Immunoassay”, Ishikawa, E., et ai., 3rd ed. 1987, • · « .* I' Igakushoin, p. 75 - 127) .
* · · ··« · * * ♦ « ·
Esimerkkejä leimalla varustamisessa käytettävästä • · · ·* * fluorisoivasta yhdisteestä ovat fluoreskeiini, fluoresk- 30 amiini, fluoreskeiini-isotiosyanaatti ja tetrametyyli- ί.:.1 rodamiini-isotiosyanaatti.
• · · « · · • · · .·*·. Esimerkkejä leimalla varustamisessa käytettävästä lumine- • · soivasta aineesta ovat lusiferiini, luminolijohdannaiset ja *!* 35 akridiniumesteri.
♦ f· * · · • · * :\j Leimalla varustamiseen voidaan käyttää kolloidista kultaa.
11
Edullisessa sovellutusmuodossa voidaan suorittaa N-peptidi-kerros-RIA. N-peptidi-kerros-RIA suoritetaan yksityiskohdittain seuraavasti: lisätään helmi, johon ensimmäinen monoklonaalinen vasta-aine on immobilisoitu, N-peptidi-5 standardiliuokseen tai näytteeseen, ja tulokseksi saatua seosta inkuboidan 1-4 tuntia, edullisesti 2 tuntia, lämpötilassa, joka on 4 - 45 °C ja edullisesti 25 - 37 °C. Tämä on ensimmäinen käytettävä reaktio. Helmi pestään ja helmeä käsitellään liuoksella, joka sisältää radioisotooppileimal-10 la, kuten I:lla, varustettua toista monoklonaalista vasta- ainetta. Tulokseksi saatua seosta inkuboidaan 1-4 tuntia, edullisesti 2 tuntia, lämpötilassa, joka on 4-45 °C ja edullisesti 25 - 37 °C. Tämä on toinen käytetty reaktio. Helmi pestään ja helmeen kiinnittyneen antigeeni-vasta-aine-15 kompleksin radioaktiivisuus havaitaan γ-laskijalla N-pepti- din määrän määrittämiseksi.
N-peptidin katsotaan olevan o;-hANP:tä pysyvämpi ja immunologisen aktiivisuuden pieneneminen näytteen talteenoton aikana 20 on vähäistä, joten N-peptidi voidaan myös tutkia seuraavalla määrityksellä, joka ei ole RIA-määritys.
. Toisessa edullisessa sovellutusmuodossa voidaan suorittaa N-
«M
Ί” peptidi-kerros-EIA. N-peptidi-kerros-EIA suoritetaan yksi-
« f I
’· , 25 tyiskohdittain seuraavasti: lisätään helmi, johon ensimmäi- 4 f · '**·* nen monoklonaalinen vasta-aine on immobilisoitu, N- • · ΐ.: ί peptidistandardiliuokseen tai näytteeseen, ja tulokseksi « · h: : saatua seosta inkuboidan 2 tunnin ajan lämpötilassa, joka on • > * ti * 4 - 45 °C ja edullisesti 25 - 37 °C. Tämä on ensimmäinen 30 käytetty reaktio. Helmi pestään ja helmeä käsitellään liuok- • sella, joka sisältää entsyymileimalla, kuten HRP:llä, varus-»·· tettua toista monoklonaalista vasta-ainetta. Tulokseksi • · * « ^ saatua seosta inkuboidaan 2 tunnin ajan lämpötilassa, joka • 4 · * ·' on 4 - 45 °C ja edullisesti 25 - 37 °C. Tämä on toinen käy- s...* 35 tetty reaktio vasta-aine/N-peptidi/vasta-aine-kompleksin muodostamiseksi helmen pintaan. Helmen pintaan pidättynyt : entsyymiaktiivisuus määritetään kolorimetrisesti sellaisen * » 12 spesifisen substraatin avulla, jonka perusteella helmen pintaan pidättynyt N-peptidimäärä voidaan määrittää. Kolori-metrinen määritys voidaan tehdä tavanomaisella spektrofoto-metrillä tai muulla vastaavalla laitteella.
5
Edellä olevan kuvauksen mukaisesti on tämän keksinnön mukainen immuunimääritys kerrosimmuunimääritys, jossa käytetään kahden tyyppisiä vasta-aineita, jotka tunnistavat eri epi-toopit. Tästä syystä tämän keksinnön mukainen kerros-10 immuunimääritys on vain yhden tyyppisen vasta-aineen käyt töön perustuviin tavanomaisiin kompetitiivisiin menetelmiin verrattuna erittäin herkkä sekä huomattavan tarkka, helppokäyttöinen ja nopea.
15 Esimerkit Tämä keksintö kuvataan yksityiskohdissaan sitä kuvaavin esimerkein.
Esimerkki 1: N-peptidi(43-66)Cys:n osan tunnistavan mono- 20 klonaalisen vasta-aineen ja vasta-ainetta tuottavan hybri- dooman valmistaminen A. Immunogeenin valmistaminen ia immunisaatio “II Kerrosimmuunimäärityksellä tapahtuvaa N-peptidin määrittä- « j * * . 25 mistä varten valmistettiin tuonnempana kuvattavalla tavalla 4 I · ***** sellainen N-peptidin osan tunnistava monoklonaalinen vasta- » · · ί.ϊ · aine, jonka tunnistuskohta poikkeaa tunnetusta monoklonaali- • · : sesta vasta-aineesta KY-ANP-III. Antigeeninä käytettiin N- *,· · peptidi (43-66) Cys :ä.
