ES2898065T3

ES2898065T3 - Materiales y procedimientos para realizar ensayos histoquímicos para proepirregulina y anfirregulina humanas

Info

Publication number: ES2898065T3
Application number: ES16733457T
Authority: ES
Inventors: Shalini Singh; Yifei Zhu; Zhiming Liao; Andrea Muranyi; Kandavel Shanmugam; Fernando Couto
Original assignee: Ventana Medical Systems Inc
Current assignee: Ventana Medical Systems Inc
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2016-06-27
Publication date: 2022-03-03
Anticipated expiration: 2036-06-27
Also published as: AU2021273603A1; EP3514174B1; CA2990214A1; EP3313878A1; AU2021273604B2; CA3162586A1; AU2021273604A1; US20210063403A1; WO2017001350A1; US11747339B2; CA3162816A1; EP3514174A1; EP3313878B1; ES2878316T3; AU2016288461A1; US20240027463A1; US20180196057A1; EP3978525A1; ES2898065T8; US10852304B2

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une específicamente a proepirregulina humana, en el que el anticuerpo comprende las siguientes HVR: (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 2; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 3; (c) una HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 4; (d) una HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 9; (e) una HVR-L2 que comprende SEQ ID NO: 10; y (f) una HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 11.

Description

DESCRIPCIÓN

Materiales y procedimientos para realizar ensayos histoquímicos para proepirregulina y anfirregulina humanas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos para detectar epirregulina en muestras humanas y procedimientos de uso de los mismos.

ANTECEDENTES

Aproximadamente un 20 % de los pacientes con cáncer de colon presentan cáncer colorrectal metastásico (CCRm) pero independientemente del tratamiento que reciben, más de la mitad (50-60 %) de estos pacientes finalmente desarrollarán una enfermedad avanzada incurable, que tiene una tasa de supervivencia de 5 años de aproximadamente un 12,5 %. Dos vías de señalización en CCRm han sido el centro del desarrollo de fármacos terapéuticos: las vías del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Actualmente, la mayoría de los pacientes con CCRm reciben quimioterapia citotóxica combinada con tratamientos dirigidos a EGFR o VEGF. El EGFR se sobreexpresa en aproximadamente un 70 % de los casos de CCR donde se asocia con un mal resultado. La inhibición dirigida de EGFR con anticuerpos monoclonales, cetuximab o panitumumab, se aprobó por la FDA en 2004 y 2006 para tratar pacientes con CCRm. Estos anticuerpos se dirigen al dominio extracelular de EGFR y compiten con ligandos endógenos para evitar la activación del receptor. Al inhibir la vía de señalización de EGFr , estos agentes biológicos inhiben la proliferación, diferenciación, migración y metástasis celular. Ambos fármacos tienen una eficacia muy similar con una tasa de respuesta de un 10-15 %.

Se han investigado varios marcadores moleculares para predecir mejor la respuesta al tratamiento anti-EGFR. Véase Perkins et al., Pharmacogenetics, vol. 15, número 7, pp. 1043-52 (2014). Los estudios clínicos han proporcionado pruebas de que los inhibidores de EGFR son los más eficaces en pacientes que carecen de mutaciones en la vía RAS y pueden ser perjudiciales para quienes tienen un tumor de tipo mutante. Las mutaciones puntuales en miembros de las vías de señalización RAS tales como KRAS, NRAS o BRAF dan lugar a la activación continua de la señalización RAS-MAPK hacia 3', independientemente de si el EGFR está inactivado farmacológicamente. Además de las mutaciones RAS y BRAF, otros mecanismos alternativos tales como amplificación de cMET o EGFR desempeñan un papel en la resistencia a Cetuximab o Panitumumab. La vía PI3K-AKT-PTEN también se puede desencadenar por la activación de EGFR por lo tanto la mutación en la pérdida de PI3K o PTEN (a menudo se produce con mutaciones KRAS o BRAF) también se asocia con una falta de respuesta. Las mutaciones RAS, BRAF y PI3K representan más de un 60 % de pacientes con CCRm que muestran una resistencia de novo a anticuerpos monoclonales dirigidos a EGFR. Del 40 % de los pacientes con tumores sin mutaciones KRAS, NRAS, BRAF y PI3K (pacientes sin mutaciones cuádruples), aproximadamente la mitad de estos pacientes (solo un 15 %) tienen un beneficio importante del tratamiento anti-EGFR y más de un 20 % no responden al tratamiento. Puesto que el estado de RAS, RAF, PI3K no es suficiente para evaluar la respuesta anti-EGFR; existe una necesidad médica no cubierta de mejorar la selección de pacientes para el tratamiento anti-EGFR.

Se están investigando varios candidatos potenciales que están implicados en la vía de señalización de EGFR o en otras vías como los receptores MET o h Er . La expresión génica elevada de epirregulina (EREG) y/o anfirregulina (AREG), ligandos para EGFR, se ha propuesto coherentemente para la predicción del tratamiento anti-EGFR. En estos tumores, los anticuerpos anti-EGFR compiten con la activación dependiente de ligando de EGFR, dando lugar a una regulación por disminución del receptor de la superficie celular, suprimiendo por tanto la señalización proliferativa. Un estudio publicado recientemente mostró que los pacientes con tumores que tenían niveles de ARNm de EREG bajos no se beneficiaron del tratamiento anti-EGFR; el tratamiento con cetuximab no se asoció con una mejora en la supervivencia global (SG). Mientras en el grupo positivo para biomarcador (ARNm alto de KRAS wt/EREG), el incremento en la expresión de ARNm de EREG se asoció fuertemente con un incremento en el beneficio terapéutico de cetuximab. En términos de ganancia de SG mediana absoluta, la adición de tratamiento anti-EGFR incrementó la supervivencia de 5,1 a 9,8 meses en comparación con cuidados paliativos solos. Este resultado sugiere que la expresión de ligandos de EGFR se podría convertir en un biomarcador clínicamente útil para cribar pacientes con CCRm para tratamiento inhibidor de EGFR.

Por lo tanto, sería útil tener nuevos anticuerpos disponibles para la detección de ligandos de EGFR, tales como EREG y AREG, en muestras tisulares.

Pradhan et al. (Nucleic Acids Res. 2014 Jun;42(10):6243-55) divulgan el uso de un anticuerpo de conejo policlonal frente a EREG humana, denominado ab175118. Se produjo el anticuerpo frente a un péptido dentro de los residuos 140-169 de EREG humana y se puede aplicar en inmunoelectrotransferencia, inmunohistoquímica y citometría de flujo.

La tecnología de señalización celular (http://media.cellsignal.com/pdf/12048.pdf) divulga un anticuerpo monoclonal de conejo que reconoce la proepirregulina y no reconoce la forma madura de la epirregulina. Se produjo el anticuerpo inmunizando animales con un péptido sintético correspondiente a los residuos que rodean Glu155 de epirregulina humana.

Zhang et al. (Cancer Prev Res (Phila). 2008 Aug;1(3):201-7) divulgan el uso de un anticuerpo anti-EREG humana de cabra policlonal en inmunohistoquímica de muestras de cáncer primario, en el que la epirregulina intratumoral confiere propiedades invasivas en células de NSCLC mutantes en EGFR.

Jonker et al. (Br J Cancer. 2014 Feb 4;110(3):648-55) divulgan que los pacientes con expresión de EREG alta parecen beneficiarse más de un tratamiento anti EGFR, tal como cetuximab.

SUMARIO

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-proepirregulina y a procedimientos de uso de los mismos. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado que se une específicamente a proepirregulina humana, en el que el anticuerpo comprende las siguientes HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de ^{aminoácidos de} RYGMS ^{(SEQ ID NO: 2); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de} SINRTAYTYYATWAKG ^{(SEQ ID NO: 3); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de} GLTYGGSDYDYDDAL ^{(SEQ ID NO: 4); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de} QASQSVYKNKNLA ^{(SEQ ID NO: 9); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de} RASTLAS ^{(SEQ ID NO: 10); y} (f) ^{una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de} QGEFSCSTFDCIL ^{(SEQ ID NO: 11). En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende además las}siguientes FR de dominio variable de la cadena pesada y dominio variable de la cadena ligera: (a) FR-H1 que ^{comprende la secuencia de aminoácidos de} QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLS (SEQ iD NO:

^{5); (b) FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de} WVRQAPGKGLEYIG ^{(SEQ ID NO: 6); (c) FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de} RFTISRTSTTVDLRMTSLTTEDTATYFCAR ^{(SEQ ID NO: 7); (d) FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de} WGPGTLVTVSS ^{(SEQ ID NO: 8); (e) FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de} QVLTQTPSSVSAAVGGTVTINC ^{(SEQ ID NO: 12);} (f) ^{FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de} WYQQKPGQPPKLLIY ^{(SEQ ID NO:}13); (g) FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYC ^{(SEQ ID NO: 14); y} (h) ^{FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de} FGGGTEMVVK ^{(SEQ ID NO: 15). En algunos modos de realización, el}anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 16 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 17. En algunos modos de realización, uno cualquiera de los anticuerpos precedentes puede ser un anticuerpo monoclonal. En algunos modos de realización, el anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo monoclonal de conejo.

En algunos modos de realización, uno cualquiera de los anticuerpos precedentes puede ser un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a proepirregulina humana. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, fragmento variable monocatenario (scFv), Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y diacuerpo.

En otro aspecto, la invención presenta un inmunoconjugado que comprende uno cualquiera de los anticuerpos precedentes.

En otro aspecto, la invención presenta un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En otro aspecto, la invención presenta un vector (por ejemplo, un vector de expresión) que comprende el ácido nucleico para expresar el anticuerpo. En otro aspecto, la invención presenta células huésped que comprenden los ácidos nucleicos y/o vectores precedentes.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento de detección de la presencia o nivel de expresión de proepirregulina humana en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con uno cualquiera de los anticuerpos precedentes y detectar la presencia del anticuerpo unido. En algunos modos de realización, la detección es por inmunohistoquímica (IHQ), inmunofluorescencia (IF) o inmunotransferencia. En algunos modos de realización, la detección es por IHQ. En algunos modos de realización, la muestra comprende tejido fijado. En algunos modos de realización, el tejido fijado es un tejido incluido en parafina fijado con formol (FFPE). En algunos modos de realización, la muestra es de un sujeto que tiene o predispuesto a cáncer o enfermedad autoinmunitaria, opcionalmente en el que el cáncer es cáncer de colon, cáncer de mama o cáncer de pulmón.

En otro aspecto, la invención presenta un distribuidor para un teñidor de portaobjetos automatizado que comprende una solución que comprende uno cualquiera de los anticuerpos precedentes.

En otro aspecto, la invención presenta un kit que comprende uno cualquiera de los anticuerpos precedentes o un distribuidor que comprende uno cualquiera de los anticuerpos precedentes.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra el proceso de producción de anticuerpos general para los anticuerpos anti-proepirregulina humana y anti-anfirregulina humana.

La figura 2 es una imagen que muestra los resultados de inmunohistoquímica (IHQ) en tejido de cáncer de colon incluido en parafina fijado con formol (FFPE) comparando el clon J5H1L1 con un clon disponible comercialmente de Cell Signaling Technologies, Inc.

La figura 3 es una imagen de un ensayo IHQ usando dos clones de anticuerpos anti-anfirregulina humana para teñir tejido de cáncer colorrectal metastásico incluido en parafina fijado con formol.

La figura 4 es una imagen que muestra los resultados de una inmunoelectrotransferencia de EREG y AREG usando lisados de líneas celulares como se menciona en los respectivos paneles de figuras.

Las figuras 5A-5C proporcionan imágenes representativas de resultados de IHQ para IHQ de EREG y AREG, demostrando tinción de membrana, granulada/puntiforme y citoplásmica.

La figura 6 es una imagen de un análisis de inmunoelectrotransferencia (WB) que compara el clon de anticuerpo para EREG J89H12L3 con el clon D405I.

La figura 7 demuestra imágenes de análisis IHQ de expresión de proteína EREG en xenoinjerto. Las muestras A-D se tiñen con el clon J89H12L3. Las muestras E-G se tiñen con el clon D405I. Las muestras A y E son xenoinjertos de células SKE23. Las muestras B y F son xenoinjertos de células PLR124EREG /-. Las muestras C y G son xenoinjertos de células SK-Hep1. Las muestras D y H son xenoinjertos de células PLR124EREG -/-. El marrón indica tinción positiva.

La figura 8 es una comparación entre J89H12L3 y D405I en tejido de carcinoma de células escamosas de pulmón (SCC). Las imágenes A-C son tejidos teñidos con el clon J89H12L3. Las imágenes D-F son tejidos teñidos con el clon D405I.

La figura 9 es una comparación entre J89H12L3 y D405I en adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células adenoescamosas. Las imágenes A-D son tejidos teñidos con el clon J89H12L3. Las imágenes E-H son tejidos teñidos con el clon D405I.

La figura 10 es un análisis IHQ de la expresión de proteína EREG en tejidos normales y tumorales usando el clon J89H12L3. Las imágenes son de tejidos teñidos con J89H12L3 como sigue: carcinoma de células escamosas cutáneo (A), carcinoma hepatocelular (B), carcinoma de células de transición de vejiga (C), adenocarcinoma de colon (D), adenocarcinoma de pulmón (E), piel (F), cuello uterino (G) y esófago (H).

Descripción detallada de modos de realización de la invención

I. Definiciones

Los términos "anticuerpo anti-proepirregulina humana", "anticuerpo que se une específicamente a proepirregulina humana" y "anticuerpo se une a proepirregulina humana" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a proepirregulina humana con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a proepirregulina humana. En un ejemplo, el grado de unión de un anticuerpo antiproepirregulina humana a una proteína distinta de proepirregulina humana no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a proepirregulina humana como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados ejemplos, un anticuerpo que se une a proepirregulina humana tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, o < 0.001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M). En determinados ejemplos, un anticuerpo anti-proepirregulina humana se une a un epítopo de proepirregulina humana que se conserva entre proepirregulina humana de diferentes especies.

Los términos "anticuerpo anti-anfirregulina humana", "anticuerpo que se une específicamente a anfirregulina humana" y "anticuerpo se une a anfirregulina humana" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a anfirregulina humana con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a anfirregulina humana. En un ejemplo, el grado de unión de un anticuerpo anti-anfirregulina humana a una proteína distinta de anfirregulina humana no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a anfirregulina humana como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados ejemplos, un anticuerpo que se une a anfirregulina humana tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, o < 0.001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinados ejemplos, un anticuerpo antianfirregulina humana se une a un epítopo de anfirregulina humana que se conserva entre anfirregulina humana de diferentes especies.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.

Una "enfermedad autoinmunitaria" es una enfermedad o trastorno que surge de y se dirige contra los propios tejidos u órganos de un individuo o una cosegregación o manifestación del mismo o afección resultante del mismo. Las enfermedades autoinmunitarias pueden ser una enfermedad específica de órgano (es decir, la respuesta inmunitaria se dirige específicamente contra un sistema de órganos tal como el sistema endocrino, el sistema hematopoyético, la piel, el sistema cardiopulmonar, los sistemas gastrointestinal y hepático, el sistema renal, la tiroides, los oídos, el sistema neuromuscular, el sistema nervioso central, etc.) o una enfermedad sistémica que puede afectar a sistemas de órganos múltiples (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide (AR), polimiositis, etc.). Las enfermedades autoinmunitarias ejemplares no limitantes incluyen trastornos reumatológicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, AR, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lupus tales como LES y nefritis lúpica, polimiositis-dermatomiositis, crioglobulinemia, síndrome de anticuerpos antifosfolipídicos, y artropatía psoriásica), trastornos gastrointestinales y hepáticos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, enfermedades intestinales inflamatorias (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), gastritis autoinmunitaria y anemia perniciosa, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, y enfermedad celíaca), vasculitis (tal como, por ejemplo, vasculitis no asociada a ANCA y vasculitis asociada a ANCA, incluyendo vasculitis de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener, y poliangiitis microscópica), trastornos neurológicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, esclerosis múltiple, síndrome de opsoclonía-mioclonía, miastenia grave, neuromielitis óptica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y polineuropatías autoinmunitarias), trastornos renales (tales como, por ejemplo, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, y enfermedad de Berger), trastornos dermatológicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, psoriasis, urticaria, ronchas, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso, y lupus eritematoso cutáneo), trastornos hemáticos (tales como, por ejemplo, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura postransfusional, y anemia hemolítica autoinmunitaria), ateroesclerosis, uveítis, enfermedades auditivas autoinmunitarias (tales como, por ejemplo, enfermedad del oído interno y sordera parcial), enfermedad de Behcet, síndrome de Raynaud, trasplante de órganos, y trastornos endocrinos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias relacionadas con diabetes tales como diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), enfermedad de Addison, y enfermedad tiroidea autoinmunitaria (por ejemplo, enfermedad de Graves y tiroiditis)). Dichas enfermedades más preferentes incluyen, por ejemplo, a R, colitis ulcerosa, vasculitis asociada a ANCA, lupus, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tiroiditis y glomerulonefritis.

Por "muestra biológica" se quiere decir una colección de células similares obtenidas de un sujeto o paciente. Una muestra biológica puede ser una muestra tisular o celular. La fuente de la muestra tisular o celular puede ser tejido sólido como el de un aspirado o biopsia o muestra tisular u órgano recién extraído, congelado y/o preservado; sangre o cualquier constituyente sanguíneo; líquidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal, o líquido intersticial; células de cualquier momento en la gestación o desarrollo del sujeto. La muestra biológica también se puede obtener de cultivo celular o tisular in vitro. La muestra tisular puede contener compuestos que no se entremezclan de forma natural con el tejido en la naturaleza tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares. Los ejemplos de muestras biológicas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, biopsias tumorales, células tumorales circulantes, suero o plasma, proteínas plasmáticas circulantes, líquido ascítico, cultivos celulares primarios o líneas celulares derivadas de tumores o que presentan propiedades similares a tumor, así como muestras tumorales conservadas, tales como muestras tumorales incluidas en parafina fijadas con formol o muestras tumorales congeladas.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento/proliferación celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma hodgkiniano y no hodgkiniano), blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar de células escamosas, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos, y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. En un modo de realización específico, la muestra biológica es una muestra de un tumor colorrectal. En otro modo de realización específico, la muestra biológica es una muestra de un tumor de mama. En otro modo de realización específico, la muestra biológica es una muestra de un tumor de pulmón, tal como carcinoma de pulmón no microcítico.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y |J, respectivamente.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211,1131,I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de micromoléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

"Funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un ejemplo, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Los términos "nivel de expresión" en general se usan de manera intercambiable y en general se refieren a la cantidad de un polinucleótido, ARNm o un producto de aminoácido o proteína en una muestra biológica. "Expresión" en general se refiere al proceso por el que la información codificada por genes se convierte en las estructuras presentes y en funcionamiento en la célula. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, la "expresión" de un gen (por ejemplo, el gen proepirregulina humana) se puede referir a la transcripción en un polinucleótido, traducción en una proteína o incluso modificación postraduccional de la proteína. Los fragmentos del polinucleótido transcrito, la proteína traducida o la proteína modificada postraduccionalmente también se considerarán expresados si se originan a partir de un transcrito generado por empalme alternativo o un transcrito degradado, o de un procesamiento postraduccional de la proteína, por ejemplo, por proteólisis. En algunos modos de realización, "nivel de expresión" se refiere a la cantidad de una proteína (por ejemplo, proepirregulina humana) en una muestra biológica como se determina usando inmunohistoquímica (IHQ), inmunotransferencia (por ejemplo, inmunoelectrotransferencia), inmunofluorescencia (IF), ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o citometría de flujo.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, pero puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde con la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos aminoacídicos que aparecen más comúnmente en una selección de secuencias estructurales de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Quinta edición, publicación NIH 91-3242, Bethesda MD, Vols. 1 3, 1991. En un ejemplo, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados ejemplos, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen:

(a) bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia et al. J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987);

(b) CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991);

(c) contactos con antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745, 1996); y

(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los residuos aminoacídicos de HVR46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3). A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un anticuerpo se puede purificar a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et al. J. Chromatogr. B. 848: 79-87, 2007.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

"Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-proepirregulina humana" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

"Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-anfirregulina humana" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, o una combinación de los mismos.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, b La s T-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.

El término "proepirregulina", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proepirregulina natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo, pero no incluye la forma escindida y secretada, que se denomina "epirregulina". El término engloba proepirregulina humana no procesada "de longitud completa" así como cualquier forma de proepirregulina humana que resulta del procesamiento en la célula, excepto para la forma escindida y secretada de epirregulina. El término también engloba variantes naturales de proepirregulina humana, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La molécula de proepirregulina normal es una proteína de membrana de tipo I de paso único de 169 aminoácidos que se escinde en una molécula secretada (denominada epirregulina) que contiene los aminoácidos 60-108 y que actúa como ligando de EGFR. Véase la entrada Uniprot 014944. Se puede encontrar información adicional sobre el gen de la proepirregulina humana, incluyendo la secuencia de ADN genómico, en n.° ID NCBI Gene 2069. La secuencia de aminoácidos de una proteína proepirregulina humana de longitud completa ejemplar se puede encontrar, por ejemplo, bajo número de acceso n Cb I BAA22146 o número de acceso UniProt O14944, y en el presente documento en SEQ ID NO: 36.

El término "anfirregulina", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier anfirregulina natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo, pero no incluye la forma escindida y secretada. El término engloba anfirregulina humana no procesada "de longitud completa" así como cualquier forma de anfirregulina humana que resulta del procesamiento en la célula, excepto para la forma escindida y secretada. El término también engloba variantes naturales de anfirregulina humana, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La molécula de anfirregulina normal es una proteína de membrana de tipo I de paso único de 252 aminoácidos que se escinde en lisina 187 para formar un ligando de EGFR secretado. Véase la entrada Uniprot P15514; Levano y Kenny, FEBS Letters, vol. 586, número 19, pp. 3500-02 (2012). Se puede encontrar información adicional sobre el gen de la anfirregulina humana, incluyendo la secuencia de ADN genómico, en n.° ID NCBI Gene 374. La secuencia de aminoácidos de una proteína proepirregulina humana de longitud completa ejemplar se puede encontrar, por ejemplo, bajo número de acceso NCBI NP_001648 o número de acceso UniProt P15514, y en el presente documento en SEQ ID NO: 36.

Como se usa en el presente documento, el término "se une específicamente a" o "es específico para" se refiere a interacciones medibles y reproducibles, tales como la unión entre una diana y un anticuerpo, lo que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas, incluyendo moléculas biológicas. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a una diana (que puede ser un epítopo, por ejemplo, los residuos aminoacídicos 148-169 de una proepirregulina humana de acuerdo con SEQ ID NO: 1 o los residuos aminoacídicos 238-252 de una anfirregulina humana de acuerdo con SEQ ID NO: 36) es un anticuerpo que se une a esta diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otras dianas. Por ejemplo, el grado de unión de un anticuerpo a una diana no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a la diana como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados ejemplos, un anticuerpo que se une específicamente a una diana tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. En determinados ejemplos, un anticuerpo se une específicamente a un epítopo en una proteína que se conserva entre la proteína de diferentes especies. En otro ejemplo, la unión específica puede incluir, pero no requiere, una unión exclusiva.

Un "sujeto" o "individuo" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology. 6.a ed., página 91, W.H. Freeman and Co., 2007. Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano et al. J. Immunol. 150: 880-887, 1993 y Clarkson et al. Nature. 352: 624-628, 1991.

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan funcionalmente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

II. Composiciones y procedimientos

La invención proporciona anticuerpos novedosos que se unen a proepirregulina humana. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para detectar la presencia de proepirregulina humana o el nivel de expresión de proepirregulina humana (por ejemplo, en muestras biológicas).

A. Anticuerpos anti-proepirregulina humana ejemplares

La invención proporciona anticuerpos anti-proepirregulina humana útiles para, por ejemplo, aplicaciones de diagnóstico (por ejemplo, inmunohistoquímica (IHQ), inmunofluorescencia (IF) e inmunotransferencia (por ejemplo, inmunoelectrotransferencia)). En un ejemplo, la invención proporciona anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a un epítopo que incluye los residuos aminoacídicos 148-169 de proepirregulina humana (por ejemplo, los residuos aminoacídicos 148-169 de SEQ ID NO: 1), que se localiza en el extremo carboxílico de la molécula proepirregulina. En un ejemplo, la invención proporciona anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a un epítopo que incluye los residuos aminoacídicos 156-169 de proepirregulina humana (por ejemplo, los residuos aminoacídicos 156-169 de SEQ ID NO: 1), que se localiza en el extremo carboxílico de la molécula proepirregulina. El epítopo en proepirregulina humana se puede reconocer de manera que sea dependiente de la conformación o independiente de la conformación.

En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a los residuos aminoacídicos 148-169 de proepirregulina humana incluyen al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 2; (b) HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 3; (c) HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 4; (d) HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 que comprende SEQ ID NO: 10; y (f) HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 11. Por ejemplo, en algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 2; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 3; y (c) una HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 4. En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen (a) una HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que comprende SEQ iD NO: 10; y (c) HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 11.

En algunos casos en los que los anticuerpos anti-proepirregulina humana se unen a los residuos aminoacídicos 148-169 de proepirregulina humana e incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 2; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 3; y (c) una HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 4, los anticuerpos antiproepirregulina humana incluyen además las siguientes regiones estructurales del dominio variable de la cadena pesada (FR): (a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 5; (b) FR-H2 que comprende SEQ ID NO: 6; (c) FR-H3 que comprende SEQ ID NO: 7; o (d) FR-H4 que comprende SEQ ID NO: 8. En algunos casos en los que los anticuerpos anti-proepirregulina humana se unen a los residuos aminoacídicos 148-169 de proepirregulina humana e incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 2; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 3; y (c) una h Vr -H3 que comprende SEQ ID NO: 4, los anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen además las siguientes regiones estructurales del dominio variable de la cadena pesada (FR): (a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 5; (b) FR-H2 que comprende SEQ ID NO: 6; (c) FR-H3 que comprende s EQ ID NO: 7; y (d) Fr -H4 que comprende SEQ ID NO: 8.

En algunos casos en los que los anticuerpos anti-proepirregulina humana se unen a los residuos aminoacídicos 148-169 de proepirregulina humana, los anticuerpos incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 2; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 3; (c) una HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 4; (d) una HVR-L1 que comprende SEQ ID n O: 9; (e) una HVR-L2 que comprende Se Q ID NO: 10; y (f) una HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 11. En algunos casos, estos anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen las siguientes FR: (a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 5; (b) FRH2 que comprende SEQ ID NO: 6; (c) FR-H3 que comprende Se Q ID NO: 7; y (d) FR-H4 que comprende SEQ ID NO: 8 y de forma adicional o alternativa pueden incluir (e) FR-L1 que comprende SEQ ID No : 12; (f) FR-L2 que comprende SEQ ID NO: 13; (g) FR-L3 que comprende s Eq ID NO: 14; y (h) FR-L4 que comprende Se Q ID n O: 15.

En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a los residuos aminoacídicos 148-169 de proepirregulina humana también pueden incluir una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 %), al menos un 90 % (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 % o 94 %), o al menos un 95 % (por ejemplo, al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con, o la secuencia de, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En determinados ejemplos, una secuencia de VH que tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 16), pero un anticuerpo anti-proepirregulina humana que incluye esa secuencia conserva la capacidad de unirse a proepirregulina humana. En determinados ejemplos, un total de 1 a 10 aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 16. En determinados ejemplos, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las f R). Opcionalmente, los anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen la secuencia de VH en SEQ ID NO: 16, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 2, (b) HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 3, y (c) HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 4.

En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a los residuos aminoacídicos 148-169 de proepirregulina humana también pueden incluir un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 %), al menos un 90 % (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 % o 94 %), o al menos un 95 % (por ejemplo, al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con, o la secuencia de, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. En determinados ejemplos, una secuencia de VL que tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 17), pero un anticuerpo anti-proepirregulina humana que incluye esa secuencia conserva la capacidad de unirse a proepirregulina humana. En determinados ejemplos, un total de 1 a 10 aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 17. En determinados ejemplos, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-proepirregulina humana comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 17, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En un modo de realización particular, el VL comprende una, dos o tres h Vr seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que comprende SEQ ID NO: 10; y (c) HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 11.

En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a los residuos aminoacídicos 148-169 de proepirregulina humana incluyen ambas secuencias VH y VL que tienen al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 %), al menos un 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, 92 %, 93 % o 94 %), o al menos un 95 % (por ejemplo, al menos un 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con, o las secuencias de, las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente, y pueden incluir o no modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En otros casos, la invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a proepirregulina humana, en los que los anticuerpos incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 2; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 3; (c) una HVR-H3 que comprende s Eq ID n O: 4; (d) una HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 9; (e) una HVR-L2 que comprende Se Q ID NO: 10; y (f) una HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 11. En algunos casos, estos anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen las siguientes FR: (a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 5; (b) FR-H2 que comprende SEQ ID NO: 6; (c) FR-H3 que comprende Se Q ID NO: 7; y (d) FR-H4 que comprende SEQ ID NO: 8 y de forma adicional o alternativa pueden incluir (e) FR-L1 que comprende SEQ ID NO: 12; (f) FR-L2 que comprende SEQ ID NO: 13; (g) FR-L3 que comprende SEq ID NO: 14; y (h) FR-L4 que comprende SEQ ID NO: 15. En algunos modos de realización, por ejemplo, los anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen tanto una secuencia VH como una VL que incluyen las secuencias de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente, y pueden incluir o no modificaciones postraduccionales.

Por ejemplo, la invención presenta anticuerpos anti-proepirregulina humana, tales como el anticuerpo antiproepirregulina humana J5H1L1, con las siguientes secuencias de región variable de la cadena pesada y ligera.

La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada comprende lo siguiente:

O S VEE SGGRLVTPGTPLTLTC TVSGF SL SRY GMSW VROAPGKGLEYIG

SINRTAYTYYATWAKCRFTISRTSTTVDLRMTSLTTEDTATYECARGL

TYGGSDYDYDDALWGPGTLVTVSS (SEO ID NO: 16)

La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera comprende lo siguiente:

OVLTOTPSSVSAAVGGTVTINCOASOSVYKNKNLAWYOOKPGOPPKL

LIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTOFTLTISGVOCADAATYYCOGEFSCS

TFDCILFGGGTEMVVK (SEQ ID NO: 17)

En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a los residuos aminoacídicos 156-169 de proepirregulina humana incluyen al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 18; (b) HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 19; (c) HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 20; (d) HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 25 OR SEQ ID NO: 26; (e) HVR-L2 que comprende SEQ ID NO: 27; y (f) HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 28. Por ejemplo, en algunos casos, los anticuerpos antiproepirregulina humana incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 18; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 19; y (c) una HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 20. En algunos casos, los anticuerpos antiproepirregulina humana incluyen (a) una HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 25; (b) HVR-L2 que comprende SEQ ID NO: 27; y (c) HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 28. En algunos casos, los anticuerpos antiproepirregulina humana incluyen (a) una HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 26; (b) HVR-L2 que comprende SEQ ID NO: 27; y (c) HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 28.

En algunos casos en los que los anticuerpos anti-proepirregulina humana se unen a los residuos aminoacídicos 156-169 de proepirregulina humana e incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 18; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 19; y (c) una HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 20, los anticuerpos antiproepirregulina humana incluyen además las siguientes regiones estructurales del dominio variable de la cadena pesada (FR): (a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 21; (b) FR-H2 que comprende SEQ ID NO: 22; (c) FR-H3 que comprende SEQ ID NO: 23; o (d) FR-H4 que comprende SEQ ID NO: 24. En algunos casos en los que los anticuerpos anti-proepirregulina humana se unen a los residuos aminoacídicos 156-169 de proepirregulina humana e incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 18; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 19; y (c) una HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 20, los anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen además las siguientes regiones estructurales del dominio variable de la cadena pesada (FR): (a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 21; (b) FR-H2 que comprende SEQ ID NO: 22; (c) FR-H3 que comprende SEQ ID NO: 23; y (d) FR-H4 que comprende SEQ ID NO: 24.

En algunos casos en los que los anticuerpos anti-proepirregulina humana se unen a los residuos aminoacídicos 156-169 de proepirregulina humana, los anticuerpos incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 18; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 19; (c) una h Vr -H3 que comprende SEQ ID NO: 20; (d) una HVR-L1 que comprende SEQ iD NO: 25; (e) una HVR-L2 que comprende Se Q ID NO: 27; y (f) una HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 28. En algunos casos, estos anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen las siguientes FR: (a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 21; (b) FR-H2 que comprende SEQ ID NO: 22; (c) FR-H3 que comprende s Eq ID NO: 23; y (d) FR-H4 que comprende SEQ ID NO: 24 y de forma adicional o alternativa pueden incluir (e) FR-L1 que comprende SEQ ID NO: 29; (f) FR-L2 que comprende SEQ ID NO: 30; (g) FR-L3 que comprende SEQ ID NO: 31; y (h) FR-L4 que comprende s Eq ID NO: 32.

En algunos casos en los que los anticuerpos anti-proepirregulina humana se unen a los residuos aminoacídicos 156-169 de proepirregulina humana, los anticuerpos incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 18; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 19; (c) una h Vr -H3 que comprende SEQ ID NO: 20; (d) una HVR-L1 que comprende SEQ iD NO: 26; (e) una HVR-L2 que comprende Se Q ID NO: 27; y (f) una HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 28. En algunos casos, estos anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen las siguientes FR: (a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 21; (b) FR-H2 que comprende SEQ ID NO: 22; (c) FR-H3 que comprende s Eq ID NO: 23; y (d) FR-H4 que comprende SEQ ID NO: 24 y de forma adicional o alternativa pueden incluir (e) FR-L1 que comprende SEQ ID NO: 29; (f) FR-L2 que comprende SEQ ID NO: 30; (g) FR-L3 que comprende SEQ ID NO: 31; y (h) FR-L4 que comprende s Eq ID NO: 32.

En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a los residuos aminoacídicos 156-169 de proepirregulina humana también pueden incluir una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 %), al menos un 90 % (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 % o 94 %), o al menos un 95 % (por ejemplo, al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con, o la secuencia de, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. En determinados ejemplos, una secuencia de VH que tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 33), pero un anticuerpo anti-proepirregulina humana que incluye esa secuencia conserva la capacidad de unirse a proepirregulina humana. En determinados ejemplos, un total de 1 a 10 aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 33. En determinados ejemplos, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las f R). Opcionalmente, los anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen la secuencia de VH en SEQ ID NO: 33, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En particular, el VH puede comprender una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 18, (b) HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 19, y (c) HVR-H3 que comprende SEQ iD NO: 20.

En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a los residuos aminoacídicos 156-169 de proepirregulina humana también pueden incluir un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 %), al menos un 90 % (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 % o 94 %), o al menos un 95 % (por ejemplo, al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con, o la secuencia de, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35. En determinados ejemplos, una secuencia de VL que tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35), pero un anticuerpo anti-proepirregulina humana que incluye esa secuencia conserva la capacidad de unirse a proepirregulina humana. En determinados ejemplos, un total de 1 a 10 aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35. En determinados ejemplos, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo antiproepirregulina humana comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En particular, el VL puede comprender una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende SEQ ID n O: 25 o SEQ ID NO: 26; (b) HVR-L2 que comprende SEQ ID NO: 27; y (c) HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 28.

En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana que se unen a los residuos aminoacídicos 156-169 de proepirregulina humana incluyen ambas secuencias VH y VL que tienen al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 %), al menos un 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, 92 %, 93 % o 94 %), o al menos un 95 % (por ejemplo, al menos un 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con, o las secuencias de, las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18, respectivamente, y pueden incluir o no modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En otros casos, la invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a proepirregulina humana, en los que los anticuerpos incluyen (a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 18; (b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 19; (c) una HVR-H3 que comprende SEQ iD NO: 20; (d) una HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 25; (e) una HVR-L2 que comprende SEQ iD NO: 27; y (f) una HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 28. En algunos casos, estos anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen las siguientes FR: (a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 21; (b) FR-H2 que comprende SEQ ID NO: 22; (c) FR-H3 que comprende SEQ ID NO: 23; y (d) FR-H4 que comprende SEQ ID NO: 24 y de forma adicional o alternativa pueden incluir (e) FR-L1 que comprende SEQ ID NO: 29; (f) FR-L2 que comprende SEQ ID NO: 30; (g) FR-L3 que comprende SEQ ID NO: 31; y (h) FR-L4 que comprende SEQ ID NO: 32. Por ejemplo, los anticuerpos anti-proepirregulina humana incluyen tanto una secuencia VH como una VL que incluyen las secuencias de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 18, respectivamente, y pueden incluir o no modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, los anticuerpos antiproepirregulina humana incluyen tanto una secuencia VH como una VL que incluyen las secuencias de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 19, respectivamente, y pueden incluir o no modificaciones postraduccionales.

Por ejemplo, la invención presenta anticuerpos anti-proepirregulina humana, tales como el anticuerpo antiproepirregulina humana J89H12L3, con las siguientes secuencias de región variable de la cadena pesada y ligera:

KSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSTFAMAWVROAPGKGLEYIG

FISLSDATYYATWAKGRFTISKSSSTTVDLKIITPTAEDTATYFCARVV

GDSSGYPNTFHPWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33)

OVLTOTPSPVSAAVGGTVTINCOASOSIHNSDFLAWYOOKPGOPPKLL

IYRASKLPSGVPSRFKGSGSGTOFTLTISDLECDDAATYYCOGTYYSG

GWYFTFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 34)

Para otro ejemplo, la invención presenta anticuerpos anti-proepirregulina humana, tales como el anticuerpo antiproepirregulina humana J89H12L8, con las siguientes secuencias de región variable de la cadena pesada y ligera:

KSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSG1DLSTFAMAWVROAPGKGLEY1G

FISLSDATYYATWAKGRFT1SKSSSTTVDLK11TPTAEDTATYFCARVV

GDSSGYPNTFHPWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33)

La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera comprende lo siguiente: OVLTOTPSPVSAAVGGTVTINCOASOMHNSDFLAWYOOKPGOPPKL

LIYRASKLPSGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCOGTYYS

GGWYFTFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 35).

En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana de la invención son anticuerpos que compiten por la unión a proepirregulina humana con uno cualquiera o más de los anticuerpos anti-proepirregulina humana descritos anteriormente. En algunos casos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana de la invención son anticuerpos que se unen al mismo epítopo o sustancialmente al mismo epítopo que uno cualquiera o más de los anticuerpos anti-proepirregulina humana descritos anteriormente.

En algunos casos, un anticuerpo anti-proepirregulina humana de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un anticuerpo monoclonal, que comprende un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En un modo de realización, un anticuerpo anti-proepirregulina humana es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otro modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto) u otra clase de anticuerpo o isotipo como se define en el presente documento.

Se debe entender que los anticuerpos anti-proepirregulina humana de la invención, aunque son útiles para la detección de la presencia o el nivel de expresión de proepirregulina humana en una muestra biológica como se ejemplifica en los ejemplos a continuación, también se pueden usar o adaptar para uso terapéutico.

En otros aspectos, los anticuerpos anti-proepirregulina humana de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones 1-5 a continuación.

1. Afinidad de anticuerpos

En determinados ejemplos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 1o nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0.001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M).

En un ejemplo, Kd se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de Fab por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoración de antígeno no marcado, a continuación capturando el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al. J. Mol. Biol. 293: 865-881, 1999). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 |jg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquea con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezclan [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al. Cáncer Res. 57:4593-4599, 1997). A continuación, se incuba el Fab de interés durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (Tw Ee N-20™) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 jl/pocillo de centelleador (m ICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.

En otro ejemplo, Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con micromatrices CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan micromatrices de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc) con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 jg/m l (-0,2 jM ) antes de su inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión uno a uno de Langmuir sencillo (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al. J. Mol. Biol.

293: 865-881, 1999. Si la tasa de asociación excede 106 M 'V por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medida en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

2. Fragmentos de anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134, 2003. Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthun. The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. vol. 113, pp. 269-315, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, 1994; véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos del epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento en la semivida in vivo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al. Nat. Med. 9: 129 134, 2003; y Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448, 1993. También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo.

En determinados ejemplos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516).

Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo inalterado, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

3. Anticuerpos quiméricos y humanizados

En determinados ejemplos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Determinados anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 6851-6855, 1984. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con cambio de clase" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinados ejemplos, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, mientras mantiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. Algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se pueden sustituir con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro et al. Front. Biosci. 13: 1619-1633, 2008, y se describen además por ejemplo, en Riechmann et al. Nature. 332: 323-329, 1988; Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 10029-10033, 1989; patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al. Methods. 36: 25-34, 2005 (que describe injerto SDR (a-CDR)); Padlan. Mol. Immunol. 28: 489-498, 1991 (que describe el "revestimiento"); DaU'Acqua et al. Methods. 36: 43-60, 2005 (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al. Methods 36: 61-68, 2005 y Klimka et al. Br. J. Cancer. 83: 252-260, 2000 (que describe el enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento del "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 1993); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 4285, 1992; y Presta et al. J. Immunol. 151: 2623, 1993); regiones estructurales maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro et al. Front. Biosci. 13: 1619-1633, 2008); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca et al. J. Biol. Chem. 272: 10678-10684, 1997 y Rosok et al. J. Biol. Chem. 271: 22611-22618, 1996).

4. Anticuerpos multiespecíficos

En determinados ejemplos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. Por ejemplo, una de las especificidades de unión es para proepirregulina humana y la otra es para cualquier otro antígeno. Los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de proepirregulina humana. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar agentes citotóxicos en células que expresan proepirregulina humana. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véanse Milstein et al. Nature. 305: 537, 1983, documento WO 93/08829, y Traunecker et al. EMBO J. 10: 3655, 1991), y genomanipulación "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden preparar genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpos (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan et al. Science. 229: 81, 1985); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al. J. Immunol. 148(5): 1547-1553, 1992); usando tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 6444-6448, 1993); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al. J. Immunol. 152: 5368, 1994); y preparar anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60, 1991.

En el presente documento también se incluyen anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento incluye también un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a proepirregulina humana así como otro antígeno diferente (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0069820).

5. Variantes de anticuerpo

Se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

a) Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados ejemplos, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadena lateral aminoacídica. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad, o mejora en ADCC o CDC.

Tabla 1. Sustituciones aminoacídicas ejemplares y preferentes

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento en afinidad, reducción en inmunogenicidad) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden preparar en "puntos calientes" de la HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196, 2008), y/o s Dr (a-CDR), sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. Se ha descrito la maduración de la afinidad por la construcción y reselección de colecciones secundarias, por ejemplo, en Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology. 178: 1-37, O'Brien et al. eds., Human Press, Totowa, NJ, 2001. En algunos ejemplos de maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. A menudo se seleccionan en particular HVR-H3 y HVR-L3.

Se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones en una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de HVR o SDR. En determinados ejemplos de las secuencias de Vh y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden dirigir por mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham et al. Science. 244: 1081-1085, 1989. En este procedimiento, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incremente la semivida en suero del anticuerpo.

b) Variantes de glucosilación

En determinados ejemplos, se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se une en general por un enlace N a Asn297 del dominio c H2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH. 15: 26-32, 1997. El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. Por ejemplo, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En un aspecto, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura carbohidratada que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, con respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos hacia 5' o hacia 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una mejora en la función ADCC. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.os Us 2003/0157108 y US 2004/0093621. Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249, 2004; y Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004. Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lecl3 carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545, 1986; documentos US 2003/0157108; y WO 2004/056312, en especial en el ejemplo 11) y líneas celulares con inactivación génica, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con inactivación génica (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004; Kanda et al. Biotechnol. Bioeng. 94(4): 680-688, 2006; y el documento WO2003/085107).

Se proporcionan además variantes de anticuerpo con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una reducción en la fucosilación y/o una mejora en la función ADCC. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2003/011878; patente de EE. UU. n.° 6.602.684; y US 2005/0123546. También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una mejora en la función CDC. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.

c) Variantes de la región Fc

Se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo anti-proepirregulina humana de la invención (por ejemplo, J5-H1L1) proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.

En determinados ejemplos, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero mantiene su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRIl y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch et al. Annu. Rev. Immunol.

9: 457-492, 1991. Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en las patentes de EE. UU. n.os 5.500.362 y 5.821.337; Hellstrom et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 7059-7063, 1986; Hellstrom et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 82: 1499-1502, 1985; y Bruggemann et al. J. Exp. Med. 166: 1351-1361, 1987. De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:652-656, 1998. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y por tanto carece de actividad c Dc . Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods. 202: 163, 1996; Cragg et al. Blood. 101: 1045-1052, 2003; y Cragg et al. Blood 103: 2738-2743, 2004. También se pueden realizar la unión a FcRn y determinaciones del aclaramiento/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova et al. Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769, 2006).

Los anticuerpos con una reducción en la función efectora incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una mejora o disminución en la unión a FcR. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312; y Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604, 2001.

Por ejemplo, una variante de anticuerpo puede comprender una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos).

En algunos ejemplos, se realizan las alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, mejoradas o reducidas), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642, e Idusogie et al. J. Immunol.

164: 4178-4184, 2000.

Los anticuerpos con un incremento en las semividas y una mejora en la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al. J. Immunol. 117: 587,1976 y Kim et al, J. Immunol. 24: 249, 1994), se describen en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 2005/0014934. Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen las de sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826). Véanse también Duncan et al. Nature. 322:738-740, 1988; patentes de EE. UU. n.os 5.648.260 y 5.624.821; y documento WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

d) Variantes de anticuerpo genomanipulado con cisteína

Puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En ejemplos particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se posicionan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados ejemplos, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se pueden sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.

e) Derivados de anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-proepirregulina humana de la invención (por ejemplo, J5-H1L1) proporcionado en el presente documento se puede modificar además para contener restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, ya sea si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otro ejemplo, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un ejemplo, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 11600-11605, 2005). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.

B. Composiciones y procedimientos recombinantes

Se pueden producir anticuerpos usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de e E. UU. n.° 4.816.567. En un modo de realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-proepirregulina humana descrito en el presente documento (por ejemplo, J5-H1L1, J89H12L3 y J89H12L8). Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En otro ejemplo, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro ejemplo, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. Por ejemplo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. Por ejemplo, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfocítica (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un ejemplo, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo anti-proepirregulina humana, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-proepirregulina humana descrito en el presente documento (por ejemplo, J5-H1L1, J89H12L3 y J89H12L8), el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla y se inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de los fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. Véase también Charlton. Methods in Molecular Biology. vol. 248, pp. 245-254, B. K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli. Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross. Nat. Biotech. 22: 1409-1414, 2004 y Li et al. Nat. Biotech. 24: 210-215, 2006.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et al. J. Gen Virol. 36:59, 1977); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4, como se describe, por ejemplo, en Mather. Biol. Reprod. 23:243-251, 1980); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL3 A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario murino (MMT060562); células TRI como se describe, por ejemplo, en Mather et al. Annals N.Y. Acad. Sci.

383:44-68, 1982; células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), que incluyen células CHO DHFR-(Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 4216, 1980); y líneas de células de mieloma tales comoY0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki et al. Methods in Molecular Biology. vol. 248, pp. 255-268, B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003.

C. Ensayos

Los anticuerpos anti-proepirregulina humana proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar para o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

1. Ensayos de unión y otros ensayos

En un aspecto, un anticuerpo de la invención se somete a prueba para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, etc.

En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con uno cualquiera de los anticuerpos de la invención por la unión a proepirregulina humana (por ejemplo, anticuerpo antiproepirregulina humana J5H1L1, J89H12L3 e I89H12L8). En determinados ejemplos, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que se une por uno cualquiera de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, anticuerpo anti-proepirregulina humana J5H1L1, J89H12L3 o J89H12L8). Los procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ, 1996).

En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba proepirregulina humana inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a proepirregulina humana (por ejemplo, anticuerpo antiproepirregulina humana J5H1L1, J89H12L3 y J89H12L8) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión a proepirregulina humana. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba proepirregulina humana inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a proepirregulina humana, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con proepirregulina humana inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con proepirregulina humana inmovilizada se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a proepirregulina humana. Véase, por ejemplo, Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual. Ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988).

2. Ensayos de detección

En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-proepirregulina humana útiles para detectar la presencia de proepirregulina humana, por ejemplo en ensayos de inmunohistoquímica (IHQ) o inmunofluorescencia (IF). En determinados ejemplos, se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar dicha actividad.

D. Inmunoconjugados

La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-proepirregulina humana en el presente documento conjugado a uno o más marcadores y/o agentes, tales como isótopos radiactivos.

En un ejemplo, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, r M), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de un anticuerpo anti-proepirregulina humana y un marcador o agente se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación del marcador o agente. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020).

Los inmunoconjugados en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).

E. Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección

En determinados modos de realización, los anticuerpos anti-proepirregulina humana proporcionados en el presente documento son útiles para detectar la presencia de proepirregulina humana en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa.

En un caso, se proporciona un anticuerpo anti-proepirregulina humana (por ejemplo, J5-H1L1, J89H12L3 o J89H12L8) para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En un caso, por ejemplo, se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de proepirregulina humana en una muestra biológica, descrito a continuación. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-proepirregulina humana como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-proepirregulina humana a proepirregulina humana, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-proepirregulina humana y proepirregulina humana. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. Se pueden usar anticuerpos anti-proepirregulina humana de la invención (por ejemplo, J5-H1L1, J89H12L3 o J89H12L8), por ejemplo, en inmunoensayos, incluyendo, por ejemplo, inmunohistoquímica (IHQ), inmunofluorescencia (IF), inmunotransferencia (por ejemplo, inmunoelectrotransferencia), citometría de flujo y ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA). En un ejemplo, se usa un anticuerpo anti-proepirregulina humana para seleccionar sujetos elegibles para tratamiento con un anticuerpo anti-proepirregulina humana, por ejemplo, donde proepirregulina humana es un biomarcador para la selección de pacientes.

En determinados casos, se proporcionan anticuerpos anti-proepirregulina humana marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

Se entiende que se puede llevar a cabo cualquiera de los procedimientos anteriores para diagnóstico y/o detección usando un inmunoconjugado de la invención, como se describe anteriormente, en lugar de o además de un anticuerpo anti-proepirregulina humana.

F. Muestras biológicas

En determinados modos de realización, los anticuerpos anti-proepirregulina humana de la invención (por ejemplo, J5H1L1, J89H12L3, J89H12L8 y/o J111H1L10) se pueden usar para detectar la presencia de proepirregulina humana en muestras biológicas usando procedimientos conocidos en la técnica o descritos en el presente documento.

En algunos casos, una muestra biológica incluye una muestra tisular o celular. Por ejemplo, una muestra biológica puede incluir una célula o tejido de pacientes normales o con cáncer, tal como, por ejemplo, tejido normal y canceroso de mama, colon, pulmón, riñón, hueso, cerebro, músculo, estómago, páncreas, vejiga, ovario, útero, así como tejido cardíaco, embrionario y placentario.

En determinados casos, la fuente de la muestra tisular o celular puede ser un tejido sólido como de una muestra o biopsia o aspirado de órgano o tejido fresco, congelado y/o conservado; sangre o cualquier componente sanguíneo; líquidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial; células de cualquier momento en la gestación o desarrollo del sujeto. En algunos modos de realización, la muestra biológica se obtiene de cultivo tisular o celular in vitro. Los ejemplos de muestras biológicas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, biopsias tumorales, células tumorales circulantes, suero o plasma, proteínas plasmáticas circulantes, líquido ascítico, cultivos celulares primarios o líneas celulares derivadas de tumores o que presentan propiedades similares a tumor, así como muestras tumorales conservadas, tales como muestras tumorales incluidas en parafina fijadas con formol (FFPE) o muestras tumorales congeladas.

En algunos ejemplos, la muestra biológica contiene compuestos que no se entremezclan de forma natural con el tejido en la naturaleza tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, nutrientes, antibióticos o similares. En determinados modos de realización, la muestra biológica se ha expuesto y/o contiene uno o más fijadores. Los fijadores que se pueden usar con procedimientos y composiciones de la invención incluyen formalina, glutaraldehído, tetraóxido de osmio, ácido acético, etanol, acetona, ácido pícrico, cloroformo, dicromato de potasio y cloruro mercúrico y/o estabilización por calentamiento o congelación por microondas.

En algunos modos de realización, la muestra biológica es de un sujeto que tiene, predispuesto a, o que se somete a prueba para una enfermedad autoinmunitaria. En determinados ejemplos, la enfermedad autoinmunitaria es un trastorno reumatológico autoinmunitario (incluyendo artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lupus tales como LES y nefritis lúpica, polimiositis-dermatomiositis, crioglobulinemia, síndrome de anticuerpos antifosfolipídicos, y artropatía psoriásica), un trastorno gastrointestinal y hepático autoinmunitario (incluyendo enfermedades intestinales inflamatorias (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), gastritis autoinmunitaria y anemia perniciosa, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, y enfermedad celíaca), vasculitis (incluyendo vasculitis no asociada a ANCA y vasculitis asociada a ANCA, incluyendo vasculitis de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener, y poliangiitis microscópica), un trastorno neurológico autoinmunitario (incluyendo esclerosis múltiple, síndrome de opsoclonía-mioclonía, miastenia grave, neuromielitis óptica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y polineuropatías autoinmunitarias), un trastorno renal (incluyendo glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, y enfermedad de Berger), un trastorno dermatológico autoinmunitario (incluyendo psoriasis, urticaria, ronchas, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso, y lupus eritematoso cutáneo), un trastorno hemático (incluyendo púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura postransfusional, y anemia hemolítica autoinmunitaria), ateroesclerosis, uveítis, una enfermedad auditiva autoinmunitaria (incluyendo enfermedad del oído interno y sordera parcial), enfermedad de Behcet, síndrome de Raynaud, trasplante de órganos, o un trastorno endocrino autoinmunitario (incluyendo enfermedades autoinmunitarias relacionadas con diabetes tales como diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), enfermedad de Addison, y enfermedad tiroidea autoinmunitaria (incluyendo enfermedad de Graves y ti roiditis)).

En otros modos de realización, la muestra biológica es de un sujeto que tiene, predispuesto a, o que se somete a prueba para una enfermedad autoinmunitaria. En determinados modos de realización, el cáncer es carcinoma, linfoma (incluyendo linfoma hodgkiniano y no hodgkiniano), blastoma, sarcoma, leucemia, cáncer de células escamosas, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar de células escamoso, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos o diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. En un ejemplo específico, la muestra biológica es una muestra de tumor colorrectal

III. Ejemplos

Se produjeron anticuerpos monoclonales de conejo frente a péptidos sintéticos correspondientes al extremo C de proteínas EREG/AREG precursoras humanas. Como resultado, estos anticuerpos detectan las formas unidas a membrana de proteínas pro-EREG y pro-AREG antes de su escisión pero también detectan el fragmento citosólico de las proteínas precursoras antes de transportarse a la membrana celular.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos anti-proepirregulina humana frente a los aminoácidos 148-169 de SEQ ID NO: 1

Se generaron anticuerpos monoclonales de conejo anti-proepirregulina humana como se representa esquemáticamente en la figura 1.

En resumen, el fragmento peptídico de los residuos aminoacídicos 148-169 de SEQ ID NO: 1 se sintetizó y se conjugó por glutaraldehído con hemocianina de lapa californiana (KLH), una proteína portadora usada ampliamente para estimular una respuesta inmunitaria sustancial por medio de la producción de anticuerpos. Se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda con antígeno proepirregulina humana conjugado con KLH y emulsionado con adyuvante de Freund completo seguido de una serie de refuerzo de antígeno proepirregulina humana emulsionado con adyuvante de Freund incompleto. Se cribaron las células que expresan anticuerpo por ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) usando el antígeno proepirregulina humana. Se cribaron además todos los clones positivos para ELISA por inmunohistoquímica (IHQ) y se seleccionó el clon que producía el anticuerpo con la mayor especificidad. Para la producción recombinante de anticuerpos anti-proepirregulina humana, se clonó ADNc que codifica las secuencias de la cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos, se expresó por cotransfección y se cribó la unión a proepirregulina humana por IHQ. Se produjo el anticuerpo monoclonal antiproepirregulina humana J5H1L1 usando estos procedimientos y posteriormente se purificó por cromatografía de afinidad con proteína A. Las secuencias de región variable de la cadena pesada y ligera del anticuerpo J5-H1L1 son como sigue.

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSRYGMSWVRQAPGKGLEYIG

SINRT A YT YY ATW AKGRFTISRTSTT VDLRMT SLTTEDTAT YF C ARGLT

YGGSDYDYDDALWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)

QVLTQTPSSVSAAVGGTVT1NCQASQSVYKNKNLAWYQQKPGQPPKLLIYEA

STLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYCQGEFSCSTFDCILFGGG

TEMVVK (SEQ ID NO: 17).

Ejemplo 2. Generación de anticuerpos anti-anfirregulina humana

Se generaron anticuerpos monoclonales de conejo anti-anfirregulina humana como se representa esquemáticamente en la figura 1. En resumen, el fragmento peptídico de los residuos aminoacídicos 238-252 de SEQ ID NO: 36 se sintetizó y se conjugó por glutaraldehído con hemocianina de lapa californiana (KLH), una proteína portadora usada ampliamente para estimular una respuesta inmunitaria sustancial por medio de la producción de anticuerpos. Se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda con antígeno anfirregulina humana conjugado con KLH y emulsionado con adyuvante de Freund completo seguido de una serie de refuerzo de antígeno anfirregulina humana emulsionado con adyuvante de Freund incompleto. Se cribaron las células que expresan anticuerpo por ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) usando el antígeno anfirregulina humana. Se cribaron además todos los clones positivos para ELISA por inmunohistoquímica (IHQ) y se seleccionó el clon que producía el anticuerpo con la mayor especificidad. Para la producción recombinante de anticuerpos antianfirregulina humana, se clonó ADNc que codifica las secuencias de la cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos, se expresó por cotransfección y se cribó la unión a anfirregulina humana por IHQ. Se produjo el anticuerpo monoclonal anti-anfirregulina humana J111H1L10 usando estos procedimientos y posteriormente se purificó por cromatografía de afinidad con proteína A. Las secuencias de región variable de la cadena pesada y ligera del anticuerpo J111H1L10 son como sigue.

QSLEESRGGLIKPGGTLTLTCTVSGFSLSSYAISWVRQAPGNGLEWIGFI

VGSSGSAYYASWAKSRSTITRDTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCAK

GLYSGGNYWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51)

AVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQSVDENNYLSWFQQKPGQPPKLLIYRAS

TLESGVPSRFSGSGSGTQFTLTVSGVQCDDAATYYCLGGYSGYSDDGFGGGF

EVVVK (SEQ ID NO: 52).

Ejemplo 3. Ensayos inmunohistoquímicos usando anticuerpos anti-proepirregulina humana y antianfirregulina humana

Reactivos

Toda la optimización de ensayo se realizó en líneas celulares de carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC) humano (NCI-H1975; NCI-H1650; H460; NCI-HCC827; H2228; Calu-3; H820), de mama (MCF7; A431) y tejidos de cáncer colorrectal. Se evaluaron portaobjetos teñidos para las condiciones sometidas a prueba por un anatomopatólogo preparado y se determinaron las condiciones de tinción óptimas en base a la intensidad de tinción, porcentaje de células positivas y el nivel de tinción inespecífica (fondo). Las condiciones examinadas y nominales (negrita) desarrolladas para iHq EREG/AREG se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Las condiciones de ensayo examinadas y nominales (negrita) para ensayos IHQ EREG/AREG

De los seis anticuerpos monoclonales de conejo anti-EREG, el clon D4O5I obtenido de CST y el clon J5H1L1 desarrollado por Spring Bioscience proporcionaron tinción aceptable. Aunque ambos clones de EREG mostraron especificidad similar, el clon anti-EREG J5H1L1 fue más sensible (figura 2). Se descubrió principalmente expresión de proteína EREG en células tumorales, pero el clon J5H1L1 también pudo detectar el nivel basal de expresión en epitelio colónico normal.

Similar a IHQ EREG, la inmunohistoquímica de AREG mostró niveles variables de expresión de proteínas en células tumorales y expresión débil en colon normal. De los dos anticuerpos monoclonales de conejo AREG, el clon J111H1L10 se comportó mejor al ser más sensible y más específico en comparación con el clon J13H2L6. La figura 3 representa imágenes para la tinción IHQ AREG en cánceres de colon.

Se sometió a prueba la especificidad de anticuerpos para EREG/AREG por análisis de inmunoelectrotransferencia de extractos de diversas líneas celulares de control. La figura 4 muestra que ambos anticuerpos monoclonales de conejo para EREG/AREG son específicos y reconocen la forma no glucosilada y el fragmento C terminal de las proteínas precursoras.

Se evaluó el rendimiento de ensayo de los ensayos IHQ EREG/AREG en 8 casos de cáncer colorrectal proporcionados amablemente por el Dr. Paul Waring. Se tiñeron inmunohistoquímicamente muestras para la expresión de EREG con el clon J5H1L1 y para la expresión de AREG con J111H1L10 en un instrumento iHq /ISH VENTANA BenchMark XT. Se usaron los siguientes protocolos de instrumento:

Tabla 4

Se puntuaron las muestras teñidas por un anatomopatólogo preparado. Ambos IHQ detectaron la expresión de proteína EREG/AREG heterogénea dando como resultado una intensidad de señal variable y patrones de tinción (tabla 5).

Tabla 5

Tres tipos de patrón de tinción fueron característicos en 8 muestras de tejido: tinción citoplásmica, membranosa y granulada/puntiforme (fig. 5A-5C). Es probable que la expresión citoplásmica de EREG/AREG se deba a la detección de los fragmentos citosólicos de las proteínas precursoras después de su escisión. La tinción granulada/puntiforme se asocia con la detección de los ligandos incorporados en exosomas. La tinción membranosa corresponde a la identificación de las proteínas EREG/AREG precursoras ancladas a membrana.

Ejemplo 4. Generación de anticuerpos anti-proepirregulina humana frente a los aminoácidos 156-169 de SEQ ID NO: 1

Se produjeron anticuerpos monoclonales de conejo frente a péptidos sintéticos correspondientes al extremo C de proteínas EREG precursoras humanas. Como resultado, estos anticuerpos detectan las formas unidas a membrana de proteína pro-EREG antes de su escisión pero también detectan el fragmento citosólico de las proteínas precursoras antes de transportarse a la membrana celular.

Se generaron anticuerpos monoclonales de conejo anti-proepirregulina humana como se representa esquemáticamente en la figura 1. En resumen, se sintetizó el fragmento peptídico de los residuos aminoacídicos 156-169 de SEQ ID NO: 1 (secuencia YERYTSGDPELPQY, SEQ ID NO: 36) y se añadieron dos aminoácidos adicionales (Cys-Gly) al extremo N de la secuencia durante la síntesis para facilitar la conjugación a la proteína transportadora KLH, una proteína transportadora usada ampliamente para estimular una respuesta inmunitaria sustancial por medio de la producción de anticuerpos. Se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda con antígeno proepirregulina humana conjugado con k Lh y emulsionado con adyuvante de Freund completo seguido de una serie de refuerzo de antígeno proepirregulina humana emulsionado con adyuvante de Freund incompleto.

Se cribaron las células que expresan anticuerpo por ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) usando el antígeno proepirregulina humana. Se cribaron además todos los clones positivos para ELISA por inmunohistoquímica (IHQ) y se seleccionó el clon que producía el anticuerpo con la mayor especificidad. Para la producción recombinante de anticuerpos anti-proepirregulina humana, se clonó ADNc que codifica las secuencias de la cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos, se expresó por cotransfección y se cribó la unión a proepirregulina humana por IHQ.

Se produjeron los anticuerpos monoclonales anti-proepirregulina humana J89H12L3 y J89H12L8 usando estos procedimientos y posteriormente se purificó por cromatografía de afinidad con proteína A. Las secuencias de región variable de la cadena pesada y ligera del anticuerpo J89H12L3 son como sigue.

KSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSTFAMAWVRQAPGKGLEYIGF

ISLSDATYYATWAKGRFTISKSSSTTVDLKIITPTAEDTATYFCARVVGD

SSGYPNTFHPWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33)

QVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQASQSIHNSDFLAWYQQKPGQPPKLLIYRAS

KLPSGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGTYYSGGWYFTFGGGT

EVVVK (SEQ ID NO: 34).

Las secuencias de región variable de la cadena pesada y ligera del anticuerpo J89H12L8 son como sigue.

KSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSTFAMAWVRQAPGKGLEYIGF

ISLSDATYYATWAKGRFTISKSSSTTVDLKIITPTAEDTATYFCARVVGD

SSGYPNTFHPWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33)

QVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQASQNIHNSDFLAWYQQKPGQPPKLLIYRAS

KLPSGVPS RFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATY YCQGT YY SGGW Y FTFGGGT

EVVVK (SEQ ID NO: 35).

Se sometieron a prueba los anticuerpos obtenidos por medio de inmunoelectrotransferencia para determinar su especificidad. Se usó el clon de anticuerpo D405I (Cell Signaling Technologies, Inc.) como control positivo. En resumen, se cargaron 10 |jg de proteína total y se separaron en gel de SDS-PAGE al 4-20 % seguido de transferencia a una membrana de PVDF. A continuación se bloqueó la membrana en TBST con BSA al 5 % seguido de incubación con 0,2 ug/ml de J89H12L3 y 0,4 ug/ml de D405I. Se detectaron proepirregulina y su propéptido por un conjugado anti-HRP de conejo caprino y se visualizaron por el sustrato quimioluminiscente SuperSignal™ West Pico (ThermoFisher Scientific 34079). La figura 6 demuestra una inmunoelectrotransferencia de este tipo para el clon J89H12L3. La inmunoelectrotransferencia fue negativa en la línea celular A549 de control negativo (carril 1) para ambos clones. Se detectaron pro-EREG glucosilada (30 kDa) y no glucosilada (17 y 18 kDa) con ambos clones en lisados celulares de células HCC827 (carril derecho).

También se sometieron a prueba los anticuerpos obtenidos en un análisis IHQ en xenoinjerto y tejido primario. Se procesó la IHQ con un sistema de tinción automático (BenchMark ULTRA, Roche) usando el siguiente protocolo. Se desparafinaron secciones de tejido FFPE y se calentaron en tampón de recuperación de antígeno EDTA durante 64 min antes de que se añadieran los anticuerpos monoclonales anti-EREG humana de conejo a las secciones tisulares. El tiempo de incubación para anticuerpo primario de conejo fue de 16 min a 37 °C y se siguió con un protocolo de detección OptiView estándar de Roche.

La figura 7 es una comparación entre J89H12L3 y D405I en diversos xenoinjertos. La tinción es fuerte en células SKE23 con mayor expresión de EREG -(A), débil en células PLR124EREG /-(B), negativa en células SK-Hepl (C) y débil en células PLR124EREG -/- (D) usando el clon J89H12L3. De forma similar, el clon D405I tiñó fuertemente las células SKE23 (E), pero es muy débil en células PLR124EREG /- (F) y negativo para ambas células SK-Hepl (G) y PLR124EREG -/-(H).

La figura 8 es una comparación entre J89H12L3 y D405I en tejido de carcinoma de células escamosas de pulmón (SCC). Se observa mayor intensidad en los tejidos de cáncer teñidos con los clones J89H12L3 (A-C) en comparación con los tejidos teñidos con el clon D405I (Cell Signaling Technologies, Inc., Danvers, MA)(D-F).

La figura 9 es una comparación entre J89H12L3 y D405I en adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células adenoescamosas. Se observa mayor intensidad en los tejidos de cáncer teñidos con los clones J89H12L3 (A-D) en comparación con los tejidos teñidos con el clon D405I (E-H).

La figura 10 es un análisis IHQ de la expresión de proteína EREG en tejidos normales y tumorales usando el clon J89H12L3. Se observa tinción de moderada a fuerte en carcinoma de células escamosas cutáneo (A), carcinoma hepatocelular (B), carcinoma de células de transición de vejiga (C), adenocarcinoma de colon (D), adenocarcinoma de pulmón (E), piel (F), cuello uterino (G) y esófago (H)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a proepirregulina humana, en el que el anticuerpo comprende las siguientes HVR:

(a) una HVR-H1 que comprende SEQ ID NO: 2;

(b) una HVR-H2 que comprende SEQ ID NO: 3;

(c) una HVR-H3 que comprende SEQ ID NO: 4;

(d) una HVR-L1 que comprende SEQ ID NO: 9;

(e) una HVR-L2 que comprende SEQ ID NO: 10; y

(f) una HVR-L3 que comprende SEQ ID NO: 11.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende además las siguientes FR de dominio variable de la cadena pesada y dominio variable de la cadena ligera:

(a) FR-H1 que comprende SEQ ID NO: 5;

(b) FR-H2 que comprende SEQ ID NO: 6;

(c) FR-H3 que comprende SEQ ID NO: 7;

(d) FR-H4 que comprende SEQ ID NO: 8;

(e) FR-L1 que comprende SEQ ID NO: 12;

(f) FR-L2 que comprende SEQ ID NO: 13;

(g) FR-L3 que comprende SEQ ID NO: 14; y

(h) FR-L4 que comprende SEQ ID NO: 15.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 16 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 17.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, opcionalmente en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal de conejo.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG, o en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a proepirregulina humana, en el que el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, fragmento variable monocatenario (scFv), Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y diacuerpo.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7.

9. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. Un procedimiento de detección de la presencia o nivel de expresión de proepirregulina humana en una muestra biológica in vitro que comprende poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y detectar la presencia del anticuerpo unido.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la detección es por inmunohistoquímica, inmunofluorescencia o inmunotransferencia.

12. El procedimiento de las reivindicaciones 10 u 11, en el que la muestra biológica comprende un tejido fijado, en el que el tejido fijado es un tejido incluido en parafina.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la muestra biológica es de un sujeto que tiene o predispuesto a cáncer o enfermedad autoinmunitaria, opcionalmente en el que el cáncer es cáncer de colon, cáncer de mama o cáncer de pulmón.

14. Un distribuidor para un teñidor de portaobjetos automatizado que comprende una solución que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

15. Un kit que comprende un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o un distribuidor de acuerdo con la reivindicación 14.