KR20140084164A - 암의 치료를 위한 scd1 길항제 - Google Patents

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KR20140084164A
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아비 아쉬케나지
샹난 두
징 칭
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제넨테크, 인크.
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Abstract

병리학적 상태, 예컨대 암의 치료를 위한 요법, 및 SCD1 길항제를 사용하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

암의 치료를 위한 SCD1 길항제{SCD1 ANTAGONISTS FOR TREATING CANCER}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 35 USC § 119하에 2011년 10월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 61/547,706, 및 2012년 9월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 61/704,397을 우선권 주장하며, 이들은 둘 다 그 전문이 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 2012년 9월 27일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 P4767R1WO_PCTSequenceListing.txt로 명명되고, 크기는 4,335 바이트이다.
분야
병리학적 상태, 예컨대 암의 치료를 위한 요법, 및 SCD1 길항제를 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
방광암은 전세계적으로 5번째로 가장 흔한 암이며, 2009년에 미국에서 70,980개의 새로운 사례 및 14,330명의 사망이 발생한 것으로 추정된다 (34). 방광암에서 FGFR3 활성화 돌연변이 및/또는 과다발현의 유병율 및 대규모의 전임상 기능-상실 연구는 이러한 질환 환경에서 중요한 종양원성 구동인자 및 잠재적 치료 표적으로 FGFR3을 연관시켰다 (12, 21-25). FGFR3을 표적화하는 치료제의 임상 개발을 위한 최근의 진전에도 불구하고, FGFR3 신호전달이 방광암 발생 및 진행에 어떻게 기여하는지에 대한 결정적인 통찰이 분명해질 필요가 남아있다.
FGFR3은 4개의 구조적으로 및 기능적으로 관련된 수용체 티로신 키나제의 패밀리에 속하며, 이들은 인간에서 22개의 확인된 FGF 폴리펩티드 중 다수로부터 신호를 전달한다 (1-3). 리간드 결합시에, FGFR3은 이량체화되어 특정 티로신 잔기에서 자가인산화된다. 이는 어답터 단백질, 예컨대 FGFR 기질 2α (FRS2α)의 수용체로의 동원을 촉발하여 정규 Ras-Raf-MAPK 및 PI3K-Akt-mTOR 경로를 비롯한 다중 하류 신호전달 캐스케이드의 활성화를 일으킨다 (1-3). FGFR3 신호전달은 배아 발생 동안 및 조직 항상성의 유지에서 결정적 역할을 수행하고, 세포 증식, 분화, 이동 및 생존을 컨텍스트-의존성 방식으로 조절한다 (3-4).
FGFR3의 이상 활성화는 다양한 생리학적 및 병리학적 상태와 연관된다. FGFR3의 기능-획득 돌연변이는 여러 인간 선천성 골격 및 두개 장애에서 가장 흔한 유전자 변경 중 하나이다 (5-6). 돌연변이 또는 과다발현을 통한 FGFR3의 조절이상은 또한 t(4;14) (p16.3;q32) 염색체 전위에 양성인 다발성 골수종 (7-10), 방광암 (11-14), 유방암 (15), 자궁경부 암종 (11, 16), 간세포성 암종 (17), 편평 비소세포 폐암 (18, 19) 및 고환 종양 (20)을 비롯한 다양한 인간 암과 연관된다. 특히, FGFR3에서의 체세포 활성화 돌연변이는 유두상의 60-70% 및 근육-침습성 방광 종양의 16-20%에서 확인되었다 (13-14). 또한, FGFR3 과다발현은 유의한 분획의 표재성 뿐만 아니라 진행성 방광암에서 보고되었다 (12-13, 21). 중요하게, 다수의 기능-상실 연구가 FGFR3 기능의 약리학적 및 유전자 개입이 배양물에서 방광암 세포 증식을 차단하고, 동물 모델에서 종양 성장을 억제한다는 것을 입증한다 (12, 22-25). 총괄적으로, 이러한 데이터는 방광암의 하위세트가 FGFR3 활성에 부가적임을 나타내며, 이는 방광암에서 치료 표적으로서의 이러한 수용체의 중요성을 강조한다. 실제로, FGFR3에 대한 모노클로날 항체 및 소분자 억제제는 둘 다 최근에 이러한 질환 환경에서 잠재적 표적화 요법으로 개발되었다 (26-28). 세포 표면 FGFR3으로부터 발생한 항-FGFR3 작용제의 임상 개발 및 정규 신호전달 경로의 특성화를 위한 이러한 최근의 진보에도 불구하고, 현재 FGFR3 신호전달이 어떻게 방광 발암에 기여하는지에 대한 정보는 거의 없다. FGFR3 활성화 하류의 정확한 분자 및 세포 결과가 분명해질 필요가 남아있다.
병리학적 상태, 예컨대 암의 치료를 위한 요법, 및 SCD1 길항제를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 한 측면에서, 암 세포를 유효량의 SCD1 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 세포 증식을 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 세포 증식을 억제하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 암 세포를 유효량의 SCD1 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 세포 주기 정지를 유도하는 방법이 제공된다. 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 세포 주기 정지를 유도하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.
한 측면에서, 암 세포를 유효량의 SCD1 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 아폽토시스를 촉진하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 아폽토시스를 촉진하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 또 다른 측면에서, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포는 자궁내막암 세포, 두경부암 세포, 신장암 세포, 난소암 세포, 결장암, 췌장암 세포, 비뇨기암 세포 또는 방광암 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 신장암 세포, 췌장암 세포 또는 방광암 세포이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현한다.
또 다른 측면에서, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 개체에서 암은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현한다.
한 측면에서, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 개체를 기반으로 하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 단 개체는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)고 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 것으로 밝혀진 것인, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 개체로부터 수득한 샘플이 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는지 결정하는 것, 및 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 유효량으로 개체에게 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 또 다른 측면에서, (a) 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 개체를 선택하는 것; 및 (b) 이에 따라 선택된 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 개체로부터 수득한 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 크다는 것을 나타내거나 또는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 크거나 또는 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 작은 개체를 확인하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 하나 이상의 바이오마커를 평가하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 더 크다는 것을 나타내고, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 있는지 여부를 예측하는 방법이 본원에 제공된다.
한 측면에서, 개체로부터 수득한 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응을 예측하는 것이고, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응의 결손을 예측하는 것인, SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응 또는 반응의 결손을 예측하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 암을 갖는 개체로부터 수득한 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는다는 것을 나타내고, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 감소된 가능성을 갖는다는 것을 나타내는 것인, 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 가능성을 결정하는 방법이 본원에 제공된다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암은 자궁내막암 세포, 두경부암, 신장암, 난소암, 결장암, 췌장암, 비뇨기암 또는 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 신장암, 췌장암 또는 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 FGFR3이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 인산화 FGFR3이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자이다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SREBF1, G6PD, ACOT7, PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11, ACER3, PDSS1, MVD, AGPAT5, HSD17B2, ACSL4, EBP, PIGW, LBR, ACLY, ADORA2B, GPCPD1, CYP24A1, ACSL3, MVK, ACSS2, FDPS, ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SC4MOL을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 성숙 SREBP1이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 Δ9 단일불포화 지방산이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 Δ9 단일불포화 지방산:포화 지방산의 비이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 PI3K 신호전달, mTOR 신호전달, MEK 신호전달이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 PI3K, PTEN, p85, TSC1/2 및 AKT로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 다형성이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 인산화 AKT이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 약 1.5배, 약 1.75배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 2.75배, 약 3.0배 또는 약 3.25배 초과 상승된다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 G01522403 (A37062), G02447171, 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 RG1, RG3, RG8, 또는 그의 유도체이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 추가의 치료제를 추가로 포함한다.
도 1. FGFR3-조절된 유전자의 확인. 3개의 FGFR3 shRNA의 유도시에 유의한 발현 변화를 갖는 유전자의 벤-다이어그램 아웃라이닝 오버랩. 적색 숫자는 상향조절된 유전자를 나타내고, 녹색 숫자는 하향조절된 유전자를 나타낸다.
도 2. FGFR3 녹다운은 스테롤 및 지방산 생합성 및 대사에 관여하는 유전자의 발현을 감소시킨다. (A) FGFR3 녹다운에 의해 조절되는 것으로 밝혀진 프로브의 열 지도. 3개의 독립적 독시시클린-유도성 FGFR3 shRNA 또는 대조군 shRNA (Ctrl)를 발현하는 RT112 방광암 세포를 1 μg/mL 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 2일 동안 배양한 후에 RNA 추출하였다. 총 RNA를 마이크로어레이 연구에 적용하였다. 모든 3개의 FGFR3 shRNA에 의해 조절되는 유전자는 열 지도에 나타내었다. 상부 패널은 FGFR3 단백질 수준을 보여준다. (B) 콜레스테롤 및 지질 생합성에 관여하는 유전자의 코호트는 FGFR3 녹다운 세포에서 억제된다. (C, D) qRT-PCR에 의한 FGFR3-조절된 지질발생 유전자의 확인. 지질 (C) 및 스테롤 생합성 경로 (D)로부터의 대표적인 유전자의 mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해 측정하였다. 데이터는 평균 +/- SD로 제시된다. (E) FGFR3 녹다운은 SREBP1 발현을 중간 정도로 감소시키지만, SREBP2는 그렇지 않았다. SREBP1 및 SREBP2 mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해 분석하였다. 데이터는 평균 +/- SD로 제시된다.
도 3. FGFR3 siRNA는 UMUC-14 세포에서 스테롤 및 지방산 생합성 및 대사에 관여하는 유전자의 발현을 감소시킨다. UMUC-14 방광암 세포를 FGFR3 siRNA 또는 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시키고, 총 RNA를 형질감염 48시간 후에 추출하였다. 지질 (A) 및 스테롤 생합성 경로 (B)로부터 대표적인 유전자의 mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해 측정하였다. 데이터는 평균 +/- SD로 제시된다. (C) FGFR3 녹다운은 SREBP1 발현을 중간 정도로 감소시키나, SREBP2는 그렇지 않았다. SREBP1 및 SREBP2 mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해 분석하였다. 데이터는 평균 +/- SD로 제시된다.
도 4. FGFR3 녹다운 세포에서 SREBP1, FASN 및 SCD1의 감소된 발현은 감소된 지방산 합성 및 탈포화와 상관된다. (A) FGFR3 녹다운은 SREBP1, FASN 및 SCD1의 발현을 감소시킨다. 독시시클린-유도성 FGFR3 shRNA 또는 대조군 shRNA (Ctrl)를 발현하는 RT112 방광암 세포를 1 μg/mL 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 3일 동안 배양한 후에 수확하였다. 세포 용해물을 이뮤노블롯 분석에 적용하였다. (B) FGFR3 녹다운은 지질 생합성을 억제한다. RT112 세포를 1 μg/mL 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 3일 동안 배양한 후에 [14C]아세테이트와 4시간 인큐베이션하였다. 지질 분획을 추출하고, 지질에 혼입된 [14C]아세테이트를 섬광 계수에 의해 측정하였다. 데이터는 샘플 단백질 함량에 대해 정규화되고, 평균 +/- SD로 제시된다. (C, D) FGFR3 녹다운은 스테아르산 탈포화를 차단한다. RT112 세포를 1 μg/mL 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 3일 동안 배양한 후에 6시간 동안 [14C]스테아르산과 인큐베이션하였다. [14C]스테아르산 탈포화를 은착제 박층 크로마토그래피에 의해 분석하고 (C), 섬광 계수에 의해 측정하였다 (D). 데이터는 평균 +/- SD로 제시되고, 3개의 독립적 실험을 대표한다.
도 5. 항-FGFR3 모노클로날 항체, R3Mab는 UMUC-14 세포에서 SREBP1, FASN 및 SCD1의 발현 및 지방산 합성을 감소시킨다. (A) UMUC-14 방광암 세포를 1% FBS 배지 중에서 배양하고, 15 ug/mL 항-FGFR3 항체, R3Mab, 또는 대조군 항체 (Ctrl Ab)로 48시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. (B) UMUC-14 세포를 15 μg/mL R3Mab 또는 Ctrl Ab를 함유하는 1% FBS 배지에서 48시간 동안 배양하면서, [14C]아세테이트를 마지막 4시간에 첨가하였다. 지질 분획으로의 [14C]아세테이트 혼입을 추출하고, 섬광 계수에 의해 측정하였다. 데이터는 각각의 샘플에서 총 단백질 수준에 대해 정규화되고, 평균 +/- SD로 제시된다.
도 6. FGFR3 신호전달은 지질생성을 SREBP1-의존성 방식으로 촉진한다. (A) FGF1-FGFR3 축은 성숙된 SREBP1의 축적 및 FASN 및 SCD1의 발현을 자극한다. Cal29 방광암 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시킨 후에 FGF1 (25 ng/mL) 및 헤파린 (10 μg/mL)으로 지시된 시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 항-FGFR3 항체로 면역침전시키고, 항-포스포-티로신 항체 (4G10)로의 FGFR3 인산화에 대해 평가하였다. 용해물을 또한 이뮤노블롯팅하여 방법에 기재된 바와 같이 지시된 단백질을 검출하였다. (B) FGF1은 Cal29 세포에서 지방산 합성을 자극한다. Cal29 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시킨 후에 25 ng/mL의 FGF1 및 10 μg/mL의 헤파린과 24시간 동안 인큐베이션하였다. [14C]아세테이트를 또 다른 16시간 인큐베이션 동안 첨가하였다. 총 지방산 (TFA), 포화 (SFA) 및 불포화 지방산 (UFA)으로의 14C 혼입을 섬광 계수에 의해 측정하였다. 데이터는 샘플 단백질 함량에 대해 정규화되고, FGF1 처리하지 않은 경우와 비교하여 평균 +/- SD로 제시되며, 3개의 독립적 실험을 대표한다. (C) FGF1은 주로 SREBP1을 통해 SCD1 발현을 자극한다. RT112 세포를 SREBP1 (Sr1), SREBP2 (Sr2)를 표적화하는 siRNA, 또는 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후에, 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시킨 다음, FGF1 (25 ng/mL) 및 헤파린 (10 μg/mL)으로 24시간 동안 처리하였다. 전체 세포 용해물을 이뮤노블롯 분석에 적용하였다.
도 7. FGF1은 방광암 세포에서 SREBP1 활성화 및 지질생성을 자극한다. (A, B) Cal29 (A) 및 RT112 (B) 방광암 세포에서 FGF1-유도된 FGFR3 활성화의 용량 반응. Cal29 및 RT112 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시킨 후에, 상이한 용량의 FGF1 플러스 10 μg/ml 헤파린으로 10분 동안 처리하였다. 세포 용해물을 지시된 항체를 사용하여 이뮤노블롯 분석에 적용하였다. FGFR3 인산화를 방법에 기재된 바와 같이 분석하였다. Cal29 세포에서, 인산화 FRS2가 명백한 이동성 이동을 나타낸다는 것에 주목한다. (C) FGF1은 SREBP1 발현 및 성숙, 및 FASN 및 SCD1 발현을 자극한다. RT112 방광암 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시킨 후에 30 ng/mL FGF1 플러스 10 μg/ml 헤파린으로 지시된 시간 동안 처리하였다. 전체 세포 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. (D) FGF1은 지방산 합성을 자극한다. RT112 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시킨 후에 30 ng/mL의 FGF1 플러스 10 μg/mL의 헤파린과 24시간 동안 인큐베이션하였다. [14C]아세테이트를 마지막 16시간 동안 첨가하였다. 포화 (SFA) 및 불포화 지방산 (UFA)으로의 [14C]아세테이트 혼입을 섬광 계수에 의해 측정하였다. 데이터는 총 단백질 수준에 대해 정규화되고, FGF1 처리하지 않은 경우와 비교하여 평균 +/- SD로 제시되며, 2개의 독립적 실험을 대표한다.
도 8. FGFR3 신호전달은 성숙된 SREBP1의 축적 및 PI3K-mTORC1 경로를 통한 지질생성을 촉진한다. (A) FGFR3 신호전달의 약리학적 억제. RT112 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시킨 후에 라파마이신 (50 nM), Ly294002 (Ly294, 20 μM) 및 PD325901 (PD901, 100 nM)로 2시간 동안 처리하고, 이어서 30 ng/ml FGF1 플러스 10 μg/mL의 헤파린으로 10분 동안 자극하였다. 세포 용해물을 지시된 항체를 사용하여 이뮤노블롯 분석에 적용하였다. PD901 처리시의 MEK의 증가된 인산화는 아마도 피드백 억제의 완화로 인한 것임에 주목한다. (B) PI3K-mTORC1 및 MEK 억제제는 RT112 세포에서 SREBP1 및 SCD1의 FGF1 유도를 차단한다. RT112 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시키고, 키나제 억제제로 4시간 동안 처리한 후에, 30 ng/ml FGF1이 보충된 배지 중에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 이뮤노블롯팅하여 SREBP1 성숙, SCD1 및 FASN 발현을 검출하였다. (C) PI3K-mTORC1 및 MEK 억제제는 FGF1-자극된 지질 합성을 차단한다. RT112 세포를 (B)에 기재된 바와 동일하게 처리하였다. [14C]아세테이트를 마지막 4시간 인큐베이션 동안 첨가하였다. 지질 분획을 추출하고, 지질에 혼입된 [14C]아세테이트를 섬광 계수에 의해 측정하였다. 데이터는 샘플 단백질 함량에 대해 정규화되고, 평균 +/- SD로 제시된다. 이들 데이터는 2개의 독립적 실험을 대표한다.
도 9. FGFR3 신호전달은 Cal29 세포에서 성숙된 SREBP1의 축적 및 PI3K-mTORC1 경로를 통한 SCD1 발현을 자극하지만 MEK-MAPK 경로는 그렇지 않았다. Cal29 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시키고, 4시간 동안 비히클 (DMSO), 50 nM 라파마이신 (Rapa), Ly294002 (Ly294, 20 μM) 및 PD325901 (PD901, 100 nM)로 처리하였다. 이어서, 세포를 30 ng/ml FGF1이 보충된 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 용해물을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
도 10. SCD1 녹다운은 세포 증식을 억제하고 아폽토시스를 유도한다. SW780 (A) 및 UMUC-14 (B) 세포를 SCD1 siRNA 또는 3개의 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시키고, 세포 증식을 형질감염 72시간 후에 [3H]티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 데이터는 RNAiMax 단독으로 형질감염된 세포 (모의)와 비교하여 평균 +/- SD로 제시되고, 3개의 독립적 실험을 대표한다. 하부 패널: siRNA 형질감염된 세포에서 SCD1 수준을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯. (C, D) SCD1 녹다운은 SW780 세포에서 G1 세포 주기 정지 (C) 및 아폽토시스 (D)로 이어진다. 세포를 방법에 기재된 바와 같이 형질감염 48시간 후에 분석하였다. (E) SCD1 녹다운은 카스파제 3/7 절단 및 활성화를 유도한다. UMUC-14 세포를 SCD1 siRNA 또는 3개의 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시키고, 세포 용해물을 이뮤노블롯 분석에 적용하였다.
도 11. SCD1 녹다운은 방광암 세포에서 아폽토시스를 유도한다. (A) 방광암 세포 증식에 대한 SCD1 siRNA의 효과. 세포를 SCD1 siRNA 또는 3개의 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시키고, 세포 증식을 형질감염 72시간 후에 [3H]티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 데이터는 RNAiMax 단독으로 형질감염된 세포 (모의)와 비교하여 평균 +/- SD로 제시된다. (B) 1% FBS 배지에서 배양된 UMUC-14 세포를 SCD1 siRNA 또는 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시켰다. FACS 분석은 방법에 기재된 바와 같이 형질감염 48시간 후에 수행하였다. 데이터는 3개의 독립적 실험을 대표한다. (C, D) SCD1 녹다운은 카스파제 3/7 활성화를 유도한다. UMUC-14 세포 (C) 및 SW780 세포 (D)를 SCD1 siRNA 또는 2개의 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에, 카스파제 3 및 7의 활성을 카스파제-글로(Caspase-Glo) 3/7 검정 키트 (프로메가(Promega))로 측정하였다. 데이터는 평균 +/- SD로 제시되고, 2개의 독립적 실험을 대표한다.
도 12. SCD1 녹다운은 세포 증식을 지방산 탈포화-의존성 방식으로 억제한다. (A) SCD1 siRNA에 의한 SCD1 단백질 수준의 하향조절. SW780 세포를 SCD1, FASN을 표적화하는 siRNA, 또는 2개의 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시켰다. 세포 용해물을 이뮤노블롯팅하여 SCD1 및 FASN 발현을 평가하였다. (B) SCD1 녹다운은 스테아르산 탈포화를 차단한다. SW780 세포를 (A)에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에, [14C]스테아르산을 6시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. [14C]스테아르산 탈포화를 은착제 박층 크로마토그래피에 의해 분석하고, 섬광 계수에 의해 측정하였다. 데이터는 평균 +/- SD로 제시된다. (C) 단일불포화 올레에이트는 SW780 세포를 SCD1 녹다운으로부터 구제한다. 1% FBS를 함유하는 배지에서 성장한 SW780 세포를 SCD1 siRNA 또는 2개의 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시켰다. 형질감염 6시간 후에, BSA-복합체화된 올레에이트 산을 지시된 농도에서 배양 배지에 첨가하였다. 세포 증식을 처리 72시간 후에 [3H]티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 데이터는 RNAiMax 단독으로 형질감염시키고 (모의) BSA만 보충된 배지에서 성장한 세포와 비교하여 평균 +/- SD로 제시된다. 이러한 데이터는 3개의 독립적 실험을 대표한다. (D) 포화 팔미테이트는 SCD1 siRNA의 효과를 역전시킬 수 없다. 세포를 BSA-복합체화된 팔미테이트를 siRNA 형질감염 6시간 후에 첨가하는 것을 제외하고 (C)에 기재된 바와 유사하게 처리하였다.
도 13. SCD1 녹다운은 UMUC-14 세포에서 세포 증식을 지방산 탈포화-의존성 방식으로 억제한다. (A) SCD1 녹다운은 스테아르산 탈포화를 차단한다. UMUC-14 세포를 SCD1 siRNA 또는 2개의 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에, [14C]스테아르산을 추가의 6시간 인큐베이션 동안 첨가하였다. [14C]스테아르산 탈포화를 박층 크로마토그래피에 의해 분석하고, 섬광 계수에 의해 측정하였다. 데이터는 평균 +/- SD로 제시되고, 2개의 독립적 실험을 대표한다. (B) 단일불포화 올레에이트는 UMUC-14 세포를 SCD1 녹다운으로부터 구제한다. 1% FBS를 함유하는 배지에서 성장한 UMUC-14 세포를 SCD1 siRNA 또는 2개의 비-표적화 대조군 siRNA (Ctrl)로 형질감염시켰다. 형질감염 6시간 후에, BSA-접합된 올레에이트 산을 지시된 바와 같이 배양 배지에 첨가하였다. 세포 증식을 처리 72시간 후에 [3H]티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 데이터는 RNAiMax 단독으로 형질감염시키고 (모의) BSA만을 보충한 배지에서 성장한 세포와 비교하여 평균 +/- SD로 제시된다. 이들 데이터는 3개의 독립적 실험을 대표한다. (C) 포화 팔미테이트는 SCD1 siRNA의 효과를 역전시킬 수 없다. 세포를 BSA-접합된 팔미테이트를 siRNA 형질감염 6시간 후에 보충하는 것을 제외하고 (B)에 기재된 바와 유사하게 처리하였다. 고용량의 팔미테이트가 세포 증식을 유의하게 감소시켰음에 주목한다.