30 • ·*· Ensimmäiseksi liuotettiin 33,5 mg kantajaproteiinina käytet- ♦ ·· .*i*. tävää naudan tioglobuliinia (BTG, saatavissa Sigma-yhtiöstä) 5 ml:aan puskuri A:ta. Seokseen lisättiin sitten 1,2 ml • · « • ·* puskuri A:ta, joka sisälsi 10,5 mg sulfosukkinimidyyli-4-(N- 35 maleimidometyyli)-sykloheksaani-l-karboksylaattia (sulfo- ·*·*· SMCC, saatavissa Pierce-yhtiöstä) . Tulokseksi saadun seoksen .\J annettiin reagoida 30 °C:ssa 1 tunnin ajan, mistä saatiin • · 13 BTG:n maleimidijohdannaista. Reaktioseos pipetoitiin Sephadex G-25 -kolonniin (Pharmacia), joka oli tasapainotettu 0,1 M fosfaattipuskurilla (pH 6,0) (puskuri B), ja talteen koottiin kolonnin ulkoista tilavuutta vastaavat frak-5 tiot, jotka sisälsivät BTG:tä, joka sisälsi siihen kiinni tettyä maleimidia. Seuraavaksi lisättiin 2,6 ml:aan puskuri B:tä, joka sisälsi 6 mg BTG:n maleimidijohdannaista, 0,4 ml puskuri B:tä, joka sisälsi 3,3 mg N-peptidi(43-66)Cys:ä (Peptide Institute, Inc.) sekä 2,5 mM EDTAra, ja seoksen 10 annettiin reagoida 4 °C:ssa 20 tunnin ajan. Tämän jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseen 40 μΐ 50 mM N-etyylimaleimidia. Näin saatu reaktioseos pipetoitiin Sephadex G-50 -kolonniin (Pharmacia), joka oli tasapainotettu puskuri B:llä ja kolonnin ulkoista tilavuutta vastaavat 15 fraktiot koottiin talteen muuttumattomana pysyneen peptidin poistamiseksi. Talteen otetut fraktiot dialysoitiin vettä vastaan 4 °C:ssa yön yli ja ne lyofilisoitiin. Tulokseksi saatiin 10,9 mg (kuivapaino) N-peptidi(43-66)Cys-BTG-konju-gaattia, ja sitä käytettiin immunogeeninä seuraavasti.
20
Immunisaatio suoritettiin antamalla intraperitoneaalisesti 100 μg konjugaattia yhtä BALB/c hiirtä kohti. Tehoste- immunisointi tehtiin kolme kertaa 3 tai 4 viikon välein. En- ·;* simmäisen ja toisen immunisoinnin yhteydessä konjugaattia • · · · j’j*; 25 annettiin Freudin täydellisen adjuvantin kanssa.
• · • · · • · · ; B. 7B6-vasta-ainetta tuottavan hybridooman valmistus ia 7B6- • · · !*V vasta-aineen valmistus hybridoomaa käyttäen i * * 8
Pernasolu (1,1 x 10 ), joka saatiin edellä kuvatussa kohdassa • · · * · · * 30 A immunisoidusta hiirestä kolmantena päivänä viimeisen immunisoinnin jälkeen, fuusioitiin hiiren myeloomasoluun (P3-Ul-X63-Ag8) , Tokyo Shuryu Research Institute, 2,1 x 107) • · · : käyttäen 50-%:ista polyetyleeniglykoli 4000:a (Merck). Näin ·*·’; suoritetulla fuusioinnilla saatu hybridooma saatiin käyttä- • · .**·. 35 mällä selektiomediumia, joka sisälsi hypoksantiinia, amino- • · · pteriiniä ja tymidiiniä. 10. päivänä solufuusion jälkeen • · · *·* ‘ seulottiin esiin hybridooma, joka tuotti spesifistä vasta- • ♦ · • ·· • « 14 ainetta. Seulonnassa käytetty EIA suoritettiin seuraavasti: kuhunkin 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn (Nunc) kuoppaan lisättiin 50 μΐ PBS:ää [fosfaattipuskuri (pH 7,4), joka sisältää 0,15 M NaCl], joka sisälsi 1 μg N-peptidi(43-67):ää 5 (Peptide Institute, Inc.), tai N-peptidi(1-25):ttä (Peptide
Institute, Inc.), ja kuoppien annettiin sitoa peptidit pintaansa pitämällä kutakin kuoppaa 4 °C:n lämpötilassa yön yli. Tämän jälkeen kuopat pestiin kerran liuoksella, joka sisälsi 25 % Block Ace’a (Dainippon Pharmaceutical Co., 10 Ltd.) ja 300 μΐ tätä liuosta lisättiin kuoppiin reagoivien kohtien saattamiseksi reagoimattomiksi. Tämän jälkeen kuopat pestiin kolme kertaa PBStllä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä, ja kuoppiin lisättiin 50 μΐ hybridooman viljelmä-supernatanttia ja seoksen annettiin reagoida huoneen lämpö-15 tilassa 2 tunnin ajan. Tämän jälkeen kuopat pestiin kolme kertaa, kuoppiin lisättiin 50 μΐ 25-%:ista Block Ace -liuosta, joka sisälsi 5 μg HRP-leimalla varustettua anti-hiiri-IgG:tä, ja näin saadun seoksen annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Kuopat pestiin kolme kertaa ja 20 kuoppiin lisättiin 50 μΐ liuosta, joka sisälsi 2,2'-atsino- bis(3-etyylibentsotioatsoliini-6-sulfonihappoa), (ABTS, Boehringer-Mannheim), jonka konsentraatio oli 4 mM, ja H202:ta, jonka konsentraatio oli 2 mM, jota käyttäen suori-tettiin HRP-reaktio kuopissa huoneen lämpötilassa 15 minuu-: 25 tin ajan. Reaktio pysäytettiin sitten lisäämällä seokseen :V: 50 μΐ 0,002-%:ista NaN3-liuosta. Kunkin kuopan absorbanssi : määritettiin 415 nm:n kohdalta mikrotiitterilevyjen luku- • ·· · • laitteella (MTP-32, Corona) .
• · · · • · · • · · • · · 30 Niissä kuopissa olevat hybridoomat, jotka osoittautuivat antavan positiivisen reaktion monoklonaalisten vasta-ainei- • · · den tuoton suhteen, kloonattiin kolme kertaa rajalaimennok- • · · ’·’ * sella, minkä avulla saatiin hybridoomia, jotka tuottivat N- • · · \ peptidi(43-66):n tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita.
• · · : : 35 • · ·
Hybridoomien tuottamien vasta-aineiden alaluokka määritet- • · # I . tiin käyttämällä hybridoomien viljelmäsupernatanttia. Tähän • « · • · · • · 15 määritykseen käytettiin hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden isotyyppien määritysreagenssipakkausta (Amersham Corp.). Uudelle saadulle monoklonaaliselle vasta-aineelle annettiin nimitys 7B6, ja tämä kuului isotyyppiin IgGj(k) .
5
Tunnetun monoklonaalisen vasta-aineen KY-ANP-III (IgG^) ja uuden monoklonaalisen vasta-aineen 7B6 reagoivuudet useiden erilaisten N-peptidifragmenttien kanssa varmistettiin edellä mainitulla EIA-menetelmällä. KY-ANP-III:nä käytettiin hybri-10 dooman PERM BP-1887 tuottamaa monoklonaalista vasta-ainetta.
