NO309483B1

NO309483B1 - Immunologisk bindingspartner og anvendelse av samme

Info

Publication number: NO309483B1
Application number: NO922149A
Authority: NO
Inventors: David R Eyre
Original assignee: Washington Res Found
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1992-05-29
Publication date: 2001-02-05
Also published as: WO1991008478A2; DK0682257T3; DK0682256T3; GR3018852T3; EP1560026A1; DE69034170D1; ATE179521T1; EP0682257B1; AU645049B2; EP0682256B1; NO922149L; IE904344A1; EP0502928A1; DE69034170T2; ATE279730T1; EP1632502A1; IE65280B1; US5473052A; DE502928T1; JP2000050865A

Description

Dette er en delvis fortsettelse av US serie nr. 444 881, registrert 1. desember 1989, som er en delvis fortsettelse av US serie nr. 118 234, registrert 6. november 1987.

Denne oppfinnelse ble gjort med regjeringens støtte under bevilgningene AR37318 og AR36794 gitt av the National Institutes of Health. Regjeringen har visse rettigheter i oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en immunologisk bindingspartner som binder til et peptid inneholdende en 3-hydroksypyridinium kryssbinding avledet fra det aminoterminale telopeptidområde av type I kollagen. Videre vedrører oppfinnelsen anvendelse av en immunologisk bindingspartner for analysering av en prøve for tilstedeværelse av en analytt indikativ for type I kollagendegradering in vivo.

Tre kjente klasser av kollagener er beskrevet til idag. Klasse I kollagenene, oppdelt i typene I, II, III, V og XI, er kjent for å danne fibriller. Disse kollagener syntetiseres alle som prokollagenmolekyler, laget av N-terminale og C-terminale propeptider, som er bundet til kjernekollagenmolekylet. Etter fjerning av propeptidene, som foregår naturlig in vivo under kollagensyntesen, består den gjenværende kjerne av kollagenmolekylet i alt vesentlig av et trippelheliks-område som har terminale telopeptidsekvenser som er ikketrippelheliske. Disse telopeptidsekvenser har en viktig funksjon som seter for intermolekylær tverrbinding av kollagenfibriller ekstracellulært.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelser av immunologisk bindingspartner for påvisning av kollagennedbrytning basert på bestemmelse av spesielle tverrbundede telopeptider produsert in vivo ved kollagennedbrytningen. Tidligere er det blitt utviklet analyser for overvåking av nedbrytning av kollagen

in vivo ved måling av forskjellige biokjemiske markører, hvorav noen har vært nedbrytningsprodukter av kollagen. F.eks. er benomsetningen i forbindelse med Pagefs sykdom blitt overvåket ved måling av små peptider inneholdende hydroksyprolin, som blir utskilt i urinen etter nedbrytning av benkollagen. Russell et al., Metab. Bone Dis. and Rel Res. 4 og 5, 255-262 (1981); og Singer, F.R. et al., Metabolic Bone Disease, Vol. II (utg. Avioli, L.V. og Kane, S.M.), 489-575 (1978),

Academic Press, New York.

Andre forskere har målt tverrbindingsforbindelsen pyridinolin i urin som en indeks for kollagennedbrytning ved leddsykdom. For bakgrunn og f.eks. se Wu og Eyre, Biochemistry, 23:1850 (1984); Black et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 48:641-644 (1989); Robins et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 45:969-973

(1986); og Seibel et al., The Journal of Rheumatology, 16:964 (1989). I motsetning til den foreliggende oppfinnelse har noen tidligere forskere hydrolysert peptider fra kroppsvæsker og deretter sett etter tilstedeværelse av individuelle hydroksypyridiniumrester. Ingen av disse forskere har rapportert måling av et telopeptid inneholdende en tverrbinding som er naturlig frembrakt in vivo etter kollagennedbrytning, som i den foreliggende oppfinnelse.

UK patentsøknad GB 2 205 643 rapporterer at nedbrytningen av type III kollagen i kroppen kan bestemmes kvantitativt ved måling av konsentrasjonen av et N-terminalt telopeptid fra type III kollagen i en kroppsvæske.

Det er mange rapporter som angir at kollagen-nedbrytning kan måles ved kvantifisering av visse prokollagenpeptider. Den foreliggende oppfinnelse involverer telopeptider istedenfor propeptider, idet de to kan adskilles ved sin plassering i kollagenmolekylet og tidspunktet for deres spalting in vivo. Se US patent 4 504 587; US patent 4 312 853; Pierard et al., Analytical Biochemistry 141:127-136 (1984); Niemela, Clin. Chem., 31/8:1301-1304 (1985); og Rohde et al., European Journal of Clinical Investigation, 9:451-459 (1979).

US patent 4 778 768 vedrører en fremgangsmåte for betemmelse av forandringer som foregår i leddbrusk og som medfører kvantifisering av proteoglykanmonomer eller antigeniske fragmenter derav i en prøve av leddvæske. Dette patent vedrører ikke påvisning av tverrbundede telopeptider avledet fra nedbrutt kollagen.

Dodge, J. Clin. Invest., 83:647-661 (1981) beskriver fremgangsmåter for analyse av type II kollagennedbrytning ved anvendelse av et polyklonalt antiserum som spesifikt reagerer med ikke-snodde alfakjeder og cyanogenbromidavledede peptider fra humane og bovine type ll-kollagener. De involverte peptider er ikke tverrbundede telopeptider som i den foreliggende oppfinnelse. Aminosyresekvenser av human type lll-kollagen, human proa1(M)-kollagen, og hele preproa1(lll)-kjeden i human type III kollagen og tilsvarende cDNA-kloner er blitt undersøkt og bestemt av flere grupper av forskere. Se Loidl et al., Nucleic Acids Research 12:9384-9394 (1984); Sangiorgi et al., Nucleic Acids Research, 13:2207-2225 (1985); Baldwin et al., Biochem. J., 262:521-528 (1989); og Ala-Kokko et al., Biochem. J., 260-509-516 (1989). Ingen av disse referanser spesifiserer strukturene av spesielle telopeptidnedbrytningsprodukter som kunne måles for å bestemme mengden av nedbrutt fibrillært kollagen in vivo.

Til tross for den ovenfor beskrevne bakgrunnsinformasjon er det allikevel et behov for effektive og enkle analyser for bestemmelse av kollagennedbrytning

in vivo. Slike analyser kunne anvendes til å påvise og overvåke sykdomstilstander hos mennesker, såsom osteoarthritis (type II kollagennedbrytning), og forskjellige betennelsesforstyrrelser, såsom vasculitis-syndrom (type III kollagennedbrytning).

Analyser for type I kollagennedbrytning, beskrevet i modersøknaden,

US serie nr. 118 234, kan anvendes til å påvise og bestemme benresorpsjon in vivo. Påvisning av benresorpsjon kan være en faktor av interesse ved overvåking og påvisning av sykdommer såsom osteoporose. Osteoporose er den mest vanlige bensykdom hos mennesker. Primær osteoporose, med øket tilbøyelighet til brudd, skriver seg fra et progressivt netto tap av benmasse fra skjelettet. Den blir anslått å påvirke 15-20 millioner mennesker i USA. Dens basis eten aldersavhengig ubalanse i nydanningen av bensubstans, dvs. i hastighetene for syntese og nebrytning av benvev.

Ca. 1,2 millioner osteoporoserelaterte brudd foregår blant eldre hvert år, omfattende ca. 538 000 kompresjonsfrakturer i ryggsøylen, ca. 227 000 hoftebrudd og et betydelig antall av tidligere frakturerte periferale ben. 12 til 20% av hoftebruddene er fatale, fordi de forårsaker alvorlig trauma og blødning, og halvparten av de overlevende pasienter krever omsorg i sykehjem. Samlede kostnader fra osteoporose-relaterte skader har nå steget til minst $7 milliarder årlig (Barnes, O.M., Science, 236:914 (1987)).

Osteoporose er mest vanlig hos kvinner etter menopausen, som gjennomsnittlig mister 15% av sin benmasse i løpet av de 10 første år etter menopausen. Denne sykdom forekommer også hos menn ettersom de blir eldre, og hos unge kvinnelige atleter med uteblivende menstruasjon. Til tross for de alvorlige og økende sosiale og økonomiske konsekvenser av osteoporose er ingen metode tilgjengelig for måling av benresorpsjonshastigheter hos pasienter eller normale individer. En hovedvanskelighet ved overvåking av sykdommen er mangelen på en spesifikk analyse for måling av benresorpsjonshastigheter.

Metoder for bestemmelse av benmasse beror ofte på måling av kalsium i hele kroppen ved nøytronaktiveringsanalyse av mineralmasse i et gitt ben ved fotonabsorpsjonsteknikk. Disse målinger kan gi bare langtidsinntrykk av hvorvidt benmassen er avtagende. Måling av kalsiumbalansen ved sammenligning av inntak med avgivelse er langsommelig og upålitelig, og kan bare indirekte fastslå hvorvidt benmineral går tapt i det lange løp. Andre metoder som for tiden er tilgjengelige for bestemmelse av nedsatt benmasse og forandring i benmetabolismen, omfatter kvantitativ scanningradiometri på utvalgte benplasseringer (håndledd, helbein, osv.) og histomorfometri av hoftekambiopsier. Førstnevnte gir et grovt mål på innholdet av benmineral på et bestemt sted i et enkelt ben. Histomorfometri gir en semi-kantitativ bestemmelse av balansen mellom nylig avsatte bensømmer og resorberende overflater.

En urinanalyse av hele kroppens avgivelse av nedbrutt ben i løpet av 24 timer ville være mye mer anvendelig. Mineralstudier (f.eks. kalsiumbalansen) kan ikke gjøre dette pålitelig eller greit. Siden benresorpsjon omfatter nedbrytning av den mineralske og organiske matriks, ville en spesifikk biokjemisk markør for nylig nedbrutte benprodukter i kroppsvæsker være den ideelle indeks. Flere potensielle organiske indekser er blitt testet. F.eks. blir hydroksyprolin, en aminosyre som i høy grad er begrenset til kollagen, og det viktigste strukturelle protein i ben og alle andre bindevev, utskilt i urin. Dets utskillingshastighet er kjent for å øke under visse betingelser, særlig Pagets sykdom, en metabolisk benforstyrrelse, hvori benomsetningen er betydelig øket, som påpekt ovenfor. Av denne grunn er hydroksyprolin i urin blitt anvendt i betydelig grad som aminosyremarkør for kollagennedbrytning. Singer, F.R. et al. (1978) sitert heri ovenfor.

US patent nr. 3 600 132 beskriver en fremgangsmåte for bestemmelse av hydroksyprolin i kroppsvæsker såsom serum, urin, lumbal væske og andre intercellulære fluider for å overvåke avvik i kollagenmetabolismen. Spesielt bemerker denne oppfinner at i patologiske tilstander såsom Pagets sykdom, Marfans syndrom, osteogenesis imperfecta, neoplastisk vekst i kollagenvev og i forskjellige former av veksthemming, kan man bestemme øket kollagenanabolisme-eller katabolisme ved å måle hydroksyprolininnholdet i biologiske fluider. Denne oppfinner måler hydroksyprolin ved å oksydere dette til en pyrrolforbindelse med hydrogenperoksyd og N-klor-p_-toluensulfonamid etterfulgt av kolorimetrisk bestemmelse i p_-dimetyl-amino-benzaldehyd.