도 14. SW780 방광암 세포에서 SCD1의 독시시클린-유도성 녹다운은 생체내에서 종양 성장을 억제한다. 3개의 상이한 SCD1 shRNA를 Tet-유도성 렌티바이러스 발현 벡터에 클로닝하였다. 독시시클린-유도성 SCD1 shRNA 또는 대조군 shRNA (Ctrl)를 안정하게 발현하는 SW780 세포를 퓨로마이신 선택으로 확립하였다. (A) 1 μg/mL 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 3일 동안 처리된 안정한 세포에서 SCD1 발현을 보여주는 대표적 블롯. KD 비는 독시시클린을 처리하지 않은 세포와 비교하여 SCD1 녹다운의 효율을 나타낸다. (B) SCD1 녹다운은 [3H]티미딘 혼입을 감소시킨다. SW780 세포를 1 μg/mL 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 3일 동안 배양한 후에 16시간 동안 [3H]티미딘과 인큐베이션하였다. 혼입된 [3H]티미딘의 수는 독시시클린을 처리하지 않은 세포와 비교하여 평균 +/- SD로 제시된다. (C) SCD1 녹다운은 마우스에서 종양 성장을 감쇠시킨다. SCD1 shRNA1 및 3 또는 대조군 shRNA (Ctrl)를 발현하는 SW780 세포를 CB.17 SCID 마우스에 접종하고, 처리에 대해 10개의 코호트로 분류하였다. 마우스에게 5% 수크로스를 단독으로 또는 이에 1 mg/mL 독시시클린을 보충하여 제공하고, 종양 크기를 1주 2회 측정하였다. 종양 부피는 평균 +/- SD로 제시된다. 제20일에, SCD1 shRNA1의 경우: p<0.0001; SCD1 shRNA3의 경우, p<0.0001. (D) 종양 용해물에서 SCD1 단백질의 발현은 대조군 또는 SCD1 shRNA 이종이식편 조직으로부터 추출하였다. 종양 용해물을 항-SCD1 항체로 면역침전시키고, 이뮤노블롯에 의해 SCD1 단백질 수준에 대해 평가하였다.
도 15. SCD1의 약리학적 억제는 마우스에서 종양 성장을 감쇠시키고 지방산 탈포화를 감소시킨다. (A) SCD1 소분자 억제제 A37062는 단일불포화 지방산의 합성을 차단한다. UMUC-14 세포를 A37062로 4시간 동안 처리한 후에, [14C]아세테이트와 6시간 동안 인큐베이션하였다. 총 지방산을 추출하고, 박층 크로마토그래피에 의해 분리하였다. (B) A37062는 AKT 인산화를 없애고, 카스파제 3 및 7을 활성화시킨다. UMUC-14 세포를 20시간 동안 혈청 고갈시킨 후에 A37062로 20시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. (C) 단일불포화 올레에이트는 UMUC-14 세포에서 성장 억제를 A37062 (100 nM)에 의해 역전시킨다. (D) 포화 팔미테이트는 A37062-처리된 UMUC-14 세포를 구제하는데 실패하였다. (E) SCD1 억제제 A37062는 미리-확립된 UMUC-14 종양의 이종이식편 성장을 지연시킨다. 마우스에게 비히클 또는 A37062 (75 mg/kg)를 경구로 1일 2회 제공하고, 종양 부피를 평균 +/- SEM으로 나타낸다. 군당 n = 8. 제20일에, p = 0.0073. (F, G) A37062는 연구의 종점에 이종이식된 종양 조직 뿐만 아니라 마우스 간 및 혈장에서 팔미테이트 (F) 및 스테아레이트 (G)의 탈포화를 감소시킨다. 마지막 처리 2시간 후에, 샘플 (군당 n = 5)을 수집하고, 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 지방산 메틸 에스테르를 기체 크로마토그래피에 의해 확인하였다. 데이터는 평균 +/- SD로 제시된다.
도 16. SCD1 억제제는 SW780 세포에서 세포 증식을 지방산 탈포화-의존성 방식으로 억제한다. (A) 단일불포화 올레에이트는 SW780 세포를 SCD1 억제제 A37062로부터 구제한다. 1% FBS를 함유하는 배지에서 성장한 SW780 세포를 100 nM의 SCD1 억제제 A37062 또는 DMSO (No 37602)로 처리하였다. BSA-접합된 올레에이트 산을 지시된 바와 같이 배양 배지에 첨가하였다. 세포 생존율을 처리 48시간 후에 셀타이터 글로(CellTiter Glo) (프로메가)에 의해 측정하였다. 데이터는 DMSO 단독으로 처리되고 BSA만 보충된 배지에서 성장한 세포와 비교하여 평균 +/- SD로 제시된다. (B) 포화 팔미테이트는 SCD1 억제제 A37062의 효과를 역전시킬 수 없다. 세포를 BSA-접합된 팔미테이트를 보충하는 것은 제외하고 (A)에 기재된 바와 유사하게 처리하였다.
도 17. SCD1의 약리학적 억제는 인간 결장암 세포주, 인간 췌장암 세포주 및 신장암 세포주에서 세포 생존율을 감소시키고 카스파제 3/7 활성을 증가시킨다. (A) SCD1 소분자 억제제 A37062는 결장암 세포의 세포 생존율을 감소시킨다. (B) SCD1 소분자 억제제 A37062는 결장암 세포에서 카스파제 3/7을 활성화시킨다. (C) SCD1 소분자 억제제 A37062는 췌장암 세포의 세포 생존율을 감소시킨다. (D) SCD1 소분자 억제제 A37062는 췌장암 세포에서 카스파제 3/7을 활성화시킨다. (E) SCD1 소분자 억제제 A37062는 신장암 세포의 세포 생존율을 감소시킨다. (F) SCD1 소분자 억제제 A37062는 신장암 세포에서 카스파제 3/7을 활성화시킨다.
도 18. SCD1의 약리학적 억제는 결장, 전립선, 췌장 및 방광 암을 비롯한 인간 암 세포주의 패널에서 세포 생존율을 감소시키고 카스파제 3/7 활성을 증가시키며, 마우스에서 종양 성장을 감쇠시킨다. (A) SCD1 소분자 억제제 A37062는 인간 암 세포의 세포 생존율을 감소시킨다. (B) SCD1 소분자 억제제 G02447171.1은 인간 암 세포의 세포 생존율을 감소시킨다. (C) SCD1 소분자 억제제는 미리-확립된 HCT15 결장 종양의 이종이식편 성장을 지연시킨다. (D) SCD1 소분자 억제제는 미리-확립된 SW780 방광 종양의 이종이식편 성장을 지연시킨다. (E) SCD1 소분자 억제제는 미리-확립된 HPAC 췌장 종양의 이종이식편 성장을 지연시킨다.
도 19. 14개의 소분자 SCD1 억제제에 의한 SCD1의 약리학적 억제는 HCT15 (A, B) 및 HT29 (C, D) 암 세포에서 세포 생존율을 감소시킨다.
도 20. SCD1 억제제 RG1, RG3 및 RG8은 HCT15 세포에서 세포 증식을 지방산 탈포화-의존성 방식으로 억제한다. (A-C) 단일불포화 올레에이트는 HCT15 세포를 SCD1 억제제로부터 구제한다. (D-F) 포화 팔미테이트는 HCT15 세포에서 SCD1 억제제의 효과를 역전시킬 수 없다.
도 21. SCD1 억제제 RG1, RG3 및 RG8은 HT29 세포에서 세포 증식을 지방산 탈포화-의존성 방식으로 억제한다. (A-C) 단일불포화 올레에이트는 HT29 세포를 SCD1 억제제로부터 구제한다. (D-F) 포화 팔미테이트는 HT29 세포에서 SCD1 억제제의 효과를 역전시킬 수 없다.
I. 정의
"스테아로일-CoA 데새투라제 1" 및 "SCD1"는 본원에서 천연 서열 SCD1 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체 및 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체 (본원에서 추가로 정의됨)의 단편을 지칭한다. 본원에 기재된 SCD1 폴리펩티드는 다양한 공급원으로부터, 예컨대 인간 조직 유형으로부터 또는 또 다른 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
"천연 서열 SCD1 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래된 상응하는 SCD1 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 천연 서열 SCD1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 서열을 포함한다.
서열 1
MPAHLLQDDISSSYTTTTTITAPPSRVLQNGGDKLETMPLYLEDDIRPDIKDDIYDPTYK
DKEGPSPKVEYVWRNIILMSLLHLGALYGITLIPTCKFYTWLWGVFYYFVSALGITAGAH
RLWSHRSYKARLPLRLFLIIANTMAFQNDVYEWARDHRAHHKFSETHADPHNSRRGFFFS
HVGWLLVRKHPAVKEKGSTLDLSDLEAEKLVMFQRRYYKPGLLMMCFILPTLVPWYFWGE
TFQNSVFVATFLRYAVVLNATWLVNSAAHLFGYRPYDKNISPRENILVSLGAVGEGFHNY
HHSFPYDYSASEYRWHINFTTFFIDCMAALGLAYDRKKVSKAAILARIKRTGDGNYKSG
"SCD1 폴리펩티드 변이체" 또는 그의 변이체는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 천연 서열 SCD1 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 SCD1 폴리펩티드, 일반적으로 활성 SCD1 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 SCD1 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 1개 이상의 아미노산 잔기가 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 첨가 또는 결실된 SCD1 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, SCD1 폴리펩티드 변이체는 서열 본원에 개시된 바와 같은 천연 서열 SCD1 폴리펩티드에 대해 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 통상적으로, SCD1 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 10개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600개의 아미노산 길이 또는 그 초과이다. 임의로, SCD1 변이체 폴리펩티드는 천연 SCD1 폴리펩티드 서열에 비해 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 SCD1 폴리펩티드 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
본원에 정의된 용어 "SCD1 길항제"는 천연 서열 SCD1에 의해 매개되는 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자이다. 특정 실시양태에서, 이러한 길항제는 SCD1에 결합한다. 한 실시양태에 따르면, 길항제는 폴리펩티드이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 길항제는 항-SCD1 항체이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 길항제는 소분자 길항제이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 길항제는 폴리뉴클레오티드 길항제이다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 존재하는 경우에 중합체의 어셈블리 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 "캡" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결부 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결부 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)를 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)을 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형 연결부 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)를 갖는 것 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기가 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체되거나, 표준 보호 기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결이 만들어지도록 활성화되거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 인산화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 당업계에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사형, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결이 대안적인 연결 기로 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결부를 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜임)로 대체되는 실시양태를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 길이가 약 7개 이상의 뉴클레오티드 및 약 250개 미만의 뉴클레오티드인 짧은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 합성된 것일 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.
용어 "프라이머"는 핵산에 혼성화하고, 일반적으로 유리 3'-OH 기를 제공함으로써 상보성 핵산의 중합을 허용할 수 있는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
용어 "소분자"는 약 2000 달톤 이하, 바람직하게는 약 500 달톤 이하의 분자량을 갖는 임의의 분자를 지칭한다.
용어 "어레이" 또는 "마이크로어레이"는 기판 상의 혼성화가능한 어레이 요소, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 프로브 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 정렬된 배열을 의미한다. 상기 기판은 고체 기판, 예를 들어 유리 슬라이드, 또는 반-고체 기판, 예를 들어 니트로셀룰로스 막일 수 있다.
용어 "증폭"은 하나 이상의 카피의 참조 핵산 서열 또는 그의 상보체의 생산 과정을 의미한다. 증폭은 선형 증폭 또는 지수 증폭 (예를 들어, PCR)일 수 있다. "카피"가 반드시 주형 서열에 대해 완전한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하는 것인 아니다. 예를 들어, 카피는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 데옥시이노신, 인위적인 서열 변경 (예컨대, 주형에 혼성화가능하지만 완전히 상보성이지는 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입된 서열 변경), 및/또는 증폭 동안 발생하는 서열 오류를 포함할 수 있다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
용어 "항-SCD1 항체" 및 "SCD1에 결합하는 항체"는 항체가 SCD1의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 SCD1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항-SCD1 항체의 비관련, 비-SCD1 단백질에 대한 결합의 정도는 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정시에, 항체의 SCD1에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-SCD1 항체는 상이한 종으로부터의 SCD1 사이에 보존된 SCD1의 에피토프에 결합한다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 및 대표적 실시양태를 하기 기재한다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변경을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하고, 반대로 경쟁 검정에서 참조 항체가 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하도록 사용되고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 상기 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
용어 "검출"은 직접 및 간접 검출을 비롯한 임의의 검출 수단을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "바이오마커"은 샘플에서 검출될 수 있는 표지자, 예를 들어 예측, 진단 및/또는 예후를 지칭한다. 바이오마커는 특정의 분자, 병리학적적, 조직학적 및/또는 임상적 특징에 의해 특성화된 특정한 하위유형의 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)의 표지자로서 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 유전자이다. 바이오마커는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA), 폴리펩티드, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 번역후 변형), 탄수화물 및/또는 당지질-기재 분자 마커를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "바이오마커 시그너처", "시그너처", "바이오마커 발현 시그너처" 또는 "발현 시그너치"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 그의 발현이 표지자, 예를 들어 예측, 진단 및/또는 예후인 바이오마커 중 하나 또는 그의 조합을 지칭한다. 바이오마커 시그너처는 특정의 분자, 병리학적적, 조직학적 및/또는 임상적 특징에 의해 특성화된 특정한 하위유형의 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)의 표지자로서 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 시그너처은 "유전자 시그너처"이다. 용어 "유전자 시그너처"은 "유전자 발현 시그너처"와 교환가능하게 사용되고, 그의 발현이 표지자, 예를 들어 예측, 진단 및/또는 예후인 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 그의 조합을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 시그너처는 "단백질 시그너처"이다. 용어 "단백질 시그너처"는 "단백질 발현 시그너처"와로 교환가능하게 사용되고, 그의 발현이 표지자, 예를 들어 예측, 진단 및/또는 예후인 폴리펩티드 중 하나 또는 그의 조합을 지칭한다.
개체에 대한 증가된 임상적 이익과 연관된 바이오마커의 "양" 또는 "수준"은 생물학적 샘플 중의 검출가능한 수준이다. 이것은 당업자에게 공지되고 또한 본 발명에 의해 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가되는 바이오마커의 발현 수준 또는 양은 치료에 대한 반응을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "발현의 수준" 또는 "발현 수준"은 일반적으로 교환가능하게 사용되고, 일반적으로 생물학적 샘플에서 바이오마커의 양을 지칭한다. "발현"은 일반적으로 정보 (예를 들어, 유전자-코딩 및/또는 후성학)가 세포 내에 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 과정을 지칭다. 따라서, 본원에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드로의 전사, 폴리펩티드로의 번역 또는 심지어 폴리뉴클레오티드 및/또는 풀리펩티드 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 번역후 변형)을 지칭할 수 있다. 전사된 폴리뉴클레오티드, 번역된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 풀리펩티드 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 번역후 변형)은 또한 이들이 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 전사체 또는 분해된 전사체로부터 유래하든지 또는 예를 들어 단백질분해에 의한 폴리펩티드의 번역후 프로세싱으로부터 유래하든지 발현되는 것으로 여겨질 것이다. "발현된 유전자"는 mRNA로서 폴리뉴클레오티드로 전사되고, 이어서 폴리펩티드로 번역되는 것, 또한 RNA로 전사되지만 폴리펩티드로 번역되지 않는 것 (예를 들어, 운반 및 리보솜 RNA)을 포함한다.
"상승된 발현", "상승된 발현 수준" 또는 "상승된 수준"은 대조군, 예컨대 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 앓고 있지 않은 개체 또는 개체들 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 바이오마커)에 비해 개체에서 바이오마커의 증가된 발현 또는 증가된 수준을 지칭한다.
"감소된 발현", "감소된 발현 수준" 또는 "감소된 수준"은 대조군, 예컨대 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 앓고 있지 않은 개체 또는 개체들 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 바이오마커)에 비해 개체에서의 바이오마커의 감소된 발현 또는 감소된 수준을 지칭한다.
용어 "하우스키핑 바이오마커"는 전형적으로 모든 세포 유형에서 유사하게 존재한 바이오마커 또는 바이오마커의 군 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 하우스키핑 바이오마커는 "하우스키핑 유전자"이다. "하우스키핑 유전자"는 본원에서 그의 활성이 세포 기능의 유지에 필수적이고 전형적으로 모든 세포 유형에서 유사하게 존재하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자의 군을 지칭한다.
본원에 사용된 "증폭"은 일반적으로 원하는 서열의 다중 카피를 생산하는 과정을 지칭한다. "다중 카피"는 적어도 2개의 카피를 의미한다. "카피"가 반드시 주형 서열에 대한 완전한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하는 것이 아니다. 예를 들어, 카피는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 데옥시이노신, 의도적인 서열 변경 (예컨대, 주형에 혼성화가능하지만 상보성이지는 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입되는 서열 변경), 및/또는 증폭 동안 발생하는 서열 오류를 포함할 수 있다.
용어 "멀티플렉스-PCR"은 단일 반응에서 2개 이상의 DNA 서열을 증폭시키는 목적을 위해 하나 초과의 프라이머 세트를 사용하여 단일 공급원 (예를 들어, 개체)으로부터 수득한 핵산에 대해 수행되는 단일 PCR 반응을 지칭한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 그의 융점 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화 가능 서열 사이의 바람직한 상동성 정도가 클수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격도에 대한 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.
본원에 정의된 바와 "엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 다음에 의해 확인될 수 있다: (1) 세척시 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 사용하거나, (2) 혼성화 동안에 42℃에서 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 함유하는 50% (v/v) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하거나, 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용하고 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 중에 10분 세척한 후에, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC로 이루어진 고엄격도 세척을 10분 수행하여 용액 중에서 밤샘 혼성화한다.
"중간 정도의 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 %SDS)의 사용을 포함한다. 중간 정도의 엄격한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 필터를 약 37-50℃에서 1 x SSC로 세척하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 알 것이다.
용어 "진단"은 분자 또는 병리학적 상태, 질환 또는 상태 (예를 들어, 암)의 확인 또는 분류를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "진단"은 특정한 유형의 암의 확인을 지칭할 수 있다. "진단"은 또한 예를 들어 조직병리학적 기준, 또는 분자 특징 (예를 들어, 바이오마커 (예를 들어, 특정한 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질) 중 하나 또는 그의 조합의 발현에 의해 특성화된 하위유형)에 의한 특정한 유형의 암의 분류를 지칭할 수 있다.
용어 "진단을 돕는 것"은 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)의 특정한 유형의 증상 또는 상태의 존재 또는 특성에 대한 임상적 결정을 돕는 방법을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, 질환 또는 상태 (예를 들어, 암)의 진단을 돕는 방법은 개체로부터 생물학적 샘플에서 특정 바이오마커를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징에 기초하여 특성화 및/또는 확인되는 세포성 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는 관심 대상체 및/또는 개체로부터 얻거나 이들체로부터 유래된 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 어구 "질환 샘플" 및 그의 변형 표현은 특성화되는 세포성 및/또는 분자 엔티티를 함유하는 것으로 예상되거나 공지된 관심 대상으로부터 얻은 임의의 샘플을 의미한다. 샘플은 일차 또는 배양된 세포 또는 세포주, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈소판, 혈청, 혈장, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 유액, 전혈, 혈액-유래 세포, 소변, 뇌척수액, 타액, 객담, 누액, 땀, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지, 조직 추출물, 예컨대 균질화된 조직, 종양 조직 및 세포 추출물, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"조직 샘플" 또는 "세포 샘플"은 대상체 또는 개체의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선하고/하거나 냉동되고/되거나 보존된 기관, 조직 샘플, 생검 및/또는 흡인물로부터의 고체 조직, 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분, 예를 들어 뇌 척수액, 양수, 복수액 또는 간질액과 같은 체액 및 대상체의 임신 또는 발생 중 임의의 시점으로부터의 세포 또는 혈장일 수 있다. 또한, 조직 샘플은 1차 또는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 질환 조직/기관으로부터 수득한다. 조직 샘플은 자연에서 조직과 자연적으로 서로 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "참조 샘플", "참조 세포", "참조 조직", "대조 샘플", "대조 세포" 또는 "대조 조직"은 비교 목적을 위해 사용되는 샘플, 세포, 조직, 표준 또는 수준을 지칭한다. 한 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 동일한 대상체 또는 개체의 건강한 및/또는 비-이환된 신체 일부 (예를 들어, 조직 또는 세포)로부터 수득한다. 예를 들어, 건강한 및/또는 비-이환된 세포 또는 조직은 이환된 세포 또는 조직 (예를 들어, 종양에 인접한 세포 또는 조직)에 인접하여 있다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 개체의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 개체의 건강한 및/또는 비-이환된 신체의 일부 (예를 들어, 조직 또는 세포)로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 개체의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포로부터 수득한다.
본원에서의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직의 박편 또는 세포를 의미한다. 조직 샘플의 동일한 절편이 형태 및 분자 수준 둘 다에서 분석되거나, 또는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 둘 다에 대해 분석될 수 있음을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 채취하여 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.
"상관시키다" 또는 "상관시키는"은 임의의 방식으로든 제1 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜의 수행시에 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/있거나 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 제2 분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분석 또는 프로토콜의 실시양태와 관련하여, 폴리뉴클레오티드 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 특정 치료 요법을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다.
"개체 반응" 또는 "반응"은 (1) 질환 진행 (예를 들어, 암 진행)의 어느 정도까지의 억제, 예를 들어 지연 및 완전한 정지, (2) 종양 크기의 감소, (3) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (4) 전이의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (5) 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)와 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화, (6) 무진행 생존 기간의 증가, 및/또는 (9) 치료 후 주어진 시점에서의 감소된 사망률을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 개체에게 이익을 나타내는 임의의 종점을 이용하여 평가할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 당업자가 2개의 수치값 (예를 들어, Kd 값 또는 발현)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 상이한"은 당업자가 2개의 수치 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과 및/또는 약 50% 초과이다.
단어 "표지"는 본원에 사용된 경우에 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 전형적으로 시약, 예컨대 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합되고, 그와 접합되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수도 있고 (예를 들어, 방사선동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 생성물을 생성하는 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수도 있다.
"유효량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료 유효량"은 인자, 예컨대, 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 도출하는 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 또한 치료 유효량은 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 치료상 유익한 효과가 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 원하는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계 전에 또는 보다 초기 단계에서 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해 사용된다.