Tulokset on esitetty kuviossa 1. Tässä kuviossa O esittää reagoivuutta N-peptidi(1-25):n kanssa ja · esittää rea-goivuutta N-peptidi(43-67):n kanssa. KY-ANP-III reagoi N-peptidi(1-25):n kanssa mutta ei N-peptidi(43-67):n kanssa 15 (kuvio IA) . Tästä poiketen 7B6-vasta-aine reagoi N-pep tidi (43-67):n kanssa, mutta ei N-peptidi(1-25):n kanssa (kuvio IB). Näin varmistettiin, että nämä kaksi vasta-ainetta tunnistavat kumpikin erikseen N-peptidin eri osat, mikä merkitsee sitä, että KY-ANP-III-vasta-aine tunnistaa N-pep-20 tidin aminohapposekvenssin osan 1-25 ja 7B6-vasta-aine tunnistaa N-peptidin osan 43 - 66.
Tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta 7B6 tuottava hybridooma talletettiin Budapestin sopimuksen ehto- : 25 jen mukaisesti talletuslaitokseen National Institute of • 11
Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial • · • Science and Technology of 1 - 3, Higashi l-chome, Tsukuba- • ·1 · : shi, Ibaraki, joka on julkinen talletuslaitos. Talletus .···, tehtiin 9.11.1994 ja sille annettiin hakunumero FERM BP- • « · 30 4878.
• m · **j·1 Talletus oli talletushetkellä elinkykyinen ja keksinnön • · · *♦1 ’ hakijat korvaavat sen, mikäli se menettäisi elinkykynsä.
•« · • · · • · • · • · · • · • ·
IM
• · · • I » • · ·
Il • · · • · 16
Esimerkki 2: Monoklonaalisen vasta-aineen 7B6 puhdistus hiiren askitesnesteestä
Kaksi viikkoa sen jälkeen, kun hiiriin (BALB/c) oli annettu intraperitoneaalisesti 0,5 ml pristaania, annettiin kuhunkin 5 hiireen intraperitoneaalisesti noin 1 x 107 esimerkissä 1 saatua hybridoomaa. Askitesneste koottiin talteen 7. ja 10. päivänä hybridoomien antamisesta ja se sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 10 000 x g.-n voimalla. Supernatantista tehtiin sitten kaksinkertainen laimennus PBS:ään ja tämä 10 pipetoitiin Proteiini G Sepharose -kolonniin (Pharmacia).
Kolonni pestiin PBS:llä. Seuraavaksi kolonni eluoitiin 0,2 M glysiini-HCl-puskurilla (pH 2,7) ja eluaatti neutraloitiin välittömästi 1 M Tris-puskurilla. Eluaatille suoritettiin ulossuolaus 50-%:isesti kylläisellä ammoniumsulfaatilla 15 0 °C:ssa. Saostuma koottiin talteen sentrifugoimalla 20 mi nuutin ajan 10 000 x g:n voimalla. Näin saatu saostuma liuotettiin PBS:ään ja seos dialysoitiin PBS:ää vastaan 4 °C:ssa yön yli, mistä saatiin puhdistettuja monoklonaalisia 7B6-vasta-aineita.
20
Esimerkki 3: Sellaisten helmien valmistus, noiden pinnalle on immobilisoitu KY-ANP-III:a
Polystyreenihelmet (Immunochemical), joita oli käsitelty etukäteen vesipitoisella l-%:isella glutaarialdehydi-:T: 25 liuoksella, peitettiin vasta-aineliuoksella, joka sisälsi 25 /xg/ml KY-ANP-III vasta-ainetta (yksi helmi/200 μΐ) ja • · • joka oli valmistettu 0,05 M fosfaattipuskuriin (pH 7,1) . KY- • ·· · : ANP-III vasta-aine, joka on N-peptidi (1-25) :n tunnistava • · · ,···] monoklonaalinen vasta-aine, saatiin viljelemällä tätä vasta- • · · 30 ainetta tuottavaa hybridoomaa (FERM BP-1887:ää). Poly- . styreenihelmien ja KY-ANP-III vasta-aineen seosta ravistel- • · · *···* tiin 25 °C:ssa 3 tunnin ajan ja vielä 4 °C:ssa vähintään • · · m* m* • · · V ’ 19 tunnin ajan. Vesipitoinen osa seoksesta poistettiin imul- la ja polystyreenihelmet pestiin 0,05 M fosfaattipuskurilla • · .*·*. 35 (pH 7,1). Tämän jälkeen helmiin lisättiin 0,05 M fosfaatti- • · · puskuria (pH 7,1), joka sisälsi 25-%:ista Block Ace’a, rea- • · · *;* [ goivien kohtien tekemiseksi reagoimattomiksi käsittelemällä • · · • ·· • · 17 seosta 4 °C:ssa ainakin 40 tunnin ajan, mistä saatiin helmiä, joiden pintaan KY-ANP-III-vasta-aine oli immobilisoitu-nut. Näin saadut helmet säilöttiin 0,1 M fosfaattipuskuriin (pH 6,5), joka sisälsi 0,15 M natriumkloridia, 0,1 % BSA:ta, 5 1 mM EDTA:a ja 0,1 % natriumatsidia.
Esimerkki 4: 7B6-vasta-aineen varustaminen radioaktiivisella iodi (125I) -leimalla
Puhdistettu 7B6-vasta-aine varustettiin 125I-leimalla klora-10 miini T -menetelmällä seuraavasti:
Lasista valmistettuun koeputkeen pipetoitiin ensin 100 μΐ 0,5 M fosfaattipuskuria (pH 7,5) ja 2 mCi/20 μΐ Na125l:tä (Amersham Corp.). Lasista valmistettuun koeputkeen lisättiin 15 sitten 60 μΐ PBS:ään valmistettua 7B6-vasta-aineliuosta, jossa vasta-aineen konsentraatio oli 3,3 mg/ml, ja 20 μΐ
0,5 M fosfaattipuskuriin (pH 7,5) valmistettua kloramiini T
-liuosta, jonka konsentraatio oli 1 mg/ml, ja koeputkea sekoitettiin. Seoksen annettiin reagoida huoneen lämpötilas- 20 sa 30 sekuntia ja reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseeen 2 0 μΐ 0,1 M fosfaattipuskuriin (pH 7,5) valmistettua natriumpyrosulfiittiliuosta, jonka konsentraatio oli 2,5 mg/ml. Reaktioseokseen lisättiin sitten 20 μΐ vesi- ./A’ pitoista kaliumjodidiliuosta, jonka konsentraatio oli • · · : 25 50 mg/ml, seos pipetoitiin Superose 12 -kolonniin
ϊ^: (1 x 30 cm) (Pharmacia) ja kolonnia eluoitiin 0,1 M
• :*: fosfaattipuskurilla (pH 7,0), mistä saatiin 125I-leimalla • ·· · : varustettua 7B6-vasta-ainetta sisältäviä fraktioita.