Når det gjelder Pagets sykdom kommer det økte hydroksyprolininnholdet i urinen sannsynligvis i stor grad fra bennedbrytning; hydroksyprolin kan imidlertid som regel ikke anvendes som en spesifikk indeks. Mye av hydroksyprolinet i urin kan komme fra ny kollagensyntese (betraktelige mengder av det nydannede protein blir nedbrutt og utskilt uten noen gang å bli inkorporert i vevsmassen), og fra omsetningen av visse blodproteiner, samt andre proteiner som inneholder hydroksyprolin. Dessuten blir ca. 80% av det frie hydroksyprolin avledet fra protein-nedbrytning metabolisert i leveren, og kommer aldri til syne i urinen. Kiviriko, K.l. Int. Rev. Connect. Tissue Res. 5:93 (1970), og Weiss, P.H. og Klein, L, J. Clin. Invest. 48: 1(1969).

Hydroksylysin og dets glykosidderivater, begge spesielle for kollagenproteiner, er blitt betraktet som mer presise enn hydroksyprolin som markører for kollagennedbrytning. Av de samme grunner som beskrevet ovenfor for hydroksyprolin, er imidlertid hydroksylysin og dets glykosider sannsynligvis like ikke-spesifikke markører for benresorpsjon. Krane, S.M. og Simon, L.S. Devlop. Biochem., 22:185 (1981).

I tillegg til aminosyrer som er unike for kollagen har forskjellige ikke-kollagenproteiner i benmatriks såsom osteocalcin, eller deres nedbrytningsprodukter, dannet basis for immunoanalyser med sikte på måling av benmetabolismen. Price, P.A. et al. J. Clin. Invest., 66: 878 (1980), og Gundberg, CM. et al., Meth. Enzymol., 107:516 (1984). Imidlertid er det nå klart at benavledede ikke-kollagenproteiner, selv om de potensielt er en brukbar indeks for benmetabolismeaktiviteten, i seg selv neppe kan gi kvantitative mål for benresorpsjonen. Serumkonsentrasjonen av osteocalcin varierer f.eks. ganske betydelig både normalt og ved metabolisk bensykdom. Dets konsentrasjon forhøyes ved tilstander av høy skjelettomsetning, men det er uklart hvorvidt dette skriver seg fra øket syntese eller nedbrytning av ben. Krane S.M., et al., Devlop. Biochem., 22:185 (1981), Price, P.A. et al., J. Clin. Invest. 66:878 (1980); og Gundberg, CM. et al., Meth. Enzymol. 107:516 (1984).

Kollagentverrbinding

Polymerene i de fleste genetiske typer av virveldyrkollagen krever dannelse av aldehydformidlede tverrbindinger for normal funksjon. Kollagenaldehyder avledes av noen få spesifikke lysin- eller hydroksylysinsidekjeder ved virkningen av lysyloksydase. Forskjellige di-, tri- og tetrafunksjonelle tverrbindende aminosyrer blir dannet ved de spontane intra- og intermolekylære reaksjoner av disse aldehyder i de nydannede kollagenpolymerer; typen av tverrbindingsrest varierer spesifikt med vevstypen (se Eyre, D.R. et al., Ann. Rev Biochem., 53:717-748 (1984)).

To hovedmetoder for tverrbinding kan differensieres for de bandede (67 nm gjentagelse) fibrillære kollagener, én basert på lysinaldehyder, den andre på hydroksylysinaldehyder. Lysinaldehydmetoden dominerer i hud, øyets hornhinne og støttehinne hos voksne og i halesene hos rotte, og forekommer også hyppig i annet mykt bindevev. Hydroksylysinaldehydmetoden dominerer i ben, brusk, bånd, de fleste sener og de fleste indre bindevev i kroppen, Eyre D.R. et al. (1974) se ovenfor. Den anvendte metode bestemmes av hvorvidt lysinrester blir hydroksylert i telopeptidsetene hvor aldehydrester senere vil dannes ved lysyloksydase (Barnes, M.J. et al., Biochem. J., 139:461 (1974)).

Den kjemiske struktur av de fullt utivklede tverrbindende aminosyrer etter lysinaldehydmetoden er ukjent, men hydroksypyridiniumrester er identifisert som fullt utviklede produkter på hydroksylysinaldehydveien. I begge metoder og i de fleste vev forsvinner de midlertidige borhydrid-reduserbare tverrbindende rester ettersom den nydannede kollagen utvikler seg, hvilket antyder at de er relativt kortlivede mellomprodukter (Bailey, A. J. et al., FEBS Lett.; 16:86 (1971)). Unntak er ben og dentin, hvor de reduserbare rester holder seg i betydelig konsentrasjon gjennom hele livet, delvis tilsynelatende fordi den raske mineralisering av de nydannede kollagenfibriller inhiberer ytterligere spontane tverrbindingsinteraksjoner (Eyre, D.R., I: The Chemistrv and Bioloov of Mineralized Connective Tissues. (Veis, A. utg.) pp. 51-55 (1981), Elsevier, New York, og Walters, C et al., Calc. Tiss. Intl. 35:401-405

(1983)).

To kjemiske former av 3-hydroksypyridiniumtverrbinding er blitt identifisert (formel I og II). Begge forbindelser er naturlig fluorescerende, med de samme karakteristiske eksitasjons- og emmisjonsspektere (Fujimoto, D. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 76:1124 (1977), og Eyre, D.R, Develop. Biochem., 22:50

(1981)). Disse aminosyrer kan oppløses og bestemmes direkte i vevshydrolysater med god følsomhet ved anvendelse av revers fase HPLC og fluorescens bestemmelse. Eyre, D. R. et al., Analyte. Biochem., 137:380-388 (1984). Det skal bemerkes at den foreliggende oppfinnelse omfatter kvantivisering av spesielle peptider heller enn aminosyrer.

Hos dyr i vekst er det blitt rapportert at disse fullt utviklede tverrbindinger kan konsentreres mer i en ikke-mineralisert fraksjon av benkollagen enn i det mineraliserte kollagen (Banes, A. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 113:1975 (1983). Andre studier på ungt bovint eller voksent humant ben understøtter imidlertid ikke dette konsept, Eyre D.R., /: The Chemistry and Biology of Mineralized Tissues (Butler, W.T. utg.) p. 105 (1985), Ebsco Media Inc., Birming ham, Alabama.

Tilstedeværelsen av kollagenhydroksypyridiniumtverrbindinger i human urin ble først rapportert av Gunja-Smith og Boucek (Gunja-Smith, Z. og Boucek, R.J., Biochem J., 197:759-762 (1981)) ved anvendelse av langvarige isolasjons-fremgangsmåter for peptider og konvensjonell aminosyreanalyse. På dette tidspunkt var de oppmerksomme bare på HP-formen av tverrbindingen. Robins (Robins S.P., Biochem J., 207:617-620 (1982) har rapportert en enzymbundet immunoanalyse for måling av HP i urin, etter at de hadde fremstilt polyklonale antistoffer til den frie aminosyre konjugert med bovint serumalbumin. Denne analyse har til hensikt å gi en indeks for overvåking av øket ledd ødeleggelse som forekommer med arthritiske sykdommer, og er ifølge Robins basert på det funn at pyridinolin er mye mer fremherskende i brusk- enn i benkollagen.

I nyere arbeid omfattende enzymbundet immunoanalyse rapporterer Robins at lysylpyridinolin er ureaktivt mot antiserum til pyridinolin kovalent bundet til bovint serumalbumin (Robins et al. Ann. Rheum. Diseases 45:969-973 (1986)). Robins urinindeks for bruskdestruksjon er basert på den oppdagelse at hydroksylysylpyridinolin, primært avledet fra brusk, finnes i urin i konsentrasjoner som er proporsjonale med resorpsjonshastigheten for leddbrusk (dvs. nedbrytning). I prinsipp kan denne indeks anvendes til måling av hele kroppens brusktap; ingen informasjon om benresorpsjon ville imidlertid være tilgjengelig.

Av interesse er også den internasjonale publikasjon nr. WO 89/12824, av The Rowett Research Institute. Denne sistnevnte publikasjon beskriver en fremgangsmåte for overvåking av kollagennedbrytning, omfattende analyse av en biologisk fluidprøve som inneholder et fragment av kollagen omfattende lysylpyridinolin eller hydroksylysylpyridinolin eller en substituert form derav, og en fremgangsmåte for derved å bestemme vevsopprinnelsen for nedbrutt kollagen.

Det eksisterer følgelig et behov for en fremgangsmåte som tillater måling av hele kroppens benresorpsjonshastighet hos mennesker. Den mest anvendbare slike fremgangsmåte ville være én som kunne anvendes på kroppsfluider, spesielt urin. Fremgangsmåten bør være sensitiv, dvs. kvantifiserbar ned til 1 pikomol og raskt måle 24 timers benresorpsjonshastigheter slik at fremgangen ved forskjellig terapi (f.eks. østrogen) kan bringes på det rene.

Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen av tilstedeværelse av spesielle tverrbundede telopeptider i kroppsvæsker hos pasienter og normale mennesker. Disse telopeptider fremstilles in vivo under kollagennedbrytning og

-nydanning. Betegnelsen "telopeptider" anvendes i bred forstand heri slik at de betyr tverrbundede peptider med sekvenser som er sammenbundet med telopeptid reg ionen i f.eks. type II og type III kollagener, og som kan ha tverrbundet til seg en rest eller peptid forbundet med det trippelheliske området i kollagen. Vanligvis vil telopeptidene beskrevet heri ha færre aminosyrerester enn hele telopeptidområdet i type II- og type lll-kollagener. Typisk vil telopeptidene omfatte to peptider sammenbundet med en pyridiniumtverrbinding og dessuten sammenbundet ved en pyridiniumtverrbinding til en rest eller et peptid i det trippelheliske området i kollagen. Etter beskrivelse av strukturene av disse telopeptider heri, vil det bli forstått av en vanlig fagmann på dette området at de også kan frembringes på annen måte enn in vivo, f.eks. syntetisk. Disse peptider vil vanligvis tilveiebringes i renset form, f.eks. i alt vesentlig fri for forurensninger, spesielt andre peptider. Foreliggende oppfinnelse vedrører immunologisk bindingspartner som binder til et peptid inneholdende en 3-hydroksypyridinium kryssbinding avledet fra det aminoterminale telopeptidområdet av type 1 kollagen, kjennetegnet ved at at peptidet består av

hvor K - K - K er en 3-hydroksypyridinium kryssbinding valgt fra hydroksylysylpyridinolin og lysylpyridinolin, og Gin er glutamin eller pyrrolidinkarboksylsyre og hvor den immunologiske bindingspartneren også er istand til å binde til peptidet når pyridiniumringen til 3- hydroksypyridinium kryssbindingen er spaltet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også immunologisk bindingspartner som binder til et peptid inneholdende et kryssbundet 3-hydroksypyridinium avledet fra det karboksyterminale telopeptidområde av type I kollagen, kjennetegnet ved at peptidet omfatter

hvor K-K-K er en 3- hydroksypyridinium kryssbinding valgt fra hydroksylysylpyridinolin og lysylpyridinolin og hvor den immunologiske bindingspartner også binder til peptidet når pyridiniumringen til 3- hydroksypyridinium kryssbindingen er spaltet.

Et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en immunologisk bindingspartner som binder til et peptid inneholdende en spaltet pyridiniumring, kjennetegnet ved at peptidet er avledet ved spalting fra et kryssbundet peptid inneholdende en 3- hydroksypyridirjjum-kryssbinding avledet fra det karboksyterminale telopeptidområdet av type I kollagen, det kryssbundne peptidet omfatter:

hvor K-K-K er et kryssbundet 3- hydroksypyridinoium valgt fra hydroksylysylpyridinolin og lysylpyridinolin.