용어 "항암 요법"은 암을 치료하는데 유용한 요법을 지칭한다. 항암 치료제의 예는, 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항혈관신생제, 아폽토시스성 작용제, 항-튜불린 작용제, 및 암을 치료하기 위한 다른 작용제, 항-CD20 항체, 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec)™ (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 시토카인, 하기 표적 PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 수용체(들) 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성제 및 유기 화학적 작용제 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그의 조합이 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하도록 의도된다. 다른 세포독성제는 하기 기재되어 있다. 종양사멸제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323 (경구 알파-4 인테그린 억제제); 다이네미신 (다이네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (독실(DOXIL)®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (마이오세트(MYOCET)®), PEG화 리포솜 독소루비신 (케릭스(CAELYX)®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (유프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론, 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®) 및 카르보플라틴; 미세소관을 형성하는 튜불린 중합을 억제하는 빈카 (빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®) 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®) 포함); 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보빈; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산 (벡사로텐 (탈그레틴(TARGRETIN)®) 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®) 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식과 연관된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (수니티닙, 수텐트(SUTENT)®, 화이자(Pfizer)); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R 11577 ); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리메르센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제 (하기의 정의 참조); 티로신 키나제 억제제 (하기의 정의 참조); 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)™); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 플레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료 요법의 약어)를 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 혼합된 효능제/길항제 프로파일을 갖는 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)®), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예컨대 SERM3; 효능제 특성을 갖지 않는 순수한 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®) 및 EM800 (이러한 작용제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고/거나, DNA 결합을 억제하고/거나, ER 턴오버를 증가시키고/거나 ER 수준을 억제할 수 있음); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트라졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®) 및 아미노글루테티미드, 및 다른 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르(RIVISOR)®), 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 파드로졸 및 4(5)-이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 효능제, 예를 들어 류프롤리드 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)®, 고세렐린, 부세렐린 및 트립테렐린; 성 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예컨대 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예컨대 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 호르몬 그 자체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전구약물"은 모 약물에 비해 종양 세포에 덜 세포독성이고, 보다 활성의 모 형태로 효소에 의해 활성화되거나 전환될 수 있는, 제약 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조한다. 본 발명의 전구약물은, 보다 활성의 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-개질된 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기 기재된 화학요법제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 경우에 "성장 억제제"는 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 그의 성장이 SCD1 발현에 의존하는 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에서) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 전통적인 M-기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 또한 S-기 정지로까지 이어진다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)] (특히, p. 13)에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목으로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래된 도세탁셀 (탁소테레®, 롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer))은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb))의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세관 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세관을 안정화시켜서 세포에서의 유사분열 억제를 유발한다.
"방사선 요법"은 정상적으로 기능하거나 세포를 파괴하는 능력이 완전히 제한되도록 세포에 대한 충분한 손상을 유도하기 위해 지정된 감마선 또는 베타선을 사용하는 것을 의미한다. 투여량 및 치료의 지속시간을 결정하기 위한 당업계에 공지된 수많은 방법이 있음을 이해할 것이다. 전형적인 치료는 1회 투여로 제공되며, 전형적인 투여량은 1일에 10 내지 200 유닛 (Gray)의 범위이다.
"환자", 개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 환자, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "공동으로"는 2종 이상의 치료제의 투여가 적어도 일부의 투여 시간이 중첩되는 경우를 지칭하도록 본원에 사용된다. 따라서, 공동 투여는 하나 이상의 작용제(들)의 투여를 하나 이상의 다른 작용제(들)의 투여를 중단한 후에 계속하는 경우의 투여 요법을 포함한다.
"감소시키거나 또는 억제하는"은 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 전반적 감소를 발생시키는 능력을 의미한다. 감소 또는 억제는 치료할 장애의 증상, 전이물의 존재 또는 크기, 또는 원발성 종양의 크기를 지칭할 수 있다.
"포장 삽입물"은 치료 제품 또는 의약의 상업용 패키지 내에 통상적으로 포함되어 있으며 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 사항, 이러한 포장 제품과 조합될 다른 치료 제품 및/또는 이러한 치료 제품 또는 의약의 사용에 관한 경고 등에 대한 정보를 함유하는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
"제조품"은 하나 이상의 시약, 예를 들어 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 치료하기 위한 의약 또는 본원에 기재된 바이오마커를 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 패키지 또는 용기) 또는 키트이다. 특정 실시양태에서, 제조품 또는 키트는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 판촉되거나, 배급되거나 또는 판매된다.
"표적 청중"은, 마케팅 또는 광고에 의해서와 같이, 특히 특정한 용도, 치료 또는 적응증을 위한 특정한 의약이 프로모션되고 있거나 프로모션되도록 의도되는 일군의 사람들 또는 기관, 예컨대 개체, 집단, 신문, 의학 문헌 및 잡지의 구독자, 텔레비젼 또는 인터넷 시청자, 라디오 또는 인터넷 청취자, 의사, 제약 회사 등이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함(하고 이를 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태로 "로 이루어지는" 및/또는 "로 본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 단수 형태는 달리 나타내지 않는 한 복수 언급대상을 포함한다.
II . 방법 및 용도
유익한 효과를 제공하도록 의도된 특정 치료 요법의 일부로서의 SCD1 길항제의 용도가 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 SCD1 길항제는 치료 방법에 사용될 수 있다. 추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제조 또는 제제화에 있어서 SCD1 길항제의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 암의 치료를 위한 것이다. 추가 측면에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 이용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 개체를 확인하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
암 세포를 유효량의 SCD1 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 세포 증식을 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 세포 증식을 억제하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 증식은 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과로 억제된다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
암 세포를 유효량의 SCD1 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 세포 주기 정지를 유도하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 또한, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 세포 주기 정지를 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 주기 정지는 G1 세포 주기 정지이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
암 세포를 유효량의 SCD1 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 세포 사멸을 촉진하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 세포 사멸을 촉진하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 사멸은 신경증이다. 일부 실시양태에서, 세포 사멸은 아폽토시스이다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스는 카스파제-의존성 아폽토시스이다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스는 카스파제-비의존성 아폽토시스이다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스의 촉진은 활성 카스파제, 예를 들어 카스파제 3 및 카스파제 7의 증가에 의해 나타난다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
또 다른 측면에서, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
또 다른 측면에서, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 개체의 암은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준 및/또는 감소된 발현 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 개체를 기반으로 하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 또한, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 단 개체는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 것으로 밝혀진 것인, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
또 다른 측면에서, (a) 개체로부터 수득한 샘플이 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는지 결정하는 것, 및 (b) 개체에게 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 유효량으로 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
(a) 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 개체를 선택하는 것; 및 (b) 이에 따라 선택된 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
개체로부터 수득한 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 크다는 것을 나타내거나 또는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 크거나 또는 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 작은 개체를 확인하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 크다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 작다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
또 다른 측면에서, 하나 이상의 바이오마커를 평가하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 더 크다는 것을 나타내고, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성을 예측하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 더 크다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 개체가 길항제를 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 더 작다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
또한, 개체로부터 수득한 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응을 예측하는 것이고, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응의 결손을 예측하는 것인, SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응 또는 반응의 결손을 예측하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응을 예측한다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응의 결손을 예측한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
또 다른 측면에서, 개체로부터 수득한 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는다는 것을 나타내고, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 감소된 가능성을 갖는다는 것을 나타내는 것인, 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 가능성을 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 감소된 가능성을 갖는다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자, 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 또는 그의 유도체이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 고형 종양이다. 고형 종양의 예는 방광암, 췌장암, 폐암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 두경부암, 신장암, 난소암, 하인두, 전립선암, 식도, 간세포성 암종 및/또는 비뇨기암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 방광암, 췌장암, 폐암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 두경부암, 신장암, 난소암 및/또는 비뇨기암의 군으로부터 선택된 암이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 방광암, 췌장암, 결장암, 결장직장암, 신장암 및/또는 비뇨기암의 군으로부터 선택된 암이다. 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 두경부암, 신장암, 난소암 및/또는 비뇨기암의 군으로부터 선택된 암으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 신장암이다. 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 췌장암이다. 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 I기, II기, III기 및/또는 IV기이다. 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 국재화된다. 일부 실시양태에서, 암 및/또는 암 세포는 전이성이다.
임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 FGFR3이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 FGFR3을 갖는다. 예를 들어, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체의 암은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하고, 하나 이상의 바이오마커는 FGFR3인, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 실질적으로 동일한 수준의 FGFR3을 발현한다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 인산화 FGFR3이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 인산화 FGFR3을 발현한다. 예를 들어, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체의 암은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하고, 하나 이상의 바이오마커는 인산화 FGFR3인, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 인산화 FGFR3을 발현한다. 일부 실시양태에서, 상승된 수준은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상승된 발현은 바이오마커의 발현 수준/양의 증가를 지칭하며, 여기서 증가는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 또는 100X이다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 실질적으로 동일한 수준의 인산화 FGFR3을 발현한다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 FGFR3의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 비-암성이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 FGFR3의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 암성이다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플에서 FGFR3의 발현은 세포 표면 발현이다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플에서 FGFR3 경로는 구성적으로 활성이다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플에서 FGFR3 경로는 리간드 의존성이다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 FGFR3에 돌연변이를 포함한다. FGFR3에서 구성적으로 활성인 돌연변이의 예는 FGFR3 S249C, FGFR3 R248C, FGFR3 G372C, FGFR3 Y375C, FGFR3 K652E, FGFR3 K652Q 및/또는 FGFR3 K652M을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 FGFR3에 대한 야생형이다.
임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자를 발현한다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자를 발현한다. 예를 들어, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체의 암은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하고, 하나 이상의 바이오마커는 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처인, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상승된 발현은 바이오마커의 발현 수준/양의 증가를 지칭하며, 여기서 증가는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 또는 100X이다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 실질적으로 동일한 수준의 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처를 발현한다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 비-암성이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 암성이다.
일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SREBF1, G6PD, ACOT7, PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11, ACER3, PDSS1, MVD, AGPAT5, HSD17B2, ACSL4, EBP, PIGW, LBR, ACLY, ADORA2B, GPCPD1, CYP24A1, ACSL3, MVK, ACSS2, FDPS, ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SC4MOL을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상승된 발현은 바이오마커의 발현 수준/양의 증가를 지칭하며, 여기서 증가는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 또는 100X이다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 1.4, 1.5, 1.6 또는 1.7배 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 -0.5, -0.6, -0.7 또는 -0.8 또는 그 초과의 전반적 증가 평균 log2 배수 변화를 지칭한다.
일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SC4MOL을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 1.8, 1.9, 2.0, 또는 2.1배 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 -0.9, -1.0, -1.1 또는 -1.2 또는 그 초과의 전반적 증가 평균 log2 배수 변화를 지칭한다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SC4MOL을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6 또는 2.7배 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 -1.0, -1.1 또는 -1.2 또는 그 초과의 전반적 증가 평균 log2 배수 변화를 지칭한다.
일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SC4MOL을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1 또는 3.2배 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 -1.4, -1.5, -1.6 또는 -1.7 또는 그 초과의 전반적 증가 평균 log2 배수 변화를 지칭한다.
일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SQLE를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 PCSK9를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SCD1을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 FABP4를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 또는 3.8배 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 -1.6, -1.7, -1.8, -1.9 또는 -2.0 또는 그 초과의 전반적 증가 평균 log2 배수 변화를 지칭한다.
임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 절단된 성숙 SREBP1이다. 일부 실시양태에서, 전장 단백질 SREBP1a는 유니프롯(UNIPROT) 아미노산 서열 P36956-1의 1-1147 aa이고, 절단된 성숙 형태는 유니프롯 아미노산 서열 P36956-1의 1-490 aa이다. 일부 실시양태에서, 전장 단백질 SREBP1c는 유니프롯 아미노산 서열 P36956-3의 1-1123 aa이고, 절단된 성숙 형태는 유니프롯 아미노산 서열 P36956-3의 1-466 aa이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 성숙 SREBP1을 발현한다. 예를 들어, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체의 암은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하고, 하나 이상의 바이오마커는 성숙 SREBP1인, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 성숙 SREBP1을 발현하고, 성숙 SREBP2의 수준은 실질적으로 상승하지 않는다 (즉, 실질적으로 동일한 수준의 발현). 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, SREBP1은 SREBP1 이소형 a이다. 일부 실시양태에서, SREBP1은 SREBP1 이소형 c이다. 특정 실시양태에서, 상승된 발현은 바이오마커의 발현 수준/양의 증가를 지칭하며, 여기서 증가는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 또는 100X이다. 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 성숙 SREBP1 및/또는 성숙 SREBP2의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 비-암성이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 성숙 SREBP1 및/또는 성숙 SREBP2의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 암성이다.
임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 Δ9 단일불포화 지방산이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 Δ9 단일불포화 지방산을 발현한다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 Δ9 단일불포화 지방산:포화 지방산의 비이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 Δ9 단일불포화 지방산:포화 지방산의 비를 발현한다. 예를 들어, 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체의 암은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하고, 하나 이상의 바이오마커는 Δ9 단일불포화 지방산:포화 지방산의 비인, 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상승된 발현은 바이오마커의 발현 수준/양의 증가를 지칭하며, 여기서 증가는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 또는 100X이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 Δ9 단일불포화 지방산 및/또는 포화 지방산의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 비-암성이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 Δ9 단일불포화 지방산 및/또는 포화 지방산의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 암성이다. Δ9 단일불포화 지방산의 예는 팔미톨레산 (C16:1) 및 올레산 (C18:1)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 포화 지방산의 예는 스테아르산 (C18:0) 및 팔미트산 (C16:0)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 질량 분광측정법, 기체 크로마토그래피 및 박층 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는 Δ9 단일불포화 지방산 및 포화 지방산을 측정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 PI3K 신호전달, mTOR 신호전달, MEK 신호전달이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 PI3K, PTEN, p85, TSC1/2 및 AKT로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 다형성이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 인산화 AKT이다. 임의의 용도 및 방법의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 활성화 PI3K 신호전달 (예를 들어, 상승된 PI3K 신호전달), 활성화 mTOR 신호전달 (예를 들어, 상승된 mTOR 신호전달) 및/또는 활성화 MEK 신호전달 (예를 들어, 상승된 MEK 신호전달)을 포함한다. 임의의 방법 및/또는 용도의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 PI3K 활성화 돌연변이를 포함한다. 임의의 방법 및/또는 용도의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 PTEN 상실 및/또는 돌연변이를 포함한다. 임의의 방법 및/또는 용도의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 p85 돌연변이를 포함한다. 임의의 방법 및/또는 용도의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 AKT 활성화 돌연변이를 포함한다. 임의의 방법 및/또는 용도의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 상승된 수준의 인산화 AKT (예를 들어, pAKT S473)를 포함한다. 임의의 방법 및/또는 용도의 일부 실시양태에서, 개체, 암 및/또는 암 세포로부터의 샘플은 TSC1/2 기능 상실 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상승된 수준은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상승된 발현은 바이오마커의 발현 수준/양의 증가를 지칭하며, 여기서 증가는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 또는 100X이다. 일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 약 1.5배, 약 1.75배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 2.75배, 약 3.0배 또는 약 3.25배 초과의 전반적 증가를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 감소된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 당업계 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 감소를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 감소된 발현은 바이오마커의 발현 수준/양의 감소를 지칭하며, 여기서 감소는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X 또는 0.01X이다.
임의의 용도 및/또는 방법의 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 본원에 기재된 임의의 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 SMI37062 (G01522403), G02447171, 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이고, 항체 단편은 SCD1에 결합한다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 개체는 인간일 수 있다.
바이오마커의 발현 수준/양은 mRNA, cDNA, 단백질, 단백질 단편 및/또는 유전자 카피 수를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 기준을 기초로 하여 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 샘플에서 바이오마커의 발현 수준/양은 제2 샘플에서의 발현/양과 비교하여 증가된다. 특정 실시양태에서, 제1 샘플에서 바이오마커의 발현 수준/양은 제2 샘플에서의 발현/양과 비교하여 감소된다. 특정 실시양태에서, 제2 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직이다. 유전자의 발현 수준/양을 결정하기 위한 추가의 개시내용은 본원에 기재된다.
본원에 기재된 SCD1 길항제는 요법에서 단독으로 또는 기타 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 SCD1 길항제는 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 mTOR 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 PI3K 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 MEK 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 FGFR3 억제제이다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 개별 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포괄하고, 이 경우에 본 발명의 SCD1 길항제의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 수행될 수 있다. 본원에 기재된 SCD1 길항제는 또한 방사선 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
본원에 기재된 SCD1 길항제 (예를 들어, 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 소분자)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여가 단기간인지 또는 장기간인지의 여부에 부분적으로 의존하여, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본원에 기재된 SCD1 길항제 (예를 들어, 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 소분자)는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려할 요인은 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 요인을 포함한다. SCD1 길항제는 반드시 그러할 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 SCD1 길항제의 양, 장애 또는 치료법의 유형, 및 상기 논의된 다른 요인에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원에 기재된 SCD1 길항제의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, SCD1 길항제가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 SCD1 길항제에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. SCD1 길항제는 환자에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 본원에 기재된 SCD1 길항제가 환자에게 제공되도록). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시적인 투여 요법은 투여를 포함한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 및 치료 방법은 SCD1 길항제 대신에 또는 이에 더하여 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
바이오마커의 발현 수준/양은 mRNA, cDNA, 단백질, 단백질 단편 및/또는 유전자 카피 수를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 기준을 기초로 하여 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현은 단백질 발현이다. 특정 실시양태에서, 발현은 폴리뉴클레오티드 발현이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 특정 실시양태에서, 제1 샘플에서 바이오마커의 발현 수준/양은 제2 샘플에서의 발현/양과 비교하여 증가된다. 특정 실시양태에서, 제1 샘플에서 바이오마커의 발현 수준/양은 제2 샘플에서의 발현/양과 비교하여 감소된다. 특정 실시양태에서, 제2 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직이다. 유전자의 발현 수준/양을 결정하기 위한 추가의 개시내용은 본원에 기재된다.
샘플 중 다양한 바이오마커의 발현은 면역조직화학 (IHC), 웨스턴 블롯 분석, 면역침전, 분자 결합 검정, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 매스어레이, 단백질체학, 정량적 혈액 기반 검정 (예를 들어, 혈청 ELISA), 생화학적 효소적 활성 검정, 계내 혼성화, 노던 분석, 폴리메라아제 연쇄 반응 ("PCR") (정량적 실시간 PCR (qRT-PCR) 포함) 및 다른 증폭 유형 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등), RNA-Seq, FISH, 마이크로어레이 분석, 유전자 발현 프로파일링 및/또는 유전자 발현의 일련의 분석 (SAGE) 뿐만 아니라 단백질, 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 임의의 다양한 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 방법론에 의해 분석될 수 있으며, 이들 중 다수는 당업계에 공지되어 있고 당업자에 의해 이해된다. 유전자 및 유전자 산물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology] (유닛 2 (노던 블롯팅), 4 (서던 블롯팅), 15 (이뮤노블롯팅) 및 18 (PCR 분석))에서 찾아볼 수 있다. 멀티플렉스화 면역검정, 예컨대 룰즈 베이스드 메디슨(Rules Based Medicine) 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) (MSD)로부터 입수가능한 것도 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이오마커의 발현 수준은 (a) 샘플 (예컨대, 환자 암 샘플)에 대해 유전자 발현 프로파일링, PCR (예컨대, rtPCR), RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스어레이 기술, 또는 FISH를 수행하는 것; 및 b) 샘플에서 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 한 측면에서, 바이오마커의 발현 수준은 (a) 항체를 사용하여 샘플 (예컨대, 환자 암 샘플)의 IHC 분석을 수행하는 것; 및 b) 샘플에서 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, IHC 염색 강도는 참조 값과 비교하여 결정된다.
일부 실시양태에 따르면, 유전자 발현은 상기 언급된 유전자의 단백질 발현 수준의 관찰에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현 수준은 PCR 방법, 마이크로어레이 방법, 또는 면역검정 방법으로부터 선택된 방법에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 마이크로어레이 방법은 엄격한 조건 하에 상기 언급된 유전자를 코딩하는 핵산 분자에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 갖거나 또는 상기 언급된 유전자에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 이상에 결합할 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드 (예컨대, 펩티드 또는 항체)를 갖는 마이크로어레이 칩의 사용을 포함한다. 한 실시양태에서, PCR 방법은 qPCR이다. 한 실시양태에서, PCR 방법은 멀티플렉스-PCR이다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 마이크로어레이에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 표현은 멀티플렉스-PCR에 의해 측정된다.
특정 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바이오마커의 결합을 허용하는 조건 하에 상기 바이오마커에 대한 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것, 및 항체와 바이오마커 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 예를 들어 환자의 선택을 위한 바이오마커인 SCD1 길항제를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 샘플은 검정된 바이오마커의 양의 차이 및 사용된 샘플의 품질의 가변성 둘 다, 및 검정 수행 사이의 가변성에 대해 정규화된다. 널라 공지되어 있는 하우스키핑 유전자, 예컨대 ACTB를 비롯한, 특정의 표준화 바이오마커의 발현을 측정하고 그를 도입함으로써 상기와 같은 정규화를 달성할 수 있다. 대안적으로, 정규화는 검정된 유전자 또는 그의 큰 하위세트 모두의 평균 또는 중간 신호에 기초할 수 있다 (전반적 정규화 접근법). 유전자마다, 환자 종양 mRNA 또는 단백질의 측정된 정규화 양을 참조 세트에서 확인된 양과 비교한다. 각 환자마다 시험된 종양당 각 mRNA 또는 단백질에 대해 정규화된 발현 수준은 참조 세트에서 측정된 발현 수준의 백분율로서 표현될 수 있다. 분석할 특정한 환자 샘플에서 측정된 발현 수준은 이러한 범위 내의 일부 백분위수에 포함될 것이며, 이는 당업계에 널리 공지된 방법으로 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 유전자의 상대 발현 수준은 다음과 같이 결정된다:
상대 발현 유전자1 샘플1 = 2 exp (Ct 하우스키핑 유전자 - Ct 유전자1) (Ct는 샘플에서 결정됨).
상대 발현 유전자1 참조 RNA = 2 exp (Ct 하우스키핑 유전자 - Ct 유전자1) (Ct는 참조 샘플에서 결정됨).
정규화된 상대 발현 유전자1 샘플1 = (상대 발현 유전자1 샘플1 / 상대 발현 유전자1 참조 RNA) x 100.
Ct는 역치 사이클이다. Ct는 반응 내에서 생성된 형광이 역치 선을 넘는 사이클 수이다.
모든 실험은 다양한 조직 공급원 (예를 들어, 클론테크(Clontech) (캘리포니아주 마운틴 뷰)로부터의 참조 RNA #636538)으로부터 RNA의 포괄적 혼합물인 참조 RNA에 대해 정규화된다. 동일한 참조 RNA를 각각의 qRT-PCR 실행에 포함시켜서 상이한 실험 실행 사이의 결과의 비교를 허용한다.
한 실시양태에서, 샘플은 임상 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 진단 검정에 사용된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 수득된다. 조직 생검은 종양 조직의 대표적인 조각을 얻기 위해 종종 사용된다. 대안적으로, 종양 세포는 관심 종양 세포를 함유하는 것으로 공지되어 있거나 그렇게 여겨지는 조직 또는 유체의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 폐암 병변의 샘플은 절제, 기관지경검사, 미세 바늘 흡인, 기관지 찰과술에 의해, 또는 객담, 흉막액 또는 혈액으로부터 수득될 수 있다. 유전자 또는 유전자 산물은 암 또는 종양 조직으로부터, 또는 다른 신체 샘플, 예를 들어 소변, 객담, 혈청 또는 혈장으로부터 검출될 수 있다. 암성 샘플에서 표적 유전자 또는 유전자 산물의 검출에 대해 상기 논의된 것과 동일한 기술이 다른 신체 샘플에도 적용될 수 있다. 암 세포는 암 병변으로부터 벗겨져서 이러한 신체 샘플 중에 나타날 수 있다. 이러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써 이들 암에 관한 간단한 조기 진단을 달성할 수 있다. 또한, 요법의 진행은 이러한 신체 샘플을 표적 유전자 또는 유전자 산물에 대해 시험함으로써 보다 용이하게 모니터링될 수 있다.