··· · • ·♦ • · · ♦ ♦ ·
30 Esimerkki 5: Kerros-RIA
Valmistettiin standardiliuoksia, jotka sisälsivät N-pepti- • · · '.V. di(l-67):n (Peptide Institute, Inc.) konsentraatiosarjoja.
• · » • ♦ · *. Kuhunkin ennakolta määrättyyn lukumäärään koeputkia pipetoi- • · · • tiin viisikymmentä mikrolitraa standardiliuosta tai näytet- 35 tä. Seuraavaksi kuhunkin koeputkeen lisättiin 250 μΐ puskuri ..j.. C:tä, joka on 0,1 M fosfaattipuskuri (pH 6,5), joka sisältää • · · ! . 0,15 M natriumkloridia, 0,1 % BSA:ta, 1 mM EDTA:a ja 0,1 % • · · • · · • · 18
Kathon CG:tä (Rohm & Haas). Kukin esimerkissä 3 valmistetuista KY-ANP-III:11a päällystetyistä helmistä pantiin koeputkeen. Jokaista koeputkea ravisteltiin ravistelu-nopeudella 200 työntöä minuutissa 25 °C:ssa 2 tunnin ajan 5 (ensimmäinen reaktio). Kussakin koeputkessa oleva liuos poistettiin imun avulla ja koeputket pestiin kolme kertaa 2 ml :11a puskuri D:tä (tämä on 0,05 M fosfaattipuskuri (pH 6,5), joka sisältää 1 mM EDTA:a, 0,0075 % Tween 20:a ja 0,1 % Kathon CG:tä). Seuraavaksi suoritettiin toinen reaktio 10 menetellen seuraavasti. Kuhunkin koeputkeen lisättiin 300 μΐ (noin 200 000 cpm) 125I-leimalla varustettua 7B6-vasta-aine-liuosta, joka oli laimennettu 0,1 % BSArta sisältävällä puskuri D:llä, ja koeputkia ravisteltiin ravistelunopeudella 200 työntöä minuutissa 25 °C:ssa 2 tunnin ajan. Koeputkissa 15 oleva liuos poistettiin imun avulla ja koeputket pestiin kolme kertaa 2 ml :11a puskuri D:tä. Kuhunkin koeputkessa olevaan helmeen pidättynyt radioaktiivisuus määritettiin y-laskijalla (ARC-600, Aroca).
20 Yllä mainitusta kerros-RIA:sta saatu standardikäyrä on esi tetty kuviossa 2. Radioaktiivisuus oli verrannollinen N-peptidi(1-67):n konsentraatioon alueella 0 - 5000 fmol/ml. Alhaisin havaittavissa oleva herkkyys oli 40 fmol/ml.
·;· Toistettavuuskoe suoritettiin neljällä ihmisen veriplasma- *»·· :1·’· 25 näyttellä. Toistettavuuskoe suoritettiin menetelmän tarkkuu- den varmistamiseksi. On olemassa kahden tyyppisiä määritys- • · :menetelmiä: määrityksen sisäinen toistettavuustesti tehdään • i · .‘V sen määritysarvojen vaihtelun varmistamiseksi, jota esiintyy J · · *J1.1 yhdellä näytteellä suoritetun yhden testin aikana. Määritys- • · · ** ’ 30 ten välinen toistettavuustesti tehdään sen määritysarvojen vaihtelun varmistamiseksi, jota esiintyy yhdellä näytteellä suoritetuissa useissa testeissä. Taulukoissa 1 ja 2 on esi- • · · V : tetty näiden kahden toistettavuustestin tulokset. Määrityk- sen sisäisessä testissä variaatiokerroin (CV) oli 1,5 - • · • · .···. 35 2,2 % (taulukko l), ja määritysten välisessä toistettavuus- • · *·1 testissä CV oli 4,1 - 5,6 % (taulukko 2) ··· • · · « · · · • · · • · · • · 19
Taulukko 1 Määrityksen sisäinen toistettavuus kerros-RIA:11a
Keskiarvo ± SD CV
Näyte_ n _f mol/ml_ % 5 Ihmisen veri- 10 283 ±4,8 1,7 plasma 1
Ihmisen veri- 10 836 ±12,9 1,5 plasma 2
Ihmisen veri- 10 2364 ±52,5 2,2 10 plasma 3
Ihmisen veri- 10 4232 ± 75,9 1,8 plasma 4
Taulukko 2 15 Määritysten välinen toistettavuus kerros-RIA:11a a
Keskiarvo ± SD CV
Näyte_ n f mol /ml_ %
Ihmisen veri- 7 266±14,9 5,6 plasma 1 20 Ihmisen veri- 7 837 ± 42,4 5,1 plasma 2
Ihmisen veri- 7 2217 ± 93,1 4,2 plasma 3
Ihmisen veri- 7 3780 ± 156,0 4,1 25 plasma 4 ««« ·*·[ a Seitsemän erillistä määritystä suoritettiin kolmena rinnaksi : kaisena määrityksenä 7 päivän kuluessa.
• · ♦ · · *.*.* 30 Seuraavaksi suoritettiin laimennoskoe ihmisen veriplasmalla.
9 · j.» : Neljästä ihmisen veriplasmanäytteestä tehtiin kaksinkertai- • · S;* siä sarjalaimennoksia puskuri C:llä, mistä saatiin määri- :T: tettäviksi lukuisia näytteitä useissa eri konsentraatioissa.
Näin saadut näytteet määritettiin kerros-RIA-menetelmällä . 35 samalla tavoin kuin edellä. Tulokset on esitetty kuviossa 3.
• · ·
Koetulokset osoittavat sen, että kaikilla konsentraatioilla • * · jokainen piste sijaitsee suoralla viivalla, joka kulkee • · t J .* suunnilleen nollapisteen kautta.
• · · 4 Ψ 4 · «·· 40 Seuraavaksi tutkittiin, olisiko veriplasmassa esiintyviksi .·. : katsottavilla komponenteilla vaikutusta kerros-RIA:hän.
