JPH05502223A

JPH05502223A - 生体内でのコラーゲン分解の検出方法

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Publication number: JPH05502223A
Application number: JP3500884A
Authority: JP
Inventors: エア，デイヴィッド　アール．
Original assignee: ワシントン　リサーチ　ファンデーション
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2013-07-30
Also published as: WO1991008478A2; DK0682257T3; DK0682256T3; GR3018852T3; EP1560026A1; DE69034170D1; ATE179521T1; EP0682257B1; AU645049B2; EP0682256B1; NO922149L; IE904344A1; EP0502928A1; DE69034170T2; ATE279730T1; EP1632502A1; IE65280B1; US5473052A; DE502928T1; JP2000050865A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称　生体内でのコラーゲン分解の検出方法発明の技術分野本発明は、生体中でのコラーゲンの分解を検出し、観察する方法に関する。更に詳しくは、コラーゲンタイプ■及び■の分解により、生体内で生産される架橋したテロペプチドを定量する方法に関する。

発明の背景本出願は、（９Ｂ？年１１月６日に出願された米国出願第１１１２３４号の一部継続出願である、１９８９年１１月１日に出願された米国出願第４４４．８８１号の一部継続出願である。

今日まで３種類の公知のクラスのコラーゲンが報告されている。クラスＩのコラーゲンは、タイブエ、ｎ、ｍ、ｒｖ及びＶに細分類され、原線維を形成することが知られている。これらのコラーゲンは、各コラーゲン分子に付加している、Ｎ −末端及びＣ−末端プロペプチドから成る、プロコラーゲン分子から合成される。

コラーゲン合成中に生体内で自然に起こるプロペプチド除去の後、コラーゲン分子の残りの核は、大部分が、三重らせんではない末端テロペプチド鎖を有する三重らせん構造から成る。これらのテロペプチド鎖は、コラーゲン原線維の分子内架橋点として、細胞外で重要な機能を有している。

本発明は、生体内でのコラーゲン分解により製造される特異的架橋テロペプチドの分析に基づくコラーゲン分解を検出する方法に関する。過去において、種々の生物化学的マーカーを測定することにより生体内のコラーゲンの分解を観察するための分析法が開発されており、それらのいくつかはコラーゲンの分解生成物であった。例えば、ベーチェット病と結合した骨転換は、骨コラーゲンの分解に続いて尿中に排泄されたヒドロキシプロリンを含有する小さいペプチドを測定することにより観察されている。ルッセル等（Ｒｏｕｅｌｌ　ｅｌ　友１）、　Ｍｅｌｘｂ、Ｂｏｎｅ　Ｄｉｓ。

ｌａｄ　Ｒｅｌ、　Ｒｅｄ、　４及び５．２５５−２６２　（１９８１１：及びシンガー等（Ｓｉｎｇｅｒ、Ｆ、Ｒ，、＋ｔ＋１．．ｌ　、代謝骨病（ｉｌｔ１８ｂｏｌｉｃ　Ｂｏｎｅ　Ｄｉ＋ｅｕ＋）　、　ＶＯｌ、　２．　（！ｄＩ　＾ｙｉｏｌｉ、Ｌ、Ｖ、ｕ■ ＫｔＩｌｅ、Ｓ、１１．）、４８９−５７５　（１９７８１、アカデミツクプレス、ニューヨーク。

他の研究は、複合病におけるコラーゲン分解の指標としての尿中の架橋化合物ピリジノリンを測定している。背景及び例として、ウー及びアイル（ｌｊ＊　ｓｎｄ　Ｅ７ｒｅ）　、Ｂｉｏｅｈｅｓｉｓｔｒ７．　２３：１８５０　（１９８４）；　ブラック等　（ＢＩ鳳ｅｋ　ｅｔ　＊１．）：　＾ｎｅｔｌ＋　ａ狽煤B １ＲｂｅＩＩ■ｔｌｉｃ　Ｄｉ＋ｅｔｕｓ、４８：　６４１．−６４４：ロビンス等（Ｒｏｂｉｎ＋　ｅｔ　Ｉｌ、）；＾ｅｕ１ｇ　ｏｌｔ■ ｈ　Ｒｈｅａ＠ｔｌｉｃ　Ｄｉｔｅｔ＋ｅ＋、４５：　９６３−９７３＋及びサイベル等（Ｓｅｉｂｅｌ　ｅｌ　Ｉｌ、）　、　Ｔｈｅ　Ｉ■ −ｒｎ＊ｌｏｌ　Ｒｈ＋ｏｓ塞１ｏｌｏ（７、＋６１９６０１９８９）参照。本発明とは対照的に、何人かの先行研究者は、体液からのペプチドを加水分解し、次いで個々のヒドロキシピリジニウム残基の存在を捜した。それらの研究者は何れも、本発明のように、コラーゲンの分解により生体内で自然に生産される、架橋を含むテロペプチドの測定を報告してはいない。

英国特許出願Ｇｌｌ　２．２０５．６４３号は、体内のタイプ■コラーゲンの分解が、体液中のタイプ■コラーゲンからのＮ−末端テロペプチドの濃度を測定することにより定量的に決定されることを報告している。この引例においては、架橋テロペプチド領域は望ましくないことが報告されている。実際、この引例は、テロペプチドを得るためには、架橋していないコラーゲン源を使用することが必要であると報告されている。本発明のペプチドは全て架橋している。コラーゲンの架橋は、「コラーゲン架橋」と標題された、以下の項目で詳細に記載する。

ある種のプロコラーゲンペプチドを定量することによりコラーゲンの分解が測定できると記載された数多くの報告がある。本発明は、プロペプチドよりもテロペプチドを含むものであり、これら二者は、コラーゲン分子中のそれらの位置及び生体内でのそれらの開裂の時期により区別される。米国特許第４．５０４．５８７号、米国特許第４．３１２．８５３号、ビエラルド等（Ｐｉｅ＋ｕｄ　ｅｔ　ｔｌ、ｌ、＾ｎ＊１７１ｉｃｊｌ　Ｂｉｏ−ｃｈｕｉ＋ｌＢ　１４１：　１２７ −１３５　（１９８４１＋ニエメラ　［Ｎｉｅｍｅｎ）、Ｃｌ１ｎ、Ｃｂｅｓ、、３１／８：１３０１−１３０４　（１９８５）：及びロープ等（Ｒｏｈｄｅ　ｅｌ　＊１．）、Ｋｕｏｐｅｕ　Ｉｏｅ＋ｕｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉ−ｃｌｌ　１ｎｙｃ＋ｔｉｇ暑ｔｉｏｎ、９：４５１−４５９　（１９７９）参照。

米国特許第４．７７８．７６８号は、滑液試料中のプロテオグリカン単量体またはその抗原性フラグメントを定量することを含む、関節軟骨に生ずる変化を定量する方法に関する。この特許は、分解したコラーゲンから誘導される架橋したテロペプチドを検出するものではない。

ドッジ　（Ｄａｄｇ＋ｌ、１．　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｕｖｅｒｌ、、８３：６４７− ６６１　（１９８１）　は、ヒト及びウシタイプ■コラーゲンの、巻いていないアルファー鎖及びシアナゲンブロミドから派生するペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗血清を利用するタイプ■コラーゲンの分解を分析する方法を開示している。含有されているペプチドは、本発明のような架橋したテロペプチドではない。

ヒトタイプ■コラーゲン、ヒト前進性（ＩＩ）コラーゲン、及びヒトタイプ■コラーゲンの全体のブリプロアル（ｍ）鎖及び相当するｃＤＮＡクローンのアミノ酸配列がいくつかのグループの研究者らにより研究されており決定されている。

ロイトル等（Ｌｏｉｄｌ　！ｌ　＊１．ｌ　、Ｎａｅｌｅｉｃ　Ａｅｉｄ＋　Ｒｅｕｕｅｂ　１２：９３８３−９３９４　（１９１１）：サンジョルジュ等ｆｓＩａＨｉｏ＋１ｉ　＋ｔ　＋１．ｌ　、Ｎｏｃｌｅｉｃ　Ａｅｉｄ＋　Ｒｅ５ｅｕｃｈ　１３：２２０７−２２２５　ｆ１９８５＋　、パールドウイン等ｆＢ＊１ｄｖｉｎ　！ｌ　ｓｌ、ｌ　、Ｂｉｏｃｈｃｍ、１．、　２６２：５２１−５２８　ｆ１９８９）１及びアラーコッコ等（＾ｌ＋−ｋｏｋｋｏ　ｅｌ　＊１．ｌ　、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、１．．２６０：５０９−５１６（１９８９）参照。それらの引例は、何れも、生体内で分解した原線維コラーゲンの量を定量することができる特別なテロペプチドの分解生成物の構造を特定してはいない。

上記した背景技術の情報にも拘らず、生体内のコラーゲン分解を定量するための効果的で簡単な分析方法が必要とされている。そのような分析法は、変形性関節症（タイプｍコラーゲン分解）のようなヒトの病状、及び脈管炎症候群（タイプｍコラーゲン分解）のような炎症性の障害を検出し観察するのに使用することができる。

親出願の米国出願第１１８．２３４号に記載されているタイプｍコラーゲン分解の分析は、生体内の骨再吸収を検出し評価するのに利用することができる。骨再吸収の検出は、骨粗しよう症のような病気を観察し検出するのに重要な因子であるかもしれない。骨粗しよう症は人類における最も一般的な骨の病気である。主要な骨粗しよう症は、骨折が起こり易くなると共に、骨格骨量の正味量の急激な損失を引き起こす。米国においては、１５００〜２０００万人の人が罹っていると予想される。その原因は骨を作り直す際の年齢に依存する不均衡、即ち、合成速度と骨組織の分解における不均衡である。

約１２０万人の骨粗しよう症に関連する骨折が、毎年、年長者に起こり、約５３８．０００の背骨の圧縮骨折、約２２７．０００の臀部骨折及びかなりの数の耳の末梢骨の骨折が含まれている。臀部骨折の１２〜２０％は致命的である。

何故なら、彼らは重大な精神的障害及び出血を引き起こし、生き残った半数の咀者は在宅看護を必要とする。骨粗しよう症に関連する障害に要する総額は、現在、毎年、少なくとも７０億ドルである（ハーネス　（Ｂｇ＋ｎｅ＋、　Ｏ，ｉｌ、）　、　５ｃｉｅｎｅｃ、２３６９＋４　ｆ１９８７＋１゜骨粗しよう症は、平均して、閉経後の１０年間で彼らの骨の１５％を失う閉経後の女性に最も一般的なものである。この病気は、また、年長の男性及び若い無月経の女性競技者にも生ずる。骨粗しよう症の主要で、かつ増加し、社会的及び経済的な重大性にも拘らず、患者及び正常人の骨再吸収の速度を測定するのに有用な方法はない。この病気を観察する際の主要な困難は、骨再吸収速度を測定する特殊な分析法が欠如していることである。

骨量を査定する方法は、しばしば、中性子活性分析により身体全体のカルシウム量を、または得られた骨の無機物量を光子吸収技術により測定することに頼っている。これらの測定は、骨の量が減少するかどうかの長い期間の結果によってのみ得ることができる。カルシウムのバランスを摂取及び放出を比較することにより測定することは冗長で、信頼性が低く、骨無機物が長い期間に失われているかどうかを間接的に評価するだけである。減少した骨の量及び変化した骨の代謝を評価するのに、現在、有用な他の方法としては、選択された骨の位置（手首、踵骨、等）での定量的操作放射測定及び腸骨稜生体組織検査の組織体型測定が挙げられる。前者は単一骨中の特定点の骨無機物量のおおよその値を与える。組織体型測定は、新たに付着した骨の縫合線と再吸収表面の間のバランスを半定量的評価として与える。

分解した骨の全身からの排出について２４時間の間の尿を分析することは、より有用であろう。無機物の研究（例えば、カルシウムバランス）は、これを信頼性高くまたは容易に行うことができない。骨再吸収は無機物及び有機マトリックスの分解を伴っているので、体液中の新たに分解した骨の製造物のための特別の生物化学的マーカーは、理想的なインデックスであろう。幾つかの可能な有機インデックスが試験されている。例えば、コラーゲンに対し非常に制限されたアミノ酸で、骨及び他の全ての連結組織の主要組織タンパク質であるヒドロキシプロリンが尿中に排泄される。その排泄速度は、ある条件においては増加することが知られており、上記したように、骨の転換が非常に増大する代謝骨疾患であるベーチェット病で顕著である。この理由から、尿のヒドロキシプロリンは、コラーゲン分解のアミノ酸マーカーとして広範囲に使用されている。上記に引用したンンガー等（ＳｉＢｅ＋、Ｆ、Ｒ，ｃｔ　＋１．）　（１９７Ｂ）。

米国特許第３．６００．１３２号には、コラーゲン代謝の変動を観察するために、血清、尿、腰椎液及び他の細胞間液のような体液中のヒドロキシプロリンの定量方法が開示されている。特に、この発明者は、ベーチェット病、マーファン症候群、骨形成不全症、コラーゲン組織及び矯小発育症における腫瘍性成長等の病理学的条件下において、生物学的液体中のヒドロキシプロリン量によって測定されるように、増加したコラーゲンの同化作用または異化作用が定量できることを注記している。この発明者は、ヒドロキシプロリンを、それを過酸化水素及びＮ −クロロ−１）−トルエンスルホンアミドにより酸化してピロール化合物とし、次いで、ｐ−ジメチル−アミノ−ベンズアルデヒド中で比色定量することにより測定している。