특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 단일 샘플 또는 시험 샘플이 수득되는 때보다 하나 이상의 다른 시점에 수득된 동일한 대상체 또는 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 예를 들어, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 시험 샘플이 수득된 때보다 이른 시점에 동일한 대상체 또는 개체로부터 수득된다. 이러한 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 참조 샘플이 암의 초기 진단 동안 수득되고 시험 샘플이 암이 전이성이 되었을 때 이후에 수득되는 경우에 유용해질 수 있다.
특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 환자가 아닌 하나 이상의 건강한 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 환자가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 갖는 하나 이상의 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 정상 조직으로부터 모은 RNA 샘플 또는 대상체 또는 환자가 아닌 하나 이상의 개체로부터 모은 혈장 또는 혈청 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 종양 조직으로부터 모은 RNA 샘플 또는 대상체 또는 환자가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 갖는 하나 이상의 개체로부터 모은 혈장 또는 혈청 샘플이다.
특정 실시양태에서, 샘플 내 단백질의 발현은 면역조직화학 ("IHC") 및 염색 프로토콜을 이용하여 검사한다. 조직 절편의 면역조직화학 염색은 샘플 내 단백질의 존재를 평가 또는 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 밝혀졌다.
IHC는 형태 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 같은 추가의 기술과 함께 수행할 수 있다. 2가지 일반적 IHC 방법; 즉 직접 및 간접 검정이 이용가능하다. 첫번째 검정에 따르면, 표적 항원에 대한 항체의 결합은 직접 결정된다. 이러한 직접 검정은 추가의 항체 상호작용 없이도 시각화될 수 있는 표지된 시약, 예컨대 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정에서, 미접합 1차 항체가 항원에 결합한 후에, 표지된 2차 항체가 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우에, 발색 또는 형광 기질을 첨가하여 항원의 시각화를 제공한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다: (a) 방사성동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H 및 131I; (b) 콜로이드성 금 입자; (c) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드, 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민, 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌, 또는 상업적으로 입수가능한 형광단, 예컨대 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7)과 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 중 임의의 하나 이상의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 형광 표지; (d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 번호 4,275,149는 이들 중 일부의 개관을 제공한다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시타제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다.
효소-기질 조합물의 예는 예를 들어 기질로서 수소 퍼옥시다제와의 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO); 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트와의 알칼리성 포스파타제 (AP); 및 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제)과의 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)를 포함한다. 이들의 일반적 검토를 위해, 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980을 참조한다.
이에 따라 제조된 시료를 탑재하고 이에 커버슬립을 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 당업계에 통상적으로 사용되는 염색 강도 기준을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 1+ 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 특정 실시양태에서, IHC 검정에서 약 2+ 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 다른 실시양태에서, 약 3 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 한 실시양태에서, 종양 또는 결장 선종으로부터의 세포 및/또는 조직을 IHC를 사용하여 검사하는 경우, 염색은 일반적으로 (샘플 중에 존재할 수 있는 기질 또는 주위 조직에 반대되는 것으로서) 종양 세포 및/또는 조직에서 측정 또는 평가되는 것으로 이해된다.
대안적 방법에서, 샘플을 항체-바이오마커 복합체 형성에 충분한 조건하에서 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉시킨 후에 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 다수의 방법, 예를 들어 혈장 및 혈청을 포함하는 다양한 조직 및 샘플을 검정하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차에 의해 검출될 수 있다. 이러한 검정 포맷을 이용한 광범위한 면역검정 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653을 참조한다. 이들은 비-경쟁적 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정 뿐만 아니라, 통상적인 경쟁적 결합 검정을 둘 다 포함한다. 또한, 이러한 검정은 표적 바이오마커에 대한 표지된 항체의 직접 결합을 포함한다.
세포에서 mRNA의 평가 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 상보적 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정 (예컨대, 하나 이상의 유전자에 특이적인 표지된 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 검정 (예컨대, 하나 이상의 유전자에 특이적인 상보적 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형의 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.
포유동물로부터의 샘플은 노던, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여 mRNA에 대해 편리하게 검정될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 생물학적 샘플에서 표적 mRNA의 수준의 결정 (예를 들어, "하우스키핑" 유전자, 예컨대 액틴 패밀리 구성원의 비교 대조 mRNA 서열 수준을 동시에 조사함으로써 결정됨)을 허용하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 증폭된 표적 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.
본 발명의 임의의 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플 중의 mRNA, 예컨대 표적 mRNA를 검사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여, 시험 및 대조 조직 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이어서, 프로브를 고체 지지체 상에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 어레이는 어레이의 각각의 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있도록 구성된다. 예를 들어, 그의 발현이 항혈관신생 요법이 보이는 증가된 또는 감소된 임상적 이익과 서로 관련성이 있는 것인 유전자의 선택물을 고체 지지체 상에 배열할 수 있다. 특정한 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 그 유전자를 발현한다는 것을 나타낸다.
조직 또는 세포 샘플 중 선택된 바이오마커의 발현은 또한 기능 또는 활성-기반 분석에 의해 조사될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커가 효소인 경우에, 당업계에 공지된 검정을 수행함으로써 조직 또는 세포 샘플에서 주어진 효소 활성의 존재를 결정 또는 검출할 수 있다.
III . 치료 조성물
본원에 기재된 방법에 유용한 SCD1 길항제가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 및/또는 폴리뉴클레오티드이다.
A. 항체
한 측면에서, SCD1에 결합하는 단리된 항체를 본원에 제공된다. 임의의 상기 실시양태에서, 항체는 인간화된다. 본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-SCD1 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-SCD1 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-SCD1 항체는 하기 섹션에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al ., J. Mol . Biol . 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 ~10 반응 단위 (RU)로 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주사한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주사한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트가 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 온-레이트는 분광측정계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295nm, 방출 = 340nm, 16nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선하기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat . Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histol. Histopathol., 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공개는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 SCD1에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 SCD1의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 SCD1을 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 이용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 SCD1 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
a) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 및 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결손" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
b) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 일부 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결손되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결손될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가, 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 1개 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al ., J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.) 특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 발생시키는 변경이 Fc 영역에서 만들어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 1개 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 1개 이상의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826). Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
c) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 임의의 1개 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
B. 면역접합체
또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-SCD1 항체를 포함하는 면역접합체가 본원에 제공된다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체 (ADC)이며, 여기서 항체는 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 약물에 접합된다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편 (디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (또한 자기 공명 영상화, mri로 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al ., Cancer Res . 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교-링커 시약 (BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않음)으로 제조된 이러한 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지는 않는다.
C. 결합 폴리펩티드
결합 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 SCD1에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드는 SCD1 길항제이다. 결합 폴리펩티드는 공지된 폴리펩티드 합성 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있거나 또는 재조합 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 결합 올리고펩티드는 통상적으로는 적어도 약 5개 아미노산 길이, 대안적으로는 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 또는 그 초과의 아미노산 길이이고, 여기서 이러한 결합 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 표적, SCD1에 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 결합 폴리펩티드는 널리 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 폴리펩티드에 대해 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 널리 공지되어 있는 것으로 주지된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, 및 Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 널리 공지된 기술이며, 이는 큰 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 표적 폴리펩티드, SCD1에 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리의 구성원(들)을 확인하는 것을 허용한다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상의 코트 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다 (문헌 [Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386]). 파지 디스플레이의 유용성은, 선택적으로 무작위화된 단백질 변이체 (또는 무작위 클로닝된 cDNA)의 대규모 라이브러리가 표적 분자에 고친화도로 결합하는 서열에 대하여 빠르고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지 상에서 펩티드 (문헌 [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]) 또는 단백질 (문헌 [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]) 라이브러리의 디스플레이가 수백만가지의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 특이적 결합 특성을 갖는 것에 대해 스크리닝하는데 사용되고 있다 (문헌 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리 분류는 다수의 변이체를 구축하여 증식시키는 전략, 표적 수용체를 사용하여 친화도 정제하는 절차, 및 결합 풍부화의 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다. 미국 특허 번호 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 및 5,663,143.
대부분의 파지 디스플레이 방법에서 필라멘트형 파지가 사용되어 왔지만, 람다형 파지 디스플레이 시스템 (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), T4 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)]) 및 T7 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993)]; U.S. 5,766,905)이 또한 공지되어 있다.
추가의 개선은 선택된 표적 분자와의 결합에 대해 펩티드 라이브러리를 스크리닝하고 이러한 단백질을 바람직한 특성에 대해 스크리닝하는 잠재성을 이용하여 기능적 단백질을 디스플레이하는 디스플레이 시스템의 능력을 증진시킨다. 파지 디스플레이 반응에 대한 조합 반응 장치가 개발되었으며 (WO 98/14277), 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 이분자 상호작용 (WO 98/20169; WO 98/20159) 및 억제된 나선형 펩티드의 특성 (WO 98/20036)을 분석 및 제어하였다. WO 97/35196은 파지 디스플레이 라이브러리를, 리간드가 표적 분자에 결합할 하나의 용액 및 친화성 리간드가 표적 분자에 결합하지 않을 제2 용액과 접촉시켜 친화성 리간드를 단리함으로써 결합 리간드를 선택적으로 단리하는 방법을 기재한다. WO 97/46251은 친화도 정제된 항체를 사용하여 무작위 파지 디스플레이 라이브러리를 바이오패닝한 후에 결합 파지를 단리하고, 이후에 마이크로플레이트 웰을 사용하는 마이크로패닝 과정에 의해 고친화도 결합 파지를 단리하는 방법을 기재한다. 친화성 태그로서의 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphlylococcus aureus) 단백질 A의 용도가 또한 보고되었다 (문헌 [Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187]). WO 97/47314는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있는 조합 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하는 기질 제외 라이브러리의 사용을 기재한다. 파지 디스플레이를 이용하여 세제 중에 사용하기에 적합한 효소를 선택하는 방법은 WO 97/09446에 기재되어 있다. 특이적 결합 단백질을 선택하는 추가의 방법은 미국 특허 번호 5,498,538, 5,432,018, 및 WO 98/15833에 기재되어 있다.
펩티드 라이브러리를 생성하고 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 또한 미국 특허 번호 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, 및 5,723,323에 개시되어 있다.
D. 결합 소분자
SCD1 소분자 길항제로 사용하기 위한 결합 소분자가 본원에 제공된다.
결합 소분자는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 SCD1에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 본원에 정의된 바와 같은 결합 폴리펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 결합 유기 분자는 공지의 방법을 이용하여 확인되고 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어 PCT 공개 번호 WO 00/00823 및 WO 00/39585 참조). 결합 유기 소분자는 통상적으로 크기가 약 2000 달톤 미만이고, 대안적으로 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이며, 여기서 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 이러한 유기 소분자는 널리 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있는 것으로 주지된다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 결합 유기 소분자는 예를 들어 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 WO 2005/011655 및/또는 US 2005/0119251에 기재된 화합물이며, 이들은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 화학식 I의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 거울상이성질체 또는 호변이성질체, 그의 제약상 허용되는 염, 그의 제약 조성물 또는 그의 전구약물이다:
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서: x 및 y는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고; W는 -C(O)N(R1)-; -C(O)N[C(O)R1a]-, -N(R1)C(O)N(R1)- 또는 -N(R1)C(O)-이고; V는 -C(O)-, -C(S)- 또는 -C(R10)H이고; 각각의 R1은 독립적으로 수소; 할로, 메틸 또는 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C1-C6 알킬; 및 메톡시 및 히드록실로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C2-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R1a는 수소, C1-C6 알킬 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 C1-C12 알킬, C2-C12알케닐, C2-C12히드록시알킬, C2-C12 히드록시알케닐, C1-C12 알콕시, C2-C12 알콕시알킬, C3-C12시클로알킬, C4-C12시클로알킬알킬, 아릴, C7-C12아르알킬, C3-C12 헤테로시클릴, C3-C12헤테로시클릴알킬, C1-C12헤테로아릴 및 C3-C12헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R2는 2 내지 4개의 고리를 갖는 다중-고리 구조이며, 여기서 고리는 독립적으로 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이 때 고리 중 일부 또는 전부는 서로 융합될 수 있고; R3은 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12히드록시알킬, C2-C12히드록시알케닐, C1 -C12알콕시, C2-C12알콕시알킬, C3-C12시클로알킬, C4-C12시클로알킬알킬, 아릴, C7-C12아르알킬, C3-C12헤테로시클릴, C3-C12헤테로시클릴알킬, C1-C12헤테로아릴 및 C3-C12헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; R3은 2 내지 4개의 고리를 갖는 다중-고리 구조이며, 여기서 고리는 독립적으로 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이 때 고리 중 일부 또는 전부는 서로 융합될 수 있고; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메틸, 메톡시 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로 또는 -N(R12)2로부터 선택되고; R6, R6a, R7, R7a, R8. R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6 및 R6a가 함께, 또는 R7 및 R7a가 함께, 또는 R8 및 R8a가 함께, 또는 R9 및 R9a가 함께 옥소 기이고, 단 V가 -C(O)-인 경우에, R7 및 R7a가 함께 또는 R8 및 R8a가 함께 옥소 기를 형성하지 않으며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6, R6a, R7 및 R7a 중 하나는 R8, R8a, R9 및 R9a 중 하나와 함께 알킬렌 가교를 형성하며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되고; R10은 수소 또는 C1-C3 알킬 이고; 각각의 R12는 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 화학식 II의 화합물 (그의 입체이성질체, 거울상이성질체 또는 호변이성질체, 그의 제약상 허용되는 염, 그의 제약 조성물 또는 그의 전구약물 포함)이다:
<화학식 II>
Figure pct00002
상기 식에서: x 및 y는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고; W는 -C(O)N(R1)- 및 -N(R1)C(O)-로부터 선택되고; 각각의 R1은 독립적으로 수소; 할로, 메틸 또는 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C1-C6 알킬; 및 메톡시 및 히드록시로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C2-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 C7-C12 알킬, C3-C12 알케닐, C7-C12히드록시알킬, C2-C12 알콕시알킬, C3-C12 히드록시알케닐, C3-C12 시클로알킬, C4-C12 시클로알킬알킬, C13-C19 아르알킬, C3-C12 헤테로시클릴알킬 및 C3-C12 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R2는 2 내지 4개의 고리를 갖는 다중-고리 구조이며, 여기서 고리는 독립적으로 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이 때 고리 중 일부 또는 전부는 서로 융합될 수 있고; R3은 C3-C12 알킬, C3-C12 알케닐, C3-C12 히드록시알킬, C3-C12 히드록시알케닐, C3-C12 알콕시, C3-C12 알콕시알킬, C3-C12 시클로알킬, C4-C12시클로알킬알킬, 아릴, C7-C12 아르알킬, C3-C12헤테로시클릴, C3-C12 헤테로시클릴알킬, C5-C12 헤테로아릴 및 C3-C12헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R3은 2 내지 4개의 고리를 갖는 다중-고리 구조이며, 여기서 고리는 독립적으로 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이 때 고리 중 일부 또는 전부는 서로 융합될 수 있고; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메틸, 메톡시 및 트리플루오로메틸로부터 선택되고; 및 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6 및 R6a가 함께, 또는 R7 및 R7a가 함께, 또는 R8 및 R8a가 함께, 또는 R9 및 R9a가 함께 옥소 기이고, 단 V가 -C(O)-인 경우에, R7 및 R7a가 함께 또는 R8 및 R8a가 함께 옥소 기를 형성하지 않으며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6, R6a, R7 및 R7a 중 하나는 R8, R8a, R9 및 R9a 중 하나와 함께 알킬렌 가교를 형성하며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 화학식 III의 화합물, 그의 입체이성질체, 거울상이성질체 또는 호변이성질체, 그의 제약상 허용되는 염, 그의 제약 조성물 또는 그의 전구약물이다:
<화학식 III>
Figure pct00003
상기 식에서: x 및 y는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고; A는 산소 또는 황이고; W는 -C(O)N(R1 )- 및 -N(R1 )C(O)-로부터 선택되고; 각각의 R1은 독립적으로 수소; 할로, 메틸 또는 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C1-C6 알킬; 및 메톡시 및 히드록시로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C2-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 히드록시알킬, C2-C12 히드록시알케닐, C1-C6 알콕시, C3-C12 알콕시알킬, C3-C12시클로알킬, C4-C12 시클로알킬알킬, 아릴, C7-C12 아르알킬, C3-C12 헤테로시클릴, C3-C12헤테로시클릴알킬, C C12헤테로아릴 및 C3-C12헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R2는 2 내지 4개의 고리를 갖는 다중-고리 구조이며, 여기서 고리는 독립적으로 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이 때 고리 중 일부 또는 전부는 서로 융합될 수 있고; R3은 할로, 시아노, 니트로, 히드록시, C1-C6 알킬, C1-C6 트리할로알킬, C1-C6 트리할로알콕시 C1-C6 알킬술포닐, -N(R11)2, -OC(O)R11, -C(O)OR11, -S(O)2N(R11)2, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 헤테로아릴 및 헤테로아릴시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 페닐이고, 단 R3은 임의로 치환된 티에닐로 치환된 페닐이 아니고; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메틸, 메톡시 및 트리플루오로메틸로부터 선택되고; R6, R6a, R7. R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6 및 R6a가 함께, 또는 R7 및 R7a가 함께, 또는 R8 및 R8a가 함께, 또는 R9 및 R9a가 함께 옥소 기이고, 단 V가 -C(O)-인 경우에, R7 및 R7a가 함께 또는 R8 및 R8가 함께 옥소 기를 형성하지 않으며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6, R6a, R7 및 R7a 중 하나는 R8, R8a, R9 및 R9a 중 하나와 함께 알킬렌 가교를 형성하며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되고; 각각의 R11은 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, C3-C6 시클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 화학식 IV의 화합물, 그의 입체이성질체, 거울상이성질체 또는 호변이성질체, 그의 제약상 허용되는 염, 그의 제약 조성물 또는 그의 전구약물이다:
<화학식 IV>
Figure pct00004
상기 식에서: x 및 y는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고; 각각의 R1은 독립적으로 수소; 할로, 메틸 또는 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C1-C6 알킬; 및 메톡시 및 히드록시로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C2-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12히드록시알킬, C2-C12히드록시알케닐, C2-C12알콕시알킬, C3-C12 시클로알킬, C4-C12 시클로알킬알킬, C3-C12헤테로시클릴, C3-C12 헤테로시클릴알킬, 아릴, C7-C12 아르알킬, C1-C12 헤테로아릴 및 C3-C12 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R2는 2 내지 4개의 고리를 갖는 다중-고리 구조이며, 여기서 고리는 독립적으로 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이 때 고리 중 일부 또는 전부는 서로 융합될 수 있고; R3은 C1-C12 알킬, C2-C12알케닐, C2-C12히드록시알킬, C2-C12 히드록시알케닐, C1-C12 알콕시, C2-C12알콕시알킬, C3-C12 시클로알킬, C4-C12 시클로알킬알킬, 아릴, C7-C12아르알킬, C3-C12 헤테로시클릴, C3-C12 헤테로시클릴알킬, C1-C12 헤테로아릴 및 C3-C12 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R3은 2 내지 4개의 고리를 갖는 다중-고리 구조이며, 여기서 고리는 독립적으로 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이 때 고리 중 일부 또는 전부는 서로 융합될 수 있고; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메틸, 메톡시 및 트리플루오로메틸로부터 선택되고; R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6 및 R6a가 함께, 또는 R7 및 R7a가 함께, 또는 R8 및 R8a가 함께, 또는 R9 및 R9a가 함께 옥소 기이고, 단 V가 -C(O)-인 경우에, R7 및 R7a가 함께 또는 R8 및 R8a가 함께 옥소 기를 형성하지 않으며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6, R6a, R7 및 R7a 중 하나는 R8, R8a, R9 및 R9a 중 하나와 함께 알킬렌 가교를 형성하며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 화학식 Va의 화합물, 그의 입체이성질체, 거울상이성질체 또는 호변이성질체, 그의 제약상 허용되는 염, 그의 제약 조성물 또는 그의 전구약물이다:
<화학식 Va>
Figure pct00005
상기 식에서: x 및 y는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고; W는 -C(O)N(R1)-; -N(R1)C(O)N(R1)- 또는 -N(R1)C(O)-이고; 각각의 R1은 독립적으로 수소; 할로, 메틸 또는 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 CrC6알킬; 및 메톡시 및 히드록시로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C2-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 C7-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C7-C12 히드록시알킬, C2-C12 히드록시알케닐, C1-C12 알콕시, C2-C12알콕시알킬, C3-C12 시클로알킬, C1-C12 시클로알킬알킬, C13-C19 아르알킬, C1-C12 헤테로시클릴, C3-C12 헤테로시클릴알킬, C1-C12 헤테로아릴 및 C3-C12 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R3은 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 히드록시알킬, C2-C12 히드록시알케닐, C1-C12 알콕시, C2-C12 알콕시알킬, C3-C12 시클로알킬, C4-C12시클로알킬알킬, 아릴, C7-C12아르알킬, C3-C12헤테로시클릴, C3-C12헤테로시클릴알킬, C1-C12 헤테로아릴 및 C3-C12헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메틸, 메톡시 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로 또는 -N(R2)2로부터 선택되고; R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6 및 R6a가 함께, 또는 R7 및 R7a가 함께, 또는 R8 및 R8a가 함께, 또는 R9 및 R9a가 함께 옥소 기이고, 단 V가 -C(O)-인 경우에, R7 및 R7a가 함께 또는 R8 및 R8a가 함께 옥소 기를 형성하지 않으며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6, R6a, R7 및 R7a 중 하나는 R8, R8a, R9 및 R9a 중 하나와 함께 알킬렌 가교를 형성하며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되고; R10은 수소 또는 C1-C3 알킬이고; 각각의 R12는 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬로부터 선택되나; 단 R2는 피라지닐, 피리디노닐, 피롤리디노닐 또는 이미다졸릴일 수 없다.
일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 화학식 Vb의 화합물, 그의 입체이성질체, 거울상이성질체 또는 호변이성질체, 그의 제약상 허용되는 염, 그의 제약 조성물 또는 그의 전구약물이다:
<화학식 Vb>
Figure pct00006
상기 식에서: x 및 y는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고; W는 -C(O)N(R1)-; -N(R1)C(O)N(R1)- 또는 -N(R1)C(O)-이고; 각각의 R1은 독립적으로 수소; 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 할로, 메틸 또는 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택된 C1-C6 알킬; 및 메톡시 및 히드록시로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된 C2-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12히드록시알킬, C2-C12히드록시알케닐, C1-C12 알콕시, C2-C12 알콕시알킬, C3-C12시클로알킬, C4-C12 시클로알킬알킬, 아릴, C7-C12 아르알킬, C3-C12 헤테로시클릴, C3-C12 헤테로시클릴알킬, C1-C12 헤테로아릴 및 C3-C12헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R3은 C7-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 히드록시알킬, C2-C12 히드록시알케닐, C1-C12 알콕시 또는 C2-C12알콕시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 메틸, 메톡시 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로 또는 -N(R12)2로부터 선택되고; R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되거나; 또는 R6 및 R6a가 함께, 또는 R7 및 R7a가 함께, 또는 R8 및 R8a가 함께, 또는 R9 및 R9a가 함께 옥소 기이고, 단 V가 -C(O)-인 경우에, R7 및 R7a가 함께 또는 R8 및 R8a가 함께 옥소 기를 형성하지 않으며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3-알킬로부터 선택되거나; 또는 R6, R6a, R7 및 R7a 중 하나는 R8, R8a, R9 및 R9a 중 하나와 함께 알킬렌 가교를 형성하며, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 및 R9a는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬로부터 선택되고; R10은 수소 또는 C1-C3 알킬이고; 및 각각의 R12는 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 US20050119251, WO2006014168, WO2006034441, WO2006034312, WO2006034315, WO2006125194, WO2007046868, WO2007050124, WO2006034279, WO2006034338, WO2006125181, WO2007044085, WO2007046867, WO2006034341, WO2006101521, WO2006125179, WO2006034440, WO2006034446, WO2006125178, WO2006125180, WO2007136746, WO2007130075, WO2007143597, WO2008024390, WO2008036715, WO2008074835, WO2008127349 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다.
일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 한 종점 상에서 관능화 피페라진 벤즈아미드에 의해 및 다른 종점 상에서 카르복스아미드에 의해 치환된 중심 피리다진/피리딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 화합물 1이다. 일부 실시양태에서, SCD1 소분자 길항제는 화합물 2이다.
Figure pct00007
일부 실시양태에서, 피리다진/피리딘 코어는 하기 나타낸 바와 같은 피리미딘 (둘 다 위치이성질체) 및 피라진, 피리디논, 페닐 고리, 이미다졸로피리다진 및 벤즈이미다졸을 비롯한 다른 모노시클릭 및 비시클릭 고리로 대체된다.
Figure pct00008
일부 실시양태에서, 6-원 헤테로아릴 고리는 피리다진 대용물로서 5-원 고리, 예컨대 [1,2,4]티아디아졸, 피라졸 및 티아졸로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 3이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 4이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 5이다.
Figure pct00009
일부 실시양태에서, 피리다진 고리는 비-시클릭 아미딘 구조로 변화된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 6이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 비-방향족 티아졸리딘디온 피페리딘 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 7이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 융합된 테트라히드로-1,6-나프티리딘이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 테트라히드로푸로[2,3-c]피리딘이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 8이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 9이다.
Figure pct00010
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피페라진 벤즈아미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 피페라진 벤즈아미드는 피페리딘 벤즈아미드에 변형된다. 일부 실시양태에서, 피페라진 벤즈아미드는 아닐린 피페리딘 (다른 측면 상의 질소) 및 비시클릭 3-아자비시클로[3.1.0]헥산-6-아민으로 변형된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피페리딘과 페닐 고리 사이에 이중 결합 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피페라진이고, 이는 시클로헥산 또는 테트라히드로피리미딘으로 변형된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 하기 나타낸 도메인을 포함한다.
Figure pct00011
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피리다진 및 피페리딘 고리 사이에 삽입되는 링커, 예컨대 산소, 아미노 및/또는 카르보닐 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 10이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 직접-연결된 헤테로아릴피페라진 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 11이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 트리시클릭 SCD1 억제제이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 12이다.
Figure pct00012
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 이미다졸린이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 옥사디아졸 (3개의 상이한 위치이성질체)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 이미다조피리딘이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 시클릭 우레아이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 하기 나타낸 도메인을 포함한다.
Figure pct00013
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 카르복스아미드는 피리미딘 주형 상에서 1,4로부터 1,3 배열로 이동한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 13이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 트리시클린 융합 옥사제피논이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 14이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 페닐 고리로 고리화되어 프탈이미드 유형을 생성한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 15이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물의 양쪽 말단을 고리화한 마크로사이클이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 16이다.
Figure pct00014
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 티아졸 카르복스아미드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 17이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 2-옥소피리딘-1(2H)-일 티아졸 카르복스아미드 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 18이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 50 nM의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 19이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 30 nM의 IC50 값을 갖는다.
Figure pct00015
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 2-(피라진-2-일)-티아졸 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 2-(1H-피라졸-3-일)-티아졸 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 21이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 42 nM의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 22이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 49 nM의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 티아졸릴 피롤리디논 및 피페리디논-기재 SCD1 억제제이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 트리아졸릴 티아졸-기재 SCD1 억제제이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 22이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 120 nM의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 23이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 10 nM의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 디히드로이미다졸리논이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 이미다졸리디논이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 26이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 27이다.
Figure pct00016
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2006130986, WO2007009236, WO2007056846, WO2008017161 WO2008141455, WO2007134457, WO2007143823, WO2007143824, WO2008046226, WO2008064474 및/또는 WO2008128335 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 아자시클로헥산 유도체이다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 티아졸릴 옥사디아졸 화합물이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 26이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 27이다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 상이한 카르복스아미드 생동배체를 갖는 피리다진 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 28이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 29이다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 융합된 비시클릭 헤테로아릴을 갖는 화합물이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 융합된 비시클릭 헤테로아릴을 갖는 티아졸로피리미디논이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 융합된 비시클릭 헤테로아릴을 갖는 티아졸로피리미딘이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 융합된 비시클릭 헤테로아릴을 갖는 퓨린이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 융합된 비시클릭 헤테로아릴을 갖는 1H-이미다조[4,5-c]피리딘-4-아민 (예를 들어, 피리다진 코어를 대체함)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 30이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 31이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 32이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 33이다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 비시클릭이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 34이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 35이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피리다진 고리를 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피리다진 고리를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 36이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 37이다.
Figure pct00017
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 6-원 피페리딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 4원 아제티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 38이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 39이다.
Figure pct00018
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 5-원 피롤리딘 고리를 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 40이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 41이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 42이다.
Figure pct00019
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 43이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 44이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 테트라졸 아세트산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가로 테트라졸 아세트산을 포함하는 SCD1 길항제 소분자는 지방족 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 45이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 46이다.
Figure pct00020
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 문헌 [Liu G. et al., J Med Chem (2007);50:3086-100, Zhao H. et al., Bioorg Med Chem Lett (2007);17:3388-91, Xin Z. et al., Bioorg Med Chem Lett (2008);18:4298-302 및/또는 Liu G. Stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD1) Inhibitors: Discovery and in vivo evaluation. Emerging Targets for Type 2 Diabetes Symposium, The 233th ACS National Meeting, Chicago, IL, March 2007, MEDI-382] (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 46이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 경구로 이용가능하다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 각각 마우스 및 인간에서 4.5 및 26 nM의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 HepG2 세포에서 장쇄 지방산-CoA 탈포화를 [13C]-C16:1/[13C]-C16:0에 의해 측정시에 6.8 nM의 IC50 값으로 억제한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 (CL = 0.28 (l h)/kg, Vss = 0.71 l/kg, AUC = 10.66 (μg h)/ml 및 F = 59%)의 시험관내 PK이다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 글리신 아미드 피리딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 48이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 인간 SCD1을 90 nM의 IC50 값으로 억제한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피라진 화합물이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 49이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 인간 SCD1에 대해 37 nM의 IC50 값을 갖는다.
Figure pct00021
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피페리딘 우레아이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 50이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 IC50 < 4 nM 대 mSCD1, 37 nM 대 hSCD1) 및 PK 특성 (CL = 0.4 (l h)/kg, Vss = 0.4 l/kg, 경구 AUC = 13.3 (μg h)/ml, 경구 F = 102%)을 갖는다.
Figure pct00022
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008123891, WO2008043087, WO2008127615 및/또는 문헌 [Koltun DO et al. Potent, selective, and metabolically stable stearoyl-CoA desaturase (SCD) inhibitors for the potential treatment of obesity and diabetes. The 236th ACS National Meeting, Philadelphia, PA, August 2008, MEDI-198] (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 프테리디논 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008043087 및/또는 WO2008127615에 나타낸 바와 같이 효력 및 시험관내 ADME 프로파일을 둘 다 개선시키는 코어 주형의 전체 변형을 포함하는 프테리디논 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 51이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 프테리돈 유사체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 각각 래트 및 인간 SCD1에 대해 250 및 280 nM의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 3-옥소피리도[3,2-b]피라진이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 52이다. 화합물 52는 실시예에 사용된 A37602 (G01522403)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 37 nM의 hSCD1 IC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 래트에서 7.8 nM의 IC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 2-옥소피리도[3,4-b]피라진 유사체를 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 53이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 2-옥소퀴녹살린-기재 SCD1 억제제이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 54이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 Δ5 및 Δ6 데새투라제에 대해 선택적으로 나노몰 아래의 IC50을 가지며, HLM 및 RLM (30분 인큐베이션)에서 50% 초과의 안정성을 갖는다.
Figure pct00023
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008074824, WO20080074832, WO2008074833, WO2008074834, WO2008104524 및/또는 WO2009010560 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. GSK는 SCD1 억제제와 관련하여 다수의 특허 출원을 공개하였다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피라졸릴 4-아미드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 55이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 래트 SCD1에 대해 pIC50 (-log IC50) 값 < 5.5를 갖는다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피라졸릴 3-아미드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 56이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 래트 SCD1을 5.5 초과의 pIC50으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 피라졸은 티아디아졸로 변형된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 57이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 래트 SCD1을 5.5 초과의 pIC50으로 억제한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 58이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 시험관내 및 세포 효력을 갖는다 (각각 pIC50 7.00 내지 7.25).
Figure pct00024
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008044767 및/또는 WO2008096746 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 방향족 아민 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 59이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 10 μM에서 마이크로솜 SCD1 활성의 100%를 억제한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피리다진 주형이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 60이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 DIO 마우스에서 DI (C18:1/C18:0)를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008056687, JP2009019013 및/또는 WO2008139845 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 스피로피페리딘 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 61이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 HEK293 세포에서 형질감염된 인간 SCD1에 대해 0.2 μM 미만의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 62이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 아졸 아미드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 63이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 인간 SCD1을 < 1 μM의 IC50 값으로 억제한다.
Figure pct00025
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008120744, WO2008123469 및/또는 WO2008029266 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 2,5-이치환된 티오펜/푸란 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 64이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 0.1 μM 미만의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 6-원 아릴 고리로 변형된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 벤즈마이드 유사체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 65이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 래트 SCD1에 대해 0.1 μM 미만의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피페리딘으로 변형된다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 우레아 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 66이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 래트 SCD1에 대해 0.1 μM 미만의 IC50 값을 갖는다.
Figure pct00026
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008029266 및/또는 WO2008062276 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피리디닐옥사졸라논이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 67이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 인간 SCD1을 10 μM에서 99% 억제한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피리다진/피리딘을 함유하는 아세틸렌이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 68이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 인간 SCD1을 10 μM에서 100% 억제한다.
Figure pct00027
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008003753 및/또는 WO2008116898 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피라졸로[1,5-a]피리미딘 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 69이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 140 nM의 IC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 70이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 22 nM의 IC50 값을 갖는다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008157844 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피페라진-기재 SCD1 억제제이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 71이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 72이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 SCD1을 IC50 값 < 10 mM으로 억제한다.
Figure pct00028
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2008135141 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 비시클릭 피롤로[3,4-c]피롤로 디아민 코어 스캐폴드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 73이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 74이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 래트 SCD1를 10 μM에서 100% 억제한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 75이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 76이다.
Figure pct00029
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 19b이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 24b이다. 화합물 24b는 실시예에 사용된 G02447171.1 (G02447171)이다.
Figure pct00030
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 WO2011011872, WO2011011506, WO2011047481, WO2011011508, WO2011039358, WO2011030312, WO2010025553, WO2010094120, WO2010112520, WO2009060452, WO2009019566, WO2009010560, WO2009016216 및/또는 WO2009056556 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 스피로시클릭 화합물이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 스피로 화합물이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 벤조-융합 옥사제핀 화합물이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 피라졸 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 트리아졸 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 N-티아졸릴-1,2,3,4-테트라히드로-6-이소퀴놀린카르복스아미드 유도체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 A939572 (4-(2-클로로페녹시)-N-(3-(메틸카르바모일)-페닐)피페리딘-1-카르복스아미드)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 CVT-11,127이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 MF-438이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 퀴녹살리논이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 CVT-13,036이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 11,563이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 CVT-12,012이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 CVT-12,805이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 http://caocao.myipcn.org/science?_ob=MImg&_cid=273013&_user=4861547&_ pii=S0065774310450071&_zone=rslt_list_item&_coverDate=12%2F31%2F2010&wchp=dGLzVlt-zSkWz&_valck=1&md5=117298fb3b239424e814148d8b4bae32&ie=/sdarticle.pdf (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서의 SCD1 길항제 소분자이다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 거울상이성질체 형태이다:
<화학식 IIa>
Figure pct00031
상기 식에서, R1은 C5 내지 C14, 특히 C6의 알킬, 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기를 나타내고, 상기 아릴 또는 헤테로아릴은 1개 이상의 기 Ra로 임의로 치환되고; -Ra는 할로겐 원자, 히드록실 기, -NO2, -CN, -NH2, -N(C1 - 6알킬)2, C1 - 6알킬, C1-6알콕시, -C(O)-C1 - 6알킬, C2 - 6알케닐, C3 - 6시클로알킬, 아릴, C3 -6 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴을 나타내고, 상기 알킬, 알콕시, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴은 1개 이상의 할로겐 원자, C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, -C(0)-C1-6 알킬, -NO2, -CF3, -OCF3, -CN, -NH2, 및/또는 -N(C1 - 6알킬)2로 임의로 치환되고; -n은 0, 1, 2, 또는 3을 나타내고; -R2는 C5 내지 C14, 특히 C6의 알킬, 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기를 나타내고, 상기 아릴 또는 헤테로아릴은 1개 이상의 기 Rb로 임의로 치환되고; -Rb는 할로겐 원자, 히드록실 기, N02, -CN, -CF3, -OCF3, C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, -C(O)-C1 -6 알킬, -NH2, -N(C1 - 6알킬)2, C3 -6 시클로알킬, C3 -6 헤테로시클릴, 아릴, 헤테로아릴을 나타내고, 상기 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 헤테로아릴은 1개 이상의 히드록실 기, -CF3, -OCF3, -NH2, -NO2, 및/또는 -CN 중 하나로 임의로 치환된다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 미국 특허 출원 번호 7,652,013 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SCD1 길항제 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화학식 II의 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염이다:
<화학식 II>
Figure pct00032
상기 식에서, R1 및 R5는 서로 독립적으로 수소, 비치환된 저급 알킬, 할로겐, 트리플루오로메틸, 히드록시, 아릴, 알콕시 또는 NO2이고; R1 및 R2는 임의로 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께, 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 9-원 고리를 형성하고; R2 및 R4는 서로 독립적으로 수소, 비치환된 저급 알킬, 저급 알케닐, 알콕시, 할로겐, 시아노, 트리플루오로메틸, O-트리플루오로메틸 또는 NO2이고; R3은 수소, 비치환된 저급 알킬, 알콕시 또는 할로겐이고; 여기서 R1, R2, R3, R4 또는 R5 중 1개 이상은 수소이다. 일부 실시양태에서, R1은 할로겐이고, R4는 알콕시이고 R5는 히드록시이다. 일부 실시양태에서, R1, R4 및 R5는 각각 수소이다. 일부 실시양태에서, R2는 할로겐이고, R4는 할로겐이고 R5는 히드록시이다. 일부 실시양태에서, R2 및 R3은 둘 다 비치환된 저급 알킬이다. 일부 실시양태에서, R2 및 R5는 둘 다 트리플루오로메틸이다. 일부 실시양태에서, R3 및 R4는 둘 다 할로겐이다. 일부 실시양태에서, R4 및 R5는 둘 다 할로겐이다. 일부 실시양태에서, R2는 할로겐이고 R3은 히드록시이다. 일부 실시양태에서, R2는 할로겐이고 R5는 NO2이다. 일부 실시양태에서, R2는 -O-트리플루오로메틸이고 R5는 히드록시이다. 일부 실시양태에서, R3은 할로겐이다. 일부 실시양태에서, R4는 비치환된 저급 알킬이다. 일부 실시양태에서, R5는 비치환된 저급 알킬이다. 일부 실시양태에서, R5는 트리플루오로메틸이다. 일부 실시양태에서, R5는 할로겐이다. 일부 실시양태에서, R5는 NO2이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 6-[4-(3-브로모-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온; 6-[4-(5-브로모-2-히드록시-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온; 6-[4-(3-클로로-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온; 6-[4-(5-클로로-2-니트로-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온; 6-[4-(2,3-디클로로-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온; 6-[4-(3,5-디클로로-2-히드록시-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온; 6-[4-(2,6-디메틸-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온; 6-[4-(2-히드록시-5-트리플루오로메톡시-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온; 6-[4-(2-니트로-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온; 또는 6-[4-(2-트리플루오로메틸-벤질)-피페라진-1-일]-3H-피리미딘-4-온이다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 77 (실시예의 RG1; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 24)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 78 (실시예의 RG2; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 51)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 79 (실시예의 RG3; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 50)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 80 (실시예의 RG4; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 44)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 81 (실시예의 RG5; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 45)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 82 (실시예의 RG6; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 46)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 83 (실시예의 RG7; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 28)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 84 (실시예의 RG8; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 49)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 85 (실시예의 RG9; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 48)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 86 (실시예의 RG10; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 25)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 87 (실시예의 RG11; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 38)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 88 (실시예의 RG12; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 47)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 89 (실시예의 RG13; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 35)이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제 소분자는 화합물 90 (실시예의 RG14; 미국 특허 출원 7,652,013의 실시예 31)이다.
Figure pct00033
Figure pct00034
E. 길항제 폴리뉴클레오티드
폴리뉴클레오티드 길항제가 본원에 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 안티센스 핵산 및/또는 리보자임일 수 있다. 안티센스 핵산은 SCD1 유전자의 RNA 전사체 중 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나, 절대 상보성은 바람직하기는 하지만 요구되지는 않는다.
본원에 지칭된 "RNA의 적어도 일부에 상보적인" 서열은 RNA와 혼성화하여 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있도록 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하고; 따라서 이중 가닥 SCD1 안티센스 핵산의 경우에, 듀플렉스 DNA의 단일 가닥을 시험할 수 있거나 또는 트리플렉스 형성을 검정할 수 있다. 혼성화 능력은 안티센스 핵산의 상보성 정도 및 길이 둘 다에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화 핵산이 길수록 SCD1 RNA와의 염기 미스매치가 더 많을 수 있고, 안정한 듀플렉스 (또는 경우에 따라 트리플렉스)를 함유하고 계속 형성할 수 있다. 당업자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하기 위해 표준 절차를 이용하여 허용가능한 미스매치의 정도를 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 길항제는 5'-GATCCCCCTACAAGAGTG GCTGAGTTTTCAAGAGAAACTCAGCCACTCTTGTAGTTTTTTGGAAA-3' (서열 2); 5'-GA TCCCCCTACGGCTCTTTCTGATCATTCAAGAGATGATCAGAAAGAGCCGTAGTTTTTTGGAAA-3' (서열 3); 또는 5'-GATCCCCGCACATCAACTTCACCACATTCAAGAGATGTGGTGAAGTTG ATGTGCTTTTTTGGAAA-3' (서열 4)를 포함한다.
메시지의 5' 말단, 예를 들어 AUG 개시 코돈까지 및 이를 포함하는 5' 비번역 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 번역을 억제하는데 가장 효율적으로 작동해야 한다. 그러나, mRNA의 3' 비번역 서열에 상보적인 서열이 또한 mRNA의 번역을 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 문헌 [Wagner, R., 1994. Nature 372:333-335]을 참조한다. 따라서, SCD1 유전자의 5'- 또는 3'-비-번역, 비-코딩 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 안티센스 접근법에 사용하여 내인성 SCD1 mRNA의 번역을 억제할 수 있다. mRNA의 5' 비번역 영역에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 상보체를 포함해야 한다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 번역의 보다 덜 효율적인 억제제이지만, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. SCD1 mRNA의 5'-, 3'- 또는 코딩 영역에 혼성화되도록 설계되는지 여부에 관계없이, 안티센스 핵산은 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이를 가져야 하며, 바람직하게는 6 내지 약 50개 뉴클레오티드 범위의 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 구체적 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개의 뉴클레오티드, 적어도 17개의 뉴클레오티드, 적어도 25개의 뉴클레오티드 또는 적어도 50개의 뉴클레오티드이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 SCD1 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터의 전사에 의해 세포내에서 생산된다. 예를 들어, 벡터 또는 그의 일부가 전사되어, SCD1 유전자의 안티센스 핵산 (RNA)을 생산한다. 이러한 벡터는 SCD1 안티센스 핵산을 코딩하는 서열을 함유할 것이다. 이러한 벡터는 원하는 안티센스 RNA를 생산하도록 전사될 수 있는 한 에피솜을 보유하거나 또는 염색체에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 당업계 표준의 재조합 DNA 기술 방법에 의해 구축될 수 있다. 벡터는 척추동물 세포에서 복제 및 발현을 위해 사용되는, 플라스미드, 바이러스 또는 당업계에 공지된 다른 것일 수 있다. SCD1 또는 그의 단편을 코딩하는 서열의 발현은 척추동물, 바람직하게는 인간 세포에서 작용하는 것으로 당업계에 공지된 임의의 프로모터에 의한 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성 또는 구성적일 수 있다. 이러한 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역 (문헌 [Bernoist and Chambon, Nature 29:304-310 (1981)]), 라우스(Rous) 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터 (문헌 [Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980)]), 헤르페스 티미딘 프로모터 (문헌 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981)]), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (문헌 [Brinster, et al., Nature 296:39-42 (1982)]) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
F. 항체 및 결합 폴리펩티드 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 표적-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체 및/또는 결합 폴리펩티드 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
[표 1]
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기가 치환되는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL로 높은 빈도에서 돌연변이화를 수행하는 코돈에 의해 코딩되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 이차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 이차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-지정된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-10851]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
G. 항체 및 결합 폴리펩티드 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 부착되어 있는 중합체의 수는 달라질 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착되어 있는 경우에, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체 및/또는 결합 폴리펩티드 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티에 대한 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체 및/또는 결합 폴리펩티드-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
IV . 재조합 방법 및 조성물
항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 항-SCD1 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질전환됨): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같은, 항-SCD1 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체 및/또는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.
항-SCD1 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체 및/또는 글리코실화 결합 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산 및/또는 결합 폴리펩티드 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
기재는 항체- 및 결합 폴리펩티드-코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 생산하는 것과 주로 관련된다. 물론, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 제조하기 위해 당업계에 널리 공지된 대안적 방법을 사용할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열, 또는 그의 부분을 고체-상 기술을 이용하여 직접 펩티드 합성에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 펩티드 합성기 (캘리포니아주 포스터 시티)를 제조업체의 지침에 따라 이용하여 달성될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 다양한 부분은 개별적으로 화학적으로 합성되고, 원하는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 생산하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합될 수 있다.
항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 형태물을 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막-결합된 경우에, 적합한 세제 용액 (예를 들어, 트리톤-X 100)을 사용하거나 효소적 절단에 의해 항체를 막으로부터 방출시킬 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 주기, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴할 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 절차는 예시적인 적합한 정제 절차이다: 이온-교환 칼럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 오염물, 예컨대 IgG를 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼; 및 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 에피토프-태그 부착된 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 칼럼. 다양한 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 이용된 생산 공정의 특성, 및 생산된 특정한 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 따라 달라질 것이다.
재조합 기술을 이용하는 경우에, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 세포내에서 생산되거나, 주변세포질 공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 중으로 직접 분비될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 세포 내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 입자 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 절차가 기재되어 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해물은 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드가 배지 중으로 분비되는 경우에, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제할 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 회수할 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 이용될 수도 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및/또는 결합 폴리펩티드 및 오염물을 포함하는 혼합물을, pH 약 2.5-4.5의 용리 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염으로부터)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있다.
V. 바람직한 기능을 갖는 SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인 방법
SCD1 길항제, 예컨대 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 소분자를 생성하는 기술에 상기 기재되어 있다. 본원에 제공된 추가의 SCD1 길항제, 예컨대 항-SCD1 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 결합 소분자는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 및/또는 특성화될 수 있다.
(a) 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플을 SCD1 후보 길항제와 접촉시키는 것, (b) SCD1 후보 길항제의 부재 하의 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플에 대한 세포 주기 단계의 분포, 세포 증식의 수준 및/또는 암 세포 사멸의 수준을 결정하는 것을 포함하며, 이에 의해 SCD1 후보 길항제의 존재 하의 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플 및 SCD1 후보 길항제의 부재 하의 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플 사이의 세포 주기 단계의 분포의 차이, 세포 증식의 감소된 수준 및/또는 암 세포 사멸의 증가된 수준이 SCD1 후보 길항제를 암 세포 주기 정지를 유도하고/거나, 암 세포 증폭을 억제하고/거나 암 세포 암 사멸을 촉진하는 SCD1 길항제로서 확인하는 것인, 암 세포 주기 정지를 유도하고/거나, 암 세포 증폭을 억제하고/거나 암 세포 사멸을 촉진하는 SCD1 길항제를 스크리닝하고/거나 확인하는 추가의 방법이 본원에 제공된다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, SCD1 후보 길항제는 암 세포 주기 정지를 유도한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, SCD1 후보 길항제는 암 세포 증폭을 억제한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, SCD1 후보 길항제는 암 세포 사멸을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 암 세포 사멸은 아폽토시스이다. 일부 실시양태에서, 암 세포 사멸은 신경증이다.
SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플은 방광암, 췌장암, 폐암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 두경부암, 신장암, 난소암, 하인두, 전립선암, 식도, 간세포성 암종 및/또는 비뇨기암이다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플은 방광암, 췌장암, 폐암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 두경부암, 신장암, 난소암 및/또는 비뇨기암의 군으로부터 선택된 암으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플은 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 두경부암, 신장암, 난소암 및/또는 비뇨기암의 군으로부터 선택된 암으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플은 방광암이다.
SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 FGFR3을 발현한다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 FGFR3을 발현한다. 일부 실시양태에서, 참조 암 세포는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 실질적으로 동일한 수준의 FGFR3을 발현한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 인산화 FGFR3을 발현한다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 과 비교하여 상승된 수준의 인산화 FGFR3을 발현한다. 일부 실시양태에서, 참조 암 세포는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 실질적으로 동일한 수준의 인산화 FGFR3을 발현한다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 FGFR3 및/또는 인산화 FGFR3의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 비-암성이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 FGFR3 및/또는 인산화 FGFR3의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 암성이다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플에서 FGFR3의 발현은 세포 표면 발현이다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플에서 FGFR3 경로는 구성적으로 활성이다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플에서 FGFR3 경로는 리간드 의존성이다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 FGFR3에서의 돌연변이를 포함한다. FGFR3에서 구성적으로 활성인 돌연변이의 예는 FGFR3 S249C를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 FGFR3에 대해 야생형이다.
SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 실질적으로 동일한 수준의 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처를 발현한다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 비-암성이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 암성이다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SREBF1, G6PD, ACOT7, PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11, ACER3, PDSS1, MVD, AGPAT5, HSD17B2, ACSL4, EBP, PIGW, LBR, ACLY, ADORA2B, GPCPD1, CYP24A1, ACSL3, MVK, ACSS2, FDPS, ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SQLE를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 PCSK9를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SCD1을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 FABP4를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 성숙 SREBP1을 발현한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 성숙 SREBP1을 발현하고, 성숙 SREBP2의 수준은 실질적으로 상승되지 않는다 (즉, 실질적으로 동일한 수준의 발현). 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 성숙 SREBP1 및/또는 성숙 SREBP2의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 비-암성이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 성숙 SREBP1 및/또는 성숙 SREBP2의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 암성이다.
SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 Δ9 단일불포화 지방산을 발현한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 Δ9 단일불포화 지방산:포화 지방산의 비를 발현한다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 Δ9 단일불포화 지방산 및/또는 포화 지방산의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 비-암성이다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 Δ9 단일불포화 지방산 및/또는 포화 지방산의 공지된 수준의 발현의 존재 또는 부재 하에 암성이다. Δ9 단일불포화 지방산의 예는 팔미톨레산 (C16:1) 및 올레산 (C18:1)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 포화 지방산의 예는 스테아르산 (C18:0) 및 팔미트산 (C16:0)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 활성화된 PI3K 신호전달, 활성화된 mTOR 신호전달 및/또는 활성화된 MEK 신호전달을 포함한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 PI3K 활성화 돌연변이를 포함한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 PTEN 상실 및/또는 돌연변이를 포함한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 p85 돌연변이를 포함한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 AKT 활성화 돌연변이를 포함한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 상승된 수준의 인산화 AKT (예를 들어, pAKT S473)를 포함한다. SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포, 암 조직 및/또는 암 샘플은 TSC1/2 기능 상실 돌연변이를 포함한다.
SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상승된 수준은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직과 비교하여 본원에 기재된 것과 같은 표준 당업계 공지의 방법에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상승된 발현은 샘플에서 바이오마커의 발현 수준/양의 증가를 지칭하며, 여기서 증가는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 또는 100X이다. 일부 실시양태에서, 상승된 수준은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 약 1.5배, 약 1.75배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 2.75배, 약 3.0배 또는 약 3.25배 초과의 전반적 증가를 지칭한다.
SCD1 길항제의 스크리닝 및/또는 확인을 위한 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 감소된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직과 비교하여 본원에 기재된 것과 같은 표준 당업계 공지의 방법에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 감소를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 감소된 발현은 샘플에서 바이오마커의 발현 수준/양의 감소를 지칭하며, 여기서 감소는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X 또는 0.01X이다.
본원에 기재된 SCD1 길항제의 성장 억제 효과는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 내인성으로 또는 각각의 유전자(들)로의 형질감염된 후에 SCD1를 발현하는 세포를 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 적절한 종양 세포주 및 SCD1 폴리펩티드-형질감염된 세포를 수일 (예를 들어, 2-7일) 동안 다양한 농도의 본원에 기재된 SCD1 길항제로 처리하고, 크리스탈 바이올렛 또는 MTT로 염색하거나, 일부 다른 비색 검정에 의해 분석할 수 있다. 증폭을 측정하는 또 다른 방법은 본 발명의 항체, 결합 폴리펩티드 또는 결합 소분자의 존재 또는 부재 하에 처리된 세포에 의한 3H-티미딘 흡수를 비교하는 것일 수 있다. 처리 후에 세포를 수확하고, DNA에 혼입된 방사능의 양을 섬광 계수기에서 정량화한다. 적절한 양성 대조군은 선택된 세포주를 그 세포주의 성장을 억제하는 것으로 공지된 성장 억제 길항제로 처리하는 것을 포함한다. 종양 세포의 생체내 성장 억제는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 결정할 수 있다.
세포 주기 단계의 분포, 세포 증식의 수준 및/또는 세포 사멸의 수준을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본원의 실시예에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 암 세포 주기 정지는 G1에서의 정지이다.
일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플의 암 세포 증폭을 시험관내 또는 생체내에서 처리되지 않은 암 세포, 암 조직 또는 암 샘플과 비교하여 약 25-100%, 보다 바람직하게는 약 30-100%, 보다 더 바람직하게는 약 50-100% 또는 약 70-100% 억제할 것이다. 예를 들어, 성장 억제는 세포 배양물에서 약 0.5 내지 약 30 μg/ml 또는 약 0.5 nM 내지 약 200 nM의 SCD1 길항제 농도에서 측정할 수 있으며, 여기서 성장 억제는 종양 세포의 SCD1 후보 길항제에 대한 노출 1-10일 후에 결정한다. SCD1 길항제는 약 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg (체중)의 SCD1 후보 길항제가 SCD1 후보 길항제의 최초의 투여로부터 약 5일 내지 3개월 내에, 바람직하게는 약 5 내지 30일 내에 종양 크기의 감소 또는 종양 세포 증식의 감소를 발생시킨다면 생체내에서 성장 억제성이다.
암 세포 사멸을 유도하는 SCD1 길항제를 선택하기 위해, 예를 들어 프로피듐 아이오다이드 (PI), 트리판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 지시된 바와 같은 막 완전성의 상실을 참조물에 대해 평가할 수 있다. PI 흡수 검정은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행될 수 있다. SCD1-발현 종양 세포는 배지 단독 또는 적절한 SCD1 길항제를 함유하는 배지와 인큐베이션한다. 세포를 3일 기간 동안 인큐베이션한다. 각각의 처리 후에 세포를 세척하고, 35 mm 여과-마개가 장착된 12 x 75 튜브 (튜브 당 1 ml, 처리군당 3개의 튜브)로 분취하여 세포 응집물을 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 μg/ml)를 넣는다. 샘플은 팩스캔(FACSCAN)® 유동 세포측정기 및 팩스컨버트(FACSCONVERT)® 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 이용하여 분석될 수 있다. PI 흡수에 의해 결정시에 통계적으로 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 항체, 결합 폴리펩티드 또는 결합 소분자가 세포 사멸-유도 항체, 결합 폴리펩티드 또는 결합 소분자로서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 세포 아폽토시스는 카스파제 3 및/또는 카스파제 7의 활성화에 의해 나타난다.
관심 항체에 의해 결합된 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하여 이와 상호작용하는 SCD1 길항제를 스크리닝하기 위해, 통상적인 교차-차단 검정, 예컨대 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것을 수행할 수 있다. 이러한 검정을 이용하여 시험 SCD1 길항제가 기지의 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는지 결정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 에피토프 맵핑은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체 서열 또는 결합 폴리펩티드는 예컨대 알라닌 스캐닝에 의해 돌연변이화되어 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 돌연변이체 항체 및/또는 돌연변이체 결합 폴리펩티드는 처음에 폴리클로날 항체 또는 결합 폴리펩티드와의 결합에 대해 시험하여 적절한 폴딩을 확실하게 하였다. 상이한 방법에서, 폴리펩티드의 상이한 영역에 상응하는 펩티드를 시험 항체 또는 시험 결합 폴리펩티드 또는 시험 항체들 또는 시험 결합 폴리펩티드들 및 특징적인 또는 기지의 에피토프를 갖는 항체를 사용하는 경쟁 검정에 사용할 수 있다.
임의의 스크리닝 및/또는 확인 방법의 일부 실시양태에서, SCD1 후보 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 후보 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다.
한 측면에서, SCD1 길항제는 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 그의 결합 활성 (예를 들어, 항원 결합 활성)에 대해 시험된다.
VI . 제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 SCD1 길항제의 제약 제제는 바람직한 정도의 순도를 갖는 이러한 SCD1 길항제를 하나 이상의 임의적인 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 결합 소분자, 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드이다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 이는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지 않다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
또한, 본원에서 제제는 치료되는 특정한 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
VII . 제조품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 SCD1 길항제이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 그 내부에, SCD1 길항제를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 그 내부에, 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제조품은 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물을 포함하고; 여기서 조성물은 하나 이상의 시약 (예를 들어, 하나 이상의 바이오마커에 결합하는 일차 항체 또는 본원에 기재된 바이오마커 중 하나 이상에 대한 프로브 및/또는 프라이머), 조성물이 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 나타내는 용기 상의 라벨, 및 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 존재를 평가하기 위해 시약을 사용하기 위한 지침을 포함한다. 제조품은 샘플의 제조 및 시약의 활용에 대한 지침 및 물질의 세트를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제조품은 시약, 예컨대 일차 및 이차 항체 둘 다를 포함할 수 있으며, 여기서 이차 항체는 표지, 예를 들어 효소 표지에 접합된다. 일부 실시양태에서, 제조품은 본원에 기재된 바이오마커 중 하나 이상에 대한 하나 이상의 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다.
임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 FGFR3이다. 임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 인산화 FGFR3이다.
임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자이다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SREBF1, G6PD, ACOT7, PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11, ACER3, PDSS1, MVD, AGPAT5, HSD17B2, ACSL4, EBP, PIGW, LBR, ACLY, ADORA2B, GPCPD1, CYP24A1, ACSL3, MVK, ACSS2, FDPS, ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자는 SC4MOL을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 성숙 SREBP1이다. 임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 Δ9 단일불포화 지방산이다. 임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 Δ9 단일불포화 지방산:포화 지방산의 비이다. 임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 PI3K 신호전달, mTOR 신호전달, MEK 신호전달이다. 임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 PI3K, PTEN, p85, TSC1/2 및 AKT로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 다형성이다. 임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 인산화 AKT이다.
제조품 중의 다른 임의의 성분은 하나 이상의 완충제 (예를 들어, 차단 완충제, 세척 완충제, 기질 완충제 등), 다른 시약, 예컨대 효소 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예를 들어, 발색체), 에피토프 복구 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함한다.
임의의 제조품의 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, SCD1 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이고, 항체 단편은 SCD1에 결합한다.
본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조품이 SCD1 길항제 대신에 또는 이에 더하여 본원에 기재된 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예를 위한 물질 및 방법
세포 배양, siRNA 형질감염 및 시약
인간 방광암 세포주 SW780, BFTC-905 및 Cal29는 ATCC로부터 입수하였다. RT112 세포는 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (DSMZ, 독일)로부터 구입하였다. FGFR3 또는 EGFP를 표적화하는 독시시클린-유도성 shRNA를 안정하게 발현하는 RT112 세포는 (24)에서 이전에 기재되어 있다. 방광암 세포주 UMUC-14는 미시간 대학교로부터 에이치.비. 그로스만(H.B. Grossman) 박사 (현재 텍사스 대학 M.D. 앤더슨 캔서 센터(Anderson Cancer Center), 텍사스주)로부터 입수하였다. 방광암 세포주 TCC-97-7은 세인트 제임스(St. James) 대학 병원 (영국 리즈)의 마가렛 놀즈(Margret Knowles) 박사로부터의 현물이었다. 세포는 37℃에서 5% CO2의 조건 하에 10% 태아 소 혈청 (FBS) (시그마), 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 및 L-글루타민이 보충된 RPMI 배지에서 유지하였다.
라파마이신 및 PI3K 억제제 LY294002는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology) (매사추세츠주 댄버스)로부터 입수하였다. 강력하고 선택적인 MEK1/2 억제제 PD0325901 (화이자)는 신테시스 메드 켐(Synthesis Med Chem) (캘리포니아주 샌디에고)으로부터 구입하였다. SCD1 소분자 억제제 A37062는 바이오파인 인터내셔널(BioFine International) (캐나다 밴쿠버)로부터 구입하였다.
모든 RNA 간섭 실험은 온-타켓플러스(ON-TARGETplus) siRNA (50nM, 다마콘(Dharmacon), 콜로라도주 라파예트)를 사용하여 수행하였다. 세포를 리포펙타민 RNAiMax (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)로 형질감염시키고, 세포 증식 또는 아폽토시스를 형질감염 48시간 또는 72시간 후에 평가하였다.
유전자 발현 어레이 및 분석
FGFR3 또는 EGFP를 표적화하는 독시시클린-유도성 shRNA를 발현하는 RT112 세포를 10 cm 플레이트에서 독시시클린 (1 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 성장시켰다. 전면성장-미만의 세포 배양물로부터 총 RNA를 RNAeasy 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 단리하였다. RNA 품질을 애질런트(Agilent) 생물분석기 2100 상에 샘플을 구동시켜 검증하고, 충분한 품질의 샘플을 아피메트릭스(Affymetrix) HGU133-Plus_2.0 칩 상에 프로파일링하였다. 마이크로어레이 연구를 삼중 RNA 샘플을 사용하여 수행하였다. 상보적 RNA의 제조, 어레이 혼성화, 스캐닝 및 이후의 어레이 영상 데이터 분석을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 모든 프로브 세트에 대한 발현 요약 값은 바이오컨덕터(Bioconductor)로부터의 아피(affy) 패키지에서 실행되는 바와 같은 RMA 알고리즘을 이용하여 계산하였다. 차별적으로 발현되는 유전자의 통계적 분석은 바이오컨덕터로부터의 림마(limma) 패키지에서 실행되는 바와 같은 선형 모델 및 경험적 베이스(Bayes) 적합화 통계를 이용하여 수행하였다. 차별적으로 발현되는 유전자에 의해 과다-출현하는 생물학적 과정을 수득하기 위해, 진 온톨로지(Gene Ontology) (GO) 생물학적 과정 카테고리 및 유전자의 연관에 대한 초기하 시험을 위한 고스태츠(GOstats) 및 카테고리 패키지를 이용하여 수행하였다. 발현 프로파일의 계층적 클러스터링은 거리 척도로서 (1 - 피어슨(Pearson) 상관관계) 및 응집 방법으로서 와드(Ward) 최소-분산 방법을 이용하여 수행하였다.
mRNA 발현 수준의 정량적 RT - PCR 분석
SREBP1, SREBP2, FASN, SCD1, SQLE, 및 HMGCoA 신타제의 전사체를 검출하기 위해, 정량적 RT-PCR을 예비-설계된 택맨(Taqman) 유전자 발현 검정 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))으로 수행하였다. 모든 반응은 적어도 이중으로 수행하였다. 모든 mRNA의 상대 양은 인간 RPL19에 대한 정규화 후에 비교 CT 방법을 이용하여 계산하였다.
총 지방산 합성의 분석
지질발생 활성은 보고된 바와 같이 [1,2-14C] 아세테이트 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 매사추세츠주 월섬)의 지방산으로의 혼입을 모니터링함으로써 결정하였다 (39). [1,2-14C] 아세테이트 (0.1% BSA를 갖는 DMEM 배지 중 0.5 μCi/mL)를 세포에 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 스크래핑하고, 2% KOH에서 용해시켰다. 용해물을 시험 튜브로 옮기고, 밤새 80℃에서 비누화시켰다. 스테롤 및 다른 중성 지질을 디에틸 에테르로 2회 추출하였다. 이어서, 하부 상을 6N HCl로 중화시키고, 헥산과 2회 혼합하여 지방산을 추출하였다. 지방산 분획을 수집하고, 질소 스팀 하에 건조시키고, 섬광 계수에 의해 분석하였다. [14C] 방사능을 샘플 단백질 함량에 대해 정규화하였다.
SCD1 활성 검정
SCD1 활성은 [1-14C] 18:0 스테아레이트 (아메리칸 라디오라벨드 케미칼스(American Radiolabeled Chemicals), 미주리주 세인트 루이스)의 탈포화 또는 [1,2-14C] 아세테이트의 단일불포화 지방산으로의 혼입을 모니터링함으로써 결정하였다. 세포를 표지된 기질과 6-8시간 동안 인큐베이션하였다. 총 지질을 상기 기재된 바와 같이 단리하고, 메탄올 중 14% 삼플루오린화붕소의 1ml에 용해시키고, 64℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 1mL의 물을 첨가한 후에, 메틸 에스테르를 2 mL의 헥산으로 추출하고, 윌슨(Wilson) 및 세르진트(Sergeant)의 절차에 따라 헥산/디에틸 에테르 (85:15, v/v)로 이루어진 용매 상을 이용하여 10% 은빛 함침 실리카 겔 플레이트 상에서 박층 크로마토그래피 (TLC)에 의해 분리하였다. 분리 후에, 공기-건조된 플레이트를 X선 필름에 노출시키고, TLC 상의 지방산 스폿을 스크래핑하고, 액체 섬광 분광계를 이용하여 방사능을 계수하였다. SCD1 활성은 스테아르산 메틸 에스테르에 대한 올레산 또는 팔미트산 메틸 에스테르에 대한 팔미톨레산의 비로 표현하였다.
BSA - 복합체화된 올레에이트 및 팔미테이트의 제조
50 mM 올레에이트 또는 팔미테이트 원액을 올레에이트 또는 팔미테이트의 나트륨 염 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 사용하여 4 mM NaOH에서 제조하였다. 지방산-무함유 BSA (시그마-알드리치)를 증류된 H2O에서 4 mM의 최종 농도로 제조하였다. 1 부피의 올레에이트 또는 팔미테이트의 50 mM 원액을 1.5 부피의 4 mM BSA와 합하고, 55℃에서 1시간 동안 가열하여 ~8.3:1의 지방산/BSA 비로 BSA-복합체화된 올레에이트 또는 팔미테이트의 20 mM 원액을 수득하였다.
SCD1 shRNA 를 발현하는 SW780 안정한 세포의 생성
3개의 독립적 SCD1 shRNA를 pG-pHUSH 렌티바이러스 벡터 (제넨테크에서 개발됨)로 클로닝하였다. 벡터에 대한 상세한 정보는 요청시 제공될 것이다. 연구에 사용된 SCD1 shRNA의 서열은 다음과 같다: shRNA1: 5'-GATCCCCCTACAAGAGTGGCTG AGTTTTCAAGAGAAACTCAGCCACTCTTGTAGTTTTTTGGAAA-3' (서열 2); shRNA2: 5'-GATCCCCCTACGGCTCTTTCTGATCATTCAAGAGATGATCAGAAAGAGCCGTAGTTTTT TGGAAA-3' (서열 3); shRNA3: 5'-GATCCCCGCACATCAACTTCACCACATTCAAGAGA TGTGGTGAAGTTGATGTGCTTTTTTGGAAA-3' (서열 4). 모든 구축물은 서열분석에 의해 확인되었다. EGFP 대조군 shRNA는 이전에 기재되어 있다 (24). shRNA-함유 렌티바이러스는 GNE293T 세포를 패키징 플라스미드 델타 8.9, 외피 플라스미드 VSV-G 및 pG-pHUSH-shRNA 구축물로 공동-형질감염시켜 생성되었다. 바이러스 상청액을 형질감염 48 및 72시간 후에 수확하고, 0.45μm 시린지 필터를 통해 여과하여 세포 용해물을 제거하였다. 렌티바이러스 전달 및 안정한 세포 선택을 기재된 바와 같이 수행하였다 (24).
세포 증식 및 아폽토시스 연구
소형 간섭 RNA 실험의 경우에, 형질감염 72시간 후에, 세포를 [메틸-3H] 티미딘 혼입을 위해 처리하였다. 독시시클린-유도성 shRNA 실험의 경우에, 세포를 1 μg/mL 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 72시간 처리한 후에 [3H] 티미딘과 16시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. SCD1 소분자 억제제 실험의 경우에, 세포를 DMSO 중 지시된 농도의 A37062 또는 DMSO 단독으로 48시간 동안 처리하였다. 세포 생존율을 셀타이터-글로 (프로메가)로 평가하였다. 카스파제 3 및 카스파제 7의 활성화를 카스파제-글로 3/7 검정 키트 (프로메가)로 측정하였다. 값은 4개조의 평균 +/- SD로 제시된다. 데이터는 적어도 3회의 독립적 실험을 대표한다.
세포 주기 분석의 경우에, 세포 현탁액을 70% 에탄올에 고정하고, 0.5 mL의 프로피듐 아이오다이드 및 RNase 염색 완충제 (BD 파밍겐(BD Pharmingen))로 15분 동안 실온에서 염색하였다. 아폽토시스의 유동 세포측정법 분석을 위해, 미토트레커 레트(MitoTracker Red) 및 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488-접합된 아넥신(Annexin) V를 이용하여 제조업체의 지침 (인비트로젠)에 따라 세포를 염색하였다. 유동 세포측정 데이터 분석 및 시각화를 플로우조(FlowJo) v8.4 소프트웨어 (트리 스타, 인크.(Tree Star, Inc.))를 이용하여 수행하였다.
단백질 분석
세포를 도면 범례에 기재된 바와 같이 처리하였다. 전체 세포 용해물을 위해, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 포스파타제 억제제 칵테일 PhosSTOP 및 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 인디애나주 인디애나폴리스)이 보충된 RIPA 완충제 (밀리포어(Millipore), 매사추세츠주 빌러리카) 중에서 추출하였다. 용해물에서 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거하였다. 종양 이종이식편에서 단백질 발현의 분석을 위해, 종양 조직으로부터의 용해물은 용해 완충제 (프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제가 보충된 150 mM 염화나트륨, 20 mM 트리스 (pH 7.5), 2 M EDTA, 1% 트리톤 X-100, 10 mM 플루오린화나트륨으로 이루어짐)로 동결된 조직을 패스트프렙(FastPrep)-24 균질화기를 제조업체 (MP 바이오메디칼스(MP Biomedicals), 캘리포니아주 어바인)에 의해 기재된 바와 같이 이용하여 분쇄함으로써 추출하였다.
pFGFR3을 검출하기 위해, FGFR3을 토끼 폴리클로날 항체 (sc-123, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 캘리포니아주 산타 크루즈)를 이용하여 면역침전시키고, 소듐 도데실-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 인산화 FGFR3을 포스포-티로신 (4G10, 밀리포어) 또는 pFGFRY653 /645 (#3476, 셀 시그널링 테크놀로지, 매사추세츠주 댄버스)에 대한 모노클로날 항체로 평가하였다. 종양 조직에서 SCD1을 검출하기 위해, SCD1을 마우스 모노클로날 항체 (GTX19862, 진텍스(GeneTex), 캘리포니아주 어바인)를 사용하여 동등한 양의 용해물로부터 면역침전시키고, 토끼 SCD1 항체 (#2438, 셀 시그널링 테크놀로지)로 프로빙하였다.
사용된 일차 블롯팅 항체는 FGFR3 (sc-13121, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), SREBP1 (sc-13551, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), SREBP2 (557037, BD 파밍겐), 총 FRS2 (sc-8318, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), pAKTT308 (#2214-1, 에피토믹스(Epitomics))이다. 하기 일차 항체는 셀 시그널링 테크놀로지로부터 구입하였다: pFRS2 Y196 (#3864), FASN (#3189), pAKTS473 (#4060), 총 AKT (#9272), pMAPK (#9101), 총 MAPK (#4695), pS6 (#2211), 절단된 카스파제 3 (# 9664), 총 카스파제 3 (#9665), 절단된 카스파제 7 (#9491), 총 카스파제 7 (#9492) 및 PARP (#9542). 블롯을 화학발광 기질 (ECL 플러스(ECL Plus), 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech), 뉴저지주 피스카타웨이)을 이용하여 시각화하였다.
이종이식 연구
6-8주령의 암컷 CB17 중증 복합 면역결핍 (SCID) 마우스는 찰스 리버 래보러토리(Charles River Laboratory) (캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하였다. 암컷 무흉선 누드 마우스는 하를란 래보러토리(Harlan Laboratory) (캘리포니아주 헤이워드)로부터 구입하였다. 마우스를 특정 병원체-무함유 조건 하에 유지하였다. SW780 shRNA 안정한 세포 (7 x106개)를 HBSS/매트리겔 (1:1 v/v, BD 바이오사이언시스) 중 0.2 ml의 부피로 CB17.SCID 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. UMUC-14 세포 (5 x106개) 및 HCT-15 세포 (5 x106개)를 매트리겔 없이 무흉선 누드 마우스에 이식하였다. 효능 연구의 경우에, 150 내지 200 mm3의 평균 부피의 종양을 갖는 마우스를 8 또는 10개의 처리 코호트로 무작위로 분류하였다. shRNA 연구의 경우에, 마우스에게 수크로스 H2O를 단독으로 또는 이에 1 mg/mL 독시시클린을 보충하여 제공하였다. SCD1 억제제 A37062 (75 mg/kg) 또는 비히클 대조군을 21일 동안 경구 위관영양에 의해 1일 2회 투여하였다. 도 18의 실험의 경우에, 상이한 용량의 SCD1 억제제 G02447171 및 A37062, 또는 비히클 대조군을 21일 동안 경구 위관영양에 의해 1일 2회 투여하였다. 종양 부피 결과를 평균 종양 부피 +/- SEM으로 제시하고, 데이터를 스튜던트 t 검정에 의해 분석하였다. 체중 및 캘리퍼 측정을 1주에 2회 수행하고, 종양 부피를 식: V=0.5 a x b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 폭임)을 이용하여 계산하였다. 종양 부피 결과를 평균 종양 부피 +/- SEM으로 제시하고, 데이터를 스튜던트 t 검정에 의해 분석하였다.
종양 조직 및 마우스 혈장 및 간에서 지방산 탈포화를 분석하기 위해, 샘플을 효능 연구 종점 (마지막 투여 2시간 후)에 수집하고, 급속 냉동시켰다. 지방산 프로파일링은 비누화 및 메틸화를 위한 표준 샘플 제조 방법을 이용하여 마이크로비얼 ID, 인크(Microbial ID, Inc) (델라웨어주 뉴어크)에서 수행하였다. 지방산 메틸 에스테르를 추출하고, 분석을 위해 기체 크로마토그래피에 로딩하였다. 탈포화 인덱스를 스테아르산 메틸 에스테르에 대한 올레산 또는 팔미트산 메틸 에스테르에 대한 팔미톨레산의 비로 표현하였다.
통계
모은 데이터를 평균 +/- SEM으로 나타내었다. 언페어드 스튜던트 t 검정 (양측)을 이용하여 2개의 군 사이를 비교하였다. P < 0.05의 값은 모든 실험에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
세포 생존율 및 카스파제 3/7 활성 검정
SCD1 소분자 억제제의 실험의 경우에, 세포를 DMSO 중 지시된 농도의 A37062 (애보트(Abbott) 화합물 4c) 또는 G02447171.1 (다이치(Daichii) 화합물 24) 또는 DMSO 단독으로 48-72시간 동안 처리하였다. 세포 생존율을 셀타이터-글로로 처리 72시간 후에 평가하였다 (프로메가). 카스파제 3 및 카스파제 7의 활성화를 카스파제-글로 3/7 검정 키트로 처리 48시간 후에 측정하였다 (프로메가). 값은 4개조의 평균 +/- SD로 제시된다. 데이터는 적어도 3회 독립적 실험을 대표한다.
실시예 1: FGFR3 녹다운은 스테롤 및 지방산 생합성 및 대사에 관련된 유전자의 발현을 억제한다
독시시클린-유도성 shRNA를 이용하는, 방광암 세포주 RT112에서의 FGFR3의 녹다운은 문헌 [Qing et al. J. Clin. Invest. 119(5):1216-1229 (2009)]에서 이전에 밝혀진 바와 같이 시험관내 및 생체내 종양 성장을 유의하게 감쇠시켰다. 잠재적 FGFR3-하류 표적을 확인하기 위해, 대조군 shRNA 또는 3개의 독립적 FGFR3 shRNA를 발현하는 RT112-유래 세포주의 전사 프로파일을 비교하였다. 상이한 FGFR3 shRNA를 발현하는 3개의 RT112-유래 세포주를 사용하여 이들 독립적으로 확립된 세포주에서 비-특이적 차이에 대한 대조군을 제공하였다. 모든 세포주를 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 처리하여 FGFR3 단백질을 고갈시킨 후에 마이크로어레이 분석을 위해 mRNA를 단리하였다 (도 2A). 모든 3개의 FGFR3 shRNA 세포주에서 독시시클린 유도시에 차별적으로 발현되나 (오류 발견율 < 0.1, 변화 배수 > 2) 대조군 shRNA 세포에서는 그렇지 않은 유전자를 잠재적 FGFR3-조절된 유전자로 간주하였다 (도 1). 어레이 상에 나타난 19,701개 유전자 중에서, 313개의 유전자는 FGFR3 녹다운에 반응하여 일치하는 차별적 발현을 나타내었고, 이 중 196개는 상향조절되고 117개는 하향조절되었다 (도 2A 및 도 1; 또한 표 2 참조).
이들 FGFR3-조절된 유전자의 기능적 분류는 유의하게 하향조절된 유전자 (p 값 < 0.01)의 큰 분획이 지방산 및 스테롤 생합성 및 대사에 관여하는 효소 및 단백질의 코호트를 코딩한다는 것을 밝혀내었다 (도 2B). 포화 지방산의 단일불포화 지방산으로의 전환을 촉매하는 속도-제한 효소인 SCD1은 최대 감퇴를 보여주는 유전자이다 (3.85배 떨어짐, 도 2B). 이러한 클러스터는 또한 지방산 신타제 (FASN), 히드록시메틸글루타릴-조효소 A 신타제 1 (HMGCS1), 및 스쿠알렌 에폭시다제 (SQLE) (도 2B)를 포함한다. 마이크로어레이 결과는 대표적 유전자의 mRNA 풍부 수준의 정량적 RT-PCR (qRT-PCR) 분석을 이용하여 추가로 확인하였다 (도 2C 및 D). 또한, 이러한 지질발생 유전자의 FGFR3-의존성 조절은 방광암 세포주 UMUC-14에서 짧은-간섭 RNA (siRNA)-매개된 FGFR3 녹다운으로 검증되었다 (도 3A 및 B). 이러한 데이터는 함께 스테롤 및 지질 생합성 및 대사 경로에 대한 FGFR3 신호전달의 주요 효과를 시사한다.
또한, 특정 항-FGFR3 항체, R3Mab는 UMUC-14 종양 이종이식편에서 지질발생 유전자의 발현을 감소시켰다. UMUC-14 이종이식 종양을 대조군 항체 (Ctrl Ab) 또는 R3Mab으로 처리하고, 종양 조직을 제5일에 수확하였다. 총 RNA를 마이크로어레이 분석을 위해 종양 조직으로부터 단리하였다. Ctrl Ab와 비교하여 R3Mab에 의해 유의한 조절을 나타내는 유전자를 추가로 분석하였다. 모든 유전자 및 SC4MOL을 비롯한 추가의 유전자는 si-RNA-매개된 FGFR3 녹다운 이용시에 유의하게 하향조절되었다.
본 발명자들의 발현 어레이 연구에서 확인된 다수의 이러한 지질생성 유전자는 마스터 전사 인자의 SREBP 패밀리에 의해 조절되기 때문에, SREBP1 및 SREBP2 mRNA 수준을 qRT-PCR을 이용하여 검사하였고, RT112 세포에서의 FGFR3 녹다운이 SREBP1 mRNA 수준을 약 50%의 중간 정도로 감소시키고, SREBP2 수준에는 영향을 미치지 않는다는 것을 발견하였다 (도 2E). 유사한 결과가 FGFR3 siRNA로 형질감염된 UMUC-14 세포에서 관찰되었다 (도 3C). 이러한 데이터는 FGFR3 신호전달이 부분적으로 SREBP1을 통해 신생 지질생성을 조절할 수 있다는 가능성을 제시하였다.
실시예 2: FGFR3 녹다운은 지방산 합성 및 탈포화를 억제한다
마이크로어레이 및 qRT-PCR 결과에 기초하여, 지질생성에 있어 FGFR3 신호전달의 역할 및 세포 결과를 연구하였다. 우선 FGFR3 녹다운시에 SREBP1 발현 및 활성화를 조사하였다. 콜레스테롤 및 지방산 고갈에 반응하여, SREBP1이 N-말단 단백질분해적 절단 및 이후의 핵 전위를 거쳐 지질발생 효소의 전사 유도를 도출한다는 것은 알려져 있다. 독시시클린에 의한 FGFR3 shRNA의 유도는 FGFR3 단백질 수준을 감소시켰다 (도 4A). 독시시클린 처리는 또한 전장 뿐만 아니라 절단된 성숙한 형태의 SREBP1을 감소시켰으나, 전장 또는 프로세싱된 SREBP2에는 영향을 미치지 않았다 (도 4A). FASN의 중간 정도의 감소 및 SCD1 수준의 현저한 감소가 FGFR3 shRNA를 발현하는 세포에서 관찰되었으나 대조군 shRNA 세포에서는 그렇지 않았다 (도 4A). [1,2-14C] 아세테이트와 인큐베이션된 RT112 세포의 추가의 분석은 FGFR3 녹다운이 지방산 합성을 현저하게 감소시킨다는 것을 밝혀내었다 (도 4B). 이러한 관찰과 일치하게, 항-FGFR3 특이적 항체, R3Mab을 사용한 UMUC-14 세포의 24시간-처리 (WO 2010/111367 참조, 그의 전문이 참조로 포함됨)는 또한 전장 및 프로세싱된 활성 형태의 SREBP1의 수준 뿐만 아니라 FASN 및 SCD1의 발현을 감소시켰다 (도 5A). 유사하게, 총 지방산 합성이 UMUC-14 세포에서 R3Mab에 의해 감소하였다 (도 5B).
FGFR3 녹다운은 SCD1 발현을 거의 없애고, SCD1은 단일불포화 지방산의 생합성에서 속도-제한 효소이기 때문에, 지방산 탈포화에 대한 FGFR3 shRNA의 효과를 [14C]-표지된 스테아르산을 사용하여 조사하였다. FGFR3 shRNA는 포화 스테아르산 전구체로부터 불포화 올레산의 생산을 차단한 반면, 대조군 shRNA는 영향을 미치지 않았다 (도 4C 및 D). 이러한 결과는 함께 FGFR3 억제가 신생 지방산 합성 및 탈포화의 현저한 감소를 발생시키며, 이에 수반하여 SREBP1 발현 및/또는 절단이 감소할 뿐만 아니라 FASN 및 SCD1을 비롯한 핵심 지질발생 효소가 감소한다는 것을 시사한다.
실시예 3: FGFR3 신호전달은 SREBP1 을 활성화하고, PI3K - mTORC1 을 통해 신생 지방산 합성을 촉진한다
신생 지질생성의 FGFR3 조절의 기초가 되는 분자 회로를 조사하기 위해, 방광암 세포에서 FGFR3 신호전달을 FGF1로 활성화시키고, SREBP1 발현 및 절단을 분석하였다. Cal29 방광암 세포주는 내재적으로 높은 수준의 FGFR3을 발현하였고, FGF1 처리는 FGFR3 및 하류신호전달 이펙터의 강한 인산화 및 활성화를 시간- 및 용량-의존성 방식으로 유도하였다 (도 6A 및 도 7A). FGF1은 전장 불활성 SREBP1 단백질 수준에 영향을 미치지 않았으나, 절단된 활성 형태의 SREBP1은 처리 2시간 후에 실질적으로 더 높았으며, 축적은 24시간에 실험 전체 과정 동안 지속되었다 (도 6A). 대조적으로, 전장 또는 프로세싱된 SREBP2는 영향을 받지 않았다. 유사하게, SCD1 단백질 수준, 및 FASN은 보다 적은 정도로 FGF1에 의해 유도되었다 (도 6A). 이러한 변화에 일치하게, FGF1은 24-시간 인큐베이션 후에 총 지방산의 합성을 증가시켰다 (도 6B). 분획화 분석은 포화 및 불포화 지방산 둘 다가 FGF1에 의해 유도된다는 것을 밝혀내었다 (도 6B). 유사한 결과가 보다 느린 동역학으로 RT112 세포에서 관찰되었으며, 전장 SREBP1은 중간 정도로 증가하였고, 활성 SREBP1의 축적은 약 처리 24시간 후에 최고였다 (도 7B, C 및 D).
FGF1 자극에 의한 지질발생 효소, 예컨대 SCD1의 유도가 프로세싱된 활성 SREBP1에 의존하는지 여부를 결정하기 위해, SREBP1 또는 SREBP2 발현을 RT112 세포에서 siRNA를 사용하여 고갈시켰다. SREBP1을 표적화하는 siRNA는 기저 및 FGF1-유도된 SCD1 발현 둘 다를 현저하게 감소시키는 반면, SREBP2 단독의 녹다운은 영향을 미치지 않았다 (도 6C). 관심 있는 것 중에서, SREBP1 및 SREBP2를 둘 다 표적화하는 것은 SCD1 발현을 거의 완전하게 제거하였으며 (도 6C), SREBP1이 SCD1 발현을 조절하는데 있어 우세한 역할을 수행하더라도, SREBP1 및 SREBP2가 둘 다 FGF1 자극시에 SCD1의 최대 유도에 기여한다는 것을 시시한다. 유사하게, FASN의 유도는 또한 SREBP1 및 SREBP2 둘 다에 의존하며, SREBP1은 보다 우세한 역할을 수행한다 (데이터는 나타내지 않음).
지질생성의 조절에 있어 FGFR3 하류 신호전달 캐스케이드의 연관을 평가하기 위해, 정규 FGFR3 신호전달은 다중 절에서 PI3K 억제제 Ly294002, mTORC1 억제제 라파마이신, 및 강하고 선택적인 MEK1/2 억제제 PD325901로 약리학적으로 차단되었다. RT112 방광암 세포에서, 각각의 억제제는 각각 AKT, S6 및 MAPK의 인산화에 의해 평가되는 바와 같이 그의 의도된 표적의 FGF1-유도된 활성화를 약하게 하였다 (도 8A). 억제제는 전장 SREBP1 단백질의 발현에 대해 최소의 효과를 도출한 한편, 이들은 모두 절단된 활성 SREBP1의 기저 및 FGF1-유도된 수준 둘 다를 실질적으로 감소시켰다 (도 8B). 대등하게, SCD1 발현은 각각의 억제제에 의해 유의하게 감소되었으며, PI3K 억제제 Ly294002가 가장 강한 억제를 나타내었다. FASN 발현은 각각의 억제제에 의해 단지 중간 정도로 감소되었다 (도 8B). 억제제를 사용한 RT112 세포의 처리는 FGF1에 의해 자극된 총 지방산 합성을 현저하게 억제하였으며, Ly294002 및 PD325901이 가장 강한 억제 효과를 나타낸다 (도 8C). Cal29 방광암 세포에서, 라파마이신 및 Ly294002가 RT112 세포에서 관찰된 결과와 일치하게 활성 SREBP1의 축적 및 SCD1의 발현을 차단하였다는 것은 주목할만하다 (도 9). 그러나, Cal29 세포에서, 선택적 MEK1/2 억제제 PD325901은 단지 부분적으로 활성 SREBP1의 FGF1-유도된 축적을 감소시켰으며, SCD1 유도에 대해 더 큰 효과를 나타내지 않았다 (도 9). 따라서, 방광암 세포에서, FGFR3은 주로 PI3K-mTORC1 축을 통해 신호를 전달하여 SREBP1 절단 및 활성화를 촉진하였으며, 이는 상승된 신생 지질생성 및 지방산 탈포화를 발생시켰다. MEK-MAPK 경로의 기여는 세포주- 및/또는 컨텍스트-의존성일 수 있다.
실시예 4: SCD1 의 siRNA - 매개된 녹다운은 세포주기 진행을 차단하고 활성 FGFR3 신호전달을 갖는 방광암 세포에서 아폽토시스를 유도한다
신생 지질생성은 세포 성장 및 증식을 위한 전제조건인 새로운 막 및 소기관 형성을 위해 빠르게 증식하는 세포에 필수적이다. 지질 및 그의 대사 중간체는 또한 신호전달 분자의 지질화를 통한 신호 전달, 단백질의 준세포 국재화의 조절 또는 제2 메신저로서의 작용을 조절할 수 있다. 따라서, 유방, 전립선 및 교모세포종을 비롯한 특정의 암 유형은 제어되지 않은 세포 증식 및 생존을 위한 신생 지방산 합성에 의지하는 것으로 가정된다 (33). 방광 종양 성장에서 FGFR3-자극된 지질생성의 중요성을 조사하고 치료 표적으로서 지질발생 경로의 잠새성을 탐구하기 위해, SREBP1, FASN 및 SCD1의 siRNA-매개된 녹다운에 따른 세포 증식에 접근하였다. 본 발명자들의 초기 연구는 SCD1 siRNA가 가장 강한 항증식 효과를 도출한다는 것을 밝혀내었으며, 이에 따라 SCD1을 추가로 연구하였다 (데이터는 나타내지 않음).
방광암 세포주의 패널이 본 연구에 사용되었다 (표 3). UMUC-14 및 TCC-97-7 세포는 FGFR3에서 가장 빈번한 활성화 돌연변이인 FGFR3S249C를 보유한다 (24). SW780 세포주가 야생형 FGFR3을 함유할지라도, 이는 구성적 FGFR3-FRS2-AKT 활성화를 보여준다 (데이터는 나타내지 않음). 다중 SCD1 siRNA는 SCD1 단백질 수준을 감소시켰으며, siRNA4는 덜 효과적이었다 (도 10A 및 B). SCD1 녹다운은 SW780, UMUC-14 및 TCC-97-7 세포를 비롯하여 구성적으로 활성화된 FGFR3을 갖는 세포에 의한 [3H]티미딘 혼입을 현저하게 억제하였다 (도 10A 및 B; 도 11A). 대조적으로, RT112 및 BFTC-905 세포는 야생형 FGFR3을 함유하고, SCD1 siRNA는 그의 증식에 명백한 효과를 갖지 않았다 (도 11A). 이러한 결과는 구성적으로 활성인 FGFR3 신호전달을 갖는 세포가 증식 및 생존을 위해 SCD1 활성에 보다 더 의존할 수 있음을 시사한다.
[표 3]
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기하급수적으로 성장하는 SW780 세포의 추가의 분석은 SCD1 녹다운 48시간 후에, 세포 주기의 G2 및 S 기에서의 세포의 백분율이 실질적으로 및 특이적으로 감소하면서 G1 기에서는 세포가 동반적으로 증가한다는 것을 밝혀내었다 (도 10C). 하위-이배체 집단이 SCD1 녹다운 72시간 후에 나타나기 시작하였으므로 (데이터는 나타내지 않음), 아폽토시스에 대한 SCD1 siRNA의 효과를 분석하였다. SCD1 녹다운은 SW780 세포 (도 10D) 및 UMUC-14 세포 (도 11B)에서 아넥신-V에 대해 양성으로 염색된 세포 집단을 유의하게 증가시켰다. 이펙터 카스파제의 추가의 연구는 SCD1 녹다운이 카스파제 3 및 7 뿐만 아니라 그의 하류 표적 PARP의 절단 및 활성화를 발생시켰다는 것을 밝혀내었다 (도 10E). 이러한 관찰과 일치하게, SCD1 siRNA는 이들 세포에서 카스파제 3 및 7의 보다 높은 효소 활성을 발생시켰다 (도 11C 및 D). 따라서, 활성화된 FGFR3 신호전달을 갖는 방광암 세포에 대한 SCD1 녹다운의 억제 효과는 세포 주기 진행의 차단 및 아폽토시스의 유도 둘 다로 인한 것이다.
실시예 5: SCD1 siRNA 는 지방산 탈포화 -의존성 방식으로 세포 증식을 억제한다
SCD1은 단일불포화 지방산의 생합성에서 속도-제한 효소이므로, 지방산 탈포화에 대한 SCD1 siRNA의 효과에 접근하였다. 은착제 박층 크로마토그래피를 이용하여, SCD1 녹다운은 [14C]-스테아레이트의 올레에이트로의 전환을 현저하게 차단하는 것으로 밝혀진 반면 (도 12A 및 B), 비-특이적 대조군 siRNA 또는 FASN siRNA는 영향을 미치지 않았다. 세포 증식의 억제는 단일불포화 지방산의 생산의 결손으로 인한 것일 수 있고, 외재적으로 제공된 올레에이트는 세포를 구제할 수 있다. 실제로, 올레에이트 보충은 SW780 및 UMUC-14 세포 둘 다에서 SCD1 siRNA-매개된 성장 억제를 용량-의존성 방식으로 역전시킨 반면, 다시 팔미테이트를 첨가하는 것은 구제에 실패하였다 (도 12C 및 D; 도 13). 팔미테이트의 높은 농도 (20 μM)가 이러한 세포의 생존율에 해롭다는 것을 주목할만하다 (도 12D; 도 13C). 따라서, SCD1에 의해 매개된 지방산 탈포화는 방광암 세포 증식 및 생존에 필수적이다.
실시예 6: SCD1 의 독시시클린-유도성 녹다운은 생체내에서 종양 성장을 감쇠시킨다
동물 모델에서 종양 성장에 대한 SCD1의 효과를 평가하기 위해, 독시시클린-유도성 SCD1 shRNA를 발현하는 안정한 SW780 세포를 확립하였다. 독시시클린에 의한 3개 독립적 SCD1 shRNA의 유도는 SCD1 발현을 감소시킨 반면, EGFP를 표적화하는 대조군 shRNA의 발현은 영향을 미치지 않았다 (도 14A). 독시시클린 처리는 SCD1 shRNA를 발현하는 세포에 의해 [3H]티미딘 혼입을 감소시켰으나, 대조군 shRNA는 그렇지 않았으며 (도 14B), 이는 SCD1 녹다운이 세포 증식을 억제한다는 것을 확인한다.
마우스에서 미리-확립된 SW780 종양 이종이식편의 성장에 대한 SCD1 shRNA의 효과를 평가하였다. SCD1 녹다운은 대조군 shRNA를 발현하는 세포와 비교하여 종양 성장을 실질적으로 및 특이적으로 억제하였다 (도 14C). 제20일 종양 샘플의 분석은 SCD1 shRNA의 독시시클린 유도시에 효과적인 SCD1 녹다운을 확인하였다 (도 14D). 이러한 결과는 SCD1이 시험관내 및 생체내에서 둘 다 SW780 방광암 세포의 성장에 결정적으로 중요하다는 것을 입증한다.
실시예 7: SCD1 의 약리학적 억제는 마우스에서 종양 성장을 감쇠시키고 지방산 탈포화를 감소시킨다
종양 성장에서 지방산 탈포화의 중요성을 추가로 조사하기 위해, SCD1 효소 활성을 소분자 억제제 A37062로 약리학적으로 차단하였다. 이 화합물은 [14C]스테아르산의 올레산으로의 전환을 차단하였으며 (데이터는 나타내지 않음), [14C]아세테이트로부터 단일불포화 지방산의 합성을 30 nM의 추정된 IC50 값으로 억제하였다 (도 15A). UMUC-14 세포를 SCD1 억제제로 처리하여 인산화 AKT의 감소 및 이펙터 카스파제 3 및 7 뿐만 아니라 그의 표적 PARP의 절단 및 활성화를 발생시켰다 (도 15B).
A37062의 특이성 및 선택성을 또한 평가하였다. 정상 성장 조건 하에, A37062는 다중 방광암 세포주의 증식을 억제하고, 배양물에서 아폽토시스를 유도하였다 (데이터는 나타내지 않음). 100 nM A37062는 UMUC-14 세포의 생존율을 대략 85% 감소시켰다 (도 15C 및 D). 외재적으로 보충된 올레에이트는 성장 억제 효과를 용량-의존성 방식으로 역전시킨 반면 (도 15C), 팔미테이트는 세포를 구제하는데 실패하였다 (도 15D). 유사한 결과가 SW780 세포에서 관찰되었다 (도 16). 이러한 데이터는 억제제 A37062가 SCD1-특이적이고, 세포 증식 및 생존에 대한 그의 억제 효과는 단일불포화 지방산 생성의 결여로 인한 것임을 강력하게 시사한다.
다음에, 생체내에서 방광암 세포의 성장에 대한 A37062의 효과를 조사하였다. 무흉선 누드 마우스에게 UMUC-14 세포를 접종하여, 종양을 ~150 mm3의 평균 부피까지 성장하도록 하고, 이러한 동물에게 비히클 또는 A37062 (75 mg/kg)를 20일 동안 1일 2회 투여하였다. 제20일에 비히클 대조군과 비교하여, A37062는 종양 성장을 약 60% 억제하였다 (도 15E). 마지막 투여 2시간 후에 수집된 종양 용해물의 분석은 A37062가 단일불포화 지방산 대 포화 지방산의 비를 현저하게 감소시켰다는 것을 보여주었다 (도 15F 및 G). 유사하게, 마우스 간 및 혈장에서의 지방산 탈포화가 또한 유의하게 감소하였다 (도 15F 및 G). 따라서, A37062는 지방산 탈포화의 차단과 함께 UMUC-14 종양 이종이식편의 성장을 억제한다. 실험 과정에서, 누드 마우스에서 유의한 체중 손실 또는 다른 전체적인 이상이 관찰되지 않았다.
실시예 8: SCD1 소분자 억제제를 사용한 생체내 효능 연구
결장, 췌장 및 신장 암에 대한 SCD1 소분자 길항제의 효과를 연구하기 위해, 결장암 세포주, 췌장암 세포주 및 신장암 세포주를 연속적으로 희석된 A37062로 72시간 동안 처리하고, 세포 생존율을 상기 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 (프로메가)에 의해 측정하였다. 또한, 결장암 세포주, 췌장암 세포주 및 신장암 세포주를 연속적으로 희석된 A37062로 48시간 동안 처리하고, 카스파제 3/7 활성을 상기 기재된 바와 같이 카스파제-글로 3/7 검정 키트 (프로메가)에 의해 측정하였다. SCD1의 약리학적 억제는 인간 결장암 세포주 (도 17A 및 B), 인간 췌장암 세포주 (도 17C 및 D) 및 인간 신장암 세포주 (도 17E 및 F)에서 세포 생존율을 감소시키고 카스파제 3/7 활성을 증가시켰다. 데이터는 평균 +/- SD로 나타내었고, 이는 2회 독립적 실험을 대표한다.
추가의 SCD1 소분자 길항제의 효과를 연구하기 위해, 결장, 전립선, 췌장 및 방광 암을 포함하는 인간 암 세포주를 연속적으로 희석된 A37062 또는 G02447171.1로 72시간 동안 처리하고, 세포 생존율을 셀타이터-글로 (프로메가)에 의해 측정하였다. A37062 또는 G02447171.1을 사용한 SCD1의 약리학적 억제는 결장, 전립선, 췌장 및 방광 암을 포함하는 인간 암 세포주의 패널에서 세포 생존율을 감소시키고 카스파제 3/7 활성을 증가시켰다 (각각 도 18A 및 B). 데이터는 평균 +/- SD로 나타내었고, 이는 2회 독립적 실험을 대표한다.
SCD1 소분자 길항제의 효과를 연구하기 위해 암 세포주를 연속적으로 희석된 A37062로 72시간 동안 처리하고, 세포 역가 IC50 (nM) 및 세포 생존율을 상기 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 (프로메가)에 의해 측정하였다. 표 4를 참조한다.
[표 4]
Figure pct00037
Figure pct00038
마우스에서 종양 성장에 대한 SCD1 소분자 길항제의 효과를 연구하기 위해, 마우스에게 비히클 또는 SCD1 소분자 억제제 G01522403 (A37062) 및 G02447171을 기재된 바와 같이 1일 2회 경구로 제공하였다. SCD1의 약리학적 억제는 미리-확립된 HCT15 결장 종양, 미리-확립된 SW780 방광 종양 및 미리-확립된 HPAC 췌장 종양의 이종이식편 성장을 지연시켰다 (각각 도 18C, D 및 E). 종양 부피는 평균 +/- SEM으로 제시하였다. 또한 표 5를 참조한다.
[표 5]
Figure pct00039
실시예 9: SCD1 의 약리학적 억제는 종양 세포 생존율을 감쇠시킨다
추가의 SCD1 소분자 길항제의 효과를 연구하기 위해, HT29 및 HCT15를 연속적으로 희석된 소분자 억제제 RG1-14 및 G02447171 (G7171)로 72시간 동안 처리하고, 세포 생존율을 셀타이터-글로 (프로메가)에 의해 측정하였다. SCD1 소분자 억제제의 특이성 및 선택성을 또한 평가하였다. 표 6-9를 참조한다. 정상 성장 조건 하에, 소분자 SCD1 길항제는 HT29 및 HCT15 세포의 증식을 억제하였다 (도 19). 외재적으로 보충된 올레에이트는 성장 억제 효과를 용량-의존성 방식으로 역전시킨 반면 (도 20A-C 및 21A-C), 팔미테이트는 세포를 구제하는데 실패하였다 (도 20D-F 및 21D-F).
[표 6]
Figure pct00040
[표 7]
Figure pct00041
[표 8]
Figure pct00042
[표 9]
Figure pct00043
실시예에 대한 논의
본 실시예는 FGFR3 신호가 PI3K-mTORC1을 통해 SREBP1 및 그의 하류 표적을 활성화시켜 인간 방광암 세포에서 신생 지질생성 및 지방산 탈포화를 촉진한다는 것을 보여준다. 또한, SCD1에 의해 촉매되는 지방산 탈포화를 차단하는 유전자 또는 약리학적 개입은 세포 배양물 및 이종이식된 마우스에서 종양 성장을 매우 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 처음으로 방광 종양 성장 및 생존의 유지, 종양원성 성장 인자 신호전달과 변경된 세포 대사 사이의 메카니즘적 연결의 제공에 있어 FGFR3-조절된 지질 대사의 중요성을 밝혀내었다.
편향되지 않은 발현 분석으로부터의 한 가지 놀라운 발견은 스테롤 및 지방산 합성 및 대사에 관여하는 유전자의 큰 코호트가 방광암 세포에서 FGFR3 녹다운의 결과로서 가장 우세하게 하향조절되는 유전자라는 것이다. 본 실시예는 FGFR3 신호전달의 활성화가 절단된, 전사적으로 활성인 SREBP1의 양을 증가시키고, 이어서 핵심 지질발생 효소의 발현을 유도하고 지방산 (포화 및 불포화 부류 둘 다 포함)의 신생 합성을 촉진한다는 것을 추가로 입증한다. 이러한 결과는 교모세포종에서 활성화된 EGFR 신호전달이 SREBP1 프로세싱의 자극을 통해 지질생성을 촉진한다는 것을 보여주는 최근의 보고로 상기된다 (35). 이러한 발견은 EGFR 및 Her2의 활성화가 유방암 세포주에서 FASN 발현을 유도한다는 것을 보여주는 이전의 연구와 일치하고 이를 확장시킨다 (36-38). 성장 인자, 예컨대 EGF 및 PDGF가 섬유모세포 (39) 및 상피 세포 (40-41)에서 SREBP1 활성화 및 지질생성을 촉진시킬 수 있음을 고려하여, 종양원성 성장 인자 수용체 신호전달-자극된 지질생성이 다수의 암 유형에서 상승된 지방산 합성을 기반으로 하는 공통 메카니즘일 수 있다고 생각할 수 있다.
낮은 세포내 스테롤 수준 또는 인슐린 자극에 반응하여, SREBP1은 단백질분해적 절단에 의해 활성화되고, 성숙 N-말단 단편은 핵으로 전위되어 지질발생 유전자의 캐스케이드의 전사를 활성화시킨다 (32). 성장 인자 및 그의 수용체는 잠재적으로 전사 상향조절, 증가된 단백질분해적 프로세싱, 또는 GSK3-Fbw7-매개된 유비퀴틴화 및 프로테아솜 분해의 억제에 의한 절단된 SREBP1의 안정화를 비롯한 다중 메카니즘을 통해 SREBP1을 활성화시킬 수 있다 (33). 본 실시예는 리간드-유도된 FGFR3 활성화가 전장 불활성 SREBP1의 유도에 단지 약간의 영향을 미치는 반면, SREBP1의 절단된 활성 형태는 유의하게 축적된다는 것을 입증한다. 또한, PI3K 또는 mTORC1 억제제에 의한 정규 FGFR3 신호전달의 급성 약리학적 억제는 전장 불활성 SREBP1의 수준에는 영향을 미치지 않고 성숙된 SREBP1의 수준을 현저하게 감소시킨다. 이러한 데이터는 SREBP1의 FGFR3-유도된 활성화가 주로 PI3K-mTORC1의 성숙된 SREBP1의 선택적 증가를 방해한다는 것을 시사한다. 이러한 발견은 myr-AKT를 과다발현하는 세포 (42) 또는 TSC의 유전자 제거를 통한 mTORC의 구성적 과다활성화를 갖는 마우스 배아 섬유모세포 (43)에서의 여러 최근의 연구와 일치한다. 이 연구로부터 또 다른 주목할만한 관찰은 상이한 세포에서의 FGF1-자극된 SREBP1 활성화에 대한 MEK-MAPK의 차별적 기여이다. 이는 성장 인자 수용체에 의한 SREBP1 활성화에 MEK-MAPK가 관여한다는 외견상 상반된 결과를 보여주는 이전의 결과와 일치하며, SREBP1의 MEK-MAPK 조절이 고도로 컨텍스트-의존성일 수 있음을 시사한다 (37, 39-41). FGFR3 신호전달이 SREBP1 프로세싱 및/또는 안정성을 어떻게 조절하는지에 대한 정확한 메카니즘은 추가로 조사 예정이다.
본 발명자들의 최근의 연구에서 한 가지 중요한 발견은 지방산 탈포화에서 속도-제한 효소인 SCD1이 방광암 세포에서 FGFR3 녹다운에 의한 가장 현저한 조정을 보여주는 유전자라는 것이다. 따라서, FGF1은 SCD1 발현 및 불포화 지방산의 합성에서 현저한 증가를 유도하였다. SREBP1 siRNA가 기저 및 FGF1-유도된 SCD1 발현을 현저하게 감소시키는 반면, 녹다운 SREBP2는 단독으로는 SCD1 발현에 대해 명백한 효과를 갖지 않으므로, 이러한 조절은 주로 SREBP1을 통해 매개된다. 또한, 본 실시예는 SCD1이 구성적으로 활성화된 FGFR3과 방광암 세포의 증식 및 생존을 유지하는데 필수적임을 나타낸다. RNA 간섭 또는 약리학적 개입을 통한 SCD1의 억제는 지방산 탈포화를 차단하여, G1 세포 주기 정지 및 이후의 아폽토시스를 발생시켰다. 또한, 외재적으로 보충된 올레산은 SCD1 억제로부터 세포를 구제할 수 있으며, 이는 세포 증식 및 생존에서 지방산 탈포화의 중요성을 확인한다. 최종적으로, SCD1 억제는 마우스에서 여러 방광암 이종이식편의 성장을 현저하게 감쇠시켰다. 따라서, 방광 종양 성장을 유지하는데 있어 SCD1 기능의 중요성은 이를 이러한 질환 설정에서 잠재적인 새로운 치료 표적으로 제안한다. 제한된 세포주 패널을 사용한 실시예는 구성적으로 활성화된 FGFR3을 갖는 세포가 SCD1 억제에 보다 민감하다고 제안하였으나, FGFR3 활성화 상태 자체가 SCD1-기반 요법에 대한 반응을 예측할 수 있는지 여부는 아직 명확하지 않다. PI3K-AKT-mTORC1 축, 및 보다 적은 정도로, MEK-MAPK가 지질생성 및 SCD1 활성을 촉진할 수 있으므로, FGFR3 하류의 신호전달 경로의 변경, 또는 다른 수용체 티로신 키나제의 조절이상이 SCD1-표적화된 요법에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있다.
여러 최근의 연구는 SCD1이 폐암 및 전립선암을 비롯한 다른 악성종양에서 과다발현되며 종양 성장에 필수적이고 (44-46), 전립선암에서의 지방산 탈포화 인덱스가 질환 진행과 상관된다고 보고하였다 (45). 이러한 질환에서 SCD1 상향조절의 근본적 메카니즘은 아직 설명되지 않았을지라도 (45-48), 이러한 데이터는 SCD1이 부분적으로 세포 분열 동안 막 생물발생 및 세포 증식, 생존 및 스트레스 적응에 중요한 다양한 경로의 신호 전달을 제어함으로써 종양발생에서 보다 광범위한 역할을 수행할 수 있음을 시사한다.
참고문헌의 일부 목록
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
상기 본 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
[표 3]
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL <120> METHODS OF USING SCD1 ANTAGONISTS <130> P4767R1-WO <140> <141> <150> 61/547,706 <151> 2011-10-15 <150> 61/704,397 <151> 2012-09-21 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Ala His Leu Leu Gln Asp Asp Ile Ser Ser Ser Tyr Thr Thr 1 5 10 15 Thr Thr Thr Ile Thr Ala Pro Pro Ser Arg Val Leu Gln Asn Gly Gly 20 25 30 Asp Lys Leu Glu Thr Met Pro Leu Tyr Leu Glu Asp Asp Ile Arg Pro 35 40 45 Asp Ile Lys Asp Asp Ile Tyr Asp Pro Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Gly 50 55 60 Pro Ser Pro Lys Val Glu Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Leu Met Ser 65 70 75 80 Leu Leu His Leu Gly Ala Leu Tyr Gly Ile Thr Leu Ile Pro Thr Cys 85 90 95 Lys Phe Tyr Thr Trp Leu Trp Gly Val Phe Tyr Tyr Phe Val Ser Ala 100 105 110 Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Pro Leu Arg Leu Phe Leu Ile Ile Ala Asn Thr Met 130 135 140 Ala Phe Gln Asn Asp Val Tyr Glu Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His 145 150 155 160 His Lys Phe Ser Glu Thr His Ala Asp Pro His Asn Ser Arg Arg Gly 165 170 175 Phe Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Ala 180 185 190 Val Lys Glu Lys Gly Ser Thr Leu Asp Leu Ser Asp Leu Glu Ala Glu 195 200 205 Lys Leu Val Met Phe Gln Arg Arg Tyr Tyr Lys Pro Gly Leu Leu Met 210 215 220 Met Cys Phe Ile Leu Pro Thr Leu Val Pro Trp Tyr Phe Trp Gly Glu 225 230 235 240 Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Val Ala Thr Phe Leu Arg Tyr Ala Val 245 250 255 Val Leu Asn Ala Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Phe Gly 260 265 270 Tyr Arg Pro Tyr Asp Lys Asn Ile Ser Pro Arg Glu Asn Ile Leu Val 275 280 285 Ser Leu Gly Ala Val Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Ser Phe 290 295 300 Pro Tyr Asp Tyr Ser Ala Ser Glu Tyr Arg Trp His Ile Asn Phe Thr 305 310 315 320 Thr Phe Phe Ile Asp Cys Met Ala Ala Leu Gly Leu Ala Tyr Asp Arg 325 330 335 Lys Lys Val Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala Arg Ile Lys Arg Thr Gly 340 345 350 Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Gly 355 <210> 2 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gatcccccta caagagtggc tgagttttca agagaaactc agccactctt gtagtttttt 60 ggaaa 65 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 gatcccccta cggctctttc tgatcattca agagatgatc agaaagagcc gtagtttttt 60 ggaaa 65 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 gatccccgca catcaacttc accacattca agagatgtgg tgaagttgat gtgctttttt 60 ggaaa 65

Claims (42)

  1. 암 세포를 유효량의 SCD1 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 세포 증식을 억제하는 방법.
  2. 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 세포 증식을 억제하는 방법.
  3. 암 세포를 유효량의 SCD1 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 세포 주기 정지를 유도하는 방법.
  4. 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 세포 주기 정지를 유도하는 방법.
  5. 암 세포를 유효량의 SCD1 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 아폽토시스를 촉진하는 방법.
  6. 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 아폽토시스를 촉진하는 방법.
  7. 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포를 치료하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포가 자궁내막암 세포, 두경부암 세포, 신장암 세포, 난소암 세포, 결장암, 췌장암 세포, 비뇨기암 세포 또는 방광암 세포인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 암 세포가 신장암 세포, 췌장암 세포 또는 방광암 세포인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포가 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 것인 방법.
  11. 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 개체의 암이 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 것인 방법.
  13. 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 개체를 기반으로 하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  14. 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하는 것을 포함하며, 단 개체는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 것으로 밝혀진 것인, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  15. 개체로부터 수득한 샘플이 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는지 결정하는 것, 및 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 유효량으로 개체에게 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  16. (a) 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 상승된 수준의 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 개체를 선택하는 것; 및 (b) 이에 따라 선택된 개체에게 유효량의 SCD1 길항제를 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  17. 개체로부터 수득한 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 크다는 것을 나타내거나 또는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 크거나 또는 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 더 작은 개체를 확인하는 방법.
  18. 하나 이상의 바이오마커를 평가하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 더 크다는 것을 나타내고, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법을 사용한 치료에 효과적으로 반응할 가능성이 있는지 여부를 예측하는 방법.
  19. 개체로부터 수득한 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응을 예측하는 것이고, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응의 결손을 예측하는 것인, SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법에 대한 개체의 반응 또는 반응의 결손을 예측하는 방법.
  20. 암을 갖는 개체로부터 수득한 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 상승된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는다는 것을 나타내고, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 샘플에서의 하나 이상의 바이오마커의 감소된 발현 수준은 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 감소된 가능성을 갖는다는 것을 나타내는 것인, 암을 갖는 개체가 SCD1 길항제를 포함하는 항암 요법으로부터 이익을 얻을 가능성을 결정하는 방법.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 자궁내막암 세포, 두경부암, 신장암, 난소암, 결장암, 췌장암, 비뇨기암 또는 방광암인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 암이 신장암, 췌장암 또는 방광암인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 암이 방광암인 방법.
  24. 제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 FGFR3인 방법.
  25. 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 인산화 FGFR3인 방법.
  26. 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자인 방법.
  27. 제26항에 있어서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자가 SREBF1, G6PD, ACOT7, PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11, ACER3, PDSS1, MVD, AGPAT5, HSD17B2, ACSL4, EBP, PIGW, LBR, ACLY, ADORA2B, GPCPD1, CYP24A1, ACSL3, MVK, ACSS2, FDPS, ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자가 ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자가 CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자가 LDLR, MSMO1, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, FGFR3-조절된 지질발생 시그너처의 하나 이상의 유전자가 SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 방법.
  32. 제10항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 성숙 SREBP1인 방법.
  33. 제10항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 Δ9 단일불포화 지방산인 방법.
  34. 제10항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 Δ9 단일불포화 지방산:포화 지방산의 비인 방법.
  35. 제10항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 PI3K 신호전달, mTOR 신호전달, MEK 신호전달인 방법.
  36. 제10항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 PI3K, PTEN, p85, TSC1/2 및 AKT로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 다형성인 방법.
  37. 제10항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 인산화 AKT인 방법.
  38. 제10항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준이 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 약 1.5배, 약 1.75배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 2.75배, 약 3.0배 또는 약 3.25배 초과 상승된 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, SCD1 길항제가 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드인 방법.
  40. 제39항에 있어서, SCD1 길항제가 소분자인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 소분자가 G01522403 (A37062), G02447171 또는 그의 유도체인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 방법.
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