• ·· • · 20
Tulokset osoittivat, että sitovaa tyyppiä olevan bili-rubiinin (0,15 mg/ml), vapaata tyyppiä olevan bilirubiinin (0,17 mg/ml), hemoglobiinin (4,25 mg/ml) ja kylomikronien (formatsiinisameus, 24 astetta) vaikutuksia ei havaittu, ja 5 näin ollen näillä komponenteilla ei ollut vaikutusta.
Näin varmistettiin, että N-peptidi voidaan määrittää tämän keksinnön mukaisella kerros-RIA:lla hyvällä tarkkuudella veriplasmassa olevien muiden komponenttien vaikuttamatta 10 määritykseen.
Näiden lisäksi suoritettiin ihmisen veriplasmaa käyttäen saannon määritys, jossa tutkittavaan näytteeseen lisätään standardiainetta. Neljä ihmisen veriplasmanäytettä laimen-15 nettiin kaksinkertaisesti N-peptidi (1-67) -standardiliuoksel- la, joka sisälsi N-peptidiä konsentraatioissa 250, 500 ja 1000 fmol/ml. Näin saadut näytteet määritettiin kerros-RIA:lla samalla tavoin kuin mitä edellä on kuvattu. Tulokset on esitetty taulukossa 3. Lisätyn N-peptidin saanto oli 88 -20 134 %. Näin varmistettiin se, että ihmisen veriplasmassa olevien useiden erilaisten N-peptidien ja N-peptidistandar-din reagoivuudet tämän keksinnön mukaisessa kerros-RIA:ssa ovat keskenään melko samanlaiset.
« ·· 1 >··· * » · t 1 · 444 % 4 · ♦ 4 4 4 4 4 f · t « « «44 4 4 4 114 • 4 4 «·· 4 414 4 · 4 «44 4 4 4 4 4 <44 444 4 4 4 4 4 « 4 · » 4 44 4 4 4 « * 4 • 4 4 4 4 t : 414 4 « 44 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 » 4 21
Taulukko 3
Lisätyn aineen saannon määritys kerros-RIA:11a
Endogeeni- nen N-pep- Lisätty Havaittu tidi määrä määrä a Saanto Näyte (fmol/ml) (f mol/ml)_ (fmol/ml) (%)_ 5 Ihmisen ve- 2216 250 250 100 riplasma 1 2216 500 469 94 2216 1000 1053 105
Ihmisen 2517 250 294 118 veriplasma 2 2517 500 556 111 2517 1000 1104 110
Ihmisen 1868 250 221 88 10 veriplasma 3 1868 500 513 103 1868 1000 998 100
Ihmisen 2282 250 336 134 veriplasma 4 2282 500 515 103 2282 1000 961 96 a endogeenisen N-peptidimäärän ylittävä osa 15
Seuraavaksi määritettiin N-peptidin konsentraatio veriplasmassa 36:11a terveellä koehenkilöllä (23 miespuolista ja 13 naispuolista koehenkilöä) tämän keksinnön mukaista kerros-RIA: ta käyttäen. Tulokseksi saatu keskiarvo oli *:· 20 213 fmol/ml ja keskihajonta 90 fmol/ml.
*«« · » ·· # « · • « · \
Esimerkki 6: 7B6-vasta-aineen varustaminen piparjuuri - j ,·. peroksidaasi (HRP) -leimalla i · » V’.' Puhdistettu 7B6-vasta-aine varustettiin HRP-leimalla • · · » · · "*.* 25 Ishikawa, et al.’:n, supra, menetelmällä seuraavasti: * · · « · ·
Ensimmäiseksi lisättiin PBS:ään valmistettuun puhdistetun '.I.* 7B6-vasta-aineen liuokseen, jonka määrä oli 4,5 ml ja kon- %··
V : sentraatio 4,4 mg/ml, 4,5 ml 0,2 M sitraattipuskuria (pH
% :\\ 30 4,0) ja 0,9 ml 0,2 M sitraattipuskuriin valmistettua pepsii- « i ···, ni (Boehringer-Mannheim) -liuosta, jonka konsentraatio oli ψ m *1* 2,2 mg/ml, ja seosta inkuboitiin 37 °C:ssa 18 tunnin ajan.
f *.· * Tulokseksi saatu pilkkoutunut materiaali erotettiin seokses- * « i « « t M ♦ * 22 ta käyttäen Ultrogel ACA 44:ää (2,6 x 84 cm)(IFB bio- technics), joka oli tasapainotettu 0,1 M fosfaattipuskurilla (pH 7,0). F(ab)2:a sisältävät fraktiot koottiin talteen ja konsentroitiin Centricon 30:llä (Amicon).
5
Seuraavaksi pelkistettiin näin saatu F(ab)2:ta edustava näyte seuraavasti: 1,2 ml:aan 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 7,0), joka sisälsi 3,3 mg F(ab)2:a, lisättiin kymmenesosa tämän tilavuudesta 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 6,0), joka sisälsi 10 0,1 M 2-merkaptoetyyliamiinia ja 5 mM etyleenidiamiinitetra- etikkahappoa (EDTA), ja seoksen annettiin reagoida 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Pelkistettyjä materiaaleja sisältävä seos erotettiin komponentteihinsa Superose 12:11a (1,5 x 50 cm) (Pharmacia) , joka oli tasapainotettu 5 mM EDTA-.aa sisältä-15 väliä 0,1 M fosfaattipuskurilla (pH 6,0) Fab:tä sisältävien fraktioiden aikaansaamiseksi. Fraktiot konsentroitiin Centricon l0:llä (Amicon).
Toisaalta meneteltiin siten, että 17,2 mg:aan HRP:tä 20 (Sigma), joka oli liuotettu 2 ml:aan 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 7,0), lisättiin 23,6 mg e-maleimidokaproyylioksi-sukkinimidiä (EMCS, Dojinkagaku), joka oli liuotettu 250 /xl:aan Ν,Ν-dimetyyliformamidia, ja seoksen annettiin reagoida 30 °C:Ssa 15 minuutin ajan. Näin aikaansaatu saos-25 tuma poistettiin sentrifugoimalla ja supernatantti käsitel- • · : .·. tiin PD-10-kolonnissa (Pharmacia) , joka oli tasapainotettu • · · I1V 0,1 M fosfaattipuskurilla (pH 6,0) pienimolekulaaristen • · · V.' aineiden poistamiseksi, mistä saatiin HRP:n maleimidi- ♦ ♦ · *·1 ’ johdannaista.