ベーチェット病の場合には、増加した尿のヒドロキシプロリンは、恐らく、大部分が骨の分解からきているが、ヒドロキシプロリンは、しかしながら、一般的には特異的なインデックスとして使用することができない。尿中の多くのヒドロキシプロリンは、新しいコラーゲン合成（かなりの量の新たに作られたタンｌ々り質は、分解され、組織繊維の中に導入されることなく排泄される。）か呟及びヒドロキシプロリンを含有するある血液タンパク質並びに他のタンｌぐり質の転換からくるのかもしれない。更に、タンパク質の分解から派生する遊離のヒドロキシプロリンの約８０％は、肝臓中で代謝され、尿中には決して出現しない。キビリコ（Ｋｉｗｉ＋ｉｋｏ、　Ｌｌ、）　、　ｌｎｌ、　Ｒｕ、　Ｃｏｕｅ＋１．　Ｔｉｉ＋ａｅ　Ｒｕ、５：９３　（１９７０）及びヴアイス及びクライン　（Ｗ＋ｉｏ、Ｐ、Ｈｌｎｄ　Ｋｌｅｉｎ、Ｉｌ、１．　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎマｕｔ、４８：１（１９６９）。

共に膠原性タンパク質に固有である、ヒドロキシリシン及びそのグリコノド誘導体は、コラーゲン分解のマーカーとして、ヒドロキシプロリンよりもより正確であると考えられている。しかしながら、ヒドロキシプロリンについて上記したのと同じ理由で、ヒドロキシリシン及びそのグリコンド誘導体は、おそらく骨再吸収のマーカーとしては同様に非特異的であろう。クレーン及びシモン（Ｉｏｔａｔ。

５．１１．　ｓａｄ　Ｓｉｍｏｍ、　Ｌ、Ｓ、）、Ｄｅｎｔｏｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２２：＋８５　＋１９８１）。

コラーゲンに独特のアミノ酸に加えて、オステオカルシン、またはそれらの分解生成物のような種々の骨マトリックスの非膠原性タンパク質は、骨代謝を測定することを目的とした免疫分析の基礎を形成している。プライス等（Ｐｒｉｃｅ、　ＦＡ、ｃｌ　＋１．ｌ　、　１．　Ｃｌ１ｎ、ｔｎｙｅ＋１．、６６：８７８　（１９８０）及びガンバーブ等（Ｇｗｎｂｅ＋１゜ＣＪｌｌ　ｉｆ、）、１ｌｅｌｈ、Ｅｕ７Ｉｌｏ１．、　１０７：５１６　＋１９８４）。しかしながら、骨から派生した非膠原性タンパク質は、可能性としては骨代謝活性の有用なインデックスではあるけれども、それら自身、骨再吸収の定量的な尺度を提供しそうにはないということが明らかである。オステオカルシンの血清中濃度は、例えば、正常と代謝骨病の両者で非常に広く変動する。その濃度は、高骨格転換の状態で上昇するが、しかし、これが増加した合成または骨の分解から引き起こされているかどうか明らかではない。クレーン等（にｒｌｆｆｉｅ、ＳＭ、ｅｔ　ｉｌ、ｌ、Ｄｅｔｅｌｏｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２２：１８Ｓｆ＋、９８＋１、プライス等（Ｐｒｉｃｅ、Ｐ、　Ａ、ｅｌ　＊１．）、１．　Ｃ１１ｅ、Ｉｕｅｊｌ、、　６６：８７８（１９Ｈ１；及びガンバーブ等（Ｇｕｂｕ（、ＣＪ、　ｅｔ　ＩＩ、）、Ｍｅｌｂ、　Ｅｕ７ｍｏ１．、１０７：５１６　（１９８４）。

コラーゲン架橋を椎動物コラーゲンの最も遺伝学的なタイプの重合体は、通常の機能のためにアルデヒドを介在させた架橋の形成が必要である。コラーゲンアルデヒドはりシルオキシダーゼの作用により、幾つかの特異的なりシンまたはヒドロキシリシン側鎖から派生している。種々の二、三及び四官能性架橋アミノ酸は、新たに形成されたコラーゲン重合体の内部でそれらアルデヒドの自発的な分子間及び分子内反応により形成される。架橋残基の種類は組織タイプにより特異的に変わる（アイル等（ｈｔｅ、　Ｄ、Ｒ，ｒｔ　Ｉｌ、）、Ａ＋ｎ、ｂｙ、Ｂｉｏｅｂｅｔ、５３４１７−７４８　（１９８４１）。

架橋の二つの基本的な経路が、結合した（６７ｎｍ繰り返し）原線維コラーゲンについて分類することができ、一つはりシンアルデヒドに基づくものであり、他はヒドロキシリシンアルデヒドに基づくものである。リシンアルデヒド経路は成人の皮膚、角膜、電膜、及びラットの尾腰に支配され、そしてまた他の柔らかい連結組織にしばしば生ずる。ヒドロキシリシン経路は骨、軟骨、靭帯、殆んどの朧及び体の殆んどの内部連結組織に支配される、アイル等（Ｅ７＋ｅ、Ｄ、Ｒ，ｃｌ　１１．）、＋１９７４）上記参照。操作経路は、リシン残基が、アルデヒド残基がリンルオキシダーゼにより後に形成される、テレペプチド部位でヒドロキシル化されるかどうかにより支配される　（ハーネス等ｆＢｕｎｅｔ　’ｄ、　ｉ、ｅｔ　ｔｌ、）、Ｂｉｏｅｈｕ、１．．１３９：４６１ｆ１９７４））。

リシンアルデヒド経路上の熟成した架橋アミノ酸の化学構造は知られていないが、ヒドロキシピリジニウム残基はヒドロキシリシン経路で完成した生成物として同定されている。両者の経路において、及び殆どの組織において、中間体であるポロヒドリドで還元しつる架橋残基は、新たに形成されたコラーゲン熟成物となって消失し、それらが比較的短いライフの中間体であることを示唆している（ペイレイ等ｆＢ＋山７．　Ａ、１．　ｅｌ　ｔｌ、）、ＦＥＢＳ　Ｌｕ１１．、　１６＋８６　＋１９７１））　、例外は骨と象牙質であり、そこでは還元性残基が生存中かなりの濃度で存続しており、一部では明らかに、新たに作られたコラーゲン繊維の急速な無機化が更に自発架橋相互作用を阻害するからである（アイル（Ｅ７＋ｅ、　Ｄ、Ｒ，）　、　Ｉｎ：　Ｔｂ＋　Ｃｈｕｍ…１７　ｌ１ｌｄＢｉｏｌｏＨｏｆ　１ｌｉｎｕｚｌｉｕｄ　Ｃｏｕｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉｕｕ＋、（Ｖｅｉｌ、　Ａ、　ｃｄ、）　５１−５５頁（１９８１P、Ｅｌ＋ｃｗｉｕ、　１ｉｓｔ　Ｔｏｏｋ、及びつｔルターズ等（Ｗｔｌｔｕｔ　Ｃ，ｅｆ　＋１．）　、　Ｃｔｌｃ、　Ｔｉｎ。

１ｎ１１．．３５１０１−４０５　＋１９８３１）。

３−ヒドロキシピリジニウム架橋の二つの化学式が同定されている（式１及び２、）。両者の化合物は本来蛍光体であり、同一の励起及び発光スペクトル特性である（フジモト等ｆＦｗｉｉｍｏｌｏ、Ｄ、ｃｔ　＋１．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ｒｕ、Ｃｏ■ｌ−ロ。

７６：ｌＩ２４　（＋９７７１及びアイルｆＥｒ＋ｅ、　Ｄ、Ｒ，）　、　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｃｈｃｓ、、　２２：５０　（１９８P））。

それらのアミノ酸は、逆相ＨＰＬＣ及び蛍光検定を用いることにより、良好な感度で組織の加水分解物を直接に分解し、分析することができる。アイル等（Ｅ４＋ｅ。

Ｄ、Ｒ，ｅｔ　＞１．）　、　Ａｕ１ｙｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、＋３７：３８０−３８８　（１９８４）。本発明はアミノ酸よりも特殊なペプチドを定量することを含むものであることに注目すべきである。

成長する動物において、それらの成熟した架橋体が、無機化されたコラーゲンにおいてよりも骨コラーゲンの無機化されていない留分中により集中しているであろうことが報告されている（バーンズ等（Ｂｕｔｔ　＾Ｉ、、　＠ｌ　ｓｌ、ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ＋、Ｒｕ、Ｃｅｓｍｗａ、、！＋３：１９７５　（１９０１）　、しかしながら、若いウシまたは成人のヒトの骨についての他の研究はこの概念を支持していない、アイルＭｔｒｅ、　Ｄ。

黄、）、　Ｉａ４ｈ＠　Ｃｈｅｍｉ＋ｌ＋７　ｕ＋ｄ　１ｌｉｏｌｏｌＹ　Ｏｌ　Ｍｉｓｓ＋１ｉ＋ｓ＋ｌ　Ｃｏａ＋＋ｕｌｉｎ　Ｔｉｕｗ普A　（Ｂ＊ｆｌｅ＋、Ｗ、Ｔ、ｔｄ、）　１０５頁（１０５１，Ｅｂ＋ｅｏ　Ｍｔｌｉｓ　ＩＩｅ、、Ｂｉｒｍｉａｌｂｕ、Ａ１１ｂＩｓｔ　。

ヒト尿中のコラーゲンヒドロキシピリジニウム架橋体の存在は、長いペプチドの単離工程及び従来のアミノ酸分析を用いて、タンジャースミス及びボウセック（Ｇｕ＋１１−５ｍ１ｔｈ、１．　ｚｎｄ　Ｂｏ＊ｃｅｋ、　ＬＬ、　１ｉｏｃｈｅ＋＋　１．、　１９７：７５９−７６２　（１９川）に■ り報告されている。その際、彼らは架橋体の）ＩＰ形態のみに気づいている。ロビン７．　（Ｒｏｂｉａｔ、Ｓ、Ｐ、、Ｂｉｏｃｈｎ　１．、２Ｇ７：６１７− １ｉ２０　（１Ｎ２）は、ウシ血清アルブミンに接合した遊離アミノ酸に対する活性化したポリクローナル抗体を有する、尿中のＨＰを測定するための酵素結合免疫分析について報告している。この分析法は、関節炎と共に生ずる増大した関節破壊を観察するためのインデックスを提供することを意図しており、ロビンによれば、ピリジノリンが骨コラーゲンにおけるよりも、軟骨におけるほうが遥かに多く行き渡っていることを見出したことに基づいている。

より最近の酵素結合免疫分析を含む研究において、ロビンスは、リンルビリジノリンがウシ血清アルブミンに共有結合しているピリジノリンに対する抗血清に対して反応しないことを報告している（ロビンス等（Ｒａｂｉａ＋　ｅｔ　Ｉｌ、、＾＠ｅ、　Ｒｈｅｏ曹Ｄｉ＊ｅｕｕ、４５：９６９−９７３　ｆ１９８６））。ロビンスの軟骨破壊の尿インデックスは、軟骨から主に派生するヒドロキシリシルピリジノリンが、関節軟骨再吸収（即ち、分解）の速度に比例する濃度で、尿中に見出されたという発見に基づいている。原則的には、このインデックスは、全身の軟骨損失を測定するために使用することができる。しかしながら、骨再吸収についての情報は、有用ではない。

それ故、ヒトの全身の骨の再吸収速度を測定することができる方法の存在がめられている。そのような方法で最も有用なものは、体液、特に尿に適用できるものである。方法は感度が良くなければならず、即ち、１ピコモル以下まで定量でき、且つ、２４時間の骨再吸収速度を迅速に測定できなければならず、その結果、種々の治療（例えば、エストロゲン）の１行が評価できる。

発明の概要本発明は、患者及び健常人の体液中の特異的に架橋したテロペプチドの存在を発見したことに基づいている。これらのテロペプチドは、生体内で、コラーゲンの分解及び改造の間に製造される。「テロペプチド」の語は、ここでは広い意味に使用され、例えば、タイプ■及びタイプ頁コラーゲンの領域のテロペプチドと結合する連鎖を有し、コラーゲンの三重らせん構造と結合する残基またはペプチドと架橋してもよい、架橋ペプチドを意味する。一般に、ここに開示されているテロペプチドは、タイプ■及びタイプ頁コラーゲンのテロペプチド全体構造よりもより少ないアミノ酸残基を有するであろう。典型的には、本発明のテロペプチドは、ピリジニウム架橋体により結合している二つのペプチドから成り、また、コラーゲン三重らせん構造の残基またはペプチドに架橋するピリジニウムにより更に結合している。ここに開示されたこれらのテロペプチドの構造により、当業者には、それらが生体内以外の、例えば、合成的に製造できるであろうということが理解されよう。それらのペプチドは、精製された形態で、例えば、実質的に不純物、特に他のペプチドを含まない形態で、一般に供給される。

本発明は、また、生体内でのタイプ■及びタイプ頁コラーゲンの分解を定量するための方法に関する。この方法は、３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有し、コラーゲン分解により誘導される特殊なポリペプチドの液体中の濃度を定量するものである。本発明に開示される方法は、１９８７年１１月６日に出願された米国特許出願第１１８．２３４号に開示されている生体内での骨の再吸収絶対速度を定量するためのものと類似のものである。それらの方法は、コラーゲン再吸収から誘導される３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有するテロペプチドの体液中での濃度を定量するものを含むものである。

代表的な分析法において、患者の体液はタイプ■またはタイプ頁コラーゲンから誘導される３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有するテロペプチドに特異的な免疫学的結合対手と接触される。体液はそのまま使用してもよく、或いは接触工程の前に精製してもよい。この精製工程はカートリッジ吸収及び溶出、分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及−びこれらの組合せを含む一般的工程の幾つかを使用することにより達成してもよい。