Fremgangsmåtene beskrevet i den foreliggende søknaden er analoge med dem som tidligere er beskrevet i US serie nr. 118 234, registrert 6. november 1987, for bestemmelse av den absolutte resorpsjonshastighet for ben in vivo. Disse metoder omfattet kvantifisering i en kroppsvæske av konsentrasjonen av telopeptider som har en 3-hydroksypyridiniumtverrbinding avledet fra resorpsjon av

benkollagen.

Oppfinnelsen omhandler videre en anvendelse av immunologiske bindingspartner ifølge kravene 1, 2 og 3 for analysering av en kroppsvæskeprøve for tilstedeværelse av en analytt indikativ for type I kollagendegradering in vivo, som omfatter trinnene kontakting av kroppsvæske-prøven med en immunologisk bindingspartner som er istand til binding til analytten, påvisning av binding av den immunologiske bindingspartneren i kroppsvæskeprøven og korrelering av den påviste binding med type I kollagendegradering in vivo.

I en representativ analyse bringes pasientens kroppsvæske i kontakt med en immunologisk bindingspartner som er spesifikk for et telopeptid som har en 3-hydroksypyridiniumtverrbinding avledet fra type l-kollagen. Kroppsvæsken kan anvendes som den er eller renset før kontakttrinnet. Dette rensetrinn kan gjennomføres ved anvendelse av flere standard fremgangsmåter, omfattende patronadsorpsjon og -eluering, molekylsiktkromatografi, dialyse, ioneveksling, aluminakromatografi, hydroksyapatittkromatografi og kombinasjoner derav.

Andre representative utførelser av kvantifisering av konsentrasjonen av peptidfragmenter som har en 3-hydroksypyridiniumtverrbinding i en kroppsvæske, omfatter elektrokjemisk titrering, naturlig fluorescensspektroskopi og ultrafiolett

absorbans. Elektrokjemisk titrering kan gjennomføres direkte på en kroppsvæske uten ytterligere rensing. Når dette imidlertid ikke er mulig p.g.a. for store mengder

forurensende substanser, blir kroppsvæsken først renset før det elektrokjemiske titreringstrinn. Egnede fremgangsmåter for rensing før den elektrokjemiske påvisning omfatter dialyse, ionebyttekromatografi, aluminakromatografi, molekylsiktkromatografi, hydroksyapatittkromatografi og ionebytteabsorpsjon og eluering.

Fluorometrisk måling av en kroppsvæske inneholdende en 3-hydroksypyridinumtverrbinding er en alternativ måte for kvantifisering av kollagennedbrytning (og følgelig benresorpsjon, dersom type I peptider kvantifiseres. Den fluorometriske analyse kan gjennomføres direkte på en kroppsvæske uten ytterligere rensing. For visse kroppsfluider, spesielt urin, foretrekkes det imidlertid at rensingen av kroppsvæsken gjennomføres før den fluorometriske analyse. Dette rensetrinn består i dialyse av en alikvot av en kroppsvæske såsom urin mot en vandig løsning, for derved å frembringe delvis rensede peptidfragmenter som holdes tilbake i ikke-diffusatet (retentatet). Ikke-diffusatet blir så lyofilisert, løst i en ioneparende løsning og adsorbert på en affinitetskromatografikolonne. Kromatografikolonnen vaskes med et volum av ioneparende løsning, og deretter elueres peptidfragmentene fra kolonnen med en elueringsløsning. Disse rensede peptidfragmenter kan så hydrolyseres, og hydrolysatet oppløses kromatografisk. Kromatografisk oppløsning kan gjennomføres ved enten

høytrykksvæskekromatografi eller mikrobore høytrykksvæskekromatografi.

Det beskrives peptider som har strukturer identiske med peptider avledet fra kollagennedbrytning, i alt vesentlig fri for andre humane peptider, som kan oppnås fra en kroppsvæske. Peptidene inneholder minst én 3-hydroksypyridiniumtverrbinding, spesielt en lysylpyridinolintverrbinding eller en hydroksylysylpyridinolintverrbinding, og er avledet fra telopeptidregionen av type II- eller type III- kollagen bundet til én eller flere rester fra et trippelhelisk område, typisk ved virkningen av endogene proteaser og/eller peptidaser.

Strukturene av type II- og type lll-telopeptider er beskrevet nedenfor. Informasjon om type I telopeptider, opprinnelig presentert i US serie nr. 118 234, er også inkludert.

Et trekk ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter analyse for peptidene beskrevet heri, hvori pyridiniumringene er intakt og spaltet. Siden det blir antatt at en viss spalting av pyridiniumringer foregår in vivo, kan analyser som påviser både intakte og spaltede pyridiniumringer føre til en mer presis bestemmelse av kollagennedbrytning. I forbindelse med dette trekk ifølge den foreliggende oppfinnelse kan det i analysene anvendes spesifikke bindingspartnere til de enkelte peptider inneholdende intakte eller spaltede pyridiniumringer. Enkelte spesifikke bindingspartnere som gjenkjenner begge typer peptider (peptider innholdende både intakte og spaltede pyridiniumringer) kan anvendes. Alternativt kan det også anvendes spesifikke bindingspartnere som diskriminerer mellom peptider inneholdnede den intakte pyridiniumring og de hvori pyridiniumringen er spaltet.

Strukturen av tverrbundede telopeptider avledet fra type I kollagen

En spesifikt telopeptid som har en 3-hydroksypyridiniumtverrbinding avledet fra det N-terminale (aminoterminaie) telopeptidområdet i bentype I kollagen har følgende aminosyresekvens:

er hydroksylysylpyridinolin eller lysylpyridinolin, og Gin er glutamin eller pyrrolidinkarboksylsyre.

Oppfinnelsen omfatter også et peptid inneholdende minst én 3-hydroksypyridiniumtverrbinding avledet av det C-terminale (karboksyterminale) telopeptidområdet i bentype I kollagen. Disse C-terminale telopeptidsekvenser er tverrbundet med enten lysylpyridinolin eller hydroksylysylpyridinolin. Et eksempel på en slik peptidsekvens er representert ved formelen:

er hydroksylysyl- eller lysylpyridinolin.

Siden registreringen av US serie nr. 118 234, har oppfinneren oppdaget bevis for to ytterligere type I kollagen-telopeptider i kroppsfluider med følgende strukturer:

Disse telopeptider kan også kvantifiseres i kroppsvæsker ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Struktur av et tverrbunder telopeptid avledet fra type II kollagen

Et spesifikt telopeptid med en hydroksylysylpyridinolintverrbinding avledet fra det C-terminale telopeptidområdet i type II kollagen har følgende aminosyresekvens (referert til heri nedenfor som kjernepeptidstrukturen):

hvori tverrbindingsresten beskrevet som Hyl-Hyl-Hyl er hydroksylysylpyridinolin (HP), en naturlig 3-hydroksypyridiniumrest som er tilstede i fullt utviklede kollagenfibriller i forskjellige vev.

Aminoterminale telopeptider fra type II kollagen er ikke blitt påvist i kroppsvæsker, og det blir antatt at potensielle peptider avledet fra den N-terminale telopeptid reg ion i type ll-kollagen er i alt vesentlig nedbrutt in vivo, kanskje hele

veien til den frie HP tverrbindende aminosyre.

Strukturen av tverrbundede telopeptider avledet fra type III kollagen

I analogi med beskrivelsen ovenfor kan tverrbundede peptider som er avledet fra proteolyse av humant type III kollagen være tilstede i kroppsvæsker. Disse peptider har en kjemestruktur nedlagt i følgende moderstrukturer: og

er hydrokylysyl- eller lysylpyridinolin, og Gin er glutamin eller pyrrolidinkarboksylsyre.

Et sannsynlig tverrbundet peptid avledet av type III kollagen i kroppsvæsker har kjemestrukturen:

som er avledet fra to a1(lll)N-telopeptidområder bundet til en hydroksylysyl-pyridinolinrest (Hyl-Hyl-Hyl).

Et andre mulig fragment av C-telopeptidtverrbindingsområdet, basert på kollagentypene I og II peptider observert i urin, har kjemestrukturen:

Mindre og større utgaver (som adskiller seg med én til tre aminosyrer på hver komponentkjede) av disse to peptider tilsvarende modersekvensene vist ovenfor (FORMEL VIII og IX) kan også være tilstede og være målbare i kroppsvæsker

Oppfinnelsen omfatter generelt alle spesifikke bindingspartnere til peptidene avledet fra det aminoterminale telopeptidområdet av type I kollagen beskrevet heri. "Spesifikke bindingspartnere" er molekyler som er i stand til å binde seg til peptidene. Innbefattet innenfor dette begrep er immunologiske bindingspartnere, såsom antistoffer (monoklonale og polyklonale), antigen-bindingsfragmenter av antistoffer (f.eks. Fab og Ffab^-fragmenter), enkeltkjede antigen-bindende molekyler, o.l., enten de er laget ved hybridom- eller rDNA-teknologi.

Oppfinnelsen omfatter sammensmeltede cellehybrider (hybridomer) som frembringer monoklonale antistoffer som er spesifikke for de ovenfor beskrevne kollagenpeptider og som har 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger (både med en intakt pyridiniumring og én som er blitt spaltet).

Oppfinnelsen omfatter dessuten monoklonale antistoffer frembrakt av de sammensmeltede cellehybrider, og de antistoffer (samt bindingsfragmenter derav, f.eks. Fab) koblet til en påvisbar markør. Eksempler på påvisbare markører omfatter enzymer, kromoforer, fluoroforer, koenzymer, enzyminhibitorer, kjemiluminescens materialer, paramagnetiske metaller, "spin labels" og radioisotoper. Slike spesifikke bindingspartnere kan alternativt kobles til et medlem av et ligandbindingspartnerkompleks (f.eks. avidin-biotin), i hvilket tilfelle den påvisbare markør kan leveres bundet til det komplementære medlem av komplekset.

Det beskrives også testpakninger som kan anvendes for kvantifisering av mengden av peptider som har 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger avledet fra kollagen-nedbrytning i en kroppsvæske. Pakningene kan innbefatte en spesifikk bindingspartner til et peptid avledet fra nedbrutt kollagen som beskrevet heri. De spesifikke bindingspartnere i testpakningen kan kobles til en påvisbar markør eller et medlem av et ligandbindingspartnerkompleks, som beskrevet ovenfor.

Kort beskrivelse av tegningene

FIGUR 1 er en beskrivelse av type II kollagen og et forslag til telopeptidkilde. Det er ikke fastslått hvorvidt de to viste telopeptider kommer fra ett kollagenmolekyl som beskrevet i FIGUR 1 eller fra to kollagenmolekyler. FIGUR 2 viser relativ fluorescens (297 nm eksitasjon; 390 nm emisjon) versus fraksjonsnummer (4 ml), oppnådd under molekylsiktkromatografisk rensing av tverrbundede telopeptider. Tverrbundete type II kollagen telopeptider inneholdes i fraksjonene betegnet II. FIGUR 3A viser relativ fluorescens (330 nm eksitasjon, 390 nm emisjon) versus elueringstid for fraksjoner under ionebytte HPLC (DEAE-5PW).