30
Saatu HRP: n maleimidi johdannaista sisältävä fraktio ja kon- • · · V : sentroitu Fab yhdistettiin keskenään siten, että HRP:n ja
Fab:n välinen moolisuhde oli 1 : 1, ja niiden annettiin • · ···. reagoida 30 °C:ssa 1 tunnin ajan. HRP-leimalla varustettu * · V 35 Fab erotettiin leimalla varustamattomista materiaaleista • · · käyttäen Superose 12:ta (1,5 x 50 cm), joka oli tasa- • · • · · • 1« • · 23 painotettu 0,1 M fosfaattipuskurilla (pH 6,5). Näin saatiin HRP-leimalla varustettu Fab-fragmentti (0,62 mg).
Esimerkki 7: Kerros-EIA
5 Kuhunkin useista koeputkista pipetoitiin 50 μΐ N-peptidi(l- 67)-standardiliuosta. Kuhunkin koeputkeen lisättiin sitten 250 μΐ puskuri C:tä. Kuhunkin koeputkeen asetettiin kukin esimerkissä 3 valmistetulla KY-ANP-III-vasta-aineella päällystetyistä helmistä. Kutakin koeputkea ravisteltiin hori-10 sontaalisesti ravistelunopeudella 200 työntöä minuutissa 25 °C:ssa 2 tunnin ajan (ensimmäinen reaktio), kussakin koeputkessa oleva liuos poistettiin imun avulla ja koeputket pestiin kolme kertaa 2 ml :11a puskuri D:tä. Seuraavaksi suoritettiin toinen reaktio seuraavasti. Kuhunkin koeputkeen 15 lisättiin 300 μΐ HRP-leimalla varustetun ja 0,1 % BSA:ta sisältävällä puskuri D:llä laimennetun 7B6-vasta-aineen liuosta (200 ng/koeputki) ja koeputkia ravisteltiin horisontaalisesti ravistelunopeudella 200 työntöä minuutissa 25 °C:ssa 2 tunnin ajan. Koeputkissa oleva liuos poistettiin 20 imun avulla ja koeputket pestiin viisi kertaa 2 ml :11a puskuri D: tä. Kuhunkin koeputkeen lisättiin sitten substraatti-liuokseksi 300 μΐ 0,01 M sitraattipuskuria (pH 5,0), joka sisälsi 8,5 mg/ml 2,2' -atsino-bis (3-etyylibentsotiatsoliini- ·«·· 6-sulfonihappoa) (ABTS, Boehringer-Mannheim) ja 2 mMH202:ta, 25 koeputkien annettiin olla paikoillaan 25 °C:ssa täsmälleen • · · \% 30 minuuttia ja kuhunkin koeputkeen lisättiin sitten 2 ml • · · I**.* pysäytysliuosta. Kustakin seoksesta määritettiin absorbanssi • · · ·;;/ 415 nm:n kohdalta spektrofotometrillä (UV-264, Shimadzu | · · ·* * Corporation). Nollakokeena käytettiin tislattua vettä.
30
Edellä mainitusta kerros-EIA:sta saatu standardikäyrä on • · · : esitetty kuviossa 4. Helmen pintaan pidättynyt entsyymi- ··[·. aktiivisuus oli verrannollinen N-peptidi (1-67) :n konsentraa- • ♦ tioon alueella 0 - 5000 f mol/ml. Alhaisin havaittavissa t *1* 35 oleva herkkyys oli 25 fmol/ml. Kolmea ihmisen veri- • · · ; plasmanäytettä käyttäen suoritettiin toistettavuustesti, jonka tulokset on esitetty taulukoissa 4 ja 5. Määrityksen 24 sisäisessä toistettavuustestissä CV oli 1,2 - 4,6 % ja mää ritysten välisessä toistettavuustestissä CV oli 5,9 - 15,0 %.
5 Taulukko 4 Määrityksen sisäinen toistettavuus kerros-EIA:11a
Keskiarvo ± SD CV
Näyte_ n _f mol /ml_ %
Ihmisen veri- 5 204 ±9,5 4,6
10 plasma L
Ihmisen veri- 5 730 ±8,9 1,2
plasma M
Ihmisen veri- 5 2447 ±65,6 2,7 plasma H 15
Taulukko 5 Määritysten välinen toistettavuus kerros-EIA:11a a
Keskiarvo ± SD CV
Näyte_ n _f mol/ml_ % 20 Ihmisen veri- 4 222 ±33,3 15,0
plasma L
Ihmisen veri- 4 787 ±66,1 8,4
plasma M
Ihmisen veri- 4 2511 ± 148,3 5,9
25 plasma H
«Il i : : S· a Neljä erillistä määritystä suoritettiin kahtena rinnak- *.*.· kaisena määrityksenä 4 päivän kuluessa.
• · • · · |··/ 30 Seuraavaksi suoritettiin laimennoskoe käyttäen ihmisen veri- • · · ; plasmanäytteitä. Kaksinkertaiset sarjalaimennokset puskuri *· * C: llä suoritettiin kolmea ihmisen veriplasmanäytettä käyt täen. Näin saadut näytteet määritettiin kerros-EIA:ta käyt- ; : ' täen menetellen esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Tulokset on • · · 35 esitetty kuviossa 5. Koetulokset osoittavat, että missä ;/.t tahansa konsentraatiossa jokainen piste sijaitsee suoralla • · viivalla, joka kulkee suunnilleen nollapisteen kautta.
i : • · · • · * ϊ.ϊ · Näin varmistettiin samalla tavoin kuin esimerkissä 5 se, 40 että N-peptidi voidaan määrittää tämän keksinnön mukaista • · 25 kerros-EIA:ta käyttäen hyvällä tarkkuudella veriplasmassa olevien muiden komponenttien vaikuttamatta tähän.
Tämän lisäksi suoritettiin seokseen lisätyn aineen saannon 5 määritys ihmisen veriplasmaa käyttäen. Neljästä ihmisen veriplasmanäytteestä tehtiin kaksinkertainen laimennos N-peptidi(1-67):n standardiliuoksella, joka sisälsi N-peptidiä konsentraatiosarjoina. Näin saadut näytteet määritettiin kerros-EIA:11a menetellen edellä kuvatulla tavalla. Tulokset 10 on esitetty taulukossa 6. Lisätyn N-peptidin saanto oli 82 - 103 %. Näin varmistettiin se, että ihmisen veriplasmassa olevien useiden erilaisten N-peptidien ja N-peptidistandardin reagoivuus tämän keksinnön mukaisessa kerros-EIA:ssa on keskenään samanlaista.