体液中の３−ヒドロキシビリンニウム架橋体を有するペプチド断片の濃度を定量する他の代表的な態様は、電気化学的滴定、自然蛍光分光、及び紫外吸収を含むものである。電気化学的滴定は、更に精製することなく体液を直接測定することができる。しかしながら、これが、過剰量の汚染物質の存在のために不可能であるならば、体液は電気化学的滴定の前に、先ず精製される。電気化学的滴定の前の適当な精製方法としては、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アルミナクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びイオン交換吸収及び溶出が挙げられる。

３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を含有する体液の蛍光分析測定は、コラーゲン分解（そして、それ故、もし、タイプＩのペプチドが定量されるのであれば、骨再吸収）を定量するもう一つの方法である。蛍光測定分析は、更に精製することなく体液を直接測定することができる。しかしながら、ある種の体液、特に尿については、蛍光測定分析に先立って体液の精製を行うことが好ましい。この精製工程は、水溶液に対して尿のような体液の一定量を透析することから成り、それにより非透析物（保持物）中に保持されている部分的に精製されたペプチド断片を生成する。この非透析物は次いで凍結乾燥され、イオン結合対溶液中に溶解され、そしてアフィニティークロマトグラフィーカラムで吸着される。クロマトグラフィーカラムはイオン結合対溶液の一定量で洗浄し、その後、ペプチド断片は溶出液により溶出される。これらの精製したペプチド断片は次いで加水分解され、加水分解物はクロマトグラフィーにより分離される。クロマトグラフィーによる分離は、高性能液体クロマトグラフィーまたはマイクロポア高性能液体クロマトグラフィーの何れかにより行われる。

本発明は、体液から得てもよい、他のヒトペプチドを実質的に含まない、コラーゲン分解物から誘導されるポリペプチドと同一の構造を有するペプチドを含むものである。このペプチドは、少なくとも一つの３−ヒドロキシピリジニウム架橋体、特に、リシルピリジノリン架橋体またはヒドロキシリシルピリジノリン架橋体を含み、典型的には内因性プロテアーゼ及び／またはペプチダーゼの作用により、三重らせん構造からの−もしくはそれ以上の残基と結合するタイプ■またはタイプ頁コラーゲンのテロペプチド領域から誘導されるものである。

タイプ■及びタイプ１テロペプチドの構造を以下に示す。タイプ１テロペプチドについての情報も、米国特許出願第１．１８，２３４号に最初に記載されている。

他の本発明の態様は、ピリジニウム環が完全なもの及び開裂しているものの、ここに記載したペプチドの分析を含むものである。ピリジニウム環の幾つかの開裂が生体内で起こることが推測されるので、完全な及び開裂したピリジニウム環の両者を検出する分析法が、コラーゲン分解のより正確な評価に導いてくれるかもしれない。本発明のこの態様に関連して、完全なまたは開裂したピリジニウム環を含む個々のペプチドに対する特異的結合対手が分析に使用される。ペプチドの両方のタイプ（完全なまたは開裂したピリジニウムを含有するペプチド）を認識する個々の特異的結合対手が使用される。一方、完全なピリジニウム環を含むペプチド及びピリジニウム環が開裂しているペプチドの相違を識別する特異的結合対手をもまた使用することができる。

タイプ頁コラーゲンから誘導される架橋テロペプチドの構造骨タイプ頁コラーゲンのＮ−末端（アミノ末端）テロペプチド構造から誘導される３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有する特異的テロペプチドは、以下のアミノ酸連鎖を有する＾＋ｐ−Ｇｌｕ−に一３ｕ−Ｔｈ＋−Ｇ１７−Ｇ１７τ Ｇｉｎ−Ｔ７＋−＾１ｐ−Ｇ１７−に−Ｇ１７−Ｖ＊１−Ｇｌ７に式中、Ｋ−に−にはヒドロキシリシルピリジノリンまたはりシルピリジノリンであり、モしてＧｌｎはグルタミンまたはピロリジンカルボン酸である。

本発明は、また、骨タイプ頁コラーゲンのＣ−末端（カルボキシ末端）テロペプチド構造から誘導される３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を少なくとも一つ有するペプチドをも包含する。これらのＣ−末端テロペプチド連鎖は、リシルピリジノリンまたはヒドロキシリシルピリジノリンの何れかと架橋している。そのようなペプチド連鎖の例は以下の式で表わされる。

式４゜Ａ＊ｐ−Ｇ１７−ＧＩＩｌ−Ｈ７ｐ−Ｇ１７−＾１＠１１７１−Ｇｌａ−Ｇｌｌ −Ｌｙ＋ ■ Ｇ１チー＾１９−＾ｌトＧＩＹ−＾１トに−Ｇｌ）−＾１ｐＧｌｍＪ−＾１ｓ− ｆｌｉｓ−＾＋ｐ−Ｇ１７−ＧＩＹ−＾ｒｇＧ　ｌ　ｇ−４−Ａ　ｌ　トＨｉ　ｓ−＾５ｐ−Ｇｌｙ−Ｇ１７−Ａ＋１式中、Ｋ−［４はヒドロキシリシルまたはりシルピリジノリンである。

米国特許出願第１．１０３４号を出願して以来、発明者は、以下の構造を有する、体液中の二つの更なるタイプ■コラーゲンテロペプチドの証拠を発見した。

Ｇｌｌ−Ｇｌｗ−ｔｌｙ９ＩＧ＋７−＾１ｐ−＾１＋−Ｇ１７−＾１トに−ＧＩＦ−＾１９Ｇｌｃ’に一＾Ｉｇ−Ｈｉ＋−＾＋ｐ−Ｇ１１−Ｇｌ７−Ａ＋ｇＧｌｕ−に−Ａｌａ−ｔｌｉｔ− ＾＋ｐ−Ｇ１７−Ｇｌ７−＾１ｇ及び式６％式％これらのテロペプチドは、本発明により体液中で定量することができる。

タイプ■コラーゲンから誘導される架橋テロペプチドの構造タイプ■コラーゲンのＣ−末端テロペプチドから誘導されるヒドロキシリシルピリジノリンを有する特異的テロペプチドは、以下のアミノ酸配列（以下に核ペプチド構造として言及する）を有する式７Ｇｌｏ−１１ｙｌ−Ｇ１７−Ｐ＋ｏ−人１ｐ＋ＨＨＩ　Ｃ−テロペプチド□ Ｇｌａ−ｆ１７１−Ｇ１７−Ｐτ〇−人１ｐ　暑１（ＩＩＩ　Ｃ−テロペプチドＧｌｒ−Ｖｘｌ−Ｈｙｌ　ｔｌ　（ＩＩ）　らセン構造式中、１ｌｙｌｌｌｙｌｌｌｙｌで示される架構体残基は、ヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）であり、種々の組織の成熟したコラーゲン原線維に存在する天然の３＝ヒドロキシピリジニウム残基である。

タイプ■コラーゲンからのアミノ−末端テロペプチドは、体液中に検出されてはおらず、タイプ■コラーゲンのＮ−末端テロペプチド領域から誘導される、可能性があるペプチドが、生体内で実質的に分解し恐らく遊離のＨＰ架橋アミノ酸への全ての経路まで分解することが推測される。

タイプ■コラーゲンから誘導される架橋テロペプチドの構造上記開示と類似の内容により、ヒトタイプ■コラーゲンのタンパク分解ニヨリ誘導される架橋ペプチドが、体液中に存在するであろう。これらのポリペプチドは、以下の親構造で示される積構造を有する式８゜Ｇｌａ−Ｔ７＋−Ｓｅ＋−Ｔｙ＋−Ａ＋ｐ−１ｔｌ−１（７１−３ｅｔ−Ｇ１７ −Ｖｇｌ　ｘｌ（Ｉｌｒｌ　Ｎ−テロペプチド□ Ｇｌｎ−７７＋−５ｅｔ−７７＋−＾＋ｐ−１＋１−Ｈｙｌ−Ｓｅ「−Ｇｌｙ− １ｘｌ　ｇｌ（ＤＩ）　Ｎ−テロペプチドＧ１７−＾Ｉｔ−Ａｌ＊−Ｇ１７−１１ｅ−ｔ１７１−Ｇ１７４ｉ＋−＾ｒ（１ｌ（１１１らせん構造及び式９゜Ｇｔｎ−１１ｅ−Ｇ１７−Ｇ１７−Ｇｌｗ−４１７１−＾１トＧｌｒＧＤ−Ｐｈｅ−Ａｌｔ　＊１ｆｌＨＩ　Ｃ−テロペプチドＧｌｎ−１１ｉ−Ｇｌｙ−ＧＩＹ −Ｇｌｗ−Ｇｌｎ−１１ｉ−Ｇｌｙ−ＧＩＹ−Ｇ１＾Ｉｓ　ｔｌ（ｎＩＩ　Ｃ− テロペプチド【Ｇ１７−Ｐｈｃ−Ｐ「ｏ−Ｇ［７−１１ｅｌ−１（７１−Ｇ１７−Ｂｉｔ−＾＋１　ｔｌｆＩ［）　らせん構造式中、Ｋ−に−にはヒドロキシリシルまたはりシルピリジノリンであり、そしてＧｌ＋はグルタミンまたはピロリジンカルボン酸である。

体液中のタイプ■コラーゲンから誘導される、恐らく架橋しているペプチドは式ＩＯＡ＋ｐ−Ｖｇｌ−）１７１−３ｅ＋−ＧＩ７−Ｙ＋１＾５ｐ４ｔｌ−Ｈｙｌ−８ｅｒ−Ｇ１７−Ｖｇｌ竪Ｈｙｌの積構造を有しており、これはヒドロキシリシルピリジノリン残基（ｌｌｙｌ− Ｈｙｌ−ｔｌｒｌｌに二つのｔｔｆｍｌ　Ｎ−テロペプチド構造が結合したものから誘導されるもの尿中に観察されるコラーゲンタイプ■及び■ペプチドに基づく、Ｃ−テロペプチド架橋構造の第二の考えられる断片は、式１［％式％［の積構造を有するものである。

また、上記した（式８及び９）親配列に相当するこれら二つのペプチドのより小さい及びより大きいバージタン（それぞれの組成物鎖の１〜３のアミノ酸が異なる）が存在し、体液中で測定可能である。ここに開示されたそれぞれのペプチドのより小さい及びより大きい類縁体もまた、本発明の一部を形成する。

本発明は、ここに記載したペプチドに対する全ての特異的結合対手（パートナ− ）をも一般に含むものである。「特異的結合対手」は、本発明のペプチドに結合することが可能な分子である。この言葉に含有されるものは、抗体（モノクローナル及びポリクローナル）、抗体の抗原−結合断片（例えば、Ｆｓｂ及びｒ　ｆｉｂ’　）２断片）、単鎖抗原−結合分子、等の免疫学的結合対手であり、ハイブリドーマまたは＋ＤＮＡの何れかでできているものである。

本発明は、３−ヒドロキシピリジニウム架橋体（完全なピリジニウム環及び開裂したものの両者）を有する上記したコラーゲンペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生ずる、融合した細胞ハイブリッド（ハイブリドーマ）を含む。

本発明は、更に、融合した細胞ハイブリッドにより産生されたモノクローナル抗体、及び検出可能なマーカーと結合したそれら抗体（並びにそれらの結合断片、例えば、Ｆｘｂ　）をも含むものである。検出可能なマーカーの例としては、酵素、発色団、蛍光団、補酵素、酵素阻害剤、化学発光物質、常磁性金属、スピンラベル、及び放射性同位体が挙げられる。そのような特異的結合対手は、一方、配位子−結合対手複合体（例えば、アビジン−ビオチン）の一つの部材と結合してもよく、その場合、検出可能なマーカーは、複合体の捕捉的部材と結合することにより供給することができる。

本発明はまた体液中のコラーゲン分解により誘導される３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有するペプチドの量を定量するのに有用な試験キットをも含むものである。このキットは、ここに開示した、分解したコラーゲンから誘導されるペプチドに対する特異的結合対手を含む。試験キットの特異的結合対手は、上記したように、検出可能なマーカーまたは配位子−結合対手複合体の部材と結合してもよい。

図面の簡単な説明図１は、タイプ■コラーゲンとテロペプチドの原料を提案した図である。記載した二つのテロペプチドが図１に示したーっのコラーゲン分子または二つのコラーゲン分子から来るものかは確立されていない。

図２は、架橋したテロペプチドの分子篩クロマトグラフィーによる精製中に得られた、相対蛍光度（２９７ｆｉｓ励起；３９０ｎｍ発光）に対する留分数を示している。

架橋したタイプ■コラーゲンテロペプチドは、図中■で示した留分中に含まれている。

図３Ａは、イオン交換ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ＤＥＡＥ−５ＰＷｌ中の、相対蛍光度（３３０ｎ−励起；３９０　ｎｍ発光）に対す留分の溶出時間を示す。架橋したタイプ■コラーゲンテレペプチドは、図中■で示した留分中に含まれている。

図３Ｂは、同一のクロマトグラムで、吸光度（２２０ａｍ）に対する分での溶出時間を示す。

図４Ａは、逆相ＨＰＬＣ中の、相対蛍光度（２９７ｎ■励起；３９０ｎｓ発光）に対する留分の溶出時間を示す。架橋したタイプ■コラーゲンテレペプチドは、示したように溶出している。バー（−）で示した留分は、配列の証拠を示しており、ペプチドの組成物分析はｇｌｙ（Ｇｌ及びｐｒｏ（Ｐ）残基を保持しているか失っているかを示していた。