Tverrbundede type II kollagen-telopeptider inneholdes i fraksjonen betegnet IV. FIGUR 3B viser absorbans (220 nm) versus elueringstid i min. for det samme kromatogram. FIGUR 4A viser relativ fluorescens (297 nm eksitasjon, 390 nm emisjon) versus elueringstid for fraksjoner under revers fase HPLC. Tverrbundede type II kollagen-telopeptider elueres som angitt. Fraksjonene angitt med staven (-) gir bevis ved sekvens- og sammensetningsanalyse for de angitte peptider som beholder eller har mistet gly (G) og pro (P) restene. FIGUR 4B viser absorbans (220 nm) som funksjon av elueringstid under reversfase HPLC. FIGUR 5 sammenligner konsentrasjonen av HP og LP i både kortikalt og kansellerende humant ben med alderen. FIGUR 6 beskriver tverrbindingsmolforholdet av HP til LP som funksjon av alderen. FIGUR 7A viser relativ fluorescens (297 nm eksitasjon, >370 nm emisjon) som funksjon av elueringsvolum under reversfase HPLC-separasjon av tverrbundede type I kollagen N-telopeptider. FIGUR 7B viser relativ fluorescens (297 nm eksitasjon, >370 nm emisjon) versus elueringsvolum under revers fase HPLC separasjon av tverrbundede type I kollagen C-telopeptider. FIGUR 8A viser relativ fluorescens (297 nm eksitasjon, > 380 nm emisjon) som funksjon av elueringstid for tverrbundede type I kollagen-telopeptider. FIGUR 8B viser relativ fluorescens (297 nm eksitasjon, >380 nm emisjon) som funksjon av elueringstid for de tverrbundede type I kollagentelopeptider. FIGUR 9 viser resultater av bindingseksperimenter med det representative monoklonale antistoff HB 10611 og: P1 peptidet (formel III heri, åpne kvadrater); et a2 (I) N-telopeptid (QYDGKGVGC, fylte trapes); og et a1 (I) N-telopeptid (YDEKSTGGC, fylte kvadrater). FIGUR 10 viser en del av strukturen av N-telopeptidregionen i avkalket humant ben kollagen. P1-peptidet (formel III) er innesluttet i en boks; det inneholder en epitop som korrelerer med benresorpsjonen.

Detaljert beskrivelse av den foretrukne utførelse

Type II kollagentelopeptider

Kjernepeptidstrukturen av type II kollagenpeptider kan finnes i kroppsvæsker som komponent av større peptider som bærer ytterligere aminosyrer eller aminosyresekvenser på én eller flere ender av de tre peptidsekvenser som er sammenbundet av HP-resten. FIGUR 1 viser hvordan type II kollagentelopeptider, som er bundet til en trippel-helisk sekvens, kan frembringes in vivo fra en human kilde ved anvendelse av de proteolytiske enzymer pepsin og trypsin. Mindre fragmenter som har mistet aminosyrer fra kjernepeptidstrukturen, spesielt fra den heliske sekvens, kan også forekomme i kroppsvæsker. Generelt vil addisjoner eller delesjoner av aminosyrer fra kjernepeptidstrukturen involvere fra 1 til ca. 3 aminosyrer. Ytterligere aminosyrer vil vanligis bli bestemt av den type II kollagentelopeptidsekvens som forekommer naturlig in vivo. Som eksempler kan peptider med følgende struktur: isoleres kromatografisk fra urin, og et annet med strukturen:

kan også isoleres. Dessuten kan det forekomme glykosylerte varianter av kjemestrukturen og dens større og mindre varianter, hvori en galaktoserest eller en glukosylgalaktoserest er bundet til sidekjedehydroksylgruppen i HP tverrbindingsresten. Hver topp i diagrammet vist i figurene 4A og 4B kan svare til et tverrbundet fragment med spesiell struktur som kan kvantifiseres med sikte på den foreliggende oppfinnelse.

Disse strukturer er overensstemmende med sitt opprinnelsessted i humane type II kollagenfibriller i et molekylært tverrbindingssete dannet mellom to a 1(11) C-telopeptider og rest 87 i et trippelhelisk område hvor de kjente sekvensene omkring er:

De isolerte peptidfragmenter representerer produktene av proteolytisk nedbrytning av type II kollagenfibriller i kroppen. Kjemestrukturen inneholdende HP-resten er relativt bestandig mot ytterligere proteolyse, og gir et kvantitativt mål for den mengde av type II kollagen som er nedbrutt.

Kollagen type II er tilstede i hyalinbrusk i leddene i det voksne skjelett. Kvantifisering av kollagen type II telopeptidene i en kroppsvæske, f.eks. ved hjelp av et monoklonalt antistoff som gjenkjenner en epitop i peptidstrukturen, ville gi et kvantitativt mål på hele kroppens bruskødeleggelse eller -nydanning. I en foretrukket utførelse medfører den foreliggende oppfinnelse en analyse for nedbrytning av bruskvev hos mennesker basert på kvantifisering av

urinutskillingshastigheten for minst ett medlem av denne familie av telopeptider. En slik analyse kunne f.eks. anvendes til å:

(1) undersøke voksne menneskelige individer for å finne de individer som har unormalt høye hastigheter for bruskødeleggelse som en tidlig diagnostisk indikator på osteoarthritis; (2) overvåke virkningene av potensielle antiarthritiske medikamenter på bruskmetabolismen hos osteoarthritiske og rheumatoidarthritiske pasienter; eller (3) overvåke utviklingen av degenerativ leddsykdom hos pasienter med osteoarthritis og rheumatoid arthritis og deres respons på forskjellige terapeutiske inngrep.

Osteoarthritis er en degenerativ sykdom i den artikulerende brusk i leddene. I sine tidlige trinn er den stort sett ikke-infiammatorisk (dvs. forskjellig fra rheumatoid arthritis). Det er ikke en enkelt sykdom, men representerer de senere trinn av leddsvikt som kan skyldes forskjellige faktorer (f.eks. genetisk predisposisjon, mekanisk overbelastning, misdannelse av ledd eller en tidligere skade, osv.). Ødeleggelse av artikulær leddbrusk er det sentrale progressive trekk ved osteoarthritis. Forekomsten av osteoarthritis, basert på radiografiske oversikter, ligger i området fra 4% i aldersgruppen fra 18-24 år til 85% i aldersgruppen fra 75-79 år. Sykdommen kan for tiden bare diagnostiseres ved smerte og radiografiske eller andre bildetegn på fremskreden bruskerosjon.

Analysene beskrevet ovenfor kan anvendes til påvisning av tidlige tegn på akselerert brusknedbrytning hos svakt symptomatiske pasienter, til overvåking av sykdommens utvikling hvor sykdommen har kommet lengre, og som et middel til overvåking av virkningene av medikamenter eller annen terapi.

Hos normale unge voksne (med ferdig utviklede skjeletter) er det sannsynligvis svært liten nedbrytning av bruskkollagen. En test som kunne måle fragmenter av bruskkollagen i urinen (og i blodet og i leddvæsken) ville være svært nyttig for bedømmelse av bruskens "helse" i hele kroppen og i enkeltledd. De type II kollagen-spesifikke peptidanalyser beskrevet ovenfor vil oppå dette. I det lange løp kan en slik analyse bli en rutinemessig diagnostisk screening for påvisning av de enkeltindivider som har ledd som slites bort. Disse kunne påvises tidlig for preventiv terapi, f.eks. med den neste generasjon av såkalte kondroprotektive medikamenter som nå vurderes av de større farmasøytiske selskaper som alle aktivt søker etter bedre midler for behandling av osteoarthritis.

Andre sykdommer hvor leddbrusken blir ødelagt omfatter: rheumatoid arthritis, juvenil rheumatoid arthritis, ankyloserende spondylitis, psoriatisk arthritis, Reiters syndrom, tilbakefallende polychondritis, smertesyndrom i nedre del av ryggen, og andre infeksjonsformer av arthritis. De type II kollagen-spesifikke analyser beskrevet heri kunne anvendes til å diagnostisere og overvåke disse sykdommer og vurdere deres respons på terapi, som beskrevet ovenfor i forbindelse med osteoarthritis.

Type III kollagentelopeptider

Som påpekt ovenfor, forventes humane type III kollagentelopeptider som kan være tilstede i kroppsvæsker å ha en kjemestruktur som er nedlagt i følgende morstrukturer: og

er hydroksylysylpyridinolin.

I analogi med type II peptider kan type III kollagenpeptidene forekomme i glykosylerte former av kjemestrukturen. F.eks. kan galaktoserester eller glukosylgalaktoserester være bundet til kjemestrukturen, f.eks. ved hjelp av hydroksylgrupper.

Tverrbindingsresten i type III kollagenpeptidene er gjengitt som en 3-hydroksypyridiniumrest, hydroksylysylpyridinolin. Det er blitt funnet at type II telopeptidstrukturene hovedsakelig har hydroksylysylpyridinolintverrbindingsrester. Mens imidlertid type II kollagenpeptidene er avledet fra den N-terminale telopeptidregion i type II kollagen, kan type III kollagenpeptidene være avledet fra enten N-terminalen eller C-terminalen i type III kollagen, så lenge som minst én tverrbindingsrest er tilstede.

Type III kollagen er tilstede i mange bindevev i forbindelse med type I kollagen. Det er spesielt konsentrert i karvegger, i huden og f.eks. i synovialmembranene i leddene hvor dets akselererte omsetning kan observeres i leddbetennelsessykdommer såsom rheumatoid arthritis.

En spesifikk analyse for type III kollagennedbrytning ved kvantifisering av tverrbundede type III kollagenpeptider som beskrevet ovenfor, kan anvendes for påvisning, diagnostisering og overvåking av forskjellige betennelsesforstyrrelser, muligens med spesiell anvendelse på vaskulitissyndromene. I forbindelse med analyser for måling av nedbrytningshastigheten for bentype I og brusktype II kollagen, kunne en slik analyse anvendes som et differensialdiagnostisk verktøy for pasienter med forskjellige degenerative og betennelsesforstyrrelser som fører til bindevevsødeleggelse eller patologiske prosesser.

Isolasjon av type II og type III kollagentelopeptider

Generell fremgangsmåte:

Urin blir oppsamlet fra en normal voksen under en rask fase av skjelettvekst. Ved anvendelse av en sekvens av kromatografiske trinn som omfatter, men som ikke er begrenset til adsorpsjon på selektive patroner av en hydrofob interaksjons-bærer og en ionebyttebærer og molekylsikt-, ionebytte- og reversfase HPLC-kolonnekromatografitrinn, blir enkeltpeptider isolert. De tverrbundede peptidene inneholdende HP- (og LP)-rester blir påvist under kolonnekromatografi ved sin naturlige fluorescens (Ex max 297 nm < pH 4, Ex max 330 nm, < pH 6; Em max 390 nm). Et eksempel på en isolasjonsfremgangsmåte er gjengitt i eksemplet nedenfor.

Spesifikt eksempel:

Frisk urin (ved 4°C) fortynnet 5 ganger med vann og justert til 2% (v/v) trifluoreddiksyre, ledet gjennom en C-18 hydrofob bindingspatron (Waters C-18 Sep-pak forutfuktet med 80% (v/v) acetonitril og deretter vasket med vann). Tilbake-holdte peptider ble vasket med vann og deretter eluert med 3 ml av 20% (v/v) acetonitril, og dette elueringsmiddel ble justert til 0,05 M NH4HC03,10% (v/v)

acetonitril ved tilsetning av et like stort volum av 0,1 M NH4HC03. Denne løsning ble ledet gjennom en QMA-Sep-pak (Waters), som ble vasket med 10 ml av 0,1 M NaCI 20% (v/v) acetonitril etterfulgt av 10 ml vann, og peptidene ble deretter eluert med 3 ml av 1% (v/v) trifluoreddiksyre og tørket med Speed-Vac (Savant).