15
Taulukko 6
Lisätyn aineen saannon määritys kerros-EIA:11a
Endogeeni- nen N- Lisätty Havaittu peptidi määrä määrä a Saanto Näyte_ (fmol/ml) (fmol/ml) (fmol/ml) (%)_ 20 Ihmisen 116 50 50 100
veriplasma L
. 116 125 103 82 • · · 116 250 224 90 I ί'ί ;1 1 Ihmisen 382 250 240 96
25 veriplasma M
• · : .1. 382 500 480 96 • · · • · · · : .·. 382 1250 1232 99 • · · • 1 · » ·;·. Ihmisen 1234 500 504 101
. · veriplasma H
30 1234 1250 1286 103 : 1234 2500 2526 101 • · · • · · * a endogeenisen N-peptidin määrän ylittävä osa * · · \ 35 Tutkittiin 14:stä ihmisen veriplasmanäytteestä saatujen ker- ros-RIA:lla määritettyjen arvojen (X) ja vastaavien kerros- .·!·. EIA: 11a mitattujen arvojen (Y) välistä korrelaatiota. Tämän • · ·
. tulokseksi saatu korrelaatioyhtälö oli Y = 0,79X
• · · 1 132(fmol/ml) ja korrelaatiokerroin R oli 0,99.
26
Alan ammattikokemuksen perusteella tähän keksintöön voidaan sen suojapiiristä ja hengestä poikkeamatta tehdä useita erilaisia muita modifikaatioita, jotka ovat kyseisen kokemuksen perusteella ilmeisiä. Tämän mukaisesti tähän keksin-5 töön liitetyt patenttivaatimukset eivät ole tarkoitettuja rajoittumaan tässä keksinnössä esitettyyn patentti-selitykseen vaan ne on tarkoitettu käsitettäväksi laajassa merkityksessä.
• · » • · · · « · · t · · • · · » · • · · • · * 9 * * · • « » • · · • * · · • · t : : • · · # • · · i : : • · · • · · • · · • · » • · · • · « * I*.'.
• · ^ · • · · t : 9 m » 9 9 9 9 • · · • · · « » « fc ·

Claims (15)

27
1. Menetelmä hANP(l-98):n tai sen prekursorin määrittämiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, jotka ovat: 5 inkuboidaan seosta, joka sisältää näytettä ja hANP(l- 98) :n aminohapposekvenssin osan tunnistavaa ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta; lisätään seokseen leimalla varustettua toista, hANP(l-98):n aminohapon eri osan tunnistavaa monoklonaalista 10 vasta-ainetta, minkä jälkeen inkubointia jatketaan; ja havaitaan seoksesta tulokseksi saatu antigeeni-vasta-aine-kompleksi, tunnettu siitä, että ensimmäinen tai toinen monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa hANP(l-98):n aminohapposekvenssin asemasta 43 asemaan 66 ulottuvan 15 osan.
2. Menetelmä hÄNP(l-98):n tai sen prekursorin mittaami seksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, jotka ovat: . inkuboidaan seosta, joka sisältää näytettä, hANP(l-98):n «·· •••j 2 0 aminohapon sekvenssin osan tunnistavaa ensimmäistä • · · *.* * monoklonaalista vasta-ainetta ja leimalla varustettua, • · toisen, hANP(l-98):n aminohapon sekvenssin eri osan • · ·.· · tunnistavaa toista monoklonaalista vasta-ainetta; ja • · • · · • · · havaitaan seoksesta tulokseksi saatu antigeeni-vasta- • · · * 25 aine-kompleksi, tunnettu siitä, että ensimmäinen tai toinen monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa hANP(l-98):n • · · aminohapposekvenssin asemasta 43 asemaan 66 ulottuvan ··* osan.
·· · • · · *..* 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jolloin • · *···* 30 ensimmäinen tai toinen monoklonaalinen vasta-aine on 7B6, :*·*: tunnettu siitä, että 7B6 tunnistaa hANP(l-98):n aminohapot 43-66. • · 28
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jolloin ensimmäisestä tai toisesta monoklonaalisesta vasta-aineesta toinen on 7B6 ja toinen hANP(l-98):n aminohapposekvenssin osan tunnistava monoklonaalinen vasta-aine, jonka tunnis- 5 tuskohta poikkeaa 7B6:n tunnistuskohdasta, tunnettu siitä, että 7B6 tunnistaa hANP(l-98):n aminohapot 43-66.
5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisestä ja toisesta monoklonaalisesta vasta-aineesta toinen tunnistaa hANP(l-98):n aminohapposek- 10 venssin asemasta 45 asemaan 66 ulottuvan osan ja toinen monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa hANP(l-98):n aminohapposekvenssin asemasta 1 asemaan 25 ulottuvan osan.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen monoklonaalinen vasta-aine on KY-ANP-III ja että
15 KY -ANP-III tunnistaa hANP(l-98):n aminohapot 1-25.
7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa hANP(1-98):n aminohapposekvenssin asemasta 1 asemaan 25 ulottuvan osan ja toinen monoklonaalinen vasta-aine 20 tunnistaa hANP(l-98):n aminohapposekvenssin asemasta 43 asemaan 6 6 ulottuvan osan.
• · · · • · · *.’* 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, jossa ensim- • · •t’/· mäinen monoklonaalinen vasta-aine on KY-ANP-III ja toinen : monoklonaalinen vasta-aine on 7B6, tunnettu siitä, että KY- • · · · • 25 ANP-III tunnistaa hANP(l-98):n aminohapot 1-25 ja 7B6 • * · · aminohapot 43-66.
9. Patenttivaatimuksen 1 tai patenttivaatimuksen 2 mukainen • ·· *.* · menetelmä, tunnettu siitä, että toinen monoklonaalinen • · · ·...· vasta-aine on varustettu radioisotooppileimalla, 30 entsyymileimalla, kolloidikultaleimalla, f luorisoivasta • · • · .···. aineesta muodostuvalla leimalla tai luminesoivasta aineesta • · Ί* muodostuvalla leimalla. • · · • · · • · ·
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen monoklonaalinen vasta-aine on varustettu 35 radioisotoooppileimalla tai entsyymileimalla. • · 29
11. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se tunnistaa hANP(l-98):n aminohapposekvenssin asemasta 43 asemaan 66 ulottuvan osan.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen monoklonaalinen vasta- 5 aine, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on 7B6 ja että 7B6 tunnistaa hANP(1-98):n aminohapot 43-66.