図４Ｂは、逆相ＨＰＬＣ中での吸光度（２２０ｎ■）を溶出時間の関数として示す。

図５は、年齢による皮質及び癌性のヒトの骨中のＨＰ及びＬＰの濃度を比較したものである。

図６は、年齢の関数としてのＨＰとＬＰの架橋モル比を示すものである。

図７Ａは、架橋タイプＩコラーゲンＮ−テロペプチドの逆相ＨＰＬＣ分離中の、溶出容積の関数としての相対蛍光度（２９７ｎｓ励起；　＞３７０　ｎｍ発光）を示す。

図７Ｂは、架橋タイプＩコラーゲンＣ−テロペプチドの逆相ＨＰＬＣ分離中の、溶出容積に対する相対蛍光度（２９７０ｍ励起；　＞３７００ｍ発光）を示す。

図８Ａは、架橋タイプＩコラーゲンテロペプチドについての、溶出時間の関数としての相対蛍光度（２９７ａｍ励起；　＞３８０　ｖ−発光）を示す。

図８Ｂは、架橋タイプＩコラーゲンテロペプチドについての、溶出時間の関数としての相対蛍光度（２９７Ｈ励起；　＞３８０　ｎｍ発光）を示す。

図９は、代表的なモノクローナル抗体ＨＢ１０６１１と　Ｐ１ペプチド（ここでは式３、白ヌキ四角）　；　ｇ２（１１Ｎ−テロペプチド（ＱＴＤＧＫＧＹＧＣ，黒菱形）：及び＊Ｉ（１）　Ｎ−テロペプチド（ＹＤＥＫＳ丁ＧＧＣ１黒四角）との結合実験の結果を示す。

図１０は、脱灰されたヒト骨コラーゲンのＮ−テロペプチド領域の構造の一部を示す。Ｐ１ペプチド（式３）は箱の中に囲われている；それは骨再吸収と関係するエピトープを含有する。

好ましい実施態様の詳細な説明タイプロコラーゲンテロペプチドタイプ■コラーゲンペプチドの核ペプチド構造は、ＨＰ残基により結合した３つのペプチド配列の−若しくはそれ以上の末端の付加的なアミノ酸またはアミノ酸配列を生ずる、より大きいペプチドの組成物として、体液中に見出されるであろう。図１は、三重−らせん配列に結合するタイプロコラーゲンテロペプチドが如何にして、生体内において、タンパク質分解酵素のペプシン及びトリプシンを用いてヒトの資源から産生されるかを示す。核ペプチド構造、特にらせん構造からアミノ酸を失ったより小さい断片もまた体液中に生ずる。一般に、核ペプチド構造からのアミノ酸の付加または削除には、１から約３のアミノ酸が含まれるであろう。付加的なアミノ酸は一般に、生体内で自然に生ずるタイプ■コラーゲンテロペプチド配列によって定量されるであろう。例として、以下の構造を有するペプチドは、式１２％式％式１３Ｇｌａ−Ｈ７１−Ｇ１７−Ｐ！ｏ−＾＋ｐ−Ｐ＋。

Ｇｌ＋−ｔ１７１−Ｇ１７−Ｐｒｏ−＾１ｐＧ１７−ｖｔｌ−８７１尿からクロマトグラフにより単離でき、他の構造：式１４％式％ちまた、単離されるであろう。更に、核構造のグリコリル化した変異体及びそのより大きい及びより小さい変異体が生ずるであろうし、そこではガラクトース残基またはグルコンルガラクトース残基がＨＰ架橋残基の側鎖水酸基に付加している。図４Ａ及び図４Ｂに示したグラフのそれぞれのピークは、本発明の目的のために定量されるであろう特異的構造の架橋断片に相当する。

これらの構造は、ふたつの１１（ＩＩＩ　Ｃ−テロペプチド及び三重−らせん構造の残基８７の間に形成される分子架橋部位におけるヒトタイプ■フラーゲン原線維中のそれらの起源の部位に一致しており、それについての公知の配列は式１５％式％（）単離されたペプチド断片は、体内のタイプ■コラーゲン原線維のタンパク分解生成物を示す。ＨＰ残基を含有する核構造は、更なるタンパク分解に対し抵抗性があり、タイプ■コラーゲン分解の量の定量的測定を提供する。

コラーゲンタイプ■は、成人骨格中の関節の硝子買軟骨中に存在する。例えば、ペプチド構造中のエピトープを認識するモノクローナル抗体による、体液中のコラーゲンタイプ■テロペプチドの定量は、全身の軟骨分解または改造の定量的測定を提供する。好ましい態様において、本発明は、この種のテロペプチドの少なくとも一つのものの尿中への排泄速度を定量することにより、ヒトにおける軟骨組織の分解の分析法を含む。そのような分析法は、例えば、（１）骨関節炎の早期診断指示薬として、軟骨分解の異常に高い割合を有する固体を成人ヒト患者から篩い分ける：（２）骨関節炎及びリウマチ関節炎の患者における軟骨代謝に有効な抗関節炎の薬剤の効果を監視する；または（３）骨関節炎及びリウマチ関節炎を伴う患者の変性関節病の進行及びそれらの種々の治療処方に対する応答を監視するために使用される。

骨関節炎は、関節の接合された軟骨の変性病である。その初期の段階では、それは非常に非炎症性である（即ち、リウマチ関節炎とは明確に区別される）。それは単一の病気ではなく、種々の因子（例えば、遺伝的素因、機械的使い過ぎ、関節先天異常または先行障害等）から引き起こされる関節欠陥の後期を表わしている。関節の軟骨の分解は、骨関節炎の中心的進行性特徴である。放射線写真検査に基づく骨関節炎の範囲は、１８〜２４歳の年齢群の４％から７５〜７９歳の年齢群の８５％までである。現在、この病気は、痛みと軟骨の進行した侵食の放射線写真または他の画像による兆候によってのみ診断可能である。

上記した分析法は、温和な兆候の患者における進行した軟骨分解の証拠を検出し、より進行した患者の病気の進行を監視し、そして医薬または他の治療の効果を監視する手段として使用できる。

正常な若い成人（成熟した骨格の）においては、軟骨のコラーゲンの分解は恐らく非常にわずかである。尿中（並びに血液及び関節液体中の）の軟骨コラーゲンの断片を測定することが可能な試験は、全身の及び個々の関節の軟骨の「健康」を判断するのに非常に有用である。上記したタイプ■コラーゲンー特異的ペプチド分析法はこれを達成できるであろう。長期的には、そのような分析は、関節が磨り減った個々人を見分けるための型にはまった診断篩い分けになり得全ての主要な医薬会社によって、現在、評価されている、所謂、軟骨防御医薬の次の世代のものによる、予防治療を早期の目的とすることができる。

関節の軟骨が破壊される他の病気には：リウマチ関節炎、幼年性リウマチ関節炎、強直を椎炎、乾癖関節炎、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、低背痛症候群、及び他の感染性の関節炎が含まれる。ここに述べたタイプ■コラーゲンー特異的分析法は、骨関節炎に関連して上記したように、それらの病気の診断と監視及び治療に対するそれらの応答を評価するために使用することができる。

タイプ■コラーゲンテロペプチド先に指摘したように、体液中に存在するであろうヒトタイプ■コラーゲンテロペプチドは、以下の親構造式中に具体的に示したような積構造を有すると予測される。

式８％式％式９Ｇｔｎ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇ１１−Ｇｌｏ−ｔ１７１−ＡＩ＋−Ｇｌｌ−Ｇ１７ −Ｐｈｅ−＾１１　Ｊｌ（劃　Ｃ−テロペプチドＧ１１ｌ−１１ｅ−Ｇ１１−Ｇ１７−Ｇｌａ−Ｈ！ｌ−＾１ｓ−Ｇｌｔ−Ｇ１１−Ｐｈｅ−＾Ｉ＆１ｌｆｌ［［ｌ　Ｃ−テロペプチドＧ１７−Ｐｈｅ−Ｐ＋ｏ−Ｇ１７−ｉｌｅｌ−）１１１− Ｇ１７−ｆｌｉｔ−＾＋ｇ　ｓｌ［ＩＩＩ）　らせん構造式中、ＩＩ、１−１（，１Ｈｙｌ　はヒドロキシリシルピリジノリンである。

タイプ■ペプチドとの類似性により、タイプ■コラーゲンペプチドは、積構造のグリコリル化された形態で生ずるであろう。例えば、ガラクトース残基またはグルコシルガラクトース残基は、例えば水酸基を介して、積構造に付加されている。

タイプ■コラーゲンペプチドの架橋残基は、３−ヒドロキシピリジニウム残基として示される、ヒドロキシリシルピリジノリンである。タイプロテロペプチド構造は、第一にヒドロキシリシルピリジノリン架橋残基を有することが見出されている。しかしながら、タイプ■コラーゲンペプチドは、タイプ■コラーゲンのＮ −末端テロペプチド領域から誘導されるが、タイプ■コラーゲンペプチドは、少なくとも一つの架橋残基が存在する限り、タイプ■コラーゲンのＮ−末端またはＣ−末端の何れかから誘導される。

タイプ■コラーゲンは、タイプＩコラーゲンと連携して、多くの連結組織に存在する。それは特に血管壁中、皮膚中及び、例えば、リウマチ関節炎のような炎症性関節病において、その加速された転換が観察されるであろう関節の滑液部材中に集中している。

上記したように、架橋したタイプ■コラーゲンペプチドを定量することによるタイプ■コラーゲン分解用特異的分析は、種々の炎症性疾患を、恐らくは脈管炎症候群への特殊な応用を含めて、検出し、診断し、そして監視するために使用することができる。骨タイプＩ及び軟骨タイプ■コラーゲンの分解速度を測定するための分析法に関連して、そのような分析法は、連結組織の破壊または病理学的過程において引き起こされる榎々の退行性及び炎症性疾患を伴う患者用の示差診断器具として使用できる。

タイプ■及びタイプｌコラーゲンテロペプチドの単離一般的工程：骨格成長の急速部にある正常青年から尿を集める。疎水性の相互作用キャリアー及びイオン交換キャリアーの選択的なカートリッジへの吸着並びに分子篩、イオン交換及び逆相ＨＰＬＣ力ラムクラムクロマトグラフィ一工程が、これらには限定されないクロマトグラフィ一工程の列を用いて、個々のペプチドを単離する。

ＨＰ（及びＬＰ）残基を含有する架橋ペプチドをカラムクロマトグラフィーの間にそれらの自然蛍光（ＥＩ　ｓｏ　２９７　ａｓ　＜　ｐＨ４，ＥＩ　Ｈ！　３３０１Ｎ　＞　ｐｔｌ　６；　ｂ　ＩＩＩ３９０　ｆｆ１ｍ１　により検出する。具体的な単離工程は以下の実施例において提供される。

具体例・水で５倍に希釈し、トリフルオロ酢酸を２％（マ／マ）に調整した新鮮な尿（４ ℃）を、Ｃ−１８疎水性結合カートリッジ（８０％（マ／マ）アセトニトリルで予め湿し、次いで水で洗浄したウォーターズｆＷｉ＋ｅｎｌ製Ｃ−１８セブーパブク　ｆｓｓｐ−ｐ＊ｋ）に通した。保持されたペプチドを水で洗浄し、次いで３１の２０％（マ／マ）アセトニトリルで溶出し、この溶出液を等容積の０．１　Ｍ　Ｎ１１４１１ＣＯ，を加えることにより、０．０５１１　ＮＨ４１１ＣＯ，，１０％（マ／マ）アセトニトリルに調整した。この溶液を、１０１の０、　Ｉ　Ｍ　Ｎ５Ｃ１，２０％（マ／マ）アセトニトリル次いで１０請１の水で洗浄したＱＭＡ−セプーバック（ウォーターズ）を通し、そしてペプチドを次いで３ｍｌの１％（Ｙ／マ〕トリフルオロ酢酸で溶出し、スピード−バック（Ｓｐｓｅｄ−Ｖｏｌ　（サヴアントｆｓｓマｕｔｌ製）で乾燥した。

ペプチドは、三つのクロマトグラフィーの工程で分別した。第一の工程は、１０％［ｙ／ｙ）酢酸で溶出したバイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｃｌｌ　Ｐ−１０（バイオ・ラド・ラボｔＢｉｏ　Ｒｃｄ　Ｌ＋ｂ＋）、２．５　ｅｌＩＸ９Ｇ　ｃｍ）のカラムでの分子篩クロマトグラフィーであり、図２に示したように流出液のＨＰ蛍光を監視した。図２において、Ｙ軸は３９０　ｎｍｆ２９７５１励起）での相対的蛍光発光であり、Ｘ軸は留分番号である。留分の量は４ｍｌである。■として示した留分は、架橋コラーゲンタイプロテロペプチドに富んでいる。架橋コラーゲンタイプ■テロペプチドは、■及び■で示した留分中に含有されている。

■を溜めている全ての留分（タイプ■コラーゲン架橋ペプチドに富んでいる）を合わせ、凍結乾燥し、そして図２に示したように、０．０２Ｍｈリス／ＨＣＩ、１０％（マ／マ）アセトニトリル、ｐＨ７，５で平衡にし、同一の緩衝液を用いてｏ−ｏ、ｓＭ勾配のＮａＣ１で溶出するＤＥＡＥ−ＨＰＬＣカラム（丁５Ｋ− ＤＥ＾Ｅ−５ＰＷ、７．５　ｓｍＸ　７．５　＋ｎ、バイオ・ラド・ラボ）でのイオン交換クロマトグラフィーにより分別した。

図３は、３９０　ａｙｒ　（３３０ａｓ励起）での蛍光発光に対する溶出時間を描いたものである。架橋コラーゲンタイプロテロペプチドは、主に■として示した部分の中に見出される。図３Ｂは、分での溶出時間の関数としての２２０　ａｍにおける吸光度を描いたものである。■の溜りはタイプ■コラーゲン架橋ペプチドを含有する。個々のペプチドは、次いで、■の溜りから逆相ＨＰＬＣによりＣ−１８カラム（アクアボア（＾ｑｕｐｏｎ）　ＲＰ−３Ｈ、２ＳｅｍＸ４．６　ａｓ、ブラウンソー・ラボ（Ｂｒｏｗｖ−ｌｅｅ　Ｌｘｂ＋）製）で１１．１％（マ／マ）トリフルオロ酢酸中、０〜３０％（ｒ／Ｆ）勾配のアセトニトリルで溶出することにより、分別した。図４Ａは、溶出時間の関数としての３９０” 　（２９７ｕ励起）での相対蛍光強度を描いたものである。特異的ペプチドと連携したピークは図４に示されている。図４Ｂは、時間の関数としての２２０６１での相対吸光度を示す。

ＨＰ架橋残基を含有するタイプ■コラーゲンの架橋ペプチド断片は、健常人の尿から、または、血管系の炎症性疾患を伴う患者の尿から、同様に組み合わせた工程により単離される。

タイプｌコラーゲンテロペプチド本発明のこの側面は、再吸収された骨コラーゲンから誘導されるリシルピリジノリン（Ｌ　Ｐ）及びヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）ペプチド断片（即ち、ここで使用されるテロペプチド）が、代謝されずに尿中に排泄されるという発見に基づいている。本発明は、また、他の如何なる組織もかなりの水準のＬＰを含んではおらず、成熟した骨コラーゲン中のＨＰとＬＰの割合が、ヒトの一生において比較的一定に維持されるという発見にも基づいている。

図５は、年齢によるヒトの皮質及び癌性の骨中のＨＰ及びＬＰの濃度を比較している。骨コラーゲンに架橋するＨＰプラスＬＰの濃度は１０〜１５歳で最大に達し、そして成人の一生をとおしてかなり一定に維持される。更に、ＨＰとＬＰの比は、図６に示したように、−生を通じて殆ど変化せず、約３５　：１で一定に維持されることを示している。これらの基本データは、骨コラーゲン中で架橋する３−ヒドロキソピリジニウムが比較的一定に維持され、そしてそれ故、骨コラーゲンの分解により派生する体液が、骨再吸収の絶対速度に比例する濃度で３− ヒドロキシピリジニウム架橋ペプチド断片を含有するであろうことを示している。

ＬＰは、骨コラーゲンに独特の３−ヒドロキシピリジニウム架橋体であるので、骨の再吸収の絶対速度を定量する方法は、その最も簡単な形態において、体液中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋体そして好ましくはりシルピリジノリン（ＬＰ）架橋体を含有するペプチド断片の濃度を定量することに基づいている。

この発明においてタイプ１１Ｉｆ、または■テロペプチドに使用されている、「定量するＪによって意味されるものは、分光測光、重量測定、容量測定、比色測定、免疫測定、電位差測定、または電流測定方法等を含むがそれらには限定されない如何なる適当な方法により、一定量の体液中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を含有するペプチド断片の濃度を測定することである。適当な体液は、尿、血清及び滑液である。好ましい体液は尿である。

尿のペプチドの濃度は、尿の容量が増加するのに伴い減少するので、尿が選択された体液である場合には、例えば、２４時間という固定された時間の期間内に採取された尿を合わせた全量から一定量を分析することが好ましい。この場合、骨再吸収または骨分解の絶対速度は、２４時間の期間で計算される。一方、尿のペプチドは、クレアチニンのような尿中に見出されるマーカー物質に対する相対的な割合として測定することができる。この場合、コラーゲン分解及び骨再吸収の尿指標は、尿の容積とは独立のものなる。

本発明の一つの実施態様として、尿のような体液中に見出されるリシルピリジノリン架橋体を含有するペプチド断片に対し特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体が産生される。タイプＩテロペプチド断片は如何なる患者の体液からも単離されるであろうが、しかしながら、これらのペプチドは、ベージェット病の患者からまたは急速に成長している青年から単離されることが、彼らのタイプＩペプチド断片が高濃度であることから好ましい。タイプ■及びタイプ■テロペプチドは如何なる患者の体液からも単離されるが、タイプ■またはタイプ■コラーゲン分解を伴う病気に罹っている患者からまたは急速に成長している青年からより容易に得られる。

タイプＩコラーゲンテロペプチドの単離活性ベージェット病の患者からの尿を、還元性多孔質透析管（＜３．５００モル重量除外、スペクトロポア（Ｓｐｅｃｌｒｏｐｏ＋ｅｌ製）により４℃で４８時間、塊状溶質を除くために透析した。これらの条件下で、対照とするペプチドは殆ど止まっていた。

凍結乾燥した非透析質を、次いで、パイオーゲルＰ　２　（２０Ｇ−４００メツシユ、９０ｅｓｘ２、Ｓｃｍ）のカラムで１０％酢酸により室温で溶出した。架橋ペプチドを合わせた流出液の領域は、集めた留分の２９７　ｎａ励起／３９５　ａｓ発光での蛍光を測定することにより決定し、この溜りを凍結乾燥した。この物質をバイオ−ゲルＰ−４（２Ｈ−４００メツンユ、９０ｃｉｘ２．５　ｃｍ）のカラムで１０％酢酸で溶出することにより更に分別した。

二つの隣接した留分の溜りは、上記のように溶離液の蛍光を監視することにより分けた。より早い留分は、骨タイプエコラーゲンの三重らせん体から誘導される第三の配列に結合する骨タイプＩコラーゲンの５ｌ（Ｉ）鎖のＣ−末端テロペプチド構造から誘導される、二つのアミノ酸配列を有するペプチド断片に富んでいる。これらの三つのペプチド配列は、３−ヒドロキシピリジニウムと架橋している。重複するより後の留分は、３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を介して架橋している骨タイプＩコラーゲンのＮ−末端テロペプチド構造から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチド断片に富んでいる。

個々のペプチドは、次いで、ＴＳＫ　［１ＥＡＥ−５−ＰＷカラム（バイオ・ラド７．５Ｃ■×７．５嘗會）によるイオン交換ＨＰＬＣにより、１０％（マ／マ）アセトニトリルを含有する、ｐｔｌ　７．５＋７）０．０２　Ｍ　トリフ、− ＨＣｌ中でＮａＣｌの勾配（０〜０．２Ｍ＋で溶出することにより、上記したように得られた二つの留分のそれぞれから分別される。

Ｎ−末端テロペプチド基及びＣ−末端テロペプチド基架橋ペプチドは、Ｏ，ＨＭ及び０．１５ＭＮａＣｌの間で一連の３〜４の蛍光ピークを示して溶出される。

Ｃ−末端テロペプチド基架橋ペプチドが、最初に一連の蛍光ピークをもって溶出され、そして主要な及び微小なＮ−末端テロペプチド基架橋ペプチドが特徴的なピークをもって勾配の終わりの方で溶出される。それらはそれぞれ集められ、凍結乾燥し、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣカラム（ビダック（Ｖ７ｄｔｃ）　２１８ＴＰ５４　、２５ｃｍＸ４．６　ａｍｌ　で、０．０１Ｍトリフルオロ酢酸中、アセトニトリル二〇−プロパツール（３：１マ／マ）の勾配（０〜１０％）で溶出することによりクロマトグラフィーを行った。約１００−５００）　ｇの３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を含有する個々のペプチド断片が、ベージェット患者の尿を２４時間１回集めたものからこの工程により単離された。

主要な単離ペプチドのアミノ酸組成物は、回収されたアミノ酸の全数化学量論により、純度及び分子サイズを確認した。エドマン（Ｅｄｅｎ）分解によるＮ−末端配列あ分析は、タイプＩコラーゲンの公知の架橋点の配列に相当する基本的核構造及びアミノ酸組成の整合から確認した。ｌ２（Ｉ）鎖のＮ−末端テロペプチドは、配列分析から、ピロリジノンカルボン酸に対するＮ−末端グルタミンの公知の環化に恐らくよるであろうものから防御されている。

上記の工程により得られるＮ−末端テロペプチドの典型的な溶出外形を図７に示す。得られた主要なペプチド断片は、　（Ａｕ）ｚ　（Ｇ＋り２　ｆＧｌｙ）、Ｖｓｌ−Ｔ７＋−３ｅｔ−丁ｂ＋のアミノ酸組成を有している。ここで、Ａｌｘはアミノ酸の＾Ｉｐまたは＾ｌｎであり、Ｇｌｎはアミノ酸のＧｌａまたはＧ１１ｌである。このペプチドの配列は、以下の式３によって示される。

上記により、逆相ＨＰＬＣにより分別されるＣ−末端テロペプチド基架橋ペプチドは図７Ｂに示した。この図から理解できるように、これらのペプチドは、それぞれが３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を含む一連のＣ−末端テロペプチドに更に分別される。図７Ｂに示した主要なペプチドは、上記のように分析され、（Ａｌｆｌｌｑ　（Ｇｌｗ）４（ＧＩＦ）＋ｏ　（ｔｌｉｓｌｚ　（＾［）　ｘ　（Ｈｙｐ＋　ｘ　（Ｈ＊）　ｑのアミノ酸組成を有することが見出された。このペプチドの配列は、以下の式４．で示される。図７Ｂに小さなピークとして現れる他のＣ−末端テロペプチド基架橋ペプチドは、式４で示した構造に対するアミノ酸の付加及び削除を表わしていると思われる。これらの小さなピークに含まれる如何なるペプチドも、以下に述べる免疫源として使用するのに適当である。

式３゜Ａｓｐ−Ｇ１１ｌ−に−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇ１７−Ｇ１７■ ＧｌローＴＹｒ−Ａｓｐ−Ｇ１７−ｔ−Ｇ１７−Ｖｔｌ−Ｇ１７に式４゜Ａｓｐ−ＧｌチーＧＩＩＩ−Ｈ７ｐ−Ｇ１７−＾１１■ Ｈｙｐ−Ｇｌｓ−Ｇ１７−Ｌ７ｇＧＩＹ−Ａ＋ｐ−Ａｌｘ−ＧＩ７−Ａｌｘ−トＧＩＦ−＾ｓｐ■ Ｇｌｇ−トＡ１Ａｌ１４ｉ＾＋ｐ−Ｇ１７−Ｇｌ７−＾ｒｇＧｌｗ−に−＾１ｉ４ｉ＋−＾＋ｐ−Ｇ１７−Ｇｌｔ−＾ｒ１■７ｐ−Ｇ１ｗ−ＧＩＹＧ１７−Ａ＋ｐ−ＡＩ＋−Ｇｌｌ−＾１＋−に−ＧＩＦ−＾１ｐ□ Ｇｌｏ−に−＾１ト旧＋−Ａ＋ｐ−Ｇ１７−Ｇｌ７−＾Ｉｇ及び弐６゜Ｇｌｗ４−＾１ｒ１１ｉ＋−Ａｓｐ−Ｇ１７−Ｇ１７−＾「区Ｇｌｗ−に−＾１１−旧＋−Ａ＋ｐ−Ｇ１７−Ｇｌ７−＾ｒ！式中、［４（はＨＰまたはＬＰ架橋体を表わし、ＧＩｌｌはグルタミンまたはピロリドンカルボン酸を表わす。

コラーゲン分解により体液中にそれらが存在することにより、上記構造により表わされるペプチドの等価物は、そのペプチド構造に幾つかの変化があるものをも含む。そのような変種の例としては、Ｎ及びＣ末端への１〜３のアミノ酸付加体並びに１〜３の末端アミノ酸除去体が挙げられる。例えば、式３．に相当するが、Ｎ−末端アスパラギン酸残基のアミノ末端にチロシン残基が付加しているペプチドは、ヒト尿中からは比較的少ない量で検出されている。骨再吸収から誘導される式４．で示される分子のより小さいペプチド断片は、尿中に特に顕著である。これらは、図７Ｂに見られるようにＣ−末端テロペプチド留分の小さいピークとして見出され、アミノ酸組成及び配列分析により同定することができる。

ペプチド定量工程の実施例Ａ、ペプチド定量用免疫学的工程生理学的液体から得られた骨コラーゲンに由来するペプチド断片と特異的に結合することができる免疫学的結合対手は、当業界において良く知られている方法により製造することができる。これらのペプチド断片を単離するための好ましい方法は上記した。免疫学的結合対手によって表わされるものは、ここで使用されているように、テロペプチドと結合することが可能な抗体及び抗体断片である。

ここに開示したペプチドと特異的に結合するモノクローナル及びポリクローナル抗体の両者及びそれらの等価物は、当業界で公知の方法により製造される。例えば、キャンプベル（Ｃｔｍｐｂ＋　ｌ　ｌ、ＡＭ、Ｌ＋ｂｏｎｔｏｒ７　Ｔｅｃｈｎｉｑａｃｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｎｉ＋＋＋７ｕｄ　１ｌｏｌｃｃｏｌｕ　Ｂｉｏｌｏｇ７．　Ｙｏｌ、１３　ｆ１９８６））　６単離された上記ペプチドまたはそれらの等価物に対する抗体を製造することは可能である。しかしながら、これらのペプチド断片の分子量は一般に５．０００未満なので、ハブテンを担体分子に接合することが好ましい。適当な担体分子としては、それらに限定されないが、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、サイログロブリン、及び陣笠具ヘモンアニン（Ｋ　Ｌ　Ｉ（）が挙げられる。好ましい担体はサイログロブリン及びＫＬＨである。

当業界では、ハブテンの配向は、それが担体タンパク質に結合する際に、抗血清の特異性に関して臨界的に重要であることがよく知られている。更に、全てのハブテン−タンパク質接合体が等しく免疫源として成功するわけではない。担体タンパク質への特別なハブテンを結合させるための計画の選択は、それ故、選択した尿のペプチド断片のアミノ酸配列に依存する。例えば、式３で示されるペプチドを選択する場合には、好ましい計画は、このハブテンを陣笠具ヘモンアニン（ＫＬＨ）、または他の適当な担体であるグルタルアルデヒドと共に、結合させることを含む。もう一つの計画は、ペプチドをＫＬＨとカルボジイミドと共に結合させることである。これらの計画は、好ましいエピトープ（「好ましいエピトープの特性」の標題のもとに以下において記載する）を、準備したを椎動物抗体産生細胞（例えば、Ｂリンパ球）に生じさせることを確実にするのを助ける。

他のペプチドは、その原料に基づき、異なった結合計画が必要である。従って、数多くの結合試薬が適宜、使用される。これらとしては、限定されないが、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、混合無水物、並びにホモニ官能及びヘテロニ官能試薬（例えば、ピアス（Ｐｉｅ＋ｕ）　１９８６−８７カタログ、ＰｉｕｃｌＣｈｅｍｉ＋ｉｔ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｌｏ＋ｄ、ＩＬ参照）が挙げられる。

好ましい結合試薬としては、カルボジイミド及びｍ−マレイミドベンジル−Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）等のへテロニ官能性試薬が挙げられる。

ハブテンを担体分子に結合する方法は、当業界では知られている。例えば、ここで引用したチャード（Ｃｈｕｄ、　丁、Ｌｉｂｏｒ＊ｔｏ＋７７＋ｃｂｎｉｑｍｅ＋　ｉｉ　Ｂｉｏ−ｃｈｃｓｉ＋ｔｒ７ｕｄ　Ｍｏ１ｅｃａｔｕ　Ｂｉｏｌｏｇ７．　Ｖａｌ、６　（１９８７）　Ｐｔｒｌｔ　Ｅｌｓｅｖｉｅ＋、　Ｎ、Ｔ、）参照。

ハブテン担体分子に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の何れも免疫源が製造することができる。しかしながら、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を製造することが好ましい。この理由から、免疫化はマウスで行うことが好ましい。マウスでの免疫化計画は、通常、アジュバント（補助剤）を含む。適当な計画の例としては、チャード［Ｃｂｕｄ、　Ｔ）　ｆ１９８７１　（上記参照）に記載されている。免疫化マウスの膵臓細胞を取り出し、均質にし、その後、ポリエチレングリコールの存在下に癌細胞と融合し、コラーゲンから派生するペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を産生ずる融合細胞ハイブリッドを製造した。そのようなペプチドの例としては、上記した式で表わされるものが挙げられる。適当な癌細胞には、ミエローマ（骨髄腫）、ヘパトーマ（肝癌）、カルシノーマ（癌腫）及びサルコーマ（肉腫）細胞が含まれる。計画の篩分け、選択したハイブリッド細胞の成長計画及び選択されたハイブリッド細胞により産生されるモノクローナル抗体の収穫を含む、この工程はガルフレ及びミルスタイン（Ｇ＊１ｆｒｅ、Ｇ、ｕｌ　Ｍｉｌ＋ｔ！ｉｎ。

Ｃ，Ｊｅｌｈ、Ｅｎ＋７ｓｏ１．、７３：１ｆ１９８１１）に詳しく記載されている。好ましい計画の予備的な篩分けには、骨コラーゲン再吸収により誘導され、モして固相放射免疫分析において３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を含有するペプチド断片を使用することを含む。好ましいモノクロナール抗体が記載されている特徴的な例を以下に挙げる。

組み替えＤＮＡ技術を利用する方法は、また、モノクローナル抗体を組み立てるのに適合させることができる。これらの方法は、発現情報を組み立てることにより及び当業界の熟練者による手引き盲により（例えば、ウィリアム・ヒユーズ等　（Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｄ、Ｈｕｓｅ　ｅｌ　ｔｌ、）　、’Ｇｃｎｕｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓ　Ｌｉ＋［ｅ　Ｃｏｍｂｉｎｉｔｉｏｎｔｌ　kｉｂｎ２８１、Ｄｅｃｅｓｂｅ＋　１９８９　参照、またサストリー等（Ｌ、　５ｏｌｒアｅｌ　＋１．）’ＣＩｏｎｉｎｇ　ｏｆＴｏｅ　ｌｌＩＩｎｏｌｏｇｉ＋ｓｌ　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｉｃ　Ｅ＋ｅｈｅ＋ｉｃｈ目ｅｏｌｉ　ｌｏｔ　Ｇ＋ｅｃｎｌｉｏｎ　ｏｆ@）ｌｏｎｏ− ｃｌｏ５＋ｌ　Ｃ山１７１ｉｃ　Ａｎｌｉｂｏｄｉｕ：　Ｃｏｎ＋ｌ＋ｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈ　Ｈｅ墓ｗ７　Ｃ１ｕｉｎ　Ｖｉ＋ｉ＋ｂｔ{　Ｒｅ− １ｉｏｆｆｉ−Ｓｐ＋ｃ山ｃ　（ＤＮＡ　Ｌｉｂｎｕ７’、　Ｐ＋ｏｅ、　Ｎ＊ｔｆ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８６：５７２８−５V３２．＾Ｕ川用　１９８９参照、またミケーレ・アルティング・ミース等（Ｍｉｃｂｅｌｌｅ＾ｆｌｉｎｇ−ｔｒｅｅｔ　ｅｌ　＋１．）　、　’ｉｌｏｍｏｃｉｏｕｌ＾山ｂｏｄ７　Ｅｘｐ＋ｅ＋＋ｉｏｎ　Ｌｉｂ＋ｕｉｕ：　Ａ　Ｒａｐｉｄ　Ａ１１ｕ−盾狽■ ｉｖ＋　ＩＱ　ｔ１７ｂ＋ｉｄｏｍｏ’、　５ｌｎｌＢｉｕ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｏｌｕ　Ｂｉｏｌｏｇ７３：ｌ−９，ＩｕｕＢ　１９９０参照）、またはこの目的に有用な市販のキット（即ち、５ｌｉｌ＊＋７１＋、Ｌ＋　Ｉｏｌ、ｌ＋Ｃｔｌｉ１ｏ＋ｎ目から）を購入することにより、達成することができる。端的には、この実施態様において、ｍＲＮＡがＢ細胞個体群から単離され、そしてλ免疫Ｚｘｐ（Ｈｌ及びλ免疫２ｔｐ（Ｌｌベクター（媒介体）中の重い及び軽い免疫グロブリンｃＤＮＡの発現情報を創造するために利用される。これらのベクターは、個々に篩分けされまたは共に発現され、Ｆ＋ｂフラグメントまたは抗体を形成する（ヒユーズ等（ｆｌｕｅ　ｅｌ　＋１．）、またサストリー等（Ｓ＋＋Ｈ７ｌｌ　ｔｌ、）前出参照）。陽性の血小板は、続いて、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）からのモノクローナル抗体断片の高水準発現を許容する非溶解性のプラスミドに変換される。

本発明において使用されるモノクローナル抗体または他の免疫学的結合対手は、特別なタイプのコラーゲンテロペプチドに特異的であることが好ましい。例えば、タイプ■またはタイプ■コラーゲン分解テロペプチドの分析は、タイプＩ、タイプ■及びタイプ■ペプチドを区別できることが好ましい。しかしながら、ある場合には、そのような選択性は必要がないであろう、例えば、もし、患者が一つのタイプのコラーゲンの分解に罹っているのではなく、分析されたタイプのコラーゲンからの分解に罹っているか疑わしい場合である。タイプ■、タイプ■及びタイプ■系列のテロペプチド間のアミノ酸配列が異なるので、交差反応性は重大な度合いでは起こらない。実際、ハイブリドーマは、対照とする架橋テロペプチドの篩分け（及び他の二つのコラーゲンタイプのそれらへの親和性の欠如）の間に選択することができる。単離されたペプチド構造の配列の相違に基づき、そのような特異性は完全に実施できる。そのようなノーイブリドーマの篩分けに適した親タイプエ、■及び■コラーゲンのペプチド断片は、ヒトの骨、軟骨及び他の組織から製造でき、そして体液から単離した個々の架橋ペプチド抗原と適当に免疫されたマウスからのクローンを篩分けするのに使用される。

上記の工程、またはそれと等価の工程で製造された免疫学的結合対手、特にモノクローナル抗体は、上記した３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有するペプチドの濃度を定量するための種々の免疫測定法に使用される。これらの免疫測定法は、検出可能なマーカーと結合したモノクローナル抗体または抗体断片からなることが好ましい。適当な検出可能なマーカーの例としては、それらには限定されないが、酵素、補酵素、酵素阻害剤、発色団、蛍光団、化学発光物質、常磁性金属、スピン標識、及び放射性核種が挙げられる。テロペプチドを定量するために適当な標準的免疫測定法の例としては、それらには限定されないが、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）（イングヴアール（ｌｎｇｎエマ１．　Ｅ、、　ｆｌｅｓｈ、　Ｅｎａｍｏｌ、、７０（１９８＋１１　、放射免疫測定（ＲｒＡ）、及び「サンドウィッチ」免疫放射測定（ＩＲＭＡ）が挙げられる。

その最も簡単な形態において、これらの免疫分析測定法は、単に体液を３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を宵するコラーゲンテロペプチドに特異的な免疫学的結合対手と接触させることにより、骨の再吸収またはコラーゲン分解の絶対速度を定量するのに使用することができる。

上記した免疫学的分析は、直接未処理の体液（例えば、尿、血液、血清、または滑液）に行うことが好ましい。場合によっては、汚染物質が分析を阻害するかもしれないので、体液の部分的な精製を必要とする。部分的精製は、それらに限定されないが、カートリッジ吸着及び溶出、分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びそれらの組み合わせが挙げられる。

本発明に使用するのに適当な試験キットは、上記したように製造されたモノクローナル抗体のような特異的結合対手を含み、それは体液中に見出されるコラーゲン分解に由来するペプチド断片と特異的に結合するものである。この試験キットの特異的結合対手は、上記したタイプの検出可能なマーカーと結合するものであることが好ましい。二若しくはそれ以上の結合対手のパネルを含有する試験キット、特に免疫学的結合対手が意図されている。そのような試験キットのそれぞれの結合対手は、他のタイプのコラーゲンから由来するテロペプチドと実質的に架橋しないことが好ましいであろう。例えば、タイプ■コラーゲンと特異的に結合する免疫学的結合対手は、タイプＩまたはタイプ■コラーゲンテロペプチドの何れとも交差反応しないことが好ましい。多少（例えば、５〜１０％）の交差反応は許容できる。他の試験キットとしては、ピリジニウム環（それは、ＯＨ−置換されていてもよい）含有する架橋体を有するコラーゲン−由来テロペプチドに対する第一の特異的結合対手、及び例えば、光分解により、ピリジニウム環が開裂している以外は第一のテロペプチドと同一の構造を育するテロペプチドに対する第二の特異的結合対手を含んでいてもよい。

（ｉｌ　モノクローナル抗体の製造以下は、上記式３．に基づくペプチド免疫に対するモノクローナル抗体の製造例である。

式３　（骨コラーゲン分解を示す）のペプチドに富んだ留分を、逆相及び分子篩クロマトグラフィーを用いて青年のヒトの尿から調製した。このペプチドを、グルタルアルデヒドと共に、通常の工程を用いて、陣笠貝ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｆ（）と接合させた。マウス（Ｂ＋ｌｂ／ｃ）にこの接合体［５０−７０１ｘ）を皮下注射することにより免疫し、先ず、完全フロインドアジュバント中において、次いで、３週間の間隔で不完全７０インドアジユバント中、腹腔内で増殖させたｆ２５］　ｇ）。試験血液が、ＥＬ　Ｉ　ＳＡフォーマットを用いてウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）と接合した式３゜のペプチド（以下において、Ｐｌと言及する）に対する高い力価を示した後に、選択したマウスを、殺菌したＰＢＳ中の低濃度（５）　ｇ）の免疫源で静脈注射することにより増殖させた。３日後、個々のマウスの膵臓からの細胞を、通常の細胞融合技術を用いてマウスミエローマ細胞と融合させた。９６−ウェルのプレートの個々のウェルで増殖したハイブリドーマクローンの上清を、最初に、ＢＳＡに接合した粗Ｐ１製剤を用いて、反応性モノクローナル抗体を分別した。暇界希釈による正式なりローニングの後、個々のハイブリドーマで産生された抗体は、ＥＬＩＳＡ分析を用いた抗原の篩分は用パネルに対して特性化される。これらの抗体は、ＢＳＡに接合したＰＬ（式３）及びＰ２（式４）のペプチドである。ＢＳＡと接合したＰｌがプラスチックウェルでプレートアウトしている場合、抑制分析が使用され、抗体は有効な抗原の溶液で予めインキュベートされる。第二の抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ、ＨＲＰに接合したヤギ抗−マウスＩｇＧ）は、適当な基質を用いた色発色に使用される。Ｐ１ペプチドとの高い結合親和性を有する望ましいモノクローナル抗体が同定された。腹水液製造に使用される場合、抗体は、２．　ＯＨ，０００倍希釈で最適色領域での抑制分析において機能する（このことは、結合定数が、１０−９〜１Ｏ−ＩＩ　Ｍ−１の範囲、最も好ましくは約ＩＱ−１０Ｍ−１であることを示している）。ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、抗体は、如何なる濃縮または清浄工程を経ることなく健常人の尿中に存在するＰｌを検出し、そして測定することが可能であった。この好ましいモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、承認番号Ｈ８１０６１１のもとにメリーランド２０８５２　、ロックビル、パークローン・ドライブ＋２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。このハイブリドーマは以下において１旧ｌとして示されており、それを産生ずるモノクローナル抗体は以下においてＭｓｂ−ＩＨｌｌとして示さてれいる。

サンドウィッチ分析は、また、接合Ｐ１に対するウサギで培養されたＰｌ−特異的モノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清を用いて機能することを示す。

Ｐｌ−特異的モノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清、その結合断片、等の何れも、標準ＥＬ　Ｉ　ＳＡ及び他の免疫分析プロトコルを用いる検出可能な仕様で、尿からのＰｌと特異的に結合するために使用することができる。

（１１）好ましいエピトープの特性抗体ＭＡｂ−１１１１１によって認識されるエピトープは、Ｐｌの構造中に体現されている。エピトープは、純粋なＰｌ中で、及びＰ１構造（例えば、ＰｌのＮ −末端アスパラギン酸残基を介してチロシン残基に結合したＰＬ）を含有する、成るより大きいペプチド中に認識される。エピトープは、ペプチドＰ１の構造中に体現された二つのテロペプチドの両方の化学的特徴を含んでいる。ウシ血清アルブミン（即ち、ＹＤＥＫＳＴＧＧＣ及びＱＹＤＧＫＧＶＧＣ）と結合するＣ− 末端システインノ添加ニヨリ、ヒト５ｔ（１１及びｔｅｌ）−テロペプチド配列と適合するように合成されたペプチドは、ＭＡｂ−１１（１１によっては認識されなかった。このことは、プレートアウトしたＰｌ（図９参照）に対し、競合する、または直接、結合対手としてＢＳＡに接合し、プレートアウトした遊離のペプチドを使用するＥＬＩＳＡにより示される。図９に言及すると、検出可能なマーカーのｇ＝４５０ｎｍにおける吸光度を、遊離Ｐ１ペプチドの濃度に対してプロットしている。遊離Ｐ１の量が増大するに従い、免疫（プレートアウト）されたＰｌに結合した検出可能なマーカーの量は減少する。

比較として、暑２（１）及び１１（ＩＩ　Ｎ−テロペプチドは、１１Ａｂ−［８１１との如何なる重大な競合結合も殆どないことを示している。

更に、Ｎ−末端アスパラギン酸のチロシン残基を生ずるＰｌのより大きい形態は、Ｐｌより低い収率ではあるが、ＭＡｂ−１１１１１への結合親和力により尿中から回収された。Ｐ１エピトープを生ずる他のやや大きいペプチドも回収されたが、より少ない量であった。

抗体は、Ｐｌ中の架橋体の性質について、即ち、ヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）かリシルビリジノリン（ＬＰ）かどうかについて選択的ではなかった。

アガロースに結合したＭＡｂ−１旧１から成るアフィニティカラムで尿から単離したペプチドの分析から判断すると、明らかに等しい親和性で、ＨＰ−含有及びＬＰ−含有形態の両方が結合した。何れも骨コラーゲンからの酸加水分解により作られ、または尿中に自然に存在する、遊離の架橋アミノ酸である、ＨＰ及びＬＰは、輩＾ｂ−ＩＨ１１により認識されなかった。

紫外光（要素外光）によるペプチド免疫中の３−ビリジノール環の光分解開環の後に、特異的抗体結合は、恐らくは、残された個々のペプチドがお互いに架橋するために、影響されなかった。実験を以下のように行った。

ＨＰ及びＬｌを完全に破壊することが示された（ＲＰ−ＨＰＬＣの特性蛍光ピークの蛍光の損失による証拠に基づき）条件を用いて、遊離アミノ酸または不溶性ペプチドの何れか及び完全タンパク質鎖とし、Ｐｌの製剤は照射されたく長波長の設定−−ミネラライト（Ｍｉｆｆｉｅｎｔｉｇｂｔｌ　１１１５Ｌ−２５ランプ（ＵｌｌｎＪｉｏｌｅｌ　Ｐｒｏｄｍｃｔｔ　ｌｅｅ、、Ｓｇｅ　Ｇｓｂ＋ｉｔ１．Ｃｓ１ｉｌｏ＋ｏｉｔｌ。

この溶液は、照射されていない全く同一物質の対象溶液を用いて、霞へ〇　［１１１１に対する結合を分析した。＋ｕｉｉのＥＬ　Ｉ　ＳＡによる結果は、Ｐｌに対する結合に本質的な損失がないことを示し、環の開裂がエピトープに重大な影響を与えていないことを意味している。ＵＶ照射の条件下（ｐＨ９）、環を開くための単結合の開裂の方が、環の窒素及びその例語合手を除去するための二重結合の開裂よりも起こり得ることが予測される。比較のために、アイル（Ｅｒｒｅ、　Ｄ、、　１ｌｅ１．　ＥｍｘＹ−ｏｌ、　１４４：１５５−１３９　［＋９８７＋）参照。

ＭＡｂ−１１１１１に認識されるエピトープは、それ故、それらに結合している三価の架橋アミノ酸により付与される立体的特徴と共に、図１０に枠で示したように、二つのテロペプチド配列に体現されている、少なくとも化学的及び構造的特徴から作られている。＋２（１）　Ｎ−テロペプチド配列であるＱＹＤＧＫは、エピトープの特に重要な部分である。

賛＾ｂ−ｊＨＩＩにより認識されるエピトープが完全なピリジニウム環に依存しないという事実は、予測されない発見である。通常の取扱い条件下で生体内及び試験管内の何れでも開環が起こるのであれば、明らかに思われるように、完全ピリジニウム環を有する対象ペプチドの定量分析では、骨の分解が低く評価されるであろう。予備的な観察は、対象とするペプチド中のピリジニウム環の分解が、たとえ冷凍したとしても、特に、尿及び／または尿試料中において起こると思われる。

従って、本開示に基づく分析は、比較上、より正確であると考えられる。二つの態様が考えられる二目的とするペプチドの閉じた及び開いた環の態様の両者を認識する、単一の特異的結合対手が使用されるか、或いは、閉じた及び開いた環のエピトープをそれぞれ区別しうる、二つの結合対手が使用される。

目的とするペプチドの閉じた及び開いた環の形態の間を識別する特異的結合対手は、そのような特異的結合対手を得るための通常の工程中に適当な篩分は工程を導入することにより得ることができる。例えば、Ｐ１ペプチドの開環形態に特異的に結合するモノクローナル抗体を得るために、モノクローナル抗体の候補のライブラリーは、それらの開鎖ピリジノリン環を有するＰｌと結合する能力を（例えば、紫外光照射により）、及びそれらの完全ピリジノリン環を有するＰｌと結合し得ないことから篩分けすることができる。そのような篩分は工程に有用な開環及び完全環ペプチドは、上記したＲＰ−ＨＰＬＣのような公知の精製技術で得ることができる。

更なる実験は、エピトープがヒト骨のコラーゲン中に存在しているが、広範囲にわたるタンパク質分解の後にのみ、ＭＡｂ−ＩＨｌｌにさらされ、そして結合されることを示した。かくして、細菌性のコラゲナーゼにより脱灰されたヒト骨コラーゲンから製造されたベプチ日ｔＭＡｂ−１１１１１に結合され、図１０に示されたように、らせん位置のＮ−テロペプチドから由来することが示されている。一つの形態は、＊１．（１）残基９Ｈ−９３３から明らかに由来するヘキサペプチドのＧ１にＧＨＲ（ＰＬ中の非テロペプチドに結合手の場所）を含んでいた。他の形態は、＊２（Ｉ）鎖から由来するヘキサペプチドと等価であるが明白に区別されるものを体現した。ペブンン、ＣＮＢｒ、またはトリプシンで溶解されたヒト骨コラーゲンの断片は、競合阻害剤として使用される場合のＥＬＩＳＡ法におても、或いは５ＤＡ−ポリアクリルアミド電気泳動の後のウェスタン・プロットによっても、１ｌＡｂ−ＩＨＩＩによっては認識されず、これらの溶解剤がＭＡｂ−１）１１１によって認識されるエピトープを製造しないことを示している。

Ｂ　ペプチド分析用電気化学的工程上記したペプチドを分析するための他の方法は、３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有するペプチドの物理的性質を測定することから成る。そのような物理的性質の一つは、電気化学的検出による。この方法は、尿のような体液の一定量を、３−ヒドロキシピリジニウム環を含有するペプチドの検出に適当な酸化−還元電位に平衡をとった電気化学的検出器に注入することから成る。３−ヒドロキシピリジニウム環は、フェノールであり、可逆酸化反応を行い、そしてそれ故、電気化学的検出器（例えば、モデル５１００＾クーロケムｆｃｏｎｌｏｅｈ＋１）、エサｊＥ＋ｘ、４５　Ｗｉｇｇｉｕ＾ｗｅ、、Ｂｅｄｌｏ＋ｄ、　ＩＪＡＩ　から市販）は、本ペプチドの濃度を定量するのに適当な、高度に望ましい機器である。二つの基本的な形態の電気化学的検出器が、現在市販されている　アンペアメトリック（例えば、ＢｉｏＡｕｆ７１ｉｕｌ　Ｓ７Ｎ＋ｓＩ）とクーロメトリツク（ＥＳ＾、Ｉｎｃ、、Ｂ＋ｄｌｏ＋ｄ、ＭＡ　０１７３０１　である。共に本発明において適当に使用されるが、しかし、後者の系は本来的により高感度であり、それ故、カラム流出液において分析すべき分子の完全な酸化または還元が達成されるので好ましい。更に、妨害物質を選択的に酸化または還元するために、篩または保護電極を分析電極の「上流」に配置することができ、それにより選択性を非常に改良することができる。本質的には、分析電極の電圧は、試料分子の酸化還元電位に変えられ、−若しくはそれ以上の予備処理細胞が、試料中の妨害物を破壊するために配置される。

好ましい分析方法において、通常の電流／電圧曲線は、最適な感度を設定するための適正な電圧を決定するために、リシルビリジノリンまたはヒドロキシリシルピリジノリンを含有する標準的なペプチドについて確立される。この電圧は、汚染物質からの妨害を最小にし、感度を最適化するために、体液に応じて修正される。電気化学的検出器及びそれらを使用するための最適条件は、当業者によく知られている。体液の複合混合物は、しばしば、妨害なく電気化学的検出器により直接分析される。従って、多くの患者にとって、体液の予備処理は必要としない。しかしながら、ある場合には、妨害化合物が測定の信頼性を減するかもしれない。そのような場合には、体液（例えば、尿）の予備処理が必要であろう。

従って、発明の他の実施態様において、体液は精製されたペプチド断片を電気化学的に滴定するに先立ち、先ず精製される。精製工程は、種々の方法によって行われ、限定されないが、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい精製の態様において、２４時間尿試料の測定された一定量（２５ｍｌ）を、塊状の汚染蛍光溶質を除去するために、減少した気孔率の透析管透析される。非拡散物を、次いで、凍結乾燥し、１％へブタフルオロ酪酸（ＨＦ　Ｂ　Ａ）のイオン対溶液に再溶解し、そしてペプチドがウォーターズ・セブーバックＣ−１８カートリッジに吸着される。このカートリッジは、次いで、５１１の１％ＨＦＢＡで洗浄し、更に１％１（Ｆ　ＢＡ中、５０％メタノール３１で溶出される。

精製の他の好ましい方法は、測定した一定量の尿をイオン交換フィルターに吸、着させ、そして吸着フィルターを緩衝した溶出液で溶出することから成る。３− ヒドロキシピリジニウム架橋体を有するペプチド断片を含有する溶出留分は、次いで、分析のために集められる。

精製の更に他の好ましい方法は、分子篩クロマトグラフィーを用いる。例えば、尿の一定量を、バイオ・ゲル（Ｒｉｏ−Ｇｅｌｌ　Ｐ　２またはセファデツクス（Ｓｅｐｈｔ−ｄｔｔｉＧ−２０カラムにかけ、次いで、１０００−５０００ダルトン領域に溶出した留分を集める。当業者にとっては、上記方法の組み合わせが３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有するペプチド断片を単離するために、尿または他の体液を精製し、または部分的に精製するために使用されることは明白であろう。上記工程により得られた精製し、または部分的に精製したペプチド断片は、更に追加の精製工程を行ってもよく、更に部分的に精製した状態で直接処理または分析してもよし１゜追加の精製工程は、増大した感度が望ましい場合には、高速液体クロマトグラフィ＝（）Ｔ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）またはマイクロポアＨＰＬＣを用いることにより、部分的に精製されたペプチド断片を分別することを含む。これらのペプチドは、次いで、電気化学的滴定により定量される。

好ましい電気化学的滴定法は、電気化学的検出器（クーロケム、モデル５１００＾）の検出セルの酸化還元電位を、純粋ＨＰで最高信号となるよう調整する。検出器は、次いで、部分的に精製したペプチドを分別するために使用されるＣ−１８ＨＰＬＣカラムからの流出液を監視するために使用される。

Ｃペプチド定量用蛍光分析工程ここで記載する３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有するペプチドの濃度を定量する他の好ましい方法は、これらのペプチドの天然の蛍光特性を測定することである。３−ヒドロキシピリジニウム架橋体以外の自然に発する蛍光物質を殆ど含まないそれらの体液については、体液を更に精製することなく、直接蛍光分析が行われる。この場合、ペプチドはＨＰＬＣで分解され、ＨＰ及びＬＰアミノ駿残基の自然の蛍光を３９５　ｕで２９７ｃ層の励起で測定される。ここで引例として導入されたアイル等（Ｅ７＋ｅ、　Ｄ、Ｒ，、ｅｌ１．、　Ａ１１ｌｌ山　Ｂｉｏｅｈｅｔ　１３７：３８０　（１９８４１１に実質的に記載されている。

本発明によれば、尿の蛍光分析を行うことが好ましい。尿は、しかしながら、通常、蛍光分析を行う前に除去されなければならない、かなりの量の自然に生ずる蛍光汚染物質を含有している。従って、尿試料は、上記したように、電気化学的分析のために、先ず、部分的に精製されなければならない。この部分的に精製された尿試料は、次いで、上記したように、蛍光測定法による分析を行うことができる。一方、部分的に精製した尿試料または他の体液中のＨＰ及びＬＰ架橋ペプチドは、上記したアイル等（Ｅ７ｎ、ｅｌ　ｔｌ、　（１９８４））に記載されているように、５１１ＨＣ１中、約１０８℃でおおよそ２４時間加水分解することができる。この工程は、「トリペプチドＪＨＰ及びＬＰ架橋体のりシン前駆体に連結しているアミノ酸を加水分解し、式１．及び２．で示される遊離の［（Ｐ及びＬＰアミノ酸を生ずる。

これらの小さい「トリペプチド」は、次いで、上記した技術、好ましくはＨＰＬＣで分解され、そして自然の蛍光が測定される（Ｅ！　２９７　ｎｔ　Ｅｒ　３９Ｇ　Ｉｌｍ）。

任意に、体液（好ましくは、尿）は、アセトニトリル／メタノール５ル１０水酸化テトラブチルアンモニウム等のカチオン性イオン対試薬により、０．０５〜［１．ＩＯＭに調整され、そして第二のＣ−１８逆相カートリツジを通される。この第二のカートリッジからの蛍光ペプチドを含有する洗浄した残留物は、アセトニトリル：水（またはメタノール、水）で溶出され、乾燥され、そして蛍光ペプチドは、溶離液中の０．０１Ｍトリフルオロ酢酸のようなアニオン性イオン対試薬を用いて、逆相ＨＰＬＣまたはマイクロポアＨＰＬＣにより分析される。

図８Ａは、健常人の尿からのペプチド断片の加水分解物を、自然の蛍光により逆相ＨＰＬＣによって分別した溶出図を示す。与えられた成分の周りの統合された領域の測定は、試料中のその成分の濃度を測定するために使用される。健常人尿及びベージェット病患者の尿から見出されるＨＰ　：　ＬＰの比は、図８Ｂのように、共に、約４５：１である。これは、骨それ自身に見出される４；１の比よりも若干高い（アイル等（Ｅ７＋ｅ，　ｅｌ　＊１．、　１９８４）ｌ。尿中に見出される高い比は、尿中のＨＰ留分の一部が、食物のような骨量外の源から、或いはコラーゲン分解のための源、即ち、カートリッジの異化作用からきていることを示している。この理由のために、骨からのみ由来するＬＰを骨の再吸収の絶対的指標を提供するものとして使用することが好ましい。しかしながら、リウマチ関節炎のような過剰のカートリッジ分解がない場合または骨が急速に吸収される場合には、ＨＰまたはＨＰプラスＬＰの組み合わせを骨再吸収の指標としてもよい。

本発明を好ましい実施態様に関連して記載したけれども、先の明細書を読んだ後の当業者は、ここに記載した主題の種々の変更、等価な置換及び交替を行なうことができるであろう。よって、本発明はここに特別に記載した以外の方法によっても行なうことができる。

蛍光（ｌＸ　２９７ｎｙｎ）　ｌｒ−”Ｘ）ｙｙｒｒｓ）吸光度　（？２６’ｒｙ匈年齢（歳）図５年齢（歳）図６蛍光　ｆＸ、？　９　Ｆ／７／７７蛍光　２９めｊす３１θバグ図９卿図１０国際調査報告＋＋＋＋ｗｖｉｍ−ｉ−Ｉｃｔｈ＋＋ＬＰＣＴ／ＵＳ　９０１０７０１５ｋｔｍ　ＰｅＴμｖｎＩＯ（卸乞詞ｎ−情ｌ　＠ＩＩＮＩＩ　１２１１　、Ｐ＄１１２８　≦ｔ１階ａｎｄヴ曹１馳６−６巾＋ｙＩＩＩｅ　ＰＣＴ／ｌｌＱ９０／ｎ７ｎＩ＜Ｓ＾　４２５８１

Claims

【特許請求の範囲】

１．体液を、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリンまたはリシルピリジノリンであり、Ｇｌｎはグルタミンまたはピロリジンカルボン酸である）の構造から実質的に成る第一のペプチド及び架橋しているピリミジニウム環が開裂している以外は上記式を有する第二のペプチドに対する少なくとも一つの特異的結合対と接触させる工程から成ることを特徴とする骨吸収の定量方法。
２．該体液が、尿、血液、血清または滑液である請求項１記載の方法。
３．該体液を、該第一のペプチドに対する第一の特異的結合対及び該第二のペプチドに対する第二の特異的結合対と接触させることから成る請求項１記載の方法。
４． ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリンまたはりシルピリジノリンであり、Ｇｌａはグルタミンまたはピロリジンカルボン酸である）の構造から実質的に成る第一のペプチド及び架橋しているピリミジニウム環が開裂している以外は上記式を有する第二のペプチドに対する特異的結合対から成ることを特徴とする骨吸収の定量用キット。
５．完全ピリジニウム環を有するヒドロキシリシルピリジニウム架橋体を含有するＣ−末端タイプＩＩコラーゲンテロペプチドから成る第一のペプチド、及び開裂しているピリジニウム環を有するヒドロキシリシルピリジニウム架橋体を含有するＣ−末端タイプＩＩコラーゲンテロペプチドから成る第二のペプチドの、体液中の濃度を定量することから成ることを特徴とする生体内の軟骨分解を定量する方法。
６．体液が、尿、血液、血清、または滑液である請求項５記載の軟骨分解を定量する方法。
７．第一及び第二のペプチドが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｈｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌはヒドロキシリシルピリジノリンである）の構造を有するものであり、該第一の及び第二のペプチドが完全または開裂したピリジニウム環をそれぞれ有する請求項５記載の軟骨分解を定量する方法。
８．第一及び第二のペプチドが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｈｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌはヒドロキシリシルピリジノリンである）の構造を有するものであり、該第一の及び第二のペプチドが完全または開裂したピリジニウム環をそれぞれ有する請求項５記載の軟骨分解を定量する方法。
９．３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を含有するタイプＩＩＩコラーゲンテロペプチドから成る第一のペプチド、及び開裂しているピリジニウム環を有する３ −ヒドロキシピリジニウム架橋体を含有するタイプＩＩＩコラーゲンテロペプチドから成る第二のペプチドの、体液中の濃度を定量することから成ることを特徴とする生体内のコラーゲン性連結組織の分解を定量する方法。
１０．３−ヒドロキシピリジニウム架橋体がヒドロキシリシルピリジノリンである請求項９記載の方法。
１１．体液が、尿、血液、血清、または滑液である請求項９記載の方法。
１２．タイプＩＩＩコラーゲンテロペプチドが式：▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｈｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌはヒドロキシリシルピリジノリンである）の構造を有するものであり、該第一の及び第二のペプチドが完全または開裂したピリジニウム環をそれぞれ有する請求項９記載の方法。
１３．該第一の及び第二のペプチドに対する少なくとも一つの特異的結合対手から成る請求項５から１２の何れかに記載の方法を行うためのキット。
１４．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｋ−Ｋ−Ｋは、ヒドロキシリシルピリジノリンまたはリシルピリジノリンであり、Ｇｌｎはグルタミンまたはピロリジノンカルボン酸であり、そして、第一及び第二のペプチド中の架橋アミノ酸のピリジニウム環がそれぞれ閉環及び開環である）の構造から実質的に成る第一及び第二のペプチドと結合するモノクローナル抗体を産生するセルライン。
１５．ＡＴＣＣ　ＨＢ　１０６１１（１Ｈ１１）で同定される特性を有する請求項１４記載のセルライン。
１６．請求項１４記載のセルラインで産生されるモノクローナル抗体。
１７．請求項１５記載のセルラインで産生されるモノクローナル抗体。
１８．体液中のペプチドの濃度を定量することから成り、該ペプチドがヒドロキシリシルピリジノリン架橋体を含有するＣ−末端タイプＩＩコラーゲンテロペプチドから成ることを特徴とする、生体内の軟骨分解を定量する方法。
１９．体液が、尿、血液、血清、または滑液である請求項１８記載の軟骨分解を定量する方法。
２０．検出工程が、体液を該Ｃ−末端タイプＩＩコラーゲンテロペプチドに対する特異的結合対手と接触させることから成る請求項１８記載の軟骨分解を定量する方法。
２１．Ｃ−末端タイプＩＩコラーゲンテロペプチドが、▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｈｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌがヒドロキシリシルピリジノリンである）である請求項１８記載の軟骨分解を定量する方法。
２２．Ｃ−末端タイプＩＩコラーゲンテロペプチドが、▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｈｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌがヒドロキシリシルピリジノリンである）である請求項１８記載の軟骨分解を定量する方法。
２３．体液中のペプチドの濃度を定量することから成り、該ペプチドが３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を含有するタイプＩＩＩコラーゲンテロペプチドから成ることを特徴とする、生体内の軟骨分解を定量する方法。
２４．３−ヒドロキシピリジニウム架橋体がヒドロキシリシルピリジノリンである請求項２３記載の方法。
２５．体液が、尿、血液、血清、または滑液である請求項２３記載の方法。
２６．検出工程が、体液を該タイプＩＩＩコラーゲン架橋テロペプチドに対する特異的結合対手と接触させることから成る請求項２３記載の方法。
２７．タイプＩＩＩコラーゲンチロペプチドが、▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼】（式中、Ｈｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌはヒドロキシリシルピリジノリンである）である請求項２３記載の方法。
２８．３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を含有するＣ−末端タイプＩＩコラーゲンテロペプチドのアミノ酸配列から成り、ペプチドが、２Ａｓｘ、２Ｇｌｘ、９Ｇｌｙ、７Ｐｒｏ、５Ｌｅｎ、３Ａｒｇ、１Ｆｉｇ、１Ｖａｌ、及び１ヒドロキシリシルピリジノン残基であり、（ここで、それぞれのＡｓｘは独立にＡｓｐ及びＡｓｎから成る群より選ばれたものであり、それぞれのＧｌｘは独立にＧｌｎ及びＧｌｍから成る群より選ばれたものである）またはペプチドが上記アミノ酸組成よりも１〜２１アミノ酸が少ないものであるペプチド。
２９． ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｈｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌはヒドロキシリシルピリジノリンである）のアミノ酸配列を有する請求項２８記載のペプチド。
３０． ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｈｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌはヒドロキシリシルピリジノリンである）のアミノ酸配列を有する請求項２８記載のペプチド。
３１．タイブＩＩＩコラーゲンテロペプチドのアミノ酸配列から成り、３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を有し、ペプチドが、２Ｇｌｘ、４Ｔｔｒ、４Ｓｅｒ、２Ａｓｘ、４Ｖａｌ、５Ｇｌｙ、２Ａｌａ、１Ｉｌｅ、１Ｈｉａ、１Ａｒｇ、及び１ヒドロキシリシルピリジノン残基、または、１３Ｇｌｙ、２Ｉｌｅ、２Ｇｌｘ、４Ａｌａ、３Ｐｈｅ、１Ｐｒｏ、１Ｍｅｔ、１Ｈｉａ、１Ａｒｇ、及び１ヒドロキシリシルピリジノン残基のアミノ酸配列を有し、（ここで、それぞれのＡｓｘは独立にＡｓｐ及びＡｓｎから成る群より選ばれたものであり、それぞれのＧ１ｘは独立にＧｌｎ及びＧｌｍから成る群より選ばれたものである）またはペプチドが上記アミノ酸組成よりも１〜１８アミノ酸が少ないものであるペプチド。
３２． ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｈｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌはヒドロキシリシルピリジノリンである）のアミノ酸配列を有する請求項３１記載のペプチド。
３３．ヒドロキシリシルピリジノリン架橋体を含有するＣ−末端タイプＩＩコラーゲンテロペプチドに対する特異的結合対手から成る請求項１８記載の方法を行うための試験キット。
３４．３−ヒドロキシピリジニウム架橋体を含有するタイプＩＩＩコラーゲンテロペプチドに対する特異的結合対手から成る請求項２３記載の方法を行うための試験キット。
３５．ヒドロキシリシルピリジノリン架橋体を含有するＣ−末端タイプＩＩコラーゲンテロペプチドまたはヒドロキシリシルピリジノリン架橋体を含有するタイプＩＩＩコラーゲンテロペプチドに対し特異的に結合する−もしくはそれ以上の免疫学的結合対手から成ることを特徴とする試験キット。
３６．生理的条件で測定対象物の存在を示す体液を分析する方法において、体液を該測定対象物に特異的に結合する対手と接触させ、測定対象物と特異的結合対手の間に起こる何らかの結合を検出する工程から成り、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩコラーゲンの分解により、生体内において製造される架橋したテロペプチドと同一の配列を有する架橋テロペプチドに対する少なくとも一つの特異的結合対手と体液を接触させることを特徴とする方法。