Peptidene ble fraksjonert i tre kromatografiske trinn. Det første trinn var molekylsiktkromatografi på en kolonne av Bio-Gel P-10 (Bio Rad Labs, 2,5 cm x 90 cm) eluert med 10% (v/v) eddiksyre, overvåking av avløpet på HP-fluorescens som vist i FIGUR 2. I FIGUR 2 er Y-aksen den relative fluorescensemisjon ved 390 nm (297 nm eksitasjon), og X-aksen er fraksjonstallet. Fraksjonsstørrelsen var 4 ml. Fraksjonene angitt som II er anriket på de tverrbundede kollagen type II telopeptider. De tverrbundede kollagen type I telopeptider inneholdes i fraksjonene angitt som III og IV. Fraksjonene som spenner over pool II (anriket på type II kollagen tverrbundede peptider) ble slått sammen, frysetørket og fraksjonert ved ionebyttekolonnekromatografi på en DEAE-HPLC kolonne (TSK-DEAE-5PW, 7,5 cm x 7,5 mm, Bio-Rad Labs), ekvilibrert med 0,02 M Tris/HCI, 10% (v/v) acetonitril, pH 7,5 og eluert med en gradient på 0-0.5M NaCI i den samme buffer som vist i FIGUR 2.

FIGUR 3A gjengir relativ fluorescensemisjon ved 390 nm (330 nm eksitasjon) mot elueringstid. De tverrbundede kollagen type II telopeptider finnes hovedsakelig i segmentet angitt som IV. FIGUR 3B viser absorbans ved 220 nm som funksjon av

elueringstid i minutter. Pool IV inneholder de type II kollagentverrbundede peptider. Enkeltpeptider ble så oppløst fra pool IV ved reversfase HPLC på en C-18 kolonne (Aquapore RP-300, 25 cm x 4,6 mm, Brownlee Labs), ved eluering med en gradient på 0-30% (v/v) acetonitril i 0,1% (v/v) trifluoreddiksyre. FIGUR 4A viser et diagram av relativ fluorescensintensitet ved 390 nm (297 nm eksitasjon) som funksjon av elueringstid. Toppene i forbindelse med spesielle peptider er angitt i FIGUR 4A.

FIGUR 4B viser relativ absorbans ved 220 nm som funksjon av tiden.

Tverrbundede peptidfragmenter av type III kollagen inneholdende HP tverrbindingsrester kan isoleres ved en lignende kombinajson av trinn fra urin fra normale voksende individer eller f.eks. fra urin fra pasienter med betennelsesforstyrrelser i vaskulaturen.

Type I kollagentelopeptider

Dette trekk ifølge oppfinnelsen er basert på den oppdagelse at både lysylpyridinolin (LP) og hydroksylysylpyridinolin (HP) peptidfragmenter (dvs. telopeptider, som anvendt heri) avledet fra reabsorbert benkollagen blir utskilt i urinen uten å bli metabolisert. Oppfinnelsen er også basert på den oppdagelse at intet annet bindevev inneholder signifikant nivå av LP, og at forholdet av HP til LP i ferdig utviklet benkollagen holder seg relativt konstant over en persons levetid.

FIGUR 5 sammenligner konsentrasjonen av HP og LP i både kortikalt og kansellerende menneskeben med alderen. Det observeres at konsentrasjonen av HP pluss LP tverrbindinger i benkollagen når et maksimum ved en alder på 10 til 15 år og holder seg rimelig konstant gjennom ungdomstiden. Dessuten viser forholdet av HP til LP vist i FIGUR 6, liten forandring gjennom livet, idet det holder seg konstant på ca. 3,5 til 1. Disse basisdata viser at 3-hydroksypyridiniumtverrbindingene i benkollagen holder seg relativt konstante, og følgelig at kroppsfluidene avledet fra nedbrytning av benkollagen vil inneholde 3-hydroksypyridinium-tverrbundede peptidfragmenter i konsentrasjoner proporsjonale med den absolutte benresorpsjonshastighet.

Siden LP er 3-hydroksypyridiniumtverrbindingen som er unik for benkollagen vil fremgangsmåten for bestemmelse av den absolutte hastighet for benresorpsjon, i sin enkleste form, være basert på kvantifisering av konsentrasjonen av peptidfragmenter inneholdende 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger og fortrinnsvis lysylpyridinolin (LP) tverrbindinger i en kroppsvæske.

Som anvendt i denne beskrivelse og i de vedlagte krav med hensyn til type I, II eller III telopeptider, menes med "kvantifisering" en måling på en hvilken som helst egnet måte, omfattende, men ikke begrenset til spektrofotometrisk, gravimetrisk, volumetrisk, coulometrisk, immunometrisk, potensiometrisk eller amperometrisk metode av konsentrasjonen av peptidfragmenter inneholdende 3-hydrbksy-pyridiniumtverrbindinger i en alikvot av en kroppsvæske. Egnede kroppsvæsker omfatter urin, serum og synovial væske. Den foretrukne kroppsvæske er urin.

Siden konsentrasjonen av peptider i urin vil synke ettersom urinvolumet øker, blir det videre foretrukket at når urin er den valgte kroppsvske, skal den alikvot som analyseres være fra en samlet pool av urin oppsamlet over et bestemt tidsrom, f.eks. 24 timer. På denne måte beregnes den absolutte hastighet for benresorpsjon eller kollagennedbrytning i en 24 timers periode. Alternativt kan peptider i urin måles som en kvotient i forhold til en markørsubstans som finnes i urin, såsom kreatinin. På denne måte ville urinindeksen for kollagennedbrytning og benresorpsjon holde seg uavhengig av urinvolumet.

I én utførelse ifølge den foreliggende oppfinnelse frembringes monoklonale eller polyklonale antistoffer som er spesifikke for peptidfragmentene inneholdende lysylpyridinolintverrbindinger som finnes i en kroppsvæske såsom urin. Type I telopeptidfragmenter kan isoleres fra en kroppsvæske fra en hvilken som helst pasient, imidlertid, blir det foretrukket at disse peptider isoleres fra pasienter med Pagets sykdom eller fra raskt voksende ungdommer, p.g.a. deres høye konsentrasjon av type I peptidfragmenter. Type II og type III telopeptider kan isoleres fra en kroppsvæske fra en hvilken som helst pasient, men kan lettere oppnås fra pasienter som lider av sykdommer som omfatter type II eller type III kollagennedbrytning eller fra ungdommer i rask vekst.

Isolasjon av type I kollagentelopeptider

Urin fra pasienter med aktiv Pagets sykdom dialyseres i dialyseslanger med redusert porøsitet (<3,500 molvekt s sperre Spectropore) ved 4°C i 48 timer for å fjerne mesteparten av de løste stoffer. Under disse betingelser blir mesteparten av peptidene av interesse holdt tilbake. Det frysetørkede ikke-diffusat elueres deretter (200 mg alikvoter) fra en kolonne (90 cm x 2,5 cm) av Bio-Gel P2 (200-400 mesh) i 10% eddiksyre ved romtemperatur. Et avløpsområde som kombinerer de tverrbundede peptider defineres ved å måle fluorescensen av oppsamlede fraksjoner ved 297 nm eksitasjon/395 nm emisjon, og denne pool frysetørkes. Ytterligere oppløsning av dette materialet oppnås på en kolonne av Bio-Gel P-4 (200-400 mesh, 90 cm x 2,5 cm) eluert med 10% eddiksyre.

To tilstøtende fraksjonspooler defineres ved overvåking av fluorescensen av eluanten ovenfor. Den tidligere fraksjon er anriket på peptidfragmenter som har to aminosyresekvenser som kommer fra det C-terminale telopeptidområdet i al(l)-kjeden av bentype I kollagen bundet til en tredje sekvens avledet fra det trippelheliske legemet av bentype I kollagen. Disse tre peptidsekvenser er tverrbundet med 3-hydroksypyridinium. Den overlappende senere fraksjon er anriket på peptidfragmenter som har en aminosyresekvens som er avledet fra det N-terminale telopeptidområdet i bentype I kollagen sammenbundet gjennom en 3-hydroksypyridiniumtverrbinding.

Enkeltpeptider blir så oppløst fra hver av de to fraksjoner oppnådd ovenfor ved ionebytte HPLC på en TSK DEAE-5-PW-kolonne (Bio Rad 7,5 cm x 7,5 mm) ved eluering med en gradient av NaCI (0-0.2M) i 0.02M Tris-HCI, pH 7,5 inneholdende 10% (v/v) acetonitril. De N-terminale telopeptid-baserte og C-terminale telopeptid-baserte tverrbundede peptider eluerer i en serie på 3-4 fluorescenstopper mellom 0.08M og 0,15M NaCI. De C-terminale telopeptidbaserte tverrbundede peptider eluerer først som en serie fluorescerende topper, og de større og mindre N-terminale telopeptidbaserte tverrbundede peptider eluerer mot slutten av gradienten som karakteristiske topper. Hver av disse blir oppsamlet, frysetørket og kromatografert på en C-18 reversfase HPLC kolonne (Vydac 218TP54, 25 cm x 4,6 mm), eluert med en gradient (0-10%) av acetonitril: n-propanol (3:1 v/v) i 0,01 M trifluoreddiksyre. Ca. 100-500 ^g av enkeltpeptidfragmenter inneholdende 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger kan isoleres ved denne fremgangsmåte ut i fra en enkelt 24 timers oppsamling av Pagets urin.

Aminosyresammensetninger av de viktigste isolerte peptider bekreftet renhet og molekylstørrelser ved de hele talls støkiometri for gjenvunnede aminosyrer. N-terminal sekvensanalyse ved Edman-nedbrytning bekreftet hovedkjernestrukturene tilsvarende sekvensene for de kjente tverrbindingsseter i type I kollagen og fra de tilsvarende aminosyresammensetninger. Den N-terminale telopeptidsekvens i a2(l)-kjeden var blokkert fra sekvenseringsanalyse antagelig p.g.a. den kjente cyklisering av den N-terminale glutamin til pyrrolidonkarboksylsyre.

En typisk elueringsprofil for N-terminale telopeptider oppnådd ved fremgangsmåten ovenfor er vist i FIGUR 7A. Det oppnådde hovedpeptidfragment har en aminosyresammensetning: (Asx^Glx^GlyJgVal-Tyr-Ser-Thr, hvor Asx er aminosyren Asp eller Asn og Glx er aminosyren Gin eller Glu. Sekvensen for dette peptid er representert ved formel III nedenfor.

De C-terminale telopeptid-baserte tverrbundede peptider oppløst ved revers

fase HPLC som beskrevet ovenfor er vist i FIGUR 7B. Som det kan sees av denne figur blir disse peptider ytterligere oppløst i en serie av C-terminale telopeptider som hver inneholder 3-hydroksypyridiniumtverrbindingene. Hovedpeptidet, vist i FIGUR 7B, ble analysert som beskrevet ovenfor, og ble funnet å ha

aminosyresammensetningen: (Asp)5(Glu)4(Gly)10(His)2(Arg)2(Hyp)2(Ala)5

Sekvensen for dette peptid er representert ved formel IV nedenfor. Det antas at de andre C-terminale telopeptid-baserte tverrbundede peptider som fremkommer som mindre topper i FIGUR 7B representerer addisjoner og delesjoner av aminosyrer til den struktur som er vist i formel IV. Hvilket som helst av peptidene som inneholdes i disse mindre topper er egnet for anvendelse som immunogener som beskrevet nedenfor.

og

representerer HP eller LP tverrbindinger og Gin representerer glutamin eller pyrrolidonkarboksylsyre.

Ekvivalenter til peptidene representert ved strukturene ovenfor, i kraft av sin tilstedeværelse i en kroppsvæske p.g.a. kollagennedbrytning, omfatter de tilfeller hvor det er en viss variasjon i peptidstrukturen. Eksempler på slik variasjon omfatter 1-3 aminosyreaddisjoner til N- og C-termini, samt 1-3 terminale aminosyredelesjoner. F.eks. er det blitt påvist et peptid tilsvarende formel III, men som har en tyrosinrest bundet til aminoterminus i den N-terminale aspartatrest i relativt mindre mengder i human urin. Mindre peptidfragmenter av molekylet representert ved formel IV avledet fra benresorpsjon er spesielt åpenbare i urin. Disse finnes i de mindre topper av den C-terminale telopeptidfraksjon som sees i figur 7B, og kan identifiseres ved aminosyresammensetning og sekvensanalyse.

Eksempler på fremgangsmåter for kvantifisering av peptider

A. Immunologisk fremgangsmåte for kvantifisering av peptider

Immunologiske bindingspartnere som er i stand til spesifikt å binde seg til peptidfragmenter avledet fra benkollagen oppnådd fra en fysiologisk væske, kan fremstilles ved metoder som er vel kjent i teknologien. Den foretrukne fremgangsmåte for isolasjon av disse peptidfragmenter er beskrevet ovenfor. Ved immunologiske bindingspartnere som anvendt heri, menes antistoffer og antistoff-fragmenter som er i stand til å binde seg til et telopeptid.

Både monoklonale og polyklonale antistoffer som spesifikt binder peptidene som er beskrevet heri og deres ekvivalenter, blir fremstilt ved fremgangsmåter som er kjent i teknologien. F.eks. Campbell, A. M. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13 (1986). Elsevier, inkorporert heri ved referanse. Det er mulig å frembringe antistoffer til peptidene ovenfor eller deres ekvivalenter som isolert. Det blir imidlertid foretrukket, fordi molekylvektene av disse peptidfragmenter vanligvis er mindre enn 5.000, at haptenet konjugeres til et bærermolekyl. Egnede bærermolekyler omfatter, men er ikke begrenset til, bovint serumalbumin, ovalbumin, tyroglobulin og "keyhole limpet" hemocyanin (KLH). Foretrukne bærere er tyroglobulin og KLH.

Det er vel kjent i teknologien at orienteringen av haptenet, slik det er bundet til bærerproteinet, er av kritisk viktighet for spesifisiteten av antiserum. Dessuten er ikke alle hapten-proteinkonjugater like vellykkede immunogener. Valget av en protokoll for binding av det spesielle hapten til bærerproteinet vil derfor avhenge av aminosyresekvensen i de valgte peptidfragmenter fra urin. Dersom f.eks. peptidet representert ved formel III blir valgt, vil en foretrukket protokoll omfatte kobling av dette hapten til keyhole limpet hemocyanin (KLH), eller en annen egnet bærer, med glutaraldehyd. En alternativ protokoll er å koble peptidene til KLH med et karbodiimid. Disse protokoller hjelper til å sikre at den foretrukne epitop (diskutert nedenfor under overskriften "Egenskaper for en foretrukket epitop") blir presentert for de primede antistoffproduserende celler hos virveldyr (f.eks. B lymfocytter).

Andre peptider, avhengig av kilden, kan kreve andre bindingsprotokoller. Følgelig kan flere bindingsmidler passende anvendes. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, karbodiimider, glutaraldehyd, blandede anhydrider, samt både homobifunksjonelle og heterobifunksjonelle reagenser (se f.eks. the Pierce 1986-87 catalog, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Foretrukne bindingsmidler omfatter karbodiimider og heterobifunksjonelle reagenser såsom m-maleimidobenzyl-N-hydroksysucciminidester (MBS).

Metoder for binding av haptenet til bærermolekylet er kjent i teknologien. Se f.eks. Chard, T., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol.

6 (1987) Partz Elsevier, N.Y., heri inkorporert ved referanse.

Enten monoklonale eller polyklonale antistoffer til haptenbærer-molekylimmunogenet kan fremstilles. Det foretrekkes imidlertid at det fremstilles monoklonale antistoffer (MAb). Av denne grunn blir det foretrukket at immuniseringen utføres i mus. Immuniseringsprotokoller for mus omfatter vanligvis et hjelpemiddel. Eksempler på egnede protokoller er beskrevet av Chard, T. (1987) se ovenfor. Miltceller fra den immuniserte mus blir høstet og homogenisert, og deretter sammensmeltet med cancerceller i nærvær av polyetylenglykol for å frembringe et sammensmeltet cellehybrid som frembringer monoklonale antistoffer som er spesifikke for peptidfragmenter avledet fra kollagen. Eksempler på slike peptider representeres ved formlene gitt ovnefor. Egnede cancerceller omfatter myelom-, hepatom-, karsinom- og sarkomceller. Detaljerte beskrivelser av denne fremgangsmåte, omfattende screeningprotokoller, protokoller for dyrking av valgte hybridceller og høsting av monoklonale antistoffer produsert av de valgte hybridceller er gitt i Galfre, G. og Milstein, C, Meth. Enzymol., 73:1 (1981). En foretrukket preliminær screeningprotokoll omfatter anvendelse av peptidfragmenter avledet fra benkollagenresorpsjon og inneholdende 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger i en fastfase radioimmunoanalyse. Et spesielt eksempel som beskriver et - foretrukket monoklonalt antistoff er gitt nedenfor.

Fremgangsmåter som anvender rekombinant-DNA-teknikker kan også tilpasses til konstruksjon av monoklonale antistoffer. Disse fremgangsmåter kan gjennomføres ved konstruksjon av ekspresjonsbiblioteker og primere av en vanlig fagmann på dette området (se William D. Huse et al., "Generation of a Large Combinational Library fo the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281, desember 1989, se også L. Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construciton of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library," Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:5728-5732, august 1989; se også Michelle Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas," Strategies in Molecular Biology 3:1-9, januar 1990), eller ved innkjøp av kommersielle pakninger som er tilgjengelige for dette formål (f.eks. fra Stratacyte, La Jolla, California). Ved denne utførelse blir, kort fortalt, mRNA isolert fra en B cellepopulasjon, og anvendt til å danne tunge og lettkjedede immunoglobulin cDNA ekspresjonsbiblioteker A.lmmunoZap(H)- og A.lmmunoZap(L)-vektorer. Disse vektorer kan screenes individuelt eller ko-uttrykkes til å danne Fab-f rag menter eller antistoffer (se Huse et al., ovenfor; se også Sastry et al., ovenfor). Positive plakker kan deretter omdannes til et ikke-lytisk plasmid som tillater ekspresjon på høyt nivå av monoklonale antistoff-fragmenter fra E. coli.

De monoklonale antistoffer eller andre immunologiske bindingspartnere som anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis spesifikke for en spesiell type av kollagentelopeptid. F.eks. bør analyser for type II eller type III kollagennedbrytningstelopeptider fortrinnsvis være i stand til å skille mellom type I, type II og type III peptider. I noen tilfeller vil imidlertid slik selektivitet ikke være nødvendig, f.eks. dersom det er kjent at en pasient ikke lider av nedbrytnng av én type kollagen, men er mistenkt for å lide av nedbrytning av den analyserte type av kollagen. P.g.a. forskjellene i aminosyresekvenser mellom type I, type II og type III familiene av telopeptider, bør kryssreaktivitet ikke forekomme i noen betydelig grad. I virkeligheten kan hybridomer utvelges under screeningen av splenocytt-fusjonskloner, som frembringer monoklonale antistoffer som er spesifikke for det tverrbundede telopeptid av interesse (og mangler affinitet for dem av de andre to kollagentyper). Basert på forskjellene i sekvens av de isolerte peptidstrukturer er slik spesifisitet lett gjennomførbar. Peptidfragmenter av moltypene I, II og III kollagener, passende for slik hybridomscreening, kan fremstilles fra humant ben-, brusk- og annet vev og anvendes til screening av kloner fra mus hensiktsmessig immunisert med de individuelle tverrbundede peptidantigener isolert fra kroppsvæske.

Immunologiske bindingspartnere, spesielt monokonale antistoffer, fremstilt ved fremgangsmåtene ovenfor, eller tilsvarende fremgangsmåter, blir anvendt i forskjellige immunometriske analyser for kvantifisering av konsentrasjonen av de peptider som har 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger beskrevet ovenfor. Disse immunometriske analyser omfatter fortrinnsvis et monoklonalt antistoff eller antistoff-fragment koblet til en påvisbar markør. Eksempler på egnede påvisbare markører omfatter, men er ikke begrenset til, enzymer, koenzymer, enzyminhibitorer, kromoforer, fluoroforer, chemiluminescherende materialer, paramagnetiske metaller, spin labels, og radionuklider. Eksempler på standard immunometriske metoder som egner seg for kvantifisering av telopeptidene omfatter, men er ikke begrenset til, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) (Ingvall, E., Meth. Enzymol., 70(1981)), radio-immunoassay (RIA), og "sandwich" immunoradiometric assay

(IRMA).

I sin enkleste form kan disse immunometriske metoder anvendes til bestemmelse av den absolutte hastighet for benresorpsjon eller kollagennedbrytning ved ganske enkelt å bringe en kroppsvæske i kontakt med den immunologiske bindingspartner som er spesifikk for et kollagentelopeptid med en 3-hydroksypyridiniumtverrbinding.

Det blir foretrukket at de immunometriske analyser beskrevet ovenfor blir gjennomført direkte på ubehandlede kroppsvæsker (f.eks. urin, blod, serum, eller synovialvæske). Leilighetsvis kan imidlertid forurensende substasner forstyrre analysen, og gjøre det nødvendig med delvis rensing av kroppsvæsken. Fremgangsmåter for delvis rensing ofmatter, men er ikke begrenset til, patronadsorpsjon og eluering, molekylsiktkromatografi, dialyse, ionebytting, aluminakromatografi, hydroksyapatittkromatografi og kombinasjoner derav.

Testpakninger som egner seg for anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelse, inneholder spesifikke bindingspartnere såsom monoklonale antistoffer fremstilt som beskrevet ovenfor, som spesifikt binder seg til peptidfragmenter avledet fra kollagennedbrytning og som finnes i en kroppsvæske. Det blir foretrukket at de spesifikke bindingspartnere i denne testpakning blir koblet til en påvisbar markør av typen beskrevet ovenfor. Testpakninger inneholdende et panel av to eller flere spesifikke bindingspartnere, spesielt immunologiske bindingspartnere, blir også overveiet. Hver immunologisk bindingspartner i en slik testpakning vil fortrinnsvis ikke kryssreagere i vesentlig grad med et telopeptid avledet fra en annen type kollagen. F.eks. bør en immunologisk bindingspartner som binder seg spesifikt med et type II kollagentelopeptid fortrinnsvis ikke kryssreagere med verken et type I eller type III kollagentelopeptid. En liten grad (f.eks. 5-10%) av kryssreaktivitet kan tåles. Andre testpakninger kan inneholde en første spesifikk bindingspartner for et kollagenavledet telopeptid som har en tverrbinding inneholdende en pyridiniumring (som kan være OH-substituert), og en andre spesifikk bindingspartner for et telopeptid som har den samme struktur som det første telopeptid bortsett fra at pyridiniumringen er blitt spaltet, f.eks. fotolytisk.

(i) Fremstilling av monoklonalt antistoff

Det følgende er et eksempel på fremstilling av et monoklonalt antistoff mot et peptidimmunogen basert på formel III ovenfor.

En fraksjon anriket på peptidet med formel III (som indikerer benkollagen-nedbrytning) ble fremstilt fra human urin fra ungdom ved anvendelse av reversfase-og molekylsiktkromatografi. Peptidet ble konjugert med "keyhole limpet" hemocyanin (KLH) med glutaraldehyd ved anvendelse av standard fremgangsmåter. Mus (Balb/c) ble immunisert subkutant med dette konjugat (50-70 ^g), først i komplett Freund's hjelpemiddel, deretter øket (25 ^g) med 3 ukers mellomrom i ukomplett Freunds hjelpemiddel intraperitonealt. Etter at testblødninger hadde vist en høy titer mot formel III peptidet (referert til heri som P1) konjugert med bovint serumalbumin (BSA) ved anvendelse av et ELISA-format, ble utvalgte mus injisert med en lav dose (5 ^g) av immunogenet i steril PBS intravenøst. Tre dager senere ble celler fra milten hos enkeltmus sammensmeltet med musmyelomceller ved anvendelse av standard hybridomteknologi. Supernatantene fra hybridomkloner som ble dyrket i enkeltbrønner på 96 brønners plater ble screenet for reaktive monoklonale antistoffer, initielt ved anvendelse av et rått P1 preparat konjugert til BSA. Etter formal kloning ved grensefortynning ble antistoffene frembrakt av enkelthybridomer karakterisert mot et panel av screeningantigener ved anvendelse av ELISA-analyse. Disse antigener var P1 (formel III) og P2 (formel VII) peptider konjugert til BSA. Det ble anvendt en inhiberingsanalyse hvori P1 konjugert til BSA ble platet ut i plastbrønnene, og antistoff ble preinkubert med en løsning av det potensielle antigen. Et sekundært antistoff (geit anti-mus IgG konjugert til pepperrot-peroksydase, HRP) ble anvendt for fargeutvikling ved anvendelse av et egnet substrat. Et ønskelig monoklonalt antistoff med høy bindingsaffinitet for P1 peptidet ble identifisert. Når det ble anvendt som ascitesfluidpreparat, virket antistoffet i en inhiberingsanalyse med optimalt fargeutbytte ved 2 millioner gangers fortynning (som angir en bindingskonstant i området 10"<9> til 10~11 M"<1>, mest sannsynlig ca. 10 1 n w M"1'). I et ELISA format var antistoffet i stand til å påvise og måle P1 tilstede i normal human urin uten noe som helst konsentrasjons- eller rensetrinn. Det hybridom som frembringer dette foretrukne monoklonale antistoff er deponert i the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, under adgangsnummeret HB 10611. Dette hybridom betegnes nedenfor som 1H11; det monoklonale antistoff som det frembringer er betegnet nedenfor som MAb-1H11.

Sandwich-analyser ble også vist å virke ved anvendelse av det P1-spesifikke monoklonale antistoff og et polyklonalt antiserum fremstilt i kaniner mot konjugert P1. Verken P1-spesifikke monoklonale antistoffer, polyklonalt antiserum, bindingsfragmenter derav, e.l. kan anvendes til å binde seg spesifikt til P1 fra urin, på en påvisbar måte ved anvendelse av standard ELISA og andre immunoanalyseprotokoller.

(ii) Egenskaper til en foretrukket epitop

Den epitop som gjenkjennes av antistoffet MAb-1 H11 er nedlagt i P1-strukturen. Epitopen gjenkjennes i rent P1 og i visse større peptider som inneholder P1 strukturen (f.eks. P1 bundet til en tyrosinrest via den n-terminale aspartatresten i P1). Epitopen omfatter kjemiske trekk av begge de to telopeptidsekvenser nedlagt i P1 peptidstrukturen. Peptidene syntetiseres for å tilsvare de humane a1 (I) og a2 (I) N-telopeptidsekvenser, med addisjon av et C-terminalt cystein for kobling til bovint serumalbumin (dvs. YDEKSTGGC og QYDGKGVGC), hvor de ikke gjenkjennes av MAb-1 H11. Dette ble vist ved ELISA ved anvendelse av de frie peptider som konkurrerer mot utplatet P1 (se FIGUR 9) eller direkte som bindingspartnere konjugert til BSA og platet ut. Med referanse til FIGUR 9 blir absorbansen ved g = 450 nm for en påvisbar markør avsatt mot konsentrasjonen av fritt P1 peptid. Ettersom mengden av fritt P1 øker, vil mengden av påvisbar markør bundet til immobilisert (utplatet) P1 avta. Til sammenligning viser a2(l) og a1(l) N-telopeptider liten om noen signifikant konkurrerende binding med Mab-1H11.

Dessuten ble det gjenvunnet fra urin en større form av P1 bærende en tyrosinrest på den N-terminale asparaginsyre ved affinitetsbinding til MAb-1 H11, men i lavere utbytte enn P1. Andre noe større peptider som bærer P1 epitopen, ble

også gjenvunnet, men i enda mindre mengder.

Antistoffet var ikke selektivt for karakteren av tverrbindingen i P1, dvs. enten den var hydroksylysylpyridinolin (HP) eller lysylpyridinolin (LP). Både HP-holdige og LP-holdige former ble bundet, tilsynelatende med like stor affinitet, å dømme etter analysen av peptider isolert fra urin med en affinitetskolonne bestående av MAb-1H11 koblet til agarose. De frie tverrbindende aminosyrer, HP og LP, enten de var laget ved syrehydrolyse fra benkollagen eller naturlig tilstedeværende i urin, ble ikke gjenkjent av MAb-1 H11.

Etter fotolytisk åpning av 3-pyridinolringen i peptid P1 med UV-lys (lange UV-bølgelengder), var også den spesifikke antistoffbinding upåvirket, sannsynligvis fordi de enkelte peptider holdt seg tverrbundet til hverandre. Eksperimentet ble gjennomført som følger: Ved anvendelse av betingelser som var blitt vist fullstendig å ødelegge HP og LP (som vist ved tap av fluorescens i karakteristiske fluorescerende topper på RP-HPLC) enten som de frie aminosyrer eller uløselige peptider og intakte protein-kjeder, ble et preparat av P1 bestrålt (lange bølgelengder - Mineralight UV SL-25 lampe Ultra-Violet Products, Inc., San Gabriel, California).

Denne løsning ble analysert for binding til MAb 1H11, ved anvendelse av en kontrollløsning av nøyaktig det samme materialet ikke bestrålt. Resultatene av en ELISA med 1H11 viste i alt vesentlig intet bindingstap til P1, hvilket viser at ringspalting ikke hadde påvirket epitopen signifikant. Under betingelsene for UV-bestråling (pH9), kunne det forventes spalting av en enkeltbinding for å åpne ringen, heller enn en dobbeltspalting for å eliminere ringnitrogenet og dets sidearm. Se for sammenligning Eyre, D., Met. Enzymol. 144:155-139 (1987).

Epitopen gjenkjent av MAb-1 H11 utgjøres derfor av minst en kombinasjon av kjemiske og konformasjonstrekk nedlagt i de to telopeptidsekvenser som er vist i boksene i FIGUR 10, sammen med steriske trekk pålagt av den treverdige tverrbindende aminosyre som binder dem sammen. a2 (I) N telopeptidsekvensen, QYDGK, er en spesielt betydningsfull del av epitopen.

Det faktum at epitopen gjenkjent av MAb-1 H11 ikke er avhengig av en intakt pyridiniumring, er en uventet oppdagelse. Dersom ringåpningen foregår enten

in vivo eller endog in vitro under rutinebetingelser, hvilket synes sannsynlig, vil en

kvantitativ analyse av de aktuelle peptider som har intakte pyridiniumringer underestimere mengden av benresorpsjon. Foreløpige observasjoner viser at nedbrytning av pyridiniumringer i de aktuelle peptider synes å foregå spesielt i urin og/eller i urinprøver, selv om de er nedkjølt. Følgelig forventes en analyse basert på den foreliggende beskrivelse å være sammenlignignsvis mer presis. To utførelser kan forutses: det anvendes en enkelt spesifikk bindingspartner som gjenkjenner utførelser både med lukkede og åpne ringer i målpeptidene; eller det anvendes to spesifikke bindingspartnere som skiller mellom epitopene med hhv. åpen og lukket ring.

Spesifikke bindingspartnere som skiller mellom former av målpeptidene med åpen og lukket ring kan oppnås ved innføring av et egnet screeningtrinn i standard fremgangsmåtene for å oppnå slike spesifikke bindingspartnere. For å oppnå som eksempel et monoklonalt antistoff som binder seg spesifikt til en åpen ringform av P1 -peptidet, kan et bibliotek av monoklonale antistoffkandidater screenes for sin evne til å binde seg til P1 som har en åpnet pyridinolinring (f.eks. ved ultrafiolett lysbestråling) og deres manglende evne til å binde seg til P1 som har en intakt pyridinolinring. De peptider med åpen ring og intakt ring som kan anvendes i et slikt screeningtrinn, kan oppnås ved kjent renseteknikk såsom RP-HPLC, som beskrevet ovenfor.

Ytterligere eksperimenter viste at epitopen holder seg i humant benkollagen, men blir eksponert og bundet av MAb-1 H11 bare etter utstrakt proteolyse Peptider fremstilt av avkalket humant benkollagen ved bakteriekollagenase ble således bundet av MAb-1 H11, og vist å være avledet av N-telopeptidet til heliks-setet vist i FIGUR 10. Én form innholdt heksapeptidet GIKGHR (stedenfor ikke-telopeptid K-armen i P1), som klart er avledet fra a1 (l)-restene 928-933. En annen form inneholdt et tilsvarende, men forskjellig heksapeptid som var avledet fra a2 (I)-kjeden. Fragmenter av humant benkollagen solubilisert med pepsin, CNBr, eller trypsin ble ikke gjenkjent av MAb-1 H11, verken i ELISA format når det ble anvendt som konkurrerende inhibitorer, eller på en Western blot etter SDA-polyakrylamidelektroforese, hvilket viste at disse solubiliseringsmidler ikke frembringer den epitop som gjenkjennes av MAb-1 H11.

B. Elektrokjemisk fremgangsmåte for analyse på peptider

En alternativ fremgangsmåte for analyse på de ovenfor beskrevne peptider består av måling av en fysisk egenskap for peptidene som har 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger. En slik fysisk egenskap beror på elektrokjemisk påvisning. Denne fremgangsmåte består av injisering av en alikvot av en kroppsvæske, såsom urin, i en elektrokjemisk detektor innstilt på et redox-potensial som egner seg for påvisning av peptider inneholdende 3-hydroksypyridiniumringen. 3-hydroksypyridiniumringen, som er en fenol, er gjenstand for reversibel oksydasjon, og følgelig er den elektrokjemiske detektor (f.eks. Model 5100A Coulochem som selges av Esa 45 Wiggins Ave., Bedford, MA) et høyst ønskelig instrument som egner seg for kvantifisering av konsentrasjonen av de foreliggende peptider. To hovedformer av elektrokjemisk detektor er for tiden kommersielt tilgjengelige: amperometrisk (f.eks. BioAnalytical Systems) og coulometrisk (ESA, Inc., Bedford, MA 01730). Begge er egnet for anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelse, sistnevnte system er imidlertid iboende mer følsomt, og foretrekkes derfor, siden det oppnås fullstendig oksydasjon eller reduksjon av det analyserte molekyl i kolonneavløpet. Dessuten kan screening- eller vaktelektroder plasseres "opp-strøms" fra den analytiske elektrode for selektivt å oksydere eller redusere forstyrrende substanser, for derved i høy grad å forbedre selektiviteten. I hovedsak blir spenningen på den analytiske elektrode avstemt til redokspotensialet for prøve-molekylet, og én eller flere forbehandlingsceller blir satt til å ødelegge de forstyrrende elementer i prøven.

I en foretrukket analysemetode etableres en standard strøm/spenningkurve for standard peptider inneholdende lysylpyridinolin eller hydroksylysylpyridinolin for å bestemme den korrekte spenning som skal settes for optimal følsomhet. Denne spenning blir så modifisert avhengig av kroppsvæsken for å minimalisere påvirkningen fra forurensninger, og optimalisere følsomheten. Elektrokjemiske detektorer, og de optimale betingelser for deres anvendelse, er kjent for fagfolk på dette området. Komplekse blandinger av kroppsvæsker kan ofte analyseres direkte med den elektrokjemiske detektor uten forstyrrelser. For de fleste pasienter er det således ikke nødvendig med noen forbehandling av kroppsvæsken. I noen tilfeller kan imidlertid forstyrrende forbindelser redusere målingenes pålitelighet. I slike

tilfeller kan en forbehandling av kroppsvæsken (f.eks. urin) være nødvendig.

I en alternativ utførelse av oppfinnelsen blir således en kroppsvæske først renset før elektrokjemisk titrering av de rensede petpidfragmenter. Rensetrinnet kan gjennomføres på forskjellige måter, omfattende, men ikke begrenset til dialyse, ionebyttekromatografi, aluminakromatografi, hydroksyapatittkromatografi, molekylsiktkromatografi eller kombinasjoner derav. I en foretrukket renseprotokoll dialyseres en utmålt alikvot (25 ml) av en 24 timers urinprøve i dialyseslange med redusert porøsitet for å fjerne det meste av de forurensende fluorescerende løste stoffer. Deretter lyofiliseres ikke-diffusatet, løses opp igjen i 1% heptafluorsmørsyre (HFBA), en ioneparende løsning, og peptidene adsorberes på en Waters Sep-Pak C-18 patron. Denne patron vaskes så med 5 ml av 1% HFBA, og elueres deretter med 3 ml av 50% metanol i 1% HFBA.

En annen foretrukket rensefremgangsmåte består i adsorpsjon av en utmålt alikvot av urin på et ionebytteradsorpsjonsfilter og eluering av adsorpsjonsfilteret med en bufret elueringsløsning. De eluatfraksjoner som inneholder peptidfragmenter med 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger blir så oppsamlet for analyse.

Ytterligere en annen foretrukket rensefremgangsmåte anvender moleylsiktkromatografi. F.eks. påsettes en alikvot av urin på en Bio-Gel P2 eller Sephadex G-20 kolonne, og den fraksjon som eluerer i 1000-5000 Dalton-området blir oppsamlet. Det vil være åpenbart for fagfolk på dette området at en kombinasjon av metodene ovenfor kan anvendes til rensing eller delvis rensing av urin eller andre kroppsvæsker for å isolere de peptidfragmenter som har 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger. De rensede eller delvis rensede peptidfragmenter oppnådd ved fremgangsmåtene ovenfor, kan underkastes ytterligere rensefremgangsmåter, kan bearbeides videre eller analyseres direkte i den delvis rensede tilstand. Ytterligere rensefremgangsmåter omfatter oppløsning av delvis rensede peptidfragmenter ved anvendelse av høytrykksvæskekromatografi (HPLC) eller mikrobore HPLC når det ønskes øket følsomhet. Disse peptider kan så kvantifiseres ved elektrokjemisk titrering.

En foretrukket elektrokjemisk titreringsprotokoll består av å finstille redokspotensialet for påvisningscellen i den elektrokjemiske detektor (Coulochem Model 5100A) for maksimalt signal med ren HP. Deretter anvendes detektoren for overvåking av avløpet fra en C-18 HPLC-kolonne som anvendes til oppløsning av de delvis rensede peptider.

C. Fluorometrisk fremgangsmåte for kvantifisering av peptider

En alternativ foretrukket fremgangsmåte for kvantifisering av konsentrasjonen av peptider med 3-hydroksypyridiniumtverrbindinger som beskrevet heri, er måling av den karakteristiske naturlige fluorescens av disse peptider. For de kroppsvæsker som inneholder få naturlig forekommende fluorescerende materialer forskjellige fra 3-hydroksypyridiniumtverrbindingene, kan fluorometrisk analyse gjennomføres direkte uten ytterligere rensing av kroppsvæsken. I dette tifellet blir peptidene oppløst ved HPLC, og den naturlige fluorescens av HP- og LP-aminosyrerestene blir målt ved 395 nm etter eksitasjon ved 297 nm, i alt vesentlig som beskrevet av Eyre, D. R., et al., Analyte. Biochem. 137:380 (1984) inkorporert heri ved referanse.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse foretrekkes det at den fluorometriske analyse gjennomføres på urin. Urin inneholder imidlertid vanligvis vesentlige mengder av naturlig forekommende fluorescerende forurensninger som må fjernes før gjennomføring av den fluorometriske analyse. Følgelig blir urinprøvene først delvis renset som beskrevet ovenfor for elektrokjemisk påvisning. Denne delvis rensede urinprøve kan så analyseres fluorometrisk som beskrevet ovenfor. Alternativt kan de HP og LP tverrbundede peptider i de delvis rensede urinprøver eller andre kroppsvæsker hydrolyseres i 6M HCI ved ca. 108°C i ca. 24 timer som beskrevet av Eyre et al. (1984) se ovenfor. Denne fremgangsmåte hydrolyserer aminosyrene bundet til lysinforløpeme i "tripeptid" HP og LP tverrbindinger, og frembringer de frie HP og LP aminosyrer representert ved formlene I og II. Disse små "tripeptider" oppløses deretter ved teknikken beskrevet ovenfor, fortrinnsvis ved HPLC, og den naturlige fluorescens måles (Ex 297 nm, Ex 390 nm).

Eventuelt ledes kroppsvæsken (fortrinnsvis urin) direkte gjennom en C-18 reversfase affinitetspatron etter tilsetning av acetonitril/metanol 5 til 10% VA/. Ikke-retentatet justeres til 0,05-0,10 M med et kationisk ioneparingsmiddel såsom tetrabutylammoniumhydroksyd og ledes gjennom en andre C-18 reversfasepatron. Det vaskede retentat inneholdende fluorescerende peptider, fra denne andre patron, elueres med acetonitril.vann (eller metanokvann), tørkes og fluorescerende peptider analyseres ved reversfase HPLC eller mikrobore HPLC ved anvendelse av et anionisk ioneparingsmiddel såsom 0,01 M trifluoreddiksyre i eluanten.

FIGUR 8A viser den oppløste elueringsprofil ved reversfase HPLC av naturlig fluorescens for et hydrolysat av peptidfragmenter fra normal human urin. Måling av det integrerte areal innenfor omslutningen av en gitt komponent blir anvendt til bestemmelse av konsentrasjonen av denne komponent i prøven. Forholdet av HP.LP som finnes i normal human urin og urin fra pasienter som har Pagets sykdom, FIGUR 8B, er begge ca. 4,5:1. Dette er noe høyere enn det 4:1 forhold som finnes i selve benet (Eyre, et al., 1984). Det høyere forhold som finnes i urin viser at en del av HP-fraksjonen i urin kan komme fra andre kilder enn ben, såsom dietten, eller andre kilder for kollagennedbrytning, f.eks. bruskkatabolisme. Det er av denne grunn at det foretrekkes at LP som avledes bare fra ben blir anvendt til å gi en absolutt indeks for benresorpsjon. I fravær av overskudd av brusknedbrytning såsom i rheumatoid arthritis eller i tilfeller hvor ben raskt blir absorbert, kan imidlertid HP eller en kombinasjon av HP pluss LP anvendes som en indeks for benresorpsjon.

Selv om oppfinnelsen er beskrevet i sammenheng med foretrukne utførelser, vil en vanlig fagmann etter gjennomlesning av foregående beskrivelse være i stand til å gjennomføre forskjellige forandringer, substitusjoner av ekvivalenter, og endringer av det aktuelle emnet som er fremsatt heri. Oppfinnelsen kan følgelig praktiseres på måter som er forskjellige fra dem som spesifikt er beskrevet heri. Det er derfor hensikten at den beskyttelse som gis ved patentet herpå, bare skal begrenses av de vedlagte krav og ekvivalenter dermed.

Claims

1. Immunologisk bindingspartner som binder til et peptid inneholdende en 3-hydroksypyridinium kryssbinding avledet fra det aminoterminale telopeptidområdet av type I kollagen, karakterisert ved at peptidet består av hvor K-K-K er en 3-hydroksypyridinium kryssbinding valgt fra hydroksylysylpyridinolin og lysylpyridinolin, Gin er glutamin eller pyrrolidonkarboksylsyre og hvor den immunologiske bindingspartneren også er istand til å binde til peptidet når pyrridiniumringen til 3-hydroksypyridinium kryssbindingen er spaltet.

2. Immunologisk bindingspartner som binder til et peptid inneholdende et kryssbundet 3-hydroksypyridinium avledet fra det karboksyterminale telopeptidområde av type I kollagen, karakterisert ved at peptidet omfatter hvor K-K-K er en 3-hydroksypyridinium kryssbinding valgt fra hydroksylysylpyridinolin og lysylpyridinolin og hvor den immunologiske bindingspartneren også binder til peptidet når pyridiniumringen til 3-hydroksypyridinium kryssbindingen er spaltet.

3. Immunologisk bindingspartner som binder til et peptid inneholdende en spaltet pyridiniumring, karakterisert ved a t peptidet er avledet ved spaltning fra et kryssbundet peptid inneholdede en 3-hydroksypyridinium-kryssbinding avledet fra det karboksyterminale telopeptidområdet av type I kollagen, det kryssbundne peptidet omfatter hvor K-K-K er et kryssbundet 3-hydroksypyridinium valgt fra hydroksylysylpyridinolin og lysylpyridinolin.

4. Anvendelse av en immunologisk bindingspartner ifølge kravene 1, 2 eller 3 for analysering av en kroppsvæskeprøve for tilstedeværelse av en analytt indikativ for type I kollagendegradering in vivo, som omfatter trinnene kontakting av kroppsvæske-prøven med en immunologisk bindingspartner som er istand til binding til analytten, påvisning av binding av den immunologiske bindingspartneren i kroppsvæskeprøven og korrelering av den påviste binding med type I kollagendegradering in vivo.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor analytten har en molekylvekt på mindre enn 5000.

6. Immunologisk bindingspartner ifølge krav 1, karakterisert ved at den har identifiseringskarakteristikkene til ATCC HB 10611 (1H11).