13. Hybridooma, tunnettu siitä, että se tuottaa patenttivaatimuksen 11 tai patenttivaatimuksen 12 mukaista monoklo-naalista vasta-ainetta, jolloin hybridooma on talletusnume- 10 rolla FERM BP-4878 saatu hiiren hybridooma.
14. hANP(1-98):n tai sen prekursorin immuunimääritys- testipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 11 tai patenttivaatimuksen 12 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta.
15 Patentkrav
FI955894A 1994-12-09 1995-12-08 N-peptidin kerrosimmuunimääritysmenetelmä FI119990B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP30645394 1994-12-09
JP30645394 1994-12-09

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI955894A0 FI955894A0 (fi) 1995-12-08
FI955894A FI955894A (fi) 1996-06-10
FI119990B true FI119990B (fi) 2009-05-29

Family

ID=17957191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI955894A FI119990B (fi) 1994-12-09 1995-12-08 N-peptidin kerrosimmuunimääritysmenetelmä

Country Status (8)

Country Link
US (3) US5702910A (fi)
EP (1) EP0721105B1 (fi)
KR (1) KR100375564B1 (fi)
AT (1) ATE180058T1 (fi)
DE (1) DE69509626T2 (fi)
ES (1) ES2131279T3 (fi)
FI (1) FI119990B (fi)
NO (1) NO319913B1 (fi)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003297583B2 (en) * 2002-11-26 2010-01-14 Biocon, Ltd Modified naturetic compounds, conjugates, and uses thereof
US7648962B2 (en) * 2002-11-26 2010-01-19 Biocon Limited Natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof
DE10316583A1 (de) 2003-04-10 2004-10-28 B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft Bestimmung eines midregionalen Proadrenomedullin-Teilpeptids in biologischen Flüssigkeiten zu diagnostischen Zwecken, sowie Immunoassays für die Durchführung einer solchen Bestimmung
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
DE102007010834A1 (de) 2007-03-03 2008-09-04 Brahms Aktiengesellschaft Diagnose und Risikostratifizierung von Herzinsuffizienz für NYHA I Patienten
DE102007022367A1 (de) 2007-05-07 2008-11-20 B.R.A.H.M.S Ag Verfahren zur Bestimmung von aminoterminalen pro-ANP bei übergewichtigen Patienten
EP2180322A1 (en) * 2008-10-22 2010-04-28 BRAHMS Aktiengesellschaft Prognostic biomarkers for the progression of primary chronic kidney disease
JP2014210761A (ja) * 2013-04-05 2014-11-13 株式会社シバヤギ 抗イヌｎ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体ならびにそれを用いた免疫学的測定方法、および免疫学的測定用キット

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4618600A (en) * 1984-04-19 1986-10-21 Biotechnology Research Associates, J.V. Novel polypeptide diuretic/vasodilators
JPH01216997A (ja) * 1988-02-24 1989-08-30 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd 新規セフェム化合物ならびにその製造法
JP2724315B2 (ja) * 1988-02-29 1998-03-09 塩野義製薬株式会社 α−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体およびα−ＡＮＰの免疫学的測定法
GB8815796D0 (en) * 1988-07-02 1988-08-10 Bendix Ltd Gas compressing system
JP2561513B2 (ja) * 1988-07-04 1996-12-11 塩野義製薬株式会社 γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体

Also Published As

Publication number Publication date
ATE180058T1 (de) 1999-05-15
US5827674A (en) 1998-10-27
DE69509626D1 (de) 1999-06-17
DE69509626T2 (de) 2000-01-13
US5859203A (en) 1999-01-12
NO319913B1 (no) 2005-10-03
FI955894A (fi) 1996-06-10
FI955894A0 (fi) 1995-12-08
EP0721105B1 (en) 1999-05-12
ES2131279T3 (es) 1999-07-16
NO954979L (no) 1996-06-10
KR100375564B1 (ko) 2003-05-12
KR960024367A (ko) 1996-07-20
NO954979D0 (no) 1995-12-07
US5702910A (en) 1997-12-30
EP0721105A1 (en) 1996-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2315773C2 (ru) Специфические антитела для диагностики сердечной недостаточности
US5011771A (en) Multiepitopic immunometric assay
US11340239B2 (en) BNP (1-32) epitope and antibodies directed against said epitope
EP0158973B1 (en) Multisite immunometric assay
US20150166656A1 (en) Monoclonal antibodies to gastrin hormone
JP2008513536A (ja) プロガストリンに対するモノクローナル抗体
US10954298B2 (en) Method of obtaining a binder to prepro-vasopressin or fragments thereof
JPH04232462A (ja) アンギオテンシンｉｉの特異的検定のためのキット
FI119990B (fi) N-peptidin kerrosimmuunimääritysmenetelmä
US6201109B1 (en) Assay for bone alkaline phosphatase
KR101338517B1 (ko) 인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도
CA1340391C (en) Monoclonal antibodies against atrial, natriuretic peptides of humans
EP0479929A1 (en) ANALYSIS OF VITAMIN B12.
KR960008672B1 (ko) 심방 나트륨이뇨성 폴리펩티드를 인지하는 단일클론성 항체
JP3778979B2 (ja) Ｎ−ペプチドのサンドイッチ免疫学的測定法
JP4663831B2 (ja) モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法
US5466610A (en) Immunoassays for insulin sensitivity enhancers, insulin sensitivity enhancer antibodies, and non-thiazolidinedione insulin sensitivity enhancer compositions
US7763716B2 (en) Antibody against NPW
JPS61218599A (ja) 黄体形成ホルモンの測定法、測定試薬、これに好適なモノクロナール抗体及びその取得法
Iwasa et al. Highly specific enzyme immunoassay for human chorionic gonadotropin
US6291198B1 (en) Antibody that recognizes pyrazine derivative and method for measuring 1,2-dicarbonyl derivative using said antibody
CN118852400A (zh) C-肽抗原表位肽组合物、抗体组合以及测定人c-肽的试剂盒
WO2015004248A2 (en) Augurin immunoassay
CA2047298A1 (en) Myocardial infarction immunoassay
JPS62122594A (ja) 抗ニコチンと抗コチニン抗体（モノクロ−ナル等）、及びそのニコチンとコチニン測定への使用法

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 119990

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed